河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研究

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单位代码：８４５０１ｒＩ学号：ＭＰＨ１３０４０．，丨巧公：ｙ／公午！Ｓ欢无１亏｜额士＃像讼忒■畀Ｓ国■■ｍ黴河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型＿ｆ吴病及流行病学研究＿ｆｆ１ｐｉ控，研究生：周松邑制培养单位：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所＿ｐ导师：李振军研究员§副导师：李伟副研究员专业：公共卫生２０１５年 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄单位代码：８４５０１学号：ＭＰＨ１３０４０硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研究研宄生：周松培养单位：中国疾控中心传染病预防控制所导师：李振军研宄员李伟副研究员专业：公共卫生２０１５年１Ｉ 中国疾病预防控制中心硕上学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄学位论文原创性、真实性声明本人郑重声明：《河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研究》是本人在中国疾病预防控制中心攻读公共卫生硕士学位期间，在导师指导下完成的公共卫生硕士学位论文。我承诺：本论文中所涉及的所有数据、试验记录以及研宄结果均真实可信、、，引用资料己注明出处，无剽窃篡改抄袭之行为。如本论文原创性方面出现问题，我愿负法律责任。本课题的研宄成果归中国疾病预防控制中心所有，发表文章的单位署名为中国疾病预防控制中心。特此声明！学位论文作者（签名）：研宄生导师（签名）：＇ｙ離ｔｆ２０ｌｔ年６月？曰２０ｌｆ年＾月曰ｆ２ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宂河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄ＧｅｎｅｔｙｐｉｎｇａｎｄｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆＭｏｎｏｌｉａｎｇｇｅｒｂｉｌＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓｉｎＨｅｂｅｉ硕士研宄生：周松导师：李振军研究员李伟副研宄员中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室２０１５年５月３ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研究目录缩略词中文摘要英文摘要前言第一部分、菌差异片段分型研宄第二部分、规律成簇间隔短回文重复序列分型研究第三部分、串联重复序列分型研宄第四部分、河北鼠疫遗传特征和流行病学分析小结参考文献发表文章附录致谢４ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄缩略词ＡＢＢＲＥＶＩＡＴＩＯＮ缩写英文全称ｂＢａｓｅａｉｒｓｐｐｋｂＫｉｌｏｂａｓｅａｉｒｓｐＤＮＡｄｅｏｃｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉａｃｉｄ－－ｄＮＴＰＤｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ５，ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅＰＣＲＰｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎＶＮＴＲＶａ－ｒｉａｂｌｅｎｕｍｂｅｒｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔ－ＭＬＶＡＭｕ－ｌｔｉｐｌｅｌｏｃｕｓｖａｒｉａｂｌｅｎｕｍｂｅｒｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔａｎａｌｙｓｉｓＤＦＲＤｉｆｅｒｅｎｃｅＲｅｉｏｎｇＣＲＩＳＰＲＣｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓａｃｅｄｓｈｏｒｔａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓｇｐｐＩＳＩｎｓｅｒｔｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｔｒＰＦＧＥＰｕｌｓｅｄｆｉｅｌｄｅｌｅｌｅｃｏｐｈｏｒｅｓｉｓｇ５ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄中文摘要河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄硕士研究生：周松导师：李振军研宄员李伟副研宄员单位：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所鼠疫是一种自然疫源性疾病，原发于啮齿类动物并能引起人间流行，其传染性强、传播速度快、病死率高，曾引起三次世界性的大流行。河北省鼠疫属于内蒙古高原长爪沙鼠型鼠疫，历史上该型鼠疫曾引起２０７０４较大规模流行，世纪年代至今，河北共发生次动物间鼠疫，并从疫源地中陆续分离到１００多株鼠疫菌株。近年来沙鼠疫源地则持续活跃，而河北省鼠疫自然疫源地又地处沙鼠疫源地边缘；是距离北京最近的鼠疫疫源地，鉴于鼠疫的活跃趋势、严重危害性以及河北省鼠疫自然疫源地特殊地理位置，对该疫源地鼠疫菌的基因遗传特征进行深入研究。，具有十分重要的意义本实验结合鼠疫菌基因组研究的新技术，选用三种分型方法对河北省鼠疫菌进行基因分型，探究河北菌株间的内在联系与遗传特征。差异片段（ｄｉｆｅｒｅｎｃｅｒｅｇｉｏｎ，ＤＦＲ）研究结果显不：河北省鼠疫ＧｅｎｏｍｏｖａｒＤＦＲ一菌株属于ｌｌ型。分型结果与传统的生物分型相致。规律成簾的间隔短回文重复序列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｅａｔｓ，ＣＲＩＳＰＲ）研究显不北省鼠疫菌株分为ｐ：河ｐ２个基因型即Ｃｂ２和新发现的１基因型。６ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄－ｉ－ｖａ多位点可变数目串联重复序列（Ｍｕｌｔｐｌｅｌｏｃｕｓｒｉａｂｌｅｎｕｍｂｅｒｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔａｎａｌｙｓｉｓ，ＭＬＶＡ）研究分析：本实验选用２６个ＶＮＴＲ位点进行分型，结果显示：河北省鼠疫菌株可分为２个群落５基因型。７ ‘：屮Ｍ疾祸预防拉制屮心硕１：７位论文河北竹Ｋ：爪沙鼠沏鼠疫蘭基Ｗ分艰及流行蝻研宄ＡｂｓｔｒａｃｔＧｅｎｅｔｙｐｉｎｇａｎｄｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆＭｏｎｇｏｌｉａｎｇｅｒｂｉｌＹｅｒｓｉｎｉａｅｓｔｉｓｉｎＨｅｂｅｉｐＭａｓｔｅｒｃｚｎｄｉｄａｔｅ：ＺｈｏｕＳｏｎｇＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒｓ：Ｐｒｏｆ．ＬｉＺｈｅｎｕｎｊＶｉｃｅＰｒｏｆｉｉ．ＬＷｅＮａｔｌｌｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＣｏｍｍｕｎｉｃａｂｅＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＣｈｉｎｅｓｅＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ－ｎａｔｕｒａＰｌａｕｅｉｓａｒｅｅｍｅｒｉｎｌｆｏｃａｌｄｉｓｅａｓｅＰｌａｕｅｒｉｍａｒｙｇｇｇ，ｇｐｅｘｉｓｔｅｓｉｎｒｏｄｅｎｔｓａｎｄｃａｎｃａｕｓｅｈｕｍａｎｐａｎｄｅｍｉｃｗｉｔｈｔｈｅｈｉｈｌｙ，ｇｃｏｎｔａｉｏｕｓｓｒｅａｄｆａｓｔｍｏｒｔａｌｉｔｙｒａｔｅ．Ｐｌａｕｅｉｓｃａｔｅｏｒｉｚｅｄａｓａｇ，ｐ，ｇｇ＇ＣｌａｓｓＡｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅ，ｔｈｅｍｏｓｔｓｅｒｉｏｕｓｃａｔｅｇｏｒｙｕｎｄｅｒＣｈｉｎａｓＬａｗｏｎｔｈｅＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓＣｈｉｎａ，ｉｓａｃｏｕｎｔｒｙｗｉｔｈｍｏｓｔｗｉｄｅｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ，ｍｏｓｔｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ，ａｎｄｍｏｓｔａｃｔｉｖｅｎａｔｕｒａｌｌａｕｅｆｏｃｉｉｎｗｏｒｌｄａｔｌｅａｓｔ１２ｔｅｓｏｆｎａｔｕｒａｌｐｇ，ｙｐｌａｅｆｏｃｉｓｔｉｌｌｅｘｉｓｔｃｏｖｅｒｉｎ２９９ｃｏｕｎｔｉｅｓｉｎ１ｒｏｖｉｎｃｅｓａｎｄｐｇｕ，ｇ７ｐ，ｐｌａｕｅａｍｏｎａｎｉｍａｌｓｉｓｓｔｉｌｌｐｒｅｖａｌｅｎｔｉｎｓｅｖｅｒａｌｒｅｉｏｎｓ．ＰｌａｕｅｉｎｇｇｇｇＨｅｂｅｉｐｒｏｖｉｎｃｅｂｅｌｏｎｇｓｔｏｔｈｅＩｎｎｅｒＭｏｎｏｌｉａＰｌａｔｅａｕＭｅｒｉｏｎｅｓｇｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓｐｌａｇｕｅｆｏｃｉ，ｗｈｅｒｅｈｉｓｔｏｒｉｌｙ，ｐｌａｇｕｅｈａｄｃａｕｓｅｄｌａｒｇｅｓｃａｌｅｏｆｒｅｖａｌｅｎｃｅ．Ｆｒｏｍｔｈｅｓｅｖｅｎｔｉｅｓｏｆｔｈｅ２０ｔｈｃｅｎｔｕｒｙ，ｔｈｅｒｅｈａｄｐｂｅｅｎｅｘｉｓｔｅｄａｔｏｔａｌｏｆａｎｉｍａｌｌａｕｅｏｕｔｂｒｅａｋｓｉｎＨｅｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ４ｐｇ，ａｎｄｍｏｒｅｔｈａｎ１００ｓｔｒａｉｎｓｏｆＹｅｒｓｉｎｉａｅｓｔｉｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＨｅｂｅｉｐＰｌａｕｅｆｏｃｕｓ．。ｆｏｒｔｈｅｒｅａｓｏｎｔｈａｔｔｈｅＨｅｉｂｅｉｌａｅｆｏｃｕｓｉｓｇｐｇｕａｄａｃｉｅｎｔｔｏＢｅｉｉｎｔｈｅｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎａｂｏｕｔＹｅｒｓｉｎｉａｅｓｔｉｓｅｎｅｔｉｃ，ｊｊｇｐｇｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｉｎＨｅｉｂｅｉｈａｓｖｅｒｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｆｏｒｔｈｅ８ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研究ｄｉｓｅａｓｅｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．ｐＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｐｌａｇｕｅｂａｃｔｅｒｉａｉｎＨｅｂｅｉｐｒｏｖｉｎｃｅｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｕｓｉｎｇｔｈｒｅｅｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓ，ｉ．ｅ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ＤＦＲ）ｒｅｓｅａｒｃｈｗｉｔｈｔｈｅ２３ｆｒａｇｍｅｎｔｓａｎｄｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｕｌａｒｌｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｅａｔｓＣＲＩＳＰＲｇｙｐｐ（）ｔｉ－ａｎｄＭｕｌｐｌｅｌｏｃｕｓｎｕｍｂｅｒｓｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔａｎａｌｓｉｓ（ＭＬＶＡ）ｗｉｔｈ２６ｙＶＮＴＲｌｏｃｉｓｃｈｅｍｅ，ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｕｓｉｎｇｔｈｅｂｉｏｎｕｍｅｒｉｃｓｓｏｆｔｗａｒｅ．ＤＦＲａｎａｌｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｌａｕｅｓｔｒａｉｎｏｆＨｅｂｅｉｙｐｇｐｒｏｖｉｎｃｅｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏＧｅｎｏｍｏｖａｒｕｅｎｅｔｅ．ＣＲＩＳＰＲｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｇｙｐｔｈａｔｔｈｅｐｌａｇｕｅｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＨｅｂｅｉｐｒｏｖｉｎｃｅｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ２ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ，Ｃｂ２ａｎｄａｎｅｗｇｅｎｅｔｙｐｅ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＤＦＲａｎｄＣＲＩＳＰＲｗｅｒｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｔｙｐｉｎｇ．ＭＬＶＡｐｒｏｖｉｄｅｄｍｏｒｅｄｅｔａｉｌｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｍｏｎｇｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｉｎＨｅｂｅｉｒｏｖｉｎｃｅａｎｄｅｎｅｒａｌｌｃｏｕｌｄｂｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ２ｐ，ｇｙｃｌｕｓｔｅｒｓｗｉｔｈｓｕｂｔｅｓ．５ｙｐ９ 屮Ｗ疾祸预防拧制屮心硕１：学位论义河北竹长爪沙鼠沏鼠疫闕基Ｗ分Ｍ及流行病学研宂前目一鼠疫（Ｐｌａｇｕｅ）是由鼠疫耶尔森菌（简称鼠疫菌）引起的种自然疫源性疾病，原发生在啮齿类动物之间，通过主要媒介蚤类传播。鼠疫具有传染性强、传播速度快、病死率高的特征，在人类历史上造成巨大的灾难－，是我国法定的甲类传染病之。鼠疫患者的主要临床°－表现与体征：高热（体温可迅速达到３９４０Ｃ）、寒战、淋巴结肿大、。咳嗽咳痰，严重者伴有相应的休克表现鼠疫菌在１８９４年于香港首次分离，为革兰氏阴性菌，由假结核耶尔森菌进化来，属于肠杆菌科，２［１’］耶尔森菌属。三次世界大流行一人类历史上发生：第次发生在公元６世纪“”－５６５１４（５２７），史称汝斯丁瘟疫；第二次始于世纪止于１７世“”－１６６５）三次发生于纪（１３４６，史称黑死病；第１９世纪末，止于２０世纪中叶，此次大流行期间发现了鼠疫菌，明确了鼠疫的传染源。、于传播途径中国鼠疫历史上历经数次鼠疫流行，波及范围广死亡人数多，持续时间长。２０世纪９０年代以来，人间鼠疫呈现出上升的趋势，其形势严峻。河北鼠疫：１８８８年以来，河北省曾有１３个市（，１７７７人１５７６县）发生与流行人间鼠疫据不完全统计共发病，死亡［３］人。、河北省鼠疫自然疫源地位于河北省北部，处于华北区东北区、蒙新区三大动物地理区划的交界地带，属于坝上干草原区，面积约１０００平方公里，其间有康保县的照阳河乡、屯垦乡、满德堂乡及康２００。１９７２６保牧场，距离北京约多公里１年１２月日首次判定鼠疫１０ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄自然疫源地的存在，至２００５年共发生４次动物鼠疫爆发流行，共检４［］菌１００多株，均属于内蒙古高原长爪沙鼠型鼠疫，近年来沙鼠疫源地则持续活跃。鼠疫菌的分型大概分为传统分型方法与基因分析方法。传统分型方法有生物型与生态型。根据鼠疫菌对硝酸盐还原、甘油酵解、阿拉伯糖代谢能力的不同，将鼠疫菌分为４种生物型，即古典型、中世纪５型［］、东方型和田鼠型。根据鼠疫菌的生化特征、宿主和分布地区将［６］我国鼠疫菌分为１８个生态型。鼠疫菌的基因分型可以在分子水平研究鼠疫菌的进化与遗传特征，弥补传统的表现型分型的不足。近写年来，多种先进的分子生物学技术被应用于鼠疫菌的分型研究，例如［７］差异片段分析（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｒｅｇｉｏｎ，ＤＦＲ）、多位点可变数目串联８［］ｔ－－重复序列分析（Ｍｕｌｉｐｌｅｌｏｃｕｓｖａｒｉａｂｌｅｎｕｍｂｅｒｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔ？１１ａｎａｌｙｓｉｓＭＬＶＡ）、规律成簇的间隔短回文重复序列分析（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓｎ［］－ｌｄＣＲＩＳＰＲ）、脉冲场凝胶电泳技术（Ｐｕｌｓｅｄｆｉｅｇｅｌ１３［］ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＰＦＧＥ）、插入序列分析（ＩｎｓｅｒｔｓｅｑｕｅｎｃｅＩＳ）等。本研宄采用其中３种方法对河北鼠疫菌进行分型，了解河北省鼠疫菌的基因多态性和流行病学特征。建立河北菌株的基因数据库，不仅为今后河北省鼠疫防控、疫情调查、疫情溯源和应急处理提供重要依据，而且可以与全国鼠疫菌研宄彼此的亲缘关系和遗传进化特征提供数据。１１ 中Ｗ疾病预防控制屮心硕Ｉ」学位论文河北柯Ｋ爪沙鼠型鼠疫繭坫因分型及流行病学研宄第一部分差异片段分型研宄差异区段分析（ＤｉｆｅｒｅｎｔｒｅｉｏｎＦＲｇ，Ｄ）分析的指标是细菌基因组中存在或缺失的基因片段。这些基因片段在鼠疫菌进化过程中呈现或者存在或者缺失的基因现象，这种存在／缺失反映出鼠疫菌自然选１４］［择条件下适应性进化。此方法曾被应用于鼠疫菌种群关系和微进化ＭＷＭＷ分析。本实验按照文献报道用２３个ＤＦＲ指标体系（由于ＤＦＲ１－３在Ｍｌ质粒上ＭｐＴ，因此增加了检测ｐＴｌ质粒的引物以验证该质粒的存在，共计２４对引物）对河北１１５株鼠疫菌进行分型，了解其进化与遗传特征。一、材料１、实验菌株一本实验选用１１５株鼠疫菌，详见表（菌株详细信息见附表１）上述菌株分离自１９７１疫源地发现以来河北省４次动物鼠疫疫情。该菌株为河北自系统监测鼠疫至今保存的菌株。菌株来源于河北省鼠疫防治所菌库。（注菌库登记菌株共１２８，因其中传代复苏的菌株数为１１５，均纳入本研究中）表１河北疫菌信息表疫情年份疫情持续疫情范围检菌数分离宿主ｆ时间（ｋｉ）１９７２６个月４９０１９长爪沙鼠、达乌尔黄鼠、方形黄鼠蚤蒙冀亚种１９９４１３个月１０００７０长爪沙鼠、秃病蚤蒙冀亚种、方形黄鼠蚤蒙古亚种２００２１个月７６０２６长爪沙鼠、黑线毛足鼠、黑线仓鼠、秃病蚤蒙冀亚种、宽Ｎ纤蚤２００５８天３４０１３长爪沙鼠、秃病蚤蒙冀亚种、方形黄鼠蚤蒙古亚种１２ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄２、主要设备ＰＣＲ－基因扩增仪（ＢｉｏＲａｄ公司，美国），凝胶成像分析系统Ｂ－Ｒａｄ（ｉｏ公司，美国），５４１５Ｄ小型高速离心机（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，一ｓ德国）水平电泳仪（六仪器厂，北京），低温冷冻离心机（ｉｇｍａ公司。，美国）３、主要试剂ＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘ（全式金生物技术有限公司），低分子量ＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒｓ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ和ＮＥＷＥＮＧＬＡＮＤ），ＧｏｌｄＶｉｅｗＤＮＡ染料（鼎国），０．５ＸＴＢＥ电泳缓冲液，琼脂糖粉（Ｂｉｏｗｅｓｔ）、赫氏培养基，ＤＮＡ提起试剂盒（ＱＩＡＧＥＮ，德国），２４对引物（北京睿博兴科生物技术有限公司合成）（详附表２）。二、实验方法１、鼠疫菌培养皿°冻干菌株复苏活化及鉴定后接种于赫氏培养基平，２８Ｃ培养－２４３６小时。２、核酸提取（ＱＩＡＧＥＮ试剂盒）（１）取０．９％无菌生理盐水２毫升，刮取菌苔悬浮均匀（菌浓度最９大为２Ｘ１０），５０００Ｘｇ（７５００ｒｐｍ）离心１０分钟，去上清。（２）在离心管中加入１８０微升裂解缓冲液，用移液器轻轻搅动，使其充分悬浮。°（３）再加入２０微升蛋白酶Ｋ，震荡混匀，置５６Ｃ水浴中彻底裂解。（４）加入４微升ＲＮａｓｅＡ，震荡混匀，室温２分钟。１３ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄（５）震荡１５秒，加２００微升裂解液。加２００微升无水乙醇，再混匀。６一（）吸取上步混合物放于离心管２），（放于毫升收集管上离心（８０００ｒｐｍ）１分钟，弃收集管和流出液于加盖容器内。（７）放离心柱于新的收集管上，加５００微升洗液１，离心（８０００ｒｐｍ）１分钟，弃收集管和流出液于加盖容器内。（８）放离心柱于新的收集管上，加５００微升洗液２，离心（１４０００ｒｐｍ）３分钟，弃收集管和流出液于加盖容器内。（９）放离心柱于新的收集管上，加２００微升洗脱液，室温１分钟，离心。（８０００ｒｐｍ）１分钟，离心管液体即为提取的核酸°°－ＣＣ（１０）２０保存备用，工作液２０倍稀释４保存。３、ＰＣＲ反应体系（２５ｕＬ）见表２表２ＰＣＲ反应体系加样量（ｕＬ）＾９５去离子水．ＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘ１２．５上游引物（１０ｙｍｏｌ／Ｌ）１下游引物（ｌ〇ｕｍｏｌ／Ｌ）１模板ＤＮＡ１４、ＰＣＲ反应扩增条件（详见表３）５、ＰＣＲ产物检测取ＰＣＲ产物３ｕｌ，放在１．５％的普通琼脂糖凝胶电泳，用Ｇｏｌｄｖｉｅｗ一ｖ染液进行染色，每排加孔Ｍａｒｋｅｒ对照，电压６／ｃｍ，电泳５０ｍｉｎ，最后用凝胶成像分析系统观察分析。每次实验均设阴性对照（用去离１４ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄子水代替模版ＥＶ。）和阳性对照（用菌）对可疑结果要多次重复试验后再确定。表３ＰＣＲ反应扩增条件表°Ｓｔｅｐ１预变性：９５Ｃ，３ｍｉｎ°变性：９４Ｃ，３０ｓ°Ｓｔｅｐ２退火：６０Ｃ，３０ｓ循环数：３０个°延伸：７２Ｃ，ｌｍｉｎ°Ｓｔｅｐ３再延伸：７２Ｃ，５ｍｉｎ°备注：其中ＤＦＲ１８和ＤＦＲ１９退火温度是５６Ｃ。６、聚类分析，通过ＢｉｏＮｕｍｅｔｒｉｃｓ软件进行聚类分析，聚类方法为ＵＰＧＭＡ。绘制１６［］聚类图。基因分型参照国际通用的分型型别命名。三、结果在河北省鼠疫疫源地分离到的１５１株鼠疫菌均属于１个基因型，即１７［］ＧｅｎｏｍｏｖａｒｌｌＳ。见表４．表４ＤＦＲ试验结果ＤＦＲＰＭＴ１２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５１６１７１８１９２０２１２２２３０１００１１１１００００１１０１１１１１１１１１“”“”表头中广２３代表ＤＦＲｒＤＦＲ２３位点。，１表示基因姐中存在该ＤＦＲ；０表示该ＤＦＲ在基因组中缺失四、讨论鼠疫菌基因组差异区段（ＤＦＲ）分型观察的是鼠疫菌适应自然疫源生态环境染色体上基因存在／缺失的遗传事件，反映的鼠疫菌种群关１５ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄系。采用ＤＦＲ方法对河北省鼠疫菌株进行基因分型，河北鼠疫菌ＤＦＲ遗传特征基因型全部为Ｇｅｎｏｍｏｖａｒｌｌ基因型，这表明引起河北省鼠疫疫源地鼠间鼠疫流行的菌株种群其遗传特征在基因组差异区段上一致。即使时间跨度数十年，经历４次动物鼠疫流行，鼠疫菌并没有产生在ＤＦＲ方法观察的对应２３个基因的遗传事件（存在／缺失）变化，这与河北鼠疫自然疫源地地理生态环境、宿主长爪沙鼠和主要媒介秃１８［］病蚤构成完整的生物群落密切相关。Ｇｅｎｏｍｏｖａｒｌｌ基因组型的鼠疫菌株是我国长爪沙鼠鼠疫自然疫源地的优势型菌株，主要分布在宁夏、陕西、内蒙古、河北境内，河北鼠疫自然疫源地康保县和内蒙古正镶白旗、镶黄旗接壤。河北４次动物鼠疫流行都是长爪沙鼠自然疫源地的优势菌株Ｇｅｎｏｍｏｖａｒｌｌ基因组型的菌株，提示河北流行的动物鼠疫流行范围和我国长爪沙鼠连片，河北鼠疫均经由内蒙古疫源地传一入并形成流行。方面也提示这样的可能另，即Ｇｅｎｏｍｏｖａｒｌｌ基因组型的菌株能够很好地适应河北自然疫源地的生态环境，在数次鼠间鼠一疫流行中发展和延续鼠疫菌种，这在定程度上也反应了鼠疫菌自然疫源性在自然界中的自然选择结果。１６ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄第二部分规律成簇间隔短回文重复序列分型研宄规律成簇间隔短回文重复序列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ，ＣＲＩＳＰＲ）的典型特征是一相同重复片断彼此之间间插间区序列（ｓｐａｃｅｒｓ）。ＣＲＩＳＰＲ在近半细菌和所有的古细菌中都存在，可能是原核细胞最原始的抗噬菌体系１９［］一。规律成簇间隔短回文重复序列的间区序列统之（ｓｐａｃｅｓ）被２１２２’２３＆］［］用于于鼠疫菌种群关系和微进化分析。本实验按照文献报道鼠疫菌３个ＣＲＩＳＰＲ序列（ＹＰａ，ＹＰｂ和ＹＰｃ），采用３对引物扩增河北１１５株鼠疫菌ＣＲＩＳＰＲ序列，利用ｓｐａｃｅｓ序列进行分型，了解其进化与遗传特征。一、材料与方法１、实验菌株本实验选用１１５株鼠疫菌。，同ＤＦＲ方法，详细信息见附表１２、主要设备－ＰＣＲ基因扩增伩（ＢｉｏＲａｄ公司，美国），凝胶成像分析系统Ｂ－（ｉｏＲａｄ公司，美国），５４１５Ｄ小型高速离心机（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，一仪器厂），低温冷冻离心机（ｓｉｇｍａ德国）水平电泳仪（六，北京公司，美国）３、主要试剂ＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘ（鼎国），低分子量ＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒｓ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ和ＮＥＷＥＮＧＬＡＮＤ）．５ＸＴＢ，ＧｏｌｄＶｉｅｗＤＮＡ染料（鼎国），０Ｅ电泳缓冲液，琼脂糖粉（Ｂｉｏｗｅｓｔ）、ＤＮＡ提起试剂盒（ＱＩＡＧＥＮ，德国），３对引物（北京睿博兴科生物技术有限公司合成）如下。１７ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宂ＣＲＩＳＰＲ对扩增引物：；；－Ｌ－－ＹＰ１（ＹＰａ）：（５ＡＡＴＴＴＴＧＣＴＣＣＣＣＡＡＡＴＡＧＣＡＴ３）；；－－ＹＰ－１Ｒ（ＹＰａ）：（５ＴＴＴＴＣＣＣＣＡＴＴＡＧＣＧＡＡＡＴＡＡＧＴＡ３）＇ｆ－－－ＹＰ２Ｌ（ＹＰｂ）：（５ＡＴＡＴＣＣＴＧＣＴＴＡＣＣＧＡＧＧＧＴ３）ｆ，－－－ＹＰ２Ｒ（ＹＰｂ）：（５ＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＧＣＴＣＴＧＴＣＴＡ３），／－Ｌ－－ＹＰ３（ＹＰｃ）：（５ＧＣＣＡＡＧＧＧＡＴＴＡＧＴＧＡＧＴＴＡＡ３）；，ＹＰ３－Ｒ－－（ＹＰｃ）：５ＴＴＴＡＣＧＣＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＡＴＴＧ３（）二、实验方法１、鼠疫菌培养与核酸提取参照ＤＦＲ的方法。２、２５ｕＬＰＣＲ反应体系见表５表５ＰＣＲ反应体系成分加样量Ｌ）（ｙ去离子水９．５ＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘ１２．５上游引物（１０Ｐｍｏ］／Ｌ）１下游引物（ｌ〇ｕｍｏｌ／Ｌ）１模板ＤＮＡ１３、ＰＣＲ反应扩增条件（详见表６）表６ＰＣＲ反应扩增条件°Ｓｔｅｐ１预变性：９５Ｃ，５ｍｉｎ°变性：９５Ｃ，４０ｓ°Ｓｔｅｐ２退火：５８Ｃ，４０ｓ循环数：３０个°延伸：７２Ｃ，４〇ｓ°Ｓｔｅｐ３再延伸：７２Ｃ，５ｍｉｎ４、水平琼脂糖凝胶电泳：１８ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研究取ＰＣＲ产物３微升．５％ｌｄｖｉｅｗ，放在１的普通琼脂糖凝胶电泳，用Ｇｏ一染液进行染色，每排加孔Ｍａｒｋｅｒ对照，电压６ｖ／ｃｍ，电泳５０ｍｉｎ，最后用凝胶成像分析系统鉴定产物和大小。５、ＰＣＲ产物的使用ＡＢＩ３７３０进行测序。测序结果分析，过ＣＲＩＳＰＲ网“”—ｈｔｔｐ．．络服务器（：／／ｃｒｉｓｐｒｕｐｓｕｄｆｒ／）中的ＣＲＩＳＰＲｓＦｉｎｄｅｒ工２２［］具获得菌株间区序列信息。运用以１等提出的命名方法及序列资料命名。，确定菌株的基因簇与基因型６、聚类分析通过ＢｉｏＮｕｍｅｔｒｉｃｓ软件进行聚类分析，聚类方法为ＵＰＧＭＡ。三、结果１、河北鼠疫疫源地分离到的１１５株鼠疫菌ＣＲＩＳＰＲ的间区序列种类：３个ＣＲＩＳＰＲ位点共有间区序列８种。ＹＰａ位点包括ａｌ、ａ２、ａ３；ＹＰｂ位点包括ｂｌ、ｂ２；ＹＰｃ包括ｃｌ、ｃ２、ｃ３（详见表７）。表７河北省鼠疫菌株的ＣＲＩＳＰＲ的间区序列ＣＲＩＳＰＲ位点间区序列名间区序列信息ＹＰａａｌＴＣＡＧＧＧＧＡＣＴＧＧＣＧＡＡＣＡＡＴＧＴＣＴＴＴＣＡＴＧＡＴａ２ＧＡＡＡＡＧＧＴＡＡＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＴＡＧＴＴａ３ＡＴＴＡＴＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＧＧＣＧＣＡＧＡＴＹＰｂｂｌＴＣＴＧＴＡＣＧＣＡＴＡＣＣＧＣＣＡＴＣＴＴＧＣＡＴＣＡＧＴＣＴｂ２ＡＧＣＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡＡＴＴＡＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＴＴＴＣＧＧＹＰｃｃｌＧＴＴＡＴＡＣＣＣＣＧＣＧＣＡＧＧＧＡＧＴＧＡＡＧＣＧＴＴＧＡＣｃ２ＴＴＭＧＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＡＡＴＡＡＡＴｃ３ＣＴＧＡＡＡＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＣＧＴＣＧＡＡＣＡＴ２、ＣＲＩＳＰＲ基因分型：１１５株鼠疫菌分为２个基因型１０６株鼠疫菌株１９ 屮Ｗ疾病预防拧制屮心硕士学位论文河北竹Ｋ爪沙鼠增鼠疫蘭雄Ｗ分壻及流行病学研宄为Ｃｂ２型。另外９株鼠疫菌均为新基因型（命名为ＣｃＡｌ型）。（详见表８）表８河北省鼠疫菌ＣＲＩＳＰＲ基因分型结果三个位点间区序列组合生态型菌株数基因型ＹｐａＹｐｂＹｐｃ－－－－＿沙鼠型１０６Ｃｂ２ａｌａ２ａ３ｂｌｂ２ｃｌｃ２ｃ３９Ｃ－－－—沙鼠型ｃＡｌａｌａ２ａ３ｂｌｂ２ｃ２ｃ３３、ＣＲＩＳＰＲ聚类结果见图１．四、讨论规律成族的间隔的短回文重复序列（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ，ＣＲＩＳＰＲ）是近些年发现的细菌针对噬菌体等外源性ＤＮＡ的获得性免疫系统。ＣＲＩＳＰＲ可以使细菌获得对噬菌体等外源ＤＮＡ的免疫，ＣＲＩＳＰＲ结构中的间隔序列则在免疫过程中发挥着重要作用。在细菌进化过程中，ＣＲＩＳＰＲ序列中间隔序列的插入和剔除使得ＣＲＩＳＰＲ位点具有极高的多态性。利用适当的引物ＰＣＲ扩增ＣＲＩＳＰＲ位点，测序后获得ＣＲＩＳＰＲ序列。通过分析ＣＲＩＳＰＲ。位点中间隔序列的组成和排列顺序，可以用来对细菌分型因此，［２２］ＣＲＩＳＰＲ结构可以作为细菌分型溯源与进化研究的理想位点。０＾等ＣＲＩＳＰＲ可一提出的鼠疫菌能的进化模式。河北鼠疫在第次动物鼠疫（７１年和７２年）分离的菌株，在Ｙｐ３的Ｃ３片段上存在差异，有９株菌缺少Ｙｐ３的Ｃ３片段，这是新的发现，另外９株没缺少Ｙｐ３的Ｃ３片段，属于２Ｃｂ２型。但是在以后几次鼠疫流行分离的菌株均属于Ｃｂ型。提示在早２０ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宂期分离的菌株出现基因变异，这种进化变异有可能是抵抗噬菌体的作用或是外源ＤＮＡ的干扰所产生，但是在接下来跨域３０年几次鼠疫流行中所分离到的菌株均属于Ｃｂ２型，这说明新发现的基因型不适合当地的生态环境变化而被淘汰。２１ －ｐｃ扮及ｆ中国痴釕嫌控钊ｆ硕河瞎长沙型＾■．０＠病＾ｗ究一｜＾？，＊ｆ＊：，（ｉ：咖ｌｕｉ＿ｌｐｊｉｕｉｌ．｜．ｇｌ你§？卿鶼？？躑ｍｎ￡：阶ｌｌｕ＇：１＾？礙＿ｌ．ｓ：＊．零ｊ：ｓ？；！；１＾？明｜＿Ｂ财？ｒ－＾■＂＊！；？§ｖ“＝鼷｜；＂ｌ．鵰，＊＆＝ｆ期鸞＇￡＋Ｓ－？ｌ＊＝？ｆ？ｔｒＵ吻ｌ＝＊－｜９：ｉ：＊＇－ｗ＊：？．ｌ鬌哝ｗ（期够＝－ｗ５．餅囀蝙场ｉ：＝－期埘ｌ＊，｜＃Ｋ期？ｖ＊．．＊衫？＝ｗｒ；Ｋ？．？ｒ（ｉ？？Ｋ！ｌｉＫ埯＝＃＇ｆ＾ｔ＃ｗ：ｆ，＝ｓ．ｓ，＊（ｗ—：ｗｙｉｖ：ｓ＝ｗ，：ｆｖｗ：ｓｓ：ｖ＝－＊ｗ：ｖＫ？？：；：ｗｖｗ？ｖ＝－＇＇ｗ＊ＩＫｉ＊）ｗｌ？ｗ：？．？ｌｌｓ；＾＊ｌｕ；ｌ？ｌｖｗｖｔ＞Ｉ＝ｗ？ｖ？＞？＞Ｖ＝Ｗｖ－￥ＷＩ．－ｌ？ｉＫＷ＝ｔｉ－ｓＭ１＜ｎ￡ｔｆｒｖｉｗ．￡ｖ＞ｌ＞：ｌ瀰ｌ（＞ｖｗ：ｗ三？ｔｉ＜５：ｉ寧＝ｌ－＼＇明ｌｉｔｐ－ｉ＞＝ｌ＊－ｖｆｗｌｌ豳．；ｌ？ｉｖＴｗ－：ａｐｌ＊：三ｗ？；ｓｓｉ，：Ｋ麵ｌｃ＞ｖ．螩ｗ？＝＞：ｌｓ：．ｉ－ｉ；．－＞＊ｉ？．！－ｖ：．；；；ｗＫｒ３？ｌｌ々ｌｌ＞：ｗｌ４．ｌｖ；；３ｉ：＞？＞…．！＊ｔ？－ｌ：？８ｗｉＩ．啪ｔ？？：；？ｌ．ｓ？！ｗ；■？）．＜，．：ｗｖ＊．／－？－Ｔｗｉ？ｋ．（．．．；Ｕ？ｌ（ｌ；？－．－ｉ．ｌＴｙ？ｌｌｓ．；ｕ：；！Ｉ＊ｉＭ？，ｒＴ？＊￡：，：ｓ．Ｓ１ｉａＡ．．．？ｉ．？ｉｉ；：ｓ－－Ｉ６：、．，＇■＊；Ｍ＞＇＊：：ｓ．ｘｌｌ＊：ｗｉＩ－－ｓＪｗ＊ｒｉ＊－ｗ８；？｜：ｌｗｒ？，哚ｒｗａ？！．－垛ｇ＊ｒ＊场：ｉｗ蝻ｗ－ｒ；ｔｈ－ｆｅ；ｉｉ，＇－！．ｒｗｉｒ．－＜ｗ＇ｌｗＫｒＫ＾：＊－．，ｉＢｖ：叫－＿＊ｌ＞ｓｌ６ｉ？６ｎｔ：？＃Ｈ＝．ｉ麵Ｉ：１ｌ．＇｜－ｌｒｗ．ｗ？Ｔｖ－ｌｖ对ｗ＾５炸Ｍ＾ｔＢ？＜ｉｌｉｒ：ｌ二＾．」＊ｉ－＃＊ｌｉｉｋ！ｌ＜广ｌｅｉ：．ｆ！，＊．ｌｆ：－１－：ｌｉｆＪ：ｌ，＇ｍ…：潮？，？：＾ｊｐＩｆＨ＿－」ｇ＇：「，：Ｉ＊：＿．ｒ「ｗ讕＾，？Ｂ：．？ｗ：：嘞．Ｋｆ＞ｌ？ｔ；明ｌ一：ｗｉ？Ｅ＾：；一ｗ－ｎ？Ｒｖ＞二ｗ５：＇＿ｔ１Ｒ—ＰＲ图－ｓ基因分型￥类Ｆ果ＴＦｉ？ｇｕｒｅ１ＴｈｅｉｓｏｆｃＲＩＳＰＲｒｓｇｅｏｔ３１ｆｏｒ１１５ｓ，ｔｒａｉｎｓ２２ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研究第三部分串联重复序列分型研宄－ｎｕｍｂｅｒ可变数目串联重复序列（ｖａｒｉａｂｌｅｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔ，ＶＮＴＲ）是一段相同或相似的核苷酸序列首尾相连重复序列，这种广泛存在于一原核和真核生物基因组中。同物种不同个体的ＶＮＴＲ位点的重复数不同，会形成种内的遗传多态性，将多个ＶＮＴＲ位点组合起来进行分ｔ－ｌ－子分型鉴别的方法称为ＭＬＶＡ（Ｍｕｌｉｐｌｅｏｃｕｓｖａｒｉａｂｌｅｎｕｍｂｅｒｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔａｎａｌｙｓｉｓ）方法。此方法应用于鼠疫疫情爆发溯源和２４［］＋鼠疫菌种群关系分析。本实验按照文献１６采用１４１２ＭＬＶＡ分型策略（共计２６个ＶＮＴＲ位点１５。）对河北１株鼠疫菌进行分型一、材料与方法１、实验菌株。本实验选用１１５株鼠疫菌，详见附表１２、主要设备ＰＣＲ基因Ｂ－扩增仪（ｉｏＲａｄ公司，美国），ＡＢＩ３７３０测序仪（测－序和毛细管电泳），凝胶成像分析系统（ＢｉｏＲａｄ公司，美国），５４１５Ｄ一小型高速离心机（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司，德国）水平电泳仪（六仪器厂，）心机（ｍａ公司）北京，低温冷冻离ｓｉｇ，美国３、主要试剂ＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘ（鼎国），低分子量ＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒｓ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ和ＮＥＷＥＮＧＬＡＮＤ），ＧｏｌｄＶｉｅｗＤＮＡ染料（鼎国），０？５ＸＴＢＥ电泳缓冲液，琼脂糖粉（Ｂｉｏｗｅｓｔ），２６对引物（北京睿博兴科生物技术有限公司合成）（详附表３）。２３ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄二、实验方法１、鼠疫菌培养与核酸提取参照ＤＦＲ的方法。２、ＰＣＲ：２６对引物分成１４个反应体系，采用双重或单重ＰＣＲ方法。（引物配伍详情见表９）。３一、２５ｕＬＰＣＲ反应体系（根据对或两对引物，进行调整）见表１０。表１０ＰＣＲ反应体系表成分加样量（ＵＬ）去离子水７．５ＰＣＲＳｕｐｅｒｍｉｘ１２．５上游引物（ｌ〇ｙｍｏｌ／Ｌ）２（各１）下游引物（ｌ〇ｙｒａｏｌ／Ｌ）２（各１）模板ＤＮＡ１４、ＰＣＲ反应扩增条件（详见表１１）。表１１ＰＣＲ反应扩增条件表°：９５Ｃ预变性，３ｍｉｎＳｔｅｐ１°变性：９４Ｃｌｍｉｎ，循环数：３０°Ｓｔｅｐ２退火：？Ｃｌｍｉｎ个°：７２Ｃ延伸，ｌｍｉｎ°再延伸：７２Ｃ，５ｍｉｎＳｔｅｐ３备注：不同体系退火温度不同，详见表９。２４ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研究表９各体系所加引物及ＶＮＴＲ位点信息＂ＳＩｉ－核心序列长度－理论产物长度－重复数退火温度ｉＢ引物名称位点名称￣￣ｎ＾ＨＥＸＭ５８Ｍ５８＿１７ｂｐ＿３９５ｂｐ＿８Ｕ（ｍｓ０４）６００ＹＦｍｓ５ｂｂ１ＡＭ６ｙｐ３０６０ｍｓ５６１６＿ｐ＿２２０ｐ＿７Ｕ＊Ｙ２ＨＥＸｍｓ３８ｙｐ４４２５ｍｓ３８＿１６ｂｐ＿２５１ｂｐ＿８Ｕ６０ＣＹ２ＦＡＭＭ２１Ｍ２１７ｂｐ１７９ｂ５Ｕ＿＿ｐ＿Ｙ３ＦＡＭＭ１５Ｍｌ５５ｂｐ２０３ｂｐ５ＵＱＯＶ＿＿＿Ｙ３ＨＥＸＭ６１Ｍ６１１８ｂ７ｂｐ５Ｕ＿ｐ＿３５＿Ｙ４ＦＡＭｍｓ０９ｙｐ３０５７ｍｓ０９＿１８ｂｐ＿６８２ｂｐ＿３３Ｕ５５ＶＹ４ＨＥＸＮ２４８６Ｎ２４８６１７ｂ３４６ｂｐ３Ｕ＿ｐ＿＿＊Ｙ５ＦＡＭｍｓ７３ｙｐ３２３６ｍｓ７３１８ｂｐ２２５ｂｐ６Ｕ５５Ｃ＿＿＿Ｙ５ＨＥＸｍｓ４１ｙｐ０７１８ｍｓ４１」７ｂｐ＿２１８ｂｐ＿＿７Ｕ°Ｙ６ＨＥＸＮ３７７９Ｎ３７７９１７ｂ３２８ｂ５２Ｃ＿ｐ＿ｐ＿４ＵＹ６ＦＡＭＮ２８９６Ｎ２８９６１６ｂ１ｂ３Ｕ＿ｐ＿２８ｐ＿Ｙ７ＦＡＭＮ０８６５Ｎ０８６５１８ｂ５ｂＵ５２Ｖ＿ｐ＿２２ｐ＿２Ｙ７ＨＥＸＮ２９７６Ｎ２９７６１８ｂ３Ｕ＿ｐ＿２９４ｂｐ＿＇Ｙ８ＨＥＸＮ１６０６Ｎ１６０６９ｂｐ２２１ｂｐ４Ｕ５２Ｃ＿＿＿Ｙ９ＦＡＭＮ２５７７Ｎ２５７７７ｂｐ２１９ｂｐ７Ｕ５２Ｃ＿＿＿Ｙ９ＨＥＸＮ３７７３Ｎ３７７３９ｂｐ２６５ｂｐ５Ｕ＿＿＿ＢＹＨＥＸＭ５ｓ６２Ｃ１０３４Ｍ３４＿９ｂｐ＿２５ｂｐ＿６Ｕ（ｍ）５５Ｙ０ＦＡＭＭ３３Ｍｂｐ１３３９３５７ｂｐ２２Ｕ＿＿＿＊ＹｌｌＦＡＭＭ２２Ｍ２２７ｂｐ２３５ｂｐ１３Ｕ５５Ｃ＿＿＿ＹｌｌＨＥＸＭ４３Ｍ４３１２ｂ２６９ｂｐ５Ｕ＿ｐ＿＿ｅＹ１２ＦＡＭＭ２５Ｍ２５７ｂｐ３３５ｂＵ６０Ｃ＿＿ｐ＿２２Ｙ１２ＨＥＸＭ２３Ｍ２３７ｂｐ１６９ｂ７Ｕ＿＿ｐ＿Ｙ１３ＦＡＭＭ２８Ｍ２８８ｂｐ２１２ｂｐ７Ｕ５５Ｘ：＿＿＿Ｙ１３ＨＥＸＭ２９Ｍ２９＿８ｂｐ＿２３３ｂｐ＿８Ｕ°Ｙ４ＦＡＭＮＣ１２１１７Ｎ２１１７＿９ｂｐ＿３５３ｂｐ＿３Ｕ５２每个位点数值是在Ｃ０９２菌株中的核心序列长度、重复数及扩增产物大小。２５ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宂５、水平琼脂糖凝胶电泳：ＰＣＲ３１５％Ｇｏｖｉｅｗ取产物微升，放在．的普通琼脂糖凝胶电泳，用ｌｄ一Ｍａｒｋｅｒ１ｉｎ染液进行染色，每排加孔对照，电压２０ｖ，电泳５０ｍ，最后用凝胶成像分析系统观察判断产物。６、ＰＣＲ产物的使用ＡＢＩ３７３０进行毛细管电泳。根据电泳得到的分子量大小确定各个位点的重复数。７、聚类分析ＢｉｏＮｕｍｅｔｒｉｃｓ软ＵＰＧＭＡ。绘制通过件进行聚类分析，聚类方法为聚类图和最小生成树。三、结果１、将河北省鼠疫疫源地分离到的１１５株鼠疫菌分为２个群落，５个基因型（详见表１２）。绘制聚类图（结果见图２）和最小生成树（结果见图３）。ＩＶ■■＝ｍ２００３ｍ２００５一一同款底色为同年，圆盘大小有菌株数量确定图３１１５株菌的最小生成树Ｆｉｇｕｒｅ３Ｔｈｅｍｉｎｉｍｕｍｓｐａｎｎｉｎｇｔｒｅｅｏｆ１１５ｓｔｒａｉｎｓ２６ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄表１２河北鼠疫菌ＭＬＶＡ分型信息表群落基因型菌株数分离年代７－９７２１１８１９１１１２１１２００２２３６５－１９９４１９９５２４９７－１０１１１９７２２５２－１２００２２００５２、对河北鼠疫菌的２６个ＶＮＴＲ位点分析得出：在Ｍ２２位点上有４种重复数，Ｍ２９、Ｍ３４、Ｍ３３、Ｍ４３、ｍｓ５６位点上有２种重复数，其他ＶＮＴＲ位点均有１种重复数（详见表１３）。结果提示，河北菌株Ｍ２２位点的多态性明显，而其他几种多态性较低，其中２０个ＶＮＴＲ位点在河北菌株上比较稳定显现出无多态性。表１３６个ＶＮＴＲ位点重复数种类表ＶＮＴＲ位点名称重复数Ｍ２２２６２７２９３０Ｍ２９１２１３Ｍ３４６７Ｍ３３２１２２Ｍ４３５６ｍｓ５６８９２７ ｒ－、、ｌ、ｒｌ一＇私＾Ｋ＾＇服ｍ学研究心Ｖ．ｂＬｌ＝＾＾因分Ｔｓ中Ｈ疾病预防控制中、＼子ｌｊｌＫ＾又，誠！｜ｉＶＮＴＯ１？ｔ－＾－？ｍ＞ｒ．ｗ：Ｉｓｉ－？Ｉ＾１ｉｔｉ＊？ｉ．，ｎａｓｆｌｆｓｆｆｉ４８ｓｓｅＨ！ｉ３？＾４ｓ５？ａ？５ａ？ｓ？ｓｓ？ｓｓ？？ｅ４二？ｓ２３Ｂ５？１３ｓ？１５？＊４＆ｓ？—ａＪ？Ｂ＊４ｓｓ９４６９２ｆｌｓ８？１ａ＾６ａｓｓ９２—Ｅ：Ｅｇ４ｏｓ２ｓａ１３４４８ｓＢ９ａ８二２ｓ８？ａｉ５Ｓ：Ｊｓ５８１—＊？ｓ８＊ｓ４Ｓｓ３８ｓ４８ｓｓｏ６Ｂ３＾＝，＊３３ｓ＃４ｓ４６８ｓ２２ｅｓ．＊１—＊？ａ４Ｂ＊５Ｂ．ｅ．１３ｍ３４ｓＳ＜？ｉ８ｓ２２ｓ？？？ｓ＃＊ｓ８＃８＝ａ？．—？ｅ４４ｓＢｓ９？８＃１ｅ］？６ｓｓ．ａ３？Ｂ３４？ｓ４？９ｆｔ４：ＪｅＢａ１？？８ｓｓ？８ｓｓｆ２ａＥ－：３＊４ｓ？ａｓ３７４１？＃＃ｓ．５Ｂｓｓｅ２？ａａｍｓ．＇！４５＆？？？＊８＊．ｓｌ２ｉ？８ｒ！＞ａ？？：Ｍ６ａｇｉａｖ１？ｅ３；ｖ６？ｓ４ｓ４９９＆４ｅａｓ＊＃？２，ｌ２？Ｊｔ？４５ｓ＊？：？ｓＭｒｏ＃ａ？ｅ！？ｓ５６？？ｓｒ４ｓＴ４一ａ７？６＇８８ｓ５ｓｆｔｓ？５２２ｅｓ＃ｔｚ？ＥＢ４ｃ，？ａａ１２ｆｌ？３５？４４５ｓｆｔｓｅｓｗｒｅ？１２？？ｏｒ，８＃＊ｓＴｓｓ８ＢＢ４？ａ８ａａ画？？７１＊８Ｊ？Ｂ４４ｓ？ＢＢｆｔ４？８ｚ２ｅ？ａ２．＿ｓ＊６３Ｂ４？？ｏ２．１ｓ＝８ｓＴ５ｓＳ８？８２ｅ？ａａＢ？ａ４８ＲＢ４＃ｌｉ？ｆ＇８ａ１ｉ＊？３？ｆｔｔＭ？２，；ｌ（？６Ｊ？Ｂ？肩＊ｆｔ？？１．？，？ｌ！＾ｓ？ｓ？ｓ２ｔｉ＇；＃ｌｓＢ？ｓ４＊（ｋ６？４ｒ？ｉａ８？８８ｓ？ｌ？—ｌＩｌ．－ｌｔａｓ８？４？ａ１７６ａ１３ｏ８－３ｒ５＊６６ｆｔｓｚ＜ｉｏ３？Ｒ？ｓ６６＊ｓ１７＜８１ｅｓｐｓ８ｓｒ２ｌａ３１ｓｅ４４６ｎ６ｅｓｓｓ８６８＊ｅ９？Ｊ１７？３Ｂ８１３Ｅｌ＊ｌ８４ａ４ｓ？ｓ７？＂ａ１３＃＊９ｅＳｓ？９ｓａｓ９Ｂ４ａｓａ７？３ｌ）１３Ｅ：Ｉ＃Ｊ？４ｓｓＢａ＊？ｓ？１ｏ：：：１？ｅ３？４４ｓ９ａ６ａ４ｓ２１？３ｅ！；Ｉ？ｎｅｓ７ａ！ｆｌｓ＊４ａ４ｓ５ｓＳｓ＊？—９２１７ｔ３８？ｌ１３ｒａ＊；ｓＢ？＊ｌ？ｓｆ？３ｓａｉＢ＃．ＪｓＢ４４ｆｔｆｔＢｓ（！＇ｌ．＾Ｅ？ｏ？ｎ？？－ｔＢ３ｆｔａｓ４＊Ｂ１？３ａ１．ｓＢｓ．ｆｔ３ｌｌＩｉ－＊＊ＢＢａ９？！ｆｔ＊４ｓ４８ｓ８５ｆｔ＊２１ｆｓｏｐｐｓ６Ｂ＆？９３１７ａｓｆ＝０ｆｔ３ｂ？？Ｂ４＃？ｆ？ｌｆｔａ０Ｊｆｔｅ４４ｓ？ｓ？Ｂ１Ｔａｅ１３ｌｌ＊ａｓ８ｅ＊ａ？ｉ：＾ｌ９ｅｓｅ４４ｓｓｓｓ８４ａａｓ２１７ｅＪａ６３３ａ７８ｉｅｅＪ５ｅ４ａ４９９６ｓ８４６？９ｓ？Ｊｅｐｌ－，＾ｉｓ４＜１．ｅ１ｅ３？？Ｒｓ？ｓ＃ｓ４ｅ＃６２＿Ｓｓ３Ｊ？４４ｓ＊？？６７Ｓ？ｅ：！ｉｏ６ｆｔａ５ｓ６ｓｓ？ａ７ｓ＾ｉＥＥｉ６Ｊ８ｅ４Ｔ９ｓ６８９４＊？６２１＃Ｊ８＃ｓｌａ．－ＩｎＢ４４９？９４ｅ＾ｓ２１ａ１ａｏｌ３！ｉｓ６３９＃，ｉｓ１？ｅ？ｎ４ｒｓ？ｓｒＪｔＪｅｓ６９？ａ２１＿？ｏｓ．Ｅ＊ｎｓ＂４ｓ４ｓｓ＃？８４６１．１ｉｅ６？３？ｌｓ６Ｊ．ｔＩｌ９Ｊ？ｅ４４？８＊？１．；ｉｅｓ？９ｓｅａｉ（ｌ１？Ｂ？ａＩｉ４８＞４１，Ｓ？１ｉｉ９？３＊＊４ｓ５ｓ？ｓ８ｓ８ａ？Ｂｓｓｌｉｅｌｅ？４＊＞９８ｓｓ４６？ｓ７Ｊａ１３？？ａｓａ０Ｂｅ３６ｅ？４９８ａ４？？２１７Ｊａｅｌ３ｉａｓ８ｅ？ＩＯｅ＊？Ｂ４４ｅ—？８２１．？ｌ＜８ｅ１ｓｓＥ：ｉ４ａｓａ６Ｓ８＿＜Ｉ？６ｖ１ｓ８４４ｓ？ｓＢｓ４？？６２１７ｓ：ｌｅ？ｏｅＪ６８？ｊ４４０＿ｆｔ＜７？＊？＊ｕＨ５？ｓ６ｓ２ｓ；．６ｅ＜ｓ４４ａｆｔ．８１ｏｅ３６＜ｔ６？ｅ０；ａｌ＊３ｌ．ｒ１ｏｅ３＆Ｂ？ａ４ｓ８５５ａ？６６０２１ａＪ？６３ａａｓｌｅｏｅ３Ｏｅ４４ｓａ？ｓ９４？ａＢ７ｏＪｌｎｉＥＪｏ６３Ｂ４ｓ４５９Ｂｓｓ？Ｂ？Ｓｓ７ａ？？Ｂ：ｓ＾８ｓ．？６３＆８４４ｓ９５ｓ４６６５？．ｅｓ？１９ｚ＊３？？４．４３Ｔ＾＊？ｒ？？ｓｓ９６ｏｓ２１＃３８Ｂｔ３．４：ｌ．（２＃＊＆８４Ｔｓｓ？ｓ８４ｆｅ？？２？ｓ？Ｂｉ＊？３ｅ＊４ｓ？９８８１Ｔ９ｓｌｓ＊６＃８２＊３？？３－４；？７？＊Ｊ６８－：ｒ５５ｓ５ｓ４＃＊Ｂ？ＪＡＢ１３３４ｓ４５ｓ？？５Ｂ２１ｒ？ｓｌ＃１３ｓ？？ｓ８８ｓ９ｓｓ？６＃ＤＩ？？３ｂ８＜ａ４６ｓｓＳ１，１？６ｌｓ３Ｅ：！－３６４ｓ＊＊８＊ｓｓ６５？ｓ８２ｌ，ｅｓａＢ１３ｒ６Ｊ．＊ｅｓ６ｓ？＾４６ｔ？＞５？；．ｓ１３ｅ？＃ｓ９ＡＢＢＥ＊ｒ＞ｓ８７＜ｒＳＳ８ｆｔ？ｓ４ｓ？ｓｓ４？８９２１？Ｊ．８１３？６３６ｅ？ｓ４ｓ５６ｓｏ？＊６８２１７＊３？ａ１３；ｌ－４３ｅ，？＊＞＃￥４５５９９ａ４？ｓ２１ｒ＊３＝＊ｓ＾？ｓ？？４ｓｓ４ｅｌ７３＊１？５－ｓ？ｓ？＊８２６ｓ３ｒｍｓ＊３８ｅ？ｓ４ｓ？ｓｓ４ｒｆｔｓ＃ｅｓ９５＊３Ｂ；＊？３ｓＢ４；４８＊Ｏ？ｓ＊６８８２ｌ７３Ｂｅ８２．ｍ＊；４４２１ｒｅｓｅ：？＃３９８Ｂ＊Ｓｓ９＊＞８３！ａ：＾ｆｔｓＢＢ４ｙ２ｌＪ：９８Ｊ８＜ｓ４Ｂ６？５６Ｊ８８？ｉ６４？？Ｊｅｌ８４ａＪｒｌｒｅ３Ｂ２ｒ？６Ｓｓ？ｓ６，？３６８？４ｓｓ４ａ？１ｒ？ａｌ＊＾６Ｓｔｅｅｓ．３ｓ．Ｂ４１§３ｅ＊４ｔｒ？Ｂｌｓ？？９ｓ６６９６０ｓ？ｓ．Ｊ３６９＊ｓ４ｓ４？？＆ＳＳ９ｅ９５ｚ１７６？６ｌ？３？３Ｂ＊ｒ．４４１ＴＢ＊９５ＳＢ５ｓ？？ａ２？Ｊ８１３９ｌ３＃ｅ＊ＳＳ４ｏ１７ａ１ｅ＃４５ｓｅ？２ｅＳＢ３？ｆ．＊？３ｏａ＊Ｊ＃５ＢＢ９９４ｅｆｌｓ２ｔＴ１ｌ６３？８３；３ｓ？？？ｓＳＳ５５４６５２１７ｅＪａ＊＊ｆ６ｃ！＃＊？３ｓ＜１４．ｓ８ｓ２ｌ７ｌ＊Ｂｔ３ｓ５ｓ４ｅ６＾３Ｂ＊２？６６？５４６ｅｓｚ？ｒ？ｌ＊ｌＳ＊？？ｓｅＪ；３＊４０ａｆＪ＊ｅ？ｅａ６８６４６８ｓ；ｅＪｌ？！．？—ｓ５４８ｓｌ／ｆｌｅ＊ｓ＜ｉｓ６６＆？２＃Ｊ＃ｓｓｓ．＊５－ｗ＊３６ｅ４４６．ｒ４０８＞７？？ｔｌｓ＆６ｅ３ｉ！？？４１＊ｅ＊－ｓ４６６６６＆８８ｓ７７８１６Ｊ０３；！３４？；７＃３８？ａｓ？ｓ４ａａＲ＆ｆｔ４？８ｅ！０ｅＪ？？４ａ＃ｅ６ｓ４？６ｓａＪｓ＊＾＊Ｂｅ００Ｊ？Ｂ？ｓ４Ｂｓ４？ｓｓ２？ａ＊ＪＢａ１８８ｓ３ｌ９ＢＩ＿Ｂ４ｓ４ＢＢｓ０ｓ４ｅｓ８２３ｓａＪＢａ１ｓ？ｅＢｓ８ＡＪ？＜＊ｓｓ、２－５＆ｏ４＃８Ｗａ？－４＊￣？４Ｔ？５６ｓ＊；８９ｓ８？？９Ｒｓｉ？ｅ３ｉ？８！４ｓＭ６＃？Ｔｓ５ｆｔ＊９４？ｏ＆ａＪａｏＯｕａｅ－ｓ？－４５ｓｓ４＃？ｓ？？－ａＢ１ｉｓｓ５Ｍ，￣４４６ｉ９ｅ？Ｂｓｓｓｓ＊？ｓ１ｓｅ０ｓｓ？＊ｅＪ？ｅ＊＞６！Ｂ＊ｓ４５ｓ６ｓ＊ｓｆｌａａ１ｉ６？Ｍ？Ｂ３４Ｍ，？３＊＊４５ｆｌ６ａ＊？．？ｓｓ８ｓｓａ；ａ＃１ＪＢｅ＊．？？＊ａｓ６Ｊ８＞ｌ４９９４６？＃Ｍ７＿８２８？ａ＜ａ４ｓ，；ｅ＆ｓｅ４ｓ？，Ｓ８！ｆｃ？Ｗｅｏａ？４４ｓｓｆｔ６ｆｅ８ａ４＜６９Ｗ？Ｊ？ｃ１２＃Ｂ４４ｓ５４，ｌｓｒａＪａｅ？＆８８ｓ６ｓａ？ｅ？８４ａ？４ｓｓｓｓ４？ａ＞Ｊ？ＢＭ＊Ｍ０．ｏＨ？ｓ６ｓ４＊ｓｓ，？？６ｓ．５ｌ？．６ｆｌａＢｅ９．＊？ａ＊４．ｓ６ａ？Ｂ？（９？？２８．８ｆｔ．ｉＪｏｎ４４ｌ６ａｌ３８ｓ＾＆６＆６？６ｚ８８６ｓＭ？ｓ＜６＆－ｓ６＊ｅＢ１Ｂ８ｓｅｓｏ１２＊Ｂ？ｓ４ａ４ｓＢＳｔ＆：ｓ？ａＢ：＊６ＢｗＢ１２：６ａａＢ４ａ４ｓ５６６ａ？，ｅｓ２２ａｌｔｓ１２？？ｅ６？？４９ｓ６ｓ６４？，？＊６ａ？ｏ１２ｆｉ＊ｅ＃８８４ｓ４９ｓＳｓ６＊ｅ．＃Ｍ？６ｓ１：？ｅ＆？？４９？Ｂｓｅ？？ａ？ａ＃１＜＊？Ｊｓｏｅ？？＊４９９９５ｏ４６ｔ６Ｍ＊＞；ｃ？３８Ｂ４ａ４ｓ４８ｒｇ？＊Ｂ８９ｓ６ｓ６？ａｚａ３８１２＃６０＊４８？ｓ５６ｓ４ＢｅＭｒ？Ｊａｓｓｓ？ｇＢ＊４ｓ４６８ｅ６ｓｓＳｆ８６８Ｍｒ３ａ２：；ａ０，４？？ｆｔ？４ｓ４？＊６ｆｌ６ｅｇｒ．ｌＪ．ｅ＊Ｋｒ？？■？ｓ１Ｊ－，／８ｅ＊Ｂ４＜ｓ；４Ｋ３ｓ６８－６＾？ａ６３ａｌ２ｌｅｅｅ４４６２９ｓＳｉ８４０２ｒ；Ｊａａ？２？３８８．一一－－－Ｖｆｃｔｂ１１一ｌ．Ａ＋０／Ｉ耳ｌｙ＿＇／Ｔ＾－ｊＫＬ－／图ｏ｜禾７Ａ—土＾＾ｒＩＩｓ＾畏－？，－ｊｒ＾Ａ－ｉＦｉＱｒＩｅ２Ｔｒｈｅｃ１ｓｉＧ８＾１１ｓＭｇｕ＿＾１ｏｘｄ０＜＾３１ｎｇＤｒ＾＾ｆ１１ｒｉｉｎｓ２８ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄四、讨论．一在地理分布上分析：康保县照阳河乡分离的菌株都属于个种群，集中与一３和５基因型，这说明ｆ定的地区集聚特性。而康保牧场分离的菌株则分布在多个基因型，无明显的地区集聚特性。在鼠疫流行时间上分析：根据聚类分析最小生成树分析，四次动一物疫情有明显的分型差别。１９７１年与１９７２年第次疫情分离的菌亲缘关系较近，９４年与９５年第二次疫情分离的菌菌亲缘关系较近。２００２年至２００５年分离的菌亲缘关系较近，其中２００５年分离菌株均属于５型与２００２年分离菌株相同，可认为２００５年的鼠疫是２００２年疫情的延续。２９ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研究第四部分河北鼠疫遗传特征和流行病学分析一、河北省鼠疫自然疫源地简介河北省鼠疫自然疫源地位于河北省北部，与内蒙古自治区化德县、、、白旗、太旗相毗邻（图４）。主要植被以小叶锦鸡儿养草针茅。、蒿类为主具有地势高、起伏缓和、低山丘陵交错等地形特点。该疫源地位于鄂尔多斯高原长爪沙鼠（Ｍｅｒｉｏｎｅｓｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）鼠疫自然疫源地和松辽平原达乌尔黄鼠（Ｓｐｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｄａｕｒｉｃｕｓ）鼠疫自然疫源地重叠地带，主要宿主动物为长爪沙鼠，次要宿主是达乌。尔黄鼠，两种宿主杂居疫源地面积１０００ｋｍ，包括３个乡镇、３７个一自然村。、个牧场＾／＇：ｊ．－＇＇Ａ爾寥图４河北省鼠疫自然疫源地理图３０ 屮国疾病预防控制中心硕士学位论文河北栉长爪沙鼠沏鼠疫阐基Ｍ分沏及流行病学研究二、河北省鼠疫四次动物鼠疫流行介绍一１９７１第次动物鼠疫流行：年在康保牧场发现自毙长爪沙鼠首次分离到鼠疫菌。此次疫情分离到鼠疫菌范围仅为康保牧场，检菌１９株，检出阳性材料的有：长爪沙鼠和达乌尔黄鼠。此外１９７３年４月２８日在康保牧场从自毙达乌尔黄鼠分离鼠疫菌１株，第二次动物鼠疫流行：１９９４年首先在康保牧场从自毙长爪沙鼠分离到鼠疫菌。此次疫情分离到鼠疫菌范围扩大，康保牧场、康保县照阳河乡、康保县屯垦镇都有疫情。流行时间持续到１９９５年。检菌７０多达株。检出阳性材料的有：长爪沙鼠、达乌尔黄鼠、方形黄鼠蚤蒙冀亚种。第三次动物鼠疫流行：２００２年首先在康保牧场从巢蚤：秃病蚤蒙冀亚种（长爪沙鼠）分离到鼠疫菌。此次疫情分离到鼠疫菌范围为。２６。康保牧场和康保县照阳河乡检菌株检出阳性材料的有：长爪沙鼠、黑线毛足鼠、黑线仓鼠、秃病蚤蒙冀亚种、宽圆纤圣。２００３年５月２６日在康保牧场从自毙长爪沙鼠分离鼠疫菌２株２００５第四次动物鼠疫流行：年首先在康保县照阳河乡从自毙长爪沙鼠分离到鼠疫菌。此次疫情分离到鼠疫菌范围为康保县照阳河乡１３和康保牧场。检菌株。检出阳性材料的有：长爪沙鼠、秃病蚤蒙冀亚种、方形黄鼠蚤蒙古亚种。三、河北省鼠疫遗传特征及流行病学特征分析１、河北省康保鼠疫自然疫源地与毗邻地区动物间鼠疫的发生相互影响。建国到１９７０年，康保县境内没有动物间鼠疫的发生，所以认为３１ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄该地区不存在鼠疫自然疫源地一，而康保县发生鼠间鼠疫的前年（即１９７０年）靠近康保县的内蒙古正镶白旗、化德县己发生鼠间鼠疫流行一，直延续到１９７２年。康保县发生的动物间鼠疫流行很可能就是内蒙古周边迀入的。１９７１年１２月首次从康保牧场分离出鼠疫菌。为２６［］鄂尔多斯高原型。证实了康保县为鼠疫疫源地。，毒力中等２、。有突发性；河北省鼠疫流行病学特征；疫源地面积扩大疫情间隔时间缩短；疫源地向人员集聚区扩散危害性加大。４］２５［［］３。、鼠疫菌基因分型与生化遗传特性关系董国润等和刘合智等一对几次分离的鼠疫菌进行了生化鉴定，生化特性的研究结果基本致，其生态型均属于鄂尔多斯高原型。ＤＦＲ分型，生物型为沙鼠型鼠疫菌结果显示，河北菌株均属于Ｇｅｎｏｍｏｖａｒｌｌ基因型；ＣＲＩＳＰＲ分型结果显一示，河北鼠疫在第次动物鼠疫分离的菌株，在Ｙｐ３的Ｃ１片段上存在９株Ｙｐ３Ｃ１，差异，有菌缺少的片段这是新的发现，另外９株没缺少Ｙｐ３ＣｌＣｂ２的片段，属于型。但是在以后几次鼠疫流行分离的菌株均属于Ｃｂ２型。以上两种分型表明引起河北省鼠疫疫源地鼠间鼠疫流行的菌一致的鼠疫菌株是遗传种群比较，即使时间跨度历时数十年，经历４次动物鼠疫流行，鼠疫菌并没有产生生化表型和遗传种群的变化，说明这四次流行的鼠疫菌株遗传关系近源，这可能与其地理生态环境分布、宿主长爪沙鼠和主要媒介秃病圣构成完整的生物群落密切相关。４、ＭＬＶＡ分型显示出的河北鼠疫菌的遗传特征分析。ＭＬＶＡ主要应用。于鼠疫疫情爆发溯源和鼠疫菌种群关系分析本实验结果显示：河北菌株种群有明显时间集聚性，根据聚类分析最小生成树分析，四次动３２ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄物疫情有明显的分型区别。在鼠疫流行时间上分析：根据聚类分析最小生成树分析，四次动物疫情有明显的分型差别。１９７１年与１９７２年一９４９５二第次疫情分离的菌亲缘关系较近，年与年第次疫情分离的菌菌亲缘关系较近。２００２年至２００５年分离的菌亲缘关系较近，其０２２００５中２００５年分离菌株均属于５型与２０年分离菌株相同，可认为年的鼠疫是２００２年疫情的延续。３３ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄小结１、ＤＦＲ分型结果显示，河北菌株均属于Ｇｅｎｏｍｏｖａｒｌｌ基因型２一、ＣＲＩＳＰＲ分型结果显示，河北鼠疫在第次动物鼠疫分离的菌株，在Ｙｐ３的Ｃ１片段上存在差异，有９株菌缺少Ｙｐ３的Ｃ１片段，这是新的发现，另外其他菌株没缺少Ｙｐ３的Ｃ１片段，属于Ｃｂ２型。３、ＭＬＶＡ分型显示，河北鼠疫菌分为２群，５个基因型。近年来我国多数鼠疫自然疫源地的鼠间疫情呈活跃态势，沙鼠疫源地则持续活跃，鼠间疫情不断发生，而河北省鼠疫自然疫源地又地处沙鼠疫源地边缘；河北省鼠疫自然疫源地是距离北京最近的鼠疫疫源地，距离约为２００多公里，现呈现出交通发达、人群密集，人流量大的特点，鉴于鼠疫的活跃趋势、严重危害性以及河北省鼠疫自然疫源地特殊地理位置，对该疫源地鼠疫菌的基因遗传特征进行深入研宄。分析，具有十分重要的意义本研究通过河北鼠疫菌基因分型，详细的了解河北鼠疫菌的遗传信息和遗传特征，建立了鼠疫菌基因数据库，这不仅为今后河北省鼠疫防控、疫情调查、疫情爆发溯源和应急处理提供重要依据。３４ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄六、参考文献ＡｃｈｔｍａｎＭ．ｔｉｓ［１］，ＺｕｒｔｈＫ，ＭｏｒｅｌｌｉＧｅｔａｌＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓ，ｔｈｅｃａｕｓｅｏｆＰｌａｇｕｅ，ｉｓａｒｅｃｅｎｔｌｙｅｍｅｒｇｅｄｃｌｏｎｅｏｆＹｅｒｓｉｎｉａｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９９，９６：１４０４３？［２］纪树立．鼠疫［Ｍ］．北京：人民卫生出版社１９８８．６１６６．，［３］王玉．．．梅，白万翔鼠疫防治与应急处理指南中国社会出版社［４］董国润，杜国义，等．河北省康保县鼠间鼠疫流行特点的分析，－．中国媒介生物学及控制杂志２００９：２４９２５０，２０（３）５周树武．．［］，杨进业鼠疫耶尔森氏菌基因分析的研究进展中国热０７３４４９－，７（）．带医学，２０：４５１６，，魏建春．［］海荣俞东征，等中国鼠疫耶尔森菌的分子生物学特５０９－．．中华流行病学杂志：５１３征与遗传学意义［Ｊ］，２００４，２５（６）［７］李艳君．鼠疫耶尔森氏菌基因组多态性研宄及快速鉴定溯源系统的建立［Ｄ］．中国人民解放军军事医学科学院博士论文，２００９．［８］张晓媛．中国鼠疫耶尔森菌多位点可变数目串联重复序列分析［Ｄ］．中国疾病预防控制中心硕士论文．２００８．［９］ＣｕｉＹＪ，ＬｉＹＪ，Ｇｏｒｇｅ０，ｅｔａｌ．ＩｎｓｉｇｈｔｉｎｔｏｍｉｃｒｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓｂｙｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｌｉｎｄｒｏｉ．３．ｓｈｏｒｔａｃｒｅｐｅａｔｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳ０ｎｅ．２００８（７）２６５２ｐｍ：ｅ［１０］ＰｏｕｒｃｅｌＣ，ＳａｌｖｉｇｎｏｌＧ，ＶｅｒｇｎａｕｄＧ．ＣＲＩＳＰＲｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓａｃｑｕｉｒｅｎｅｗｒｅｐｅａｔｓｂｙｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｕｐｔａｋｅｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＤＮＡ，ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅａｄｄｉｔｉｏｎａｌｔｏｏｌｓ３５ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄ｆｏｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｓｔｕｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，１５１（Ｐｔ３）：６５３－６６３．［１１］夏连续，海荣，魏建春，等．鼠疫耶尔森氏菌脉冲场凝胶电泳型－分析．中国地方病学防治杂志．２００３１８（６）：３２１３２３［Ｊ］，［１２］李丽娜．鼠疫耶尔耶尔森菌ＩＳ１００插入位点在基因分型中的应用研究．中国疾病预防控制中心传染病预防控制所硕士论文．２００５．［１３］吴汀晨．鼠疫耶尔耶尔森菌ＩＳ２８５插入位点在基因分型中的应用研究．中国疾病预防控制中心传染病预防控制所硕士论文．２００５．［１４］ＺｈｏｕＤＳ，ＨａｎＹＰ，ＳｏｎｇＹＪ，ｅｔａｌ．ＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｏｍｅｄｙｎａｍｉｃｓｉｎＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｉｎｔｏｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｏｍｅｍｉｃｒｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｎｉｃｈｅａｄａｐｔａｔｉｏｎ．Ｍｅｄ－ＪＣｈｉｎＰＬＡ，２００４，２９（３）：２０４２１０．［１５］ＤａｉＥＨ，ＴｏｎｇＺＺ，ＷａｎｇＸＹ，ｅｔａｌ．ＡｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅＨｙｂｒ￣ｉｄｄｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｏｍｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｍｏｎｇｓｔｒａｉｎｓｏｆＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ．ＣｈｉｎＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，２００５－，２５（３）：１７９１８２．［１６］ＬｉＹｊ，ＤａｉＥＨ，ＣｕｉＹｅｔａｌ．ＤｉｆｆｅｒｅｎｔＲｅｇｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓＦｏｒｊ，ＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓＩｓｏｌａｔｅｓｆｏｒｍＣｈｉｎａ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯＮＥ．，２００８，５（３）：ｅ２１６６［１７杨晓艳．］，魏柏青，靳娟，等中国鼠疫耶尔森菌差异片段分型及３６ 屮Ｗ疾ｆｅｊ预防控制屮心硕丨：９位论文河北ｆｔ长爪沙鼠型鼠疫閑坫Ｗ分艰及流行病学研宄０４－，３５８３其地理分布特征．中华流行病学杂志．２１（，９４９４８）［１８］刘合智，刘满福，李玉贵，等．河北省鼠疫自然疫源地内染疫动物及染疫媒介的研宄．医学动物防制，２００４．２０（１２）．［１９］ＫｕｎｉｎＶ，ＳｏｒｅｋＲ，ＨｕｇｅｎｈｏｌｔｚＰ．ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｉｎＣＲＩＳＰＲｒｅｐｅａｔｓｅｎｏｍｅ［Ｊ］．ＧＢｉｏｌ２００７，８（４：Ｒ６１．，）［２０］ＧｒｉｓｓａＩ，ＶｅｒｇｎａｕｄＧ，ＰｏｕｒｃｅｌＣ．ＴｈｅＣＲＩＳＰＲｄｂｄａｔａｂａｓｅａｎｄｔｏｏｌｓｔｏｄｉｓｐｌａｙＣＲＩＳＰＲｓａｎｄｔｏｇｅｎｅｒａｔｅｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓｏｆｓｐａｃｅｒｓａｎｄｒｅｐｅａｔｓ［Ｊ］＿ＢＭＣＢｉｏｉｎｆ，２００７，８（１）：１７２．２－［１］ＭｏｊｉｃａＦＪ，ＤｉｅｚＶｉｌｌａｓｅｎｏｒＣ，ＳｏｒｉａＥ，ｅｔａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ－－ａｔｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆａｆａｍｉｌｙｏｆｒｅｇｕｌａｒｌｙｓｐａｃｅｄｒｅｐｅｉｎ－ｅｔｈｅｇｅｎｏｍｅｓｏｆＡｒｃｈａｅａ，Ｂａｃｔｒｉａａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｍｏｌ［Ｊ］－－Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ２０００，３６（１）：２４４２４６．，［２２］ＹｕｊｕｎＣｕｉ，ＹａｎｊｕｎＬｉ，ＯｌｉｖｉｅｒＧｏｒｇｅ，ｅｔａｌ．ＩｎｓｉｇｈｔｉｎｔｏＭｉｃｒｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓｂｙＣｌｕｓｔｅｒｅｄＲｅｇｕｌａｒｌｙＩｎｔｅｒｓｐａｃｅｄＳｈｏｒｔＰａｌｉｎｄｒｏｍｉｃＲｅｐｅａｔｓ［Ｊ］．ＰｌｏｓＯｎｅＪｕｎｅ２００８，３（７）：ｅ２６５２［２３］ＰｏｕｒｃｅｌＣ，ＳａｌｖｉｇｎｏｌＧ，ＶｅｒｇｎａｕｄＧ．ＣＲＩＳＰＲｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓａｃｑｕｉｒｅｎｅｗｒｅｐｅａｔｓｂｙｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｕｐｔａｋｅｏｆｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＤＮＡ，ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅａｄｄｉｔｉｏｎａｌｔｏｏｌｓｆｏｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｓｔｕｄｉｅｓ［Ｊ］Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，１５１（Ｐｔ３）：６－５３６６３．３７ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄［２４］ＹａｎｊｕｎＬｉ，ＹｕｊｕｎＣｕｉ，ＢａｉｚｈｏｎｇＣｕｉ，ｅｔ．ａｌ．ＦｅａｔｕｒｅｓｍｏｆＶａｒｉａｂｌｅＮｕｍｂｅｒｏｆＴａｎｄｅｎｍＲｅｐｅａｔｓｉｎＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓａｎｄｔｈｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａＨｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇＳｃｈｅｍｅ．ＰｌｏｓＯｎｅＪｕｎｅ２０１３，８（６）：ｅ６６５６７２５刘合智张月枝史献明．河北省鼠疫菌株生化特性的研究［Ｊ］．［］，，，等２００５６４－１（）：０８３１０．中国媒介生物学及控制，，３［２６］杜国义．河北省鄂尔多斯高原型鼠疫菌毒力，史献明，刘合智，等Ｊ－试验［］．地方病通报２００７２２（２：１４１５．，，）３８ 屮Ｗ疾病预防控制屮心硕１：７位论文河北竹Ｋ爪沙鼠型鼠疫调站Ｗ分艰及流行病学研宄发表文章河北省鼠疫菌株差异片段基因分型及其流行病学特征周松＇刘合智１王海峰１杨顺林１梁莹２张懿晖１白雪薇＇胡乐乐１牛艳芬１杨晓燕１王俊香１李振军２李伟＝史献明１．河北张家口０７５０００（１河北省鼠疫防治所；２中国疾控中心传染病防治所，北京１０２２００），摘要：目的对分离自河北省自然疫源地的１１５株鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）株进行基因分型，研究其基因型分布及流行特征。方法根据鼠疫菌基因组２３个差异区段（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｇｉｏｎｓ，ＤＦＲ）设计引物，对１１５株鼠疫菌进行实验研宄，应用ＰＣＲ技术扩增鼠目的区段并做普通琼脂糖凝胶电泳，运用ＢｉｏＮｕｍｅｆｉｃｓ５．０进行聚类分析。结果在河北省鼠疫疫源地分离到的１１５株鼠疫菌均属于１个基因型，即Ｇ一２００５ｅｎｏｍｏｖａｒｌｌ型。最近次动物鼠疫流行（年）的生态型仍是鄂尔多斯高原型生态型。结论河北省分离到的１１５株鼠疫菌基因型为Ｇｅｎｏｍｏｖａｒｌｌ型。关键词鼠疫耶尔森菌；基因分型；差异区段；流行特征ＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇｏｆＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｇｉｏｎｓａｎｄｉｔｓｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｉｎＨｅｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ＇＇ＺＨＯＵ－￣￣￣Ｓｏｎｇ，ＬＩＵＨｅｚｈｉ，ＷＡＮＧＨａｉｆｅｎｇ，ＹＡＮＧＳｈｕｎｌｉｎ，ＬＩＡＮＧＹｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＹｉｈｕｉ，１ＢＡ－￣－￣ｕｎ－－ＩＸｕｅｉＨＵＬｅｌｅＮＩＵａｎｆｅｎＹＡＮＧＸｉａｎＷＡＮＧＺｈｗｃｆｆＶｆａｏｙ？ＪｘｉａｎｇｆＬＩｅｎｇｊｕｎ？ＪＬＩＷｅｉＨＩＸｉａｎ－ｉ７Ｓｍｎｇ－１ＡｎｔｉｐｌａｇｕｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｚｈａｎｇｊｉａｋｏｕ０７５０００Ｈｅｂｅｉ，ＰｒｏｖｉｎｃｅＣｈｉｎａ２ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＣｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌ，；ａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎＣｈｉｎｅｓｅＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｉａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ｓｅ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｇｅｎｏｔｙｐｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓａｎｄｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆ１１５ｓｔｒａｉｎｓｆｒｏｍｐｌａｇｕｅｎａｔｕｒａｌｆｏｃｉｏｆｈｅｂｅｉｐｒｏｖｉｎｃｅＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ．ＭｅｍｏｄｓＰｒｉｍｅｒｐａｉｒｓｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｈｅ２３ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｇｉｏｎｓ（ＤＦＲｓ）ｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄｆｒｏｍｍｌｌ５Ｙ．ｐｅｓｔｉｓｓｔｒａｉｎｓｉｎＨｅｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ．ＥａｃｈｐａｉｒｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｂｙｔｉｌｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎａｎｄｒｏｕｔｉｎｅＡＧＥ，３９ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄ａｎｄｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｕｓｉｎｇＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ〇ＲｅｓｕｌｔｓＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓｉｎＨｅｂｅｉｐｒｏｖｉｎｃｅｃｏｕｌｄｂｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｏｎｅｇｅｎｏｔｙｐｅ：Ｇｅｎｏｍｏｖａｒｌｌ。Ａｒｅｃｅｎｔａｎｉｍａｌｐｌａｇｕｅｏｆｔｈｅｅｃｏｔｙｐｅ（２００５ｉｓｓｔｉｌｌｔｈｅｏｒｄｏｓｌａｔｅａｕｅｃｏｔｅ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＩｎｔｈｅ）ｐｙｐｓｔｒａｉｎｓｏｆＹ．ｐｅｓｔｓｆｒｏｍＨｅｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｅ，ｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃｔｙｐｅｓｉｎｔｈｅｓｔｒａｉｎｓｏｆＹ．ｐｅｓｔｓａｒｅｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｇｅｎｏｍｏｖａｒｌｌ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ；Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ；ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｇｉｏｎｓＥ；ｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ鼠疫是自然疫源性疾病。河北省鼠疫自然疫源地和北京Ｂｉｔ邻，１９７１［１］。年被确认，属于内蒙古高原长爪沙鼠鼠疫疫源地２０世纪７０年代至今，共发生４次动物间鼠疫，并从疫源地中陆续分离到１００多株鼠２［］疫菌株。鼠疫耶尔森菌（以下简称鼠疫菌）在环境适应性进化过程中３［］会发生变异，这种变异可以表现于鼠疫菌遗传物质的变化。差异片ｔｒｅ一段（ｄｉｆｆｅｒｅｎｇｉｏｎ，ＤＦＲ）指在些菌株基因组中存在，而在另外４＇５］［一些菌株的基因组中缺失的基因区，细菌基因组差异区段（ＤＦＲ）［６］的缺失和获得反映了鼠疫菌在自然界适应性演化。本实验分析分离自河北省的１１５株鼠疫菌ＤＦＫ，旨在探究鼠疫菌在河北省鼠疫疫源地的遗传变异，为河北省鼠疫防治、疫情监测和应急处理提供依据，为鼠疫疫情爆发时菌株溯源提供资料。１材购方法１．１菌株来源一—１１５株鼠疫菌（详细信息见表）均分离于１９７１２００５年河北省鼠疫疫源地，对应于自疫源地发现以来河北省４次动物鼠疫疫情，菌株来源于河北省鼠疫防治所菌库。４０ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄表１实验用菌株信息分离地点分离年代分离株数－河北省康保县１９７１１９７２１８－河北省康保县１９９４１９９５６５－２００河北省康保县２００２３２６河北省康保县２００５６１．２生物学表型鉴定２１１＇１］［参照文献。１．３ＤＮＡ制备、引物设计培养活化冻干鼠疫菌株，按ＤＮＡ提取试剂盒（德国ＱＩＡＧＥＮ公司）提°［３＇７］－取鼠疫菌ＤＮＡ，提取液２０Ｃ保存。２３对引物设计参照文献进行。１．４ＰＣＲ反应体系及扩增条件．①反应体系．０ＵＬ，５ｕＬ，上：总体积２５其中混合液１２下游引°１１．〇１＾．．：〇物各１，模板１〇１１，补水至２５〇１１？０？反应条件９５；＠°Ｃ°。３ｍｉｎ：９４３０Ｓｅｃ，６０Ｃ（ＤＦＲ１８和ＤＦＲ１９为５４〇３０Ｓｅｃ，°°７２Ｃ１ｍｉｎ，３０个循环；７２Ｃ５ｍｉｎ。１ＣＲ．５Ｐ产物检测．％取ＰＣＲ产物３ｕＬ，使用１５的普通琼脂糖凝胶电泳（６Ｖ／ｃｍ、５０ｍｉｎ），用凝胶成像仪观察分析。１．６聚类分析ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ５．０，采用非加权组平均法ＵＰＧＭＡ）应用软件（聚类分析，对数据进行聚类分析。４１ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研究２结果２．１生态生物分型和ＤＦＲ分型结果。１１５株河北鼠疫菌ＤＦＲ分型分为１个型，都属于Ｇｅｎｏｍｏｖａｒｌｌ，具体ＤＦＲ结果见表２。生物分型属中世纪型。生态分型属于鄂尔多斯高原型生态型。表２ＤＦＲ试验结果菌ＤＦＲＰＭ基因型株Ｉ２５６ｂＴＢ？１０ｉ：１３１＜ｌｉ１４ＩＳｌ？ａＳ３４ＰＳＴ数Ｇｅｎｏｍｏｖａｒ１１５０１１１１００１１１１１０１０００１１１１１０１１１“”“”－１－２３ＤＦＲ１ＤＦＲ２３１表示基因组中存在该ＤＦＲ０注：表头中代表位点，；表示该ＤＦＲ在基因组中缺失。２．２河北省鼠疫其流行病学特征历史上河北共发生４次鼠间鼠疫流行，四次动物鼠疫疫点对应结果见表３。表３鼠疫菌分型信息表动物疫分离年分离株分离地点生态型生物型基因型情代数河北省康保鄂尔多斯高原型生态中世纪Ｇｅｎｏｍｏｖａｒｌ第一次县１９７１２型型１第一次河北省康保ｅｎｏｍｏｖａｒ１９７２１６鄂尔多斯高原型生态中世纪Ｇｌ县型型１ｅｎｏｍｏｖａｒ河北省康保鄂尔多斯高原型生态中世纪Ｇｌ第二次１９９４５０县型型１第二次１９９５１５河北省康保鄂尔多斯高原型生态中世纪Ｇｅｎｏｍｏｖａｒｌ４２ 中Ｍ疾病预防控制Ｉ心硕丨：学位论文河北Ｋ爪沙鼠型鼠疫蔺娃Ｗ分型及流行病学研宄县型型１河北竹成保鄂尔多斯＾原沏中纪Ｇｅｎｏｍｏｖａｒｌ．态中叶第三次县２００２２４型型１第三次河北省康保２００３２鄂尔多斯高原型生态中世纪ＧｅｎｏｍｏｖａｒｌＬＬ彻甩１河北省康保鄂尔多斯高原型生态中世纪ＧＯＴｏｍｏｖａｒｌ第四次２００５６县型型１３讨论河北省鼠疫自然疫源地位于河北省北部，与内蒙古、山西接壤，属于荒漠草原地带。该疫源地处于内蒙古高原长爪沙鼠（Ｍｅｒｉｏｎｅｓｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ）鼠疫自然疫源地和松辽平原达乌尔黄鼠（Ｓｐｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｄａｕｒｉｃｕｓ）鼠疫自然疫源地重叠地带，主要宿主动８［］物为长爪沙鼠，次要宿主是达乌尔黄鼠，以长爪沙鼠为优势鼠种。１９７１年１２月２６日河北地方病所首次从河北省康保县长爪沙鼠体内分离出鼠疫耶尔森菌，证实了该鼠疫疫源地的存在。到目前为止，？？？１９７１１９７２年、１９９４１９９５年、２００２２００３年、２００５年共发生４次［２１［１１］１１２１鼠间鼠疫流行，期间分离鼠疫菌共１００多株。董国润和刘合智对前３次河北动物鼠疫分离到的菌株的生态型、生化特性研究结果表一明，前３次疫情分离到的鼠疫菌生化型基本致，都属于鄂尔多斯高［１３］［１４］原型生态型而生物型属沙鼠型鼠疫菌。鼠疫菌的生化特性取决本身的遗传特征、生物群落密切相关，是确定疫源地结，与地理分布［９］、。构性质的主要依据河北省鼠疫菌株在生物分型中属于中世纪型，１°：］均属于鄂尔多斯高原型的强毒鼠疫菌。该疫源地，毒力为中等毒力的鼠疫流行具有突发性、流行范围广和强度的特点。４次鼠间鼠疫流４３ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄２２年、８年和３年。行隔时间分别为，表现出越来越短的趋势鼠疫是自然疫源性疾病。鼠疫菌基因组差异区段ＤＦＲ）（分型反映鼠疫菌在自然界适应性的鼠疫菌种群关系。采用ＤＦＲ方法对河北省鼠疫菌株进行基因分型，河北鼠疫菌ＤＦＲ遗传特征基因型全部为Ｇｅｎｏｍｏｖａｒｌｌ基因型，这表明引起河北省鼠疫疫源地鼠间鼠疫流行的菌株是遗传种群比较稳定的鼠疫菌，即使时间跨度历时数十年，经历４次动物鼠疫流行，鼠疫菌并没有产生生化表型和ＤＦＲ遗传种群的变５１［］化，这与其地理生态环境分布、宿主长爪沙鼠和主要媒介秃病蚤构成完整的生物群落密切相关。ＤＦＲ基因分型结果与其生态型、生化型分型结果一致，表明Ｇｅｎｏｍｏｖａｒｌｌ基因组型的菌株能够很好地适应该疫源地的生态环境，在数次鼠间鼠疫流行中发展和延续鼠疫菌种，这在一定程度上也反应了鼠疫菌自然疫源性在自然界中的自然选择结果。近年来我国多数鼠疫自然疫源地的鼠间疫情呈活跃态势，沙鼠疫源地则持续活跃疫情不断发生，而河北省鼠疫自然疫源地又地，鼠间处沙鼠疫源地边缘；河北省鼠疫自然疫源地是距离北京最近的鼠疫疫源地，距离约为２００多公里，现呈现出交通发达、人群密集，人流量、大的特点，鉴于鼠疫的活跃趋势严重危害性以及河北省鼠疫自然疫源地特殊地理位置，对该疫源地鼠疫菌的基因遗传特征进行深入研宄分析，具有十分重要的意义。本研究通过ＤＦＲ基因分型详细的了解河北鼠疫菌的遗传信息，信息建立了鼠疫菌ＤＦＲ数据库，不仅为今后河北省鼠疫防控、疫情调查４４ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄和应急处理提供重要依据，而且可以与全国鼠疫菌研究彼此的亲缘关系和遗传进化特征提供数据。参考文献：［１］李玉贵．河北省康保鼠疫自然疫源地动物流，孔祥麵，李振海，等行病学调查分析［Ｊ］．中国媒介生物学及控制杂９９２－志１３（２）：９５９８．，，［２］．河北省康保县鼠间鼠疫流行特点的分析董国润，杜国义，等，２００９２０３－中国媒介生物学及控制杂志（）：２４９２５０．，［３］ＺｈｏｕＤＳ，ＨａｎＹＰ，ＳｏｎｇＹＪ，ｅｔａｌ．ＤＮＡｍｉｃｒｏａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｏｍｅｄｙｎａｍｉｃｓｉｎＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｉｎｔｏｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｏｍｅｍｉｃｒｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｎｉｃｈｅａｄａｐｔａｔｉｏｎ．ＭｅｄｈＰＬＡ—ＪＣｉｎ，２００４，２９（３）：２０４２１０．［４］ｈｏｕＤ，ＨａｎＹ，ＳｏｎｇＹ，ｅｔａｌ．ＤＮＡｍｉｅｒｏａｒｒａｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｏｍｅｄｙｎａｍｉｃｓｉｎＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ：ｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｏｍｅｍｉｃｒｏｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｎｉｃｈｅａｄａｐｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ，２００４，－１８６１５）：５１３８５１４６．（［５］周冬生，杨瑞馥．细菌基因组进化的分子策略［Ｊ］．微生物学杂－４志，２００４，２４（１）：３４１．６．［］李艳君鼠疫耶尔森氏菌基因组多态性研宄及快速鉴定溯源系统Ｄ．的建立］．中国人民解放军军事医学科学院博士论文，２００９［［７］戴二黑，童宗中，王效义，等．应用抑制削减杂交技术进行鼠疫４５ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄．中华微生物学和免疫学杂志耶尔森菌的比较基因组研究［Ｊ］，—２００５，２５３１７９１８２．（）：？．．８］纪树立．Ｍ］：人民卫生出版社６１６６．［鼠疫［北京，１９８８［９］纪树立，张海峻，刘云鹏，等．我国鼠疫菌分型及其生态学、流－．中国地方病学杂志５）２５７２６２．行病学意义［Ｊ］，１９８２，６（：１０．］杜国义，史献明［，刘合智，等河北省鄂尔多斯高原型鼠疫菌毒力－．地方病通报２００７２２（２）：１４１５．试验［Ｊ］，，［１１］董国润．１１５株鼠疫菌的生物学特性及流行病，王桂琴，白小英，等－学研宄．２００１１２（２）：１１２１１４．［Ｊ］中国媒介生物学及控制，，１２］．河北省鼠疫菌株生化特性的研究［Ｊ］．［刘合智，等，张月枝，史献明２００５－中国媒介生物学及控制１６（４）：３０８３１０．，，１３］纪树立张海峻．［，刘云鹏，等我国鼠疫菌分型及其生态学、流行病，学意义．鼠疫论文专刊１９８３．１１０．［Ｃ］，［１４］．鼠疫菌生物型的研宄［Ｃ］．鼠疫论文专刊１９８２．９１０．宋延富，５］刘合智，刘满福，李玉贵．河北省鼠疫自然疫源地内染疫动［１，等物及染疫媒介的研究．医学动物防制，２００４。２０（１２）．４６ 屮国疾病预防控制中心硕位论文河北柝长爪沙鼠型鼠疫阐莊因分型及流行病学研宄附录附表１实验用菌菌株背景资料菌株编号分离时间分离宿主分离地点生态型７－－１１１９７１１２２２长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型７－－３０１２１９７１１２长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型７２２－－１９７２０１０６长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型７２３－－１９７２０１０６长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型７２４－－１９７２０１０７长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型７２８－－１９７２０３１５长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型７２９－－１９７２０３２２长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型７２－－１０１９７２０３２４长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型７２－－１１１９７２０３２５长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－－０６７２１２１９７２０４长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型７２－－０７１３１９７２０４黑线仓鼠牧场鄂尔多斯高原型７２－－１４１９７２０４０９长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－－７２１５１９７２０４１６长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型７２－－１６１９７２０４２８长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型７２－－１７１９７２０５０２达乌尔黄鼠牧场鄂尔多斯高原型－０５－０２７２１９１９７２达乌尔黄鼠牧场鄂尔多斯高原型７２２０－－１９７２０５０４达乌尔黄鼠牧场鄂尔多斯高原型７２２－－１１９７２０５０５长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－９４０１１９９４－０２２长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型１９４０２－－１９９４１０２２长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４０３－－１９９４１０２２长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４０４－－２６１９９４１０长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４０５－－１９９４１０２６长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－９４０６９４－３１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型１９１０９４０７－１９９４１０３１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４０８－－１９９４１０３１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型４７ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄续表１菌株编号分离时间分离宿主分离地点生态型－０－３９４０９１９９４１１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯髙原型９４１０１９９４－１０－３１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－－９４１１１９９４１１０１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４－－１２１９９４１１０１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４－－１３１９９４１１０１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型１９９－－９４１４４１１０１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４－－０１５１９９４１１１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４－－１６１９９４１１０４长爪沙鼠照阳河鄂尔多斯高原型９４１－－１７９９４１０３０长爪沙鼠照阳河鄂尔多斯高原型９４１８１９９４－０－３１长爪沙鼠照阳河鄂尔多斯高原型１９４１－－１９９９４１１０１长爪沙鼠照阳河鄂尔多斯高原型１９９４－－９４２０１１０１长爪沙鼠照阳河鄂尔多斯高原型９４２－－１１９９４１１０３长爪沙鼠照阳河鄂尔多斯高原型９４２２－－１９９４１１０３长爪沙鼠照阳河鄂尔多斯高原型９４２３１９９４－－１１０３长爪沙鼠照阳河鄂尔多斯髙原型９４２４１９９４－－１１０３长爪沙鼠照阳河鄂尔多斯髙原型９４２５－－０４长爪沙鼠照阳河鄂尔多斯高原型１９９４１１９４２６９９４－－１１１０４长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－－９４２７１９９４１１０９长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－９４２８－１９９４１１０９长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４２９－－１９９４１１０９长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４３０－－１９９４１１０９长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－－９４３１１９９４１１０９长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４３２－－１９９４１１０９长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４３３－－１９９４１１０９长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４３４－－１９９４１１１０长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－９４３５１９９４－１１１０长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型４８ 中Ｍ疾病预防控制中心硕１文：孕位论河北省长爪沙鼠墦鼠疫菌躲Ｗ分型及流行病学研宄续表１菌株编号分离时间分离宿主分离地点生态型９４３６－－１９９４１１１０长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４３７－－１９９４１１１０长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４３８－－１９９４１１１９长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４２９９９４－卜１９长爪沙鼠１１牧场鄂尔多斯高原型９４４０－－１９９４１１１９长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４４－－１１９９４１１１１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４４２９９４－－１１１２０长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４４３－－１９９４１１２２方形黄鼠蚤蒙冀亚种牧场鄂尔多斯高原型９４４４－－１９９４１１２２长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４４５－－１９９４１１２３长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４４６９９４－１－１１２３长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４４７－－１９９４１１２５长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－－９４４８１９９４１１２５长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４４９９９４－－１１１１０长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９４５０－－１９９４１１２９长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９５０－－１１９９５０１０１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９５０５９９５－０－１０４１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９５０６－－１９９５０１０５长爪沙鼠屯垦鄂尔多斯高原型９５０７１９９５－０４－７１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９５０８９９５－０４－１１８长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９５０９－０４－１９９５２０达乌尔黄鼠牧场鄂尔多斯高原型９５－－１０１９９５０５０４长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－－９５１１１９９５０５０５长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９５－－１２１９９５０５０４长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－－９５１３１９９５０５０４长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９５－－１４１９９５０５０５长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型４９ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宂续表１菌株编号分离时间分离宿主分离地点生态型－－９５１５１９９５０５０７长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型９５１６－－１９９５０５０７长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－－９５１７１９９５０５０７长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－－９５１８２０９５１１０２长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型０２０２００２－－１１０２８秃病蚤蒙冀亚种牧场鄂尔多斯高原型２－－０２０２２００１１１５长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型０２０３２００２－－１１１６长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型０２０４２００２－－１１１６黑线毛足鼠牧场鄂尔多斯高原型０２０５２００２－１－６１１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－－０２０６２００２１１１７长爪沙鼠牧场鄂尔多斯髙原型０２０７００２－－２１１１７长爪沙鼠牧场鄂尔多斯髙原型０２０８２００２－－１１１７长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型０－－２０９２００２１１１７长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－０２１０２００２１１－１７长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型０２－－１１２００２１１１７长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－－０２１２２００２１１１７长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型０２－－１３２００２１１１７黑线仓鼠牧场鄂尔多斯高原型－－０２１４２００２１１１９长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型０２－－１５２００２１１２０长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型０２－－１６２００２１１２０长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－０２－１７２００２１１２３长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型０２－－１８２００２１１２３宽圆纤蚤牧场鄂尔多斯高原型－－０２１９２００２１１０４长爪沙鼠照阳河鄂尔多斯高原型－－０２２０２００２１１０８长爪沙鼠照阳河鄂尔多斯高原型０２２－－１２００２１１０８长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－－０２２２２００２１１１１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型５０ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄续表１菌株编号分离时间分离宿主分离地点生态型－－０２２３２００２１１１１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－－０２２４２００２１１１１长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型－－０３０１２００３０５２６长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型０３０２３－０５－２００２６长爪沙鼠牧场鄂尔多斯髙原型－０５０１２００５０４－１６长爪沙鼠照阳河鄂尔多斯髙原型－０４－２０５０３２００５１长爪沙鼠照阳河鄂尔多斯高原型０５０７２００５－０４－２１秃病蚤蒙冀亚种照阳河鄂尔多斯高原型０５０８２００５－０４－２１方形黄鼠圣蒙古亚种照阳河鄂尔多斯高原型０５０９２００５－０４－２４长爪沙鼠照阳河鄂尔多斯髙原型０５－－１２２００５０４２８长爪沙鼠牧场鄂尔多斯高原型５１ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄一附表２ＤＦＲ引物览表＂ｉｌ引物名称引物序列引物在基因的位置扩增产物大小（ｂｐ）｜｜｜｜ＤＦＲ０１ＡＰ－ＡＧＡＧＡＧＴＴＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＧＡＣＣＡＴＧ８１３－８３８２００ＰＭＴ０４６ＦＡＰ－－ｐｌｔｆＴ０４６ＲＡＴＡＣＣＡＧＴＧＧＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣ１０１２９８７ＤＦＲ０２ＡＰ－ＭＴ０９０ＦＣＡＴＣＣＧＴＴＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＣ８８３－９０７３００ｐ－ＣＣＡＧＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＧＧＴＡＣＴＴＡＴＧ－１１ＡＰｐＭＴ０９０Ｒ１１８２５８－ＤＦＲ０３－ＡＰＹＰＭＴ１．＾６ｃＦＡＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＡＴＧＧＴＣＡＡＴＡＡＴＧ３１０７３１３１４００Ａ－－ＰＹＰＭＴ１．０６ｃＲＴＧＴＧＣＣＴＴＣＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＴＴＴＧ３５０６３４８３ＤＦＲ０Ａ－ＹＰ０９７６ＦＧＴＧＧＡＧＴＡＣＣＴＣＴＴＡＴＣＴＧＧＡＴＧ８２－６０５５００４Ｐ５ＡＰ－ＹＰ０９７６ＲＣＡＡＡＴＡＴＴＴＣＡＣＣＧＣＧＴＴＴＡＡＣＣ－１０８１１０５８ＤＦＲ０５ＡＰ－ＹＰ００６２４ＦＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＣＴＣＧＣＡＧＡＡＡＧＣＡＧ６７８－７０２４００－ＡＰ－ＹＰ００６２４ＲＧＣＣＡＡＴＡＧＣＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴＴＣＴＧ１０７７１０５４ＤＦＲ０６ＡＰ－ＹＰ００７３９ＦＧＡＡＭＴａＴＣＧＡＧＣＧＣＴＡ５６６－５８７３ＣＴＧＧ１８ＡＰ－ＹＰ００７３９ＲＧＧＡＡＴＧＴＧＧＣＴＴＣＴＧＣＣＴＴＧ８８３－８６４ＤＦＲ０７ＡＰ－ＹＰ－（Ｘ）７４３ＦＴＧＴＧＴＣＡＣＣＡＡＴＧＧＣＡＣＴＴＡＡＡＣ３２４３４７２００ＡＰ－ＹＰ００７４３ＲＧＧＣＴＡＴＣＴＡＴＣＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣ５２３－５００ＤＦＲ－－６７０３０００８ＡＰＹＰ００９８８ＦＡＣＣＧＴＴＴＡＣＧＣＣＴＣＭＴＡＴＧＴＴＧ６４７ＡＰ－ＹＰ００９８８ＲＧＡＴＡＧＡＡＴＡＡＴＡＣＣＡＧＣＧＧＴＴＧＡＡＣ９４６－９２１ＤＦＲ０９ＡＰ－ＹＰ０１－１１００２ＦＴＡＴＧＴＧＣＣＧＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＡＧＴＣ６８１９４００ＡＰ－ＹＰ０１００２ＲＴＴＴＡＡＣＴＡＡＡＴＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＡＣＡＧ５６７－５４２－ＤＦＲ１０ＡＰ－ＹＰ０１１６８ＦＧＴＴＡＣＣＧＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＣ１４２５１４５０５００ＡＰ－ＹＰ０－１１６８ＲＴＣＴＧＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＴＡＧＴＣＣＡＴＣ１９２４１９０１ＤＦＲ１ＡＰ－１１－１ＹＰ０９８７ＦＣＴＧＧＡＡＡＡＴＧＣＣＣＴＡＣＣＧ７８８１５５３ＡＰ－ＹＰ０１９８７ＲＴＣＧＧＴＣＧＧＣＴＴＴＡＴＣＣＣ１６２３－１６０８－－ＤＦＲ１２ＡＰＹＰ０２１１０ＦＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＣ４５５４７８３００ＡＰ－－ＹＰ０２１１０ＲＣＡＴＴＧＡＴＴＧＧＡＴＡＴＧＡＧＣＧＧＡＡＧ７５４７３１ＤＦＲ－－１３ＡＦＹＰ０２２７７ＦＧＴＴＣＴＣＣＡＧＴＴＧＴＡＧＧＴＧ５６０５７７１９１ＡＰ－ＹＰ０２２７７ＲＡＴＴＣＧＴＣＡＣＡＧＴＧＣＧＴＴＣ７５０－７３３－－ＤＦＲ１４ＡＰＹＰ０２２８６ＦＣＣＧＡＴＣＴＴＡＡＴＣＡＧＧＣＴＣＴＴＣＡＧ５４５５６８３００ＡＰ－ＹＰ０２２８６ＲＣＴＴＧＣＧＡＧＧＴＡＡＴＴＴＧＧＴＴＣＴＴＧ８４４－８２１ＤＦＲ１５ＡＰ－ＹＰ０２３１－１５ＦＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＧ６３１８８４００ＡＰ－ＹＰ０２３１５ＲＣＴＴＣＴＡＣＴＧＡＣＡＧＧＡＴＣＡＡＴＴＣＧ５６２－５３９５２ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄续表２￣＾￣引物名称、＿列引物在基因的扩增产物大｜｜｜｜位置小（ｂｐ）ＤＦＲ－－１６ＡＰＹＰ０２３７５ＦＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＴＡＣＣＧＡＣＴＡＴＣＴＧ３４４３６７５００ＡＰ－ＹＰ０２３－７５ＲＧＧＴＣＡＴＧＧＴＣＡＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＴＧ８４３８２０ＤＦＲ７ＡＰ－ＹＰ０２３８０ＦＡＴＧＧＣＡＡＴＧＴＴＡＴＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧ－１１７９９１８２２４００ＡＰ－ＹＰ０２３８０ＲＧＴＡＴＡＡＡＴＡＣＣＣＧＣＴＴＣＣＣＴＴＡＣＧ２－１９８２１７４ＤＦＲ８ＡＰ－ＹＰ０２４６９ＦＡＡＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＡＴＴＧＣ７４－９０２６７１ＡＰ－ＹＰ０２４６９ＲＧＡＣＴＧＧＣＧＡＡＣＡＡＴＧＴＣ３４０－３２４ＤＦＲＰ－ＹＰ０２４８９ＦＧＴＴＴＧＡＴＡＴＴＡＡＧＴＧＧＧＣ５－１９Ａ１６８４２２ＡＰ－ＹＰ０２４８９ＲＡＡＴＡＡＧＴＴＴＧＣＣＡＧＴＴＴＣ４－７２４５７－ＤＦＲ２０ＡＰＹＰ０３０４７ＦＧＡＧＡＣＡＴＴＣＣＴＧＣＣＴＧＡＧＴＴＡＴＴＧ４９０－５１４３００ＡＰ－ＹＰ０３０４７ＲＧＡＴＡＧＣＣＴＣＡＴＣＧＧＴＡＡＧＴＴＧＡＴＣ７８９－７６５ＤＦＲ２ＡＰ－ＹＰ０３６７４ＦＡＣＧＡＴＧＣＡＣＴＧＴＡＴＣＡＧＣＴＴＡＴＣ－〇０１１２５９１２８２１ＡＰ－ＹＰ０３６－７４ＲＡＧＡＴＡＡＣＴＴＴＣＧＣＴＧＴＣＡＣＴＧＡＴＧ１６５８１６３４￣＂－－ＤＦＲ２２ＡＰＹＰ０４０１７ＦＴＧＡＴＧＡＡＴＡＡＣＣＴＣＧＡＴＣＣＴＧＡＣＧ１０１１２５５００－－ＡＰＹＰ０４０１７ＲＴＴＧＴＴＧＧＣＡＴＴＣＧＡＴＧＴＴＣＡＧＡＧ６００５７７ＤＦＲ２３ＤＦＲ３８３Ｆ－．ＧＴＴＡＣＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＣＧ２０３７３６４Ａｎｔ－－ｉｑｕａＲＴＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＡＡＡＴＴＣＡＣ３８３３５６ＭＴ－－；１ＡＰＹＰＭＴ１．４４ＦＡＡＣＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＴＣＣＧＣＡＧＴＡＡＡＧ＾６０４８５１〇０－８－ＡＰＹＰＭＴ１．４４ＲＡＧＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＴＡＧＡＣＣＧＡＧ５９８３６５３ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研究附表３２６对引物的序列信息’’’Ｐｒｉｍｅｒ名称Ｆ引物５端标记焚光序列（５ｔｏ３）减基数（ｂｐ）￣Ｍ５８－ＦＨＥＸＧＣＧＡＴＡＡＣＣＣＡＣＡＴＴＡＴＣＡＣＡＡＴＡＡＣＣＡＡＣＡＣ３２Ｍ５８－ＲＧＣＴＧＡＴＧＧＡＡＣＣＧＧＴＡＴＧＣＴＧＭＴＴＴＧＣ２８ＭＳ５６－ＦＦＡＭＡＡＣＣＧＡＣＴＧＡＣＴＣＡＣＴＴＴＡＴＡＴＴＧＧ２５ｔｔｃＹｔｔｔｃｃａｔｔａｃｔｃａｇｃｃｔｇｔｔ２４ＭＳ３８－ＦＨＥＸＧＴＧＡＧＧＴＡＴＡＧＣＴＡＡＡＣＧＧＴＧＡＴＧＴ２５ＭＳ３８－ＲＣＧＣＣＧＴＡＧＡＴＴＡＴＴＴＧＴＣＡＣＴＴＴＡＴ２５Ｍ２１－ＦＦＡＭＧＡＴＴＴＡＴＧＡＡＴＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＣＧＣＡ２９Ｍ２１－ＲＧＴＡＧＴＧＡＴＡＣＡＧＧＣＡＡＡＴＣＣＡＡＧＡＧＣＧＣＡ２９Ｍ－１５ＦＦＡＭＧＴＣＡＣＣＴＣＴＣＴＣＡＧＧＣＧＧＧＡＡＴＣＡＴＣＴＣＴＣ３０：Ｍ１５ＲＧＣＡＴＡＡＣＧＴＣＴＴＣＡＧＴＧＣＧＴＴＧＴＧＧＣ２６Ｍ６１－ＦＨＥＸＧＣＧＣＣＡＣＡＡＴＴＡＧＧＧＣＡＡＣＴＧＣ２２Ｍ６－１ＲＧＣＣＧＣＴＴＴＡＡＴＧＧＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＧＡＣ２６ＭＳ０９－ＦＦＡＭＣＧＴＴＡＣＣＣＴＴＧＴＴＧＣＣＡＡＴＡＧＴ２２：ＭＳ０９－ＲＡＣＧＣＡＧＡＡＣＡＴＧＣＴＴＡＣＣＴＴＴＴＡＴ２４：：Ｎ２４８６ＦＨＥＸＴＧＡＣＴＧＡＴＴＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡ１９Ｎ２４８６－ＲＧＡＣＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＴＡＴＡＡＣＣＣＡ２２ＭＳ７３－ＦＦＡＭＡＡＴＡＣＣＣＴＧＴＧＧＧＴＧＡＴＡＡＴＧＡＡＣ２４＂ｍｓＴＦｒＡＴＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＡＴＴＣＡ２４ＭＳ４－１ＦＨＥＸＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＣＴＡＡＴＣＴＧＡＴＧ２３ＭＳ４１－ＲＴＡＡＴＧＡＡＴＡＧＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＣＡＡＴＡ２５Ｎ３７７９－ＦＨＥＸＡＴＧＣＣＡＣＴＧＣＧＴＴＣＴＡＴ１７￣＂＇＾Ｎ３７７９ＲＡＴＣＧＧＧＡＴＴＣＡＴＴＣＧＴＴ１７Ｎ２８９６－ＦＦＡＭＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡＣＡＧＡＣＧＣＴＣ１９－ＲＴＧＣＣＧＣＡＡＣＴＡＡＡＧＡＣＡＣＮ２８９６１８Ｎ０－ＦＦＡＭＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＧＴＣＡＴＴＣ８６５１９＾Ｎ０８６５ＲＧＴＣＡＡＡＣＣＴＧＣＣＴＴＡＴＴＣＧ１９Ｎ２９７６－ＦＨＥＸＡＴＧＴＧＧＣＧＴＧＡＧＴＧＴＣＧ１７Ｎ２９７６－ＲＧＣＴＧＣＧＴＴＴＣＣＴＧＴＴＣＧ１７Ｎ－１６０６ＦＨＥＸＡＣＧＡＧＡＡＧＡＴＡＡＣＣＡＡＡＧＣ１９Ｎ－１６０６ＲＴＡＣＡＴＣＡＡＡＡＴＡＧＣＡＣＣＣＡ１９＇Ｎ２－１１７ＦＦＡＭＣＧＴＧＴＴＣＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴ１７：Ｎ２１１７ＲＡＴＴＴＧＧＴＧＣＴＴＴＧＧＡ１５５４ 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中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄致谢衷心感谢我的导师李伟和李振军研宄员。两位导师学识渊博，视一丝不苟野广阔，对待科研工作认真严谨，；他们待人真诚、亲和、平易且淡薄名利。他们这种渊博的知识胸怀、严谨的科研态度、为人待物的高尚品格和积极上进的工作热情给我莫大的激励，我要在以后一的工作学习和处事生活中时刻以两位导师为标榜。年的生活学习中，难忘李老师对我生活的全力帮助和对我为人处事的语重心长深刻教诲，难忘李老师对我学习的严格要求和对我遇到实验困难时的鼓励冕进，难忘李老师对我实验规划设计、结果数据分析和论文认真仔细的修改，今生有幸得到与两位老师相处的缘分。在即将毕业之际，学生向您们表示崇高的敬意、衷心的感谢以及无限的祝福。衷心的感谢夏连续老师、蔡虹老师、魏建春老师、、梁旭东老师王艳华老师、张志凯老师、梁莹老师、郑霄老师、张恩民老师、张慧娟老师。、彭瑶和王雨萌在学习和生活上给予的关心和帮助感谢他们在我做实验过程中遇到各种困难时，从不嫌烦，不遗余力，认真仔细，尽力帮助。是你们的种种温暖，给我平淡的的实验生活带来乐趣。时一起修理仪器一一常想起和你们、起采摘桑葚，起聊天解闷，那是快乐的、难忘的。衷心的感谢梁莹老师在实验设计、具体操作和实验结果数据处理分析时给予诸多帮助。５６ 中国疾病预防控制中心硕士学位论文河北省长爪沙鼠型鼠疫菌基因分型及流行病学研宄一个团结互助衷心的感谢、积极奋进、充满温暖的鼠疫室。在难忘的这里，我拓展了知识、学习了技术、感受到了温情。衷心的感谢科教处老师们对我的帮助。衷心的感谢安翠红大姐和马娜小妹对我生活和学习上给予的关一心和帮助。时常想起和你们在起做实验时的快乐情景。一起生活的师兄师弟衷心的感谢和我、师姐师妹对我生活和学习上给予的关心和帮助。衷心的感谢李玉贵所长给了我读在职公共卫生硕士的机会。衷心的感谢史献明所长和刘合智主任对我工作的关心理解和帮助。衷心的感谢我的同事王海峰和杨顺林。几个月的提取鼠疫核酸强一一一起认真计划准备、毒工作中，我们、起废寝忘食起放弃假期、一起汗流浃背，姐弟情深。，最后提取成功。衷心感谢你们的并肩作战衷心的感谢我的闫东。、梁昊对我的论文中绘图的帮助衷心的感谢我的家人对我生活和学习工作的支持理解，我爱你们，为此我将更加努力学习工作。５７