1型鸭圆环病毒间接ELISA方法的建立及流行病学调查

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分类号：授予学单位代码：研究生学号：山柬袭業大咢硕士学位化文型鸭圔环病毒间接方泫的建立及流行病学调查研究生：王鑫学科专业：预防兽医学研究方向：分子病原学学院：动物科技学院指导教师：姜世金教授年月日 论文提交日期：论文答辩日期：、学位授予日期：飞学科门类灰孓答辩委员会主席 关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文,是在导师指导下,独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体,均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定,同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文,同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》,并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名： 符号说明英文缩写英文全称汉语名称氨苄青霉素碱基对基因鸡贫血病病毒二甲基亚砜鸭圆环病毒猪圆环病毒型猪圆环病毒型大肠埃希氏杆菌鹅圆环病毒辣根过氧化物酶异丙基硫代半乳糖苷卡那霉素千道尔顿升毫升聚合酶链式反应微克微升 中文摘要前言猪圆环病毒(病原学特征病毒的分子生物学特征流行病学特征的致病机理诊断方法的预防控制鸡传染性贫血病毒病原学流行病学检测方法预防控制鸭圆环病毒(,病原学特征分子生物学特征流行病学特征诊断方法本研究的目的与意义材料和方法检测基因型抗体的间接方法的建立及血清学调查菌种和质粒主要试剂和仪器聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂用于蛋白纯化的溶液的配制 2.1.5ELISA所用溶液引物设计与合成株基因原核表达载体的构建重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达和分析重组蛋白的变、复性及其纯化间接条件的优化间接的操作程序和结果判定进行符合率的验证间接方法的初步应用年山东部分地区肉鸭鸭群基因型血清学调查血清、菌种、质粒及主要试剂重组质粒在大肠打菌中的诱导表达和分析重组蛋白的变性、复性及其纯化检测结果与分析检测基因型抗体的间接方法的建立及血清学调查基因的克隆与鉴定表达产物的分析间接最佳反应条件的建立符合率的验证间接方法的初步应用年山东部分地区肉鸭鸭群基因型血清学调查表达产物的分析表达产物的分析抗体的检测结果基因型、型间接检测结果的对比分析两种已建立的方法的比较基因型鸭圆环病毒与基因型鸭圆环病毒的血清学调查结果比较 3.3.3两型〗数据对比分析检测基因型抗体的间接方法的建立及血清学调查年山东部分地区肉鸭群基因型血清学调查基因型、型间接检测结果的对比分析参考文献谢攻读学位期间发表论文情况 山东农业人学硕学位论文中文摘要鸭圆环病毒(,属于圆环病毒科(圆环病毒属的成员之一,是一类没有囊膜的单链环状病毒。自年在德国由首次报道以来,相继在匈牙利、美国、中国台湾及中国大陆等地发现或报道。本研究建立了型鸭圆环病毒间接检测方法,并对年山东省潍坊和泰安两个主要养鸭地区健康肉鸭群中的流行和分布情况,进行了血清学调查。研究共分为三部分：、检测基因型抗体的间接方法的建立及血清学调查本研究建立了检测基因型抗体的间接方法。采用技术,扩增型部分基因,构建原核表达质粒诱导表达后以纯化的重组蛋白为抗原建立间接方法并初步应用于临床检测。结果显示：基因型基因可在大肠杆囷中定、局效地表达；检测表明,表达的重组蛋白能与鸭圆环阳性血清发生特异性反应；建立的间接方法的蛋白最佳包被量为孔,血清最佳稀释度为阳性的值为。以建立的间接￡方法进行山东省健康鸭群抗体检测结果表明,结果显示：肉鸭场的抗体个体阳性率在,平均为群体阳性率为。、年山东部分地区肉鸭群基因型血清学调查为了解型在山东地区的流行情况,本研究采用实验室已经建立的型鸭圆环病毒间接方法,对年山东省潍坊和泰安两个地区的个肉鸭场份血清进行间接检测。结果显示：肉鸭场的抗体个体阳性率在平均为,群体阳性率为。潍坊地区的抗体阳性率明显高于泰安地区(显示在老养殖区鸭群中污染更加严重。、基因型与型共感染分析分析用检测基因型和基因型抗体的间接方法分别对山东潍坊、泰安地区的肉鸭群进行血清学检测结果,发现型与型的抗体符合率为。泰安地区两型均为阳性的鸭只数为,占总体检测数的,潍坊地区,两型均为阳性的个体为,略高于泰安地区。统计发现基因型和型共感染的阳性率为说明在山东省鸭群中存在比较严重的两种基因型共感染现象。关键词：型鸭圆环病毒；流行病学调查；原核表达；基因；间接 i型鸭网环彳由间抟方注的让…埝丨行从」学岡,° 山东农业大学硕士学位论文。,, 山东农业大学硕±■学位论文“‘——冃圆环病毒科的成员是病毒家族中的最小的成员。早在年,等在细胞系的传代过程中,发现了一种不引起细胞病变(的物质,当时被认为是一种细胞污染物。随后年,等用鹿糖梯度密度离心提取病毒核酸,并用外切核酸酶进行酶切鉴定,再通过电镜观察核酸状态,发现这种物质实际上是一种单链环状病毒,直径为见图,分子量为,并将其命名为猪圆环病毒(用该病毒感染实验动物,发现只有猪产生特异性抗体,而兔、鼠、牛,甚至人都为血清学阴性(。二卷翁職图纯化颗粒乙酸双氧铀着色电镜图根据国际病毒分类委员会(第九次报告(,圆环病毒科包括三个属：圆环病毒属(、圆圈病毒属(、指环病毒属(。圆环病毒属成员基因组转录时能采取双向转录的方式,其中一个幵放性阅读框位于病毒的负链上。以猪圆环病毒型(为代表种,该属的成员还包括：鹤鶴卩彖羽病毒(,■圆环病毒(,,,猪圆环病毒型(,,,金丝雀圆环病毒(鸭圆环病毒(,,海岛雀圆环病毒( 1型鸭岡环沾毒间接方法的建泛流学调海区鸟圆环病毒(八哥圆环病毒(,鹤圆环病毒(,。而圆圈病毒属成员基因组的编码方式是只能由正股编码,目前报道的只有一个成员,即鸡贫血病毒(。第次报告将输血性肝炎病毒(更名为细环病毒(,单列为指环病毒属(成员,该属不仅包括还有细小环病毒(及除感染人类外,也感染灵长动物(。近年来,随着对各种圆环病毒的研究深入,发现圆环病毒给养殖业带来越来越严重,随着养殖场建立的时间和养殖规模的扩大,圆环病毒阳性率也在逐年上升,而且一感染会弓起机体的免疫抑制,造成多种疾病的混合感染,因此需要弓起我们的高度的重视。猪圆环病毒(,猪圆环病毒(是目前发现的最小的病毒,可引起植物、鸟类以及猪等动物发病(。现已知具有和两种基因型。等最早在细胞中发现,不具致病性,广泛存在于正常猪各器官及猪源细胞中,广泛存在于正常猪血清中(。具有致病性,现在已经证明,它是断奶仔猪多系统衰竭综合症(的主要病原,而且是其他诸多传染病的病原之一。该病在我国猪群中广泛流行,给养猪业造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒己经成为严重危害世界养猪业的一种新的重要的传染病,并引起国际上的高度重视。病原学特征病毒的分类与形态是一种小而无囊膜、二十面体对称、共价闭合、环状、单股病毒,病毒例子直径为基因组大小约为分子量为。根据致病性、抗原性和核苷酸序列的差异,可分成无致病性的和有致病性的。和的核苷酸的同源性低于。病毒的理化性质病毒粒子在中的浮密度为,沉降系数。由于该病毒无囊膜,对酸性环境(、氯仿或者高温(°和有一定的抵抗作用,的酸性条件下可存活很长时间,高温(°能存活分钟,°不能将其灭活,但对苯酷、季胺类化合物、氧氧化钠和氧化剂等比较敏感。 山东农业大学硕学位论文病毒的分子生物学特征基因组结构为单股负链环状基因组非常小,基因组全长仅为,为或。同一血清型(基因型)内部各毒株核苷酸序列非常保守,同源性均在以上。两种血清型的基因组中含有几乎一致的病毒复制起点。等将复制起点定位于一长的基因片段中,该片段介于与两阅读框之间,具有多个特征性结构,包括圆环病毒属特有的莲环结构及其顶部保守的核苷酸基序等。与的核苷酸基序仅仅在第一个核苷酸上存在差异。的滚环式复制(从这个核苷酸基序对幵始,对于病毒的复制非常关键,如果这核苷酸基序发生突变将严重影响病毒的繁殖复制。等应用软件对两种血清型的基因组进行了分析,发现两种基因组均可能含有个幵放阅读框(,即、、、、、、、、、禾口各阅读框大小相差悬殊其中、、、方向相同,位于基因组正链；、、、、、、方向相同位,于基因组正链的互补链。基因组突出的特点是阅读框相互嵌套,从而充分利用了圆环病毒有限的遗传物质,是生物进化过程中自然选择的结果(。两种的各阅读框相比较,差异则很明显,核苷酸序列同源性仅为,而核苷酸序列同源性最高,同源性高达。蛋白是最大的开放阅读框,全长位于基因组正链,由病毒正链转录合成,顺时针排列,编码与病毒复制相关的蛋白。蛋白与病毒基因组的滚环复制相关。由或组成,蛋白分子量为或。与相比较,核苷酸同源性为,蛋白氨基酸序列同源性达这也是种血清型病毒产生抗原交叉性的主要原因所在。蛋白仅有个糖基化位点,位于蛋白则含有个糖基化位点,、及。蛋白具有与典型滚环复制(相关的个保守基序、、以及结合的环(结构(序列为这些结构相对于维持蛋白的功能至关重要,突变或缺失均会影响病毒的复制。系统 1型鸭阿环病毒间接方的佳：设流厅沾学调杏：发生学分析表明,圆环病毒的蛋白可能是植物病原的蛋白与小样病毒(如嵌杯样病毒)的结合蛋白或原核生物的解旋酶发生重组的结果。蛋白位于病毒基因组的负链逆时针方向排列,主要编码的病毒结构蛋白蛋白,构成病毒的核衣壳,由病毒互补链转录合成,在病毒感染细胞后在宿主各种酶的参与下产生金冬雁等,。的蛋白分子量为为,二者都只有一个糖基化位点,在蛋白的氨基酸(糖基化,的蛋白的糖基化位点在位。分子量却相差较大,可能是由于的衣壳蛋白存在许多翻译后修饰位点,如磷酸化、硫化、甲基化、乙酞化等引起的。等(对基因(即基因)进行一系列突变表明,蛋白的核内定位与其端的个氨基酸密切相关(李媛等,；杨家华等,；进一步研究发现,位于位及位的氧基酸对蛋白的核内定位起着决定性的作用。目前,对病毒的序列分析表明：的编码个氨基酸残基,而的编码个氨基酸残基。两血清型之间核苷酸同源性为,氨基酸同源性为。与比较,有较大的变异,有研究者推断变异之所以较大可能是衣壳蛋白的变异与病毒的致病性有关,推断的依据在衣壳蛋白是病毒侵入细胞与宿主细胞蛋白因子相互作用的决定因素。序列分析结果也表明的蛋白的末端为碱性氨基酸富集区,序列高度保守。等将的克隆到杆状病毒表达载体上,转染昆虫细胞进行表达,表达产物的分子量为,与从纯化的病毒粒子中检测到的蛋白大小相似,在电子显微镜下观察,这个重组蛋白可自我组装为核衣壳样粒子,从而进一步证实基因编码病毒的核衣壳蛋白。白勺研究进展的位于病毒基因组负链,逆时针方向排列,与完全重叠,有个核苷酸,编码个氨基酸,具有个糖基化位点。为研究的功能,他们将、基因分别在或细胞中进行瞬时表达,发现基因表达的细胞出现了与病毒感染类似的细胞凋亡现象(而用缺失的感染细胞,发现凋亡活性大大降低,推测基因是诱导细胞调亡的主要因素。通过间接影响基因的表达来对细胞调亡产生作用,是人体及其他动物细胞内整个基因组中最强大的抑癌基因,它的正常工作能调节多个重要的细胞过程,包括细胞生长和死亡、修复和血管生成,它是最重要的细胞管 山东农业大学硕士学位论文理者”,当发生异常,人体或其它动物会处于一种危险状态,而与有密切的关系,是泛素连接酶)家族中的新成员,由诱生,反过来有发挥泛素连接酶的功能使发生多聚泛素化而被蛋白酶水解,形成典型的负反馈调节。蛋白可与反应,导致在细胞中的定位的更改以及稳定性降低,导致与之间平衡系统被破坏,使基因表达量升高,而持续高水平表达则会导致细胞调亡。等(通过点突变将缺失,并通过质粒拯救病毒技术研究发现的缺失并不能影响病毒的复制(,；,。后来,等又将他们构建的缺失的接种周龄小白鼠,同时设置野生型病毒(接种对照。接种后天,接种两种病毒的小白鼠都发生了的阳转,但不同的是接种的小白鼠体内抗体明显比接种的小白鼠高,同时接种病毒小白鼠血清中病毒基因组的拷贝数明显升高,。组织病理学研究结果也显可造成淋巴组织的损伤,而在接种动物的淋巴细胞中却未发现明显的病理变化,且在小白鼠淋巴结中的病毒含量更高,说明基因在病毒的致病机理中占有重要的地位。年等人推测流行毒株对于家猪和野猪中存在明显差异,对德国野生猪(和家猪(的分布重叠较大区域进行了和〇与基因库序列比对分析,家猪感染的属于型,是型,野猪则分别为和结果证实了上述推测(。流行病学特征世界流行及分布情况针对引起的疾病而言,加拿大是首次报道的国家(。血清学调查表明,当前世界绝大多数国家抗体水平均呈阳性。德国、加拿大和英国猪群中的抗体阳性率甚至可高达、和。墨西哥和阿根廷等过也有感染的报道。英国在年首次暴发由引起的以来,的流行相当严重,年以来,在英国呈上升趋势,发病率为最高可达比猪癌和口蹄疫造成的经济损失还要大。韩国主要养猪地区普遍存在,发病曰龄在日龄(。在我国,也在猪群中普遍感染。郎洪武等(郎洪武等,用方法检测来自河北、河南、山东、北京、天津、吉林等个省(市)个猪群,结果显示, 1型鸭环病毒间接方法的泛流行病学调杏’日龄未断奶仔猪抗体阳性率为,育肥猪的阳性率为。王忠田、杨汉春等王忠田等用方法对我国北京、天津、河北、山西、深圳、广东等省(市)的个规模化猪场发病猪群进行感染的流行病学调查发现阳性率为。到现在为止,从黑龙江省到海南省,中国的大部分省份和地区都报道了的发生。流行特点猪群可通过粪便和鼻分泌物排出,在不同猪个体之间进行传播。这种病毒在不同猪群之间的传播方式尚不为所知；但是,和其他病毒的传播一样,不同猪群之间的移动很可能是主要的传播途径。由于这一病毒结构简单,非常能耐受不良环境,所以也可能通过鸟类、哨齿动物如鼠等带毒,也可以通过衣物和设备引起传播。有试验表明,从流产猪和死胎中检测到病毒,也有报道外观正常的公猪精液中可检测到因此可能存在病的垂直传播,从而导致繁殖障碍(。混群、应激、高密度饲养等因素可诱发仔猪发病。的致病机理免疫抑制侵入机体后,猪体内广泛的树突状细胞和其它抗原递呈细胞都被感染,但它对这些细胞的功能到底造成了多大的损害,仍有待研究。研究表明,对感染组织中淋巴细胞的侵害最为严重(,。贾贝贝等认为感染的演化是病原与宿主免疫系统相互作用的结果(。如果免疫系统及时有效地阻止、消灭病原或破坏其毒力机制,疾病就不会发生。病毒对免疫体系的这种侵害有以下几种可能：、病毒直接引发细胞病变；、病毒繁殖导致免疫体系功能允进,进而造成功能衰竭；、病毒或病毒特定基因产物导致免疫抑制；、免疫体系对非感染细胞的非特异性清除,但真正的致病机理有待研究。免疫系统在感染致病机理中发挥轴心作用(丨。抗原递呈细胞是主要细胞和依赖性细胞激活以及增殖的前提,因此感染该病毒会影响细胞和细胞的数量。研究表明,患猪外周血液中的单核细胞数量增加,细胞(主要和细胞数量却减少,并出现了低密度的未成熟粒细胞,由此可见发病猪细胞免疫功能大大降低,缺乏有效的免疫应答能力。等研究发现猪在感染后细胞数量减少同时溶解酶分泌增加。在猪发生的过程中,和免疫相关性细胞存在着不同的关系,吞噬细胞的有效激活是该病发生的启动因素,但免疫抑制却是患畜的最终结果。 山东彳权业人学硕士学位论文混合感染对疾病的诱发和促进作用在早期的实验模型中,单独接种,只会造成具有轻微的特征性的组织学损伤的轻微临床病例(,但是如果与其他病原,如、、猪链球菌共同感染,则会发生具有严重的组织学损伤的严重临床病例。等的研究认为,在运用原位杂交检测与的分布时,发现其常常感染同样的巨细胞。而则指出,目前所报道的所有毒株都对有增效作用。有些学者已经在实验室复制出,但也有一些学者通过试验表明’单独接种在猪中不能复制出具有严重临床症状的,说明的单独感染可能还不足以引起必须要有其他因素的参与才能促进疾病的发生曹胜波等,。感染后猪体内革细胞的变化猪圆环病毒在机体内存在着组织嗜好性,这也可能是多种不同临床疾病与相关的原因之一。等对妊娠期的、、的胎儿子宫内接种,同时对曰龄的仔猪接种。接种后用不同细胞标记物的双免疫突光标记和抗体对心脏、肺脏、肝脏、脾脏和腹股沟淋巴结的感染细胞进行定位和免疫分型。胎儿期,在心肌细胞、肝细胞和巨噬细胞中检测到病毒抗原,随着接种时胎儿日龄的增加,感染细胞的数量减少。心脏含有的感染细胞的数量最多,心肌细胞是主要的祀细胞。对新生仔猪来说,巨嚼细胞是不同组织中唯一的感染细胞,感染细胞的数量与妊娠期第天接种胎儿时的感染细胞数量相似。此研究表明的祀细胞在胎儿期是心肌细胞、肝细胞和巨唾细胞,而出生后只有巨嘴细胞。诊断方法血清学诊断酶联免疫吸附试验(具有灵敏、快速等特点,并适用于大规模病毒抗体的检测。目前主要有间接、竞争、抗原捕获等。等研究了两种间接方法。第一种以细胞培养旳全病毒作为抗原(,第二种以重组杆状病毒表达产物作为包被抗原(,分别用于检测针对全病毒和病毒核衣壳蛋白的抗体。结果表明两种方法均具有很好的重复性、敏感性,与猪细小病毒(及蓝耳病毒的抗体无交叉反应,其检测结果与非常一致。缺点是不能 1型鸭岡环病毒间接方的■：及流行病学调区分与抗体,病毒培养物滴度低,纯化困难,推广难度大。而使用方法时,表达产量高,且易纯化,不存在与抗原交叉反应问题。可以有效地区分和的感染(张琦等。等首次建立竞争方法(来检测抗体。该方法用细胞培养的病毒(作为抗原。用特异性单克隆抗体作为竞争制剂建立了竞争方法,并利用此方法与方法的检测结果进行了比较。对英国、加拿大和法国的份阳性的猪血清的检测结果显示,竞争方法的检出率为,高于的检出率(,可见该方法敏感性和特异性很好,可用于抗体的大规模检测。病原学诊断病毒的分离与鉴定从感染组织中,如淋巴结和肺脏中进行病毒分离时,用氯仿处理,可以除去有囊膜的病毒。细胞培养病毒时,常使用氨基葡萄糖处理感染细胞,用来提高病毒的增殖量。在病毒接种后后,用免疫组化染色、间接荧光抗体法、原位核酸杂交、或电镜观察等方法来验证是否有的存在(。聚合酶链式反应(检测技术常规王宪文等(王宪文等,建立的检测猪圆环病毒型的方法,在检测时以猪痕病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒等作为对照,结果显示对照病毒均为阴性。有研究表明用的方法可从已获取的毒株中扩增出相应的片段,但扩增其他病毒时均为阴性,测序时发现常规的特异性较高。同时,在病毒含量极少的样品中也能检测出的。证明常规具有较高的特异性和敏感性。复合复合能够同时检测种以上的样品,就是在同一次扩增中加入多对引物时,可扩增出多个目的基因片段(魏娟等。等(建立的复合法可检测和区分、和,并具有较高的灵敏度。崔尚金等(崔尚金等,建立的多重方法可同时区分和。声银华等(戶银华等,所用的复合法,在一次扩增中就能对和进行鉴别,为的快速检测和相关疾病的快速诊断提供了便利条件。套式： 山东农业大学硕！：学位论文等建立的多重套式具有较高的敏感性,是普通多重敏感度的倍,同时对第一次扩增的特异性在第二次扩增时还可进行鉴定。等也证明套式在的检测中具有更高的敏感性(。套式在模板含量很少的情况下也可检测到基因组的存在。但是该法极为敏感,在操作过程中稍有不慎就会出现假阳性结果。定量竞争性：该法直观、简便并能进行比较准确的定量(魏娟等。吕艳丽等(吕艳丽等,试验证明,竞争性在检测时具有较高的检出率,与常规相比检出率提高了。崔尚金等(崔尚金等,采用内标竞争模板,不仅降低了非内标性模板不同反应间的差异,而且剔除了假阴性。在对分离株的检测中,利用探针劳光定量具有较好的特异性(罗玉均等,。定量有望成为研制疫苗和研究发病机理的有效方法(慕泽鑫等。：该方法针对引物序列在各种样品间的保守性和酶切点的特异性,可检测来自不同地区的毒株,并进行分型,将会在及相关疾病的研究中发挥重要作用(魏娟等,。等(建立的法,在用于的致病性研究的同时可用于不同区域感染情况的检测。研究表明,用对进行快速检测是可行的,该法为相关疾病的诊断幵辟了新思路(。原位核酸杂交检测技术用地高辛标记的探针做原位杂交检测病毒,然后用原位杂交技术研究在病猪体内的病毒分布情况。快速检测的原位杂交技术是建立的,此方法利用荧光标记的探针,与细胞中病毒核酸、福尔马林固定后经石錯包埋组织中的病毒核酸进行杂交,大大缩短了杂交方法检测的时间。间接免疫荧光技术(此法适合对细胞培养物中的进行检测。或两种高免血清可以分别与接种的细胞培养物反应,虽然两种血清与反应会出现一些交叉反应现象,…同型核原与抗体反应时,血清的效价要明显的高于异型反应的效价。的预防控制是一种严重影响猪生长发育的致病因子,给养猪业带了了极其严重的后果,同时它能引起严重的免疫抑制,造成机体的免疫应答水平降低,从而引起了各种病原的 1型鸭岡环病毒间接方丨：的雄、：流行病学调混合感染。加强饲养管理：降低饲养密度、减少环境应激因素、控制并发感染、实行严格的全进全出制度、保证猪群稳定的免疫能力、加强猪场周围和内部的生物安全措施、购猪时保证来自无此病毒的猪场,这些都是预防疾病,降低经济损失的有效措施。制定合理的免疫程序：科学的免疫程序对预防本病至关重要。做好猪场猪癌、猪伪狂犬病、猪细小病毒病、气喘病和蓝耳病等疫苗的免疫接种,从而确保仔猪的安全是关键。药物预防：预防性投药和治疗,对控制细菌源性的混合感染或继发感染,是非常可取的。目前对于引起相关猪病的病原和机制尚未完全了解,不能针对其进行特异性的预防,只能开展有效的综合性措施,来保证良好的效果。鸡传染性贫血病毒(病原学历史背景年日本岐阜地区给一批商品鸡免疫疫苗预防马立克氏病(’时,发生免疫失畋的事故。在追查事故起时,等人当时认为,它与疫苗污染了网状内皮增殖病病毒(有关(,。但在他随后的研究中发现,此批疫苗可以引起鸡的贫血。年,円本学者在免疫马立克氏疫苗的鸡中分离到了一种可以在鸡体内连续传递并引起雏鸡贫血死亡的病原,并暂命名为鸡贫血因子(。因为此事,他们也马上意识到马立克氏疫苗可能作为一种传播媒介,会导致鸡传染性贫血病毒的广泛分布。其实此病毒少早在年就出现在等描述的一种造血功能被破坏的患马立克氏病的鸡只中(。后来,从这些病鸡的肿瘤细胞(液氮保存)中分离到了株(。年,取得了一项重大成果,可以在某些淋巴瘤细胞系中繁殖。对某些淋巴细胞系有致病性(如,而且不能在当任何常规单层培养细胞内复制(。这个发现使病毒可以在体外进行病毒中和、免疫荧光检测等试验,通过感染细胞更易于纯化病毒,使得的病毒学研究更加广泛。鸡贫血因子(经其形态学和生化特性确定后(被重新命名为鸡贫血病毒(,而从逻辑上讲,致病的病毒应 山东农业人学硕学位论文该称为鸡传染性贫血病毒(。年,国际病毒分类委员会第六届病毒分类报告根据的病毒粒子大小及其核酸特征,将其与猪圆环病毒(和鹤鹤卩彖羽病病毒(归为一■科,成立了新的圆环病毒科(,。随着以后的研究发现,同其他圆环病毒的序列、抗原表位、复制机制及形态相比,有明显不同,第七届国际病毒学分类委员会又将归为圆环病毒科,环形病毒属(。目前,该属只有—个成员。现在已经有很多国家分离到了病毒,如中国(崔现兰等,、很多欧洲国家(、美国(,、南美(,、澳大利亚(、南非(和新西兰(等。近年来,巴西、印度、尼日利亚等国家也相继报道了该病的流行情况。具有世界蔓延的趋势,而且受到现代商品鸡不良养殖环境的影响,已成为造成养禽业巨大经济损失的主要病原之一(。分类地位及基本特征年第六届国际病毒分类委员会(将其与和归为一类,成立了一个新病毒科,命名为圆环病毒科,它们具有圆球状形态、单股环型结构、无囊膜等共性,但三者之间并没有相同的抗原决定簇,粒子的表面结构和转录方式也各不相同。因此,在年第次国际病毒分类委员会报告后,被归为圆环病毒科(陀螺病毒属(郭志儒等,。等和等在比较了输血传播病毒(、样小病毒(与的大小、形态、浮密度和沉降系数、基因组结构以及病毒的复制和转录调控上的差异和相似性后,一致认为三者都是共价闭环单链具有一系列动物圆环病毒的典型特征；并且与、差异较大,而与和构成一种渐进的相似性(,因此建议把这种病毒共同归为一个新家族一“副圆环病毒禾斗”。游离为环状举股负链基因组大小为或,无囊膜,球形,直径约,能通过直径的滤膜,呈齿轮状,二十面体对称,有精细的表面结构。对理化因素的抵抗性很强(,能抵抗“ 1型鸭环病毒间接方的建、流行学调氯仿(和乙酸分钟、小时、°小时或°分钟及大部分常用浓度的商品化消毒剂。最近等(报道在周龄的肉用种母鸡群中分离到一个毒株,其理化性质包括热稳定性、离子大小、和氯仿敏感性与现有—致,但、病毒中和试验、免疫荧光试验和蛋白质印迹证明其抗原性与现有有差异,因此将其划为另一个血清型,即血清型。理化特征属于圆环病毒科,无囊膜,直径,球形,有固定的表面结构,病毒衣壳由个结构亚单位以二十面体的形状组合而成,为典型的、、次轴对称。在中浮密约。对理化因素的抵抗力很强,对丙酮、氯仿、乙醚等脂溶性有机溶剂均有抵抗力,能在条件下内保持活性。°或和仍有活性,可部分失活,可完全失活。病毒对酌敏感,多数消毒剂如季胺盐类化合物、中性阜、磷二氯苯溶液在°不能完全灭活。十二焼基硫酸钠°反而增强其感染力,福尔马林°可完全灭活。有报道证明不能凝集猪、猴、鸡或者绵羊的红细胞。病毒的基因组结构于年首次分析了的全部基因组,其长度为左右,位于非编码区内含有个的重复序列,大多数毒株非编码区有个重复序列。以滚环方式复制,只产生一个个核苷酸的具有多顺反子特性的转录子,具有个部分或完全重迭的幵放阅读框架(,约为、、完全位于内,与有部分重叠,不同的读码框只有唯一的启动区和多聚腺苷的信号区(。在感染鸡体内,胸腺、肝脏含有大量的,肝脏、法氏囊含有少量的。在感染的细胞中,除含有外还含有等量的复制型,主要为双股开环、闭环和线性的。世界各地分离到的不同株,其基因组差异约在,说明只有个血清型。和比较了日本分离的株病毒,应用交叉中和试验和间接焚光抗体试验比较了抗原性差别,发现株均为同一个血清型。但等(,报道,分离自周龄的株病毒与现有毒株不同,不能使用现有的特异引物经扩增出条带,也不能和特异性探针发生杂交反应,可能存在另外一个血清型。我国分离到的毒株,经基因序列比较和酶切图谱分析,属于同一个血清型。 山东农业大学硕士学位论文病毒编码的蛋白基因组单链有个部分或完全重叠的开放阅读框(编码衣壳蛋白、编码相关蛋白、编码细胞调亡因子见图。关于这三种蛋白质功能的研究己有不少报道。‘：—‘图基因组结构示意图,分子量大小约为是纯化的游离病毒子表面唯一的衣壳蛋白,也是构成中和性抗原位点的组成成分。等研究发现,的端含有主要由精氨酸组成的一组氨酸残基一组蛋白前体,能够与链牢固地结合在一起保护的功能。分子量大小约为位于感染细胞核内包涵体中,游离的病毒子中未发现明显蛋白的存在,但在病毒感染细胞中却表达了。通过免疫沉淀分析表明(黄建芳等和可进行直接的相互作用,意味着非结构蛋白可能作为支架蛋白(在的病毒装配和核酸复制过程中起着重要作用。和的研究发现,在杆状病毒昆虫细胞表达系统中,单独或的表达产物或其简单混合物不能刺激鸡产生中和抗体,而用与共同表达的重组病毒表达产物免疫鸡则可诱导中和抗体产生(。这表明参与了中和抗原表位的组成,推测是和共同组建了中和性抗原位点,其详细特性及其与宿主的相互作用有待进一步研究。蛋白分子量大小约为,是的非结构蛋白,在病毒感染细胞中表达, 1型鸭岡环病毒间接方的沾、及流行学调是最早表达的蛋白,缺失的端,病毒的复制速度明显降低(,这意味着可能参与了病毒的转录或复制环节。发现编码的能诱导鸡单核细胞产生调亡(作用。它通过与宿主染色质的相互作用而直接引起细胞凋亡,造成细胞程序性死亡(主要是造血细胞和淋巴细胞的程序性死亡,进而造成感染鸡的贫血、出血及免疫抑制(陈为民等,。因此,他建议将命名为凋亡素(。这是目前唯一已知道的致病机制。与整个诱发的细胞洞亡过程一致,触发的细胞调亡过程,使之成为研究细胞凋亡过程很有用的模型。在体外实验中,凋亡素不能诱导正常的淋巴组织、真皮、表皮、内皮以及平滑肌细胞的程序性死亡。然而,当正常细胞转化为肿瘤细胞后,就变得对调亡素诱导的调亡敏感。在正常细胞中,洞亡素主要位于细胞质中,而在转化细胞或恶性肿瘤细胞中凋亡素主要存在于细胞核中。这表明调亡素的存在部位与其功能相关。由于在诱导凋亡方面具有可独立于而发挥作用,人们就可利用的这种特点,在正常的治疗方案(如化疗或放疗等)不能发挥作用时,用调亡素来诱导调亡。调亡素的这些特性使之成为一种治疗肿瘤的可能药物(,,这将可能在人类医学肿瘤治疗上发挥作用。流行病学致病机理等首先研究了感染的致病机理(,。的致病性与鸡的日龄和母源抗体水平密切相关。周龄内雏鸡人工接种很容易引起贫血,而母源抗体水平高的雏鸡对人工接种有很强抵抗力。感染后,机体只要出现两种临床症状,即贫血和免疫缺陷。主要侵害骨髓中的成红细胞和胸腺皮质细胞,导致受损细胞染色体高度浓缩,大量段裂的片段充实于核质中,核膜周围有致密的电子云小体,细胞的形态和结构完全改变,形成病理上所谓的“脱卩筮现象”。对于引起的这种进行性细胞死亡或细胞凋亡的生理过程,目前存在两种观点。第一种观点认为细胞调亡是形成病毒复制的专门阶段。等认为,对胸腺和骨髓具有高度特异性,一旦病毒侵入这些组织的淋巴细胞和成红细胞,就促使它们发生调亡(。这种观点的研究者同时还认为调亡可能是机体的防御机制,通过使未成熟宿主细胞死亡来阻止病毒扩散。目前对于诱导凋亡的方式及致病机理还不是十分明确,有待深入研究。第二种观点认为可能是感染引起的副作 山东农业人学硕丨：学位论文用。等研究认为,感染可使机体产生糖皮质激素和别的一些非病毒性激素,它们能刺激以胸腺为主的淋巴组织中的细胞,使其形态结构和功能发生严重衰变,同时骨髓中成红细胞的衰变是因缺少来自胸腺产生的调空信号所致(,。流行与危害对几乎所有的品种鸡都易感,不同年龄、地理位置的鸡群对的感染力几乎无差异。周龄鸡易感,日龄鸡最易感,六周龄以上的鸡和成鸡感染不发病。即对于该病,鸡有年龄抵抗力。日龄雏鸡实验感染发病率达日龄则降为三周后已产生了年龄抵抗力(李振华等,。该病可垂直传播和水平传播,垂直传播是本病主要传播方式,母鸡感染日内种蛋带毒。有母源抗体的雏鸡可被感染,但不发病。流行病学调查表明(王莉莉等,杨林等,马双民等,,己在种鸡、蛋鸡、肉鸡和无特定病原鸡群中广泛存在。最近,在日本类中也发现了高滴度的中和抗体(。近年来,分别在英国、德国、波兰、丹麦、北爱尔兰、澳大利亚、瑞典、瑞士和美国等地发现,大多商品鸡群和许多鸡群抗体阳性(,。我国也有本病的报道,并分离鉴定出崔现兰等,周方红等,。因此,从病原分离和血清学调查来看,呈现世界性分布,主要侵害肉鸡、后备父母代种鸡和刚开产蛋鸡。感染后天引起骨髓的成红细胞和胸腺皮质的成淋巴细胞的溶细胞感染(韦平等,,结果导致严重淋巴衰竭、骨髓损伤及淋巴器官萎缩,从而引起免疫抑制,增加机体对其它疫病的易感性,造成其它病毒病及细菌病的混合感染,如、、、；感染鸡对正常疫苗免疫的反应性下降,从而导致免疫效果不佳或失败(。近来发现单独或与其它免疫抑制病毒如等联合感染可明显抑制疫苗及传染性喉气管炎疫苗等的免疫保护效力,并可抑制新城疫(灭活苗的抗体效价(徐彦波等,。、与先后或共同感染时,或抑制免疫反应,提高了鸡对这些疫病和其他感染的易感性,或相互作用,可增强各自的致病力(徐彦波等,周志勇等,。和双重感染可导致早期死亡,其中日龄双重感染的雏鸡在日龄时死亡；日龄双重感染的雏鸡在円龄有死亡。剖检可见胸腺、法氏囊严重萎缩,肝、肾肿大,脾有坏死灶。这些变化与超强毒株(所引起的早期死亡；综合征很相似(朱来华等,。日龄接种可引起雏鸡对疫苗(或血清型弱毒疫苗免疫失 I型鸭岡环侦毒间接方：的佳(‘：泛流行沾学败。因此感染是导致疫苗免疫失畋的原因之一。与都是引起幼鸡危害严重的免疫抑制性疾病主要侵害法氏囊组织,破坏机体的体液免疫系统,而主要侵害胸腺中的淋巴细胞,损伤机体的细胞免疫系统。当幼龄鸡同时感染和时,可使二者相互增强其感染力和致病力,损伤机体的体液免疫和细胞免疫系统,造成严重后果。感染可消除雏鸡对的円龄抵抗性,日龄接种的鸡于、、月龄感染时仍可发生贫血,甚至死亡；而未接种的鸡周龄感染却不发生贫血(朱来华等,感染可加剧由引起的法氏囊破坏。在有存在的条件下,常发生免疫失败,造成大面积暴发、病程延长且死亡率增高；在有存在的条件下,的亚临床感染可升级为临床感染,并破坏鸡群对的年龄抵抗力,使得中雏感染发病(王笑梅等,。检测方法病毒的分离鉴定病毒的分离、鉴定是最常用的方法,从病鸡的胸腺、骨髓、肝脏、法氏囊或卵巢等器官组织内,从可分离到病毒,通过细胞培养(、鸡胚(日龄、绒毛膜或卵黄囊接种)和一龄鸡来分离。将分离处理过的病料肌肉或腹腔接种日龄鸡,两周后测定血细胞压容积并检查骨髓病变,与对照雏鸡比较,若血细胞压容积值明显下降低于,并出现骨髓黄化,胸腺萎缩、肌肉皮下出血及其它贫血症状,就可初步判定为阳性,日龄雏鸡接种,被认为是确定最特异和可靠的动物试验方法(。血清学诊断中和试验中和试验既可用鸡或者培养细胞进行(。优点是特异性强；缺点是试验周期长,对实验操作有一定的要求,只适合在实验室条件下进行。间接劳光抗体试验(抗原接种于细胞内,于后收获,离心取沉淀,洗次,涂片并瞭干,丙酮固定,与阳性血清反应后加入突光标记的二抗,在荧光显微镜下可看到到细胞核内不规则的突光颗粒。酶联免疫吸附试验(可以用粗提或纯化的病毒或者重组蛋白作为抗原,检测血清中抗体的水平。 山东农业人学硕丨：学位论文此方法操作简便,敏感性高且时间短,可定性和定量分析,可同时检测大量的样品,适合的大规模普查(。分子生物学诊断方法诊断方法是实验室诊断中运用比较多的一种方法。此方法依赖于引物的特异性,优点是特异性较高,敏感性也很好。核酸杂交法诊断以非放射性的地高辛标记的全基因组作探针进行斑点杂交,可以检测到阳性病料或感染的细胞内的病毒核酸。金文杰等(金文杰等,用全基因组探针从江西、广西等地被诊断为的病料样品中检测到了如段玉友等(段玉友等,用基因片段制成探针对江苏等地随机釆集的病死鸡样品进行了感染情况的检测。预防控制管理措施对污染的鸡场应采取净化措施,隔离淘汰病鸡,更换鸡群,切断传染源。注意日常管理和卫生措施,可以预防因环境因素和其他传染病引起的免疫抑制,也可降低血清转阳率。对于鸡舍(包括舍)感染的较难根除,因为对普通消毒剂的抵抗力很强,且病毒可以通过卵垂直传播,在种鸡产卵期也可能被重新激活(。应当检测种鸡群的,以避免经垂直传播感染也可检验免疫接种情况。研究表明周时检测种鸡抗体水平,将可以很好的控制经卵传播。预防管理措施预防感染的主要途径是进行疫苗接种,提高母源抗体水平。目前商品化疫苗很少,主要有灭活疫苗和弱毒疫苗,随着分子生物学的技术不断提高,也出现了一些基因工程疫苗。年等首次报道用疫苗接种来预防。种鸡在周龄时口服自然发病肝乳剂或鸡胚毒进行免疫,这种方式能有效地预防子代鸡群中的爆发。但是这种疫并没有使病毒致弱,只是由于的滴度较低,所以存在很大的危险性。研究还表明,活疫应在周龄时进行免疫接种,不能晚于幵始收集种蛋前周,以防止经蛋传播疫苗病毒。 1型鸭關环病毒间接方法的沾及流行病学调,等人通过试验研究发现,毒株在细胞上连续传代次后仍具有抗原性,但可是传代过程中某些碱基发生突变,导致氨基酸序列的改变降低了其抗原性和致病力。等人将分离株在细胞培养中传代次后对其进行克隆,克隆株在幼鸡中传代次,分离到了致弱的毒株,命名为。该株与传代前相比,在基因的非转录区插入了一个的片段,并且基因组中碱基有替换现象,存在有个部位的核苷和个部位的氨基酸残基是与其他分离株不同的。用其感染円龄的鸡,通过临床症状和理学剖检,推断其为致弱株。但多项研究表明,通过细胞及动物试验很难获得低致病性的病毒。等人将灭活的作为疫苗免疫了产蛋前的种鸡,实验发接种的母鸡血清转阳,攻毒试验表明其后代能够抵抗强度的攻击(。王秀荣等人(王秀荣等,采用国际标准强毒接种日龄雏鸡增殖病毒,灭活后辅以白油佐剂,研成功了灭活疫苗。遗憾的是,细胞中病毒滴度很低而且易感的细胞多由马立克氏病毒(或禽白血病病毒(非正常的淋巴细胞系转化而来,以这些细胞培的病毒作为疫苗现在有携带内源性病毒的可能。所以,这类生产成本很高的灭活疫苗及存在致强病毒可能的减毒疫苗很少应用到实际生当中。随着基因工程技术的发展,研究者们看到了基因工程疫苗的应用前景。和等人由杆状病毒载体系统表达的的和重组蛋白,研究发现,有和共同表达才能产生有效的免疫原性,且其细胞裂解物免疫鸡群,可以剌激机体产具有中和活性的抗体,并且该抗体可以保护子代鸡免受感染。年等进一证明表达和重组蛋白的重组杆状病毒可以作为亚单位苗的生产系统。等人在先前构建的质粒的基础上,在基因组的启动子增强子区域引入突变,构建突变体。转染细胞后获得了有感染性的病毒,但它对鸡的细胞致病力明显降低,尤其是当启子增强子区域的插入片段时,这种作用变化更为明显。这些突变毒株在组织培养中是稳遗传的,也具有抗原中和活性表位,因而可以作为疫苗株的候选株(,。刘长军等构建了一含和基因的重组疱疫病毒,体内外的试验结果均表明重组病毒具有很好的稳定此种疫苗可以用来预防鸡马立克氏病和鸡传染性贫血病(刘长军等,。肖庆利等共同表达了和蛋白,并初步证实其可以 山东农业人学硕士学位论文诱导机体产生抗体(肖庆利等,。张恒等构建了基因缺失突变体,通过原核诱导表达试验证实突变可以抑制致病性蛋白的生成,动物试验也实这种突变体作为疫苗来使用对鸡群具有一定的免疫保护作用(张恒等,因而可以作为未来苗研制的一个方向。等最近研究表明可以用乳酸球菌的结合位点来连接,将其插入到共表达载体中,大肠杆菌转化,纯化重组、蛋白,并结合后,经口免疫雏鸡,能够发现脾细胞对的表达有免疫反细胞因子、、和的水平上升,。流行范围越来越广,对养禽业造成的损失巨大,受到了世界各国兽医科研工作者的关注。我国自从在东北地区报道该病以来(崔现兰等,,山东、安徽、江苏、天津、河南、广西西等省市均有该病的报道(王莉莉等,蒋玲艳等,杨克礼等司兴奎等,,并且该病与其它免疫抑制性疾病混合感染现象严重(崔治中等。因此,为了有效预防该病,研制高效疫苗仍是目前的主要任务,虽然常规疫苗、亚单位疫苗、弱毒疫苗等研制方面已经取得一定进展,但距安全、有效疫苗的成功研制和商业化牛产尚有较大距离,相信随着研究不断深入,该项工作必将取得重大突破。鸭圆环病毒(病原学特征■历史背景鸭感染圆环病毒最早于年由等报道(。但关于圆环病毒感染鸭的流行病学报道不一。等人对送检的份鸭病料进行电镜和检测,发现有份病料含有圆环病毒,其中份来自半番鸭,另外份分别来自北京鸭和番鸭。等运用传统方法从患病或死亡鸭的法氏囊中检出圆环病毒的阳性率为而等研究显示,圆环病毒在长岛地区饲养的鸭群中检出率很低。我国台湾学者等对年间采集的样品检测表明,圆环病毒检出率为。傅光华等对份采自曰龄鸭的法氏囊及脾脏样品检测表明,圆环病毒的阳性率为傅光华等,等有从鸭体内检测到鸭圆环病毒的报道,其阳性率为,并伴有鸭型病毒性肝炎(、鸭传染性衆膜炎(和鸭大肠杆菌(病共同感染(。分类地位及基本特征 ；型鸭岡环病毒间接方法的建立及流行病学调杏属于圆环病毒科、圆环病毒属,同同属(图,无囊膜,单股环型结构,二十面体对称。其在电镜下的大小与其他圆环病毒类似,直径为到见图。由于目前尚不能进行分离培养,所以对于其病原学特征的研究相当有限。——图根据圆环病毒的蛋白氨基酸序列绘制的进化树(驗參■‘象；“”『丨丨图电镜下的鸭圆环病毒形态(,分子生物学特征基因组结构基因组是一个长约之间)的单股环状,基本结构见图包括三个主要的、禾口。张大丙等(将鸭圆环病毒基因组分为两个基因型,型鸭圆环病毒基因组长度为、或的分离株和型鸭圆环病毒基因组长度为及以的病毒为一个分支。 山东农业火学硕丨：学位论文‘“‘‘‘‘‘“■「、”“‘〒二：“￡￠；■；：‘？：丄二,：；丨,图鸭圆环病毒基因组结构蛋白其中位于正链,编码蛋白(复制蛋白),由个氨基酸构成,为存在个与滚环复制相关的保守基序,它们是结合的环。通过和分析表明,与其它圆环病毒相比,的基因同源性更高一些。蛋白其中由个氨基酸组成,为,编码蛋白衣壳蛋白)。蛋白末端包含有几个精氧酸残基,这在其它圆环病毒基因组中也可以看到,是非常普遍的一个特征。与和的起始密码子可能是非起始来比较,蛋白的起始密码子总是。在紧靠蛋白的末端,没有发现盒和盒结构,但在核苷酸处发现了聚腺苷酸化信号。位于的互补链上,相琪旺等人将的借助打状病毒表达系统在细胞中表达,通过和分析发现,蛋白存在于感染的阳性鸭体内,从而证明了这是一个功能阅读框,并且通过流式细胞技术检测发现,在感染后、、,表达蛋白的重组奸状病毒引起的细胞的调亡比例明显大于感染野型杆状病毒而引起的细胞的调亡比例(。试验结果表明的为一个功能性,蛋白在的致病性方面可能发挥着促进宿主细胞调亡的作用(, 1型鸭环病间接方法的建：流行沾学调。另外两个位于正链上的是：编码的蛋白,由个氨基酸组成,为编码的蛋白,由个氨基酸组成,为利用分析发现,这两个蛋白与其它蛋白的同源性很低,仅为少数毒株所有,所以表达的可能性也不大,当然,还需要更多的研究才能得出结论。流行病学特征致病机理圆环病毒感染造成的淋巴组织损伤导致了机体体液免疫和细胞免疫功能的下降,这种免疫抑制反应增强了其他共感染因素的致病性。而临床上圆环病毒感染的过程和结果往往依赖于其他感染因素的并发感染(,。感染的鸭子所表现的临床症状则主要表现为发育状况差,并且明显表现羽毛营养失调,在背部脊柱(的羽毛)尤其明显,许多羽毛羽轴出血,背部皮肤组织病理学检查主要表现为囊泡和围绕囊泡的组织异嗜性炎性渗出,内脏器官总的病理表现为鸭传染性装膜炎协同感染的症状,对法氏囊组织病理学检查表明,淋巴细胞损伤、坏死、组织细胞增多(。流行与危害德国报道的群中的个体阳性率为匈牙利群中(报道的阳性率为,在中国台湾地区群中阳性率为。姜世金等首次从我国大陆地区福建省发病鸭群中检出了其个体的检出率为,群体的检出率为。随后,张兴晓等对我国山东省只搜桃谷鸭(中及混合感染的情况进行了流行病学调查,结果显示,被调查鸭中有感染了,且、周龄的鸭子较周龄的更易感。然而单纯感染的样品只占被调查样品总数的为和其他病原的混合感染,其中,二重感染的比率为或,三重感染的比率为或,四重感染的比率为,。研究结果表明,在樱桃谷鸭群中普遍存在,且呈阳性的鸭更易与其它病原发生混合感染。诊断方法由于没有可行的体外增殖培养的方法,目前尚不能在实验室完成病毒的分离 山东农业大学硕土学位论文鉴定。目前对的研究主要集中在检测及全基因组序列测定分析两个方面。电镜法在电镜下可以看到特有的直径大约为的球形结构。聚合酶链式反应法普通和荧光定量两种方法均已用于感染的诊断。二者均具有特异性好、灵敏度高的优点,但荧光定量的灵敏度要比普通高个数量级,而普通则具有简便适用、成本低廉的优点,更适合在生产中推广应用(,。：‘、‘■“‘、’■：‘十：■請、、：：士：、“主、、二‘：‘、,、‘‘各、‘、：“‘■：：图通过丨检测鸭的法氏囊中的丨,核酸探针技术核酸探针杂交检测的方法也在实验室中得到应用,这种方法既可以用于对提取的组织进行检测,也可以对福尔马林固定石錯包埋样本进行原位检测(见图但在检测灵敏度方面,核酸探针杂交要远低于检测,但其稳定性与可重复性均要高于检测,并且可以根据显色情况对被检的目的核酸进行大致白勺定量。间接方法血清学检测己经成为鸭圆环病毒检测的重要手段之一。刘少宁等人建立了型鸭圆环病的间接方法(,交叉试验结果表明该方法具有较强的特异性,对多份样品的重复检测结果表明该方法有较好的可重复性。本研究的目的与意义近年来,随着养鸭业的迅速发展,作为能引起免疫抑制性疾病的病原,应引 1型鸭网环病毒间接方法的迷’及流行沾学调：起我们的高度重视。从本实验室对的跟踪报道可以看出,近几年健康鸭群中鸭圆环病毒的感染率呈上升趋势,因此建立快速、简便、准确的检测方法显得尤为重要。由于方法只需要很小量的动物血清检测抗体即可进行病原感染判定,有利于对活体动物进行大规模流行病学调查。存在两个基因型,二者之间的衣壳蛋白同源性只有左右,抗原表位预测分析表明二者之间也存在较大差异。年本实验室刘少宁等建立了基因型抗体检测的间接检测方法(并完成了流行病学调查。本研究建立了基因型抗体检测的间接检测方法,完成了对山东省鸭群的流行病学调查,并对同样的血清样品同时进行了基因型的抗体检测,探讨了两种基因型在鸭群中的共感染问题,对丰富的流行病学资料具有重要意义。 山东农业人学硕上学位论文材料和方法检测基因型抗体的间接方法的建立及血清学调查菌种和质粒宿主菌：大肠杆菌〗和、质粒等均由本实验室保存。质粒物理图谱见图。,！‘‘：、歡‘图丨质粒物理图谱主要试剂和仪器聚合酶、载体等购自大连宝生物工程公司；羊抗鸭均购自美国公司；镇亲和蛋白纯化柱购自美国公司；超声波裂解仪(美国紫外分光光度计(円立公司酶标仪(奥地利公司)；洗板机(。聚丙插酰胺凝胶电泳(试剂丙稀酰胺的配制：将丙烯醜胺和,亚甲丙烯酷胺溶于总体积为的水中。加热至°溶解之,补加水至总体积为。用滤器(孔径)过滤除囷,置掠色瓶中保存于至温。,,、四甲基乙烯二胺),公司过硫酸胺：用去离子水配制°：存,一周内用完。甘氨酸电泳缓冲液(在去离子水中溶解碱和 1型鸭网环柄毒间接方注的流行沾学调甘氨酸,加,用双蒸水定容至。双蒸水配制。：双蒸水配制。凝胶上样缓冲液：、琉基乙醇、、溴分蓝、甘油。考马斯亮蓝染色液：将考马斯亮蓝溶解于甲醇：水：冰醋酸溶液中,用滤纸过滤除去大的颗粒,置室温保存。脱色液：甲醇、去离子水混合,再加入冰醋酸混合。用于蛋白纯化的溶液的配制：；；：；咪哩；：；咪坐；：；咪坐所用溶液包被液的碳酸盐缓冲液调值为,定容到。洗潘液调值为,加入吐温定容到。封闭液明胶 山东农业大学硕士学位论文牛血清白蛋白(脱脂奶粉准确称量后,溶解于缓冲液中。底物反应液憐酸盐缓冲液的梓檬酸溶液(梓檬酸加蒸馆水,混匀即可。显色液四甲基联苯二胺)溶液：无水乙醇)底物反应液配后立即使用。终止液浓蒸馆水引物设计与合成根据已发表的株全基因组核苷酸序列序列设计一对表达引物,分别为：：,‘：‘‘该引物扩增范围覆盖了株基因大部分全长,扩增片段长度为。弓丨物委托公司进行合成。株基因原核表达载体的构建具体方法参照试验第二部分进行。装板按照操作说明在垂直板式聚丙稀酰胺凝胶电泳槽中制备凝胶,模具齿梳厚度。将模具装好,密封。分离胶( I型鸭环病毒间接方的建、及流行病学调杏在体积小清瓶瓶中依次加入去离子水、丙烯酰胺存液、、、、。加入过程中轻旋,以充分混匀混合物,但勿摇起泡沫。加入后应迅速将混’合物沿玻璃板加入胶槽内,使槽内液体的上液面距短玻璃板上缘约,胶液表面加入去离子水密封,°下放置大约使分离胶充分凝固。以少量去离子水洗去分离胶层表面未凝固的丙烯酷胺。以吸水纸吸尽在凝胶表面的残留水。浓缩胶(在体积烧杯中依次加入去离子水、丙烯酷胺忙存液、、、叫。加入后迅速将混合物沿玻璃板加入槽内,使液体表面距短玻板边缘,小心插入事先洗净的模具齿梳,使齿梳下缘与分离胶上缘相距约。在室温下放置使浓缩胶充分交联。待浓缩胶凝固后,小心拔取模具。用加样器长针头整理各加样槽的边缘。上样电泳将处理好的样品中加入各孔。每泳道上样量为。开始电泳时,浓缩胶电压,待样品的溴酷蓝完全进入分离胶时,将电压调至。当电泳进行至样品中的溴酌蓝指示剂距凝胶下缘时,大约总用时,停止电泳。卸下凝胶,在考马斯亮蓝染色液中室温下染色以上,染色过程在脱色摇床上不断振摇。取出后用去离子水轻轻冲洗几遍,洗净凝胶,然后在脱色液中充分脱色。电泳后的凝胶结果置保存液(甘油溶液)中保存。重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达和分析将阳性工程菌于°培养,待值达到时,加入至终浓度为进行诱导表达。收集诱导后不同时间表达的菌体,于冰浴上进行超声破碎,°离心,取上清和沉淀进行电泳,并对表达产物进行分析。重组蛋白的变、复性及其纯化将表达后的菌液,,离心,弃上清,收集菌体备用；裂解与变性用变性液(尿素,悬浮沉淀(菌体与变性液的比例为,试管置于冰中,超声仪上超声破碎细菌(,作用, 山东农业人学硕学位论文间隔,重复次),此时溶液变清亮,°、离心收集上清；将上清放入小烧杯中,磁力搅拌器°搅拌使其充分变性。复性将变性后的液体装入透析袋中,用复性液(尿素,甘油,咪卩坐,透析,每换液一次；复性后的液体,放入中透析,每换液一次,然后放入中浓缩。蛋白纯化按照纯化操作说明进行,具体步骤如下：取混勻后的镇树脂加入到的纯化柱中,静止分层后去掉上清；加双蒸水,悬浮树脂,静止分层后去掉上清；加悬浮树脂,静止分层后去掉上清；重复上步；加变复性后的蛋白入纯化柱中,保持悬浮,使其充分结合,静止分层后去掉上清；加,重悬镇树脂,静止分层后去掉上清；重复上一步三次；力,悬浮镇树脂,静止分层后,收集液体,分析结果。纯化后的蛋白于分光光度计测定样品在和处的吸收值,按照公式进行计算蛋白含量：蛋白质浓度(￡稀释浓度。间接条件的优化用纯化后的重组蛋白包被板,并对影响试验的各种条件进行选择。以下各项试验条件的选择均以阳性血清与阴性血清的比值作为标准来判定结果。抗原包被浓度与血清最佳稀释度的选择采用方阵滴定,横排作抗原倍比稀释(、、、、、、纵排将阳性血清和阴性血清经大肠杆菌裂解液处理后也分别进行倍比稀释(、：、：、：、：,每个稀释度重复次,取其平均值。包被液的选择分别用蒸循水、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液(、作为包被液,抗原包被浓度为昭,阳性、阴性血清作稀释,按说明书将酶标二抗稀释至的浓度,进行检测。 1型鸭阿环彳间接方法的沾：泛流行病学阅抗原包被条件的确定用最适浓度抗原包被酶标板,分种方式,即°、和°、。用溶液封闭,加入稀释的阳性血清进行测定。血清最佳反应时间的确定加入血清后,分别在°温箱中作用、、、后,进行抗体的检测。底物最佳反应时间的确定加入底物(后,室温避光、、、后,加入终止反应。间接的操作程序和结果判定纯化后的蛋白按照以下程序建立间接方法。包被抗原：用包被缓冲液稀释后,每孔,°过夜,洗浲次；封闭：加封闭液,°作用洗剂同上；加待检血清：将用稀释液稀释后的血清每孔,°作用洗剂同上；加二抗：稀释的二抗每孔,°洗剂同上；加底物液：°作用加终止液,测每孔处吸光值(。按最佳反应条件测定份健康鸭血清的值,计算其平均数(和标准差(,则阳性的值阴性的值。运用公式来判定结果(待检样品的值；阳性对照的值；阴性对照的值)。进行符合率的验证对于间接检测的样品随机挑取个样品个阳性的个阴性,进行符合率的验证。将处理样品用分离胶进行,然后转印到砲酸纤维素膜上,用的脱脂奶粉°封闭过夜,然后用洗涤膜次,加入稀释的一抗(检测为阳性的样品),°輕育用洗去未结合的抗体；加入二抗,°孵育羊抗鸭作为二抗)；洗漆后经显色试剂盒显色,观察特异性条带。间接方法的初步应用采集山东省两个地区(潍坊、泰安)的肉鸭共个鸭场的份鸭血,分离血清,进行间接测定,分析山东省鸭群中鸭圆环病毒的感染情况。 山东农业人学硕学位论义年山东部分地区肉鸭鸭群基因型血清学调查血清、菌种、质粒及主要试剂阴性和阳性鸭血清由本实验室保存,待检鸭血清于年上半年采集自山东省潍坊和泰安两个地区个肉鸭场的日龄待出栏肉鸭,共份。表达衣壳蛋白的重组质粒、宿主菌由本实验室保存,羊抗鸭购自美国公司,镍亲和蛋白纯化柱购自美国公司。用于表达蛋白质纯化以及检测用各种试剂参照参考文献(配置。重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达和分析将阳性工程菌于°培养,待值达到时,加入至终浓度为进行诱导表达。收集诱导后不同时间表达的菌体,于冰浴上进行超声破碎,°离心,取上清和沉淀进行电泳,并对表达产物进行分析。重组蛋白的变性、复性及其纯化裂解与变性将表达后的菌液,离心,弃上清,收集菌体备用。用变性液悬浮沉淀,试管置于冰中,超声仪上超声破碎细菌,此时溶液变清亮,°、离心收集上清；将上清放入小烧杯中,磁力搅拌器°搅拌使其充分变性。复性将变性后的液体装入透析袋中,用复性液透析,每换液一次；复性后的液体,放入中透析每换液一次,然后放入中浓缩。蛋白质纯化将浓缩后的液体上镍柱进行纯化,具体步骤如下：取混勻后的镍树脂加入到的纯化柱中,静止分层后去掉上清；加双蒸水,悬浮树脂,静止分层后去掉上清；加,悬浮树脂,静止分层后去掉上清；重复上步；加变复性后的蛋白入纯化柱中,保持悬浮,使其充分结合静止分层后去掉上清；加,重悬镜树脂,静止分层后去掉上清；重复上一步三次；加,悬浮镍树脂,静止分层后,收集液体,分析结果。检测制备检测板 1型鸭网环沾毒间接方法的建及流行病学调纯化后的蛋白用包被缓冲液稀释后,每孔明成,°过夜,洗潘次；加封闭液,°作用洗剂同上。检测将待检鸭血清按用稀释液稀释后每孔加,°作用,洗剂同上；稀释的二抗每孔°作用,洗剂同上；每孔加入底物液°作用每孔加入终止液终止反应,处测每孔吸光值(。结果判定根据等的研究结果,判定抗体阴阳性的值为。即样品的值时,可以在的可信度上判定为阳性,样品的值切时,可以在的可信度上判定为阴性。 山东农业大学硕上学位论文结果与分析检测基因型抗体的间接方法的建立及血清学调查基因的克隆与鉴定扩增得到的目的片段,重组质粒经和酶切鉴定和测序结果均正确(图。—：———：三—■阁重组质粒臨切鉴定；表达产物的分析重组表达质粒鉴定正确后,转化经诱导后的表达产物在不同时间取样进行鉴定,结果可见有明显的重组蛋白表达,表达量占到菌体总蛋白的,重组蛋白以不溶性包涵体形式存在于菌体中；表达的重组蛋白纯化后有一条的目的蛋白条带(图,表明亲和层析能获得较纯的目的蛋白(浓度为：。分析发现,该重组蛋白能与抗鸭圆环阳性血清进行反应,具有良好的免疫学活性(图。 1型鸭岡环病毒间接方法的沾立及流行病学调査驅；■：：■：：■■：■纖丨广？酵一项謹：。德图重组蛋白的纯化！————、二二？、、图鉴定结果间接最佳反应条件的建立抗原包被浓度与血清最佳稀释度的确定根据方阵滴定试验结果,当抗原浓度为,待检血清以稀释时,值最大,非特异性较低。因此每孔的抗原包被量和稀释的血清浓度为最佳反应浓度,结果见表。 山东农业大学硕士学位论文表抗原和血清最佳工作浓度的确定(值)：：：：：：：：：包被液的确定““”‘用碳酸盐缓冲液(,作包被液时,值最高。抗原包被条件的确定当抗原进行°、包被时,值最高。血清最佳反应时间的确定待检血清作用时间为最佳。底物最佳反应时间的确定底物最佳反应时间以最佳。表和结果比对符合率的验证利用重组蛋白进行电泳,待电泳结束后进行转膜加一抗二抗 1型鸭网环病毒间接方法的佳、及流行沾学调反应,进行显色,结果见表。间接方法的初步应用通过对山东省潍坊、泰安两个地区的个肉鸭场的份血清进行间接检测,结果显示：潍坊地区个养殖场基因型抗体个体阳性率在,平均为见表泰安地区肉鸭场的基因型抗体个体阳性率在,平均为群体阳性率为见表。整体来看,检测的个养殖场中基因型抗体个体阳性率在,健康鸭群中抗体个体检出率为,有超过半数的鸭场个体阳性率超过。表维坊地区不同肉鸭场基因型抗体的个体检出率鸭场龄(被检鸭数量(只)阳性鸭数量(只)检出分比(％合计 山东农业人学硕士学位论文表泰安地区不同肉鸭场基因丨型抗体的个体检出率鸭场日龄(被检鸭数跫(只)阳性鸭数只)检出百分比(％！合计年山东部分地区肉鸭鸭群基因型血清学调查表达产物的分析重组表达质粒转化感受态细胞,经诱导后的表达产物在不同时间取样进行鉴定,结果可见有明显的重组蛋日表达,表込量占到菌体总蛋白的,重组蛋白分子量大小为,纯化后的重组蛋白中基本无杂带(见图。—图重组蛋白的电泳分析表达产物的分析分析发现,该重组蛋白能与抗鸭圆环阳性血清进行反应,具有良好的免疫学活性(见图。 1型鸭网环病毒间接方法的：及流行柄学调查————；；■———：、；‘二图重组蛋白的鉴定表潍坊地区不同肉鸭场基因型抗体的个体检出率鸭场日龄(被检鸣数量(只)阳性鸭数只)检出百分比(％合计抗体的检测结果通过对山东省两个地区的个肉鸭场份血清进行间接检测,结果显示：肉鸭场的抗体个体阳性率在,平均为所有个鸭场的鸭群均检测到抗体,群体阳性率为。潍坊地区肉鸭场的抗体个体阳性率在,平均为见表。泰安地区肉鸭场 山东农业大学硕丨学位论文的抗体个体阳性率在,平均为见表。表泰安地区不同肉鸭场基因型抗体的个体检出率鸭场龄(被检鸭数：只)性鸭数只)检出分比(％丁合计基因型、型抗体间接检测结果的比较两种方法检测结果符合率的比较本研究建立的基因型抗体检测的间接方法的检测结果与已建立的基因型间接方法比较,两种方法检出的符合率为：两个基因型均为阴性样品)两个基因型均为阳性样品),两种基因型检测结果的阳性符合率仅为：表,说明两种不同基因型的衣壳蛋白原核表达产物存在较大的抗原性差异,所以进行血清学检测时结果差异较大,检测需要对两种不同的基因型分幵检测,否则漏检的可能性较大。型型共感染的阳性率为,表明在山东省肉鸭群中两种基因型存在较为严重共感染现象。表两种基因型抗体检测结果比较检测地鸭数鸭数鸭鸭数被检鸭区(只)(只)数(只)(只)数(只)泰安〗雜坊指因型为性,型为阴是指函到型为阴性基因型为阳性指基因型为阳性,搞丨型为性：是指基闻型为阴性,难因型为阴性。 1型鸭环病毐间接方法的建及流行沾学调基因型与基因型的血清学调查结果比较在潍坊地区的个鸭场中,基因型的检测阳性率为基因型抗体的检测阳性率为,在泰安地区的个鸭场中,基因型抗体的检测阳性率为,基因型抗体的检测阳性率为。泰安地区基因型抗体的感染率高于基因型,而潍坊地区基因型感染则高于基因型,并且各个养殖场之间也存在较大差异,说明不同区域的感染存在不同的流行病学特征。 山东农业人学硕学位论文讨论检测基因型抗体的间接方法的建立及血清学调查目前为止,世界上多个国家均有对进行抗原检测的报道。年等首次在德国报道在鸭群中的个体阳性率为,年等报道了匈牙利鸭群中的个体阳性率为,,年等报道了中国台湾地区鸭群中个体阳性率为,年姜世金等从我国福建省发病鸭群中检出了其个体的检出率为,群体的检出率为。年张兴晓等从我国山东省只发病樱桃谷鸭中及其与其它病原微生物混合感染的情况进行了流行病学调查,结果显示,被检病鸭中有感染了其中的样品为单纯感染为和其他病原的混合感染(,。刘少宁等人在比较检测阳性鸭的五个组织器官中的检出率的研究中发现,脾脏的检出率最高,其次是法氏囊,而肝脏、胸腺和骨髓的检出率则较低,依次为、和,表明感染存在相应的组织异嗜性(刘少宁等。通过特异性抗体进行的原位荧光检测也表明,在鸭的脾脏、胸腺和法氏囊中感染后形成明显的局部病灶,为导致免疫抑制的致病机理提供了直接依据刘少宁等,。一些学者通过研究表明,单独接种无法复制出严重临床症状的说明的单独感染可能还不足引起,必须要有其他因素的参与才能促进疾病的发生(曹胜波。是否与同属的其他病毒如致病机理类似,混合感染会对疾病的诱发起促进作用,尚无法定论。由于已有研究表明的蛋白具有调亡活性,可能是机体感染后导致免疫抑制的主要原因(因此推测感染可能是导致近些年来鸭病病情复杂,呈现非典型性病症,多种病原混合感染严重的原因之一。目前尚未有关于基因型血清学检测方法建立的报道,本研究建立了检测基因型抗体的间接方法。采用技术,扩增型部分基因,构建原核表达质粒诱导表达后以纯化的重组蛋白为抗原建立间接方法并初步应用于临床检测。结果显示：基因型基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达；检测表明,表达的重组蛋白能与鸭圆环阳性血清发生特异 1型鸭环病间接方法的达、：流行彳学调性反应；建立的间接方法中蛋白最佳包被量为孔,血清最佳稀释度为：阳性的值为。使用建立的间接方法进行山东省健康鸭群基因型抗体检测结果显示：肉鸭场的抗体个体阳性率在平均为,群体阳性率为。潍坊地区肉鸭场的抗体个体阳性率在】,平均为。泰安地区肉鸭场的抗体个体阳性率在平均为。从上述数据可以看出,基因型在健康鸭群中存在普遍感染。年山东部分地区肉鸭群基因型血清学调查年刘少宁等(首次对基因型抗体进行了血清学检测,检测结果表明山东地区健康櫻桃谷鸭的抗体检测的个体阳性率为群体阳性率为,其中日龄至日龄的肉鸭的个体阳性率为。在本次流行病学调查中健康鸭感染率有所上升,潍坊地区个养殖场只肉鸭型的个体平均感染率为,群体阳性率。本研究通过方法检测的抗体检测阳性率明显高于刘少宁等的检测结果(,显示在山东健康鸭群中的感染率正在呈递增趋势,因此对于该病可能在生产中造成的危害应当给予足够的重视。感染已经越来越渗透到各大养殖场,并且感染率居高不下。本研究对年上半年采自山东省潍坊和泰安两个地区份健康搜桃谷肉鸭的血清进行了基因型抗体的检测,结果表明个健康鸭群中均检出了抗体阳性鸭,群体阳性率为个肉鸭场的抗体个体阳性率在,平均为。其中泰安地区肉鸭场的抗体个体阳性率在,平均为；潍坊地区肉鸭场的抗体个体阳性率在平均为。潍坊地区是山东省最早幵展肉鸭规模化养殖的地区,而泰安地区的规模化养鸭业发展则相对较晚。潍坊地区抗体个体阳性率明显高于泰安地区日龄相近的搜桃谷肉鸭,说明在老养殖区的污染更加严重。基因型、型间接检测结果的对比分析在建立基因型间接过程中发现,基因型的间接方法与基因型的的间接方法最佳条件之间存在较大差异,如抗原的包被量不同,基因型为孔,而基因型为值也不同,基因型的 山东农业大学硕士学位论文值为,而基因型的值为。对比株鸭圆环病毒基因组测序结果中蛋白序列同源性发现,扩增序列比较发现,两型的衣壳蛋白的同源性仅有左右(见图,说明基因型和基因型之间存在较大的差异,在血清学调查过程中应分开进行检测。用建立的检测方法对同一鸭血清样品的两种不同基因型的感染分别进行检测,检测结果表明,部分样品一种基因型的检测数值为阳性,而另一种基因型的检测结果为阴性,因此推测这两个基因型很可能是两个不同的血清型。然而目前该病毒无法体外增殖培养,无法模拟该病毒的自然感染过程,所以无法进行中和试验从而对其进行血清型分型。检测结果表明,泰安地区两种基因型抗体均为阳性的鸭只数为,占总体检测数的而潍坊地区两种基因型抗体均为阳性的个体感染率为,是泰安地区个体感染率的两倍以上,说明在老养殖区两种基因型共感染的现象更为严重。至于是否会发生两种基因型在感染动物体内复制转录过程中发生基因重组从而导致病毒毒力增强,或者一种基囚型病毒的基因组与另一种病毒的衣壳发生重组等,目前尚未可知。 1型鸭圓环病毐间接方法的建立及流行病学调杏“■务色技技,“■色‘‘疼‘…■冷巴；■十…‘丄■色午接：‘■斗《▲！吟、！夺厂邑社‘。■■巴■…〕：：：丨丨■丨丨——丨■■丨丨■■■■■丨丨丨■…§“咖”账⑴、…叫￠■—。」■￠咖图基因型型鸭圆环病毒基因序列比对 山东农业大学硕士学位论文结论、本研究建立了针对基因型抗体检测的间接方法,其原核表达衣壳蛋白作为抗原的最佳包被量为孔,血清最佳稀释度为：,阳性的值为。、本研究利用实验室建立的两种间接方法对山东省潍坊、泰安两个地区的个肉鸭养殖场份血清进行了进行间接两种基因型抗体的检测,显示在老养殖区鸭群中污染更加严重。、两种不同基因型的衣壳蛋白原核表达产物存在较大的抗原性差异,所以进行血清学检测时需要对两种不同的基因型分幵检测,否则漏检的可能性较大。、本研究发现基因型和型共感染的阳性率为,说明在我国鸭群中存在比较严重的两种基因型鸭圆环病毒共感染现象。 I型鸭环病毒间接方法的、：‘：流行病学调参考文献曹胜波陈焕春,肖少波何启盖,徐引弟,刘军发猪圆环病毒型的检测方法的建立及应用华中农业大学学报,崔尚金,全滿平,李曦,符芳,姜艳玲,张莉猪圆环病毒多重诊断方法的建立中国预防兽医学报,,崔尚金,蔡阳,陈欣检测猪圆环病毒的竞争定量方法的建立及初步应用中国预防兽医学报,崔现兰,幸桂香,吴东来,冯菊艳,李锋,曲立新鸡传染性贫血病病毒的鉴定中国畜禽传染病,陈为民,崔治中,段玉友用扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组崔治中,孟珊珊,姜世金,魏建萍我国白羽肉用型鸡群中、和染状况的血清学调查畜牧兽医学报,段玉友,肖雪君,潘志明,刘晓文,崔治中用标记探针检测鸡贫病病毒感染中国畜禽传染病,傅光华,程龙飞,施少华,彭春香,陈红梅,黄瑜鸭圆环病毒全基因组克隆与序列分析病毒学报郭志儒动物病毒分类新动态中国兽医学报黄建芳,张知良,赵宝华,胡清海,肖庆利,张志芳,何家禄鸡贫血病毒和蛋白在家香中的联合表达动物医学进屏金冬雁,黎孟枫分子克隆实验指南第二版,北京：科学出版社,金文杰,崔治中,刘岳龙,秦爱建传染性法式囊病料中、、的共感染检测中国兽医学报,⑴蒋玲艳,李莉萍,韦平,李义杰,李康然广西鸡传染性贫血流行病学的研究广西畜牧兽医,,崔尚金李媛,全艳平李建伟,胡守萍,尹训南,谷守林,童光志检测与诊断猪圆环病毒技术的建立及病毒的分离鉴定中国预防兽医学报,增刊：声银华,陈德胜,戴亚斌,陈溥言应用复合法检测猪圆环病毒中国兽医科技, 山东农业人学硕丨：学位论文吕艳丽,杨汉春,郭鑫用方法检测猪圆环病毒型中国兽医学报,罗玉均,张桂红,陈建红,杨林,廖明,任涛,罗开健探针突光定量快速检测猪圆环病毒型中国兽医杂志刘长军,王端,秦运安,焉明华,王笑梅,代春铭,李刚,赵晓岩等含鸡传染性贫血病毒、基因重组火鸡疱疫病毒的构建中国预防兽医学报,刘少宁,张兴晓,陈智,高继明,魏秀丽,孔义波,朱岩丽,姜世金我国自然发病鸭群中鸭圆环病毒的流行病学调查中国兽医学报刘少宁鸭圆环病毒的流行病学调查泰安：山东农业大学,慕泽鑫,刘珊,张社民,高英杰,刘国文,赵建增,仝利剑猪圆环病毒病实验室检验技术研究进展中国畜牧兽医马双民,寇改霞,周方红,蒋宏伟进境种鸡传染性贫血抗原检测中国兽医科技,司兴奎,陈建红,卢林,张济培,顾万钧珠江三角洲部分地区鸡传染性贫血的血清学调查中国兽医科技慕泽鑫,杨汉春,郭鑫规模化猪场猪圆环病毒型感染的流行病学调查中国兽医杂志,王忠田,杨汉春,吕艳丽猪圆环病毒型基因的克隆及序列分析动物医学进展王宪文,刘兴友,梁美兰,郑玉姝,刘丽艳猪圆环病毒型检测方法的研究中国农学通报‘魏娟,李文刚,郑宝亮郑鸣吴凤算,王鑫,高卫科,杨慧敏,吴高锋,唐桂芬猪圆环病毒型诊断方法的研究进展中国畜牧兽医。王笑梅,王秀荣,邱冬,王积海雏鸡混合感染与的研究中国预防兽医学报,王莉莉,艾武吴荫伟,黄兵,李玉峰,宋敏训山东省鸡传染性贫血流行病学调查韦平家禽病毒性免疫抑制病的危害及其防制策略中国家禽, 1型鸭冏环病毐间接方法的辻：行坫学即办王秀荣,王笑梅,杨林,陈冠春,邱冬,熊永忠鸡传染性贫血病灭活苗的研制中国预防兽医学报,徐彦波,刘忠贵鸡传染性贫血病对雏鸡新城疫免疫的抑制机理中国畜禽传染病,徐彦波,刘忠贵鸡传染性贫血病对雏鸡新城疫免疫的抑制机理中国畜禽传染病,肖庆利,张志芳,何家禄鸡贫血病毒和蛋白在家蚕中的联合表达生物工程学报,杨晓伟,赵光伟,黄伟,陈玉先重庆地区一例鹅圆环病毒病的诊断中国家禽,杨家华猪圆环病毒感染的研究进展青海畜牧兽医杂志杨林,杜宗沛,熊永忠,王笑梅,王秀荣黑龙江省鸡传染性贫血病的流行病学调查黑龙江畜牧兽医耀新验,卢胜明鸡贫血病毒中国畜牧学分会男第一次研讨会文集杨克礼,韦平,潘玲,李莉萍,蒋玲艳安徽省鸡传染性贫血病的流行病学调查黑龙江畜牧兽医张琦,李书华,王淑杰,蔡雪辉猪圆环病毒感染诊断方法研究进展动物医学进展,周方红,陈奖励,尹训南,李成,辛桂香,王祯修,张立本,吴淑清鸡传染性贫血病毒的分离与鉴定中国兽医科技,周志勇,刘忠贵鸡传染性贫血病毒感染鸡血清对骨髓造血祖细胞增殖功能的影响中国畜禽传染病,朱来华,梁成珠鸡传染性贫血中国动物检疫张恒,何成强,李云龙鸡贫血病毒突变体的构建动物医学进展, 山东农业人学硕丨：学位论,,丁,,,,,,,,,,,,,,,,,, 1型鸭丨词环蝻点间接方法的佳、流行晌学调,,,,,,,,,,,,,,,,,,,】,,,,,—,,,,,, 山东农业大学肿学位文,,：,,,,,,,,,,,,,,,,,二,,,,,,,,,,,,, 1型鸭网环沾忐问擭方注的达、‘,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 山东农业人学颂学位,,,,,,,,,,,,,,,,,, 1型鸭网环沾点间抟注的学调杏,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 山东农业人学峋卜学位论义,’,,,,】】,,,,,,,,,,,,,,, 1型鸭网环病毒间接方法的边学调色致谢本论文是在导师姜世金教授的悉心指导下完成的。三年来,导师严谨务实的治学态度、对科学前沿敏锐的洞察力、博大精深的学识、活跃的科学思维、精诚敬业的工作作风一直深深地激励着我,使我终生受益。导师为我的成长倾注了大量心血,在学习和科研上给予我耐心细致的指导,使我能够克服困难顺利毕业。师恩浩瀚,无以回报。在此,谨向导师表示崇高的敬意和诚挚的感谢！感谢本实验室王玉老师,感谢刘少宁博士、高继明博士,在就读硕士期间,他们在试验中给予了大力帮助和协作,使课题得以顺利进行,帮我克服了很多挫折。感谢我们实验室的各位师兄(姐)弟(妹),、孙慧、雷战、邹金峰、魏宗、聂兆晶、相琪旺、夏小静、陈君豪、孙振、吕佳泓、焦玉样等在试验中给予了大力帮助和协作,生活因为你们而精彩！在此期间,还得到了动科院的各位领导和预防兽医学系的崔治中教授、周恩民教授、牛钟相教授、柴同杰教授、赵宏坤教授、朱瑞良教授、刁有祥教授、常维山教授、崔言顺教授、柴家前副教授、胡敬东副教授、王海荣副教授等老师们的指导和帮助,在此一并表示感谢！我要特别感谢我的父亲和母亲,在我求学的日子里,他们给予我最无私的爱,激励我勇往直前！在论文完成之际,衷心地感谢育我成才的山东农业大学,再一次向所有关心、帮助过我的老师和朋友们表示衷心的感谢！王鑫年月 山东农业大学硕士学位论文攻读学位期间发表论文情况王鑫,相琪旺,朱岩丽,谢之景,陈君豪,周国梅,成岩,姜世金年山东部分地区肉鸭群鸭圆环病毒血清学调查,中国预防兽医学报,已录用,并列第一作者)魏宗,邹金峰,雷战,孙慧,王鑫,相琪旺,赵钦,姜世金鸭圆环病毒基因的克隆及序列分析中国预防兽医学报,,：孙慧,雷战,邹金峰,魏宗,王鑫,谢之景,姜世金山东地区禽源致病性大肠杆菌氨基糖苷类药物耐药性及耐药基因检测中国兽医学报,,：张兴晓,邹金峰,相琪旺,王鑫,陈琳,谢之景,姜世金鸭圆环病毒基因在昆虫细胞杆状病毒系统中的表达及鉴定,西北农业学报,己录用