荧光原位杂交技术(FISH)常见问答

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1、荧光原位杂交技术（FISH）常见问答对于FISH操作来说，那些因素比较重要？在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度；各种试剂pH是否符合要求直接关系到FISH的稳定性。在夏季成功检测的同一探针和样本为什么在冬季就得不到理想的效果？发生上述现象最大的可能是FISH操作的环境温度发生了变化导致的。在我国，冬季普遍比夏季寒冷，低的环境温度使FISH得不到良好的杂交效率。此外，探针的保存不当也容易引起荧光素的萃

2、灭而导致效果不佳。因此保证FISH操作中的温度非常重要。该如何保证FISH操作中的温度？最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作。如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，诸如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在1度以内）。其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH操作尤为重要。此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。同时检测的样本最好不能超过4块。操作中

3、的行动一定要迅速。操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。特别是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多（10ul），因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率。因此对上述小部件的预热也能有效地提高FISH的杂交效果。使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号。但随后信号急剧衰减。几分钟后信号就消失了。这是探针本身的质量问题吗？在正常情况下，目前的商业化探针即使是杂交后，如果保存适当，荧光信号能保持半年以上。出现上述情况主要

4、的原因是操作观察的过程中或是探针的保存过程中没有采取严格的避光措施。阳光或是强的灯光都会使荧光染料发生急剧的淬灭，从而造成了观察结果的不稳定。因此在操作和观察时，尽可能在暗室中操作。也可以在封片观察时加入一定的antifade（抗淬灭剂）以延缓荧光素的淬灭。如何配制各种试剂呢？强烈建议使用去离子水配制各种所需的试剂。此外，配制后使用pH计检测是否符合要求。配制的各种试剂都要采用超纯级的要求。每次FISH使用新的试剂，旧的试剂最好弃置不用。洗脱液和变性液当天用当天配。直标型探针和间标型探针有何不同？

5、为什么我们要选择直标型探针？所谓的直标型探针是指DNA探针共价连接着荧光素基团；间标型探针则是指DNA探针先与某个半抗原连接，诸如生物素或地高辛，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针－半抗原－荧光素基团，类似“三明治”的复合物。与间标型探针相比，直标型探针具有低背景、高特异性的特点。随着荧光染料和荧光检测技术的不断发展，直标型探针的灵敏度也不断提高。因而在FISH检测领域，尤其是在疾病分型领域，探针大多采用直标型设计。我能对同一样本进行多次的FISH操作吗？在多数情况下，如果FISH操作没有得到

6、正常的结果，我们可以将探针洗去，然后使用同样的探针进行再次的杂交。如果我们使用的是直标型探针，还可以使用不同探针对同一样本进行反复杂交。针对不同的样本，处理方法略有不同。外周血样本的处理：1、使用镊子小心地揭去杂交区的盖玻片2、将样本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各一分钟以便充分地脱水。将片子风干后就可以进行重复的杂交了。二次杂交中建议将变性的时间缩短一半，但不得少于3分钟。如果对同一样本还要进行三次杂交，变性的时间就无需减少了。对于多次杂交，复染液浓度的降低有利于保持探针的亮度。曾有报

7、道在同一样本片上进行了多达8次的FISH操作。也可对已经进行G带显色的样本片进行FISH操作：将样本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各二分钟以便充分地脱水。将片子风干后就可以进行重复的杂交了。二次杂交中建议将变性的时间缩短一半，但不得少于3分钟。如果对同一样本还要进行三次杂交，变性的时间就无需减少了。H&E去染色由于H&E染色使样本片在荧光显微镜下出现类似自发的荧光，因此有必要洗去H&E染色。以下的步骤并不能洗去100％的H&E，但对于大多数的H&E样本片，建议进行以下操作。1、揭去盖玻片

8、，置于65ºC的预处理液中孵育45分钟。残余的可见染料可在随后的去石蜡操作中被除去2、进行标准的去石蜡预处理操作当将0.1%NP-40的洗液加热时出现混浊，是否正常？加热时洗液出现混浊是正常的，并不会干扰FISH的结果。复合荧光原位杂交和光谱核型分析进展徐岚陈赛娟用染色体核型分析进行细胞遗传学检查，因其实用性和准确性，很快成为染色体异常的常规筛选检查。但是由于核型分析并不能完全适应复杂核型分析的需要，特别对于一些实体瘤组织，不仅染色体改变复杂，而且难以制备有一定质量的中期染色体分裂