鲎试剂

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1、内毒素限值：内毒素限值的建立药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg·h)表示，注射剂K=5EU/(kg·h)，放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg·h)，鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg·h)。M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml(kg·h)、mg(kg·h)或U/(kg·h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足

2、1小时，按1小时计算。最大有效稀释倍数（MVD）最大有效稀释倍数是指供试品溶液被允许稀释的最大倍数数（1—MVD)，在不超过此稀释倍数下可进行内毒素限值的检测。MVD=cL/ƛ式中L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，C的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，计算供试品的最小有效浓度C=ƛ/L。ƛ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使

3、用的标准曲线上最低的内毒素浓度。鲎试剂鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和(1,3)-β-葡聚糖.普通鲎试剂灵敏度0.5～0.125EU/ml，适用于仅需要检测内毒素限量的样品。高灵敏度鲎试剂灵敏度0.06～0.015EU/ml，适用于内毒素限量较低的样品细菌内毒素检查。特异性鲎试剂灵敏度0.5～0.015EU/ml，适用于成分较为复杂，会对鲎试剂产生干扰

4、的样品。定量法鲎试剂最低检测限0.03～0.005EU/ml，适用于需要对内毒素进行定量测定的样品。鲎试剂法利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。鲎试剂按实验方法可分凝胶法（定性或半定量测定）光度测定法：浊度法显色基质法实验原理图凝胶法通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生

5、了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。凝胶法:对鲎试剂灵敏度复核根据鲎试剂灵敏度的标示值（），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2ƛ;、ƛ;、0.5ƛ;和0.25ƛ;四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取含有分装了0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，及每一个浓度平

6、行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃适宜恒温器中，保温60分钟±2分钟。将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°时，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；形成的凝胶不坚实、变形或从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。凝胶法:对鲎试剂灵敏度复核当最大浓度2ƛ管均为阳性，最低浓度0.25ƛ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎

7、试剂灵敏度的测定值ƛc。ƛc=antilg(X/n)式中X为反应终点浓度的对数值（lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度；n为每个浓度的平行管数。当ƛc在0.5〜2ƛ(包括0.5ƛ和2ƛ)时，方可用于细菌内毒素检査，并以标示灵敏度ƛc为该批鲎试剂的灵敏度。凝胶法:干扰实验只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。

8、其他情况则认为供试品在该浓度下存在干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。凝胶法:干扰实验可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法(如过滤、中和、透析或加热处理等)排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。当进行新药的内毒素检査试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。当鲎试剂