fish荧光原位杂交操作说明

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1、普飞生物商城www.pufei.com试剂耗材一体化采购平台简便、快捷、准确－临床诊断中的FISH检测  FISH（即荧光原位杂交）技术作为分子诊断的重要工具，在科研和临床诊断领域都有着广泛的应用。FISH检测是利用荧光基团标记DNA探针，再将标记的DNA探针与样本DNA进行原位杂交，最后在荧光显微镜下对荧光信号进行计数，以此作为诊断的依据。FISH的操作简便快捷，结果直观准确，因此FISH成了许多疾病诊断的首选工具。下面我们将从探针的设计，样本的制备，原位杂交和检测结果的观察等几个方面简单介绍FIS

2、H的操作。   探针的预备1.让探针加热至室温，降低探针的粘度，使用合适的移液管2.振荡混合。用微型离心机将内容物离心（1-3秒）至底部。轻轻振荡再次混匀3.注意：该探针已经经过变性可直接与样本片子反应。若探针是非降解型，需进行73℃5分钟的变性杂交1.在片子上，将10μL的CEP18/X/Y混合探针加到一个反应区，将10μ的LLSI13/21混合探针加至另一个反应区。将22mm×22mm的盖玻片立刻覆盖反应区，使探针溶液弥漫整个覆盖区。气泡会干扰杂交，因此必须排除气泡注意普飞生物商城www.pufe

3、i.com试剂耗材一体化采购平台探针是FISH检测灵敏度和准确性的关键。FISH检测的准确性来源于探针的设计。FISH能否应用于某一领域也取决于是否具有相应的探针。用于FISH检测的探针必须具备很高的特异性，能特异性地识别特定的基因或染色体上特定的片断。而且FISH的探针必须能经受原位杂交的处理而不变性。荧光基团的标记也直接影响了检测的灵敏度和原位杂交结果的检测方式。以著名的探针生产商Vysis公司的LSI系列探针为例：LSI系列探针来源于BAC大片断基因组文库，探针所覆盖的染色体片断总长可达100K

4、b－400Kb，保证了探针的高特异性和极强的荧光信号；荧光基团采用直接标记法标记，不同波长的荧光基团使探针在荧光显微镜下呈现多种荧光信号，借此我们可以一次检测多个染色体或基因的异常；由于探针具有极强的荧光信号因而对FISH结果的检测也采用直接检测法，即在荧光显微镜下直接观察FISH的信号，而无需抗原－抗体反应对荧光信号进行放大。Vysis探针的设计既确保了探针的特异性和灵敏度，同时直接的镜检也使FISH检测更简便。   FISH检测对被测样本没有特殊的要求。可以是来自骨髓的细胞，也可以是来自羊水的细胞

5、；可以是冰冻切片的样本，也可以是经过石蜡包埋的样本。甚至可以利用尿液样本进行膀胱癌复发的预后。获取的样本细胞也无需经过培养扩增，FISH检测可以显示单个细胞核内染色体的异常情况。   ：在盖玻片覆盖前，不能在多目标区加探针溶液；盖玻片应37℃预热1.用树胶封片：用5ml的注射器吸去树胶，在盖玻片的四周加上树胶2.将封好的片子放入37℃预热的杂交盒中，盖紧盖子，37℃孵育6-24小时杂交后的冲洗1.在科普林染色缸中加入0.4×SSC/0.3%NP-40。将染色缸放入73±1℃的水浴中半小时以上，使0.4

6、×SSC/0.3%NP-40溶液的温度达到73±1℃。每批使用前都必须确保0.4×SSC/0.3%NP-40溶液的温度达到73±1℃2.在科普林染色缸中加入2×SSC/0.1%NP-40，放置至室温。两种洗液使用过一天后就应丢弃3.普飞生物商城www.pufei.com试剂耗材一体化采购平台我们以Vysis公司的AneuVysion多色DNA探针试剂盒为例，简要介绍FISH的原位杂交过程。AneuVysion多色DNA探针试剂盒用于羊水细胞的产前诊断，样本是来源于羊水的细胞。试剂盒通过两组5种探针（L

7、SI13/21和CEP18/X/Y）同时检测5个染色体的数目异常，以此为依据进行产前诊断。样本的制备1.1000转/分离心羊水（AF）5分钟。羊水应没有血色或褐色。2.用2-5ml的1×胰酶/EDTA溶液（0.05%胰酶，0.53MEDTA4Na的Hank氏平衡盐溶液，不含CaCl2、MgCl2.6H2O、MgSO4.7H2O）悬浮沉淀，37℃水浴15分钟以上3.1000转/分离心5分钟4.用2-5ml的0.56%KCl溶液悬浮细胞，37℃水浴20分钟。这些处理步骤的目的是使羊水细胞成为悬浮的单细胞。

8、5.加0.8-2ml的固定液（3∶1甲醇∶冰醋酸）至细胞低渗液中，轻轻混匀6.挪去树胶和盖玻片，将片子立即放入73±1℃装有0.4×SSC/0.3%NP-40的科普林染色缸中，漂洗3秒左右。其他片子同样操作，然后孵育2分钟。不要同时操作4片以上。假如操作4片以上，取保0.4×SSC/0.3%NP-40的温度在73±1℃注意：在洗浴前不能揭去盖玻片。当最后一片进入洗液后，开始计时2分钟1.将片子放入装有2×SSC/0.1%NP-40的科普林染色缸中室温放置