分析肌肽对动物糖代谢

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1、分析肌肽对动物糖代谢【摘要】目的研究肌肽对应激负荷小鼠糖代谢的影响。方法将雄性KM小鼠分为正常对照组、应激对照组、150mg/kg及300mg/kg肌肽给药组,每天灌胃给药1次,连续给药7d后拘束负荷应激20h灌胃葡萄糖2g/kg,检测血糖清除率、肝糖原合成能力、糖原合成酶基因表达及皮质酮水平。结果与应激负荷对照组比较,肌肽能提高应激小鼠血糖消除速率,促进糖原合成酶的基因表达,并增强肝糖原合成能力。此外,肌肽还能降低血浆皮质酮的水平。结论肌肽增强应激负荷小鼠肝糖原合成能力,其作用机制可能与肌肽降低体内糖皮质激素水平、激活糖原合酶有关。【关键

2、词】肌肽;拘束应激;肝糖原;糖皮质激素第7页共7页近年来随着社会环境及生活方式的改变,生活及工作的压力越来越大,由各种应激源导致的亚健康状态人数也逐年增多。人们长期处于应激负荷状态下容易导致免疫力下降,导致各种疾病的发生。肌肽是一种具备高效生物活性的天然二肽,广泛存在于哺乳动物的肌肉组织和神经组织中[1]。研究结果表明,肌肽具有抗氧化抗衰老功能、神经系统保护作用、抗糖基化作用、对肾中毒及肝损伤有一定的改善作用、可防止动脉硬化等生理活性[2,3]。但尚未见肌肽对应激负荷状态下糖代谢改善作用的报道。本实验通过观察肌肽对拘束负荷小鼠血糖浓度和肝糖

3、原合成的影响,以及小鼠血浆中皮质酮变化,探讨肌肽对应激引起的机体糖代谢紊乱的改善作用。1材料与方法1.1试剂肌肽(carnosine)、皮质酮(corticoste??rone)标准品及氢化可的松(cortisol)标准品为美国Sigma公司产品;乙腈(色谱纯)为FisherScientific公司产品;乙酸乙酯和NaOH为广州化学试剂厂产品;葡萄糖购自天津药业;肝糖原试剂盒购自南京建成科技公司;葡萄糖测定试剂盒购自上海荣盛生物药业公司;Trizol购自广州英韦创津生物科技公司;逆转录系统PCR试剂盒均购自北京天根生化科技公司;PCR引物根

4、据GenBank提供的基因序列使用PrimerDesign软件进行设计,引物均由英韦创津公司合成,糖原合酶??2(Gy??2)引物:5′??AACGACAGCCGATGAGT??3′(上游),5′??CTGGCACGAGAAAGGAT??3′(下游),其扩增产物长423bp;以18s为内参:5′??GGGAGAGCGGGTAAGAGA??3′(上游),5′??ACAGGACTAGGCGGAACA??3′(下游),其扩增产物长241bp。1.2实验仪器高效液相色谱系统(日本HITACHI公司);MK3型酶标仪(Labsystem,Finlan

5、d);3??18K型台式高速冷冻离心机(德国Sartorius公司);2720型PCR仪(美国AppliedBiosystems公司);电泳成像系统(美国Bio??RadLaboratories公司);MilliQPlus超级纯水仪(美国Millipore公司);电泳仪及水平电泳槽为日本Mupid公司产品。第7页共7页1.3实验动物体质量18~22g,6周龄SPF级雄性昆明种小鼠32只,购自广东省医学实验动物中心,许可证号SCXK(粤)2008??0002。饲养温度(23±2)℃,照明时间12h/d(7∶00~19∶00),饲养1周后进行实

6、验。1.4动物分组及给药将小鼠随机分为正常对照组、拘束应激对照组、150mg/kg及300mg/kg肌肽给药组,共4组,每组8只。肌肽给药组以0.1mL/10g灌胃给药,正常对照组和拘束应激模型组均灌胃等量空白水,每日1次连续给药7d。除正常对照组外,所有小鼠均在末次灌胃后30min进行拘束应激实验,小鼠拘束装置参照文献[4]制作,为通风良好的50mL尖底聚丙烯塑料离心管,给予一次性拘束20h(12:00~次日8:00),拘束期间小鼠不能进食饮水。正常对照组小鼠为禁食禁水小鼠。1.5小鼠糖耐受实验[5]上述各组实验动物在禁食和拘束结束30m

7、in后灌胃葡萄糖2g/kg,口服葡萄糖后0、20、40、60及80min尾静脉取血于肝素钠小离心管中,5000r/min5min离心,取血浆用葡萄糖测定试剂盒测定血糖浓度。1.6HPLC测定小鼠血浆皮质酮的含量第7页共7页取小鼠全血置于肝素处理过的离心管中,以5000r/min离心5min分离血浆。取0.5mL血浆,并添加入2mL乙酸乙酯振摇萃取,分离得到上层乙酸乙酯液,下层水液再用乙酸乙酯萃取1遍,合并乙酸乙酯液后用0.1mLNaOH洗1次,再用蒸馏水洗2次。乙酸乙酯液置于氮气下挥发吹干后加入100μL流动相(乙腈∶水=38∶72,体积比

8、)溶解即得皮质酮分析样品溶液。按Woodward等人的方法,采用HPLC内标法(内标物为cortisol)测定血浆中皮质酮含量[6]。检测条件为:紫外检测,检测波长为254nm;