制备小鼠骨髓来源巨噬细胞

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1、------------------------------------------作者xxxx------------------------------------------日期xxxx制备小鼠骨髓来源巨噬细胞【精品文档】制备小鼠骨髓来源巨噬细胞一、材料1.6-9周小鼠（GFP+小鼠、野生型小鼠）2.配制培养液：RPMI1640培养液+1×GlutaMax（Gibco）+10%FBS（热失活）3.盐溶液：0.9%氯化钠溶液（无菌），储存于4度。4.纯化的重组M-CSF（CSF-1）：到货后灭菌PCR管分

2、装。5.消毒后的手术器械。6.70%乙醇溶液。7.27G针头8.20ml注射器9.低绒纸巾10.100mm培养皿11.3个50ml离心管二、方法1.复温培养液（预添加M-CSF）至37摄氏度。2.处死小鼠，喷洒70%乙醇溶液消毒。拉扯双侧后腿直至听到清脆响声（提示股骨从髋骨脱臼）。3.使用干净的剪刀、镊子沿一侧大腿环形剪开皮肤，向爪子方向剥离皮肤。4.用镊子将腿部肌肉分开，露出股骨和胫骨（注意不要损伤骨头）。5.切断股骨与髋骨间的韧带，切下膝关节以下的骨头。将股骨和胫骨至于冰冷的盐溶液中。6.同法处理另一只腿

3、。7.用低绒纸巾小心剥除骨骼上附着的组织，将骨头置入70%乙醇溶液中。8.20ml无菌注射器吸满预热的培养液（无添加M-CSF），装上27G针头。并准备好50ml离心管。9.从膝关节处分离股骨和胫骨，丢弃膝盖骨。一个无菌镊夹住股骨，用一把无菌剪刀剪掉股骨上端。将针头插入骨髓腔，用培养液反复冲洗，将骨髓冲入50ml离心管。冲洗过程中，上下移动针头刮扫骨髓腔。每根骨头使用大约5ml培养液。丢弃骨头。10.同法处理胫骨（剪掉上下两端）。11.将细胞悬液离心（150g，5分钟）。丢弃上清，加入培养液（添加M-CSF）

4、。混匀细胞悬液。12.每根骨头准备两个100mm培养皿。将细胞悬液打入培养皿，添加预热培养液（添加M-CSF）至10ml。13.置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱内培养5天。14.第5天，使用室温盐溶液5ml冲洗培养皿（巨噬细胞为贴壁生长）。使用细胞刮刀刮下贴壁细胞，转移入离心管，150g离心5分钟。分离的细胞建议2天内使用。关于M-CSF的工作浓度：介于1ng/ml到1ug/ml之间。【精品文档】【精品文档】设定浓度梯度培养：如1ng/ml10ng/ml100ng/ml1ug/ml，或倍比稀释。按上述方法培

5、养5日后，细胞计数5×107/培养皿为最合适M-CSF工作浓度。【精品文档】