广东省2009-2015年耐药监测点MTB分子流行病学研究

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暨南大学硕士学位论文题名（中英对照）：广东省2009-2015年耐药监测点MTB分子流行病学研究ResearchonmolecularepidemiologyofMycobacteriumtuberculosisindrugresistancemonitoringsitesinGuangdong，2009-2015作者姓名：黄新春指导教师姓名：周琳及学位、职称：主任医师，博士生导师学科、专业名称：免疫学学位类型：（学术学位/专业学位）论文提交日期：论文答辩日期：答辩委员会主席：论文评阅人：学位授予单位和日期： 暨南大学硕士学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得暨南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解暨南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权暨南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址：邮编： 暨南大学硕士学位论文摘要近年来，由于流动人口骤增、耐药和耐多药结核菌蔓延、结核病合并人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）等客观因素的影响，全球结核病（tuberculosis，TB）疫情呈现死灰复燃的严峻形势，结核病防控工作面临巨大压力和挑战。目的为更好地了解广东省结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）的菌株特点、流行分布、传播途径及耐药发生机制。方法本研究选取广东省2009年、2013年、2015年，东西南北中五个地区共853株MTB作为研究对象，应用差异区域105（RD105）缺失基因法、分枝杆菌散在分布重复单位（mycobacterialinterspersedrepeatunits，MIRU）分型，药敏试验（Drugsensitivitytests，DST）比例法、基因测序等技术，研究广东省MTB随时间、空间的动态流行分布及耐药性特点。结果本研究发现北京家族菌株是广东省的主要流行株，MIRU分型用于广东省MTB的分子流行病学研究可取得满意结果。该省MDR和XDR耐药趋势相对稳定，结核治疗需注意合并乙肝病史患者和女性患者的临床用药，Qub11b、ETRF、Mtub21、QUB26可能与预测菌株耐药的标志物相关。结论分子流行病学研究成功阐述了广东省MTB的流行、分布及耐药性特点。关键词：分枝杆菌，结核；RD105缺失；多位点数目可变串联重复序列；基因测序I 暨南大学硕士学位论文AbstractTheepidemicsituationofglobaltuberculosispresentedaseriousresurgencebecauseofobjectivefactorssuchastherapidincreasingnumberoffloatingpopulation,thespreadofdrugresistanceandmultidrugresistance,TBandhumanimmunodeficiencyvirusco-infectionwhichmadethetuberculosis’preventionandcontrolofhugepressureandchallengesforthepastfewyears.ObjectivesTobetterunderstoodthecharacteristicsofstrain,epidemiologyanddistribution,transmissionrouteanddrugresistancemechanismofmycobacteriumtuberculosis(MTB)fromGuangdongProvince.Methodstheresearchchose853MTBsamplesfromthenorth,south,east,westandmidlandareasofGuangdongProvincein2009,2013and2015.WeusedresearchmethodssuchasRD105deletiontests,mycobacterialinterspersedrepetitiveunits,ratiomethodofdrugsensitivitytestsandgenesequencingtostudythedynamicepidemiccharacteristicsofthedistributionanddrugresistanceovertimeandspaceofMTBfromGuangdongProvince.ResultsWefoundthatBeijingfamilywasthemainprevalentstrainsandsatisfactoryresultscouldbeachievedbyMIRUinmolecularepidemiologicalstudyofMTBfromGuangdongprovince.ThedrugresistancetrendofMDRandXDRwasrelativelystable.MoreattentionshouldbepaidtopatientswithHBVandwomenduringtheclinicalTBtreatment.Qub11b,ETRF,Mtub21,QUB26couldbeassociatedwithbiomarkersforpredictingdrugresistance.ConclusionWedescribedtheprevalence,distributionanddrugresistancecharacteristicsofMTBinGuangdongprovincesuccessfullybymolecularepidemiologicalstudies.Keywords：Mycobacteriumtuberculosis;RD105deletion;mycobacterialinterspersedrepetitiveunits;genesequencingII 暨南大学硕士学位论文缩略词（Abbreviation）TB结核病RFP利福平MTB结核分枝杆菌CPM卷曲霉素MIRU分枝杆菌散在分布重复单位SM链霉素VNTR数目可变串联重复序列EMB乙胺丁醇RD105差异区域105KM卡那霉素LSP大片段多态性OFX氧氟沙星Spoligotyping间隔区寡核苷酸分型法PTO乙硫异烟胺MDR耐多药INH异烟肼XDR广泛耐药PAS对氨基水杨酸NJ-Tree系统进化图PCR聚合酶链反应DST药物敏感试验DNA脱氧核糖核酸laddermarker梯度标志HGI分辨率指数HIV人类免疫缺陷病毒MST系统发生树IS6110-RFLP插入序列6110限制性片段长度多态性分析III 暨南大学硕士学位论文目录摘要................................................................................................................................IAbstract.........................................................................................................................II缩略词（Abbreviation）............................................................................................III第1章绪论..................................................................................................................11.1结核分枝杆菌的流行现状及其分子流行病学的研究意义...........................11.2分子流行病学研究使用的方法.......................................................................21.3广东省MTB分子流行病学研究的技术路线................................................71.4研究的目的与意义...........................................................................................8第2章材料与方法......................................................................................................92.1研究的试剂与耗材...........................................................................................92.2试验菌株的复苏及总DNA的粗提..............................................................102.3MTB药物敏感性试验...................................................................................112.4RD105缺失基因法和MIRU分型................................................................122.5katG和rpoB基因测序..................................................................................142.6基本信息问卷调查.........................................................................................142.7统计分析方法.................................................................................................15第3章广东省MTB分子流行病学研究结果分析.................................................163.1北京家族菌株与非北京家族菌株鉴定.........................................................163.2药物敏感性试验.............................................................................................183.3MIRU分型.....................................................................................................193.4katG和rpoB基因测序..................................................................................263.5耐药与MIRU位点、患者信息之间的关系................................................27第4章全文讨论........................................................................................................314.1广东省MTB北京家族菌株比例分析..........................................................314.2广东省MTB的MIRU分型和聚类分析.....................................................324.3广东省MTB耐多药和广泛耐药性分析......................................................334.4不同药物耐药与MIRU位点、患者基本信息相关性分析.......................33IV 暨南大学硕士学位论文4.5利福平和/或异烟肼耐药菌株rpoB、katG基因突变分析..........................34第5章总结与展望....................................................................................................365.1工作总结.........................................................................................................365.2研究的优势与不足.........................................................................................375.3未来工作展望.................................................................................................38参考文献......................................................................................................................39硕士期间发表的论文情况..........................................................................................48致谢..............................................................................................................................49V 暨南大学硕士学位论文第1章绪论1.1结核分枝杆菌的流行现状及其分子流行病学的研究意义[1]结核分枝杆菌是引起结核病的病原体，其基因多态性较其他微生物低，是一类细长略弯曲的杆菌，呈单个或分枝状排列，无芽孢、无鞭毛、有荚膜，为专性需氧菌，营养要求高，对某些理化因子的抵抗力强，较容易产生耐药性。结核分枝杆菌自身不产生内外毒素，也不产生侵袭性酶类，其致病性主要是由于脂质、蛋白质、多糖、核酸、荚膜等菌体成分，尤其是细胞壁中大量的脂质是结核病的重要致病成分，可引起肺部和肺外感染，其中以肺部感染最常见。[2,3]结核病是世界上最古老的传染病之一，起源于非洲，可以追溯到公元前8世纪，被称为“白色瘟疫”，是世界上的三大疾病之一，亦是世界上十大致死原因之一。2016年的世界卫生组织调查报告显示，2015年全球有1040万新增结核病人，其中约48万为耐多药结核病患者，120万（11%）为艾滋病病毒感染患[4]者。在2015年，共140万人死于结核病。中国是结核病发病的大国，患病人[4]数占世界第三。广东省位于我国大陆的南边，由于其市场开放程度高，流动人[5-6]口数量大，艾滋合并结核病感染人数多，该省结核病疫情形势严峻。广东省第五次结核病流行病学抽样调查显示，该省活动性肺结核患病率为229.97/10万，[6]涂阳患者的患病率为39.75/10万，菌阳患者的患病率为62.46/10万。在十几年以前，宿主和环境因素被认为是影响导致结核菌传播与发病产生的主要因素。结核分枝杆菌感染患者与接触人群之间的疾病传播受多种因素的影响，包括病人方面的一些因素如带菌量多寡、病人和接触者所处空气环境的好坏等。健康人与活动性结核病人密切接触后，评估该类密切接触者是活动性结核患者还是潜伏性结核感染者已成为TB公共卫生策略的重要组成部分。健康人在感染结核后的前二年是发病的高危险期，该期间有3-10%的新近感染人群会发展成为活动性结核致病并出现症状。区分结核病人的发病是由于近期外源再感染快速发病导致还是内源性陈旧感染的复发导致是地区性结核控制工作的重要方面。在结核病大部分以社区为单位传播而不是通过个人传播的高负担地区，接1 暨南大学硕士学位论文触调查和常规菌株培养几乎不可用。20世纪90年代早期，结核分枝杆菌的分子流行病学研究作为对传统接触调查的补充研究工具渐渐被人们所熟知。分子流行病学是应用先进的技术测量生物学标志的分布情况，结合流行病学现场研究方法，从分子或基因水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程，并研究疾病的防治和促进健康的策略和措施的科学。基因分型为主要技术的分子流行病学研究，对了解结核病的动态传播具有重要作用，对分析流行菌株的遗传特征，阐述结核菌[7]的致病机制，追踪结核爆发流行的传染源，查证菌株传播的途径和方式等具有重要意义。与快速改变以追踪近期社区结核菌传播特点的基因标志物相比，基因分型同样被用于研究结核菌的菌株进化与种系发生，用于阐述结核分枝杆菌特异病原菌相关危险因素对疾病传播和发病机制的影响，从而使人们有更深刻理解，该技术可追踪社区特定MTB感染，对评估常驻人群和流动人群中结核的复发与传播相对趋势至关重要，为结核病控制措施的制定提供了重要建议。基于人群的研究显示，基因型相同的菌株可归类为同一簇，以便推测它们之间可能具有的或直接或间接的流行病学联系。通过对比发现，具有与其他菌株基因型不同的独特基因型的菌株，其发病可能与外来人口流入或特定时期潜伏性感染的再复发有关。1.2分子流行病学研究使用的方法1.2.1数目可变串联重复序列分型（MIRU）基因分型方法是结核分枝杆菌分子流行病学研究中常用的方法，主要包括有间隔区寡核苷酸分型法（Spoligotyping）、插入序列6110限制性片段长度多态性分析（IS6110-RFLP）、MTB散在分布重复单位（MIRU）、单核苷酸多态性分析（SNP）、多态性的富于GC的重复序列方法(polymorphicGCrichrepetitive[7,8][9]sequence，PGRS)等。Spoligotyping是依据MTB基因组特定序列中存在被非重复间隔区间隔的直接重复序列进行的分型，根据间隔区序列和个数不同从而将不同菌株区分开来，是鉴别北京家族菌株的金标准。但是，该方法分辨能力较低，不适用于存在优势菌群的地区分型。插入序列（insertionsequence，IS）是在基因内发生转座、缺2 暨南大学硕士学位论文失等改变的一类可移动基因片段，IS-6110片段只存在于MTB复合群基因组中，通过应用特异限制性内切酶切割基因片段、DNA探针杂交、放射自显影技术分析，对不同IS-6110片段位置、大小进行分析从而将不同菌株区分开来。该方法的不足之处在于较费时费力，操作繁琐，杂交结果识读较困难等。SNP是利用MTB基因组保守序列的多态性对不同菌株进行分型，该方法主要用于分析菌株的耐药、毒力和进化过程。PGRS基于基因组中短重复序列，应用DNA印记杂交技术进行分型，该方法的不足之处也在于它较费时费力。数目可变串联重复序列(variablenumberoftandemrepeat,VNTR)属于小卫星DNA，一般位于基因侧翼或内含子等非编码区以及染色体端粒端，每个特定的VNTR位点由中间的核心区和外围的侧翼区两部分组成。不同菌株表现为侧翼区相同而串联重复单位的数目不同。MTB基因组中的VNTR称之为MTB散在分布重复单位（mycobacterialinterspersedrepeatunits，MIRU），其为51-77bp的DNA片段，呈串联重复（1-8个），散布于整个MTB基因组内。MIRU方法是以数目可变串联重复序列为基础，根据不同结核分枝杆菌侧翼区相同，核心区的串联拷贝数不同，从而将不同菌株区分开。该方法具有稳定性和重复性较好、能快速简便检测、所需样本DNA用量少、分辨率高、结果数字化方便全球不同实验室进行结果比较等优势，是目前最有前景的分[7,10-12]型方法。Supply等提出MIRU分型标准化的建议，指出15位点用于常规分子流行病学研究具有与IS6110-RFLP方法相近的分辨能力，24位点可用[13]于系统发生学的研究。近年欧盟在“结核病流行病学与控制的新遗传标志和技术”会议上达成一致意见：采用公认的国际标准方案后，MIRU基础的分型方法近期内会取代IS6110RFLP，并且已被美国疾病预防控制中心推荐为结核分枝杆菌基因型分型的首选方法。国内外多个机构对MIRU位点的分[14-16]型能力进行了评估，其结果存在一定的差异。因此，寻找适合广东省分型的最佳MIRU位点组合，了解该省菌株的流行分部特征，对该省结核分枝杆菌的预防控制、流行病疫情的监督管理等具有重要指导作用。1.2.2RD105缺失基因法分型3 暨南大学硕士学位论文结核分枝杆菌根据其基因特征可以分为北京家族菌株和非北京家族菌株，基于核转录因子(nucleartranscriptionfactors,NTF)区域（北京家族菌株中IS6110的插入区域定义）和大片段多态性（LSP）的分析，北京家族菌株又可分为不同的亚型。在NTF区域存在1或2个IS6110的插入时，称之为典型的“现代型”。若NTF区域完整，不存在IS6110的插入，则归为“古典型”；LSP之一RD105存在于所有的北京家族基因型菌株，可作为有效的分子标志物来鉴别北京家族菌株，同时其他的LSP（RD181,RD142,RD150）能够进一步细分北京家族菌株为不同的亚型。北京家族基因型是1995年最先报道的亚[17]型，在世界多个国家和地区流行，由共同祖先发生衍化而来，是中国地区[18-20]的主要流行株，由于其致病性强、易发生耐药、易引起爆发流行等特点，使得其研究多年来一直成为结核领域的重点和热点。MTB基因组中存在大片段多态性(largesequencepolymorphisms,LSP)，通过DNA的缺失和重排，发生稳定可遗传的基因改变，从而作为基因分型和菌株进化分析的标志物。结核分枝杆菌的差异区域（RegionsofDifference，RD）是在结核分枝杆菌中存在而在牛分枝杆菌或者卡介苗中缺失的片段，该片段与结核分枝杆菌的毒力、[21]致病性密切相关。RD105基因属于LSP中43个靶序列之一。RD105缺失基因法分型的原理是基于结核分枝杆菌北京家族基因型的RD105基因是缺失的，而非北京家族基因型的RD105基因是存在的，从而将北京家族基因型与非北京家族基因型区分开来。李斌等通过应用Spoligotyping分型与RD105缺失基因分型法分析青海省133株结核分枝杆菌，二者鉴定北京家族菌株的结[22]果无统计学差异。刘敬华等运用RD105缺失基因法和间隔区寡核苷酸分型对来自北京、新疆、福建、吉林的342株MTB临床分离株进行鉴定，二种方[23]法区分北京家族基因型结果一致性达到100%。因此，RD105缺失基因检测法是区分北京家族基因型与非北京家族基因型简单而有效的方法。1.2.3药物敏感性试验（Drugresistancetest,DST）结核病药物敏感性试验是结核病防控工作的重要组成部分，随着耐药尤其是耐多药、广泛耐药结核病的流行，药物敏感性试验变得越来越重要，是不可缺少的重要工具。标准可信的药敏试验技术不管对临床患者的诊断还是对流行病学4 暨南大学硕士学位论文调研和监测都至关重要，尽管药敏试验有近半个世纪的历史，技术也较成熟，是结核病防控研究机构中涉及的常规工作，但其操作较为复杂、不可控因素较多，导致结果重复性较差。MTB药敏试验属于分离致病性高的病原微生物技术，实验室工作人员应佩戴N95口罩、帽子、鞋套、医用防护服等保护性设备，试验过程中尽量减少气溶胶的产生，注意对潜在的生物传染性物质进行高压灭菌，全程在国家生物安全二级实验室生物安全柜中进行相关操作。本试验严格按照WHO印发的《结核病[24]耐药监测指南》进行操作。该方法主要包括比例法、液体培养法，本研究采用比例法间接法。应用高温灭菌的接种环刮取适量对数生长期新鲜菌落于含1ml灭菌PBS的磨菌瓶中，注意刮取培养基斜面各个菌落的菌株，旋紧瓶盖，涡旋振荡尽量使菌落分散开来，静置片刻（减少气溶胶的产生）后打开瓶盖，加入适量PBS调节试管中菌液浓度，使麦氏浊度为1mg/ml（与标准麦氏比浊管比较），在无菌1.5mlEP管中加入1ml灭菌PBS备用，并加入10ul上述1mg/ml的菌-2-4液使该管菌液浓度为10mg/ml；用上述方法再次进行100倍稀释，配成10mg/ml的菌液。用标准接种环分别沾取1环（0.01ml）上述二个稀释倍数的菌液，采用划线法接种至各种含药及中性培养基表面，保证菌液尽可能在培养基斜面均匀分散。接种后培养基于37℃恒温培养箱培养3～5周报告结果。结果判读时，含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上生长的菌落数百分比大于1%为对该抗结核药耐药，否则为敏感。培养基内药物终浓度：异烟肼（INH）0.2mg/L，利福平（RFP）40mg/L，链霉素（SM）4mg/L,乙胺丁醇（EMB）2mg/L，卡那霉素（KM）30mg/L，氧氟沙星（OFX）2mg/L，卷曲霉素（CPM）40mg/L，乙硫异烟胺（PTO）40mg/L，对氨基水杨酸（PAS）1mg/L。1.2.4KatG和rpoB基因测序近年来，由于病人的不规则用药、滥用药、环境因素影响等原因使菌株基因组或表型改变，导致结核病的耐药率居高不下，给结核病人的治疗带来极大的挑[25]战。随着1998年结核分枝杆菌H37Rv菌株全基因组测序工作的完成，快速检测结核分枝杆菌基因耐药的分子生物学诊断技术迅速发展。结核分枝杆菌耐药机制复杂且未完全研究明朗，现今仍然是结核病研究领域的重点。5 暨南大学硕士学位论文异烟肼（INH）和利福平（RFP）是结核病治疗中两个关键的一线杀菌药物。[26,27]RFP耐药与rpoB基因突变密切相关，RFP通过与结核分枝杆菌RNA聚合酶的β亚基结合，干扰转录从而发挥作用，rpoB基因编码分枝杆菌RNA聚合酶的β亚基，RFP耐药可能是rpoB突变导致的药物作用靶点β亚基发生改变，阻断了RFP与之结合从而导致耐药。INH耐药与KatG基因突变密切相关，KatG基因表达的过氧化氢酶-过氧化物酶在INH作用中发挥了关键性作用。KatG基因发生突变会使过氧化氢酶-过氧化物酶活性降低甚至丧失，影响INH的活化而导致耐药。同时耐异烟肼和利福平二种抗结核药物的菌株被称为耐多药（MDR）菌株。耐多药结核菌中，同时耐氟喹诺酮类药物和1种以上二线静脉注射类药物(卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星)的菌株被称为广泛耐药（XDR）菌株。近年来研究成果表明，大部分MTB发生耐药的分子基础是由于其药物作用的靶标发生了改变。该二类菌株的治疗采用目前的标准化疗方案无效。运用测序为基础的分子方法可不依赖菌株培养技术，直接、快速检测临床样本相关药物的耐药性，该技术具有自动化程度高、生物危险性较低等优点。了解广东省异烟肼和利福平耐药菌株katG和rpoB基因突变位置及突变类型对菌株耐药的早期诊断、新抗结核药物的开发具有重要意义，同时，为耐多药、广泛耐药菌株的管理、治疗提供重要的理论指导。总之，通过基因测序可以快速的鉴定结核分枝杆菌株的耐药性，从而为临床诊疗以及药物的选择提供依据。1.2.5本研究与免疫学的联系结核病是结核分枝杆菌感染所致的慢性传染病，具有抗感染免疫的特征，包括先天性免疫和获得性免疫。其中先天性免疫是抗结核的天然抵抗力，由体表和体内防御系统组成，是非特异性免疫。如体表屏障;呼吸道的纤毛上皮；肺泡巨噬细胞；嗜中性白细胞、单核细胞、巨噬细胞的吞噬作用;溶菌酶的杀菌作用等，这是发生结核病的一个因素。另一方面，绝大多数人感染结核杆菌后可以终生不发病，其中除社会因素等的影响外，非特异性免疫力亦起一定的作用。与结核免疫关系密切的淋巴因子有巨噬细胞活化因子(MAF)、巨噬细胞移动抑制因子6 暨南大学硕士学位论文(MIF)、趋化因子(CF)、淋巴毒素(LT)及转移因子(TF)等。这些因子使大量单核细胞、巨噬细胞聚集并不断繁殖，活化的巨噬细胞对结核杆菌的消化杀伤能力显著增强，由此扩大结核病的细胞免疫效应。由此可见，结核病的发生发展、流行传播与机体免疫状态息息相关。本研究分别从整体和个体的水平上，研究分析我省不同时间、不同区域的结核病的发生、发展、流行、传播情况，为进一步掌握结核病的发生发展规律，指导结核病防控工作具有重要的意义。1.3广东省MTB分子流行病学研究的技术路线本研究主要从三方面进行分子流行病学研究，首先,对所有样本进行药物敏感性试验，了解菌株的耐药性情况，并对所有异烟肼耐药菌株进行katG基因测序，所有利福平耐药菌株进行rpoB耐药核心区域测序，了解耐药相关基因突变情况，发现耐药相关危险因素；其次，对所有样本应用RD105缺失基因法分析北京家族菌株在广东省的整体流行分布特点；另外，应用MIRU分型，筛选出适合广东省分型的最佳MIRU组合，并对所有样本采用Bionumerics软件进行聚类分析，了解菌株在广东省的种群结构和系统进化特点。总的来说，我们对广东省MTB进行随时间、地区的动态分子流行病学研究。技术路线如下：7 暨南大学硕士学位论文1.4研究的目的与意义本研究从分子流行病学角度，了解广东省MTB流行菌株的遗传特征、流行分布特点,追踪爆发流行的传染源、查证传播途径，了解广东省疫情的特点。主要目的是了解北京家族菌株亚型在广东省的流行分布特点，筛选适合广东省分型的最佳MIRU组合，聚类分析菌株在广东省的种群结构、系统进化特点。同时，我们对所有耐药菌株进行耐药相关基因测序，从基因水平阐述耐药的发生机制，了解耐药相关危险因素。8 暨南大学硕士学位论文第2章材料与方法2.1研究的试剂与耗材2.1.1试验中使用的仪器设备主要见表2-1表2-1实验仪器和设备仪器名称型号/规格生产厂商-80℃超低温冰箱DW-86L338(J)海尔集团公司细胞培养板12孔美国Costar公司37℃培养箱HERAcell2401美国Thermo公司金属浴锅K30杭州奥盛仪器有限公司低温离心机Z216MK德国HERMLE公司离心管1.5ml美国AXYGEN公司凝胶成像系统UniversalHoodⅡ美国BIO-RAD公司TM电泳仪PowerPac基础电泳仪美国BIO-RAD公司接菌环1ul/10ul德国Greiner公司PCR板96孔美国AXYGEN公司PCR仪Labcycler德国SensoQuest公司生物安全柜HR40-ⅡB2青岛海尔公司9 暨南大学硕士学位论文2.1.2实验使用的试剂耗材主要见表2-2表2-2实验试剂试剂/耗材规格/等级生产厂商TE缓冲液PH8.0自配TAE缓冲液1×、50×自配PBS缓冲液PH8.0自配DNAladderMarker100bp天根生化科技有限公司PCRMastermix2×Taq天根生化科技有限公司药敏培养基无菌广东省结核病控制中心中性培养基无菌广东省结核病控制中心琼脂糖100g西班牙BiowestAgarose公司TMGoldView1ml北京鼎国昌盛生物技术有限公司加样枪10/200/1000ul德国Eppendorf公司枪头10/200/1000ul美国AXYGEN公司巴氏吸管1000支/盒上海晶安生物科技有限公司N95口罩3M8210-N95美国3M公司一次性防护服4510美国3M公司2.2试验菌株的复苏及总DNA的粗提本研究的MTB菌株采用直接抽样法，选自广东省2009年、2013年、2015年东西南北中五个地理位置，其中菌株来源的年份、地区（耐药监测点）、数量及患者基本信息详见表2-3。广东省结核病控制中心参比实验室-80℃冰箱取出10 暨南大学硕士学位论文试验菌株，室温放置半小时待样本复融，用巴氏吸管轻轻吹打混匀样本，然后小心吸取20ul至中性培养基中，轻晃斜面，使菌株冻存液能均匀地布满培养基整个斜面，37℃培养箱培养4-7周，待长出肉眼可见的明显的菌落，待用。将300ul高压灭菌的TE缓冲液加入EP管，然后刮取适量复苏后的单克隆菌落于该管，混匀后于100℃金属浴锅中煮20-30min，此时菌株的细菌壁破裂，DNA溶于上层TE缓冲液中，将该EP管置于4℃冰箱放置过夜，次日拿出10000rpm离心10min，离心半径8.5cm，抽取上清于新的无菌EP管，即为粗提结核分枝杆菌总DNA，可用于后续试验。整个带有生物危害的过程都在生物二级P2实验室生物安全柜中完成。表2-3不同年份菌株来源及年龄、性别情况2009年2013年2015年广东省地理耐药监测点（菌株数量）中番禺（27）增城（79）番禺（30）东五华（50）潮安（101）五华（51）西电白（24）罗定（182）电白（50）南斗门（35）顺德（17）斗门（49）北英德（37）仁化（76）南雄（45）年龄（岁）＜2518462225-44611386145-646617494≥65289748性别女359851男1383571742.3MTB药物敏感性试验刮取适量已复苏的单克隆菌落至1mlPBS缓冲液中，调整细菌浓度使缓冲-2液麦氏浊度（MCF）为1mg/ml，然后用PBS分别将菌液稀释至10mg/ml和-410mg/ml二种浓度菌液。以上二种浓度菌液每管分别接种10种培养基，即9种含药培养基（分别含INH、RFP、SM、EMB、KM、OFX、CPM、PTO、PAS）11 暨南大学硕士学位论文和1管中性培养基。每次用接种环蘸取一环至每个药敏培养基斜面，沿培养基长轴画一条线，然后以垂直该线的方向均匀画连线布满整个斜面，使菌液均匀分散地分部在斜面表面。药敏试验时，先接种较低浓度菌液，再接种较高浓度菌液，不同样本之间避免交叉污染。接种完后，将培养基置于37℃培养箱，培养4-7周后查看结果。2.4RD105缺失基因法和MIRU分型以粗提的总DNA为模板进行基因分型。送北京六合华大基因科技有限公司[13,28-30]合成引物，不同基因片段的引物序列及该片段在H37Rv的大小见表2-4。PCR反应为20ul体系，包括粗提模板DNA1ul，上下游引物各0.5ul，2×TaqPCRMastermix10ul，ddH2O8ul。PCR反应程序为94℃预变性10min，94℃1min，58℃（ETRF63℃）1min，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物经1％-2％琼脂糖凝胶电泳（GoldView作为染料），200V，40-50min，100bpDNAladdermarker和H37Rv标准菌株分别用于确定相对分子量、作为阳性对照株。电泳胶经凝胶成像系统分析。RD105缺失基因检测法鉴定北京家族与非北京家族基因型，如果电泳图谱在786bp存在条带，鉴定为北京家族基因型菌株，如果菌株在786bp无电泳条带，鉴定为非北京家族基因型菌株。MIRU分型的电泳图谱识读时，根据DNAMarker分析条带大小，并根据标准株大小换算成重复数。HGI指数用于评估各位点的多态性。HGI=1-1/N（N-1）错误!未找到引用源。错误!未找到引用源。[31]其中，N代表所有菌株数，S代表组数，nj代表在j组中的菌株数表2-4MIRU位点、RD105、引物及其在H37Rv的片段大小、重复次数重复PCRH37Rv单元产物位点引物（5’-3’）重复长度长度次数（bp）（bp）L)ATTTCGATCGGGATGTTGATETRA753973R)TCGGTCCCATCACCTTCTTAL)GCGAACACCAGGACAGCATCATGETRB572923R)GGCATGCCGGTGATCGAGTGGL)GACTTCAATGCGTTGTTGGAETRC583464R)GTCTTGACCTCCACGAGTGC12 暨南大学硕士学位论文L)GCGCGAGAGCCCGAACTGCETRD773303R)GCGCAGCAGAAACGTCAGCL)ACTGATTGGCTTCATACGGCTTTAETRE536513R)GTGCCGACGTGGTCTTGATL)CTCGGTGATGGTCCGGCCGGTCACETRF794763R)GGAAGTGCTCGACAACGCCATGCCL)TGGACTTGCAGCAATGGACCAACTMIRU2535082R)TACTCGGACGCCGGCTCAAAATL)GTTCTTGACCAACTGAGTCGTCCMIRU10536433R)GCCACCTTGGTGATCAGCTACCTL)TCGGTGATCGGGTCCAGTCCAAGAMIRU16536712R)CCCGTCGTGCAGCCCTGGTACL)GCCCTTCGAGTTAGTATCGTCGGTTMIRU20775912R)CAATCACCGTTACATCGACGTCATCL)CAGCGAAACGAACTGTGCTATCACMIRU23538736R)CGTGTCCGAGCAGAAAAGGGTATL)CGACCAAGATGTGCAGGAATACATMIRU24543931R)GGGCGAGTTGAGCTCACAGAAL)CCCGCCTTCGAAACGTCGCTMIRU26516133R)TGGACATAGGCGACCAGGCGAATAL)TCGAAAGCCTCTGCGTGCCAGTAAMIRU27536573R)GCGATGTGAGCGTGCCACTCAAL)CGCATCGACAAACTGGAGCCAAACMIRU39536462R)CGGAAACGTCTACGCCCCACACATL)GGGTTGCTGGATGACAACGTGTMIRU40544071R)GGGTGATCTCGGCGAAATCAGATAL)CTTGGCCGGCATCAAGCGCATTATTMtub04512682R)GGCAGCAGAGCCCGGGATTCTTCL)AGATCCCAGTTGTCGTCGTCMtub21572062R)CAACATCGCCTGGTTCTGTAL)AGTCACCTTTCCTACCACTCGTAACMtub30583192R)ATTAGTAGGGCACTAGCACCTCAGL)GCCCAAAAAGCATGGGAACGTGCCCCTMtub38633733R)GGTTGTCCCCGCAGTATCTCL)AATCACGGTAACTTGGGTTGTTTMtub39585156R)GATGCATGTTCGACCCGTAGL)CCGATGTAGCCCGTGAAGAOub11b695625R)AGGGTCTGATTGGCTACTCAL)GTGCCGGCCAGGTCCTTCCQub261117085R)CACCGCGTGTTTGACCCGAACL)ACCGCAAGGCTGATGATCCQub4156c594152R)GTGCATCTCGTCGACTTCC13 暨南大学硕士学位论文L)GGAGTCGTTGAGGGTGTTCATCAGCTCAGTCRD105786R)CGCCAAGGCCGCATAGTCACGGTCG2.5katG和rpoB基因测序从NCBI上查找结核分枝杆菌H37Rv的katG和rpoB目的基因序列，其中[32]利福平耐药菌株中，95%以上的相关耐药基因变异发生在rpoB507-533位（大肠杆菌RNA聚合酶β亚单位氨基酸编号），即包含81bp的rpoB基因利福平耐药决定区，所以该试验rpoB基因测序主要包含该耐药决定区，katG测序则包含全部目的基因序列。根据目的基因序列应用PrimerPremier5程序设计引物，其中rpoB基因上游引物5’GACCACGATGACCGTTCCG3’，下游引物5’TACACGATCTCGTCGCTAACC3’，katG基因上游引物5’AGCAACACCCACCCATTAC，下游引物5’CTTCGGGTCCAACTCGG。目的基因扩增条件为，94℃预变性5min，94℃1min，60℃1min，72℃1min（katG2min），30个循环，72℃延伸5min。体系为20μl，2×TaqPCRMastermix10μl，ddH2O8μl，上下游引物0.5μl，模板1μl。katG和rpoB的PCR扩增产物分别为2101bp和534bp。扩增后PCR产物送上海派森诺生物科技股份有限公司运用Sanger法测序（即一代测序）。DNA的体外复制过程以目的基因DNA为模板，在特异性DNA聚合酶和引物的作用下，四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）通过磷酸二酯键连接从而实现DNA的半保留复制。一代测序是模拟DNA的复制过程，反应体系中加入脱氧核苷酸三磷酸的同时，混合加入了双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），由于该ddNTP缺乏3’羟基末端（3-OH），使磷酸二酯键形成受阻，从而终止了DNA复制过程，通过调节dNTPs和ddNTPs的量，使碱基终止在不同位置的核苷酸上，再以高分辨率变性凝胶电泳法分离不同大小的凝胶片段，经X-光非同位素标记或者放射自显影检测相应位置的碱基。2.6基本信息问卷调查纳入问卷调查的病人（2015年225例患者），告知病人试验目的并得到患者签署知情同意书，根据《广东省结核病耐药性监测患者信息表》内容，以通俗14 暨南大学硕士学位论文易懂的询问方式询问病人信息：姓名、性别、年龄、病史、初治复发、现住址等基本信息，收集并做好记录。信息表登记的内容尽量完整准确如实反映病人情况。菌株来源：广东省2015年番禺、南雄、斗门、电白和五华5个耐药监测点（属于广东省东西南北中五个地区）共登记627株菌株，采用直接抽样法抽取300株临床分离株，培养阳性256株，其中225株样本信息完整：初治患者195例，复治患者30例；男174例，女51例；＜25岁，22例，25～44岁61例，45～64岁94例，≥65岁48例；城镇37例，农村188例；现住址居住时间＜1年10例，≥1年215例。2.7统计分析方法2统计分析使用SPSS16.0分析软件，多个样本率的χ检验比较广东省东西南北中各地区间北京家族基因型所占比率、三年份之间北京家族基因型所占比率、MIRU分型各型中菌株数量、成簇率差异有无统计学意义，多因素logistics回归分析前进法评估抗结核药物与MIRU位点，及患者基本信息之间的相关关系，P＜0.05差异有统计学意义。15 暨南大学硕士学位论文第3章广东省MTB分子流行病学研究结果分析3.1北京家族菌株与非北京家族菌株鉴定采用RD105缺失基因法分析广东省2009年、2013年、2015年三年、东西南北中五个地区北京家族基因型所占比例。其中，2009年五华、电白、斗门、英德、番禺五个耐药监测点北京家族基因型菌株所占比例差异无统计学意义（χ²=6.249，P=0.181）（表3-1），2013年潮安、罗定、顺德、仁化、增城五个耐药监测点北京家族基因型菌株所占比例差异无统计学意义（χ²=10.340，P=0.07）（表3-2）,2015年五华、电白、斗门、南雄、番禺五个耐药监测点北京家族基因型菌株所占比例差异也无统计学意义（χ²=7.601，P=0.107）（表3-3）。全部菌株综合分析时，东西南北中五个地区北京家族菌株比例差异有统计学意义（χ²=11.356，P=0.023），以中部耐药监测点比例最高，西南部监测点次之，东北部监测点最低（表3-4）。单一年份的地区间北京家族基因型比例无差异，而累积年份存在差异，提示地区间的差异尚不明显，需要累积才能体现出来。全部试验菌株随时间的变化中，不同年份北京家族基因型所占比例差异有统计学意义（χ²=8.266，P=0.016），其中2009年与2013相比，该差异无统计学意义（χ²=0.002，P=0.964），2013年与2015年（χ²=7.643，P=0.006）、2009年与2015年（χ²=4.946，P=0.026）该差异有统计学意义，即2015年（70.22%）各耐药监测点北京家族菌株比例高于2009年（59.54%）、2013年（59.34%）北京家族菌株比例。表3-12009年菌株来源分布及RD105缺失基因检测法分型广东省地区菌株数地理全部北京非北京北京家族/χ²值P值菌株家族家族全部菌株东五华08220.56016 暨南大学硕士学位论文西电白2410140.417南斗门3521140.6006.2490.181北英德3724130.649中番禺272070.741表3-22013年菌株来源分布及RD105缺失基因检测法分型广东省地区菌株数地理全部北京非北京北京家族/χ²值P值菌株家族家族全部菌株东潮安10153480.525西罗定182119630.65410.340.070南顺德171160.647北仁化7636400.474中增城7951280.646表3-32015年菌株来源分布及RD105缺失基因检测法分型广东省地区菌株数地理全部北京非北京北京家族/χ²值P值菌株家族家族全部菌株东五华5130210.5817 暨南大学硕士学位论文西电白03710740南斗门4933160.6737.6010.107北南雄4532130.711中番禺302640.867表3-4三年、五个地区北京家族菌株数/该地区总数×100%地区200920132015地区均值东56.052.558.855.0西41.765.474.164.8南60.064.767.364.4北64.947.471.158.2中74.164.686.771.3aP值0.023aχ²值11.356年份均值59.559.370.2bP值0.016bχ²值8.266注：a，东西南北中五个地区北京家族菌株比例的卡方检验；b，2009、2013、2015三年北京家族菌株比例的卡方检验3.2药物敏感性试验广东省2009年、2013年、2015年结核分枝杆菌药物敏感性试验比例法显示，广东省三个年份之间结核分枝杆菌MDR耐药率差异无统计学意义（χ²=2.176，P=0.337），三个年份之间的XDR耐药率差异也无统计学意义（χ²=1.468，P=0.480），见表3-5。2009年、2013年和2015年MDR和XDR耐药菌株聚类分析系统发生树（MST）见图3-1，由图可见，2009年由于耐药菌18 暨南大学硕士学位论文株总数较少，MST复合群不明显，2013年和2015年耐药菌株的MST图都包含三个复合群，表明耐药菌株的同源性较高。表3-5广东省不同年份结核分枝杆菌MDR和XDR结果MDR菌株比率（菌株数/XDR菌株比率（菌株数/年份菌株总数）菌株总数）20093.461（6/173）1.156（2/173）20134.835（22/455）1.099（5/455）20156.667（15/225）2.222（5/225）P值0.3370.480χ²值2.1761.468图3-12009、2013、2015年耐多药菌株（MDR和XDR）系统进化树注：2013年耐药菌株包含三个复合群，2015年耐药菌株包含三个复合群3.3MIRU分型3.3.12013年5个耐药监测点455例结核分枝杆菌MIRU-24分型1，单个位点多态性该研究应用MIRU-24对广东省2013年5个耐药监测点共455例结核分枝杆菌临床分离株（包括270例北京家族菌株、185例非北京家族菌株）进行基因分型，455例全部菌株、270例北京家族菌株、185例非北京家族菌株中高多态性位点数分别有6个、3个、11个，中等程度多态性位点数分别有11个、9个、8个，低多态性位点数分别有7个、12个、5个。位点对不同菌株进行分型，重复数存在差异（以Qub26为例，图3-2），不同位点对不同菌株进行分型，多态性19 暨南大学硕士学位论文存在差异，且位点在非北京家族菌株中的分辨率多态性优于在北京家族菌株中的多态性，见表3-6。20 暨南大学硕士学位论文表3-6MIRU-24分型广东省2013年全部菌株、北京家族菌株、非北京家族菌株多态性HGI等位基因位点MIRUMIRU-MIRU-MIRU-个数（范名称8121524围）全部北京非北京菌株家族家族N=455N=270N=185Mtub39++6（1-6）0.4460.2400.628MIRU40++++5（1-5）0.5940.3890.661MIRU23+5（2-8）0.1820.1140.276ETRF+++5（1-5）0.5420.3460.678ETRA+++5（1-5）0.5070.3090.605Qub11b++++10（1-10）0.8190.7470.915Mtub04++++5（1-5）0.7050.6360.725MIRU24+2（1-2）0.0690.0290.130MIRU02+4（1-4）0.0180.0070.032ETRB+7（1-8）0.2870.0580.512Mtub21++++8（1-8）0.7930.6490.681MIRU26++++7（3-9）0.7350.5020.686MIRU10++++4（1-4）0.6000.4000.648ETRC+5（2-6）0.1260.0870.181Qub++5（1-5）0.4520.4020.5144156Mtub30++4（2-5）0.4630.1930.426MIRU27+4（2-5）0.2980.0930.475MIRU16+4（2-5）0.3810.2170.561ETRD+7（1-8）0.3220.0370.612Mtub38+++4（1-4）0.5400.0930.447MIRU39+++4（1-4）0.5670.3380.332MIRU20+2（1-2）0.0760.0290.146ETRE++++4（3-6）0.6410.3680.461Qub26++++9（2-10）0.7320.5760.85121 暨南大学硕士学位论文图3-2不同菌株在位点Qub26的多态性结果注：M,100bpDNAladderMarker；H,H37Rv；1-5，临床分离株2，组合位点分辨率（HGI）[13,由于MIRU-15能达到与IS6110相近的分辨能力，可用于系统发生学研究33]，所以该研究以MIRU-15组合的分辨率（HGI）为标准，筛选不同的位点进行组合并与MIRU-15分辨能力进行比较，该研究目的是找出最少数量的位点组合，使其分辨能力与MIRU-15分辩能力相近，该组合可推荐作为广东省结核分枝杆菌MIRU分型的一线分型方法。不同数量的位点组合对广东省2013年五个耐药检测点的455例全部菌株、270例北京家族菌株、175例非北京家族菌株进行MIRU分型的结果见表3-7。该研究中，MIRU-12的分辨率（HGI=0.9991）与MIRU-15的分辨率（HGI=0.9992）相接近，因此，MIRU-12推荐作为分型广东省结核分枝杆菌的一线分型方法；同时，MIRU-8的分辨率亦较好（HGI=0.9985），推荐作为广东省MTB的辅助分型方法，可减少MIRU分型的工作成本和工作量。22 暨南大学硕士学位论文表3-7MIRU-24分型广东省2013年MTB组合位点分辨率比较全部菌株n=455基因型数成簇菌株数成簇率％HGIVNTR-839232021.540.9985VNTR-124146313.850.9991VNTR-154185912.970.9992VNTR-24437419.010.9994北京家族基因型n=270VNTR-82019925.560.9946VNTR-122335513.700.9975VNTR-152384811.850.9980VNTR-24247348.520.9984非北京家族基因型n=185VNTR-8175195.410.9994VNTR-1218092.700.9996VNTR-15180102.700.9997VNTR-2418261.620.99983.3.2MIRU-12分型2009、2013、2015年菌株聚类分析应用筛选的最佳组合MIRU-12对广东省2009年、2013年、2015年东西南北中五个耐药监测点853株结核分枝杆菌株进行基因分型，应用BioNumerics软件进行聚类分析生成系统发生树（MST），见图3-3。从系统发生树可知，广东省五个耐药监测点的全部菌株主要包括一个北京家族复合群和二个非北京家族复合群（3-3A）。531例全部北京家族菌株的聚类系统发生树主要包括一个复合群（3-3B），包含407个独特型菌株和由124例菌株组成的46个簇。322例全部非北京家族菌株的系统发生树主要包括2个复合群（3-3C），包含309个独特型菌株和由13例MTB组成的6个簇。23 暨南大学硕士学位论文图3-3，MIRU-12分型广东省2009、2013、2015年五个耐药监测点MTB的系统发生树（MST）注：A，全部853株结核分枝杆菌的MST，包括一个北京家族复合群和二个非北京家族复合群；B，531株北京家族菌株的MST，包括一个北京家族复合群；C，322株非北京家族菌株MST，包括二个非北京家族复合群全部853株MTB聚类分析生成的系统进化图（NJ-Tree）表明，广东省MTB主要分为Ⅰ、Ⅱ二大群，见图3-4。广东省MTB的主要流行群是Ⅰ群。Ⅰ群中96.140%是北京家族菌株，3.860%是非北京家族菌株；Ⅱ群中96.764%是非北京家族菌株，3.236%是北京家族菌株。Ⅰ群主要是2015年菌株，Ⅱ群主要是2009年、2013年菌株，差异有统计学意义（P=0.043χ²=6.314）。同时，Ⅰ群菌株主要来自中部地区，东部地区比例最低，Ⅱ群菌株来源则与之相反（P=0.037χ²=10.184），见表3-8。24 暨南大学硕士学位论文图3-4广东省853株MTB聚类分析NJ-Tree表3-8853例MTB聚类分析Ⅰ、Ⅱ群菌株信息Ⅰ群菌株比率（Ⅰ群菌株数Ⅱ群菌株比率（Ⅱ群菌株数/Ⅰ、年份/地区/Ⅰ、Ⅱ群菌株总数）Ⅱ群菌株总数）200961.850（107/173）38.150（66/173）201361.099（278/455）38.901（177/455）201570.667（159/225)29.333（66/225）aP值0.043aχ²值6.314东56.931（115/202）43.069（87/202）西64.062（164/256）35.938（92/256）南68.317（69/101）31.683（32/101）北61.392（97/158）38.608（61/158）中72.794（99/136）27.206（37/136）bP值0.037bχ²值10.184注：a，2009、2013、2015三年MTB在Ⅰ、Ⅱ群比率的卡方检验；b，东西南北中五个地区MTB在Ⅰ、Ⅱ群比率的卡方检验25 暨南大学硕士学位论文3.4katG和rpoB基因测序全部853例试验菌株经DST发现，异烟肼耐药菌株98例，异烟肼敏感株755例，利福平耐药菌株60例，利福平敏感菌株793例。3.4.1结核分枝杆菌katG全基因测序98例异烟肼耐药菌株katG基因序列Sanger法测序发现共有87.755%（86/98）菌株katG基因水平上发现了变化，具体突变结果见表3-9。98株耐药菌株中，29株菌株为单点突变，54株菌株为双点突变，2株菌株为三点突变，1株菌株为四点突变，12.245%（12/98）菌株未发现任何突变。表3-998例异烟肼耐药结核分枝杆菌katG基因变异分析突变位置密码子改变氨基酸改变菌株数量315AGC→ACCSer→Thr62AGC→AACSer→Asn1463CGG→CTGArg→Leu75126ATG→ATAMet→Ile1161TGG→CGGTrp→Arg2232CCG→TCGPro→Ser1147CTG→CGGLeu→Arg1127CAG→CCGGln→Pro1189GAC→AACAsp→Asn33.4.2结核分枝杆菌rpoB基因RFP耐药决定区（RRDR）序列测序60株利福平耐药菌株rpoB基因RRDR序列Sanger法测序发现共有83.333%（50/60）菌株rpoB基因RRDR序列上发现了变化，具体突变结果见表3-10。60株利福平耐药菌株中，主要集中在531位56.667%（34/60）和526位18.333%（11/60），二者总突变率为75.000%（45/60）；47例菌株为单点突变；1例菌株为双位点单密码子突变，涉及531位；1例菌株为三位点联合突变，涉及515位、516位和531位；1例为碱基缺失，缺失的碱基为ATTCATGGA，涉及513位-516位；测序未见其他类型突变发生。26 暨南大学硕士学位论文表3-1060例利福平耐药结核分枝杆菌rpoB基因变异分析a氨基酸位置密码子改变氨基酸改变菌株数量531TCG→TTGSer→Leu32TCG→TTTSer→Phe1TCG→CAGSer→Gln1526CAC→TACHis→Tyr5CAC→GACHis→Asp6511CTG→CCGLeu→Pro1512AGC→AACSer→Asn1515ATG→GTGMet→Val2ATG→ATCMet→Ile1516GAC→GGCAsp→Gly1GAC→TACAsp→Tyr1513-516碱基缺失ATTCATGGA1a，大肠埃希菌的rpoB基因编号3.5耐药与MIRU位点、患者信息之间的关系3.5.1耐药与MIRU位点之间的多因素logistics回归分析为了评价MIRU位点预测不同耐药的能力，该试验应用多因素logistics回归进行统计分析。研究发现一些MIRU位点与不同耐药相关（表3-11），Qub11b与RFP（P=0.013）和INH（P=0.012）耐药相关，ETRF与INH（P=0.039）、SM（P=0.040）、EMB（P=0.023）和OFX（P=0.003）耐药相关，Mtub21与CPM（P=0.040）耐药相关，PTO与QUB26（P=0.047）耐药相关，其中OR值都小于1，说明这些位点的重复数越大，耐药危险性降低，见表3-11。表3-11MIRU位点重复数与耐药之间多因素logistic回归分析药物位点βSEPOR95%CIforORLowerUpperRIFQub11b-0.4270.1720.0130.6530.4660.91427 暨南大学硕士学位论文INHQub11b-0.4360.1740.0120.6470.4600.909ETRF-0.7250.3520.0390.4840.2430.965SMETRF-0.6710.3270.0400.5110.2700.970EMBETRF-1.0880.4770.0230.3370.1320.858OFXETRF-1.3550.4580.0030.2580.1050.633CPMMtub21-0.7630.3720.0400.4660.2250.966PTOQub26-0.5900.2960.0470.5550.3100.9923.5.2患者信息与耐药之间的多因素logistics回归分析根据多因素logistics回归分析，研究发现患者信息与耐药之间存在相关关系（表3-12）。患者合并乙肝病史与INH（P=0.019）、EMB（P=0.037）耐药相关，患者合并乙肝发生耐INH（OR=4.271）、耐EMB（OR=5.617）的危险性增高。除此之外，我们还发现性别与CPM（P=0.019）、PTO（P=0.010）、PAS（P=0.029）耐药相关，其中女性发生耐CPM（OR=7.074）、PTO（OR=22.211）、PAS（OR=5.701）的危险性增高。另外，乡村人口居民比城镇人口居民发生北京家族MTB感染的危险性增高（P=0.035，OR=2.74）。复治患者单变量危险因素分析：2015年225例患者中，复治患者占13.333%（30/225），通过卡方检验分析可知，结核病复治情况的发生与患者自身情况及菌株特点之间未发现相关联系，见表3-13。表3-12患者信息与耐药之间多因素logistics回归分析95%CIforOR药物信息βSEPORLowerUpperINH乙肝病史1.4520.6190.0194.2711.27114.357EMB乙肝病史1.7260.8260.0375.6171.11328.349CPM性别1.9560.8380.0197.0741.37036.523PTO性别3.1011.2100.01022.2112.074237.92PAS性别1.7410.7970.0295.7011.19727.15928 暨南大学硕士学位论文RD105现住址1.0080.4790.0352.7401.0717.007表3-13广东省2015年MTB初治与复治的单因素logistics分析初治患者数复治患者数χ²值P值总数19530性别女性474男性148261.7200.190年龄＜2520225-445650.0170.89745-6479151.9830.159≥654080.0120.914名族汉19130其他400.0020.961现住址城镇361农村159293.3000.069居住时间（年）＜153≥1188272.3040.129职业农民13320其他62100.0280.866合并糖尿病史是17229 暨南大学硕士学位论文否167270.0040.951不知道1110.0130.909合并乙型肝炎史是21否183270.0330.856不知道1020.0001.000RD105北京家族菌株13820非北京家族57100.2090.647聚类群Ⅰ类菌株数13362Ⅱ类菌株数2190.0390.844成簇菌株数Ⅰ类成簇数324Ⅱ类成簇数200.0001.00030 暨南大学硕士学位论文第4章全文讨论4.1广东省MTB北京家族菌株比例分析北京家族菌株同源性较高，由一类遗传背景相似的共同祖先发展衍化而来，[34]是中国结核分枝杆菌中最重要的亚型，我国多个省份对该型菌株所占比例进[35-37]行了报道，其结果在62.2％-91.8％之间不等。自1995年在来源于北京地区的菌株中被首次报道以来,该类菌株已经成为引起世界上结核病暴发流行最主要[38,39]的亚型。北京家族菌株与结核病的耐药性高度相关，其高耐药性可能由菌[40][41,42]株的高突变特性引起，曾在纽约、俄罗斯等多个地区引起暴发流行。同时，该类菌株生长速度较快、致病性较强，与患者复发、治疗失败和近期传播相[18,43]关，现已在全球范围内广泛蔓延和传播。分子流行病学研究发现，北京家[35]族菌株是中国最主要的流行株（74.08%），中国结核病的高负担状态与该型[35]菌株在中国地区的高流行状态密不可分。本研究纳入的结核分枝杆菌临床分离株来自广东省2009年、2013年、2015年三个年份，并且每年的样本都来源于广东省东西南北中五个地区。RD105缺失基因检测法研究表明，北京家族菌株是广东省的主要流行株，广东省北京家族菌株比例2015年高于2009年、2013年，呈现一个上升的趋势，提示该型菌株在广东省的疫情较为严重，可能存在比例上升的趋势。鉴于北京家族菌株的强致病性，广东省MTB防控工作中要加强对该型菌株的监管，努力做到对患者的早期发现与治疗，应用个体化的诊疗方案，切断传染源、阻断传播途径，从实际出发，制定高效实用的预防控制策略。同时，研究还发现北京家族菌株比例在东西南北中五个地区存在差异，中部地区北京家族菌株比例最高，西南部地区次之，东北部地区最低。王铁兵等应用多因素logistics回归分析深圳市933株MTB发[44]现，人口的流动性、性别、年龄、学历、职业等都与结核病发病相关，推测[5,45]北京家族菌株在中部地区比例较高与流动人口增加、市场开放等因素相关，可能由于广东省中部地区珠三角等地经济水平较发达，大量外来人口涌入和人群迁移导致中部地区北京家族菌株的比例增高。高谦等指出结核病的全国流行源于[46]“北京家族”菌株，结核病与社会发展、人类的迁移之间具有密切关系，支持了31 暨南大学硕士学位论文本研究的推测。4.2广东省MTB的MIRU分型和聚类分析分子流行病学研究已经证实，不同MTB在传播、发展成为活动性结核病，发生爆发流行的能力不同，特定的种系除了有不同的传播能力和致病性，还有不同的临床结果，一般认为特异的临床结果主要与菌株对应的宿主和环境有关。MIRU分型是目前MTB基因分型中最具前景的分型方法，国内外多地区的研究机构应用MIRU方法对不同地区来源的MTB进行了分型，不同位点的分辨率在[14,15,47,48]不同地区的研究中存在差异，其中Mtub39、ETRA等位点多态性在地[14,15,49,50]区间差异较大。多个不同地区提出了适合当地分型的最佳MIRU组合，这些位点组合对该研究地区的MTB分型可取得较满意结果，但是分型其他地区菌株时，分辨率无法保证，尤其是在北京家族菌株为主要流行株的地区，MIRU[51,52]位点的分辨率不高。TaoLuo等应用MIRU-25分型来自中国地区6个省份[29]的1362株MTB，提出MIRU-9作为中国地区的一线分型方法。R.X.Liu等应用MIRU-29分型来自中国重庆的210株MTB，提出MIRU-8作为重庆地区的一[42]线分型方法。ZhangL等应用MIRU-45分型来自中国上海的269株MTB，[53]提出MIRU-7作为上海地区的一线分型方法。由于不同地区报道的一线分型方法存在差异，广东省尚未有最佳MIRU组合的报道，本研究对广东省2013年455株MTB进行MIRU-24分型，研究表明MIRU-12的分辨率较好，可作为分型广东省MTB的一线分型方法。该最佳MIRU组合与其他地区存在差异，与报道基本相符。同时，不同位点分型广东省MTB，分辨率存在差异，不同位点对非北[14,15,47]京家族菌株分辨率优于对北京家族菌株分辨率，与国内外报道基本一致。以MIRU位点数字化结果为基础构建的系统发生树能够反映相同亚型中不[54]同微生物个体的微进化特征。应用最佳MIRU-12组合分型广东省853株MTB聚类分析可知，广东省菌株主要分成Ⅰ、Ⅱ二群，其中Ⅰ群是广东省的主要流行群，主要为北京家族菌株，且来自2015年的菌株主要分布在Ⅰ群，再次表明北京家族菌株的广泛流行状态，同时Ⅰ群菌株中，中部地区菌株比例高于Ⅱ群菌株，与RD105缺失基因分型法结果一致。全部北京家族菌株聚类分析主要形成一个复合群，提[55]示该亚型菌株遗传相似度高，发生近期传播的危险性较大，与报道相符。全32 暨南大学硕士学位论文部322株非北京家族菌株聚类分析结果主要包含2个复合群，不同亚型菌株之间遗传距离较大，表明该型菌株具有一定多样性。MIRU-12聚类分析531株北京家族菌株和322株非北京家族菌株，统计分析结果表明北京家族菌株中成簇率和成簇菌株数均高于非北京家族菌株，再次表明MIRU位点分型对非北京家族菌株流行的MTB分辨率较好，对北京家族菌株流行的MTB分辨率较差。4.3广东省MTB耐多药和广泛耐药性分析MDR和XDR耐药的出现，给全球范围内结核病防控工作带来巨大挑战。由药物质量问题、患者不规则用药、治疗时间不足等因素导致菌株自发出现耐药相关基因的突变称为获得性耐药；由耐药结核病患者直接传播感染导致的结核病称为原发性耐药。2016年世界卫生组织调查报告显示，MDR发生率在新发和复发结核患者中分别为3.3%、20%，且近年来发生率趋势较稳定。同时，约9.7%[4]的MDR病人会发展成为XDR患者。有报道称在南非，所有结核病中约10%[56]为MDR菌株，同时约10%的MDR病例为XDR患者。广东省MTB中2009年、2013年、2015年三年MDR耐药率差异无统计学意义，同时，广东省三个[57,58]年份结核分枝杆菌XDR耐药率差异也无统计学意义，与报道相符，说明广东省不同年份的耐药趋势较稳定。但是，广东省MTB耐药性仍然面临巨大挑战，结核病患者在患病与贫困的多重压力下，还要面临治疗失败的威胁，因此，在长期的抗结核治疗过程中，定期有效检测结核菌的药物敏感性，实行个体化用药方案至关重要。由于菌株数量较少，2009年MDR耐药菌株的MST复合群不明显，而2013年、2015年MDR菌株MST均包含三个复合群，说明耐药菌株的同源性[2,17,59]较高，发生近期传播的危险性大，是多个具有一定遗传相似度的不同亚型。4.4不同药物耐药与MIRU位点、患者基本信息相关性分析多因素logistics回归分析发现乙肝病史患者更易发生INH和EMB耐药，由于抗结核药物治疗多引起肝功能损害，严重的肝损害可能导致治疗终止而失败[60-62]，因而提示临床医生在治疗过程中需使用更合理安全的用药方案，注意乙肝病史合并结核病患者中INH和EMB的使用。女性出现CPM、PTO、PAS耐药的危险性高于男性，提示女性患者治疗中注意该三种药物的使用。同时，该研究33 暨南大学硕士学位论文结果表明结核复治患者的出现与病人自身情况、菌株特点之间未见明显联系，提[63,64]示复治患者的出现可能是一个由多因素引起的复杂的病理生理过程，应注意对复治患者使用个体化用药方案并加强对该类患者的监督管理。多因素logistics回归分析发现Qub11b与RFP和INH耐药相关，ETRF与INH、SM、EMB、OFX耐药相关，QUB26与PTO耐药相关，Mtub21与CPM耐药相关，不同MIRU位点可能作为耐药的保护性因素，串联重复数越高，相应发生耐药的危险性降低，因而，这些MIRU位点可能作为基因分型的生物标志物用于预测菌株耐药性，但仍需进一步研究验证。有报道MIRU位点可通过[65,66]调控其上下游基因的表达水平从而影响邻近基因的功能，例如，结核分枝杆菌中当Mtub39拷贝数是4时，其下游基因lpdA的表达量是拷贝数为1时的[67][16]12倍，TantivitayakulP等则报道MIRU10可促进下游基因gfp的表达。由于基因因素在抗结核药物治疗中发挥重要的作用，不同MIRU位点预测耐药性的作用可能与影响相关耐药基因的表达有关。4.5利福平和/或异烟肼耐药菌株rpoB、katG基因突变分析利福平和异烟肼是抗结核治疗中重要的一线药物，该二种抗结核药物耐药的出现，使结核病治疗面临巨大挑战，严重影响结核病患者的治愈率。MTB的耐药基础是由于基因发生突变，导致药物作用靶点改变或是激活药物代谢相关的酶类。分析不同耐药基因的突变位置、突变发生率、性质和菌株来源等对耐药的早期诊断、有效治疗、预防控制和新型抗结核药物的研发等具有重要意义。异烟肼耐药机制是一个受多因素多靶位影响的复杂过程，与katG基因水平的突变密切相关。JiaoWW等报道katG和inhA基因突变可以解释80%以上临床分离株的[68]异烟肼耐药。本研究表明广东省异烟肼耐药菌株中，87.8%菌株katG基因水平上发生了突变，表明广东省MTB异烟肼耐药的发生以katG基因突变为主。同时，katG315位点突变占所有异烟肼耐药的64.3%，katG463位点突变占76.5%。欧维正等分析贵州省各地来源的465株异烟肼耐药MTB，发现katG315点突变[69]率为83.6%，katG463位点突变与INH耐药无直接相关性。而芬兰报道的katG[70]315点突变率低至7%，说明不同位点点突变的地域差异性较大，katG463与INH耐药关系及其机制仍需要进一步研究。除此之外，126、161、232、147、127、34 暨南大学硕士学位论文189位点突变发生概率较低，其对异烟肼耐药的作用大小尚需深入探讨。本研究中，katG基因测序发生的突变都为点突变，不存在插入、缺失等其他突变类型，提示点突变在katG基因改变引起的INH耐药中发挥主要作用。另外，本研究有12.2%的异烟肼耐药菌株katG基因水平未检测到突变，说明异烟肼耐药在katG基因以外，仍受多种其他耐药机制的影响。由于90%以上的RFP耐药MTB同时发生INH耐药，耐RFP检测同时可作[71]为MDR菌株的标志，因此，耐RFP的快速检测技术在临床实践工作中具有重要的价值。由于95%以上的RFP耐药发生在rpoB基因的RRDR，检测该耐药相关核心区域可快速高效的了解rpoB基因突变情况。本研究显示广东省共有83.3%RFP耐药菌株rpoB基因RRDR序列上发现了变化，主要集中在531位（56.67%）和526位（18.33%），二者总突变率为75.00%，大部分RFP耐药菌株为单位点突变，1例菌株为双位点单密码子突变，涉及531位，1例菌株为三位点联合突变，涉及515位、516位和531位三个氨基酸，1例为碱基缺失，缺失的碱基为ATTCATGGA，涉及513位～516位三个氨基酸。刘敬华等报道531[72]位和526位是中国地区利福平耐药菌株rpoB基因中最常见的突变类型。531[73][74]位突变率在不同地区存在差异：新疆（57.1%）、北京（42.3%）、意大利[75]（59.5%）等地区报道存在差异，其原因可能与rpoB基因发生点突变利福平耐药后在该地区传播导致流行有关，也可能跟样本量与抽样过程产生的误差影响有关。有报道516位点的天冬氨酸突变以后，可能易导致其他位点的氨基酸发生[72]突变。rpoB基因不同位置的突变可能引起不同程度的利福平耐药，该基因的[76]突变分析对了解利福平耐药及耐药水平都具有重要的指导意义。这些突变形式在RFP耐药中的作用仍需进一步探讨，进一步说明RFP耐药机制是一个受多因素影响的、尚不明确的复杂过程。35 暨南大学硕士学位论文第5章总结与展望5.1工作总结结核病仍然是广东省主要的传染性疾病之一，严重的疫情给当地政府及结核病防控机构带来巨大的经济负担，分子流行病学研究的发展使我们能更好的认识、评估不同地区结核病的近期传播和复发情况，更好的发现与近期传播相关的临床、社会、地域危险因素，为结核病的正确认识和有效防控提供科学的理论依据。鉴于广东省的高结核负担现状，本文应用RD105缺失基因法分析了广东省MTB中北京家族菌株随时间、空间流行分布的动态特点；通过MIRU分型分析广东省MTB主要的亚型、复发和传播机制；通过rpoB和katG基因测序了解广东省利福平和/或异烟肼耐药菌株基因水平的改变情况，结合药敏试验结果，从分子流行病学角度阐述了广东省MTB的动态传播特点，对结核病防控措施效果的进一步提高和指导公共健康资源的更精确分配等具有重要意义，为后续筛选活动性肺结核患者体内特异性细胞因子和效应分子，与结核病发生、发展相关的生物标志物提供了理论指导,为获得结核特异性血清蛋白和microRNA、耐药相关血清蛋白和基因位点等提供了研究基础。主要结论见下：1．广东省MTB北京家族菌株在全部菌株中的比例，2015年高于2009年和2013年，且其在中部地区比例高于其在西南部地区和东北部地区，提示北京家族菌株发生近期传播的危险性可能呈现一种增高趋势，尤其在广东省中部地区要加强MTB北京家族菌株亚型的预防控制和菌株监管。2.不同MIRU位点分型广东省MTB多态性存在差异，整体而言，MIRU位点对非北京家族菌株分辨率优于其对北京家族菌株的分辨率，MIRU-12可作为分型广东省MTB的一线分型方法。基因聚类分析显示广东省MTB主要包括二个亚群，广东省菌株的主要流行群是Ⅰ群，且菌株的同源性较高。3.广东省MTB耐多药和广泛耐药率随时间呈现较稳定的趋势，说明耐药菌株的防控工作取得一定成效，且每年的聚类分析系统进化树相接近，提示异烟肼和利福平耐药菌株发生近期传播的危险性仍然较高。4.87.755%异烟肼耐药菌株katG基因水平上发生了变化，83.333%利福平36 暨南大学硕士学位论文耐药菌株rpoB基因RRDR序列水平上发生了变化，提示发生该二种药物耐药的分子基础主要是由于基因水平发生改变导致。5.多因素logistics回归分析发现Qub11b与RFP和INH耐药相关，ETRF与INH、SM、EMB、OFX耐药相关，Mtub21与CPM耐药相关，QUB26与PTO耐药相关，且位点的重复数越大，耐药危险性越低，提示这些位点可能是相应耐药的保护性因素，与预测菌株耐药的标志物相关。除此之外，我们还发现患者合并乙肝病史发生耐INH、耐EMB的危险性增高，女性发生耐CPM、PTO、PAS的危险性增高。另外，乡村人口居民比城镇人口居民发生北京家族菌株感染的危险性增高。5.2研究的优势与不足5.2.1该研究的优势1，应用RD105缺失基因检测法分别从时间动态和空间动态上分析了广东省结核分枝杆菌中北京家族基因型与非北京家族基因型菌株的流行分布特点，了解广东省北京家族基因型所占的比例在不同的地区和年份的流行差异。2，应用MIRU分型分析广东省结核分枝杆菌，比较不同MIRU位点分型广东省菌株的分辨率差异，找出适合广东省分型的最佳MIRU组合，通过聚类分析从株水平上分析广东省菌株的亲缘关系及流行病学特点。3，通过药敏试验，了解广东省结核分枝杆菌耐多药率及广泛耐药率特点，并通过基因测序，了解异烟肼耐药菌株katG基因、利福平耐药菌株rpoB基因的突变情况。4，通过多因素logistics回归分析，阐明不同耐药与患者自身情况、菌株特点之间的相关关系；阐明不同菌株耐药与MIRU位点之间的相关关系。5.2.2研究不足该研究选取广东省2009年、2013年、2015年菌株进行试验，年份间相隔较近，且选取的是部分地区、部分菌株作为样本，忽略了地区间的相互影响，可能存在抽样误差，北京家族基因型比例，耐药率，聚类分析结果可能存在一定偏差，可能对动态分析结果产生一定影响。另外，对可能由克隆产生，在传播过程37 暨南大学硕士学位论文中或在个体患者体内分散过程中发生微进化的较为特殊的菌株，分子流行病学研究可能出现分类错误。5.3未来工作展望以基因分型技术为主要研究手段的分子流行病学研究可用于阐述结核病的传播途径，发现活动性结核病的相关危险因素，从而更好地提出针对不同人群的高效防治措施。通过对广东省MTB分子流行病学研究，本研究阐述了MTB在广东省发生、发展、传播和流行的特点，但是还有待需要深入研究分析的地方。未来需要对更多的样本量进行系统的回顾性研究，更准确更全面的发现与近期传播相关的危险因素，同时阐明这些危险因素导致近期传播的具体途径和机制。另外，如何更好的将分子流行病学研究的成果应用于结核病防控的具体工作中，仍然是目前结核病防控领域面临的一大难题。由于及时有效的分子流行病学数据对结核病的早期发现、成簇性的分析、疫情的暴发流行有重要指导作用，因此，缩短病人就诊后得到有效分子流行病学研究数据的时间也至关重要。38 暨南大学硕士学位论文参考文献[1]ACHTMANM.Evolution,populationstructure,andphylogeographyofgeneticallymonomorphicbacterialpathogens[J].Annualreviewofmicrobiology,2008,62(53-70.[2]COMASI,COSCOLLAM,LUOT,etal.Out-of-AfricamigrationandNeolithiccoexpansionofMycobacteriumtuberculosiswithmodernhumans[J].Naturegenetics,2013,45(10):1176-82.[3]BOSKI,HARKINSKM,HERBIGA,etal.Pre-ColumbianmycobacterialgenomesrevealsealsasasourceofNewWorldhumantuberculosis[J].Nature,2014,514(7523):494-7.[4]WorldHealthOrganization.WHOGlobaltuberculosisreport2016[R].Geneva:WHO,2016.[5]孙晓舒,景军,张晓虎.从市场化程度和人口流动性看艾滋病问题--以广东省为例[J].人口与发展,2011,17(6):93-8.[6]钟球,尹建军,钱明,etal.广东省第五次结核病流行病学抽样调查分析[J].中国防痨杂志,2011,33(6):317-22.[7]KATO-MAEDAM,METCALFEJZ,FLORESL.GenotypingofMycobacteriumtuberculosis:applicationinepidemiologicstudies[J].Futuremicrobiology,2011,6(2):203-16.[8]刘毅,程君,李传友.结核分枝杆菌基因分型的研究进展[J].中华结核和呼吸杂志,2013,36(5):341-5.[9]KOTLOWSKIR.AnovelmethodofMycobacteriumtuberculosiscomplexstraindifferentiationusingpolymorphicGC-richgenesequences[J].ActabiochimicaPolonica,2015,62(2):317-22.[10]RINDIL,MEDICIC,BIMBIN,etal.GenomicvariabilityofMycobacteriumtuberculosisstrainsoftheEuro-Americanlineagebasedonlargesequencedeletions39 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暨南大学硕士学位论文致谢时光匆匆，三年的硕士生涯转眼间就要迎来终点，而我马上就要告别母校，告别曾经一起学习奋斗、打闹玩耍的伙伴们。所有的场景依然历历在目，犹如发生在昨天，这一路有哭过，笑过，将成为我人生中最珍贵的记忆！犹记得研一刚开学的时候，我怀着忐忑的心情去找导师报到，心里还在因为各种不确定而焦虑的时候，周老师亲切和蔼的笑容打动了我，让我瞬间淡定了许多。感谢这三年以来，周老师您如母亲般对我的谆谆教导和真诚帮助。工作中的您严格要求自己，追求完美，生活中的您幽默和蔼。您不仅是我的良师益友，也是我的亲人。您时常告诫我们，科研是一条孤独的路，做科研更是要沉的下心，耐得住寂寞，要我们不骄不躁。您时常教导我们要有一颗感恩的心，感谢父母亲的辛勤培育，要兼顾学业与家庭。周老师您严谨求实的工作态度，不怕辛劳的奋斗精神，积极乐观的生活态度，精明睿智的处事方式，和善亲睦的待人方式成为我人生道路的指明灯，时时感染激励着我，我将以此为鉴，在以后的工作学习中，认真仔细的向老师学习，努力提升自己的综合素质和能力，不辜负老师的知遇与栽培。总之，在这毕业之际，我真诚的跟您说声，谢谢老师，老师您辛苦了！一路上有您真好！同时，我也要感谢这三年来在实验室关心、帮助我的各位老师、师兄师姐和师弟师妹们，是你们的帮助让我这三年硕士路不孤单，有你们的陪伴，我感受到省结核病控制中心如家一般的温暖与真诚。在你们的熏陶教育下，我能更好的辨别是与非，对与错，更好的独立完成一项工作，感谢硕士路上有你们的指引。我也要感谢免疫学专业的所有老师和同学给我的帮助。感谢我住在了737的小窝，遇到了三个单纯善良的靓妹子和为四个“女儿”操碎了心的王妈，我们一起跨年，一起玩游戏，一起熬夜，让我在以后的每一次回忆中，都会想起我们曾经疯狂肆意的青春，我们每一个人都要幸福哦。最后，我要感谢的是我的爸爸妈妈和家人，感谢这么多年来你们对我的养育与教导，这么多年的求学路，是你们的无私奉献、默默付出、宽容与理解，让我有条件，也有勇气面对一路走过来的每一个挫折与挑战。这么多年求学路，我一49 暨南大学硕士学位论文直在外地，都没有时间好好的陪伴你们，每每想起这些，心里总是满怀愧疚。只想在这里说一句，爸爸妈妈，你们辛苦了！同时，我也要感谢关心照顾我的哥哥姐姐，感谢你们一路的主持，感谢你们对我的无要求，让我可以无顾忌的做我想做的事。最后，再次对所有关心、帮助过我的老师、亲人、朋友们表达我最衷心的感谢和最真诚的祝福！50