牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立

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学校代码３．３：１０２２分类号：Ｓ８５５学号ＸＳ１４３１００密级：公开：硕士学位论文牛副流感病毒３型Ｑ－ＰＣＲ及间接ＥＬＩＳＡ方法的建立研究生：张玲玲指导教师：闻晓波副教授学科专业：预防兽医学研究方向：分子免疫与免疫制剂培养学院：动物科技学院中国·大庆２０１７．６．？： Universitycode：10223Classifiedcode：S855.3Graduatenumber：XS14310Confidentialdegree：PublicHeilongjiangBayiAgriculturalUniversityMasterDissertationDevelopmentofQ-PCRandIndirectELISAfortheDetectionofBovineParainfluenzaVirusType3Postgraduate:ZhangLing-lingSupervisor:A.P.WenXiao-boPreventiveVeterinaryMajor:MedicineMolecularImmunityandResearchdirection:ImmunologicAgentsDegreecategory:MasterofAgronomyCollegeofAnimalScienceCollege:andVeterinaryMedicineDaqingChinaJune.2017 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包一含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得黑龙江八农垦大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：私灰死Ｚ日期：年４月日〉关于论文使用授权的说明一农垦大学有关保留本人完全了解黑龙江八、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印一、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意黑龙江八农垦大学可以用不同方式在不同刊物上发表，传播学位论文的全部或部分内容。（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）研究生签名：＿力＊师签名日期：６月日日期：年心月Ｉ／Ｏ爭ｆ丨＾ 目录目录摘要.............................................................................................................................................IXAbstract.........................................................................................................................................XI1文献综述.....................................................................................................................................11.1牛副流感病毒3型的概况...............................................................................................11.1.1病毒的命名.............................................................................................................11.1.2牛副流感病毒3型的分子结构.............................................................................11.1.3牛副流感病毒3型的基因分型.............................................................................21.2病毒的病原学及流行病学研究.......................................................................................31.2.1牛副流感病毒3型的病原学.................................................................................31.2.2牛副流感病毒3型的流行病学.............................................................................31.3牛副流感病毒3型诊断及防治.......................................................................................41.3.1病毒分离.................................................................................................................41.3.2红细胞吸附实验.....................................................................................................51.3.3聚合酶链式反应.....................................................................................................51.3.4荧光定量PCR........................................................................................................51.3.5血凝性实验.............................................................................................................71.3.6酶联免疫吸附试验.................................................................................................81.3.7病毒中和试验.........................................................................................................81.3.8牛副流感病毒3型的防制措施.............................................................................91.4研究目的与意义...............................................................................................................92牛副流感3型Q-PCR方法的建立及应用.............................................................................112.1材料.................................................................................................................................112.1.1毒株、质粒...........................................................................................................112.1.2主要试剂...............................................................................................................112.1.3主要仪器设备.......................................................................................................112.2方法.................................................................................................................................122.2.1引物和探针设计...................................................................................................122.2.2标准品的制备.......................................................................................................122.2.3TaqMan荧光定量PCR体系的优化....................................................................142.2.4TaqMan荧光定量PCR标准曲线的绘制............................................................142.2.5SYBRGreenIQ-PCR体系的优化.......................................................................152.2.6SYBRGreenIQ-PCR标准曲线的绘制...............................................................152.2.7TaqMan探针法与SYBRGreenI染料法的比较................................................152.2.8临床样品的检测...................................................................................................162.3结果..................................................................................................................................162.3.1标准品的制备.......................................................................................................162.3.2TaqMan-MGB荧光定量PCR体系的优化..........................................................162.3.3TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线的绘制..................................................162.3.4SYBRGreenIQ-PCR体系的优化.......................................................................172.3.5SYBRGreenIQ-PCR标准曲线的绘制...............................................................17I 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立2.3.6特异性试验...........................................................................................................182.3.7敏感性试验...........................................................................................................192.3.8重复性实验...........................................................................................................202.3.9临床样品的检测结果...........................................................................................202.4讨论.................................................................................................................................213重组蛋白NP-N-C的表达........................................................................................................233.1材料.................................................................................................................................233.1.1病毒、细胞、质粒及菌种...................................................................................233.1.2主要试剂...............................................................................................................233.1.3主要仪器...............................................................................................................233.2方法.................................................................................................................................233.2.1引物设计与合成...................................................................................................233.2.2细胞的培养及病毒的扩增...................................................................................243.2.3TRIzol法提取RNA..............................................................................................243.2.4反转录...................................................................................................................253.2.5PCR扩增...............................................................................................................253.2.6PCR产物的纯化与回收.......................................................................................253.2.7pET-28a-NP-N表达质粒的构建...........................................................................263.2.8重组质粒pET-28a-NP-N的鉴定.........................................................................263.2.9pET-28a-NP-N-C表达质粒的构建.......................................................................273.2.10重组质粒pET-28a-NP-N-C的鉴定...................................................................273.2.11重组蛋白的诱导表达及诱导条件的优化.........................................................283.2.12重组蛋白的大量表达.........................................................................................303.2.13重组蛋白的纯化与定量.....................................................................................313.2.14重组蛋白的Western-blotting分析....................................................................323.3结果..................................................................................................................................333.3.1抗原表位的预测分析...........................................................................................33.........................................................................................................................................333.3.2目的基因NP-N及NP-C的扩增........................................................................333.3.3原核表达重组质粒的鉴定...................................................................................343.3.4重组蛋白的诱导表达形式的鉴定.......................................................................343.3.5重组蛋白表达条件的优化...................................................................................353.3.6重组蛋白的纯化及浓度的测定...........................................................................35................................................................................................................................................363.3.7重组蛋白的WesternBlot鉴定............................................................................363.4讨论.................................................................................................................................364牛副流感3型间接ELISA诊断方法的建立..........................................................................394.1材料.................................................................................................................................394.1.1主要试剂................................................................................................................394.1.2主要仪器................................................................................................................394.2方法.................................................................................................................................39II 目录4.2.1间接ELISA方法操作步骤..................................................................................394.2.2间接ELISA方法条件的优化...............................................................................394.2.3重复性试验...........................................................................................................414.2.4临床样品的检测...................................................................................................414.3结果..................................................................................................................................414.3.1间接ELSIA方法条件的优化结果......................................................................414.3.2间接ELISA临界值的确定..................................................................................44.........................................................................................................................................454.3.4重复性实验...........................................................................................................454.3.5临床样品的检测...................................................................................................464.4讨论.................................................................................................................................465全文结论...................................................................................................................................49参考文献.................................................................................................................................51致谢.............................................................................................................................................55个人简历.......................................................................................................................................57III ContentsContentsAbstractinChinese.......................................................................................................................IXAbstractinEnglish........................................................................................................................XI1Reviewoftheliterature................................................................................................................11.1TheoverviewofBPIV3.....................................................................................................11.1.1Nomenclatureofvirus..............................................................................................11.1.2MolecularstructureofBPIV3..................................................................................11.1.3GenotypeofBPIV3..................................................................................................21.2Etiologyandepidemiologyofvirus...................................................................................31.2.1EtiologyofBPIV3....................................................................................................31.2.2EpidemiologyofBPIV3...........................................................................................31.3DiagnosisandcontrolofBPIV3........................................................................................41.3.1Virusisolation...........................................................................................................41.3.2Redbloodcelladsorptiontest..................................................................................51.3.3polymerasechainreaction........................................................................................51.3.4FluorescentquantitativePCR...................................................................................51.3.5Hemagglutinationtest..............................................................................................71.3.6Enzymelinkedimmunosorbentassay......................................................................81.3.7Virusneutralizationtest............................................................................................81.3.8ControlmeasuresofBPIV3.....................................................................................91.4Thepurposeandmeaningoftheresearch..........................................................................92EstablishmentandapplicationofQ-PCRfortheDetectionofBPIV3......................................112.1Materials...........................................................................................................................112.1.1virusandplasmid...................................................................................................112.1.2Mainreagents.........................................................................................................112.1.3Maininstrumentsandequipments..........................................................................112.2Methods............................................................................................................................122.2.1DesignofPrimersandprobes................................................................................122.2.2Preparationofstandardproducts............................................................................122.2.3OptimizationofTaqManfluorescentquantitativePCRsystem.............................142.2.4PlottingofstandardcurveforTaqManQ-PCR......................................................142.2.5OptimizationofSYBRGreenIQ-PCRsystem.....................................................152.2.6PlottingofstandardcurveforSYBRGreenIQ-PCR...........................................152.2.7ComparisonofTaqManQ-PCRandSYBRGreenIQ-PCR.................................152.2.8Thetestofclinicalsample......................................................................................162.3Results..............................................................................................................................162.3.1Preparationofstandardproducts............................................................................162.3.2OptimizationofTaqManfluorescentquantitativePCRsystem.............................162.3.3PlottingofstandardcurveforTaqManQ-PCR......................................................162.3.4OptimizationofSYBRGreenIQ-PCRsystem.....................................................17V 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立2.3.5PlottingofstandardcurveforSYBRGreenIQ-PCR...........................................172.3.6Specificitytest........................................................................................................182.3.8Sensitivitytest........................................................................................................19................................................................................................................................................19................................................................................................................................................202.3.7Repeatabilitytest....................................................................................................202.3.9Theresultsofclinicalsamplestest.........................................................................202.4Discussion........................................................................................................................213ExpressionofrecombinantproteinNP-N-C..............................................................................233.1Materials...........................................................................................................................233.1.1Virus,cells,plasmidsandbacteriastrains..............................................................233.1.2Mainreagents.........................................................................................................233.1.3Maininstrumentsandequipments..........................................................................233.2Methods............................................................................................................................233.2.1Primerdesignandsynthesis...................................................................................233.2.2Cultivationofthecellsandamplificationofthevirus...........................................243.2.3TheextractionofRNAbyTRIzolmethod.............................................................243.2.4Reversetranscription..............................................................................................253.2.5TheamplificationofPCR.......................................................................................253.2.6PurificationandrecyclingofPCRproducts...........................................................253.2.7EstablishmentofexpressionplasmidpET-28a-NP-N............................................263.2.8IdentificationofrecombinantplasmidpET-28a-NP-N..........................................263.2.9EstablishmentofexpressionplasmidpET-28a-NP-N-C........................................273.2.10IdentificationofrecombinantplasmidpET-28a-NP-N-C....................................273.2.11InducedexpressionofrecombinantproteinNP-N-C...........................................283.2.12Massexpressionofrecombinantprotein..............................................................303.2.13Thepurificationandquantificationofrecombinantprotein................................313.2.14Western-blottinganalysisofrecombinantprotein................................................323.3Results..............................................................................................................................333.3.1Theredictionandanalysisofepitoperegion..........................................................33.........................................................................................................................................333.3.2AmplificationoftargetgenesNP-NandNP-C......................................................333.3.3Identificationofrecombinantplasmidsforprokaryoticexpressing.......................343.3.4Theidentificationofinducedexpressionformsforrecombinantproteins............343.3.5Optimizationofexpressingconditionsforrecombinantprotein............................353.3.6Purificationandconcentrationdeterminationofrecombinantprotein...................35................................................................................................................................................363.3.7Identificationofrecombinantproteinsbywesternblot.........................................363.4Discussion........................................................................................................................364TheestablishedindirectELISAfordetectionofBPIV3antibodies..........................................394.1Materials...........................................................................................................................394.1.1Mainreagents.........................................................................................................394.1.2Maininstrumentsandequipments..........................................................................39VI Contents4.2Methods............................................................................................................................394.2.1StepsofindirectELISAmethod.............................................................................394.2.2OptimizationofindirectELISAmethodcondition................................................394.2.3Repeatabilitytest....................................................................................................414.2.4Thetestofclinicalsample......................................................................................414.3Results..............................................................................................................................414.3.1OptimizationresultsofindirectELSIAmethodconditions...................................414.3.2DeterminationofindirectELISAcriticalvalue.....................................................44.........................................................................................................................................454.3.4Repeatabilitytest....................................................................................................454.3.5Thetestofclinicalsample......................................................................................464.4Discussion........................................................................................................................465Conclusion..................................................................................................................................49Reference.......................................................................................................................................51Conveythanks...............................................................................................................................55Personalresume.............................................................................................................................57VII 摘要摘要牛副流感病毒3型（Bovineparainfluenzavirustype3,BPIV3）为单股负链RNA病毒，副黏病毒科、呼吸道病毒属成员，与牛疱疹病毒I型（BovineherpesvirusI，BoHV-I）、牛呼吸道合胞体病毒（Bovinerespiratorysyncytialvirus,BRSV）、牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrheavirus,BVDV）共同构成了牛呼吸道疾病综合征（Bovinerespiratorydiseasecomplex,BRDC）的主要病毒性病原，在世界范围内每年都会给养牛业造成巨大的经济损失。流行病学调查表明，该病毒在我国已呈现广泛分布。因此，建立能够方便、准确的检测BPIV3的方法已迫在眉睫。病原学诊断方面，本研究根据GenBank上已公布BPIV3的P基因中保守区域设计特异性引物及TaqMan-MGB探针，并建立了TaqMan探针和SYBRGreenI两种检测BPIV3的荧光定量PCR方法，并对两种方法的特异性、敏感性、重复性进行验证。结果表明，TaqMan探针法及SYBR染料法构建的标准曲线在103~107copies/μL内均具有较好的线性关系，特异性实验中，两种方法检测BPIV3a及BPIV3c的结果为阳性，而对牛的其他呼吸道病毒无交叉反应。敏感性试验中，TaqManQ-PCR对标准品的最小检出量为101copies/μL，SYBRGreenIQ-PCR对标准品的最小检出量为103copies/μL。重复性试验中，Ct值变异系数均小于1.0%。血清学诊断方面，本研究选取在不同毒株中相对保守的NP蛋白，对NP蛋白进行抗原表位的预测及初步筛选，结合现有文献的报道，最终确定NP蛋白的N端8aa~156aa（NP-N）及C端368aa~507aa（NP-C）为优势抗原区，设计合成两对特异性引物并扩增。构建原核表达载体pET-28a-NP-N-C，并在E.coliBL21（DE3）中诱导表达。以纯化的融合蛋白NP-N-C作为包被抗原，以BPIV3阴性、阳性血清为对照建立了检测BPIV3抗体间接ELISA诊断方法。通过实验对比，确立最佳反应条件，通过SPSS分析构建ROC曲线，确定临界值，计算该方法的特异性、敏感性，并对其重复性进行验证。最佳反应条件如下：抗原最佳包被浓度为4μg/mL，37℃，1h后4℃过夜为抗原最佳包被条件，最佳血清稀释度为1:80。5%的脱脂乳为封闭液的最佳浓度，37℃条件下最佳封闭时间为1h，血清的最佳作用条件为37℃1h。二抗最佳稀释度选择1:5000。37℃条件下，二抗的最佳孵育时间为1h。TMB底物最佳作用时间为15min。该方法的临界值为0.267时，所建立方法的特异性为97.4%，敏感性为95.3%。重复性实验中，以同一批次及不同批次包被的酶标板检测已知血清，变异系数均小于10%，IX 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立本研究所建立的两种Q-PCR检测方法具有检测3种不同基因型的BPIV3的潜力，为BPIV3的病原学早期诊断及定量分析提供了更快速、稳定、可靠的方法。本研究建立的检测BPIV3抗体的间接ELISA方法能够应用于BPIV3的血清流行病学调查及追溯性诊断。本研究所建立的两种Q-PCR病原学诊断方法和间接ELISA血清学诊断方法可以为BPIV3相关疾病的防治提供可靠指导。关键词：牛副流感3型；Q-PCR；间接ELISA；NP基因X AbstractAbstractBovineparainfluenzavirustype3(BPIV3)isasingleandnegativestrandRNAvirus,whichisthememberofgenusRespirovirusofthefamilyParamyxoviridae.BPIV3isaleadingviralpathogenofBovinerespiratorydiseasesyndrome,bywhichBovineherpesvirusI(BHV-I),Bovinerespiratorysyncytialvirus(BRSV)orBovineviraldiarrheavirusinfects(BVDV).BPIV3causessignificanteconomiclossestocattleindustryeveryyearworldwide.SerologicalsurveysshowedthatBPIV3hasbeenwidelydistributedinChina,therefore,itisimminenttoestablishafeasibleandaccuratemethodfordiagnosisofdiseaseassociatedwiththeBPIV3.Inetiologicaldiagnosis,inthisstudy,onepairofspecificprimersandTaqMan-MGBprobesweredesignedbasedonthesequencesofBPIV3publishedinGenBanktoestablishSYBRGreenIQ-PCRandTaqMan-MGBQ-PCRmethods,whichcoulddetectBPIV3specifically.Thespecificity,sensitivityandrepeatabilityofsuchtwomethodswereevaluated.Thestandardcurveinarangeof103~107copies/μLshowedagoodlinearrelationship.Inthespecificitytests,bothSYBRGreenIQ-PCRandTaqMan-MGBQ-PCRmethodswerehighlyspecificfordetectionofBPIV3aandBPIV3c,andneitheroftwomethodswaspositiveforbovineviraldiarrheavirusandbovineherpesvirustypeI.Inthesensitivitytests,theminimumdetectablequantityofTaqManQ-PCRwas1.0×101copies/μL,incomparison,SYBRGreenIQ-PCRwas1.0×103copies/μL.Intherepeatabilitytests,theCtvaluevariationcoefficientsoftwomethodswerelessthan1.0%.Inserumdiagnostics,inthisstudyfordevelopmentofanindirectELISA,thenucleocapsid(NP)proteinofBPIV3waschosen,sinceitwasrelativelyconservativeinvariousBPIV3strains.AccordingtopapersandsoftwareanalysisofNP,theaminoterminalofNPprotein(aa8~156)andthecarboxylterminalofNPprotein(aa368~507)wereanalyzedasthebestepitopeantigenregions.Twopairsofspecificprimersweredesignedtoamplifythegiventargetfragments.TheprokaryoticexpressionvectorpET-28a-NP-N-CwasconstructedandexpressedinE.coliBL21(DE3).ThefusionproteinNP-N-CwasusedascoatingantigenbydetectionofBPIV3-positiveandnegativesera,whichwasdevelopedforthedetectionofBPIV3sera.ThereactionconditionsofindirectELISA,includingquantityofcoatingantigenandincubationtime,dilutionoftheanalyzedsera,selectionofblockingbuffer,dilutionofsecondaryantibodyandsubstrateXI 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立incubationtimewereoptimized.TheROCcurvewasconstructedbySPSSanalysisandcut-offvaluewasdetermined.ThespecificityandsensitivityoftheindirectELISAwereevaluatedanditsrepeatabilitywasverified.Theoptimalreactionswereasfollows:quantityofcoatingantigenwas4μg/mL,incubatedat37℃for1h,followedbybeingincubatedat4℃for12h.Thedilutionmultipleofserawas1:80.Theconcentrationofblockingbufferwas5%skimmedmilkandthereactionconditionsofskimmedmilkwasincubatedat37℃for1h.Theoptimalreactionconditionsofserumwasincubatedat37℃for1h.Thebestdilutionofsecondaryantibodieswas1:5000,theoptimalreactionconditionsofsecondaryantibodieswasincubatedat37℃for1h.TheincubationtimeofTMBsubstratewas15min.Thecut-offvalueofOD450readingwassetas0.267andtheresultingspecificityoftheindirectELISAwas97.4%andthesensitivitywas95.3%.Intherepeatabilitytests,thegivenseraweredetectedunderoptimalparameter,demonstratingthatthecoefficientofvariationsintra-assayandinter-assaywaslessthan10%.TheQ-PCRassaysestablishedinthisstudyrepresentedapotentialofdetectionofBPIV3threegenotypesanditprovidedamorerapid,stableandfeasiblemethodfortheearlydiagnosisandquantitativeanalysisofBPIV3.TheestablishedindirectELISAfordetectionofBPIV3antibodiescouldbeappliedtoserologicalepidemiologicalinvestigationandretrospectdiagnosisforBPIV3.Q-PCRsandindirectELISAdevelopedinthisstudymayprovidethebasicguideforthepreventionandcontrolofthediseaseduetoBPIV3.Keywords:Bovineparainfluenzavirustype3;Q-PCR;NPgene;ELISAXII 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立英文缩略词缩略词英文全称中文全称BHV-IBovineherpesvirus1牛疱疹病毒I型BPIV3Bovineparainfluenzavirustype3牛副流感病毒3型BRDCBovinerespiratorydiseasecomplex牛呼吸道疾病综合征BRSVBovinerespiratorysyncytialvirus牛呼吸道合胞体病毒BVDVBovineviraldiarrheavirus牛病毒性腹泻病毒cDNAComplementaryDNA互补DNAE.coliEscherichiacoli大肠埃希氏菌HRPHorseradishPeroxidase辣根过氧化酶IPTGIsopropylthio-β-D-galactoside异丙基硫代-β-D-半乳糖苷LBLuria-bertanimediumLB培养基ODOpticaldensity吸光度PVDFPolyvinylidenefluoride聚偏二氟乙烯RT-PCRReverseTranscriptase-PolymeraseChainReaction反转录聚合酶链式反应SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠XIII 文献综述1文献综述1.1牛副流感病毒3型的概况BRDC是因病毒、细菌单独或混合感染引发的牛支气管炎、肺炎等呼吸道疾病的统称，该疾病的严重程度常常与牛自身免疫力、应激、饲养管理等息息相关。临床多表现为高热、呼吸困难、精神萎靡、食欲低下。近年来随着我国养牛业的飞速发展，规模化，集约化管理模式的兴起，牛群人为的迁徙急剧增加，生产实践中，犊牛断奶后调往育成牛场进行饲养繁育，是大多数养牛业的管理模式，运输过程中犊牛的应激反应极易引发BRDC，因此该病也被称为“运输热”。BRDC是引起世界范围内的舍饲牛发病及死亡的主要原因，严重危害着养牛业的发展[1,2]。BPIV3与BHV-I、BRSV、BVDV共同构成了BRDC的主要病毒性病原。1.1.1病毒的命名BPIV3最早由美国马里兰州布尔茨维尔能源部的农业实验室分离，样品来自患有运输热的牛鼻液中，并于1959年8月出版于《美国兽医协会杂志》中的一篇文章中初步命名为黏病毒SF-4[3]。与此同时曾参与SF-4病毒分离工作的马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院的科研人员也成功获得了第2例分离株，并与人副流感病毒3型（Humanparainfluenza3virus,HPIV3）HA-1株进行一系列的对比，发现这两种病毒均能在牛肾细胞、猴肾细胞、HeLa细胞及KB细胞上增殖，但在首次传代分离中，猴肾细胞上并未出现细胞病变效应，而SF-4在牛肾细胞上造成的CPE也并不明显，但在HeLa细胞培养过程中，两种病毒形成的CPE类型相似，两种病毒均对醚敏感，可以使豚鼠红细胞发生凝集且凝集效价高于鸡红细胞[4,5]。Andrews等人鉴于这些新病毒的生物学性质，将其定名为副流感病毒，与流感病毒一同划为黏病毒，随后Waterson提出副流感病毒的理化性质及生物学性质与流感病毒并不相同，流感病毒该被定为第一类黏病毒，而副流感病毒应被定为第二类黏病毒，直至1982年第四次国际病毒会议上才将第二类黏病毒正式命名为副黏病毒属[6,7]。Dawson等人通过实验证明了BPIV3的神经氨酸酶活性，使得人们进一步确认了BPIV3为副黏病毒科成员[8]。1.1.2牛副流感病毒3型的分子结构BPIV3与其他副黏病毒相同，具有囊膜及核衣壳结构，基因组全长一般集中在15450bp~15480bp左右，为单股不分节段的负链RNA病毒，6组编码基因共编码了9种蛋白，1 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立以3ˊ端起，NP基因编码核衣壳蛋白、P基因编码V、C、D3个非结构蛋白及磷蛋白，M基因编码融合蛋白，F基因编码融合蛋白，HN基因编码血凝素-神经氨酸酶，L基因编码大聚合酶[9,10]。BPIV3的NP蛋白作为包裹病毒核酸的结构蛋白，其在病毒粒子中的含量较高且相对保守，大聚合酶L、磷蛋白P与NP结合时，形成VRNA，完成蛋白的转录，最终完成病毒基因组的复制[11]。血凝素-神经氨酸酶HN及融合蛋白F位于病毒粒子的最外层，融合蛋白M紧贴于病毒囊膜，包裹着病毒粒子，是病毒主要的保护性抗原。F、HN、M蛋白共同作用结合，以便病毒入侵宿主细胞，F蛋白负责病毒与包膜融合，使病毒核酸侵入感染细胞中，在病毒释放的过程中，M蛋白可以将病毒基因组牵引至细胞膜部位，并形成包膜使得病毒以出芽的形式释放[12,13]。1.1.3牛副流感病毒3型的基因分型随着分子生物学技术的发展，PCR、测序技术的革新，人们对BPIV3的研究不再停留于病毒形态学研究、血清学研究等方面，而是深入到了基因水平。2003年，Vecherov通过对日本、俄罗斯、美国几株BPIV3的结构蛋白HN序列进行分析，分析结果表明，BPIV3分为两个不同的亚群，北美毒株与部分俄罗斯分离株构成一个亚群，而日本毒株与部分俄罗斯分离株则构成另一个亚群，但由于所选毒株的差异并不大，两个亚群在核酸水平上的最大差异为8%，在氨基酸水平上最大差异仅为4%，然而这些数据还不足以支持BPIV3在基因水平上的分型研究[14]。2008年Horwood等针对新分离的澳大利亚分离株与此前的分离株在基因水平上存在很大的差异，经分子进化树分析后，将其界定为新的基因型B型（BPIV3b），而将先前分离的毒株界定为基因型A型（BPIV3a），这也是国内外首次关于BPIV3的基因分型的报道。对于BPIV3的基因分型，一般根据M基因及全基因组的序列分析[15,16]。2012年，董秀梅在针对BPIV3分型的讨论中，以SD0835为分析对象，将其与部分BPIV3a、BPIV3b的HN基因、M基因及全基因组分别构建进化树，进行分析，得出无论在HN基因、M基因还是全基因组水平上，SD0835分离株与已报道的BPIV3a、BPIV3b毒株差异较大，可能为一潜在的新基因型，暂定为基因C型（BPIV3c）[17]。融合蛋白、HN蛋白作为表面抗原，其编码基因F及HN对于BPIV3的分型也具有参考价值参考。张峣以分离株NX49的F基因、HN基因及全基因组为分析对象，选取已报道的不同基因型的部分代表毒株与之进行核酸及氨基酸同源性比对，并根据全基因组比对结果绘制进化树，同源性分析结果表明NX49株与BPIV3b中的中国分离株NM09在F蛋白上存在68个氨基酸的差异，在HN蛋白上存在82个氨基酸的差异，进化树结果表明NX49与2 文献综述SD0835均为BPIV3c，且属于同一亚型[18]。1.2病毒的病原学及流行病学研究1.2.1牛副流感病毒3型的病原学BPIV3为单股负链RNA病毒目（Mononegavirles）、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亚科（Paramyxovirinae）、呼吸道病毒属（Respirovirus）的成员，是引起BRDC的主要病毒性病原之一，与之同属的还包括仙台病毒、HPIV3、HPIV1。与其他副黏病毒相比，BPIV3的热稳定性较低，且不同毒株的热稳定具有一定的差异，本病毒在60℃以上处理1h即可全部失活[18-20]。该病毒在4℃及-70℃保存时毒力较为稳定，血清可降低病毒的灭活速度，长期冻存时可在培养基中添加血清保存，以增加病毒的稳定性，延长病毒的保存时间及复苏后的感染能力。BPIV3对酸敏感，在PH值3.0~3.4的条件下处理该病毒，可使其迅速失活，在PH7.4~8.0的条件下适于其生长[21]。该病毒对脂溶剂敏感，且Mg2+对其不具有保护作用[18,22]。新分离的病毒由于病料保存或是病毒毒力的原因，接种细胞后大多不易形成明显的CPE现象及血凝素，因此用红细胞吸附实验相对容易检出，以此作为该病毒是否具有继续盲传的意义。目前常用作培养、分离BPIV3的传代细胞有MDBK、PK-15、BT、HeLa及Hep-2细胞，部分实验室会通过培养如牛肺细胞等原代细胞分离BPIV3。1.2.2牛副流感病毒3型的流行病学以畜牧业发达的澳洲为例，Moore等人针对2010年到2012年临床表现为健康的澳洲出口牛进行BRDC检测，共收集1484份的鼻拭子及部分样本血清以PCR及ELISA方法进行BRDC主要病毒性病原检测，结果BPIV3在鼻拭子中的检出率高达46%，在血清抗体阳性检出率则高达87%[23]。BPIV3多发生于舍饲牛，而放牧牛则较少发病，秋冬两季多为该病的高发期[24,25]。该病可分为犊牛型及成牛型，2周龄~5月龄的犊牛为该病的易感群体，1岁以内的犊牛均可感染该病毒，并表现出较为严重的临床症状，而成牛感染后因多表现为亚临床症状而常常被忽视。Frank等人的研究结果表明血清检测已存在BPIV3抗体的牛也能够发生2次感染，并可能出现排毒现象，这可能与BPIV3不同分型间的交叉保护性较差有关，亚临床症状的成牛作为潜在的病原携带体应得到重视[26,27]。该病作为一种接触性传染疾病，可通过呼吸道飞沫、鼻腔分泌物、泪液传播，有文献报道在公牛精液，子宫、及流产胎牛内检测到该病毒，并怀疑该病毒也可引发病牛不孕不育[28]。感染BPIV3的牛只大多呼吸道上皮会出现病变损伤，由于BPIV3能够导致机体免疫受到抑制，导致病牛抵抗3 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立力下降，多杀性巴氏杆菌、曼氏杆菌、牛支原体等常见的细菌性病原体趁机感染病牛，引起严重的呼吸系统症状如支气管炎、气管炎甚至严重的肺炎并可能导致病毒的全身性败血症[29-31]。自1959年Reisinger等首次从犊牛肾脏内首次分离到BPIV3，世界各国也相继报道出现该病毒[16,32-41]。其中美国、日本、中国、韩国、埃及已成功分离该病毒[22,41-46]。到目前为止，基因B型主要集中于澳大利亚、阿根廷、美国[15,27,47]。而基因C型则主要集中在中国，且呈现了扩散的趋势，自首次报道中国山东出现新的基因型BPIV3c以来，随后韩国、阿根廷、日本、埃及、美国也相继报道检测到了BPIV3c[27,41,43,45]。Neill对美国的部分分离株进行测序分析，指出按照基因分型TVMDL16属于BPIV3c，TVMDL15属于BPIV3b，分离时间早于中国和澳大利亚，认为BPIV3b及BPIV3c也许早就存在于美国，然而仅仅根据分离病毒时间很难说明病毒起源[27]。Benjamin等人针对阿拉巴马州中未接种疫苗的偶蹄动物进行3种基因型的BPIV3分布检测，相比BPIV3a而言，BPIV3b的阳性率有着明显的上升[48]。我国于2008年首次分离出BPIV3，此后内蒙古、黑龙江、山东、宁夏等地也相继出现报道[16,22,44,49]。血清学调查表明该病毒在我国已呈现广泛分布，其中东北、西北及养牛业发达的中部地区感染较为严重[49-51]。1.3牛副流感病毒3型诊断及防治牛呼吸道疾病病原复杂多样，具有相似的临床表现，临床诊断往往需要借助实验室检测以求得出更准确的结论。目前实验室中针对BPIV3的检测主要包括病原学检测及血清学检测。1.3.1病毒分离BPIV3一般定植于患病动物鼻咽部，随着病程发展，病毒进一步感染支气管及肺部，引发病变，也有少量国外文献报道从公牛精液及流产胎牛中分离出了该病毒，并认为BPIV3可引发牛不孕不育，BPIV3因此一般采集病牛的鼻腔分泌物（鼻拭子）和呼吸道分泌物，而对病死牛一般兽医在进行剖检时会采集牛肺脏或气管中明显病变的部位送往实验室进行进一步的病原学诊断。分离病毒时一般将病料经过无菌滤膜过滤除菌或双抗处理后，接种至传代牛肾细胞（MDBK）或原代牛肺细胞中[22,44]。病毒分离作为检测病原的诊断方法存在较大的局限性，病毒分离周期较长，Abinanti在比对BPIV3及HPIV3的生物学特性中也提到过，BPIV3首次接种于MDBK时，形成的CPE并不明显[6]，而实验室中对病毒分4 文献综述离选取连续盲传多次后往往也很难出现较明显的CPE现象，另一方面，毒株也会因运输储存病料的不正当操作，导致毒力受损，从而导致分离周期延长，甚至无法分离。BPIV3的免疫抑制作用，临床发病多为多种病原的混合性感染及继发性感染，接种的病料中常常含有多种病毒性病原，同样不利于病毒的分离。1.3.2红细胞吸附实验BPIV3感染细胞并在细胞内增殖时，被感染的细胞能够吸附一些动物的红细胞，而未受感染的细胞不具有吸附红细胞的能力，该试验常作为病毒增殖的衡量标准，尤其对于CPE现象不明显的毒株，可结合该试验判定病毒是否具有盲传下去的价值，一般经细胞扩增培养而分离获得的病毒株大多能够凝集红细胞。Zhu等人以BPIV3分离株SD0835感染牛鼻甲骨细胞后，以豚鼠红细胞悬液进行红细胞吸附实验，结果表明，该分离株具有红细胞吸附能力[16]。1.3.3聚合酶链式反应BPIV3与其他副黏病毒存在交叉免疫反应为血清学检测结果添加了不确定因素，随着分子生物学技术的发展，人们对BPIV3的研究也从血清学及病原学深入到了基因层面。聚合酶链式反应（PCR）是实验室分子生物学中诊断病原的主要方法之一。反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）作为实验室初步诊断BPIV3的依据可信度较高[52]，临床送检病料多为牛鼻拭子或病死牛的肺脏，经初步处理后，提取RNA，经反转录及PCR后，琼脂糖凝胶电泳即可观察检测结果。相对血清学检测手段，RT-PCR方法更为敏感，且检测周期短，操作更简单，参考GenBank上已发表的BPIV3序列设计针对目的基因扩增的特异性引物，以样品的cDNA为模板，进行RT-PCR扩增，通过观察扩增产物的大小及测序结果来判定样品病原中是否包含BPIV3具有较高的特异性[47]。许多国内外学者都针对BPIV3建立了RT-PCR方法，Vaucher等针对HN基因的保守区域设计了扩增产物为1009bp的特异性引物，可用于检测其他样品且特异性良好[53]。刘晓乐等针对NP基因设计特异性引物，并通过NCBI上的Primer-Blast改良PCR扩增的敏感性及特异性，并建立了RT-PCR检测方法，该方法的敏感度为10-3TCID50/0.1mL。1.3.4荧光定量PCR荧光定量PCR技术（FluorescentQuantitativePolymeraseChainReaction，Q-PCR）是通过监测PCR反应过程中所加入荧光基团的荧光信号，利用PCR过程中累积的荧光信号实现对PCR产物的实时监测，通过已知浓度的模板构建的标准曲线对未知样品进行定量分5 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立析的一种核酸定量技术。Q-PCR对模板定量的策略有绝对定量与相对定量两种，相对定量一般是应用于对比样本中目的基因相对另一参照组中目的基因的量的变化，绝对定量则是用已知拷贝数的标准品构建标准曲线，通过已知的标准曲线推算未知样品的量[54]。在PCR的反应起始的几个循环内，荧光与背景信号并不容易区分，随着反应过程的推进，PCR产物的量的不断累积，使得与之结合并激发的荧光信号越来越强，这时整个扩增过程进入了指数期，PCR产物的拷贝数与Ct值呈现良好的线性关系，随着反应的进行，体系中的酶，染料消耗殆尽，荧光信号不再随着Ct值的增加而改变，此为反应的最终的平台期[19]。早在1993年，Higuchi便提出在常规PCR中通过使用溴化乙锭对核酸实现插入染色，并改良PCR仪，以紫外光照射PCR产物，激发EB发光，并通过电荷耦合装置（CCD）照相机对产物实现检测[55]。该方法能够实现在CCD的检测限度下，精确的几率每一个PCR循环中产物的量，但由于EB并不具有特异性识别作用，一些非特异性产物或引物二聚体也会被记录在其中。随着科学技术的飞速发展及新型的荧光染料的出现，1996年由美国AppliedBiosystems公司推出实时荧光定量PCR仪（ABI17700），Heid等人也首次阐述了该技术的原理及仪器的使用方法[56]。该方法克服了传统PCR的非特异性扩增易造成假阳性的缺点，并采用了完全闭管检测，不需进行琼脂糖凝胶电泳等后续处理，与传统PCR检测技术相比，具有高效、快速、特异性强、能够做到传统PCR的定性的同时完成精确定量[29]。随着Q-PCR技术的成熟，其成本也在大幅缩减，使得该技术不仅仅在局限于科研项目的应用，能够更多的应用于临床病原检测[57-59]。市场上的Q-PCR仪主要有AppliedBiosystems公司推出的ABIprism系列，美国PE公司GeneAmp系列，Bio-Rad公司的iCycer系列，罗氏公司推出的LightCycler系列等，这些仪器大多采用基于Ct值与荧光信号的动态检测，实现实时荧光定量检测，可用于荧光染料及探针法为化学集团的Q-PCR。根据Q-PCR所应用的荧光物质不同，可将其分为染料法及探针法两大类[60]。1.3.4.1探针法荧光定量PCR探针法是指PCR体系中在加入引物的同时加入特异性的荧光探针，两端分别标记着报告荧光基团及淬灭荧光基团，是以荧光共振能量转移的原理为基础建立的Q-PCR技术。探针的种类主要包括水解探针、双探针杂交、复合型探针以及分子信标等。TaqMan探针作为水解探针的代表，也是最早应用于Q-PCR的商品化探针，其原理是利用一条能够特异性识别模板并与之互补的探针，探针的5ˊ端标记荧光报告基团，3ˊ端则标记荧光淬灭基团，6 文献综述荧光报告基团的荧光光谱和荧光淬灭基团的激发光谱相重叠，自然状态下的探针由于荧光报告基团距离淬灭基团较近，报告基团所发射的荧光能量被荧光淬灭基团作为激发能所吸收，仪器无法检测到荧光信号，随着PCR反应的进行，目的基因在链的延伸过程中，随着DNA链与探针结合，探针在Taq酶的5ˊ-3ˊ外切核酸酶的活性作用下，将结合在模板上的完整探针切断，报告基团的荧光信号不再被淬灭基团所吸收，一个单位的荧光信号就此产生，因此TaqMan探针也被称为外切核酸酶探针。2011年Horwood和Mahony首次将多重实时定量PCR应用于BRDC的检测，这也是首次将Q-PCR应用于BPIV3的检测[29]。TaqMan探针因能够特异性识别固有序列使检测方法的特异性得到了提升，另一方面位于两侧的荧光报告基团与荧光淬灭基团可能由于探针过长使基团淬灭不彻底，本底偏高，而Taq酶的外切酶的活性不高也会造成荧光信号不强，从而形成假阴性。2000年美国ABI公司推出了一种在TaqMan探针基础上改造的新型水解探针TaqMan-MGB探针，与以往荧光淬灭基团不同，3ˊMGB吸收荧光报告基团的能量后不会发光，大大降低了本底信号的强度，从而提升检测的特异性及敏感性，另一方面，探针的3ˊ端连接的小沟结合物，能够稳定探针与模板的结合，使探针的Tm值在一定程度上得到提高[61,62]。董秀梅等人针对BPIV3M基因设计特异性引物及TaqMan-MGB探针并成功建立了能够检测BPIV3c的Q-PCR方法，这也是国内首次将实时定量应用于BPIV3的检测的报道[63]1.3.4.2染料法荧光定量PCR由于探针法的成本过高，使得与溴化乙锭类似的荧光染料替代物逐渐兴起，荧光染料是能够非特异性的识别核酸，并与之结合，从而使得目的片段带有荧光信号，实现对PCR产物量的累积的实时监测。该方法也称为DNA结合染色，原理与溴化乙锭结合染色核酸相近，在激发光源的照射下，与染料结合的DNA双链会发出荧光信号，而荧光信号的强弱则代表了双链DNA的数量的多少，随着PCR反应的进行，双链DNA数量的逐步累积，染料和双链DNA分子结合越来越多。目前的已有的荧光染料分子主要包括SYBRgreenI、SYBRGreenER、PowerSYBR、LCGreenTM-1、YOYO、YO-PRO-I和BEBO、EvaGreenTM等，其中SYBRGreenI应用较为广泛。荧光染料SYBRGreenI为带有绿色激发波长的荧光素染料，只能识别DNA双链中的小沟，并与之特异性结合激发出荧光信号，而游离的SYBRGreenI几乎不会发出荧光信号，因此在一个反应体系中，荧光信号强弱可以变相的反应出DNA分子的拷贝数。1.3.5血凝性实验7 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立血凝及血凝抑制实验作为病毒学研究中较常用的检测方法之一，成本较低，操作简便，可在较短时间内获得检测结果而被广泛应用。Zhu等以豚鼠红细胞对BPIV3分离株进行血凝试验，结果表明在4℃条件下，4株分离株对豚鼠红细胞凝集效价为1:3~1:128[16]。张峣则针对分离株NX49在不同温度下分别进行了血凝实验，结果表明分离株NX49仅在4℃对豚鼠红细胞具有凝集作用，且凝集效价仅为1:4[18]。周玉龙等人分离的HJ-1株则对鸡、豚鼠、大鼠红细胞均无凝集作用，经序列比对分析，分离株与已知毒株相比，发生了7个碱基的变异，从而引发4个氨基酸的改变，可能导致了血凝素-神经氨酸酶蛋白构象的变化，使得分离株失去了血凝性[20]。由此可知，不同毒株针对豚鼠等动物的红细胞血凝作用差异较大，因此以血凝性实验进行BPIV3的病原学检测存在较大隐患。1.3.6酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种高度敏感的试验技术，自上世纪70年代初问世以来，发展迅速，目前已被广泛应用于生物学及医学科学的许多领域，作为常用的血清学检测方法之一，该方法操作简单，快速且特异性强，更适合在大规模临床样品检测中应用，是血清流行病学调查的首选技术。ELISA方法主要包括竞争ELISA、双抗体夹心ELISA和间接ELISA。直接竞争ELISA主要检测可溶性抗原，一般小分子激素、药物的检测应用较多。双抗体夹心法则是检测相应抗原，李丽阳等人以兔抗BPIV3多克隆抗体为包被抗体，抗BPIV3单克隆抗体为检测抗体建立的双抗体夹心ELISA[64]。间接ELISA方法主要针对病原抗体进行检测，从而对传染病进行诊断，流行病学调查以及牛场大规模病原检测时的病料也以血清为主，因此，间接ELISA的临床应用前景也相对更为广泛。杨建乐等人以BPIV3核衣壳蛋白（NP蛋白）与血凝素神经氨酸酶蛋白截短、串联表达重组融合蛋白建立了BPIV3抗体间接ELISA检测方法，与进口商品化试剂盒具有较高的符合率[65]。周玉龙等人利用原核表达重组HN蛋白并建立了间接ELISA方法，与VNT试验同样可体现中和抗体变化的趋势，并且敏感性更高[20]。1.3.7病毒中和试验病毒中和试验是常用于检测BPIV3的血清学诊断方法之一，也是检测BPIV3的金标准。该方法的检测结果较为准确，但试验结果常受到病毒效价、细胞丰度以及血清病毒作用时间等因素影响，对试验条件要求较高，早期的BPIV3实验室诊断大多以血清学检测为主，2012年霍志云以VNT针对内蒙、山西、吉林三省的牛群进行了BPIV3血清学调查，8 文献综述结果表明，BPIV3在我国北方三省牛群中普遍存在[50]。新建立的检测方法及技术大多以VNT方法检测方法的准确性，比对检测结果阳性率与VNT检测结果的符合率，从而对建立的新方法的可靠性进行验证。杨建乐、周玉龙、Yang等在成功建立BPIV3的ELISA检测方法后，均以VNT试验对新建立的方法的准确性进行了评估[20,65,66]。BPIV3与其他副黏病毒所存在的交叉免疫反应使得单纯依靠血清学检测并不可信，且临床检测中常常要求对多种呼吸道病原同时进行检测，以确定病因[33,67]1.3.8牛副流感病毒3型的防制措施由于该病在应激的条件下极易发生，应尽可能的减少长途运输。犊牛育成至16至19个月时进行首次配种为最佳时间，因此可以待犊牛养成至1.5岁时再运输至育成牛厂，或者育成牛厂与犊牛厂厂址选择不易过远。其次尽量坚持自繁自养的同时，严格把控种牛的引进，新引进的犊牛应注意隔离观察。BPIV3作为一种接触性传染病原，可经由空气中病牛咳出的飞沫、气溶胶甚至带有病原的微尘而感染，因此，应搞好环境卫生，严格消毒，尤其在疾病高发的秋冬季。日常的饲养管理中，应保证饲料营养均衡，给料充足，夏季注意给牛舍降温，保证通风，冬季注意保暖，提高牛群的抵抗力，从而降低易感性。由于BPIV3能够对患病牛产生免疫抑制的作用，使病牛继发致死性的肺炎，导致病牛尤其是犊牛的急性死亡，因此牛群中一旦出现BPIV3的感染，应及时将患病牛隔离，并对牛舍进行全面的消毒，并在病牛的饲料中添加抗生素，预防细菌性疾病的继发感染，此外还可用干扰素进行辅助治疗，最大限度的控制疾病的进程和蔓延。1.4研究目的与意义BPIV3作为BRDC的主要病原，会引发成牛及犊牛肺炎、支气管肺炎、并引起肺脏病变，导致病牛临床死亡或淘汰，给养牛业造成了巨大的经济损失，我国的集约化养殖模式，以及各养殖企业的管理模式等诸多因素导致BPIV3在我国的发病率居高不下。我国针对BPIV3的研究工作开展较晚，大多仍停留于实验室的研究之中，而国内目前还没有针对BPIV3有效的商品化诊断试剂盒，而国外检测试剂盒较为昂贵，使得检测该病的成本过高，不利于疾病的防治，因此建立针对BPIV3诊断技术对BPIV3的防控于有着巨大的意义。本研究以P基因为研究对象，通过序列比对分析，选取保守区域，建立Q-PCR中具有代表性的TaqMan探针法及SYBRGreenI染料法两种病原学检测方法，并对两种方法进行比较。同时本研究选取NP基因中的抗原表位区域截短构建融合蛋白NP-N-C的表达9 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立载体，以重组蛋白为诊断抗原建立检测BPIV3抗体间接ELISA方法的血清学检测方法。10 牛副流感3型Q-PCR方法的建立及应用2牛副流感3型Q-PCR方法的建立及应用2.1材料2.1.1毒株、质粒BPIV3标准毒株BN-1株（BPIV3a）、BPIV3分离毒株NX49株（BPIV3c）、BVDV、BHV-I、质粒pCI-neo、宿主菌E.coliDH5α由本实验室保存，pCI-P是以BPIV3的P基因克隆至pCI-neo质粒，经测序正确后由本实验室保存。2.1.2主要试剂TRIzol为Invitrogen公司产品，RPMIMedium1640basic为美国Gibco公司产品，四季青胎牛血清为浙江天杭生物科技有限公司产品；DNAMarker、PremixExTaq（ProbeqPCR）为TaKaRa有限公司产品，RNA提取试剂盒为康为世纪公司产品、GoTaq®GreenMasterMix为Promega公司产品，反转录试剂盒为ThermoFisherScientific公司产品，琼脂糖为HyAgarose公司产品；其他试剂均为国产分析纯。2.1.3主要仪器设备表2.1实验主要仪器设备Table2.1Themaininstrumentsandequipments仪器型号品牌二氧化碳培养箱311型美国ThermoFisherScientific公司离心机Allegra®X-15R型美国BECKMANCOULTER低温离心机CR3i美国ThermoFisherScientific公司分析天平AR3130型美国奥豪斯仪器有限公司电热恒温培养箱DRP-9082型中国上海森信实验仪器有限公司高速冷冻离心机CR21型日本日立公司高压灭菌器MLS-3750日本三洋电机株式会社超净工作台BCN-1360B中国哈尔滨东联电子技术开发有限公司全温振荡仪HZQ-QX型中国哈尔滨东联电子技术开发有限公司加热磁力搅拌器EMS-9A型中国天津市欧诺仪器仪表有限公司四维旋转仪BE-1100型中国海门市其林贝尔仪器制造有限公司电泳仪DYY-6C型中国北京六一仪器厂水平摇床WD-9405B型中国北京六一仪器厂转移微型翘板摇床BETS-M5型中国海门市其林贝尔仪器制造有限公司半干式转移电泳槽ST-Ⅱ型中国大连竟迈生物科技有限公司垂直电泳槽VE-180中国上海天能科技有限公司Real-TimeSystemPCR仪CFX96TM美国伯乐公司11 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立表2.2BPIV3参考毒株及基因登录号Table2.2ThereferenceBPIV3strainsusedinthisstudyandGenBankaccessionnumbers参考毒株序列号NX49KT071671SD0835HQ530153910ND84095NM09JQ063064TVMDL15KJ647284TVMDL16KJ647285TVMDL24KJ647288TVMDL60KJ647289Q5592EU27765812Q061JX969001HS9LC0006382.2方法2.2.1引物和探针设计通过DNAStar、MEGA软件对本实验室分离的NX49株的全基因组序列以及GenBank上已公开的BPIV3毒株序列进行同源性比对分析（毒株序列号见表2.2），根据比对结果选取P基因中的保守序列，利用Oligo6.0及DNAStar中的PrimerSelect软件设计特异性引物及探针，并由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，预计扩增片段长度为125bp。TaqMan-MGB探针5ˊ端标记荧光基团为FAM，3ˊ端荧光淬灭基团为MGB，具体见表2.3。表2.3引物和探针序列Table2.3PrimersandTaqManprobeusedinthisstudy.5ˊ报告/引物Sequence（5ˊ-3ˊ）3ˊ淬灭基团RT-PFAGGACACAGAAGAGAGCACTRT-PRATTCGCCACACATACAACTCFAM/MGB探针GGGCGATTACATTATTACAG2.2.2标准品的制备2.2.2.1感受态细胞E.coliDH5α的制备1）取冻存于-80℃的E.coliDH5α的甘油菌，于不含抗生素的LB固体平板中进行划线，12 牛副流感3型Q-PCR方法的建立及应用37℃倒置培养12h~14h；2）挑取单个菌落，转接于2mL不含抗生素的LB液体培养基中，置于水平摇床，37℃，180r/min振摇8h；3）取振摇后的菌液，1%转接至2mL不含抗生素的LB液体培养基中，37℃，180r/min振摇14h~16h；4）取500μL振摇后的菌液转接至50mL不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振摇左右2h，测定菌液OD600达到0.4~0.6时，将装有菌液的培养瓶置于冰上快速旋转使之冷却；5）4℃，5000×g离心7min，弃掉上清收集菌体沉淀；6）将装有菌体的离心管置于冰上，以5mL冰冷的TSS缓冲液将菌体重悬，快速分装至预冷的1.5mL离心管中，每管100μL，-80℃冻存。2.2.2.2转化1）将感受态细胞DH5α置于冰上，待感受态完全融化，取1μLpCI-P、pCI-neo分别加入两只融化的感受态中；2）冰水中静置30min，42℃水浴热激90s，再次冰水中静置2min；3）加入0.8mL不含抗生素的LB液体培养基，37℃，180r/min振摇40min；4）5000×g离心4min，弃去上清后，以100μLLB重悬菌体，均匀涂布在含有100μg/mL氨苄霉素的LB平板上，于37℃倒置培养12h~14h。2.2.2.3碱裂解法小量提取质粒挑取单克隆菌落并接种至3mL含氨苄霉素100μg/mL的液体LB培养基中，37℃，180r/min振摇培养12h~16h，采用碱裂解法小量提取质粒。具体步骤如下：1）取菌液2mL，5000×g离心4min，弃去上清后，收集菌体；2）以100μLSolutionI反复吹打菌体，使之重悬；3）加入200μLSolutionII（新鲜配制），轻轻上下颠倒离心管，使溶液与菌体充分混匀，切勿剧烈振荡，冰水浴4min；4）开盖管口有拉丝出现，溶液变得清亮，此时沿管壁加入150μLSolutionIII，轻轻颠倒离心管，使溶液充分反应，切勿剧烈振荡，冰水浴静置7min；5）4℃，12000×g离心15min，上清移入新的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀；13 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立6）4℃，12000×g离心10min，弃上清，加入1mL75%乙醇；7）重复步骤（6）；8）4℃，12000×g离心10min，弃上清，沉淀置于37℃干燥，加入40μLTE缓冲液（20μg/mLRNase），37℃水浴孵育30min，于-20℃中保存。2.2.2.4重组质粒的鉴定以特异性引物RT-PF/R对重组质粒pCI-P进行PCR检测，并以空载体pCI-neo为阴性对照，对引物的特异性进行验证，PCR体系如下：2×GoTaq®GreenMasterMix12.5µL，RT-PF/R1µL，模板1µL，补加ddH2O至25µL。PCR扩增条件如下：95℃3min；95℃30s，60℃15s，72℃10s，共40个循环；72℃5min，以1%琼脂糖凝胶电泳，置于凝胶成像系统观察电泳结果。2.2.2.5标准品的稀释以ThermoNanodrop2000对重组质粒pCI-P的浓度及纯度进行鉴定，根据公式：拷贝数（copies/μL）=（重组质粒浓度ng/μL×10-9）×6.02×1023／（660×重组质粒碱基数），计算重组质粒pCI-P的拷贝数。将重组质粒按10倍梯度稀释后，使其终浓度为101~108copies/μL作为标准品于-80℃保存备用。2.2.3TaqMan荧光定量PCR体系的优化2.2.3.1引物浓度及探针浓度的优化为防止探针、引物浓度不当而引起非特异性竞争抑制，采用矩阵法优化引物及探针浓度，以104copies/μL的质粒标准品作为模板，取200nM、400nM、600nM、800nM4个引物及探针终浓度进行优化性选择，Q-PCR反应体系：2×PremixExTaq10μL，P-F/R(10μM）、探针分别取0.4μL、0.8μL、1.2μL、1.6μL，模板2μL，加入ddH2O至20μL。反应条件为：95℃2min；95℃10s，60℃40s，40个循环，优先考虑Ct值，以Ct值越小，荧光信号越强作为评判标准，选取最佳的反应引物及探针浓度。2.2.3.2退火温度的优化以104copies/μL的重组质粒pCI-P作为模板，ddH2O作为阴性对照，利用CFX96上的温度梯度功能，在55℃~62℃退火温度下进行检测，选择最佳退火温度。2.2.4TaqMan荧光定量PCR标准曲线的绘制以103~107copies/μL的重组质粒pCI-P为模板绘制标准曲线，并设置ddH2O为阴性对14 牛副流感3型Q-PCR方法的建立及应用照，采用优化后的反应体系及参数进行TaqManQ-PCR，绘制标准曲线。2.2.5SYBRGreenIQ-PCR体系的优化2.2.5.1引物浓度的优化以104copies/μL的重组质粒pCI-P作为模板，分别取200nM、400nM、600nM、800nM4个引物终浓度进行优化性选择，每个引物浓度作3个平行重复，反应体系：SYBRGreenImix（2×）10μL，上游引物/下游引物(10μM）分别取0.4μL、0.8μL、1.2μL、1.6μL，模板2μL，加入ddH2O至20μL。反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸30s，共40个循环。2.2.5.2退火温度的优化以104copies/μL的重组质粒pCI-P作为模板，ddH2O作为阴性对照，利用CFX96上的温度梯度功能，在55℃~62℃不同退火温度下进行检测，以荧光信号最强，Ct值最小，并结合溶解曲线，选取最佳退火温度。2.2.6SYBRGreenIQ-PCR标准曲线的绘制以103~107copies/μL的重组质粒pCI-P作为模板，并设置ddH2O为阴性对照，采用优化后的反应体系及参数进行SYBRGreenIQ-PCR，绘制标准曲线。2.2.7TaqMan探针法与SYBRGreenI染料法的比较2.2.7.1特异性试验提取BVDV、BPIV3a及BPIV3c的RNA并反转录成cDNA，提取BHV-I的DNA并利用建立的TaqMan探针法及SYBRGreenI染料法两种不同的Q-PCR进行检测，以ddH2O为阴性对照，验证所建立方法的特异性，并比较两者的差别。2.2.7.2重复性试验取105~107copies/μL3个浓度的重组质粒pCI-P，每个浓度做3个平行样本，分别以TaqMan探针法及SYBRGreenI染料法两种Q-PCR进行3次重复性试验，计算批内及批间Ct值的平均值、标准差、变异系数并评价两种方法的稳定性。2.2.7.3敏感性试验取101~108copies/μL的重组质粒pCI-P作为模板，进行TaqMan探针法及SYBRGreenI染料法两种Q-PCR及常规PCR检测，并比较敏感性的差异。15 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立2.2.8临床样品的检测对2016年上半年宁夏地区不同养殖场有呼吸道症状的20份牛鼻拭子进行RNA提取及反转录，以建立的两种Q-PCR方法、常规RT-PCR分别对得到的cDNA进行检测，同时将病料无菌处理后于MDBK细胞中进行病毒分离。2.3结果2.3.1标准品的制备PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，重组质粒pCI-P经PCR扩增可见125bp的目的条带（图2.1），大小与预期一致，阴性对照pCI-neo并未见非特异性扩增条带，证明设计的引物特异性良好，对质粒不存在非特异性扩增。测定pCI-P的浓度质量为91.3ng/μL，根据公式得出重组质粒的拷贝数，结果原始质粒拷贝数为1.15×1010copies/μL。MM12bp20001000500200100图2.1重组质粒pCI-P的鉴定Fig.2.1TheidentificationofrecombinantplasmidpCI-PM：DL2000Marker；1：pCI-neo；2：重组质粒pCI-PM:DL2000Marker；1:pCI-neo；2:recombinantplasmidpCI-P2.3.2TaqMan-MGB荧光定量PCR体系的优化以梯度PCR确定最佳退火温度为60℃。优化后的反应体系如下：模板2μL，上/下游引物(10μM）各0.8μL，荧光探针（10μM）1μL，PremixExTaq（2×）10μL，加入ddH2O至20μL。优化的反应条件如下：95℃2min，95℃5s，60℃30s，共40个循环。2.3.3TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线的绘制如图2.2、图2.3为TaqManQ-PCR方法的扩增曲线及标准曲线。标准曲线线性方程：Y=-3.203lgx+45.76，扩增效率为103.2%，R2为0.999，表明重组质粒在该浓度范围内具有良好的线性关系。16 牛副流感3型Q-PCR方法的建立及应用123456图2.2TaqMan荧光定量PCR的扩增曲线Fig.2.2TheamplificationplotofTaqManQ-PCR1-5：1.00×107copies/μL~1.00×103copies/μL；6：阴性对照1-5:1.00×107copies/μLto1.00×103copies/μL；6:Negativecontrol图2.3TaqManQ-PCR的标准曲线Fig.2.3ThestandardcurveofTaqManQ-PCR2.3.4SYBRGreenIQ-PCR体系的优化以梯度PCR确定最佳退火温度为60℃。优化后的反应体系如下：SYBRGreenImix（2×）5μL，上游引物/下游引物(10μM）分别取0.8μL、模板2μL，加入ddH2O至10μL。优化的反应条件如下：94℃预变性2min；94℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸30s，共40个循环。2.3.5SYBRGreenIQ-PCR标准曲线的绘制如图2.4、图2.5为TaqManQ-PCR方法的扩增曲线及标准曲线。标准曲线线性方程：Y=-3.217lgx+28.483，扩增效率为98.2%，R2为0.998，表明重组质粒在该浓度范围内具有良好的线性关系。17 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立123456图2.4SYBRGreenIQ-PCR的扩增曲线Fig.2.4TheamplificationplotofSYBRGreenIQ-PCR1-5：1.00×107copies/μL~1.00×103copies/μL；6：阴性对照1-5:1.00×107copies/μLto1.00×103copies/μL；6:Negativecontrol34567图2.5SYBRGreenIQ-PCR的标准曲线Fig.2.5ThestandardcurveplotofSYBRGreenIQ-PCR2.3.6特异性试验如图2.6、2.7特异性试验检检测结果中仅BPIV3a、BPIV3c检测结果为阳性，其余病毒检测结果均呈阴性，说明了该检测方法具有良好的特异性。123图2.6TaqManQ-PCR的特异性检测结果Fig.2.6ThespecificitytestforTaqManQ-PCR1：BPIV3a；2：BPIV3c；3：BHV-I、BVDV及阴性对照1:BPIV3a;2:BPIV3c;3:BHV-I,BVDVandnegativecontrol18 牛副流感3型Q-PCR方法的建立及应用123图2.7SYBRGreenIQ-PCR的特异性检测结果Fig.2.7SpecificitytestoftheSYBRGreenIQ-PCR1：BPIV3a；2：BPIV3c；3：BHV-I、BVDV及阴性对照1:BPIV3a;2:BPIV3c;3:BHV-I,BVDVandnegativecontrol2.3.7敏感性试验如图2.8，2.9，本研究建立的TaqManQ-PCR对标准品最小检出量为1.00×101copies/μL。SYBRGreenIQ-PCR对标准品最小检出量为1.00×103copies/μL，而常规PCR的最小检出量为105copies/μL，证明本试验建立的方法均比常规PCR方法更为敏感。A23456781BM12345678200bp100bp图2.8TaqManQ-PCR（A）与常规PCR（B）敏感性试验Fig.2.8SensitivitytestoftheTaqManQ-PCR(A)andconventionalPCR(B)1：阴性对照；2-8：重组质粒pCI-P（107~101copies/μL）；1:Negativecontrol;2-8:RecombinantplasmidpCI-P(107~101copies/μL);19 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立2345671图2.9SYBRGreenIQ-PCRFig.2.9TheresultofsensitivetestforSYBRGreenIQ-PCR1：阴性对照；2-7：重组质粒pCI-P（108~103copies/μL）；1:Negativecontrol;2-7:RecombinantplasmidpCI-P(108~103copies/μL);2.3.8重复性实验如表2.4、表2.5，重复计算得出三组平行样本的Ct值的变异系数CV均稳定小于1.5%，说明该方法具有良好的重复性及稳定性。表2.4TaqMan荧光定量PCR的重复性实验结果Table2.4TheresultofrepeatabilitytestforTaqManQ-PCR浓度批内重复Ct值批间重复Ct值Copies/μL平均值标准差CV/%平均值标准差CV/%1×10520.300.060.3020.330.140.651×10617.100.050.2917.080.110.601×10712.470.020.1612.510.070.56表2.5SYBRGreenIQ-PCR的重复性实验结果Table2.5TheresultofrepeatabilitytestforSYBRGreenIQ-PCR浓度批内重复Ct值批间重复Ct值Copies/μL平均值标准差CV/%平均值标准差CV/%1×10520.600.120.5820.680.190.921×10617.080.070.4117.240.160.931×10713.650.050.4013.040.060.462.3.9临床样品的检测结果临床样品检测结果如表2.6，两种Q-PCR检测结果阳性率均为70%（14/20），常规RT-PCR检测结果阳性率为55%（11/20），病毒分离试验阳性率同样为55%（11/20），但部分病料接种细胞病变现象并不明显，需进行连续传代。20 牛副流感3型Q-PCR方法的建立及应用表2.6Q-PCR与常规RT-PCR检测结果Table2.6ThetestresultsofQ-PCRandconventionalRT-PCR常规RT-PCR阳性阴性共计阳性11314Q-PCR阴性066共计119202.4讨论BPIV3不同基因型间的血清学交叉保护力较小，使得即使体内出现BPIV3抗体的个体，也存在二次感染的可能，且有研究表明二次感染BPIV3的病牛仍可排毒，另一方面，由于成年牛感染BPIV3所引发的症状并不明显，大多呈现亚临床症状，容易被忽略，为BPIV3的防控埋下了隐患。牛呼吸道疾病病原复杂多样，具有相似的临床表现，临床诊断往往需要借助实验室检测以求得出更准确的结论。目前实验室中针对BPIV3的检测主要包括病毒分离鉴定、中和实验、血凝抑制实验、免疫荧光实验及RT-PCR检测。病毒分离鉴定及中和实验作为传统的检测手段，适用于大部分病毒的检测，但其检测周期较长，无法对病原进行快速确诊。而BPIV3与其他副黏病毒所存在的交叉免疫反应使得单纯依靠血清学检测并不可信，且临床检测中常常要求对多种呼吸道病原同时进行检测，以确定病因[33,67]。与病毒分离及血清学诊断相比，RT-PCR具有特异性强、检测周期短等优点，但由于RT-PCR的敏感性限制，使得检测结果仍存在部分假阴性，为传染性疾病的防控埋下隐患。与之相比，Q-PCR技术具有敏感、快速、特异性强的优点，且无需像传统PCR对产物进行琼脂糖凝胶电泳等后续处理，避免了过多人为因素对实验结果的影响，使得实验结果更准确，一目了然，更适合于病原的快速诊断。目前，Q-PCR主要分为染料法及探针法，其中SYBRGreenI作为应用较为普遍的染料法，最大的优点在于其可以与任意引物、模板相配合，从经济角度考虑，SYBR法比探针法更为经济，但由于SYBR染料能与所有双链DNA结合，使得引物二聚体或其他外源基因的污染均有可能影响到检测方法的特异性与重复性，通常SYBR法会结合溶解曲线分析对引物二聚体的问题加以解决，进而区分特异性和非特异性扩增[68]。2011年Horwood和Mahony建立了BVDV、BPIV3及BHV-I多重实时定量PCR方法应用于BRDC的检测，这也是首次将Q-PCR应用于BPIV3的检测[32]。董秀梅等人针对BPIV3M基因设计特异性引物及TaqMan-MGB探针并成功建立了能够检测BPIV3c的21 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立Q-PCR方法，这也是国内首次将Q-PCR应用于BPIV3检测的报道[63]。目前实验室针对临床样品检测大多使用RT-PCR，与传统PCR方法相比，Q-PCR具有更高的敏感性，张田生针对猪流行性腹泻病毒同时建立RT-PCR、TaqMan-MGBQ-PCR、SYBRGreenIQ-PCR三种不同的检测方法，并对其敏感性比较，实验结果表明SYBRQ-PCR的最小检出量达到103copies/μL，TaqMan-MGB探针Q-PCR的最小检出量达到101copies/μL，常规PCR的最小检出量达到105copies/μL，由此可看出，Q-PCR在敏感性上具有较大的优势。本研究参考GenBank已公布的BPIV3全序列，针对BPIV3P基因高度保守区域设计特异性引物及TaqMan-MGB探针并建立了TaqMan探针法及SYBRGreenI荧光染料法两种不同的Q-PCR检测方法。TaqMan探针法无论在批间还是批内的重复性均优于SYBR荧光染料法，敏感性高于SYBRGreenI100倍，更适用于科研中对基因的高精度定量分析。由于成本的原因，已建立好的Q-PCR方法很少真正能应用于临床样本的检测。本研究建立的SYBR荧光染料法以10μL的反应体系进行Q-PCR时仍能表现出较好的重复性与敏感性，将该检测方法应用于临床病料的检测中能够以相对较小的成本将检测结果的准确度大幅度提升。将本研究中所设计的RT-PF/R及探针与GenBank上已公布的BPIV3b序列进行比对分析，结果表明本研究使用的引物及探针所识别区域在已公布的BPIV3b序列中同样高度保守，证明本研究所建立的两种Q-PCR均具有检测3种不同基因型的BPIV3的潜力，为疾病的早期诊断、病毒定量及致病机理研究提供了更为稳定、可靠的方法。22 重组蛋白NP-N-C的表达3重组蛋白NP-N-C的表达3.1材料3.1.1病毒、细胞、质粒及菌种BPIV3cNX49株、菌株E.coliDH5α及E.coliBL21（DE3），原核表达质粒pET-28a均由黑龙江八一农垦大学预防实验室保存，MDBK细胞购自和元生物技术（上海）有限公司。3.1.2主要试剂RPMIMedium1640basic（1×）为美国Gibco公司产品；四季青胎牛血清为浙江天杭生物科技有限公司产品；胰蛋白酶-EDTA为北京索莱宝科技有限公司产品；TRIzol、Ni-NTAPurificationSystem为美国Invitrogen公司产品；RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit、蛋白质Marker、限制性内切酶NdeI、BamHI、SacI、HindⅢ为美国ThermoFisherScientific公司产品；Wizard®SVGelandPCRClean-UpSystem为美国Promega公司产品；辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗牛IgG为Sigma公司产品；PrimeSTARTMHSDNAPolymerase及DNAMarker为日本TaKaRa公司产品；琼脂糖为HyAgarose公司产品；其他试剂均为国产分析纯。3.1.3主要仪器主要仪器见表2.13.2方法3.2.1引物设计与合成参考NCBIGenBank已发表的BPIV3NX49株全序列（KT071671），利用DNASTAR中软件的Protean程序对NP蛋白进行抗原表位分析，确定NP蛋白的N端8aa~156aa（NP-N）及C端368aa~507aa（NP-C）为优势抗原区，利用DNASTAR5.0及Oligo6设计两对特异性引物，于NP-N的上、下游引物中分别引入NdeI及BamHI限制性酶切位点，于NP-C的上下游引物中分别引入SacI、HindⅢ限制性酶切位点。NP-N片段上游引物序列：ATTCATATGTTCAGTGCACGCAGGCAGGAA；NP-N下游引物序列：ATCGGATCCAAGATCTTCAATTGTGGAGGTGC，扩增片段长度为447bp；NP-C片段上游引物序列：ATTGAGCTCGCACGTGACGCCGAGTCA，NP-C片段下游引物序列：ATCAAGCTTTTAGTCATCTATCTCAGTCTGGTCAGC，扩增片段长度为420bp。引物由北京华大基因公司合成。23 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立3.2.2细胞的培养及病毒的扩增3.2.2.1细胞培养将MDBK细胞以含有5%胎牛血清，1%青-链双抗的RPMI1640培养基进行培养，培养条件为5%CO2，37℃，待细胞铺满培养瓶表面，弃掉培养基，以PH为7.2的PBS清洗细胞表面3次。弃掉PBS，加入胰蛋白酶，晃动培养瓶，使胰蛋白酶均匀分布在细胞表面，待细胞培养层呈现雾状，弃掉胰蛋白酶，加入上述培养基，将细胞吹打均匀，显微镜下观察细胞是否分散均匀。取少量细胞进行台盼蓝染色，调整细胞浓度，对细胞进行分瓶培养。细胞培养过程需全程无菌操作，防止由于操作不当导致细胞污染。3.2.2.2病毒的扩增待MDBK细胞长至75cm2细胞瓶的80%时，PBS洗涤细胞表面3次，弃掉PBS。室温解冻病毒液，将1mL病毒液加入至培养瓶内，转动培养瓶，使病毒液均匀覆盖在细胞表面，于37℃恒温培养箱中孵育1~2h，每隔20min转动培养瓶一次，孵育完成后，弃掉病毒液，加入15mL无血清、含1%青-链双抗的RPMI1640培养基，于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养3~4d，并设置空白对照，待接毒培养瓶内细胞CPE达到80%~90%时，即可收毒，将培养瓶置于-80℃超低温冰箱中冻存，反复冻融接种病毒的细胞3次，使细胞完全破裂，病毒释放，转移至15mL离心管中，1500×g离心5min，将上清分装至新的无菌离心管中，于-80℃超低温冰箱中保存备用。3.2.3TRIzol法提取RNA1）取300μLNX49株病毒液至无RNase的离心管中，加入500μLTRIzol并快速振荡1min，冰上静置15min；2）加入350μL氯仿，快速振荡1min，冰上静置10min，氯仿沸点较低，操作中应小心管盖爆开；3）4℃，12000×g离心15min，取上层液置于新的无RNase离心管中，加入2倍体积的已预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，于-20℃静置2h，沉淀RNA；4）4℃，12000×g离心15min，弃上清，加入1mL已预冷的75%乙醇，颠倒离心管，洗涤沉淀；5）重复步骤4；6)弃去上清，以无RNase的白枪头沿管壁吸去多余乙醇，于超净台中干燥40min~60min，待RNA干燥完全，加入40μLRNasefreewater，轻柔吹打至充分混匀，操作时注意24 重组蛋白NP-N-C的表达不要引入外源RNA酶。3.2.4反转录向无RNasePCR管中加入TotalRNA4μL，RandomHexamerPrimer（100μM）1μL，RNasefreewater7.5μL，旋涡振荡混匀，瞬时离心，65℃水浴5min后，置于冰上迅速冷却，向PCR管中加入5×ReactionBuffer4µL，dNTPMixture（10mM）2µL，RevertAidReverseTranscriptase（200U/µL）1µL，RibLockRNaseInhibitor（40U/µL）0.5µL。旋涡振荡混匀，瞬时离心，进行反转录第二步，42℃水浴反应2h，70℃反应5min，终止反应，置于冰上迅速冷却。此时即获得BPIV3cDNA，放入-20℃或-80℃保存备用。3.2.5PCR扩增以NP-N-F/R及NP-C-F/R为引物，分别对BPIV3的cDNA进行PCR扩增，具体操作如下：向PCR管中加入5×PrimeSTAR®Buffer（Mg2+plus）10µL，dNTPMixture(10mM)5µL，上、下游引物各1µL，PrimeSTAR®HS（2.5U/µL）0.5µL，补加ddH2O至50µL。PCR扩增条件为：预变性98℃3min；变性98℃10s，退火60℃10s，延伸72℃1min，变性、退火、延伸35个循环；最终延伸72℃10min，PCR产物以1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。3.2.6PCR产物的纯化与回收1）以1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，电泳条件110V35min，紫外灯下照射，分别切下目的带凝胶，放入1.5mL离心管中，做好标记，去皮称重；2)根据Wizard®SVGelandPCRClean-Upsystem试剂盒说明书计算所需溶液量，每10mg凝胶中需加入10µLBindingSolution；3）65℃水浴中溶解胶块，每间隔1min混匀一次，直至胶块完全溶解，旋涡振荡混匀。4）待溶液冷却至室温，将溶解的凝胶混合液加入SV微型柱中；5）室温条件下，12000×g离心1min，弃掉收集管中的废液，将SV微型柱重新放入收集管中；6）向SV微型柱内加入700μLMembraneWashSolution（使用前添加无水乙醇）。12000×g离心2min，弃掉收集管中的废液，将SV微型柱重新放入收集管中；7）向SV微型柱内加入500μLMembraneWashSolution，12000×g离心2min；8）弃掉收集管中废液，将SV微型柱置于离心管内，室温条件下，12000×g离心3min，将SV微型柱置于超净台晾干，以除去微型柱中残留的乙醇；9）将晾干的SV微型柱置于一个新的1.5mL离心管中，向微型柱中加入50μL预热25 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立的ddH2O，室温放置2min~3min，12000×g离心3min，为增加目的片段的回收率，可重新将洗脱下来的溶液加入SV柱中进行二次离心回收；10）1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，置于凝胶成像系统下观察；11）纯化后的胶回收产物储存于-20℃或-80℃中保存备用。3.2.7pET-28a-NP-N表达质粒的构建3.2.7.1纯化后PCR产物NP-N和pET-28a的双酶切对纯化后PCR产物NP-N和质粒pET-28a分别进行双酶切，纯化后PCR产物NP-N双酶切体系：10×TangoBuffer10.0µL，NP-N25µL，NdeI2.0µL，BamHI2.0µL，补加ddH2O至50µL；pET-28a双酶切体系：10×TangoBuffer10.0µL，pET-28a15µL，NdeI2.0µL，BamHI2.0µL，补加ddH2O至50µL；水浴37℃双酶切8h。3.2.7.2NP-N与pET-28a酶切产物的纯化将NP-N双酶切产物和质粒pET-28a双酶切产物分别进行1%琼脂糖凝胶电泳，110V，35min，进行切胶纯化，Wizard®SVGelandPCRClean-Upsystem试剂盒进行回收，回收步骤与3.2.6相同。3.2.7.3NP-N与pET-28a连接将片段NP-N与质粒pET-28a进行连接，体系如下：10×T4DNALigaseBuffer1.0µL，pET-28a双酶切回收产物2.0µL，NP-N双酶切回收产物6.5µL，T4DNALigase（30U/µL）0.5µL，总体积共10µL。反应条件：16℃连接过夜。连接产物转化至感受态细胞E.coliDH5α中，以含有35µg/mL的卡那霉素的LB平板筛选阳性菌落，于37℃，倒置过夜培养，分别挑取单个菌落于2mL含有卡那霉素35µg/mL的液体LB培养基中，37℃，180r/min，振摇培养8h。3.2.8重组质粒pET-28a-NP-N的鉴定3.2.8.1菌液PCR鉴定以NP-N-F/R为引物，以振摇8h的菌液为模板，进行PCR鉴定，具体操作如下：向PCR管中加入2×GoTaq®GreenMasterMix12.5µL，NP-N-F/R1µL，菌液1µL，补加ddH2O至25µL。PCR扩增条件为：95℃3min；95℃10s，60℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃10min。以1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，置于凝胶成像系统下观察结果。26 重组蛋白NP-N-C的表达3.2.8.2重组质粒的双酶切鉴定将鉴定为阳性的菌液1%转接至3mL含有卡那霉素35µg/mL的液体LB培养基中，37℃，180r/min振摇培养12h~14h，以碱裂解法提取质粒，并以双酶切法进一步验证重组质粒是否连接正确，pET-28a-NP-N双酶切体系：10×TangoBuffer4µL，pET-28a-NP-N10µL，NdeI1µL，BamHI1µL，补加ddH2O至20µL；37℃孵育6h，以1%琼脂糖凝胶对pET-28a-NP-N双酶切产物进行电泳，置于凝胶成像系统下观察结果，将鉴定结果正确的质粒命名为pET-28a-NP-N。3.2.9pET-28a-NP-N-C表达质粒的构建3.2.9.1纯化后PCR产物NP-C和质粒pET-28a-NP-N的双酶切将纯化后PCR产物NP-C与质粒pET-28a-NP-N分别进行双酶切，纯化后PCR产物NP-C双酶切体系：10×TangoBuffer5.0µL，NP-C10µL，SacI2µL，HindⅢ2µL，补加ddH2O至50µL；质粒pET-28a-NP-N双酶切体系：10×TangoBuffer5.0µL，pET-28a-NP-N10µL，SacI2µL，HindⅢ2µL，补加ddH2O至50µL，37℃进行酶切过夜。3.2.9.2NP-C与质粒pET-28a-NP-N酶切产物的纯化以1%琼脂糖凝胶对NP-C双酶切产物和质粒pET-28a-NP-N双酶切产物分别进行电泳，进行切胶纯化，并应用Promega的Wizard®SVGelandPCRClean-Upsystem试剂盒进行回收，步骤与3.2.6相同。3.2.9.3NP-C与质粒pET-28a-NP-N连接将片段NP-C连接到pET-28a-NP-N表达质粒上，体系如下：10×T4DNALigaseBuffer1.0µL，质粒pET-28a-NP-N双酶切回收产物2.0µL，NP-C双酶切回收产物6.5µL，T4DNALigase（30U/µL）0.5µL，总体积共10µL。反应条件：16℃连接6h，连接产物转化至感受态细胞E.coliDH5α中，以含有35µg/mL的卡那霉素的LB平板筛选阳性菌落，37℃倒置过夜培养，分别挑取单个菌落接种于2mL含有35µg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，180r/min，振摇培养8h。3.2.10重组质粒pET-28a-NP-N-C的鉴定3.2.10.1菌液PCR鉴定以振摇8h的菌液为模板，以特异性引物NP-C-F/R及通用引物T7promoter/terminatorprimer分别进行PCR鉴定，具体操作如下：向PCR管中加入2×GoTaq®GreenMasterMix27 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立10µL，上游引物1µL，下游引物1µL，菌液1µL，补加ddH2O至20µL。扩增条件为：预变性95℃3min；变性95℃10s，退火60℃30s，延伸72℃1min，变性、退火、延伸共35个循环；最终延伸72℃10min。以1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，置于凝胶成像系统下观察结果。3.2.10.2重组质粒的双酶切鉴定将鉴定为阳性的菌液1%转接至3mL含有卡那霉素35µg/mL的液体LB培养基中，37℃，180r/min，振摇培养12h~14h，以碱裂解法提取质粒，并以双酶切法近一步验证重组质粒是否连接正确，pET-28a-NP-N-C双酶切体系：10×TangoBuffer4µL，pET-28a-NP-N-C10µL，NdeI1µL，HindⅢ1µL，补加ddH2O至20µL；37℃孵育10h。以1%琼脂糖凝胶对pET-28a-NP-N-C双酶切产物进行电泳，置于凝胶成像系统下观察结果，将鉴定结果正确的质粒命名为pET-28a-NP-N-C。3.2.11重组蛋白的诱导表达及诱导条件的优化3.2.11.1重组质粒pET-28a-NP-N-C的诱导表达将重组质粒pET-28a-NP-N-C及质粒pET-28a以化学转化法分别转至表达宿主菌E.coliBL21（DE3）中，涂布于含卡那霉素35mg/mL的LB培养基平板，制备BL21（DE3）感受态细胞方法及转化步骤参照2.2.2.1及2.2.2.2，不同之处在于BL21（DE3）生长较快，一般于37℃培养10h左右，即可挑取阳性菌落。1）挑取阳性菌落，分别转接至3mL含有35μg/mL卡那霉素的LB培养基中，做好标记，37℃，180r/min培养12h~16h；2）1%转接至3mL含有35μg/mL卡那霉素的LB培养基中，以37℃180r/min的培养条件，测得菌液OD600值在0.4~0.6即可，向菌液中加入IPTG至终浓度为1.0mM诱导蛋白表达，37℃继续震荡培养4h，并以BL21（DE3）pET-28a诱导组作为对照组；3）取诱导后的E.coliBL21（DE3）-pET-28a-NP-N-C及E.coliBL21（DE3）-pET-28a的菌液各3mL，6000×g离心7min，弃掉上清收集菌体；4）以1mLPBS将菌体重悬，6000×g离心7min，此步骤可重复2~3次；5）加入150μLBugBuster®MasterMix，反复吹打使菌体，使之重悬，将重悬的菌体置于四维旋转混匀器颠倒混匀10min~20min，菌液变得粘稠即可；6）4℃，12000×g离心20min，将上清转移至新的离心管，沉淀以150μLBugBuster®MasterMix重悬；28 重组蛋白NP-N-C的表达7）以Nanodrop2000测定表达产物浓度。3.2.11.2重组蛋白的Glycine-SDS-PAGE分析1）对重组蛋白进行Glycine-SDS-PAGE分析，以pET-28a为对照组。将5×SDS-PAGELoadingBuffer（内含5%β-巯基乙醇）分别与收集的菌体裂解上清及沉淀按照1:4的比例混合，沸水浴10min，冰上冷却；2）选取1.5mm的胶板，以制胶架固定，以水对其进行验漏；3）根据蛋白大小确定分离胶及浓缩胶的浓度。配制12%的下层分离胶，具体配方如下：ddH2O2.4mL，30%丙烯酰胺溶液3mL，1.5M的Tris（PH8.8）1.95mL，10%SDS75μL，10%过硫酸铵75μL，TEMED3μL；4）弃掉玻璃板内的水，加入6mL下层分离胶溶液，并以水或者无水乙醇压平液面，需注意因为水能够进入分离胶内，故以水封压液面时，应缓慢均匀的加入；5）将分离胶置于室温下凝固30min或置于37℃凝固20min后，此时分离胶与水界面形成一条明显的分界线，将水弃掉，并用滤纸轻轻吸干胶体表面的水。配制5%浓缩胶，具体配方如下：ddH2O1.4mL，30%丙烯酰胺溶液0.33mL，1.5M的Tris（PH6.8）0.5mL，10%SDS40μL，10%过硫酸铵40μL，TEMED3μL。加入5%浓缩胶溶液2mL，迅速插入1.5mm，10孔梳子；7）待凝胶完全凝固后，放至电泳槽，加入电泳缓冲液，将梳子垂直拔出，根据测定的蛋白浓度计算每孔加样量，每孔加入蛋白含量20μg左右即可；8）开启电源，电压调至90v，待蛋白条带进入分离胶时，调整电压至120v，直到LoadingBuffer跑出分离胶，即可停止电泳；9）电泳结束后切下分离胶，置于染色液考马斯亮蓝R-250中，水平摇床染色1h~2h，至胶体呈现均匀的蓝色即可；10）将胶体取出，置于考马斯亮蓝染色-脱色液中，水平摇床脱色数小时，直至显现较清晰的蛋白条带。3.2.11.3诱导表达的温度及时间的优化将E.coliBL21（DE3）-pET-28a-NP-N-C及E.coliBL21（DE3）-pET-28a以1%的比例分别转接至3mL含有35μg/mL卡那霉素的LB培养基中，做好标记，37℃，180r/min培养12h~16h，将过夜活化的菌液1%转接至含有35μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃180r/min进行培养，当菌液的OD600值在0.4~0.6时，向菌液中加入至终浓度为1.0mM29 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立的IPTG，并设置未诱导组，选取16℃、25℃、33℃、37℃，共4个温度梯度，180r/min诱导蛋白表达。其中，16℃、25℃诱导组于诱导6h、8h、10h、12h后各取2mL菌液，33℃、37℃诱导组于诱导2h、4h、6h、8h后各取2mL菌液，将所取菌液以BugBuster®MasterMix处理为上清、沉淀，并进行Glycine-SDS-PAGE电泳，具体操作参考3.2.11.2，对电泳结果进行分析，选取重组蛋白可溶性表达、表达量最大的温度及诱导时间作为最佳诱导温度及诱导时间。3.2.11.4诱导剂IPTG浓度的优化将E.coliBL21（DE3）-pET-28a-NP-N-C及E.coliBL21（DE3）-pET-28a以1%的比例分别转接至3mL含有35μg/mL卡那霉素的LB培养基中，做好标记，37℃，180r/min培养12h~16h，将过夜活化的菌液1%转接至含有35μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃180r/min进行培养，当菌液的OD600值在0.4~0.6时，分别向菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、1.0mM，在最佳诱导温度、最佳诱导时间的条件下，以180r/min，诱导蛋白的表达，取以不同浓度IPTG诱导组的菌液各2mL，将所取菌液以BugBuster®MasterMix处理为上清、沉淀，并进行Glycine-SDS-PAGE结果进行分析，并进行Glycine-SDS-PAGE分析，具体操作参考3.2.11.2，对电泳结果进行分析，选取重组蛋白可溶性表达、表达量最大的温度及诱导时间作为加入的诱导剂最佳浓度。3.2.12重组蛋白的大量表达3.2.12.1菌体的裂解a）以优化后的培养条件制备新鲜的BL21（DE3）-pET-28a-NP-N-C菌液3L。b）6000×g，4℃，离心20min，弃掉上清，收集菌体沉淀。c）以PBS反复吹打菌体，使之重悬，洗涤菌体，6000×g，4℃，离心3min，收集菌体，此步骤可重复2~3次。d）向菌体沉淀中加入变性结合缓冲液，体积相当于原菌液的1/5，反复吹打菌体，使之充分重悬。e）冰浴，超声破碎条件为：300w，超声时间5s，冰上静置10s，每次超声10min，重复3次。f）4℃，10000×g，离心20min，收集沉淀。3.2.12.2包涵体洗涤与溶解a）用PBS对离心收集的沉淀洗涤，反复吹打沉淀，直至沉淀完全分散；30 重组蛋白NP-N-C的表达b）4℃，10000×g，离心20min，收集沉淀，用2M的尿素洗涤沉淀两次，方法同上，用4M尿素对沉淀进行最后的洗涤；c）用8M尿素将沉淀置于冰上重悬，反复吹打溶液，直至包涵体完全溶解，4℃，10000×g，离心20min，收集上清于-80℃保存，以上步骤在冰上进行，以免蛋白降解。3.2.13重组蛋白的纯化与定量3.2.13.1纯化柱的准备采用Ni-NTA纯化系统（Invitrogen）对重组蛋白进行纯化。1）温和颠倒Ni-NTA树脂并轻敲瓶身，使Ni-NTA琼脂糖混匀；2）倾倒2mL的树脂至10mL的纯化柱中，使树脂在重力作用下自然下沉，待树脂沉淀完全后，（此过程约7-10min），轻柔的将上清液吸出，勿吹动树脂；3）向纯化柱中加入6mL已灭菌的去离子水，轻柔的上下颠倒纯化柱数次使树脂重悬；4）待树脂在重力的作用下再次自然下沉后，轻柔的将上清液吸出；5）向纯化柱中加入6mL变性结合缓冲液，轻柔的颠倒纯化柱使树脂重悬；6）待树脂在重力的作用下自然下沉后，轻柔的吸出上清液；7）重复步骤上述步骤三次。3.2.13.2蛋白的纯化1）向上步准备好的纯化柱中加入8mL处理过的包涵体蛋白，将柱子固定在低速振荡器上，于4℃，结合30min~60min；2）将纯化柱垂直固定好，待树脂在重力的作用下自然的下沉，小心吸出上清；3）向纯化柱中加入4mL变性结合缓冲液，轻轻摇动柱子2min，使树脂重悬，待树脂在重力作用下自然下沉，小心吸出上清；4）向纯化柱中加入4mL变性洗涤缓冲液（pH6.0），轻轻摇动柱子2min，使树脂重悬，待树脂在重力作用下自然下沉，小心吸出上清；5）向纯化柱中加入4mL变性洗涤缓冲液（pH5.3），轻轻摇动柱子2min，使树脂重悬，待树脂在重力作用下自然下沉，小心吸出上清；6）重复步骤4）；7）将纯化柱垂直固定，去除下方的盖子。向纯化柱中加入5mL洗脱缓冲液将蛋白从纯化柱中洗脱。每洗脱1mL需测定OD280检测蛋白的洗脱效果，以复性液对纯化后的蛋白进行复性，并对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，检测纯化效果。31 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立3.2.13.3纯化后重组蛋白的定量以Thermo的CoomassiePlusTM（Bradford）AssayKit对纯化后的蛋白进行定量。使用前先将CoomassiePlusReagent溶液轻轻颠倒混匀（切勿剧烈摇晃），参照表3.1制备相应浓度的蛋白标准品。向96孔微型板中加入150μL蛋白标准品或待测样品，每孔滴加150μLCoomassiePlusReagent，并轻轻的晃动微型板以混匀液体。将微型板于室温放置10min后，测定OD595。将得到的样品与空白对照组的OD595值做差。以BSA标准品浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制出BSA组的蛋白浓度标准曲线。通过每组待测蛋白对应在标准曲线上的点来确定对应待测样品的浓度。表3.1BSA标准品的制备Table3.1ThepreparationofBSAstandardBSA终浓度分组稀释液体积（μL）BSA来源BSA体积（μL）（μg/mL）10原液30020002125原液37515003325原液32510004175B组稀释后溶液1757505325C组稀释后溶液3255006325E组稀释后溶液3252507325F组稀释后溶液3251258400G组稀释后溶液100259400无0空白对照3.2.14重组蛋白的Western-blotting分析以BPIV3NX49株全病毒蛋白为阳性对照，以1.5mm的12%分离胶，5%浓缩胶对纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳结束后切下分离胶，进行Western-blotting分析。具体步骤如下：1）切去多余的凝胶，以需进行转膜的凝胶大小为准，对PVDF膜、滤纸进行裁剪。将PVDF膜置于已预冷的无水甲醇中浸泡10min；2）将PVDF膜、滤纸、凝胶置于已预冷的转膜缓冲液中浸泡5min~10min即可；3）转膜：将浸泡好的PVDF膜、滤纸、凝胶依次叠放在半干转膜仪中，叠放次序按照从下到上的顺序为：滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸。将气泡以滚轮赶尽，吸走多余的转膜液，以免造成短路，接通电泳仪，电压调至15v，定时45min；4）洗膜：将PVDF膜置于已预冷的PBST中，置于水平摇床，洗涤5min，重复2~332 重组蛋白NP-N-C的表达次；5）封闭：5%脱脂乳浸泡PVDF膜，37℃孵育2h；6）洗膜：重复步骤4）；7）一抗：将BPIV3阴、阳性血清进行1:100倍稀释，将PVDF膜置于其中，37℃孵育2h或者4℃孵育16h均可；8）洗膜：重复步骤4）；9）二抗：以5%脱脂乳对兔抗牛IgG辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体进行1:5000倍稀释，将PVDF膜置于其中，37℃孵育1h~2h；10）洗膜：重复步骤4）；11）显色：参照说明书将DAB显色液A、B按比例混匀（配制后需在6h内使用），放入PVDF膜，一般显色3min~5min即可，以蒸馏水终止显色。3.3结果3.3.1抗原表位的预测分析抗原表位预测结果如图3.1，根据抗原性、亲水、疏水区的分布以及抗原表位的分布等几个方面进行分析，结果表明NP蛋白的8aa~156aa（NP-N）及C端368aa~507aa（NP-C）两段抗原表位区具有较高的抗原性，分别命名为NP-N及NP-C。图3.1BPIV3NP蛋白抗原表位筛选Fig.3.1ThescreeningantigenepitopeareaofBPIV3NPprotein3.3.2目的基因NP-N及NP-C的扩增PCR产物进行电泳检测。得到大小分别为447bp及420bp的特异性条带，与片段预期大小相符，结果如图3.2。33 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立bpM12320001000750500250100图3.2目的基因的PCR扩增Fig.3.2AmplificationoftargetgenesbyPCRM：DL2000Marker；1：阴性对照；2：NP-N；3：NP-C；M:DL2000Marker；1:Negativecontrol1:NP-N；2:NP-C3.3.3原核表达重组质粒的鉴定以特异性引物NP-N-F/R、NP-C-F/R及载体通用引物T7promoter/terminatorprimer分别对重组菌进行菌液PCR鉴定，得到大小分别为447bp、420bp、1146bp条带，与片段预期大小相符，结果如图3.3。测序结果表明重组质粒中的目的基因与NX49株基因组序列素编码的核苷酸、氨基酸的同源性均为100%，不存在突变移码等现象，可以应用于原核表达。bpM123420001000750500250100图3.3目的基因的PCR扩增Fig.3.3AmplificationoftargetgenesbyPCRM：DL2000Marker；1：阴性对照；2：pET-28a-NP-N；3：pET-28a-NP-N-C特异性引物鉴定；4：pET-28a-NP-N-C通用引物鉴定M:DL2000Marker；1:Negativecontrol;2:ThespecificprimersidentificationofpET-28a-NP-N；3:ThespecificprimersidentificationofpET-28a-NP-N-C;4：TheUniversalprimersidentificationofpET-28a-NP-N-C3.3.4重组蛋白的诱导表达形式的鉴定34 重组蛋白NP-N-C的表达Glycine-SDS-PAGE电泳结果如图3.4，得到42Ku的蛋白条带，比预期大小相符，并以包涵体的形式表达，同时于35Ku处出现一条带，需进一步鉴定。M1234100705535251510图3.4重组蛋白的Glycine-SDS-PAGE分析Fig.3.4TheGlycine-SDS-PAGEanalysisofrecombinantproteinM：蛋白Marker；1：对照组诱导后菌体裂解上清；2：对照组诱导后菌体裂解沉淀；3：重组菌诱导后菌体裂解上清；4：重组菌诱导后菌体裂解沉淀M:ProteinMarker；1:Thesupernatantoflysateofcontrolgroupafterinduction;2:Theprecipitationoflysateofcontrolgroupafterinduction;3:Thesupernatantoflysateofrecombinantbacteria4：Theprecipitationoflysateofrecombinantbacteria;3.3.5重组蛋白表达条件的优化对重组蛋白NP-N-C的诱导温度、诱导时间、诱导剂的浓度三个表达条件进行优化，获得使重组蛋白的表达量最高的诱导条件，最终确定IPTG浓度为0.8mM，诱导温度为37℃，诱导时间为6h时，重组蛋白的表达量最高。3.3.6重组蛋白的纯化及浓度的测定重组蛋白经Ni-NTA纯化系统纯化后于42Ku及35Ku出现条带，结果见图3.5，以CoomassiePlusTM（Bradford）AssayKit测定纯化的重组蛋白浓度，重组蛋白的浓度约为121μg/mL。35 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立KuM12501301007055352515图3.5纯化后重组蛋白的Glycine-SDS-PAGE分析Fig.3.5TheGlycine-SDS-PAGEofpurifiedrecombinantproteinM：蛋白质Marker；1：纯化后的重组蛋白M:ProteinMarker；1:purifiedrecombinantprotein3.3.7重组蛋白的WesternBlot鉴定WesternBlot结果表明重组蛋白能与BPIV3阳性血清反应，同时重组蛋白的35Ku处条带也能与BPIV3阳性血清反应，与全病毒蛋白对照组反应结果相符，结果见图3.6。KuM1237055352515图3.6重组蛋白Westernblot分析Fig.3.6TheWesternblotanalysisofrecombinantproteinM：蛋白质；1：重组蛋白与BPIV3阴性血清反应；2：重组蛋白与BPIV3阳性血清反应；3：BPIV3全病毒蛋白与BPIV3阳性血清反应M:ProteinMarker；1:hereactionofrecombinantproteinwithBPIV3negativeserum;2:ThereactionofrecombinantproteinwithBPIV3positiveserum3:TheBPIV3proteinwithBPIV3positiveserum3.4讨论BPIV3作为BRDC的主要病原之一，严重危害着舍饲牛的健康，截至目前，BPIV3已被报道的基因型有3种，即BPIV3a、BPIV3b及BPIV3c。据以往文献报道，我国目前分离36 重组蛋白NP-N-C的表达到的毒株只有A、C两个型，且C型为我国首次报道的基因型，尽管有学者指出按照基因分型同属于BPIV3c的美国分离株TVMDL16的分离时间早于我国首次分离的BPIV3山东分离株SD0835，但结合已有文献报道可知，BPIV3c在我国已呈现扩散趋势。本实验室保存的宁夏分离株NX49经测序分析鉴定为BPIV3c，且近两年本实验室从内蒙、黑龙江、宁夏分离的病料以分型引物初步鉴定也多以C型为主，董秀梅等人以SD0835株为研究对象，与不同基因型BPIV3的M基因与HN基因进行序列分析，发现在病毒进化过程中高度保守的HN基因，与BPIV3b相比，产生了较大的差异，并推断可能是BPIV3c在我国变异进化的体现。NX49株由本实验室于2014年分离得到，并于2015年完成测序，病毒来源、背景清楚，且其基因型为我国较流行的BPIVc，在研究开展的初期，曾尝试以昆虫细胞杆状病毒真核表达系统表达糖蛋白HN，但考虑到基因B型与C型在HN基因上存在较大差异，而NP蛋白作为病毒粒子的核衣壳蛋白，与位于囊膜表面糖蛋白的HN、F相比，NP蛋白在不同毒株间相对更为保守，且该蛋白是病毒粒子中表达量最高的蛋白，更适于作为建立检测方法的候选抗原。结合抗原表位预测分析结果，初步选取NP蛋白上两段抗原表位富集区进行融合表达，并通过低温诱导、优化诱导剂浓度、更换表达宿主菌使融合蛋白可溶性表达，经过反复的优化表达条件，目的蛋白虽仍以包涵体的形式表达，但表达量得到了提升，经WesternBlot分析，表达的融合蛋白具有较好的反应原性，为下一步建立检测BPIV3抗体间接ELISA方法提供了基础。37 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立38 牛副流感病毒3型间接ELISA诊断方法的建立4牛副流感3型间接ELISA诊断方法的建立4.1材料4.1.1主要试剂BPIV3阴、阳性血清由本实验室保存，辣根过氧化酶（HRP）标记的兔抗牛IgG；其他试剂均为国产分析纯。4.1.2主要仪器主要仪器见表2.14.2方法4.2.1间接ELISA方法操作步骤1）包被：用碳酸盐包被缓冲液（CBS）将纯化的重组蛋白NP-N-C稀释至6μg/mL，包被酶标板，4℃孵育12h~16h；2）将孔内溶液弃掉，甩干，以PBST洗涤3次，每次3min；3）封闭：加入封闭液，于37℃温箱中，孵育1h~2h；4）重复步骤2）；5）加入稀释到至相应浓度的待见样品并设置空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔，每孔100μL，37℃温育1h；6）重复步骤2）；7）将HRP标记的二抗兔抗牛IgG以1:5000进行稀释，每孔加入100μL，37℃孵育1h；8）重复步骤2）；9）每孔加入新鲜配制的TMB底物显色液50μL，37℃避光孵育一定时间；10）终止：每孔加入2M硫酸50μL。测值：用酶标仪检测对应的OD450nm值。4.2.2间接ELISA方法条件的优化4.2.2.1抗原包被最佳浓度及阴、阳性血清最佳稀释倍数的优化按照间接ELISA方法进行方阵滴定试验，以CBS对纯化的重组NP-N-C蛋白进行稀释，0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL共6个梯度的稀释对阴性及阳性血清也分别作倍比稀释，稀释倍数为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320，共五个梯39 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立度稀释。每组设置三个平行重复，按照4.2.1中ELISA检测方法操作，酶标仪测定OD450。选取P/N值最大，阳性血清OD450≥1，阴性血清OD450＜0.2的稀释度组合作为抗原包被最佳浓度及阴、阳性血清最佳稀释倍数。4.2.2.2抗原最佳包被条件的确立以最佳的抗原包被浓度进行包被，分别设置4℃过夜，37℃包被1h，37℃包被2h，37℃包被1h加4℃过夜，4组不同的包被条件，每组设置三个平行重复，血清以最佳稀释度进行稀释，其余按照4.2.1中ELISA检测方法操作，酶标仪测定OD450。选取P/N值最大，阳性血清OD450≥1，阴性血清OD450＜0.2所对应的抗原包被条件作为抗原最佳包被条件。4.2.2.3封闭液最佳浓度及封闭时间的确立以最佳抗原包被浓度在最佳包被条件下进行包被，分别以2.5%、5%、10%三个不同浓度的脱脂乳在37℃的条件下封闭1h，每组设置三个平行重复。加入最佳稀释度的待检血清，酶标仪测定OD450。选取P/N值最大，阳性血清OD450≥1，阴性血清OD450＜0.2所对应封闭液浓度为封闭液的最佳浓度。设置30min、60min、90min、120min四个不同的封闭时间组，在37℃条件下封闭酶标板，每组设置两个平行重复，对封闭时间进行优化。根据选取P/N值最大，阳性血清OD450≥1，阴性血清OD450＜0.2确立最佳封闭液及封闭时间。4.2.2.4血清的最佳孵育时间的确立按照上述优化结果以最佳优化条件进行间接ELISA，对血清的最佳孵育时间进行优化，加入阴性和阳性稀释血清后，置于37℃，孵育时间分别设置30min、60min、90min、120min，其余按照4.2.1中ELISA检测方法操作，测定OD450。以P/N值最大且阳性血清OD450≥1，阴性血清OD450＜0.2时所对应的时间为血清最佳孵育时间。4.2.2.5酶标二抗的最佳工作浓度及孵育时间的确立以1:3000、1:5000、1:7000、1:10000四个不同的稀释度对辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗牛IgG进行稀释，并设置37℃作用时间30min、45min、60min，测定OD450。根据P/N值最大且阳性血清OD450≥1.0、阴性血清OD450＜0.2来确定二抗的最佳工作浓度及孵育时间。4.2.2.6最佳底物显色时间的确立40 牛副流感病毒3型间接ELISA诊断方法的建立按照上述优化结果以最佳优化条件进行间接ELISA，加入新鲜配置的TMB显色液时，以2min、4min、6min、8min、10min六个不同的时间进行TMB显色，测定OD450，根据P/N值最大且阳性血清OD450≥1.0、阴性血清OD450＜0.2来确定二抗的最佳工作浓度及孵育时间。4.2.2.7阴、阳性临界值的确立随机选取79份BPIV3阴性血清及85份BPIV3阳性血清，以优化后的最佳反应条件分别进行检测，测定OD450。采用SPSS19.0对测得的OD值进行统计学分析。通过非参数法构建ROC曲线，并以Youden指数最大的切点作为阴阳性判断的临界点，并确定该方法的特异性及敏感性。4.2.3重复性试验取同一批次包被的酶标板，随机抽取4份不同效价的阳性血清和2份阴性血清，每组3个平行重复，以ELISA筛选出的最优条件来对稀释后血清进行检测，对测定的OD450进行统计并计算变异系数，评价该方法的批内重复性。用同样的方法以不同批次包被的ELISA板，对上述6份血清进行3次批间重复检测，以ELISA筛选出的最优条件来对稀释后血清进行检测，对测定的OD450进行统计并计算变异系数，评价该方法的批间重复性。4.2.4临床样品的检测运用本研究建立的BPIV3间接ELISA方法对2016年10~12月采自宁夏、内蒙古、黑龙江不同牛场的234份临床血清样品进行抗体检测，并统计分析BPIV3抗体阳性率。4.3结果4.3.1间接ELSIA方法条件的优化结果4.3.1.1抗原的最佳包被浓度及血清的最佳稀释倍数ELSIA方阵结果如表4.1，“＋”代表检测结果为阳性，“－”代表检测结果为阴性，抗原包被浓度为4μg/mL，血清稀释倍数为1:80时，P/N值最大为7.14，且此时的阳性血清OD450≥1，阴性血清OD450＜0.2。因此确定包被抗原的最佳包被浓度为4μg/mL，血清的最佳稀释倍数为1:80。41 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立表4.1包被抗原的最佳浓度及血清的最佳稀释度Table4.1Thebestconcentrationofenvelopeantigenandthebestdilutionmultipleofserum抗原包被浓度（μg/mL）血清稀释倍数0.51248+－+－+－+－+－1:400.7630.1560.8670.1650.9460.1831.5330.2241.6570.2461:800.7540.1510.8970.1611.1570.1791.4840.1931.6270.2291:1600.7800.1490.9070.1570.9970.1681.2360.1861.2470.1931:3200.7980.1460.8460.1580.8730.1611.0850.1741.1090.1824.3.1.2抗原最佳包被条件的确立如图4.1，重组蛋白NP-N-C在37℃包被1h加4℃过夜的条件下，P/N值最大，为7.37，且此时血清OD450≥1，阴性血清OD450＜0.2，因此，抗原最佳包被条件为37℃包被1h加4℃过夜。图4.1抗原的最佳包被条件Fig4.1Thebestconditionforcoatingantigen4.3.1.3封闭液最佳浓度及封闭时间的确立如图4.2（A），5%脱脂乳作为封闭液时，P/N值最大，为7.84，阳性血清OD450≥1，阴性血清OD450＜0.2，因此，5%脱脂乳为最佳封闭液。如图4.2（B），37℃条件下，5%脱脂乳作为封闭液，封闭时间为60min时，P/N值最大，为7.64，阳性血清OD450≥1，阴性血清OD450＜0.2，因此，37℃条件下，以5%脱脂乳为封闭液时，最佳封闭时间为60min。42 牛副流感病毒3型间接ELISA诊断方法的建立AB图4.2封闭液最佳浓度（A）及最佳封闭时间（B）Fig4.2Thebestconcentrationofblockingbufferandbestblockingtime4.3.1.4血清的最佳孵育时间的确立如图4.3，血清孵育时间为60min时，P/N值最大，为7.32，且阳性血清OD450≥1，阴性血清OD450＜0.2，因此血清的最佳孵育时间为60min。图4.3血清的最佳孵育时间Fig4.3Theestablishmentofoptimalincubationtimeofserum4.3.1.5酶标二抗的最佳工作浓度及孵育时间的确立如图4.4（A），当二抗（兔抗牛-HRP）稀释为1:5000时，P/N值最大，为7.62，且此时阳性血清OD450≥1，阴性血清OD450＜0.2。因此，二抗最佳稀释倍数为1:5000。如图4.4（B），当二抗（兔抗牛-HRP）孵育时间为60min时，P/N值最大，为7.32，且此时阳性血清OD450≥1，阴性血清OD450＜0.2。因此，二抗最佳稀释倍数为1:5000。43 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立图4.4二抗的最佳浓度及孵育时间的确定Fig4.4Theestablishmentofoptimalconcentrationandincubationtimeofsecondantibodies4.3.1.6底物最佳显色时间的确立如图4.5，底物作用时间为15min时，P/N值做大，为7.384，且此时阳性血清OD450≥1，阴性血清OD450＜0.2，因此底物最适作用时间为15min。图4.5最佳显色时间的确定Fig4.5Theestablishmentofoptimalchromogenictime4.3.2间接ELISA临界值的确定通过对79份BPIV3阴性血清及85份BPIV3阳性血清检测，SPSS19.0对测得的OD值进行统计学分析，得到特异性与敏感性相关的ROC曲线如图4.6，本研究中Youden指数最大为0.927，所对应的临界值为0.267，此时该方法的特异性为97.4%，灵敏性为95.3%，阴、阳性样本检测结果如表4.2。44 牛副流感病毒3型间接ELISA诊断方法的建立Sensitivity1-Specificity图4.6ROC曲线Fig4.6Receiver-operatorcharacteristiccurve表4.2与病毒中和试验的符合结果Table4.2TheresultoftheconformancewithvirusneutralizationtestVNT阳性阴性共计阳性81283ELISA阴性47781共计85791644.3.4重复性实验通过批内重复性试验及批间重复性试验，对结果进行分析统计，结果见表4.3，批内重复性试验的变异系数在3.6%~6.67%，批间重复性试验变异系数4.08%~8.93%，均小于10%，证明了该间接ELISA方法具有良好的重复性。表4.3重复性实验结果Table4.3TheresultofrepeatabilitytestOD450批内重复OD450批间重复样本组别CV/%CV/%平均值标准偏差平均值标准偏差阳性11.2140.0473.871.2280.0735.95阳性阳性20.9840.0636.400.9970.0898.93阳性31.2090.0746.671.1980.0857.09阳性41.3260.0574.301.3190.0816.14阴性阴性10.1860.0093.60.1910.0084.19阴性20.1940.0115.670.1960.0084.0845 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立4.3.5临床样品的检测对采自内蒙古、辽宁、黑龙江的243份血清进行BPIV3间接ELSIA检测，共有BPIV3阳性血清190份，血清抗体总的阳性率为81.20%（190/234），结果如表4.4，说明BPIV3在我国北方这三个省份牛场仍然普遍流行。表4.4北方三省BPIV3抗体血清学调查Table4.4SerologicalsurveyofantibodiesagainstBPIV3in3provincesofChina省份样本数阳性血清数阳性率（%）内蒙古704868.5辽宁787089.4黑龙江867283.74.4讨论国外针对BPIV3的研究开展较早，目前市场上的BPIV3的检测试剂盒也以国外品牌为主，价格也较为昂贵，而我国针对BPIV3的检测方法的研究还大多停留在实验室研究中[49,64,65]。在澳大利亚等养牛业的发达国家，BPIV3的感染率及抗体阳性率同样居高不下，有研究指出，澳大利亚出口牛中BPIV3的感染率达到了46%，抗体阳性率则高达87%[23]。随着我国养牛业发展，我国养牛模式逐渐呈现规模化、集约化，引进高产奶牛及优种冻精、血清等生物制品也越发的频繁，导致我国近年来BPIV3的感染率与抗体阳性率呈现明显的攀升趋势，且养牛业发达地区成为了该病的重灾区，而目前针对BPIV3的检测，我国尚无商品化的试剂盒。自上世纪70年代，随着ELISA检测方法的兴起，该方法以其较高的特异性、良好的敏感性、检测结果以数值的方式体现出来，判断更为客观标准等优点而被广泛应用于畜禽疾病的检测中。大型养殖场为进行疾病筛查时，所送检的样本也多以血液样本为主，ELISA方法能够满足临床疾病筛查时同批检测样本量大，操作简单的同时，能够做到标准化生产。本研究建立的BPIV3抗体间接ELISA方法的原理是通过纯化的特异性蛋白抗原与样本中待检抗体相结合，因此，抗原的纯度及反应原性是试验成功的关键。传统的间接ELISA中一般以全病毒或病毒的某个蛋白作为包被抗原，全病毒的蛋白成分过于复杂，而原核表达全蛋白时易出现包涵体，使得抗原表位不能充分暴露，因此本研究利用生物学软件对NP蛋白的表位进行了初步预测，并结合已有报道最终截选N端与C端两段抗原表位富集区进46 牛副流感病毒3型间接ELISA诊断方法的建立行融合蛋白表达，尽管最终表达融合蛋白仍以包涵体形式存在，仍具有较好的反应原性，满足本实验的需求。47 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立48 全文结论5全文结论1本研究成功构建检测BPIV3的TaqMan、SYBRGreenI实时定量PCR，两种Q-PCR在敏感性上TaqManQ-PCR虽优于SYBRGreenIQ-PCR，但当基因拷贝数低于102copies/μL，Ct值与荧光信号间的线性关系较差，在批内及批间重复性试验中，TaqManQ-PCR重复性优于SYBRGreenIQ-PCR。2本研究所建立的BPIV3间接ELISA方法具有良好的特异性、重复性及敏感性，该方法能够应用于BPIV3抗体的检测、血清流行病学调查和追溯性诊断。49 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立50 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致谢致谢不知不觉中已在学校中度过了3年愉快而充实的时光，即将开启新的生活，面对社会这个大学堂，带着自己的梦想与家人的期望，继续前行。虽然前途未知，但我满怀着信心，因为在学校度过了充实的3年，成长的3年。我要感谢所有曾经帮助过我的人，是他们的帮助使得我一路成长，学会了更多，让我学会了更好的面对人生中的美好与困难。首先，感谢我敬爱的科研导师闻晓波副教授和冉旭华副教授。闻老师勤勤恳恳、一丝不苟的科研态度、渊博的知识、扎实的科研功底是我学习的榜样，您对我的科研、文章写作及为人处世等多方面的指导和谆谆教诲，使我受益良多。冉老师严谨敬业的教学作风、乐观积极的人生态度对我的学习和生活都大有启发，是我学习的榜样；在两位老师的谆谆教导下，我逐渐养成了良好的科研习惯，开阔了自己的科研思路，为以后的工作和学习打下了坚实的基础。其次，感谢在学习和生活中给予我帮助的倪宏波老师，朱战波老师，崔玉东老师，王春仁老师，侯喜林老师，常巧呈老师，翟军军老师，陈雪龙老师，周玉龙老师，邵红老师；感谢师姐苗艳、曹思、齐晓雪、栾云艳，师兄张峣、常春龙、邢思毅、刘泽轩、刘宇对我的关心照顾和实验上的无私帮助；感谢师妹王宇婷、马莉莉、赵薇、高琦，师弟刘通给予的帮助；感谢同学刘阳阳、毕莹、岳冬梅、李晓婷、付雪、宿欣、刘瑶、王士霞、王华欣、赵静虎一路的陪伴与相互扶持，有你们的陪伴我才能顺利的完成学业。由衷的感谢你们，陪我走过这人生中重要的三年，是你们的帮助使我更加优秀与坚强。还要感谢一直在背后默默支持我的父母，感谢你们的辛苦养育与教导。在外求学，你们的关心、疼爱、鼓励和支持是我的人生的动力，在以后的人生道路上我会更加的努力，不辜负二老对我的希望，也希望你们永远健康快乐。最后，由衷的感谢百忙之中抽出宝贵时间评阅论文和参加答辩的各位专家、教授！本论文的研究工作得到了黑龙江省农垦总局科技攻关计划（HNK125B-11-08A）及黑龙江八一农垦大学研究生创新项目项目（YJSCX016-Y27）经费支持，特此感谢。55 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立56 个人简历个人简历个人情况姓名：张玲玲性别：女民族：汉族出生年月：1991年6月籍贯：山东泰安政治面貌：群众教育背景2010.09-2014.06黑龙江八一农垦大学动物科技学院农学学士学位动物医学2014.09-2017.06黑龙江八一农垦大学动物科技学院农学硕士学位预防兽医学专业科研经历2015.01-2017.01黑龙江省农垦总局科技计划（重点项目）“基于牛副流感病毒3型病毒引起的牛呼吸道疾病综合征反向遗传系统的建立及应用”2016.05-2017.05黑龙江八一农垦大学研究生创新项目项目“牛副流感3型病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用”在学期间发表论文1．闻晓波,张玲玲,倪宏波,刘阳阳,曹思,冉旭华.G6P[5]型牛轮状病毒的分离鉴定[J].黑龙江八一农垦大学学报,2016,28(4):36-40.2．闻晓波,张玲玲,冉旭华.铝佐剂的作用机制研究进展[J].现代畜牧兽医,2016,11:47-51.3．卢元赫,张玲玲,张峣,任博雯,祝子涵,冉旭华,倪宏,刘阳阳,李维香,闻晓波.牛副流感病毒3型血凝素-神经氨酸酶蛋白在杆状病毒中的表达[J].中国生物制品学杂志,2016,29(4):360-364.4.刘阳阳,张玲玲,倪宏波,闻晓波.牛病毒性呼吸道疾病混合感染的病例诊断报告[J].兽医导刊,2016,04:161.57 牛副流感病毒3型Q-PCR及间接ELISA方法的建立5．冉旭华,曹思,刘阳阳,张玲玲，张峣，倪宏波，闻晓波.牛轮状病毒VP6蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备[J].中国生物制品学杂志,2016,29(7):696-700.6．冉旭华,张峣,曹思,卢元赫，张玲玲，刘阳阳，倪宏波，朱战波，闻晓波.C基因型牛副流感3型病毒的分离鉴定[J].中国畜牧兽医,2016,43(5):1368-1373.7．冉旭华,张峣,卢元赫,曹思,张玲玲,刘阳阳,倪宏波,闻晓波.C基因型牛副流感3型病毒分离株全基因组测序及分析[J].中国生物制品学杂志,2016,29(6):595-599.8．毕艳铎,魏晓曼,冉旭华,曹思,张峣,张玲玲,苗艳,闻晓波,猪轮状病毒重组VP8*蛋白的原核表达及免疫原性分析[J].黑龙江八一农垦大学学报,2016,27(6):28-32.58