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《帕金森病大鼠肠功能障碍及血清脑肠肽与脑内酪氨酸羟化酶相关性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号Ｒ７４密级公开＿ＵＤＣ６１０学校代码１０巧日＠若＃义拿硕古学位论文Ｉ．．ｒ．．．．‘庐．ｔ（专业学位）’帕金森病大鼠肠功能障碍及血清脑肠化与脂内酪氨酸磬化酶相关性研究研巧生姓名：戴钱华指导教师、职碌：武衡教授专业学位类别（领域）：神经病学研究方向：神经退行性疾病一所在学院：第临床学院二０—六年五月 ＠，泰＃义拿帕金森病大鼠肠功能障碍及血清脂肠化与脂内酪氣酸茗化酷柏关性研究论文作者签名年‘―＼：＼／／指导教师签名７论文评阅人１：唐小卿教授硕导南华大学评阅人２；田邵文教授硕导南华大学答辩委员会主席；汤永红郵授硕导南华大堂委员１：邹伟教授硕导南华大学委员２：谢明教授硕导南华大学委员３；游咏教授硕导南华大学委员４：憂亚雄教授硕导南华大学答辩日期１６年５月１０日：２０ 南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研巧工作及取得的研巧成果。尽我所知，除了论文中恃别加标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研巧成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研充所作的贡献均己在论文中作了明。。的明完全意识到本声明的法结果由本人承担确说本人律者签名始１作月娜书南华大学学位论文版权使用授权学位论文是本人在南华大学攻读（博±学位期间在导师指导下完成的本１位。＾｜它巧成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得其单位学论文本论文的研。南华大、论，本人同；的名义发表意学有关保留使用学位文的规定即学校有权保论义被查１，和借；学校可＾＾公布学位论文的全部或部分内留学位论文允许学位阅阅、它手段论；可根国，可臥用印缩印或其保留学位文学校据家或湖南省有关容采复送交。入《国优秀±学位论全数据部口定学位论文同意学校将论文加中博硕文文规》规。库》，《±学位论文全文数据库出版章程定享受相关权益并按中国优秀博硕论文收录《国学位论全意授权中国科学信息技术巧究所将本学位到中文文数据同。密，，过网络息服对于的学位论文解密后适用该》并遁向社会公众提供信务涉库授。权作者签日名緣ｋｊ：辦抑饰导师签名月主ｉ 帕金森病大鼠肠功能障碍及血清脑肠肽与脑内酪氨酸羟化酶相关性研究硕士生：戴钱华导师：武衡摘要目的：观察鱼藤酮诱导的PD大鼠行为学改变及胃肠功能障碍，测定血清中胆囊收缩素（CCK）、新脂肪因子（Nesfatin-1）含量与黑质纹状体中酪氨酸羟化酶（TH）平均光密度值的相关性来研究脑肠肽是否可作为PD早期诊断指标；测定不同时间不同部位TH平均光密度值的变化来探讨PD早期可能的发病机制。方法：采用随机原则将84只大鼠分成实验组及溶媒组各42只，实验组采用颈背部皮下注射浓度为2mg/ml的鱼藤酮葵花油乳液，溶媒组注射等体积葵花油乳液，分别在0周、2周、4周、6周注射30分钟后测定大鼠体重、跨步实验及悬挂实验、粪便含水量百分比及胃内容物占体重的百分比，利用免疫组化法检测不同时期直肠、胸髓及黑质纹状体酪氨酸羟化酶（TH）平均光密度值，ELISA法测定脑肠肽CCK及Nesfatin-1的含量，应用Pearson分析法分别分析血清中CCK、Nesfatin-1与脑内TH之间的关系。结果：行为学检测发现，较溶媒组相比，实验组大鼠体重显著下降（P＜0.05）；实验组悬挂实验的分值明显降低（P＜0.05），尤其在2~4周最明显，而从4~6周后则下降的程度变慢，实验组大鼠跨步数目明显减少(P＜0.05)，而溶媒组大鼠体重、悬挂实验及跨步实验均无明显变化（P＞0.05）。粪便含水量及胃内容物占体重百分比测定发现，实验组从第2周开始即出现粪便含水量显著减少（P＜0.05）及胃内容物占体重的百分比明显增高（P＜0.05）。应用ELISA法检测发现，与I 溶媒组相比，实验组大鼠血清中CCK含量及Nesfatin-1含量从第2周开始就明显增高（P＜0.05），Nesfatin-1含量在第6周后逐渐出现下降趋势；溶媒组大鼠均无明显变化（P＞0.05）。免疫组化结果显示，实验组直肠、胸髓及黑质纹状体中TH平均光密度值明显下降（P＜0.05），直肠从第2周开始就表现出较明显的下降趋势；而溶媒组大鼠肠道、胸髓及黑质纹状体中TH平均光密度值无明显改变（P＞0.05）。从实验组大鼠血清CCK含量与脑内TH平均光密度值两者的动态变化发现两者随时间变化呈负相关性r=-0.953（P＜0.05）。实验组大鼠血清中Nesfatin-1含量与黑质纹状体中TH平均光密度值无明显相关性r=-0.530（P＞0.05）。结论：帕金森病大鼠血清中CCK含量早期明显升高，其与脑内多巴胺能神经元呈负相关性，提示血清中CCK可作为预测早期PD的可能指标。关键词：脑肠肽；帕金森病；肠神经系统；酪氨酸羟化酶II THEANALYSISOFPDRATINTESTINALDYSFUNCTIONANDTHECORRELATIONOFPLASMAGHRELINANDBRAINTYROSINEHYDROXYLASEDaiQianhua（Neurology）DirectedbyWuHengAbstractObjective:ByobservingthePDratsinducedbyrotenonebehaviorchangeandgastrointestinaldysfunction,measuringtherelevanceofgallbladdercontractionelement(CCK)inserum,thenewfatfactor(Nesfatin-1)contentandTHmeanopticaldensityofthesubstantianigrastriatumtoanalysiswhetheritcanbeusedasPDearlydiagnosisindex;ThroughcomparingTHaverageopticaldensityvalueindifferentpartsatthesametime，wemayexplorethepathogenesisofearlyPD.Methods:Adopttheprincipleofrandom84ratsweredividedintoexperimentalgroupand42ofsolventgroup.Theexperimentalgroupwiththebackofthenecksubcutaneousinjectionconcentrationof2mg/mlofrotenonesunfloweroilemulsion,injectionvolumesuchassunfloweroilemulsionsolventgroup,after0,2weeks,4weeks,6weekscollecttheratfeceswithin2hours,respectively,calculatethepercentageofwastewater,atthesametimethedeterminationofratgastricresidueweight/bodyweightpercentage,steptestandsuspensiontesttocomparetheexperimentalgroupandsolventgroupratsbehaviorchange,usingimmunohistochemicalmethodindifferentperiodoftherectum,testchestpulpandsubstantianigrastriatumtyrosinehydroxylase(TH)theaverageopticaldensityvalue,ElisamethodwasusedtodetectghrelinCCKandNesfatin-1content.PearsonanalysismethodwasusedtoanalyzetherelationsbetweentheCCK、Nesfatin-1andtyrosinehydroxylaseinthebrain.III Results:Behavioraltestingfoundthattheexperimentalgroupratsweightdecreasedsignificantly(P<0.05);Theexperimentalgrouphangingscorewassignificantlydecreased(P<0.05),themostobviouswasespeciallyin2~4weeks,anddroppedfrom4~6weeks,theexperimentalgroupratsstridenumberwasdecreasedsignificantly(P<0.05),andsolventgroupratsweight,hangingandstepexperimenthadnoobviouschange(P>0.05).ThetestingofWastewaterandweightpercentageofgastriccontentsfoundthatfromthe2weeksthewastewatercontentoftheexperimentalgroupwassignificantlydecreased(P<0.05)andthepercentageofgastriccontentsweightsignificantlyincreased(P<0.05).UsingELISAmethod,wefoundthatcomparedwiththesolventgroup,theserumcontentsofCCKandNesfatin-1inexperimentalgroupratsbecamesignificantlyhigher(P<0.05)fromthe2week,buttheCCKinthe6weekcomparingwiththe2weekgroup,butthecontentofNesfatin-1wasgraduallydeclined;solventgroupwerenosignificantchange(P>0.05).ImmunohistochemicalresultsfromthestudyshowedthattheTHaverageopticaldensityvalueoftherectum,breastpulpandsubstantianigrastriatumwassignificantlydecreased(P<0.05),andespeciallyinrectumshowedasignificantdeclinefromthe2week;andinsolventgroup,therewasnosignificantchange(P>0.05).FromthedynamicchangesoftheserumCCKcontentofexperimentalratsandtheaverageopticaldensityvalueofTH,wefoundovertimeitshowedanegativecorrelationr=0.953,(P<0.05).TherewasnoobviouscorrelationbetweentheNesfatin-1contentintheexperimentalgroupandtheaverageopticaldensityvalueofTHr=0.530,(P>0.05).Conclusion:ItisincreasedsignificantlyofCCKcontentintheearlyParkinson'sdiseaseratsserum,andthecontentofCCKintheserumisnegativecorrelationwithdopaminergicneuronsinthebrain,hintingCCKinserumcanbeusedasapossiblepredictorofearlyPD.IV Keywords：ghrelinParkinson'sdiseasetheentericnervoussystemtyrosinehydroxylaseV 中英文缩写缩写英文全称中文全称DAdopamine多巴胺LBLewybody路易小体SNpcSubstantiaNigraParsCompacta黑质致密部PDParkinson’sdisease帕金森病CNScentralnervoussystems中枢神经系统ENSentericnervoussystems肠神经系统THtyrosinehydroxylase酪氨酸羟化酶CCKcholecystokininCCK胆囊收缩素ELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫分析法SPCentralsubstanceP中枢性P物质NPYneuropeptideY神经肽YVIPvasocativeintestinalpolypeptide肠血管活性肽VII 目录摘要....................................................................................................................................ⅠAbstract..............................................................................................................................Ⅲ第1章绪论........................................................................................................................11．1实验材料.................................................................................................................31．2试验方法.................................................................................................................41．3统计方法.................................................................................................................7第2章实验结果................................................................................................................9第3章讨论......................................................................................................................17第4章结论......................................................................................................................21参考文献............................................................................................................................23文献综述………………………………………………………………………………..27攻读学位期间的科研成果................................................................................................35致谢....................................................................................................................................37IX 第1章绪论帕金森病（Parkinson‘sdisease，PD）已经成为一种人们熟知神经退行性疾病，在我国PD的患病人数逐年增加，每年新增约15万[1]，目前已超过200万，＞65岁的人群中患病率1-2%，发病的高峰年龄在55-60岁。该疾病主要的病理特点是路易小体(Lewybody，LB)在黑质致密部（SNpc）神经元中的形成及多巴胺能神经元选择性丢失[2]，其发病与异常聚集的a-突触核蛋白及酪氨酸羟化酶（TH）的表达降低有关[3]。患者临床症状包括运动症状及非运动症状。其中非运动症状中最常见的胃肠功能障碍是目前研究的热点，其发生率可高达百分之九十以上[4]。它包括大便干结、胃肠排空延迟及流涎、呕吐等[5]，但其具体机制目前尚不得而知。研究发现，便秘、胃肠排空延迟等胃肠功能障碍的非运动症状甚至可能早于PD的运动症状出现[6]。因此，早期识别这些非运动症状可能成为PD运动症状出现前的早期预测指标，为早期诊断及有效治疗PD提供了条件。已知的与PD相关的因素有环境、遗传及免疫、炎性等因素，但具体机制还不清楚。国外曾报道称PD的病理学改变起源于肠壁内神经节，并以朊蛋白形式沿迷走神经逆行到达延髓、脑干及大脑皮质等部位[7-8]。近年来Braak等提出了PD病理学损害的起源及播散方式，认为在疾病的不同阶段，a-突触核蛋白的异常聚集起源于胃肠道的迷走神经，并以特定的模式逐渐累及到胸髓、黑质纹状体等中枢神经系统中[9]，尽管试验表明不是所有的患者随疾病的进展神经元变性的顺序与Braak所提出的假说完全一致，但该假说为PD可能机制的研究提供了新的理论依据[10]。目前诊断早期PD的方法有限，如PET或SPECT检查及基因检测技术，主要依据运动迟缓、静止性震颤、肌强直及姿势步态异常的临床运动症状和对左旋多巴治疗的敏感性来诊断，但在帕金森病早期可能尚未出现典型的帕金森病的相关症状，出现临床症状后药物治疗效果欠佳，甚至出现运动并发症。因此寻找早期诊断及治疗该疾病的方法迫在眉睫。但在PD早期，患者可能仅表现为胃肠功能障碍及体重减轻等非运动症状，早期很难被患者及家属察觉，进而错过诊治帕金森病的最好时期。胃肠道功能的正常运行是中枢神经系统、周围神经系统及肠神经系统共同协作的结果，Braak[11-12]等证实在PD早期就可发现肠神经系统的神经元发生变性及a-突触核蛋白的异常聚集，并将PD分为0~6期，其中最早出现的0期即可出现PD的胃肠功能障碍，即肠神经系统的改变可能早于中枢神经系统，肠神经系统中异常聚1 集的a-突触核蛋白能够以类朊蛋白的作用方式在细胞间转移，促进受体细胞中的a-突触核蛋白发生聚集，通过某神经通路转移到中枢神经系统，最终导致中枢多巴胺能神经元的变性和死亡[13]。Lebouvier及Philips等也通过实验证实，PD的胃肠功能障碍与粘膜下迷走神经丛中LB小体密切相关，相比对照组的便秘发生率显著升高[14]，有文献报道PD的病理学损害起源于肠壁内神经节，胃肠肌间神经丛，一氧化氮是胃肠道非肾上腺素能非胆碱能抑制性递质，在PD患者肠肌丛，特别是一氧化氮能神经元发现存在a-突触核蛋白阳性包涵物，表明一氧化氮能神经元受损可能与PD胃肠功能障碍有关。在肠道神经系统变性的同时，作为神经系统及消化系统共同分泌的脑肠肽含量也受到影响，如CCK、SP、Nesfatin-1及Ghrelin、降钙素相关基因肽及神经肽Y（NPY）、肠血管活性肽（VIP）、生长激素抑制剂及促肾上腺激素释放激素，其水平的改变可间接反映所属系统的病变情况[15]，可作为某些神经变性疾病及胃肠功能障碍的观察指标。脑肠肽可以作为胃肠肽能神经释放的神经递质或调节介质起作用，也可以直接作用于胃肠感觉神经末梢或平滑肌细胞的相应受体而调节胃肠道功能。作为神经退行性疾病的PD，主要的病理改变除了选择性累及黑质-纹状体-多巴胺能系统导致中脑黑质多巴胺能神经元变性[16]，纹状体DA的含量明显下降，另外还可累及其他系统，如边缘系统及下丘脑等导致所分泌的脑肠肽含量改变[17]，直接或间接地影响肠道的机械运动功能。甚至在疾病的早期脑肠肽水平的改变即发生了改变，进而推测是否可以作为疾病的预测及诊断的因素。脑内含量最高的脑肠肽即胆囊收缩素（CCK），是小肠黏膜分泌的一种具有早饱及调控疼痛、体温及镇痛的肽类激素，还具有信息传递和记忆的功能，能影响脑内多种激素的释放，如脑内多巴胺及垂体前叶，除了与消化系统及与消化道疾病具有相关性，其含量与中枢神经系统也具有相关性。研究发现，通过在正常大鼠的不同部分如腹侧被盖区及伏隔核注射微量CCK-8，结果显示在前者中注射微量外源性CCK-8则可加速脑中DA的更新速度及释放量[18]，CCK投射至中隔及嗅球中部的中脑边缘系统DA传出通路，参与了精神分裂及PD神经精神症状。以上表明CCK不仅能调节胃肠道功能，还参与了中枢神经系统的某些疾病。新脂肪因子（Nesfatin-1）与胃促生长素（Ghrelin）均是由胃底X/A样细胞分泌的一种新型脑肠肽[19]，研究发现，后者可以通过激活细胞膜上电压依赖型KCNQ钾通道来促进多巴胺能神经元的存活[20]，因此推测前者是否也与中枢神经系统的多巴胺能神经元具有相关性？2 近年来研究较多的是PD的治疗方法，但出现运动症状需要药物治疗时往往效果欠佳，再加上长期用药后出现的不良反应，因此研究早期诊断PD的方法是目前的热点。本实验通过使用鱼藤酮颈背部小剂量皮下注射来制作大鼠帕金森病实验组，来观察大鼠在不同时期的粪便含水量百分比及胃内容物占体重百分比的胃肠功能改变及体重改变、跨步试验与悬挂试验的行为学改变，不同时程大鼠血清中脑肠肽CCK、Nesfatin-1含量的变化，脑肠肽与黑质纹状体中TH平均光密度值变化及相关性研究等综合分析，进一步寻求早期诊断该疾病的方法提供了依据，并可初步阐明PD发病的可能机制。1.1实验材料与方法1.1.1实验动物：清洁级雌性SD大鼠，体重在180-250g之间，鼠龄5～6个月，共84只，购于南华大学动物实验中心。自然进食喂养及光照，控制室内平均温度及湿度分别在23～25℃、50%～70%之间，实验前适应性喂养2周。1.1.2主要仪器：名称品牌及型号台式冷冻离心机湘仪TGL-16全自动酶标洗板机汇松PW-812酶标仪汇松MB-530恒温振荡器强乐THZ-C摇床其林贝尔TS-92恒温箱北京六一DYY-6C微波炉美的MM721AAU-PW切片刀莱卡M199切片机浙江金华益迪试验器材YD-315包埋机常州中威电子仪器BMJ-A4℃普通冰箱荣事达BCD-245F精密PH计雷磁E-201-C显微镜MoticBA210T3 盖玻片海门远泰DY89-1载玻片海门远泰AY89-21.1.3主要试剂名称品牌一般的实验试剂上海国药生物鱼藤酮美国Sigma公司石蜡美国Sigma公司中性树胶美国Sigma公司葵花油美国Sigma公司苏木素WellbioPBS(7.2-7.6)Wellbio枸橼酸盐缓冲液Wellbio二步法试剂盒WellbioDAB试剂盒中杉金桥4%多聚甲醛南华大学实验室提供10%水合氯醛南华大学实验室提供1.1.4实验用品实验器械：电子天平、解剖器械、离心管（2ml）、容量瓶及离心管（50ml）、注射器（1ml、5ml）、络活碘、计时器、自制金属丝1.2实验的方法：1.2.1药物配置：鱼藤酮实验组试剂的配置：使用电子天平称取鱼藤酮100mg加入容量瓶中，再加入适量葵花油乳液定容至50ml，充分混匀后避光保存在棕色瓶中。1.2.2动物分组及给药：采用随机原则对84只大鼠进行分成两组，每组各42只：（1）实验组：采用颈背部皮下注射浓度为2mg/ml的鱼藤酮葵花油乳液，于每日上午10：00注射，剂量为1.5mg/kg/d[21]；（2）溶媒组：注射等体积葵花油乳液。期间死亡的大鼠再用雌性SD大鼠重新补齐。分别在0周、2周、4周、6周注射304 分钟后比较实验组及溶媒组大鼠的体重变化、跨步实验及悬挂实验的行为学改变和粪便含水量百分比、胃内容物占体重的百分比的胃肠功能改变。1.2.3大鼠行为学改变及胃肠功能改变：每2周给药30分钟后观察大鼠的运动、精神及采食情况，并记录死亡情况，分析死亡的可能原因，观察其行为学评分及行为学改变、记录粪便含水量百分比及胃内容物占体重百分比的改变。1.2.3.1行为学评分：通过大鼠长期小剂量鱼藤酮颈背部皮下注射的预试验（SD大鼠12只）观察，把出现的不同症状分为6个等级：1分，表现出动作缓慢、反应迟钝及应激能力减弱、毛发黄；2分，有1分的症状，而且自主活动减少或行走不太稳，并缓慢出现震颤；4分，有2分的症状，而且行走不稳，或者行走时身体偏向一侧；6分，出现一侧或两侧肢体瘫痪向一侧偏斜，行走困难和/或拒食，消瘦；8分，大鼠出现体重快速下降及肢体运动不能（单肢、前肢和/或后肢），不能进食；10分，反应迟钝或死亡。1.2.3.2跨步实验[22]：检测前肢的运动功能。将大鼠的一侧前肢及躯干后部固定并使其后肢离地，记录大鼠在5s内斜向同一侧移动90cm着地侧的前肢跨步数目，记录两侧上肢分别检测后的跨步数和。1.2.3.3悬挂实验：该实验用来检测肢体的肌张力。参照Kuribara[23]的方法，将大鼠两前爪放置在水平的金属丝（直径约2mm，长约20cm，离地面90cm）上，记录三次落地前的时间，每次间隔5min，重复测3次，若在3s内掉下或翻坐在金属丝上均属失败。记录时间按下述评分标准：0～4s为0分，5～9s为1分，10～14s为2分，15～19s为3分，20～24s为4分，25～29s为5分，大于30s为6分。1.2.3.4粪便含水量百分比的检测：第0周、2周、4周、6周在两组分别随机取4只大鼠，自由进食，单独置于干净的笼子中，2小时后用电子天平称取粪便的湿重，再将粪便置于干燥烤箱（65℃）12小时后至重量不变，该重量即为粪便干重。粪便含水量百分比=（粪便湿重-粪便干重）/粪便湿重×100%5 1.2.3.5胃内容物占体重的百分比：第0周、2周、4周、6周上午10：00待大鼠自由进食2小时后每组随机取4只处死，暴露腹腔，沿喷门及幽门处剪断胃，用滤纸拭干后称重，即为胃总重，除去胃内容物后再称重，此为胃净重。胃内容物占体重的百分比=（胃总重-胃净重）/大鼠体重×100%1.2.4ELISA法测脑肠肽的含量1.2.4.1实验试剂ELISA试剂盒:CCK试剂盒、Nesfatin-1试剂盒（均购于长沙维世尔生物科技公司）1.2.4.2ELISA的样本处理及操作步骤大鼠血清样本的采集及处理：在不同时间点分别取实验组及溶媒组大鼠各12只，禁食过夜，在次日上午10：00腹腔注射10%水合氯醛（3ml/kg）麻醉剖腹并暴露腹主动脉下取约3ml的血，沿管壁缓慢注于离心管中，室温下静置凝固约半小时后，取其上清液，如果出现沉淀，便在离心机上离心（以2000～3000转/分的速度，约20分钟）后取上清液，统一置于EP管中-70℃保存及送检。操作步骤：标准品的稀释及加样→加样（分别加40μl样品稀释液及10μl待测样品于待测样品孔底部）→温育（37℃，30分钟）→配液（用30倍的蒸馏水将30倍的浓缩洗涤液稀释）→洗涤（揭掉封板膜后弃去液体并甩干，将洗涤液加满10个孔后静置30s，再丢弃液体，步骤5重复5次后甩干）→加酶（除空白孔外每孔加入50μl的酶标试剂后再用封板膜封板）→温育（37℃，30分钟）→洗涤（揭掉封板膜后弃去液体并甩干，将洗涤液加满10个孔后静置30s，再丢弃液体，步骤5重复5次后甩干）→显色（先在10个孔中先后加入50μl显色剂A及显色剂B，慢慢摇晃混匀后置于37℃避光条件下显色15分钟）→终止（分别于10个孔中加入50μl终止液，当由蓝色立转为黄色时即为反应终止）→测定（将空白孔调零的条件下，在加入终止液后的15分钟内，用450nm的波长对10个孔分别检测吸光度，并计算样本的浓度和含量）具体的标准品稀释及加样方法如下：设10个标准孔于酶标包被板上（依次为1、6 2、3、4、5、6、7、8、9、10），在第1、2孔中分别加入100μl的标准品，再分别加标准品稀释液50μl，摇均匀；然后，从第1、2孔中分别取100μl加于第3、4孔中，再在第3、4孔中分别加入标准品稀释液50μl，混匀；其次在第3、4孔中各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第5、6孔中，以此类推，最后稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为480pg/mL，320pg/mL，160pg/mL，80pg/mL，40pg/mL）。1.2.5免疫组化法检测1.2.5.1组织样本的取材在第0周、2周、4周、6周上午10：00分别选取行为学评分在2～6分的大鼠作为鱼藤酮实验组及溶媒组各4只，12小时禁食不禁水，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠后放在灌流台上，暴露左心室后用250ml生理盐水快速灌注后取脑并放于冰盘上，分离出大鼠黑质纹状体组织块，后用眼科剪分别分离出胸髓及距肛门1～2cm处的直肠约1cm，用PBS漂洗三次置于4%多聚甲醛中固定1周。1.2.5.2免疫组化SP法：操作步骤如下：直肠、胸髓及中脑黑质纹状体组织→乙醇脱水→二甲苯中脱乙醇，直到组织透明→温箱内浸蜡包埋成石蜡块，取石蜡切片→60℃烤片30～60min→置于二甲苯中10min×2次→100%乙醇5min→95%乙醇5min→85%乙醇5min→75%乙醇5min→蒸馏水浸洗5min→浸入枸橼酸盐缓冲液（PH6.0，0.01M）→加热至沸腾后断电，隔5～10min，重复1～2次→冷却后在PBS（pH7.2～7.6，0.01M）中洗涤3min×3次→加3%H2O2进行10min灭活内源性酶→PBS冲洗3min×3次→滴加TH一抗后4℃过夜→PBS冲洗5min×3次→滴加50～100μL抗兔IgG抗体-HRP多聚体→37℃孵育30min后置于PBS冲洗5min×3次→滴50～100μL预制好的DAB显色剂→室温孵育1～5min后用蒸馏水洗涤→5～10min的苏木素复染→蒸馏水洗涤→PBS返蓝→各级酒精（60～100%）脱水，每级进行5min→置于二甲苯中10min×2次→树胶封片→显微镜观察。先在100倍光镜下找到胞质内含有棕色颗粒浓密的椭圆形或粒状的TH阳性细胞较多的部位，利用Image-Pro-Plus6.0分析软件分别计算400倍镜下不同部位的TH平均光密度值，每个直肠、胸髓及黑质纹状体部位分别选4张连续切片，计算均数及标准差。7 1.3统计方法：采用普通的显微镜100倍及400倍物镜采集图像，应用Image-Pro-Plus6.0分析软件进行TH阳性细胞平均光密度值的分析。使用SPSS18.0进行统计分析，实验采用析因分析法及两组变量采用Pearson相关性分析方法，计量资料采用均数±标准差（X±S）,P＜0.05表示数据资料具有统计学意义。8 第2章实验结果2.1死亡大鼠分析原计划每组12只，鱼藤酮实验组死亡6只，溶媒组死亡4只，其中2只考虑为技术不熟练注射时伤及脑干导致死亡有关，3只考虑为大鼠间互相斗殴致死，2只进食困难饥饿死亡，另外3只考虑为个体间对注射鱼藤酮的毒副反应较为敏感有关，期间死亡的大鼠再随机取相同条件的雌性SD大鼠按相同的实验步骤重新补齐。2.2大鼠行为学变化及胃肠功能障碍：实验组大鼠4～6天后就开始出现自主活动变慢、抗拘捕能力下降，毛色变脏发黄，立毛；第10天逐渐出现食欲下降、体重减轻、反应迟钝，行走不稳，个别甚至出现叹气样呼吸，翻滚，后死亡。严重的行为学改变如行走变慢、震颤及肢体运动不能等在第4周左右均有显现，在第4～6周评分急剧升高。各组大鼠在不同时期的外观及行为学变化见图2.10周组实验组2周组实验组4周组实验组6周组溶媒组2周组溶媒组4周组溶媒组6周组图2.1与葵花油乳液溶媒组相比，实验组在实验的不同时期（2周组、4周组、6周组）行为学变化大鼠逐渐出现抗捕捉能力减退，应激水平下降，每日进食量减少，从第2周开始即出现了大鼠毛色光滑度及清洁度下降、消瘦、偶竖毛，后逐渐出现动作迟缓、9 毛色发黄及行走不稳、震颤等，呈进行性加重，精神萎靡、进食及呼吸困难、关节僵硬、一侧肢体瘫痪、站立不稳，甚至死亡。第4周后实验组出现上述症状的大鼠增多，而溶媒组大鼠抗拘捕能力正常、毛色光亮及进食正常。2.2.1大鼠行为学改变：相比溶媒组，实验组大鼠体重明显下降（P＜0.05）约10%，从第2周下降较为显著，后随着时间的推移体重下降较缓慢。相比溶媒组，实验组悬挂实验的分值明显降低（P＜0.05），尤其在2~4周最明显，提示大鼠肌力及协调能力随着药物作用时间的延长逐步下降，而从4~6周后则下降的程度变慢。与溶媒组相比，实验组大鼠跨步数目明显减少(P＜0.05)，而溶媒组跨步数目无明显影响，甚至增多。（图2.2）2520*15*10*实验组5溶媒组跨步实验步数（步）00w2w4w6w时间点图2.2不同时间大鼠行为学改变注：与溶媒组比较，*P＜0.05。2.2.2各组大鼠胃肠功能变化。与溶媒组相比，实验组从第2周开始即出现粪便含水量显著减少（P＜0.05），10 后随着时间的推移粪便含水量减少的幅度下降；与溶媒组比较，实验组从第2周就表现出明显的胃排空延缓（P＜0.05），而在第4周后大鼠逐渐出现活动减慢及肌张力障碍影响进食，胃内容物占体重的百分比出现下降趋势。（见图2.3）4%**3%*2%实验组溶媒组1%胃内容物占体重百分比0%0w2w4w6w时间点图2.3不同时间大鼠胃肠功能改变注：与溶媒组比较，*P＜0.05。2.3各组大鼠血清中脑肠肽水平的变化。与溶媒组相比，实验组大鼠血清中CCK含量从第2周开始就明显增高（P＜0.05），第6周组较第2周组增高的更明显；与溶媒组比较，实验组大鼠血清中Nesfatin-1含量从第2周开始也明显增高（P＜0.05），但第4~6周含量出现下降趋势，溶媒组大鼠均无明显变化（P＞0.05）（见图2.4）300250*ng/l）200（*150*实验组100溶媒组50血清中CCK含量00w2w4w6w时间点图2.4不同时期大鼠血清中CCK及Nesfatin-1含量变化注：与溶媒组比较，*P＜0.05。11 2.4各组大鼠肠道、胸髓及黑质纹状体中TH阳性细胞的比较。2.4.1大鼠肠道、胸髓及黑质纹状体TH阳性细胞。（见图2.5、2.6、2.7）免疫组化结果显示，在溶媒组中直肠黏膜层及肌层可见许多胞浆内含有浓密棕色颗粒的TH阳性细胞（见图2.5红色箭头），表明该区域内的多巴胺能神经元基本完好，未见到变性坏死细胞的现象；在溶媒组中的胸髓及黑质纹状体细胞胞浆中可见到显示较清晰的大量TH阳性颗粒，阳性细胞形态较完整，多为椭圆形或颗粒状，胞质内棕色颗粒浓密，部分可见到突起及其分支，实验组直肠、胸髓及黑质纹状体TH阳性细胞稀疏，且着色不均，染色较浅，部分细胞染色不清，甚至未见到阳性细胞，残存的细胞萎缩甚至坏死，提示该区域多巴胺能神经元变性坏死。A.溶媒组2w组THB.溶媒组4w组THC.溶媒组6w组THD.实验组2w组THE.实验组4w组THE.实验组4w组THF.实验组6w组TH图2.5各组大鼠肠道TH阳性细胞（×400倍，AC为溶媒组，DF为实验组）A.溶媒组2w组THB.溶媒组4w组THC.溶媒组6w组THE.实验组4w组THF.实验组6w组THD.实验组2w组THE.实验4w组THF.实验6w组TH图2.6各组大鼠胸髓TH阳性细胞（×400倍，AC为溶媒组，DF为实验组）12 A溶媒组2w组THB溶媒组4w组THC溶媒组6w组THD.D实验组实验组2w2w组组THTHE实验组4w组THF实验组6w组TH图2.7各组大鼠黑质纹状体TH阳性细胞（×400倍，AC为溶媒组，DF为实验组）2.4.2大鼠肠道、胸髓及黑质纹状体TH阳性细胞的平均光密度值比较。从不同部位TH平均光密度值的图可以看出，相比溶媒组，实验组直肠、胸髓及黑质纹状体中TH平均光密度值明显下降（P＜0.05），直肠从第2周开始就表现出较明显的下降趋势；实验组胸髓及黑质纹状体TH平均光密度值在不同时间（2周、4周、6周）较溶媒组明显下降（P＜0.05），而溶媒组大鼠肠道、胸髓及黑质纹状体中TH平均光密度值无明显改变（P＞0.05）。（见图2.8）13 图2.8不同时期肠道、胸髓及黑质纹状体TH平均光密度值变化注：与溶媒组比较，*P＜0.05。2.5不同时期PD大鼠血清CCK、Nesfatin-1与黑质纹状体中TH平均光密度值的相关性分析：利用Pearson相关分析的检测方法对实验组大鼠血清CCK含量与脑内TH平均光密度值两者的动态变化可以看出，两者在时间上的变化呈负相关性（相关系数-0.953，P为0.040，P＜0.05）。实验组大鼠血清中Nesfatin-1含量与黑质纹状体中TH平均光密度值无明显相关性（相关系数-0.530，P为0.667，P＞0.05）（见图2.9、2.10）。14 15 16 第3章讨论3.1鱼藤酮帕金森病实验组的建立：帕金森病的病理特点涉及到a-突触核蛋白的异常聚集及黑质多巴胺能神经元选择性损害，最终导致多巴胺的释放减少[24]。PD的非运动症状是目前研究的热点及难点[25]。BetarbetT[26]等2000年第一次应用鱼藤酮成功制造出类人类PD病理学改变的PD大鼠模型，该研究发现鱼藤酮能直接进入多巴能神经元中导致其受损而不需多巴胺转运体的协助，该特点与其他模型通过抑制线粒体复合体I的机制不同[27]。鱼藤酮的PD动物模型存在长期大剂量给药后易出现急性毒性反应及死亡率高、成模率低的特点[27]，本研究采用小剂量颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳化液来制作PD大鼠实验组，既能模拟类人类的PD黑质纹状体的选择性多巴胺能神经元变性的病理特点[28]，又能降低死亡率的优点，本实验期间有大鼠注射鱼藤酮后突发死亡，随着注药时间的延长，死亡的大鼠逐渐增多，考虑前者可能是个体对鱼藤酮急性毒性反应敏感所致，后者可能是由于药物长期作用后的蓄积导致大鼠中毒死亡。3.2帕金森病大鼠的胃肠功能障碍近年来PD胃肠功能障碍已经严重困扰了患者的生活，缓解胃肠功能障碍能明显改善患者的生活质量。本实验发现鱼藤酮实验组大鼠从第2周开始便逐渐出现食量下降、粪便排出量下降、粪便含水量百分比下降及胃内容物占体重的百分比下降，在第4周出现上述症状的大鼠明显增多。Chaumett[29]等对MPTP诱导的PD动物模型胃肠神经元进行研究发现，胃肠道多巴胺能神经元数量是减少的，Singaram[30]等也对PD患者尸体解剖的研究中发现胃肠道DA能神经元的数量也是减少的，然而胃肠道多巴胺能神经元的减少并不能充分解释PD患者存在的胃肠排空延缓，因为根据肠神经系统多巴胺能神经元是一种抑制性神经元，能引起胃平滑肌舒张，它的减少应该是加快胃肠的蠕动而不是胃排空延缓及便秘。本实验通过实验组大鼠体重发现，鱼藤酮实验组大鼠体重较溶媒组体重下降了10%，影响PD大鼠体重下降的因素可能与能量摄入及消耗失去平衡相关，可能与PD大鼠出现肌张力障碍及吞咽困难、嗅觉减退等有关，但具体原因尚不清。相比溶媒组，鱼藤酮实验组普遍存在粪便排出量及含水量的下降，该现象可能与以下因素有关：1）结肠蠕动功能减退：Jost[14]等通过试验发现PD患者存在胃肠道蠕动功能的明显减退。但目前还不清楚与PD的严重性是否相关。2）粪便排出受阻：有研究认为可能与肌张力障碍相关，但17 尚未发现依据来证实该现象。3）抗PD药物的使用：Muller等报道使用抗PD药物后便秘发生率增加，Tateno[31]则认为可以缓解PD便秘，而Lrogh等[32]通过实验发现同时给予脱羧酶抑制剂与左旋多巴可以改善便秘；根据以上的研究结果不一及机制的不确定性，还需要多中心、大样本的研究来探讨PD便秘与抗PD药物之间的相关性。另外，本实验发现胃内容物占体重百分比结果发现在0~4周期间较溶媒组明显增高，但从第4周后逐渐出现下降趋势，考虑为随着鱼藤酮在体内的聚集，帕金森病的运动症状逐渐明显，大鼠逐渐出现活动减慢及吞咽困难、腹胀等症状，进食量下降。但有研究者提出了胃肠功能障碍可能与肠道内分泌功能障碍相关：经研究发现在PD患者体内的某些激素水平也发生了改变。3.3胆囊收缩素、新脂肪因子与帕金森病的相关性本实验通过ELISA法检测鱼藤酮实验组大鼠血清中CCK及Nesfatin-1含量，发现较溶媒组相比血清中CCK含量明显增高，可能与患者便秘及胃肠排空延缓后继发性CCK升高有关，但也可能与胃肠神经丛变性导致相关激素分泌失调有关，本研究通过实验组大鼠血清中CCK含量与脑内黑质纹状体中TH平均光密度值相关性分析发现两者具有负相关性（相关系数-0.953，P为0.040，P＜0.05），因此，帕金森病大鼠血清中CCK含量早期即明显升高，其与脑内多巴胺能神经元呈负相关性，提示血清中CCK可作为预测早期PD的可能指标。新脂肪因子（Nesfatin-1）与胃促生长素（Ghrelin）均是由胃底X/A样细胞分泌的一种新型脑肠肽。研究发现，在PD患者体内血清中Ghrelin升高，且具有保护PD大鼠模型黑质多巴胺能神经元的作用，因此推测前者是否因此推测前者是否也与多巴胺能神经元具有相关性。但根据本实验结果发现，PD实验组大鼠血清中Nesfatin-1及其与脑内TH平均光密度值无明显相关性（相关系数为-0.530，P为0.667，P＞0.05），但实验组该指标较溶媒组明显增高，推测Nesfatin-1可能也具有多巴胺能神经元的保护作用，但与PD不具有相关性，不能作为预测早期PD的可能指标。3.4酪氨酸羟化酶与帕金森病的关系酪氨酸羟化酶（tyrosinehydroxylase，TH）是多巴胺能神经元合成多巴胺（dopamine，DA）的限速酶，因此可以把TH作为多巴胺能神经元的蛋白标志物[33]，帕金森病的发病机制与TH的降低有关，因此研究PD脑内TH的变化对PD的发病机18 制及寻找治疗PD的方法有着重要的意义[34]。本实验通过免疫组化SP法检测大鼠直肠、胸髓及黑质纹状体中TH平均光密度值发现，较溶媒组相比，实验组各部位的TH平均光密度值均明显下降（P＜0.05），且以黑质纹状体下降的更明显，初步证明TH的减少与帕金森病的发病机制有关，可能与PD选择性损伤多巴胺能神经元相关，但也不排除与PD的神经逆行性变性及异常聚集的a-突触核蛋白的类朊蛋白传播有关。近年来有人提出将TH基因转染的神经细胞移植入脑内的方法可以治疗帕金森病，Jiao[35]曾利用经TH修饰的肌细胞移植入PD大鼠的纹状体中，缓解了PD的相关症状。虽然基因治疗可以作为治疗PD的一种方法，但仍存在许多困难，因此还需要大样本、长时程的试验对TH基因治疗的进一步研究。3.5总结实验发现，鱼藤酮可以制造PD相似的运动症状及非运动症状，且胃肠功能障碍发生于PD的早期，早于运动症状出现；通过检测PD大鼠实验组血清中CCK含量与脑内TH平均光密度值及两者之间的关系可以得出，实验组血清中CCK含量与脑内多巴胺能神经元呈负相关性，可以通过检测血清中CCK含量作为预测及评价早期PD疾病的指标之一，识别这些早期症状及指标可以为PD进行更有效的干预、提高患者生活质量及推迟抗PD药物的使用具有重要的意义。根据肠道、胸髓及黑质纹状体TH平均光密度值的比较发现，肠道TH阳性细胞改变较其他部位明显且胃肠功能障碍的改变较运动症状的改变早，可以得出帕金森病病理学改变可能起源于胃肠道的肠神经系统。寻求如何通过保护外周神经系统的方法改善PD的发病可能为进一步探索如何预防及治疗该疾病提供了理论依据。综上，我们的实验表明：帕金森病大鼠血清中CCK含量早期即明显升高，其与脑内多巴胺能神经元呈负相关性，提示血清中CCK可作为预测早期PD的可能指标。帕金森病病理学改变可能起源于胃肠道的肠神经系统。因此，通过寻求切断该通路的方法可能对治疗PD提供了新的方法。19 20 第4章结论帕金森病大鼠血清中CCK含量早期即明显升高，其与脑内多巴胺能神经元呈负相关性，提示血清中CCK可作为预测早期PD的可能指标。21 22 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26 帕金森病相关脑肠肽的研究进展戴钱华综述武衡审校【关键词】帕金森病；脑化学；肽类；脑肠肽作为中枢神经及周围神经的肽类神经机制或调质，在神经系统中发挥着重要作用。近年来随着对帕金森病（Parkinson′sdisease，PD）认识的逐渐深入，发现PD在早期即出现了胃肠功能障碍，部分脑肠肽可能直接或间接影响了胃肠功能障碍，甚至某些脑肠肽的变化水平与PD的严重程度具有相关性。本文将与PD及胃肠功能障碍具有相关性的脑肠肽胆囊收缩素（CCK）、中枢性P物质（SP）、Nasfatin-1及胃促生长素（Ghrelin）作一综述。1脑肠肽1.1CCKCCK为小肠黏膜细胞分泌的一种肽类激素，其主要作用不仅是作为饱感因素调节摄食，而且能刺激胰酶的合成及分泌，增强胰碳酸氢盐的分泌，进而使胆囊收缩、Oddi括约肌松弛，促进肝胆汁的分泌，调节肠道的运动。天然的CCK化学结构包括CCK八肽（CCK-8）、CCK-33、CCK-39、CCK-58。CCK不仅存在于周围神经系统中，在中枢神经系统中如皮层额叶、海马、丘脑、间脑、小脑，其含量甚至大于小肠内的含量，尤其是充分含有多巴胺（DA）的区域，如纹状体。经检测发现，部分黑质-纹状体纤维末梢除可释放DA外，还可释放CCK，CCK可以调节胃肠功能的状态，将周围神经系统与中枢神经系统相连接，并相互制约影响[1]。朱镛连[2]在正常大鼠腹侧被盖区（VTA）和伏隔核（Acb）区微量注射CCK-8观察其大脑DA含量的变化，在PD大鼠模型上测定VTA和Acb中DA及CCK-8的含量。结果发现，在Acb予以外源性CCK-8可增加该区的DA含量，6-羟基多巴单侧毁损内侧前脑束后中脑多巴胺能系统中VTA和Acb的DA含量均降低，同时该系统中与DA共存的CCK-8含量也降低。另外，CCK腹腔注射可使小鼠纹状体DA的释放增加及脑内DA的更新率升高，CCK静脉注射可使脑内A10核团内多巴胺能神经元的放电增加[3]。CCK27 在脑内Acb的不同部位作用不同，在其中后部CCK通过CCK-IR参与调节CCK促进DA的释放，而在前部CCK通过CCK-ZR介导抑制DA的释放[4]。研究发现，在大鼠的中脑边缘系统DA能传出通路包括CCK投射至Acb的中后部中隔和嗅球中部，该通[1]路参与了人类的某些神经精神性疾病如PD、精神分裂症和药瘾等。上述资料表明，CCK参与了中枢神经系统及胃肠功能的调节。1.2SPSP是最早发现的脑肠肽之一，广泛分布于细神经纤维内，在黑质及内侧苍白球的含量最多[5]。研究表明，PD患者黑质多巴胺能神经元减少的同时SP含量也降低了32%～46%。SP含量降低的原因可能由代谢改变和（或）变性改变所致，不同的人观点不一样。Mauborgne等[6]坚持SP神经元减少是由变性和（或）代谢改变所致，而Grafe等[7]认为SP含量的降低是由代谢改变而引起。近期有研究者利用MPTP（1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶）诱导的PD模型发现纹状体的DA含量降低77%，而黑质-纹状体等处的SP含量却未见下降。SP含量的下降可能有两方面的作用：（1）黑质SP神经末梢的代谢活动降低或SP含量的降低可能使黑质-纹状体DA的传递减弱，进而加重运动减少的症状；（2）SP的合成代偿性增加使DA的传递加强，从而缓解DA减少出现的症状。同时SP在胃肠功能中有一定的作用，但其具体机制目前尚不清楚。马晓凯等[8]给家兔侧脑室注入SP拮抗剂DADTL后再行电针，发现可以缓解电针所抑制的胃肠活动。另外有证据表明，SP与经典的神经递质相互作用，在大鼠侧脑室注入SP，与NK1受体相结合，可刺激DA、去甲肾上腺素及5-羟色胺在脑内不同部位的合成。试验发现，大鼠黑质内微量注射SP使阿扑吗啡（APO）诱导的PD模型异常旋转行为较对照组明显减轻，SP可能通过基底神经节缓解了丘脑-皮层的抑制作用，改善PD大鼠的异常行为。该试验结果表明，黑质内SP水平的改变在PD的发病机制中发挥着重要的作用，SP参与了躯体运动的调节。1.2Nesfatin-1Nesfatin-1是在2006年由Oh-Ⅰ等[9]首次发现的由NEFA/NUCB2基因编码的28 含有82个氨基酸组成的脑肠肽，由胃底的X/A样细胞分泌，是一种参与能量代谢和摄食功能的调节肽，能够抑制大鼠的摄食行为。Nesfatin-1表达在外周各组织如胃、十二指肠黏膜下层，脂肪组织和中枢神经系统如下丘脑、脑干迷走神经背核、孤束核、动眼神经核等部位[10]。目前有关Nesfatin-1在活体内生理功能的研究还处于初级阶段。近期研究发现，Nesfatin-1可在大鼠蛛网膜下腔出血和脑损伤中通过抗凋亡机制发挥神经保护作用[11]，包括多巴胺能神经元，Nesfatin-1可通过抑制细胞色素C的释放和激活Caspase-3，保护线粒体功能，经验证，该保护作用与ERK1/2/MAPK信号通路不相关[12]。另外，Nesfatin-1可结合多巴胺能细胞膜表面的G蛋白偶联受体激活腺苷酸环化酶（AC），催化细胞内的腺苷三磷酸（ATP）成为环磷酸腺苷（cAMP），激活蛋白激酶A（PKA），使促凋亡蛋白Bad磷酸化，减少了Bad从胞质易位到线粒体，使线粒体功能及细胞完整性得到了保护。1.3GhrelinGhrelin可通过抗凋亡、缓解细胞氧化应激及增强神经元的电活动等机制来保护黑质，纹状体多巴胺能神经元。Ghrelin是Kita等[13]于1999年发现的由28个氨基酸组成的脑肠肽，是生长激素促分泌素受体（GHS-R）的内源性配体，其受体有GHS-R1a、1b2种，但生物学能主要由GHS-R1a所介导[14]，该受体在大小鼠黑质-纹状体中高表达[15]，Ghrelin与其受体GHSR1a结合可通过磷脂酶（PLC）、甘油二酯（DG）、三磷酸肌醇（IP3）及蛋白激酶（PKC）的途径使胞浆内钙离子（Ca2+）浓度上升而介导细胞保护作用。Jiang等[16]报道，应用基因打靶技术使GHSR-IRES-tauGFP转基因小鼠GHS-R1a携带上绿色荧光蛋白，发现在黑质致密带可同时表达GHS-R1a和DA1型受体（D1R）。在离体状态下，使GHS-R1a和D1R形成异二聚体，能促进GHS-R1aG蛋白偶联的变构，导致DA诱导的细胞内cAMP大量聚集，进而实现Ghrelin对DA信号的放大作用[17]。结合该机制，通过应用Ghrelin及其类似剂能够缓解多巴胺能神经元缺失所引起的DA系统功能的下降，同时该研究表明，Ghrelin能在突触后通过GHS-R1a发挥神经调质作用。另外，Ghrelin可通过改变线粒体膜通透性的机制来调节细胞的凋亡，其机制可能是通过下调Bax及上调Bcl-29 2的表达，即调节Bax与Bcl-2的比值来调节凋亡。近期研究还证明，Ghrelin能够增强黑质多巴胺能神经元的电活动，其机制可能是通过激活细胞内PLC/PKC信号通路，抑制胞膜上电压依赖型KCNQ钾通道来实现的[18]。Ghrelin可以增加小胶质细胞及星形胶质细胞的活性，促进多巴胺能神经元的存活，其机制可能是通过抑制受损海马神经元基质金属蛋白酶-3（MMP-3）的表达[19-20]。但Ghrelin非功能受体亚型1b不能与Ghrelin及GHSs相结合，分布于机体各脏器，目前生物学功能尚不清楚。2脑肠肽与PD脑肠肽为神经系统及消化系统共同分泌的肽类激素，是神经系统及其他细胞类型中的重要介质，如CCK、SP、Nasfatin-1及Ghrelin、降钙素相关基因肽及神经肽Y（NPY）、肠血管活性肽（VIP）、生长激素抑制剂及促肾上腺激素释放激素，其水平的改变可间接反映其所属系统的病变情况[21]，可作为某些神经变性疾病及胃肠功能障碍的观察指标。作为神经退行性疾病的PD，主要的病理变化除了选择性累及黑质-纹状体-多巴胺系统导致中脑黑质多巴胺能神经元变性，纹状体DA的含量明显降低，另外还可累及其他系统，如边缘系统及下丘脑等导致所分泌的脑肠肽含量改变[22]，直接或间接地影响肠道的机械运动功能。PD的临床症状除了运动症状还有非运动症状，如胃肠功能障碍中的便秘、腹胀、流涎，其中便秘见于70%～80%的PD患者[23]，甚至早于运动症状出现，严重影响患者的生活质量[24]，其胃肠功能障碍的概率之高与疾病本身导致胃肠道肌丛多巴胺能神经元丢失而影响了体内肽类激素水平的改变如CCK、SP、Nesfatin-1及Ghrelin，某些肽类激素变化的水平甚至与PD的严重程度呈正相关[25]。其水平改变的可能是由PD导致分泌脑肠肽的中枢神经系统变性和（或）肠道神经丛病理性核蛋白形成影响脑肠肽的分泌，实验是通过分析PD肠道迷走神经丛突触核蛋白的形成及Braak等[26]病理机制来推测的。3展望PD作为神经系统变性疾病中的不可治愈性疾病，该疾病进展缓慢，在PD早期某些患者就出现了腹胀及便秘等胃肠功能障碍的非运动症状，严重影响患者的生活30 质量，近年来，PD的非运动症状在疾病早期就占据重要地位，探究PD早期发病过程中脑肠肽改变的水平及与疾病的相关性可为进一步寻求一种早期诊断及探索延长PD病程[25]，延缓多巴制剂的使用时间及减少药物的不良反应，提高患者生活质量及方法提供了理论依据。近年来对脑肠肽的研究发现，脑肠肽可能通过影响肠道微生物与肠-微生物-脑轴的相互作用来发挥双向调节作用[27]。尽管目前神经肽对微生物及中枢神经系统的相互作用尚有待分析，在健康与疾病之间脑肠肽可能成为神经和内分泌编排细菌-肠-脑的信使，进而影响神经系统疾病与内分泌疾病。参考文献[1]RedmondEM，SitzmannJV，CahillPA.Potentialmechanismsforcardiovascularprotectiveeffectofethanol[J].ActaPharmacolSin,2000,21(5):385-390.[2]朱镛连.神经递质与疾病和药物康复[J].中国康复理论与实践,2011,17(2):198-200.[3]栾守婧,付文玉,庄文欣,等.帕金森病大鼠中缝背核5-HT、NPY、SP蛋白及mRNA的表达变化[C]//解剖学杂志编辑委员会.中国解剖学会2013年年会论文文摘汇编,郑州,2013.上海:解剖学杂志编辑部,2013:64.[4]陈大庆,倪宏.缩胆囊素生物学作用的多样性[J].国外医学:儿科学分册,2002,29(3):164-166.[5]HengYJ,SaundersCI,KundeDA,etal.TRPV1，NK1receptorandsubstancePimmunoreactivityandgeneexpressionintheratlumbosacralspinalcordandurinarybladderaftersystemic,lowdosevanilloidadministration[J].RegulPept,2011,167(2/3):250-258.[6]MauborgneA,Javoy-AgidF,LegrandJC,etal.DecreaseofsubstancePlikeimmunoreactivityinthesubstantianigraandpallidumofParkinsonianbrains[J].BrainRes,1983,268(1):167-170.[7]JiangH,LiLJ,WangJ,etal.GhrelinantagonizesMPTP-inducedneurotoxicitytothedopaminergicneuronsinmousesubstantianigra[J].ExpNeurol,2008,212(2):532-537.[8]马晓凯,范凯.P物质与帕金森病[J].大连医科大学学报,2005,27(2):151-153.[9]Oh-IS,ShimizuH,SatohT,etal.Identificationofnesfatin-1asasatietymoleculeinthehypothalamus[J].Nature,2006,443(7112):709-712.31 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