病毒的分离鉴定

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1、--病毒的别离与鉴定要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，那么必须满足以下原那么：①从患病者体别离出病毒；②在实验动物或寄主细胞中可以培养；③证明这种培养物具有滤过性；④在原始宿主或相关种属能产生同样的病症；⑤能重新别离出病毒。1.病毒的别离1.1标本的处理1.1.1标本的收集a)粪便标本：将5g粪便标本和50mlPBS放入盛有20-25颗玻璃小珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的液体尽量

2、挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g4℃离心30min。c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时参加足量的PBS制备成20%的悬液，3000×g4℃离心30min。1.1.2除菌处理a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。-.word.zl---a)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用4小时。b)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，那么可参加等量的乙醚4℃过夜除菌。1.1病毒的别离培养病毒是严格

3、的细胞寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物〔动物接种〕、鸡胚〔鸡胚接种〕或离体细胞进展别离培养〔细胞培养〕。1.2.1鸡胚接种a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以的受精卵以保证规格质量上的一致。b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱进展,气室向上，孵育的最适温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况〔二天一次〕。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模

4、糊的阴影。②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵有一小黑点〔鸡胚〕，有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，那么可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。d)接种：-.word.zl---图2.鸡胚羊膜腔接种：用12～14天鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊水检查。常用于流感病毒的初次别离。图1.鸡胚卵黄囊接种：用5～8天鸡胚，以细长针头由鸡卵气室端刺入卵黄囊。孵育后取获卵黄囊膜检

5、查。常用于某些嗜神经病毒的别离。图3.尿囊腔接种用9～12天鸡胚，将标本接种于尿囊腔,孵育后取尿囊液检查,常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等。图4.绒毛尿囊膜接种：用10～l2天鸡胚，以无菌手续在蛋壳上开—小窗，然后将材料滴在绒毛尿囊膜上．孵育后。观察膜上有无斑点病变。常用于培养单纯疱疹病毒、天花病毒和痘病毒。a)剖检及收获收获前鸡胚应置4℃冰箱过夜，使鸡胚血液凝固。收获时，用碘酒将气室部卵壳消毒，将气室处卵壳剥去〔不要将碎片落入壳膜〕。然后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压，〔切勿压破卵黄囊〕再用

6、吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶，于低温保存。b)优缺点优点：技术简单、来源充分、价格低廉、数量可大、不需特殊设备。缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。1.2.2细胞培养-.word.zl---细胞培养(cellculture)是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至2～4个细胞团悬液进展培养。根据细胞的类型和培养细胞代数的不同，可将其分为两种：原代细胞培养；传代细胞培养。组织细胞培养的病毒，当出现稳定的细胞病变后，就可取培养液或培养液与细胞培养物混和物，细胞培养物中的

7、病毒可采用冻融、超声波等方法使其释放出来。优点：a)每个细胞生理特性根本一致，对病毒易感性相等；b)无个体差异，准确性和重复性好；c)可严格执行无菌操作；d)细胞培养本身就能显示病毒的生长特征；e)应用空斑技术可进展病毒的克隆化。1.病毒的鉴定1.1形态学鉴定细胞病变效应〔cytopathiceffect，CPE〕：病毒在细胞增殖后，可引起细胞的不同变化。常见的形态学改变如细胞圆缩、聚合、溶解或脱落。CPE出现的时间是鉴定病毒的标志之一。某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，在普通光学显微镜下

8、可见胞浆或胞核出现的呈嗜酸性或嗜碱性染色、大小数量不等的圆形或不规那么形的团块状构造，病毒学上称为包涵体。1.2血吸附和血凝作用-.word.zl---多见于以出芽方式释放的病毒。血吸附指感染细胞具有吸附红细胞的能力；血凝作用指感染细胞的培养液中有许多游离病毒存在，具有凝集红细胞的作用。1.1.1血吸附实验具有血凝能力的病毒能使感染的细胞吸附红细胞，这种现象被称作吸附作用。大多数粘液病毒能引起吸附。具体检验步骤如下：a)用PBS配制10%的豚鼠红细胞悬液，4℃保存，用前按需要量稀释成0.5%的浓