腺病毒包装流程及操作

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1、腺病毒包装流程及操作重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。重组腺病毒具有以下几个显著优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织；感染效率高达100%，可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染；对外源基因容载能力大（可以高达8Kb）；不整合基因组；滴度高，操作方便。因此，重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。目前常用的腺病毒载体基于人腺病毒5型（Ad5），其基因组是36Kb长的线性双链DNA。腺病毒可通过自身的纤维（fiber）和细胞表面的受体结合被内吞进入细胞，然后从内吞体（endosome）

2、转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装。一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。目前最常用的腺病毒包装体系有AdEasy和AdMAX两种，其共同特点是目的基因首先克隆到穿梭载体，然后再重组到腺病毒的大骨架上。这两个系统均具有腺病毒早期转录复制基因E1和E3的缺陷(ΔE1,ΔE3)，其中E3基因对病毒产生并非必需。因此，腺病毒包装必需依赖表达E1的细胞系，例如HEK-293，HEK-293A等。相对于Adeasy系统，AdMAX系统操作便利，并且可以获得更好的病毒滴度。本操作说明均基于AdMAX系统，该系统由pHBAd系列

3、穿梭质粒、腺病毒骨架载体pBHGlox(delta)E1,3Cre双载体组成。一、整体实验流程二、实验材料该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（pHBAd系列，包括包括过表达、干扰等类型）和骨架质粒（pBHGlox(delta)E1,3Cre)。1、载体信息（见附1）2、菌株：大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。3、细胞株：293A，腺病毒的包装细胞，表达腺病毒基因E1，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞，生长培养基为DMEM+10%FBS+双抗（DMEM完全培养基）。293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具

4、有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在70%以下，则293A细胞能连续培养3～4个月维持原有的细胞特性。若以购买得到的293A作为第一代，则30代内都能得到最佳结果。随着传代次数的增加，293A细胞会出现生长状态变差、突变等现象。为了防止此类现象的出现，我们需要在初始阶段对细胞进行大量的冻存保种，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，可增加细胞复苏成活率。注：为了达到最好的细胞状态，提高腺病毒出毒效率，推荐在培养基中加入汉恒生物的SaveItTM抗支原体试剂。三、

5、腺病毒包装和浓缩（一）质粒构建和扩增构建有目的基因的腺病毒穿梭质粒和骨架质粒需经过大量抽提，浓度要求大于1g/l，A260/280在1.7~1.8范围内方可用于病毒包装。推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提（质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度）。注：质粒构建推荐使用汉恒生物HB-infusionTM无缝克隆试剂盒。（二）腺病毒包装事先准备好用于包装病毒的293A细胞（50-70%的汇合度）和病毒质粒，转染每个直径为6cm的培养皿成分如下：pHBAd系列穿梭质粒2μgpBHGlox(delta)E1,3Cre4μgDMEM需在37℃水

6、浴中预热，LipoFiterTM转染试剂需恢复至室温方可使用，并在使用前摇匀。转染6h后置换成新鲜培养液。注：1、LipoFiterTM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipoFiterTM说明书。2、转染前细胞必须处于良好的生长状态。（三）病毒收集病毒收集前要观察病毒空斑是否形成。为了限制病毒的扩散而让空斑更好地形成，通常在培养液中加入低熔点琼脂糖，转染后一般在第10至21天可以在显微镜下看到小的空斑。如果穿梭质粒带有荧光蛋白（GFP或RFP），则在空斑形成之前观察荧光，以确定转染效率。空斑形成后将空斑与琼脂糖一起挑起，放入1ml新鲜培养基中过夜。通常挑取3

7、-6个空斑不等，然后比较滴度，使用滴度最高的一个空斑进行后续实验。空斑示意图注：高纯度的低熔点琼脂糖储液可以配制在无菌PBS中，终浓度5%；使用之前用沸水浴完全融化，然后自然降温到45℃待用。用37℃预热的完全培养基稀释5%的琼脂糖溶液到终浓度1.25%，混匀后马上加到去除培养基的细胞上，轻轻地覆盖均匀。6孔板每孔覆盖3ml琼脂糖/培养基。（四）病毒扩增第二天，将培养基中病毒加入新鲜293A细胞培养液中进行病毒少量扩增。至细胞再次出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒，以此病毒为P1代病毒，以P1代腺病毒感染293A细胞，连续进行三代感染，至P4代进行腺病

8、毒的大量扩