郴州地区不同人群丙型肝炎病毒感染状况和分子流行病学特点分析

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目录摘要-------------------------------------------------------------------------------ⅠAbstract----------------------------------------------------------------------------Ⅲ第1章绪论--------------------------------------------------------------------1第2章实验材料与方法-----------------------------------------------------52.1实验材料--------------------------------------------------------------------52.2实验方法-------------------------------------------------------------------72.3统计方法-----------------------------------------------------------------------11第3章实验结果-------------------------------------------------------------133.1不同人群HCV感染状况分析-------------------------------------------133.1.1不同人群HCV感染临床特点------------------------------------133.1.2不同人群HCV感染及其共感染ALT/AST比较---------------143.1.3不同人群HCV感染及其共感染HCVRNA比较---------------163.1.4HCV基因型分布情况（5'UTR-C区）-------------------173.1.5HCV基因型分布情况（NS5B区）---------------------203.1.6不同人群HCV单感染者各基因型ALT/AST比较------------233.1.7不同人群HCV单感染者各基因型别HCVRNA比较---------243.2HCV基因进化分析（NS5B区）--------------------------26第4章讨论----------------------------------------------------------------31第5章结论---------------------------------------------------------------------35参考文献---------------------------------------------------------------------------37文献综述-----------------------------------------------------------------------41 课题资助-------------------------------------------------------------------------51作者攻读学位期间的科研成果-----------------------------------------------53致谢-------------------------------------------------------------------------------------55 郴州地区不同人群丙型肝炎病毒感染状况和分子流行病学特点分析摘要目的：了解郴州地区临床患者和吸毒人群HCV（丙型肝炎病毒）抗体阳性患者HCV感染状况，基因型分布及其变化特点。方法：1.收集临床患者和吸毒人群患者血样，采用Elisa（酶联免疫反应）检测抗HCV抗体，HBsAg（乙肝表面抗原）和HDVIgG(丁型肝炎病毒抗体)；2.采用巢式RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）检测HDV核酸和扩增HCV5'UTR-C区和NS5B区，将HCV阳性产物送测序公司；3.采用real-timePCR(实时定量PCR)检测不同人群血清HCVRNA；4.运用Mega5.2软件对HCV5'UTR-C区段和NS5B区段基因序列进行比对和构建系统进化树分析。结果：1.临床患者和吸毒人群HCV抗体阳性患者HCV核酸阳性率分别为64.6%和81.1%，其中HCV单感染率分别为52.0%和71.0%，HCV/HBV共感染率均为5.6%，HCV/HBV/HDV共感染率分别为0.8%和2.2%。2.临床患者HCV感染者1b型27例（32.9%），2a型8例（9.8%），3型19例（23.2%），6a型22例（26.8%）；吸毒人群中1b型8例（3.7%），2a型8例（3.7%），3a型70例（32%），6a型129例（59.2%）。I 通过进化树分析发现，本地区HCV1b型序列分散在广州株和广西株附近，2a型序列分布靠近湖北株，而6a型与参考序列分布比较分散。3.不同人群总体及其各基因型的HCVRNA水平具有统计学意义。临床患者6a型HCVRNA水平明显高于3型，吸毒人群6a型HCVRNA水平明显高于3型和2a型，3型和1b型HCVRNA水平明显高于2a型，且差异均具有统计学意义（P值均＜0.05），而且HCV单感染患者HCVRNA水平明显高于HCV/HBV共感染者，且差异均具有统计学意义（P值均＜0.05）。4.不同人群总体及其各基因型的ALT和AST水平无统计学差异，HCV单感染患者ALT和AST水平与HCV/HBV共感染患者差异无统计学意义（P值均＞0.05）。5.通过相关性分析发现不同人群HCVRNA水平与ALT和AST水平无相关性。结论：1.临床患者HCV基因型主要以1b为主，而吸毒人群以6a为主。2.临床患者病毒载量高于吸毒人群，而且在两组人群中HBV和HCV共感染中病毒复制水平不平衡。关键词丙型肝炎病毒；吸毒人群；临床患者；基因型；病毒载量II THESTATUSANDMOLECULAREPIDEMIOLOGYOFHEPATITISCVIRUSAMONGDIFFERENTPOPULATIONINCHENZHOUShanLuo(ClinicalMedicine)DirectedbyWenshengOuAbstractObjective：Toinvestigatethestatus,genotypedistributionandchangecharacteristicsofhepatitisCvirus(HCV)infectionamonggeneralpatients(GP)andinjectingdrugusers(IDUs)inChenzhou.Methods:1.SerumsamplesfromGPandIDUs,Elisawasappliedtotestanti-HCV,HBsAgandanti-HDVamongdifferentpopulation.2.Nestreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)wasdetectedbyHDVRNAandHCVRNA(5'UTR-CandNS5Bgene),andtheHCVRNApositiveproductwassequenced.3.SerumHCVRNAwasdetectedbyreal-timePCRamongdifferentpopulation.4.TheHCV5'UTR-CandNS5Bgenesequenceswerealigned,andphylogenetictreeswerereconstructedwithMega5.2software.Results:1.HCVRNApositiveratewere64.6%ingeneralpatientsand81.1%ininjectiongdrugusersinfectedwithHCVIgG.HCVmono-infectionratewere52%and71%,respectively;co-infectedwithHCVandhepatitisBvirus(HBV)andhepatitisDvirus(HDV)ratewereIII 0.8%and2.2%,respectively;co-infectedwithHCVandHBVratewere5.6%,respectively.2.Thegenotype1b,2a,3and6awere27(32.9%),8（9.8%）,19(23.2%）and22（26.8%）,respectively,ingeneralpopulation;butthegenotype1b,2a,3and6awere8（3.7%）,8（3.7%）,70（32%）and129（59.2%）,respectively,ininjectingdrugusers.1bstraindispersedamongstrainsfromGuangzhouandGunagxi,2astrainswerecloselyclusteredwithstrainsfromHubei,but6astrainsshowednorelationshiptoanyoftheoriginalstrainsthroughphylogenetictrees.3.Amongdifferentpopulation,theHCVRNAlevelhadstatisticallysignificantdifferencesindifferentgenotype.InGP,thepatientsinfectedwithgenotype6ahadhigherHCVRNAthanthosewithgenotype3andgenotype1b.InIDUs,thepatientsinfectedwithgenotype6ahadhigherHCVRNAthanthosewithgenotype3andgenotype2a,andthepatientsinfectedwith2ahadlowerHCVRNAthanthosewithgenotype2a.TheHCVRNAlevelhadstatisticallysignificantdifferencesinpatientssingleinfectedwithHCVandthosewithHCVandHBVco-infection(allP<0.05).4.Amongdifferentpopulation,theALTandASThadnostatisticallydifferencesindifferentgenotype,andtheALTandASTlevelhadnostatisticallydifferencesinpatientssingleinfectedwithHCVandthosewithHCVandHBVco-infection(allP>0.05).IV 5.Throughthecorrelationanalysis,HCVRNAhadnocorrelationwithALTorAST.Conclusion:1.ThemainHCVgenotypeis1bingeneralpopulation;however,themainHCVgenotypeis6aininjectingdrugusers.2.ThegeneralpopulationpatientshadhigherlevelofHCVRNAthanthoseoftheinjectingdrugusers,andHBVandHCVco-infectionhaddifferentHCVreplicationlevelamongdifferentpopulation.Keywords:HCVgeneralpatientsinjectingdrugusersgenotypeHCVRNAV 第1章绪论第1章绪论据世界卫生组织统计，全球约1.85亿人感染HCV，每年因HCV感染导致死亡人数约35万[1,2]。我国流行病学调查显示，我国1-59岁临床患者抗HCV阳性率为0.43%，约560万[3]。HCV感染后约15%-45%的患者能自发清除病毒，55%-85%的患者发展为慢性感染。20年内15%-30%慢性感染患者会发展为肝纤维化或肝硬化，其中每年约有2%-4%患者发展为肝癌[4]。由于HCV起病隐匿，容易被人们所忽视,绝大多数感染者等到表现出明显的症状意识到感染了HCV。目前聚乙二醇干扰素和利巴韦林联合的抗病毒治疗方案对HCV的治疗还比较成功，尤其是直接抗病毒药（DAAs）的出现，使1型的病毒持续应答率（SVR）上升到了90%，但是除药品价格昂贵和副作用之外，在治疗过程中还需要监测各项指标，如病毒载量，肝功能，基因型，使得HCV的治疗还很受限。1.1HCV基因型与疾病的关系HCV感染后引起急、慢性肝炎，如不及时得到治疗甚至发展为肝纤维化，肝硬化和肝癌，因此及时抗病毒治疗就显得至关重要。而在治疗过程中各项指标的监测也尤为重要。如反映肝细胞炎症程度的肝酶学指标（主要为ALT），反映病毒复制活跃和衡量抗病毒疗效的病毒学应答指标的病毒载量和作为抗病毒方案选择依据的基因型指标。有资料显示，HCV基因型之间病毒载量具有明显差异，如张红梅[5]等报导慢性HCV感染患者1b型和3b型病毒载量明显高于2a型。唐维等也有类似的报导慢性HCV感染患者1型和6a型的病毒载量要明显高于3型患者[6]。对各基因型肝损伤的研究中，有学者认为不同基因型与肝损伤疾病进展和转归密切相关，因为ALT是肝组织损伤指标，其升高在一定程度上能反应肝细胞损伤程度。但也有学者认为不同基因型肝功能无显著差异[5,7]，因此不同型别与肝功能的相关性还存在争议。由此可见，在HCV抗病毒治疗中需要监测各项实验室指标，且在抗病毒治疗前还需进行基因型的检测。1.2HCV基因型检测方法HCV属于黄病毒科肝炎病毒属，其基因组全长9.6kb，为单股正链RNA病毒。1 南华大学硕士论文HCV基因组主要由9个区域构成，从5'端开始依次为5'非编码区（5'UTR区），核心蛋白区（C区），包膜蛋白区（E1,E2区）及P7，非结构蛋白区（NS2,NS3,NS4和NS5区）和3'非编码区（3'NCR区），在HCV进入和复制过程中分别扮演着不同角色。HCV基因分型的方法有：直接测序，限制性片段长度多态性分析，特异性探针杂交方法，基因芯片和遗传系统进化树分析方法。目前HCV分型最准确的方法对全基因组扩增，测序后构建进化树分析。由于全基因组扩增难度大，通常只选择某个区段进行扩增，主要分型区段为5'UTR，core/E1和NS5B区。有报导称目前所使用的建立在5'UTR最保守区的分型结果在基因型水平上准确性与NS5B区的测序分型结果相比,一致性>95%。虽然对NS5B区进行扩增是HCV基因分型的“金标准”，但对5'UTR扩增测序并分型也具有可靠性。1.3HCV基因型全球分布特点HCV是高度异质性RNA病毒，根据HCV基因组核苷酸的序列的差异将HCV分为7个基因型和多个亚型[8]。每种基因型核苷酸差异为30%-35%，每种亚型的核苷酸差异为20%-25%。HCV基因型及亚型的分布存在着明显的地域性。一般来说，1型，2型和3型呈全球性分布，在美国，欧洲，日本和中国超过70%的HCV感染者为1b型[9]，而且主要为输血传播。美国北部，欧洲和亚洲10%-30%HCV感染者基因型主要为2a和2b[10]。印度和东南亚以3型为主[11]，4型主要分布在非洲和地中海中部和北部[12，13]，5型主要分布在南非[14]，6型主要分布在中国香港和东南亚国家[15，16]。中国HCV基因型主要为1b和2a型[17，18]，其它型别相对少见，在邻近东南亚的西南地区和广东地区，6a型已取代2a型成为第二大主要基因型[19]。1.4我国HCV基因型分布特点中国HCV基因型主要有1，2，3和6型，在我国大部分地区临床患者中1b和2a型基因型仍然较为常见，其中以1b型为主,2a型次之。一些地区有1a、3a和3b型及多种混合型的报道，6型主要见于香港和澳门地区,而华南、西南等南方边境省份由于地理位置的特殊性使得HCV基因型分布具有其独特性。近来年由于人口流动和静脉吸毒人群的增加，中国的基因型分布已逐渐变化。1b型和2a型流行率逐渐降低，3型和6a型流行率逐渐增加。中国HCV基因型分布2 第1章绪论除具有地理差异外，还存在人群差异。我国临床患者仍以1b型和2a型为主，但吸毒人群则以6a型和3型为主[20-22]，而且在西南地区尤其明显。云南地区HIV/HCV共感染的吸毒人群主要以6型和3型为主，分别占21.5%和59.7%。而另一篇关于云南吸毒人群HCV基因型分布的报导称该地区主要以6和3型为主，分别为47%和41%，广东地区更是6a型已取代2a型成为仅次于1b型的基因型[19，23，24]，可能HCV由高危人群向临床患者传播。总之，中国临床患者仍以1b型和2a型为主，但由于血液制品的严格筛查和静脉吸毒人群的增加，1b和2a型感染比率逐渐下降，而6a和3型感染率逐渐增加，而且HCV正由高危人群向临床患者扩散。3 南华大学硕士论文本研究目的至今为止，HCV尚无可预防性的疫苗和可以完全治愈的药物，因此目前的抗病毒药物只能是遏制HCV的复制，阻止病情的进一步进展。除了控制病情，还应该对其预防，而准确的流行病学资料是最有力的依据。郴州处于中部地区，比较缺乏HCV感染情况的研究，尤其是吸毒人群，因此掌握本地区HCV感染情况对疾病的预防、控制和治疗具有重要参考价值。第一，HCV基因型分布具有地理和人群差异，了解本地区HCV基因型分布及其进化情况，有助于为HCV感染患者抗病毒方案的选择和流行趋势提供依据。第二，HCVRNA是病毒复制活跃程度和抗病毒疗效应答的指标，肝功能是反应肝脏炎症程度的敏感性指标，了解HCV感染患者病毒载量和肝功能情况能为抗病毒疗效和进一步的抗病毒治疗提供客观依据。总之，本研究的最终目的在于了解郴州地区HCV感染患者基本感染情况和基因型分布及其进化特点，为相关人群的疾病防控和治疗提供数据支持。4 第1章绪论5 南华大学硕士论文第2章材料和方法2.1实验材料2.1.1研究对象临床患者：收集2014年4月至2015年1月郴州市第一人民医院中心医院抗HCV阳性住院患者血样，排除梅毒，HIV抗体阳性和吸毒史，共127例，采集患者临床信息，包括年龄，临床表现，既往病史等。吸毒人群：与郴州市疾病中心合作采集2014年8月至2014年11月美沙酮门诊和戒毒所具有吸毒史人群的血样，排除梅毒和HIV抗体阳性，经检测采集抗HCV阳性患者血样269例。由经过培训的美沙酮专科医生对入组患者进行问卷调查，包括年龄、吸毒方式等。该研究在伦理委员会和患者知情同意下进行。2.1.2主要试剂淋巴细胞分离液（美国GE公司）丙型肝炎抗体检测试剂盒（北京万泰股份公司）乙型肝炎表面抗原检测试剂盒（北京万泰股份公司）丁型肝炎抗体检测试剂盒（北京万泰股份公司）TIANampVirusDNA/RNAKit（DP315）（天根生化科技公司）TranscriptorcDNASynthesisKit（德国Roche公司）TaqPCRMastermix(KT201)（天根生化科技公司）PowerUPSYBRGreenMasterMIX(life公司)DM2000(北京康为世纪公司)GoodviewII(北京赛百盛公司)TBEbuffer(天根生化科技公司)琼脂糖（HYDRAGENE）2.1.3实验耗材(l)15ml一次性国产离心管(2)1.5ml一次性进口离心管，进口灭菌带滤芯微量吸头（10ul,100ul,200ul,6 第2章材料和方法1000ul）（美国AXYGEN公司）(3)一次性灭菌乳胶手套，一次性灭菌口罩，巴氏消毒剂(4)一次性真空抗凝采血管（10ml），复合碘皮肤消毒，75%消毒酒精，无水乙醇(5)0.2ml透明平盖PCR管（美国AXYGEN公司）(6)lightcycle8tubestrips（德国罗氏公司）2.1.4主要仪器设备BSC-1300IIA2生物安全柜（苏净安泰公司）-80度冰箱（美国Thermo公司）-20度冰箱（海尔公司）移液器(德国Eppendorf公司)5424R离心机（德国Eppendorf公司）洗板机（美国Thermo公司）荧光化学发光多功能酶标仪（美国Thermo公司）LS-D202恒温孵育器(赛默飞世尔科技公司)高速冷冻离心机（美国Thermo公司）掌式离心机(美国Bio-RAD公司)梯度PCR仪（德国Eppendorf公司）核酸水平电泳仪(美国Bio-RAD公司)凝胶电泳成像分析系统(美国Bio-RAD公司)LightCycler480荧光定量PCR仪(德国罗氏公司)电子天平（上海精密科学仪器有限公司）2.1.5引物表7 南华大学硕士论文HCV引物表病毒区引物名称引物序列(5'-3')核苷酸位置5‘UTR-CF71GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGT71-94F130-2CGGGAGAGCCATAGTGGTCT130-111R751-2GGATGTAYCCCATGAGRTCG751-731R311CTCGCAAGCACCCTATCAGGNS5BF8247GGSTTYTCNTATGAYACCMGNTGYTTTGA8247-8256R9351CTACCCCTACNGNDAGTAGGAGTAGGC9351-9325F8266GCTGYTTTGAYTCAACNGTCAC8266-8287R9302GRGCHYGVGACACGCTGTGATANATGTC9302-9275HDV引物表引物名称引物序列(5'-3')核苷酸位置F856GGATGCCCAGGTCGGACCG856-874R1159AAGAAGAGRAGCCGGCCCGY1159-1140F888ATGCCATGCCGACCCGAAGA888-907R1104GGGGAGCGCCCGGDGGCGG1104-10852.2.实验方法2.2.1样本采集与处理用肝素抗凝管采集临床患者和吸毒人群5-10ml血液，采用梯度分离法用淋巴细胞分离液分离血清，于-80℃储存，用于病毒核酸提取和抗原、抗体检测。2.2.2抗HCV、HDV抗体及HBsAg检测采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测HCV抗体和HBsAg（北京万泰制药）。具体操作步骤如下：1．编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照3孔、阳性对照2孔（HCV抗体检测设4孔）、空白1孔。2．加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照（HBsAg、HDV抗体检测分别加50和10ul，HCV抗体检测在100ul样本稀释样中加入10ul血清样本）。3．温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4．洗板：小心将封板膜揭掉，使用洗板机吸干孔内液体，用稀释的洗涤液洗58 第2章材料和方法次，最后一次尽量扣干。5．加酶：每孔加入酶标试剂100ul，空白孔除外。6．温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。7．重复步骤4。8．显色：每孔加入显色剂A、B液各50ul，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置37℃避光显色15分钟。9．测定：每孔加终止液50ul，轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长于450nm/630nm处，测定各孔OD值。2.2.3ALT和AST检测送郴州市第一人民医院中心医院检验科采用西门子全自动生化分析仪（ADVIA2400）检测。2.2.4血清HCVRNA提取（TIANampVirusDNA/RNAKit（DP315），天根生化科技公司）。按试剂说明书操作如下：1.用移液器将20ulProteinaseK加入一个干净的1.5ml离心管中。2.向离心管中加入200ul血清。3.加入200ulCarrierRNA工作液（为缓冲液GB与CarrierRNA溶液的混合液）。盖上管盖，涡旋振荡15sec混匀。4.在56℃孵育15min。简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体5.加入250ul无水乙醇，此时可能会出现絮状沉淀,盖上管盖并涡旋振荡15s混匀,在室温（15-25℃）放置5min。6.简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体。7.仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-Free吸附柱CR2（吸附柱管中），盖上管盖，10000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放中。8.小心打开吸附柱盖子，加入500ul溶液GD（使用前先加入无水乙醇）盖上管盖，10000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。9.小心打开吸附柱盖子，加入600ul溶液PW（使用前先加入无水乙醇）盖上管盖，静置2min，10000rpm离心1min离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管。9 南华大学硕士论文10.重复此步骤一次。11.小心打开吸附柱盖子，加入500ul无水乙醇，盖上管盖，10000rpm离心1min，弃废液。12.将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心5min，使吸附膜完全变干，弃废液。13.将吸附柱放入一个RNase-Free离心管（1.5ml）中，小心打开吸附柱的盖放置5min，使吸附膜完全变干。向吸附膜的中间部位悬空滴加50ulRNase-FreeddH2O，盖上盖子，室温放置5min。12,000rpm离心2min。14.将提取的病毒核酸分成2管，于-80℃储存。2.2.5cDNA合成（TranscriptorcDNASynthesisKit,Roche公司），按试剂说明书操作如下：逆转录体系为20ul1.用无酶离心管置于冰上按如下体系配液RNA10ulRandomPrimer2ulWater1ul轻轻混匀，离心管壁上液体，65℃10min，然后置于冰上2.用另一无酶离心管置于冰上按如下体系配液TranscriptorReverseTranscriptaseReactionBuffer4ulDeoxynucleotideMix2ulProtectorRNaseInhibitor0.5ulTranscriptorReverseTranscriptase0.5ul轻轻混匀，离心管壁上液体，25℃10min,50℃60min,85℃5min,然后置于冰上。2.2.6HDVRNA扩增通过巢式RT-PCR检测HDV核酸。PCR体系25ul，第一轮，10×TaqMixPlusPCR12.5ul(天根生化)，引物（F856/R1159）各0.1ul，模板0.5ul，RNaseFreeH2O11.8ul。反应条件：94℃3min热启动，94℃30s预变性56℃45s变性72℃30s延伸，72℃10min后延伸，35个循环，4℃保存扩增产物。第二轮，10×Taq10 第2章材料和方法MixPlusPCR10ul(天根生化)，引物（F888/R1104）各0.1ul，模板0.5ul，RNaseFreeH2O14.3ul。反应条件：95℃2min热启动，94℃30s预变性58℃30s变性72℃45s延伸，72℃5min后延伸，35个循环，4℃保存扩增产物。使用的PCR仪为Eppendorf。引物序列见HDV引物表。2.2.7HCV5'UTR-Core区扩增通过巢式逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增5'UTR-Core区筛选HCV核酸阳性样本。PCR体系20ul，第一轮，10×TaqMixPlusPCR10ul(天根生化)，引物（F71/R751-2）各0.5ul，模板1ul，RNaseFreeH2O8ul。反应条件：95℃3min热启动，95℃30s预变性56℃30s变性72℃1min延伸，72℃10min后延伸，40个循环，4℃保存扩增产物。第二轮，10×TaqMixPlusPCR10ul(天根生化)，引物（F130-2/R751-2）各0.5ul，模板0.5ul，RNaseFreeH2O8.5ul。反应条件：95℃3min热启动，95℃30s预变性60℃30s变性72℃1min延伸，72℃10min后延伸，35个循环，4℃保存扩增产物。使用的PCR仪为Eppendorf。引物序列见HCV引物表。2.2.8HCVNS5B区扩增通过巢式RT-PCR扩增NS5B区。PCR体系20ul，第一轮，10×TaqMixPlusPCR10ul(天根生化)，引物（F8247/R9351）各0.5ul，模板1ul，RNaseFreeH2O8ul。反应条件：94℃5min热启动，94℃30s预变性51℃30s变性72℃1min延伸，72℃10min后延伸，40个循环，4℃保存扩增产物。第二轮，10×TaqMixPlusPCR10ul(天根生化)，引物（F8266/R9302）各0.5ul，模板0.5ul，RNaseFreeH2O8.5ul。反应条件：94℃5min热启动，94℃30s预变性55℃30s变性72℃1min延伸，72℃10min后延伸，40个循环，4℃保存扩增产物。使用的PCR仪为Eppendorf。引物序列见HCV引物表。2.2.9凝胶电泳及基因测序配置1.2％的琼脂糖凝胶，使用GoodViewII核酸染料和DM2000Marker凝胶电泳电压为80V，时间为20min，在凝胶成像仪下观察结果5'UTR-Core和NS5B区段阳性为核酸阳性样本，并将阳性扩增产物送至南京金斯瑞公司测序。11 南华大学硕士论文2.2.10HCVRNA定量采用实时荧光定量（realtimePCR）法检测血清中HCVRNA水平。PCR体系20ul，PowerUPSYBRGreenMasterMIX10ul，引物（F130-2/R311）各0.5ul，模板2ul,RNaseFreeH2O7ul。反应条件：95℃10s60℃1min。根据HCV标准品建立的标准曲线由软件自动计算出样本的HCVRNA载量,引物序列见HCV引物表。2.2.11基因部分区段序列分析将PCR产物送南京金斯瑞生物科技公司进行测序，对所分离的HCV采用Mega5.2分析软件，以ClustalW进行序列比对，邻接法(Neighbour-Joining)和Kimura-2-parameter法分析并构建系统进化树，Bootstrap验证复数为1000，Bootstrap值>70%的系统进化分支认为具有较高的可信度。基因型分析采用以GenBank中注册的HCV标准株基因序列为参照。2.3统计方法采用SPSS19.0统计软件进行数据分析。非正态分布的计量资料采用中位数和四分位数间距Ｍ（P25～P75）表示，正态分布的计量资料采用X±SD表示。两个总体率和构成比的差异采用χ²检验，各组间比较正态分布采用单因素方差分析，非正态分布采用Man-WhitneyU检验，P<0.05为差异有统计学意义。12 第2章材料和方法13 南华大学硕士论文第3章实验结果3.1不同人群HCV感染状况分析及基因型分布3.1.1不同人群HCV感染临床特点表1.临床患者与吸毒人群HCV感染临床特征临床患者吸毒人群(n=127)（n=269)性别男71（55.9%）226(84%)女56（44.1%）43(16%)年龄（年）≤3013(10.2%)21(7.8%)31-3922(17.3%)84(31.2%)92(72.5%)≥40164(61%)ALT（U/L)28.15（17.40～56.95）34.60(18.80～57.10)AST(U/L)29.35（21.20～53.45）35.20(19.10～49.90)HCVViralload4.85(3.74～5.55)3.63（2.93～4.48）(log10copies/ml)病毒感染情况HCV+66(52.0%)191(71.0%)HCV+HBV+15(5.6%)15(5.6%)HCV+HBV+HDV+1(0.8%)6(2.2%)注:HCV+:HCVRNA+HCV+HBV+:HCVRNA+HBsAg+HCV+HBV+HDV+:HCVRNA+HBsAg+HDVRNA+14 第3章实验结果本研究共采集396例抗HCV阳性样本，其中临床患者127例，吸毒人群269例。其感染状况见表1.临床患者中，男71例（55.9%），女56例（44.1%）。平均年龄为（48.73±15.77）岁，年龄≤30岁13例(10.2%)，31-39岁22例(17.3%)，≥40岁92例(72.5%)。吸毒人群中，男226例(84%)，女43例(16%)。平均年龄为（40.56±6.67）岁，年龄≤30岁21例(7.8%)，31-39岁84例(31.2%)，≥40岁164例(61%)。通过对两组人群ALT和AST分析发现，临床患者ALT和AST分别为28.15（17.40～56.95）(U/L)和34.60(18.80～57.10)(U/L)，吸毒人群ALT和AST分别为29.35（21.20～53.45）(U/L)和35.20(19.10～49.90)(U/L)。通过realtimePCR检测血清HCVRNA。临床患者平均HCVRNA为4.85（3.74～5.55）log10copies/ml，吸毒人群平均HCVRNA为3.63（2.93～4.48）log10copies/ml。另外，通过Pearson相关性分析发现，一般人群和吸毒人群HCVRNA水平与ALT无相关性(r=0.439,P=0.094;r=0.072,P=0.309)，提示病毒血症水平与肝脏炎症无关。在HCV感染人群中，临床患者HCV单感染（HCV核酸阳性）66例（52.0%），HCV/HBV共感染(HCV核酸和HBsAg均阳性)15例（5.6%），HCV/HBV/HDV共感染(HCV核酸HBsAg和HDV核酸均阳性)1例（0.8%）；吸毒人群HCV单感染191例（71.0%）；HCV/HBV共感染15例(5.6%)，HCV/HBV/HDV共感染6例（2.2%）。吸毒人群中6例为HCV核酸阳性和HDV抗体阳性者不符合分组条件，未进行分组。由上述可见，临床患者和吸毒人群具有高HCV感染率，且吸毒人群HCV单感染率明显高于临床患者。3.1.2不同人群HCV感染及其共感染ALT/AST比较本研究为了检测HCV感染对肝功能的损伤程度，分别对两组人群进行了ALT和AST检测（见图1）。临床患者ALT和AST水平与吸毒人群无统计学差异（P值均>0.05），而且两组人群HCV单感染组ALT和AST水平与HCV/HBV共感染组无统计学差异（P值均>0.05），吸毒人群HCV单感染组ALT和AST水平与HCV/HBV/HDV共感染组差异无统计学意义（P值均>0.05），提示HCV/HBV共感染并不会加重肝损伤。15 南华大学硕士论文ABCDEF图1.两组人群HCV感染ALT/AST比较（图A.B:GP为临床患者，IDU为吸毒人群；图C.D为临床患者，图E.F为吸毒人群）16 第3章实验结果3.1.3不同人群HCV感染及其共感染HCVRNA比较通过采用realtimePCR检测两组人群血清HCVRNA（见图2）发现，临床患者HCVRNA水平明显高于吸毒人群，且差异具有统计学意义（P<0.001）。另外，本研究还通过对两组人群HCV单感染和HCV/HBV共感染病毒载量比较发现，HCV单感染HCVRNA水平明显高于HCV/HBV共感染组，且差异具有统计学意义（P值均<0.05），提示HBV感染可能降低HCV的病毒载量。ABC图2.两组人群HCV感染HCVRNA比较（图A:GP为临床患者，IDU为吸毒人群；图B为临床患者；图C为吸毒人群）17 南华大学硕士论文3.1.4HCV基因型分布情况（5'UTR-C区）为了筛选HCV核酸阳性样本，通过巢式RT-PCR扩增HCV高保守区5'UTR-C。269例吸毒人群和127例临床患者分别有218例和82例HCV核酸阳性样本，分别占81.1%和64.6%，并将全部核酸阳性样本进行测序。根据测定样本的核酸序列和GenBank下载的参考序列,分别进行5'UTR-C区段同源关系进化树确定各基因亚型。临床患者中1，2，3和6型分别各占35.3%，9.8%，23.2%和30.5%，未发现4型和5型。其中1a型2例（2.4%）,1b型27例（32.9%），2a型8例（9.8%），3a型4例（4.9%），3b型15例（18.3%），6a型22例（26.8%），6n型3例（3.7%）混合型（2a+1a）1例(1.2%)。吸毒人群中1，2，3和6型分别各占4.2%，3.7%，32%和59.2%，未发现4型和5型。其中1a型1例（0.5%）,1b型8例（3.7%），2a型8例（3.7%），3a型39例（17.9%），3b型31例（14.1%），6a型129例（59.2%），混合型（2a+6a,3a+1a）2例(0.9%)。临床患者和吸毒人群HCV基因型分布具有统计学差异（χ²=57.715，P<0.001），吸毒人群中HCV基因型以6a为主，而临床患者中主要以1b为主。结果见表2.表2.两组人群HCV基因型分布（5'UTR-C）临床患者吸毒人群基因型χ²P（n=82)n=218)1a2（2.4%）1（0.5%）57.7150.0001b27（32.9%）8（3.7%）2a8（9.8%）8（3.7%）3a4（4.9%）39（17.9%）3b15（18.3%）31（14.1%）6a22（26.8%）129（59.2%）6n3（3.7%）0（0%）混合型1（1.2%）2（0.9%）根据构建的同源关系进化树（见图3），不同人群1b，2a，3a，6a亚型样本均各自集中地成簇分布，同参考病毒株相比分支较短，临床患者和吸毒人群各间的遗传距离分别为1b型（0.0165和0.0053），2a型(0.0169和0.0234)，3a型（均为0.01606和0.0123），6a型（0.0165和0.2095），表明这些亚型样本具有共同起源，而3b型则分布比较分散，在进化树中相对分散性与差异分布，18 第3章实验结果说明他们具有不同的来源。ACZ_GP0053CZ_GP0113CZ_GP0067CZ_GP0073CZ_GP0037CZ_GP0115CZ_GP0046CZ_GP0117CZ_GP0085CZ_GP0107CZ_GP00426aCZ_GP0048CZ_GP0040CZ_GP0064CZ_GP0028866a_Y120836a_AY859526CZ_GP0068CZ_GP0074CZ_GP008896CZ_GP0089CZ_GP0090CZ_GP008180CZ_GP00836n99CZ_GP00826n_DQ2788942a_D00944CZ_GP003596CZ_GP012399CZ_GP0017CZ_GP00302aCZ_GP0125CZ_GP0101CZ_GP0029CZ_GP0077CZ_GP00791b_M58335CZ_GP00201b_D90208CZ_GP0110CZ_GP0059CZ_GP0057CZ_GP0022CZ_GP0056CZ_GP0071CZ_GP0060CZ_GP0069CZ_GP0127CZ_GP00101bCZ_GP0080CZ_GP0009CZ_GP0027CZ_GP0001CZ_GP0052CZ_GP0109CZ_GP0047CZ_GP0066CZ_GP0076CZ_GP0105CZ_GP0025CZ_GP0062CZ_GP0102CZ_GP011983CZ_GP0002CZ_GP0016CZ_GP00083a993a_D17763CZ_GP01081a_M6232198CZ_GP00431a99CZ_GP0049CZ_GP0003CZ_GP00159972CZ_GP0099CZ_GP0116CZ_GP0041CZ_GP00363b_D49374CZ_GP00323bCZ_GP0034CZ_GP0031CZ_GP0038CZ_GP0094CZ_GP0051CZ_GP0044CZ_GP0039CZ_GP01240.0119 南华大学硕士论文BCZ_IDU314690CZ_IDU301197CZ_IDU3096792a_D009442a75CZ_IDU3172CZ_IDU3126CZ_IDU3040CZ_IDU3142CZ_IDU3205CZ_IDU307099CZ_IDU2071CZ_IDU3175CZ_IDU2073CZ_IDU3137CZ_IDU3061CZ_IDU3180CZ_IDU1037CZ_IDU3145CZ_IDU3181CZ_IDU3140CZ_IDU31626aCZ_IDU309899CZ_IDU3010CZ_IDU3134CZ_IDU2117CZ_IDU3107CZ_IDU30796a_Y12083CZ_IDU3129CZ_IDU314788CZ_IDU2083CZ_IDU2148CZ_IDU211392CZ_IDU3091CZ_IDU31251b_D90208CZ_IDU3209CZ_IDU30131b_M58335CZ_IDU3179CZ_IDU3030CZ_IDU3002CZ_IDU31921bCZ_IDU314970CZ_IDU3103CZ_IDU2032CZ_IDU315172CZ_IDU1015CZ_IDU3138CZ_IDU1110CZ_IDU1086CZ_IDU104076CZ_IDU2121CZ_IDU3207CZ_IDU318872CZ_IDU3015CZ_IDU3113CZ_IDU30811a_M62321CZ_IDU30531a99CZ_IDU2108CZ_IDU3115CZ_IDU3062CZ_IDU1147CZ_IDU2146CZ_IDU31663a_D17763CZ_IDU2017CZ_IDU3087CZ_IDU2015CZ_IDU1076CZ_IDU308985CZ_IDU1046CZ_IDU310090CZ_IDU3063CZ_IDU3097CZ_IDU3084CZ_IDU3117CZ_IDU3201CZ_IDU200987CZ_IDU3200CZ_IDU3102CZ_IDU3139CZ_IDU3184CZ_IDU3199CZ_IDU3088CZ_IDU2037CZ_IDU3042CZ_IDU1151CZ_IDU3127CZ_IDU3038CZ_IDU2078CZ_IDU3159CZ_IDU3122CZ_IDU3026CZ_IDU3190CZ_IDU1121CZ_IDU2084CZ_IDU1193CZ_IDU3094CZ_IDU3085CZ_IDU2047CZ_IDU3135CZ_IDU3029CZ_IDU3072CZ_IDU3171CZ_IDU3189CZ_IDU3204CZ_IDU3176CZ_IDU31203aCZ_IDU315096CZ_IDU3019CZ_IDU3196CZ_IDU3068CZ_IDU3128CZ_IDU3024CZ_IDU3054CZ_IDU3074CZ_IDU3105CZ_IDU3185CZ_IDU2138CZ_IDU2023CZ_IDU1166CZ_IDU1074CZ_IDU1083CZ_IDU1070CZ_IDU1034CZ_IDU3004CZ_IDU1124CZ_IDU3123CZ_IDU3037CZ_IDU3153CZ_IDU2042CZ_IDU3069CZ_IDU3009CZ_IDU3177CZ_IDU2004CZ_IDU2012CZ_IDU3001CZ_IDU3066CZ_IDU3152CZ_IDU3036CZ_IDU3116CZ_IDU3132CZ_IDU3032CZ_IDU3065CZ_IDU1051CZ_IDU2002CZ_IDU3191CZ_IDU1059CZ_IDU3101CZ_IDU3104CZ_IDU3008CZ_IDU3093CZ_IDU3148CZ_IDU3163CZ_IDU3194100CZ_IDU3197CZ_IDU31616a_AY85952690CZ_IDU11663b_D49374CZ_IDU2015CZ_IDU1030CZ_IDU212899100CZ_IDU2136CZ_IDU30800.01CZ_IDU1044CZ_IDU1201CZ_IDU307777CZ_IDU1043CZ_IDU2040CZ_IDU2074CZ_IDU1053CZ_IDU3078CZ_IDU30833bCZ_IDU3006CZ_IDU3050CZ_IDU2128CZ_IDU3025CZ_IDU2088CZ_IDU3133CZ_IDU2028CZ_IDU213679CZ_IDU2030CZ_IDU3208CZ_IDU204679CZ_IDU30510.01图3.不同人群HCV5'UTR-C基因同源关系进化树（为地方参考序列）(图A为临床患者，图B为吸毒人群)20 第3章实验结果3.1.5HCV基因型分布情况（NS5B区）由于NS5B扩增，测序并进行进化树分析成为HCV基因分型的“金标准”，因此本研究采用巢式RT-PCR扩增HCVNS5B区，进一步验证扩增5'UTR-C区分型结果。我们筛选部分1b，2a和6a型临床患者和吸毒人群部分样本扩增NS5B区进行测序，根据测定样本的核酸序列和GenBank下载的参考序列,分别进行NS5B区段同源关系进化树确定各基因亚型。临床患者成功分型45例，吸毒人群成功分型61例。临床患者中1，2和6型分别各占36.4%，31.8%和31.8%，也未发现4型和5型。其中1b型16例（36.4%），2a型14例（31.8%），6a型15例（31.8%）。吸毒人群中1，2和6型分别各占4.9%，18.1%和77%，未发现4型和5型。其其中1b型3例（4.9%）,2a型11例（18.1%），6a型47例（77%）。并且临床患者和吸毒人群HCV基因型分布具有统计学差异（χ²=25.379，P<0.001）。由此可见，临床患者HCV基因型以1b为主，而吸毒人群主要以6a型为主，与5'UTR-C区分型情况基本一致。表3.不同人群HCV基因型分布（NS5B）临床患者吸毒人群基因型χ²P（n=44)（n=61)1b16(36.4%)3(4.9%)25.3790.0002a14(31.8%)11(18.1%)6a14(31.8%)47(77%)根据构建的同源关系进化树（见图4），不同人群1b，2a和6a型样本均各自集中地成簇分布，同参考病毒株相比分支较短，临床患者和吸毒人群各型的遗传距离分别为1b型（0.051和0.132），2a型（均为0.045），6a型为（0.042和0.037）表明这些亚型样本具有共同起源。21 南华大学硕士论文ACZ_GP0022CZ_GP0025CZ_GP0062CZ_GP0119CZ_GP0127CZ_GP0009CZ_GP0105CZ_GP0060CZ_GP01021bCZ_GP0047CZ_GP0052CZ_GP0001CZ_GP0027CZ_GP005699CZ_GP0020921b_M58335CZ_GP0069CZ_GP00286a_Y1208399CZ_GP0048CZ_GP00406a_AY859526CZ_GP007499CZ_GP005387CZ_GP00646aCZ_GP0073CZ_GP0113CZ_GP0037CZ_GP0068CZ_GP0046CZ_GP0042CZ_GP0085CZ_GP01072a_D00944CZ_GP0017CZ_GP0123CZ_GP012599CZ_GP002999CZ_GP0077CZ_GP0101CZ_GP00712aCZ_GP011498CZ_GP008092CZ_GP001079CZ_GP005984CZ_GP0067CZ_GP0076CZ_GP00810.02B22 第3章实验结果CZ_IDU1190CZ_IDU2047CZ_IDU2012CZ_IDU3189CZ_IDU1093CZ_IDU105197CZ_IDU2076CZ_IDU1074CZ_IDU3085CZ_IDU1121CZ_IDU1170CZ_IDU1040CZ_IDU3102CZ_IDU2009CZ_IDU2017CZ_IDU2032CZ_IDU3053CZ_IDU2125CZ_IDU2108CZ_IDU3207CZ_IDU2056CZ_IDU3072CZ_IDU3066CZ_IDU3122CZ_IDU3166CZ_IDU108674CZ_IDU2091CZ_IDU31676a93CZ_IDU3191CZ_IDU2034CZ_IDU3021CZ_IDU3123CZ_IDU10706a_Y12083CZ_IDU2113CZ_IDU317994CZ_IDU214684CZ_IDU2148CZ_IDU20236a_AY859526CZ_IDU3107CZ_IDU3126CZ_IDU2105CZ_IDU2071CZ_IDU2042CZ_IDU3137CZ_IDU21229971CZ_IDU1037CZ_IDU3138CZ_IDU3140CZ_IDU2065CZ_IDU3147CZ_IDU3070CZ_IDU3142CZ_IDU3145CZ_IDU31761b_M58335CZ_IDU11101b9977CZ_IDU1204CZ_IDU3015CZ_IDU31482a_D0094498CZ_IDU301794CZ_IDU300299CZ_IDU318785CZ_IDU3162CZ_IDU20262a78CZ_IDU3127CZ_IDU3132CZ_IDU3150CZ_IDU3165CZ_IDU3180CZ_IDU1026CZ_IDU31640.02图4.不同人群HCVNS5B基因同源关系进化树（为地方参考序列）(图A为临床患者，图B为吸毒人群)23 南华大学硕士论文3.1.6不同人群HCV单感染者各基因型ALT和AST比较通过巢式RT-PCR扩增HCV5'UTR-C段，将PCR产物测序分型，HCV单感染患者中，临床患者1b型22例，2a型7例，3型12例，6a型21例，其它型别4例；吸毒人群HCV单感染患者1b型7例，2a型6例，3型60例，6a型115例，其它型别3例。有资料显示，HCV感染会对肝功能造成不同程度的损伤，为了解各基因型对肝功能的影响，本研究对HCV各基因型ALT和AST进行分析发现（见图5），临床患者和吸毒人群各基因型之间ALT和AST水平无统计学差异（P值均>0.05）。另外，1b,2a，3和6a各基因型之间两组人群ALT和AST水平差异无统计学意义（P值均>0.05）（见图6）。ABCD图5.不同人群HCV单感染者各基因型之间ALT和AST比较(图A.B为临床患者，图C.D为吸毒人群)24 第3章实验结果ACEGBDFH图6.HCV各基因型中不同人群ALT和AST比较（图A.B为1b型，图C.D为2a型，图E.F为3型，图G.H为6a型）3.1.7不同人群HCV单感染者各基因型别HCVRNA比较本研究分别对HCV单感染者各基因型HCVRNA水平分析发现(见图7)，吸毒人群1b型，2a,3和6a型的HCVRNA平均水平分别为(4.06±1.15)log10copies/ml(2.19±0.68)log10copies/ml(3.52±0.92)log10copies/ml和(3.92±1.02)log10copies/ml，6a型的HCVRNA平均水平最高，其次为1型，不同基因型间HCVRNA平均水平的总体比较差异有统计学意义(F=6.528，P<0.001)两两比较6a型HCVRNA平均水平明显高于3型和2a型，1b型和3型HCV水平明显高于2a型，见图7.临床患者中，HCV基因型HCVRNA平均水平的总体比较差异无统计学意义(F=2.504，P=0.07)，但6a型HCV25 南华大学硕士论文RNA平均水平较高，高于3型(P<0.05)，见图7.本研究还通过比较比较各型别两组人群HCV单感染患者HCVRNA水平发现，临床患者感染HCV2a型，3型和6a型HCVRNA水平明显高于吸毒人群组，且差异具有统计学意义（P值均<0.01），虽然临床患者1b型HCVRNA水平明显高于吸毒人群组，但差异无统计学意义（P>0.05）（见图8）。AB图7.不同人群HCV单感染者各型别之间HCVRNA比较（图A为临床患者，图B为吸毒人群）AB26 第3章实验结果CD图8.HCV各型别中不同人群HCV单感染者HCVRNA比较（图A:1b型，图B:2a型，图C:3型，图D:6a型）3.2HCV基因进化分析（NS5B区）为了研究郴州地区不同人群HCV基因亚型进化起源，将本地区HCV病毒株序列和已上传至PubMed数据库的中国南方其它地区病毒株序列构建进化树（NS5B区）进行分析。Bootstrap值>70%的系统进化分支认为具有较高的可信度。1b型进化树中，来自临床HCV患者分离的病毒株分散在广州株附近，吸毒人群HCV病毒株的其中1株与云南病毒株分布于一个分枝，表明临床患者1b型HCV病毒株可能由广州传入本地区，而吸毒人群病毒株可能起源于广西地区。2a型进化树根据基因相似度和进化距离主要分为两簇，A簇临床患者和吸毒人群病毒株序列相嵌分布，并且与武汉株分布在一个分枝，表明HCV由吸毒人群向临床患者传播；B簇为来自临床患者HCV病毒株，邻近湖北株分布，表明本地区临床患者和吸毒人群HCV病毒株可能起源于湖北地区。6a进化树中，不同人群病毒株分布分散，与参考株没有共同来源。27 南华大学硕士论文HCV-1bCZ_GP00251b_GQ205760_GuangzhouCZ_GP0022CZ_GP0119CZ_GP0052CZ_GP0102CZ_GP0127CZ_GP0009CZ_GP0027CZ_GP0020CZ_GP004793CZ_GP0105CZ_GP0056CZ_GP0060CZ_GP0062CZ_GP0069CZ_GP00011b_KF292130_GuangxiCZ_IDU3015CZ_IDU1110CZ_IDU3176731b_KT735853_Yunnan791b_KT735812_Kunming1b_KC878949_Nanjing1b_AY835018_Shanghai931b_JX183282_Wuhan1b_AY835020_Shenzheng0.00528 第3章实验结果HCV-2aCZ_IDU3002CZ_GP0114CZ_GP0081CZ_GP0071CZ_GP0010CZ_IDU3017CZ_IDU3162CZ_IDU3127CZ_IDU315099CZ_IDU3180CZ_IDU2026CZ_GP0067CZ_GP0076CZ_GP008070CZ_IDU3132CZ_IDU3165CZ_IDU3187CZ_GP00592a_JX183289_Wuhan2a_GQ208088_Guangzhou2a_JN977113_Shanghai2a_KF793394_Guangzhou2a_KC878941_Nanjing2a_GQ285266_Yunnan2a_AY834966_Shenzhen2a_KM1523557_HubeiCZ_GP012581CZ_GP0017CZ_GP0101CZ_GP0077CZ_GP0123CZ_GP00290.0129 南华大学硕士论文HCV-6aCZ_IDU2017CZ_IDU2108CZ_IDU3053CZ_GP0073CZ_GP0113CZ_IDU2032CZ_GP0085CZ_GP0068CZ_GP0107CZ_IDU31026a_JN977076_Shanghai6a_JX183342_WuhanCZ_IDU1040CZ_GP0053CZ_GP0064CZ_GP0074CZ_IDU11216a_JF721181_ChangshaCZ_IDU2056CZ_IDU3123CZ_IDU3066CZ_IDU3122CZ_IDU10866a_JF721196_KunmingCZ_GP0046CZ_GP0037CZ_IDU2034CZ_IDU31666a_GQ205950_GuangzhouCZ_IDU3072CZ_IDU2047CZ_IDU2009CZ_GP0042CZ_IDU1051CZ_IDU2012CZ_IDU3085CZ_IDU3189CZ_IDU2113CZ_IDU2148CZ_IDU21466a_JF721186_FujianCZ_IDU3179CZ_GP00486a_JF721188_GuangxiCZ_GP00286a_GQ205993_GuangzhouCZ_IDU3107CZ_IDU3126CZ_IDU2042CZ_IDU2071CZ_IDU1037CZ_IDU31386a_AY859526_Hongkong6a_JF721183_FujianCZ_IDU3070CZ_IDU3142CZ_IDU3147CZ_IDU2065CZ_IDU2105CZ_IDU3137CZ_IDU3145CZ_GP00406a_JF721193_HangzhouCZ_IDU31400.005图9.不同人群HCVNS5B亚型进化树分析（为地方参考序列）30 第3章实验结果31 南华大学硕士论文第4章讨论据世界卫生组织统计，全世界约1.85亿人感染HCV，我国临床患者抗HCV阳性率为0.43%，约560万[1-3]。研究表明在许多发达国家，静脉吸毒已成为HCV感染的高危因素[25]，而且吸毒人群中HCV的感染率更高，显然本研究的结果与报道基本一致。目前HCV感染已成为慢性肝炎的主要原因之一，由于HCV起病隐匿，多数患者症状不明显，容易被人们所忽视，因此感染者未能及时得到治疗，而造成不同程度的肝损伤，大部分发展为慢性感染。本研究对不同人群的ALT和AST检测发现，临床患者和吸毒人群肝损伤无显著差异，而且两组人群HCV/HBV共感染也并没有使ALT水平增加，与笔者的另一篇报导一致[26]。可能与HCV/HBV共感染引起的肝损伤会相互抑制有关，或者患者当时正处于免疫耐受期，肝组织学无明显异常或轻度炎症坏死，以致HCV感染引起的肝组织炎症反应与病情严重程度不一致。同时本研究还发现不同人群HCV感染基因型之间肝损伤无明显差异，与张红梅和周泉等的报导一致[5，7]，可能是患者感染型别比较单一，病毒载量相对较低，机体免疫应答所引起的炎症反应较轻，从而肝损伤程度较轻。HCVRNA是病毒复制活跃及抗病毒疗效应答的指标，因此在抗病毒治疗中显得尤为重要。本研究通过对不同人群HCVRNA分析发现，临床患者HCVRNA水平明显高于吸毒人群组。可能是由于临床患者年龄偏大，而且入院前并没有意识到感染了HCV，感染时间长，未经过治疗，导致病毒复制水平上升；而吸毒人群相比临床患者年龄偏小，身体状况相对好，反复暴露，易感染多种病毒，使机体发生交叉免疫，促使HCV中和抗体的产生，导致其血清病毒复制水平降低。同时本研究还发现HCV单感染组HCVRNA水平明显高于HCV/HBV共感染组，与Chu等报导一致[27]。可能由于HBV属于DNA病毒，感染后更稳定，能够竞争合成所需的核苷酸，当HBVDNA合成增加时，影响HCVRNA的合成；另一方面，HBV感染后诱导产生的细胞因子能够清除病毒。由于HCVRNA聚合酶缺乏校正功能，使得其高度变异，而不同基因型病毒具有不同的生物学特性，包括病毒的复制能力和致病能力，因此HCV的基因型与血清病毒含量之间可能存在一定的相关性。许多研究也表明，吸毒人群HCV32 第4章讨论各基因型HCVRNA水平总体比较具有显著差异[6,28-30]，而且6a型的HCVRNA平均水平最高。临床患者中，HCV基因型HCVRNA平均水平总体比较差异无统计学意义,但6a型HCVRNA平均水平高于3型。可能是由于6a型HCV基因型的传播和流行与其高病毒滴度和社会行为有密切的相关性。通过相关性分析发现不同人群肝损伤与病毒载量无相关性，表明肝脏炎症[31]活动程度与病毒血症无关，与雷华等报导一致，这可能是HCV不直接杀伤肝细胞，肝细胞损伤及炎症发生的主要机制是机体清除病毒时引起的免疫应答；或者是机体表现出滞后反应，使得肝炎症程度与疾病严重程度不平行。由于HCV基因型是抗病毒方案选择和预后指标，因此在抗病毒治疗前应该进行基因型检测。HCV基因型的分布具有地区差异性，一项对我国23个医院的[32]1012例HCV慢性感染者的研究表明，我国HCV基因型仍以1b型为主，2a型次之[21，22]。本研究显示本地区临床患者HCV感染以1b型为主，与我国HCV基因型流行趋势一致，但感染率明显低于中国其它大部分地区，可能是由于近年来普遍实施系统化的血液及血制品筛查，输血相关感染降低，因此1b型感染率有所降低。其次本研究临床患者6a型成为仅次于1b型的感染型别，与Fu[19]报导的广东珠江三角洲地区6a型已取代2a型成为当地仅次于1b型的HCV感染型别一致，由于人口流动和吸毒人群的增加使HCV感染由高危人群向临床患者扩散，进化树分析结果进一步证明了这点。HCV基因型分布不仅存在地区差异性，还存在人群差异性。研究表明，6型主要分布于东南亚和中国香港及部分南方边境地区，而且6a型和３型多见于静[20-22][16]脉吸毒人群。有研究表明香港吸毒人群中6a型占52.4%，西南地区吸毒人群HCV基因型主要以6型和3型为主。如云南地区HIV/HCV共感染的吸毒人群主要以6型和3型为主，分别占21.5%和59.7%。而另一篇关于云南昆明吸毒人群HCV基因型分布的报导称该地区3型占79.2%，6型占17.6%。贵州吸毒人群6a型和3型分别占28.1%和57.3%。重庆地区吸毒人群6a和3型分别占34.9%和43.4%[23,33，34]。而且Yan[20]等和Raptopoulou[35]等的研究表明地理位置相近和静脉吸毒人群增多，加速了HCV的传播，使得HCV基因型和地理分布发生了改变。广东和香港地区靠近东南亚地区和“金三角地区”,毒品走私以及静脉吸毒人群的增加，使得这些地区HCV感染率增加；另外，便利的交通和繁荣的经济，33 南华大学硕士论文使得这些地区人口流动性增加,加速了HCV的传播。另一项研究也显示，广东省HCV6a型可能起源于越南，然后向中国其它地方扩散。而郴州地区靠近广东地区，因此HCV基因型分布与广东地区相似。但本研究通过进化树分析发现本地区6a型传入途径不明，可能是由于样本纳入存在偏差，只对部分本进行NS5B扩增测序，而且未纳入HCV抗体阴性的感染患者；也可能是由于大多为慢性感染患者，病毒在体内不断突变，使得HCV6a型成为具有地区特异性的型别。另外，发现少量混合型感染情况，如2a+6a,3a+1a可能与病毒基因重组和人口流[36，37]动相关。总之，本研究对郴州地区不同人群HCV感染状况和分子流行病学进行了分析，基因掌握了其病毒感染特点和基因型分布情况，以及不同型别病毒载量和肝功能的影响，可为相关人群的疾病防控提供数据支持。此外，从两个群体的高感染率和患病率来看，加强毒品控制的同时还应该重视该人群中肝炎病毒特别是HCV的调查与干预，减少HCV的传播，延缓疾病的进展。34 第4章讨论35 南华大学硕士论文第5章结论1.临床患者HCV基因型主要以1b为主，而吸毒人群以6a为主。2.临床患者病毒载量高于吸毒人群，而且在两组人群中HBV和HCV共感染中病毒复制水平不平衡。36 南华大学硕士论文37 南华大学硕士论文参考文献[1]MohdHanafiahK,GroegerJ,FlaxmanAD,etal.GlobalepidemiologyofhepatitisCvirusinfection:newestimatesofage-specificantibodytoHCVsero-prevalence.[J]Hepatology(Baltimore,Md).2013;57(4):1333-42.[2]LavanchyD.TheglobalburdenofhepatitisC.[J]Liverinternational:officialjournaloftheInternationalAssociationfortheStudyoftheLiver.2009;29Suppl1:74-81.[3]丙型肝炎防治指南(2015年更新版).中华实验和临床感染病杂志(电子版)2015.[4]GuidelinesfortheScreening,CareandTreatmentofPersonswithHepatitisCInfection.Geneva:WorldHealthOrganization2014.;2014Apr.[5]张红梅,王建芳,张小玉,等.慢性丙型肝炎患者病毒基因分型与肝生化、脂代谢血清学指标的相关性研究.[J]肝脏.2014(12):963-967.[6]唐维,苏明华,江建宁,等.广西地区丙型肝炎病毒的基因型分布与流行病学特征.[J]世界华人消化杂志.2014(09):1300-1306.[7]周泉,李艳,童永清,等.武汉地区丙型肝炎病毒基因分型与慢性丙型肝炎患者肝功能和血液指标分析.[J]国际检验医学杂志.2013(13):1693-1695.[8]SimmondsP.GeneticdiversityandevolutionofhepatitisCvirus--15yearson.[J]TheJournalofgeneralvirology.2004;85(Pt11):3173-88.[9]SultanaC,OprisanG,SzmalC,etal.MolecularepidemiologyofhepatitisCvirusstrainsfromRomania.[J]Journalofgastrointestinalandliverdiseases:JGLD.2011;20(3):261-6.[10]ChungH,UedaT,KudoM.ChangingtrendsinhepatitisCinfectionoverthepast50yearsinJapan.[J]Intervirology.2010;53(1):39-43.[11]RehanHS,ManakS,YadavM,etal.DiversityofgenotypeandmodeofspreadofHepatitisCvirusinNorthernIndia.[J]Saudijournalofgastroenterology:officialjournaloftheSaudiGastroenterologyAssociation.2011;17(4):241-4.[12]Abdel-HamidM,El-DalyM,MolnegrenV,etal.Geneticdiversityinhepatitis38 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南华大学硕士论文中国丙型肝炎病毒基因型分布的研究进展摘要丙型肝炎病毒（HCV）在全球范围内流行，HCV感染已成为严重的公共卫生问题。根据HCV基因组核苷酸的序列的差异将HCV分为7种主要基因型和多种亚型，而且不同基因型和亚型分布具有地域差异性。我国HCV基因型主要以1b和2a为主，但由于近年来人口流动和吸毒人群的增加，使得HCV基因型正逐渐变化。由于基因型与抗病毒方案的选择和疾病预后密切相关，因此了解HCV感染患者基因型便显得至关重要，尤其是吸毒人群。下面就中国地区临床患者（主要指献血和性传播）和吸毒人群HCV基因型分布的研究进展予以简要综述。关键词丙型肝炎病毒基因型别临床患者吸毒人群据世界卫生组织统计，全世界有1.85亿人感染HCV，每年新增感染者约350万[1]。我国一般人群抗HCV阳性率为3.2%，约560万[2]，HCV感染后约80%可发展为慢性感染，部分进而发展为肝纤维化、肝硬化及肝癌。HCV为单股正链RNA病毒，属于黄病毒科，其基因组全长9.6Kb。根据HCV基因组核苷酸的序列的差异将HCV分为7个主要基因型，除5型和7型外，其它型别又进一步分为多个亚型[3]。HCV基因型及亚型的分布在不同地区存在很大差异，其中1，2和3型分布全球，4型和5型主要分布于非洲[4]，6型主要分布于中国香港和东南亚[5-7]。中国大陆HCV基因型主要以1b和2a为主，但HCV基因型地理分布正逐渐变化，原因不明，人口流动和吸毒人群增加可能是原因之一。本综述就中国地区临床患者和吸毒人群HCV主要基因型分布作一总结。1.我国临床患者不同地区HCV基因型分布研究表明，我国HCV基因型分布以1b和2a型为主，但不同地区基因型分布存在差异，临床患者HCV基因型分布见表1。华北[8-10]和东北地区[11-14]HCV基因型型别比较单一，主要以1b和2a为主，有少量3型和1a型，混合型少见，主要42 文献综述[15-17]为1b/2a，未发现6a型。西北地区HCV基因型仍然以1b型和2a型为主，陕西2a型感染率超过1b型，青海3型感染率明显超过2a型，其次本地区还发现了3型，6a型以及混合型，且3型感染率明显比华北和东北地区有所上升。华[18-26]东地区型别分布比北方相对复杂，发现1b，2a，3a，3b和6a型，但1b和2a仍然为主要型别。而且在本地区发现了新的亚型，江苏发现了6n型，研究表明主要是由东南亚地区传入云南和广东地区，然后由广东地区向江苏地区传播。表1.我国临床患者HCV主要基因型构成比（%）的地区分布省份1b2a3a3b6a混合型其它型未分型北京7023.90001.62.61.9a河北47.238.52.2*0012.10山西89.747.702.560000b辽宁53.839.55.350001.350c吉林48.733.31.300016.70黑龙江5030.181.7200016.10上海76.69.403.11.53.16.30江苏70.5172.36.82.301.10d浙江58.78.613.361.970.720.494.210安徽57.942.1000000e江西72.67.81108.88.80福建49.717.44.58.411.608.40山东63.128.5701.1905.961.190河南56.38.511.32.819.701.40湖北83130.62.31.1000f湖南--------广东67.57.73.73.417.7000广西--------香港--------重庆46.914.75.615.912.100.93.4贵州--------云南7.8413.7317.6541.187.84011.760陕西3646684000g甘肃619.802.40026.80青海60100300000新疆60.5828.835.673.990.460.4600abcde注：邢台代表河北鞍山与沈阳的均值长春代表吉林省湖州，宁波和温州的均值fg萍乡代表江西郴州代表湖南兰州代表甘肃*3a与3b共占比例43 南华大学硕士论文表明HCV由高危人群向临床患者传播。福建发现了1c型，上海地区出现了三种型别混合感染（1a+1b+2a）的情况，浙江地区混合感染比例达到了20%。华中地区[27,28]也发现以1b,2a,3a,3b和6a为主的5个亚型，1b为主要型别，而河南地区6a和3a型比例明显超过2a型，成为仅次于1b的基因型。相比北部地区，南部地区HCV基因型分布较为复杂。华南地区[29]1b仍为主要型别，但广东地区6a型和3型比例也超过了2a型,成为该地区流行程度仅次于1b型的基因型，这一点明显与北方不一致。西南地区[10,30]HCV基因型分布在临床患者中报导相对少。重庆地区3型比例超过2a型成为第二主要基因型，而云南3型更是超过1b型成为最主要型别，并且重庆地区还发现了新的型别6k型，可能是因为该地区靠近东南亚地区，加上传播方式的改变和人口流动，加速了HCV的感染和传播。总之，从总体来看，中国临床患者中HCV基因型分布仍然以1b和2a为主，但由北向南分布比例逐渐减少，而6a型和3型却逐渐增长。云南地区3型更是成为最主要感染型别。此外，临床患者HCV感染型别比较单一，混合感染比较少见，未发现4型和5型。2.我国吸毒人群不同地区HCV基因型分布由于吸毒人群比较复杂，而且吸毒本身就是HCV感染的高危因素，因此HCV基因型分布相对临床患者更复杂。关于吸毒人群HCV基因型分布报导相对较少，主要集中于华中，华南，西南和华东地区，特别是西南地区。具体情况见表2.本次分析中，华东地区[19,31]HCV基因型上海仍以1b型为主，未发现6a型，混合感染率较高，而江苏以3型和6a型感染率明显超过1b型，成为最主要基因型，另外在该地区还发现了新的型别6e和6n型，但未发现混合感染。华中地区[32,33]HCV基因型以6a和3型为主，且6a型所占比例均超过50%，还发现少量混合感染。华南地区[34-36]则主要以6a和3型为主，但香港主要以6a和1b型为主并且在香港地区还发现了新的型别6e和6h型。西南地区[30,37,38]成为吸毒人群HCV高感染率地区，主要以6a型和3型为主，云南地区发现了6n，6u和6v型，但没发现混合感染。有资料显示，6型主要分布在东南亚和中国香港及南部边境地区，而且吸毒人群HCV基因型主要以6型和3型为主，通过进化树分析6n型主要起源于云44 文献综述南边境；6u型则是跨境传播，主要来源于缅甸；6a型则主要起源于越南，传播至云南、广西等西南地区后，再传播至广东等地，最后由广东传播至中国其它地区。中国毗邻东南亚和“金三角”，毒品走私以及静脉吸毒人群的增加，使得HCV基因型分布发生变化，吸毒人群中6a和3型感染率不断增加。表2.我国吸毒人群HCV主要基因型构成比（%）的地区分布省份1b2a3a3b6a混合型其它型未分型北京--------a河北--------山西--------b辽宁--------c吉林--------黑龙江--------上海38.95.65.60022.222.20江苏16.75.516.722.227.80110d浙江--------安徽--------e江西--------福建--------山东--------河南--------h湖北21.7010.917.450000f湖南3.83.827.1*60.92.300广东9.6030.91.651.55.900广西5.3019.839.536.8018.40香港38.51.14.81.854.200.80.7重庆15.33.414.728.734.900.32.6贵州10.2025.232.128.104.40云南10.6021.837.95.1024.40陕西--------g甘肃--------青海--------新疆--------h注：武汉代表湖北*3a与3b共占比例由上述可知，中国吸毒人群HCV基因型主要以6a和3型为主，其次为1b45 南华大学硕士论文型，2a型和混合感染所占比例少甚至缺如。6a型由西向东感染率增加，而3型则由西向东减少。另外，本次分析中还发现了6e，6n，6u，6h和6v多种新亚型，未发现4型和5型。3．两组人群HCV基因型分布差异我国HCV基因型分布存在地域差异和人群差异，临床患者仍以1b和2a为主，而吸毒人群以6a和3型为主。由于临床患者主要经血液及血制品传播，有偿献血主要集中于20世纪90年代，HCV感染较早，因此感染型别比较单一，主要为1b型和2a型。但由于近来普遍实施系统化的血液及血制品筛查，输血相关感染降低，因此1b和2a型感染率有所降低。而吸毒人群中HCV感染以6a型和3型为主，显然与临床患者感染型别不一致。6型主要分布于中国香港和东南亚地区，而且6a型和3型主要分布于吸毒人群[38,39,40]。本次分析资料显示，吸毒人群主要集中于西南，华南等南部地区，而西南，华南地区毗邻东南亚和吸毒人群的不断增加，使得HCV感染率上升，再加上经济的发展和人口的流动，使得HCV迅速传播，因此HCV基因型的地理分布也逐渐发生改变，Fu等报导6a型主要起源于越南，由越南传入广东，然后由广东向中国其它地区传播[34]，进一步证实了我国南部地区吸毒人群HCV6a型和3型的传播来源。在本次分析中，吸毒人群中发现了多种6型的亚型，可能是HCV发生变异，也可能是由东南亚传入我国，Xia等报导已证实6v起源于缅甸[41]。另外，还发现了一定比例的混合感染，可能是由于反复暴露以及吸毒习惯的改变，也可能是由于检测技术的进步使得检测更准确。总之，由于输血相关感染的减少，使得1b型和2a型感染比例下降，却吸毒人群的增加使得6a型和3型不断增加。但在本次分析中临床患者出现了一定比例的6a型和3型，特别是广东地区6a型已取代2a型成为第二主要型别[34]，说明我国HCV正由高危人群向临床患者扩散。由于我国对于吸毒人群的研究局限于南方地区，北方地区资料比较短缺，而且以临床患者的为主的研究对象大多数来自医院，加上HCV感染症状隐匿，多数患者症状不明显，因此并不能够完全反映我国总体HCV基因型分布情况，还应针对更广人群，更广地区展开调查，以便更好地了解我国HCV基因型的分布以及变化特点，为可为相关人群的疾病防控提供数据支持。46 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南华大学硕士论文作者攻读学位期间的科研成果[1]骆珊,陈菲,张健,等.郴州地区门诊美沙酮吸毒人群HCV感染状况及基因型分布特征.[J]临床肝胆病杂志.2015(11):1841-4.[2]陈菲,欧文胜,骆珊等.丙型肝炎病毒各感染状态外周血中白细胞介素8表达水平研究[J].现代医院,2016,16（2）164-166,169.[3]陈菲，欧文胜,骆珊等.早期糖皮质激素联合抗病毒治疗重型乙型肝炎病例对照研究[J].国际病毒学杂志.2016，已接收。[4]BoWen,ShanLuo,FeiChen,JianZhang,WenpeiLiuandXiaowangQu.HepatitisCVirusgenotype6aisthepredominantgenotypeininjectiondrugusersandshowsincreasedfrequencyinthegeneralpopulationinChenzhou,SouthChina(submitted)[5]FeiChen,JianZhang,BoWen,ShanLuo,DongpinYuan,YingbiaoLin,WenshengOu,WenpeiLiuandXiaowangQu.Co-infectionofHBVandHCVchangevirusreplication,antibodyproductionandcytokineexpressioncomparingwithmono-HBVorHCVinfection.(submitted)[6]FeiChen,JianZhang,BoWen,ShanLuo,WenshengOu,WenpeiLiuandXiaowangQu.HBV,HCVandHDVcirculatingamonginjectiondruguserandgeneralpopulation:consistencyanddifference.(received)54 南华大学硕士论文55 南华大学硕士论文致谢本论文是在我的导师欧文胜副主任医师在临床工作上的指导，感谢文波助理研究员的悉心指导下完成的，在课题的设计、具体实施、资料总结及论文的书写中无不渗透着导师的心血和汗水。他们对科学严谨的态度，事实求实的学风时时刻刻影响着我,对科学孜孜不倦追求的精神不断激励我，这将使我受益终生。这本论文是我在南华大学转化医学研究所工作和生活总结。感谢郴州市疾病控制中心在样本采集中的大力支持，郴州市第一人民医院检验科对实验的支持，感谢病毒与免疫实验室瞿小旺、张健老师在实验设计和数据分析上的指导，感谢各位同学及师弟师妹们在实验和生活中的帮助，这是一个充满朝气，充满阳光，充满温暖又人才济济的大家庭，能和他们在一起生活学习我感到无比的荣幸和骄傲。感谢所有关心着我的亲人和朋友们，在你们扶助的臂膀和鼓励的目光下，我才能不断前进。祝你们永远健康、幸福！56