琼脂糖凝胶的制备

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1、欢迎阅读琼脂糖凝胶的制备#配制1*TE电泳及制胶缓冲液（用于电泳的缓冲液和制胶的缓冲液必须是相同的）。#在三角锥瓶中加入60ml制胶缓冲液+1.2g琼脂糖粉，制成2%琼脂糖。#在微波炉中加热溶解琼脂糖。（用微波炉加热琼脂糖时，要防止过热引起琼脂糖沸腾溢出。把称量好的琼脂粉先在电泳缓冲液中溶解5-10min，可降低沸腾溢出的可能性）#使溶液冷却到60度左右，加入5ul2%EB（溴化乙锭）溶液。（溴化乙锭见光会分解，致癌物质）#将琼脂糖溶液倒入灌胶盒中，在适当位置插上梳子。灌胶前要确保灌胶盒放置在水平面上。凝胶厚度一般在3-5mm之

2、间。（一般琼脂糖凝胶灌注厚度不超过5-7.5mm。一旦凝胶厚度超过0.75cm，样品的转移效率就会降低，需要更长的时间才能使样品充分转移到膜上。）（溶化的琼脂糖是澄清的，在灌胶盒里冷却的过程中会逐步变得不透明。在胶完全凝固之前不要移动灌胶盒）。（最佳的灌胶方式是在齿梳插入前，把琼脂糖溶液缓慢而匀速的倒入灌胶盒中部，直至整个灌胶盒的表面被覆盖时就可以停止，然后立即插上梳子。会得到均一的没有气泡的凝胶。假如仍然有气泡，可以用灭菌枪头的尖端把气泡挑出或者赶到边缘。）(配制凝胶时，核糖核酸酶（RNase）可能会污染电泳仪器，特别是齿梳部

3、分。虽然可用某些变性剂抑制核糖核酸酶的活性，但是它们可以转移到或干扰后续的实验部分。如果没有其他情况，梳子必须被浸泡在3%的H2O2或是0.5%SDS、50mmol/lEDTA溶液中，再在使用前用大量的无菌水冲洗。不要使用DEPC或30%的H2O2，它们不仅对电泳槽有损害，对使用者也可能造成危险。)欢迎阅读（灌胶盒一定要清洗干净、烘干，否则灌胶后会看到胶下面有大量气泡，这时因为胶与水不相容）#室温下使胶凝固（大约30min），然后放置到电泳槽中，倒上电泳缓冲液（电泳缓冲液刚好没过凝胶1mm为好），拔出梳子。（应给予充分的时间，使

4、胶凝固。拔梳子前把胶浸没在电泳缓冲液中，这样可以减少拔梳子时大气压力造成的影响，降低上样孔底部被破坏的可能性。假如加样孔被破坏却未能察觉，RNA样品上样后会漏掉。）（用最小体积的电泳缓冲液完全覆盖凝胶。因为电流倾向于走电阻最小的路径，也就是说倾向于绕过而非穿过凝胶。所以过多的缓冲液可以降低电泳速度。另外要记得检查边缘处的凝胶，凝胶与盒子的边缘结合处会产生倾斜的截面，如果这部分没有完全没在缓冲液中则不能很好的散热，累积的高温效应会融化部分琼脂糖凝胶。另外要尽量避免在外侧泳道上样，因为凝胶的厚度不均一，外侧泳道的迁移率会不一致（边缘

5、效应）。）#上样。桌面上铺一张EP手套，先在ep手套上点6*buffer1ul，然后加上5ul上样样品或actin内参（也就是把b