2742.探讨小麦硫转运蛋白基因rt-pcr半定量检测体系的建立

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1、科技大学200届毕业论文（设计）题目：探讨小麦硫转运蛋白基因RT-PCR半定量检测体系的建立姓名:专业：生物技术学院：生命科学学院指导教师：完成日期：2004年6月14小麦硫转运蛋白基因RT-PCR半定量检测体系的建立[摘要]应用RT-PCR技术，以Tubulin为内参基因，小麦硫转运蛋白基因(Sul)为检测基因，优化Mg2+浓度、退火温度、循环次数、引物浓度和Taq酶浓度，获得适宜的PCR反应参数，建立一个相对稳定、准确、特异的检测Sul表达量的半定量体系，为进一步研究小麦硫转运蛋白表达调节机制奠定技术基础。[关键词]小麦；Tubulin；硫转运蛋白基因；RT-PCR

2、；半定量PCRToEstablishaMethodofSemiquantitativePolymeraseChainReactionforDetectingSulGeneExpressionAbstractToestablishamethodofsemiquantitativepolymerasechainreactionfordetectingSulphatetransportergeneexpressioninwheatroots，weestablishedasemiquantitativePCRbyputtingprimerofTubulinservedasint

3、ernalreferencegeneandprimeroftargetgeneinthesameconditionsandoptimizingexperimentparametersforPCRsuchastheconcentrationofMg2+andcycletimesetc.ThismethodisusabletotesttheexpressivelevelofSulgeneinthewheatroots.Keywords：wheat；Sulphatetransporter；RT-PCR；semiquantitativePCR前言硫转运蛋白即硫酸盐转运蛋白，是一

4、类主动运输硫酸根时所需的载体蛋白，也是植物体吸收、运输硫元素时的必需蛋白。硫元素是植物生长发育所必需的基本元素之一，它主要以SO42-形式被植物吸收，通过硫转运蛋白进入植物体后，大部分同化为含硫氨基酸（如胱氨酸，半胱氨酸和蛋氨酸）和辅酶A﹑硫胺素、生物素等维生素。因此硫转运蛋白植物原生质构成、能量固定、光合作用、固氮作用提高植物抗逆性等方面起到非常重要的作用。14近年来，由于农业生产的提高增加了单位面积上养分的输出，不含硫或含硫少的肥料的使用量增加，作物秸秆还田少或作其他用途，导致土壤缺硫现象越来越严重。硫缺乏已成为很多地区限制农业生产的重要因素之一，因而研究硫转运蛋

5、白对提高小麦吸硫效率﹑提高小麦品质与产量有着非常重要的意义。为了进一步探讨硫转运蛋白基因调控机制，有必要建立一种灵敏，简便，特异的半定量检测SulmRNA表达的方法。逆转录多聚合酶链式反应(RT－RCR)技术法是近年来发展出来的探讨基因转录水平的有效手段。因此本实验采用小麦为供试材料，以Tubulin为内参基因，Sul为检测基因，应用RT-PCR技术对小麦根部硫转运蛋白基因的表达进行半定量，建立一个特异、稳定的RT-PCR半定量检测体系，为进一步研究其表达调节机制奠定基础。一、材料与方法（一）实验材料采用郑引1号小麦。（二）主要试剂1、主要试剂Hogland营养液，Tr

6、izol，M-MLV反转录酶，Taq酶和PCR其他相关试剂，DNA回收纯化试剂盒，0.5×TBE，琼脂糖。2．引物（1）Tubulin引物：根据Nemoto等设计的扩增小麦Tubulin基因片段的引物合成了上游引物Ⅰ和下游引物Ⅱ。（2）Sul引物：根据小麦硫转运蛋白基因序列TAE分别自行设计和合成上游引物Ⅰ和下游引物Ⅱ。（3）反转录引物：Oligo-d（T）。（三）主要仪器Eppendorf5415D型离心机，RT-200型PCR扩增仪，DYYⅢ型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂），UVI凝胶成像系统。（四）实验方法1．材料准备小麦种子用5%NaClO消毒10min，吸胀

7、24h，萌发48h后，在完全Hogland营养液中光照培养至3叶期。2．总RNA提取取小麦根0.1g，置液氮迅速研磨，加Trizol1000ml，室温静置5min。加氯仿200ml剧烈混匀，4℃下12000g离心15min。吸取上层水相加400ml异丙醇，混匀室温静置10min，4℃下12000g离心10min。小心弃上清，沿管壁加75％乙醇1000ml洗涤管壁。加75％乙醇1000ml涡悬，4℃下8000g离心10min。小心弃上清，短暂离心，吸取所有上清，沉淀于超净台下干燥，加20mlDEPCH2O溶解。取5ml总RNA稀释100倍，