苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的抗药性风险评估及生物源杀菌剂的室内活性评价

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分类号：S436.611.1+1学校代码：10712UDC：632研究生学号：2015050148密级：公开2018届攻读硕士学位研究生学位（毕业）论文苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的抗药性风险评估及生物源杀菌剂的室内活性评价学科专业植物病理学研究方向植物病害综合治理研究生王帅指导教师黄丽丽教授合作指导教师冯浩副教授完成时间2018.05中国陕西杨凌 Classificationcode:S436.611.1+1Universitycode:10712UDC:632Postgraduatenumber:2015050148Confidentialitylevel:PublicThesisforMaster’sDegreeNorthwestA＆FUniversityin2018RESISTANCERISKASSESSMENTOFVALSAMALITOPYRACLOSTROBINANDANTIFUNGALACTIVITYOFBIOLOGICALFUNGICIDESMajor:PlantPathologyResearchfield:PlantDiseaseIntegratedManagementNameofPostgraduate:WangShuaiAdviser:Prof.HuangLi-liCo-adviser:Assoc.Prof.FengHaoDateofsubmission:2018.05YanglingShaanxiChina 本研究由陕西省重点研发计划（2016TZC-N-3-2）及国家重点研发计划（2016YFD0201100）资助。 研究生学位（毕业）论文的独创性声明本人声明：所呈叉的硕士学位（毕业）论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究结果；论文中的研究数据及结果的获得完全符合学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》一切后果与法律责任均，如果违反此规定，由本人承担。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他人已经发表，或撰写过的研究结果，也不包含其他人和自己本人已获得西北农林科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文的致谢中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名＇：时间：加年“Ｓ曰导师指导研究生学位（毕业）论文的承诺本人承诺：我的硕士研究生ｉ所呈交的硕士学位（毕业）论文是在我ｙ指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现岗职务工作的结果，并严格按照学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》而获得的研究结果。如果违反学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，我愿接受按学校有关规定的处罚处理并承担相应导师连带责任。导师签名时间年Ａ月ｒ曰 关于研究生学位（毕业）论文使用授权的说明保本学位（毕业）论文的知识产权归属西北农林科技大学。本人同意西北农林科技大学存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版允许论文被查阅和借阅；，同意西北农林科技大学将本学位（毕业）论文的全部或部分内容授权汇编录入《优士中国秀硕学位论文全文数据库》和《中国学位论文全文数据进行出版权益库》，并享受相关。本人保证，在毕业离开（或者工作调离）西北农林科技大学后，发表或者使用本学位一（毕业）论文及其相关的工作成果时，将以西北农林科技大否愿学为第署名单位，则，意按《中华人民共和国著作权法》等有关规定接受处理并承担法律任。任何收责存和保不管得本论文各种版本的其他单位和个人（包括研究生本人）未经本论文作者的导师同意，有对本论文进行复制、修改、发行、出租、改编等侵犯权的按违著作行为，否则，背《中华人民共和国著作权法》等有关规定处理追究法律责任。并（保密的学位汇论编论文在文保密期限内，不得以任何方式发表、借闶、复印、缩印或担描复制手段保存、）研４究生签名：ＪＴ曰时间：＞０及年月／导师签名＾时间：以年么月广日／＾ 苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的抗药性风险评估及生物源杀菌剂的室内活性评价摘要苹果黑腐皮壳属真菌（Valsamali）侵染引起的苹果树腐烂病是一种毁灭性的枝干病害，严重威胁着我国苹果产业的健康可持续发展。由于病菌侵染途径多，潜伏性强，且致病机理复杂，导致该病防治非常困难。目前生产上主要采用化学药剂来防治腐烂病。然而，化学药剂的大量重复使用，会导致病原菌抗药性的产生，同时也造成了严重的环境污染问题。因此，评估化学药剂的抗药性风险，寻找高效低毒低残留的替代生物源杀菌剂，对于制定和实施苹果树腐烂病的防控措施及生产上科学用药具有重要意义。本研究通过测定苹果树腐烂病菌对一种高效、低毒、广谱的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）的敏感性，室内诱导获得吡唑醚菌酯的抗性菌株，分析抗性菌株的生物适合度及交互抗药性，系统评估了苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的抗药性风险。同时，通过测定不同生物源杀菌剂对腐烂病菌的毒力及其对接种腐烂病菌离体枝条的保护作用，评价了6种生物源杀菌剂的室内活性，为生产上合理用药及苹果树腐烂病的安全防治提供了科学依据，取得以下主要结果：1.测定了采自于辽宁、山东、甘肃、山西、陕西、新疆6个省份的120株苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的敏感性。结果表明，所有供试菌株对吡唑醚菌酯均有极高的敏感性，EC50值分布范围在0.00137-0.0240µg/mL之间，平均EC50值为0.00909±0.00552µg/mL，可作为苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的敏感性基线。不同菌株间EC50值差异较小，最不敏感菌株的EC50值是最敏感菌株的17.5倍。不同地区间的菌株对吡唑醚菌酯的敏感性存在一定的差异，最敏感的是新疆菌株，最不敏感的是辽宁菌株，未出现敏感性下降的腐烂病菌亚群体。2.随机选取14株苹果树腐烂病菌野生菌株，在含吡唑醚菌酯的培养基上驯化诱导，获得了3株能够稳定遗传的吡唑醚菌酯抗性菌株，其抗性倍数分别是野生亲本菌株的41.0，56.8和22.0倍。生物适合度分析结果显示，抗性菌株产繁殖体数量与野生亲本菌株相比无明显差异，但菌落生长直径、菌丝干重和致病力显著降低。与亲本菌株相比，吡唑醚菌酯抗性菌株对水杨肟酸（SHAM）和NaCl更敏感。交互抗药性结果显示，吡唑醚菌酯与戊唑醇、苯醚甲环唑、抑霉唑和甲基硫菌灵之间不存在交互抗药性。以上结果表明，苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯存在中低水平的抗药性风险。3.评价了6种生物源杀菌剂对腐烂病菌的室内活性。结果显示，6种供试药剂对腐烂病菌均有一定的抑制效果，除3%中生菌素WP外，其它5种药剂对分生孢子萌发的 抑制效果均优于对菌丝生长的抑制效果。其中，300亿/克解淀粉芽孢杆菌WP和1000亿/克枯草芽孢杆菌WP的室内毒力最强，对菌丝生长的EC50分别为0.69μg/mL和0.89μg/mL，对分生孢子萌发的EC50分别为0.19μg/mL和0.039μg/mL。其次为3%中生菌素WP、0.5%小檗碱AS和0.4%蛇床子素SL3种药剂，对菌丝生长的EC50为26.06-290.7μg/mL，分生孢子萌发的EC50为8.29-65.22μg/mL。而2%农抗120AS对菌丝生长的EC50高于5000μg/mL，毒力最差。离体枝条保护试验结果显示，300亿/克解淀粉芽孢杆菌WP和1000亿/克枯草芽孢杆菌WP对离体枝条保护作用最强，其室内防效分别为92.7%和86.7%，而2%农抗120AS保护作用最差，这与室内毒力测定结果相一致。以上结果表明，300亿/克解淀粉芽孢杆菌WP和1000亿/克枯草芽孢杆菌WP可作为防治苹果树腐烂病的替代生物源杀菌剂。关键词：苹果树腐烂病菌；吡唑醚菌酯；抗药性风险；生物源杀菌剂；毒力 RESISTANCERISKASSESSMENTOFVALSAMALITOPYRACLOSTROBINANDANTIFUNGALACTIVITYOFBIOLOGICALFUNGICIDESABSTRACTTheappleValsacanker(AVC)causedbyValsamaliisadevastatingbranchdiseasethathasseriouslythreatenedthehealthyandsustainabledevelopmentoftheappleindustryinChina.Thepathogencaninfectbranchesasymptomaticallythroughavarietyofwaysandthepathogenicmechanismiscomplex,makingitdifficulttopreventandcontrol.Inpractice,theapplicationoffungicideshasbeenthemainmethodtocontrolAVC.However,repeateduseofchemicalagentscanleadtothedevelopmentofresistancetopathogensandseriousenvironmentalpollution.Therefore,theassessmentofchemicalagentsresistanceriskandsearchingforhigh-efficiency,low-toxicityandlowresiduealternativebiologicalfungicidesareofgreatsignificancefortheformulationandimplementationofAVCpreventionandcontrolmeasuresandscientificpesticidesusedinpractice.Theobjectivesofthisstudywereto(i)determinethebaselinesensitivityofnaturalpopulationsofV.malitopyraclostrobinwhichbelongstothequinoloxidationinhibitor(QoI)classwithhighlyefficient,low-toxicity,broad-spectrum;(ii)generatepyraclostrobin-resistantstrains(PRstrains)ofV.mali;(iii)measurethebiofitnessoftheseresistantstrainsinvitro;(iv)assaythecross-resistancerelationshipsbetweenpyraclostrobinandotherfungicides,and(v)screenofbiologicalfungicidestoimproveourunderstandingofresistancedevelopmenttopyraclostrobinofV.maliandprovideascientificbasisforthesecuritypreventionofAVC.Themainresultsareasfollows:1.Intotal,120isolatesofValsamaliwerecollectedfromsixprovinces(Liaoning,Shandong,Gansu,Shanxi,Shaanxi,andXinjiang)ofChina.Thebaselinesensitivityoftheseisolatestopyraclostrobinwasdetermined.Allcollectedstrainsshowedsimilarsensitivitytopyraclostrobin,whichhadstrongantifungalactivitywithEC50valuesfrom0.00137to0.0240µg/ml.ThebaselinesensitivitywasdistributedasaunimodalcurvewithameanEC50valueof0.00909(±0.00552)μg/ml.ThedifferenceinEC50valuesamongdifferentstrainsissosmallthattheratioofthemaximumtotheminimumEC50valueswas17.5.ThemeanEC50valuesdifferedamongdifferentgeographiclocations.ThemostsensitivestrainisfromXinjiangand themostinsensitivestrainisfromLiaoning.Nosub-populationofV.maliwithreducedsensitivity.2.Threepyraclostrobin-resistantstrains(PRstrains)wereobtainedbydomesticationofpyraclostrobinthroughfourteenisolatesofV.malirandomlyselected.Theresistancefactorofresistantstrainswas41.0,56.8and22.0-foldcomparedwiththeirparentalisolates,respectively.Theresistanceofthestrainswasfoundtobestableafter10serialtransfersonpyraclostrobin-freemedium.Moreover,thephenotypesofPRstrainswereobserved.ThenumberofpropagulesbetweenthePRstrainsandtheirparentalisolatesshowednosignificantdifferences,butthehyphalgrowthonPDA,mycelialdryweightandpathogenicityweresignificantlylowerthanthoseoftheirparentalisolates.Sensitivitytothealternativeoxidaseinhibitorsalicylhydroxamicacid(SHAM)andNaClwereincreasedinthePRstrains.Furthermore,nocross-resistanceexistedbetweenpyraclostrobinandtebuconazole,difenoconazole,imazalil,andthiophanatemethyl.Therefore,pyraclostrobincancurrentlyberecommendedtocontrolappleValsacankerwithalow-to-moderateriskofresistance.3.EvaluatingantifungalactivityofsixbiologicalfungicidesagainstV.maliinvitro.TheresultsshowedthatallthetestedagentsdisplayedinhibitoryeffectsonV.mali.Theypresentedstrongerinhibitoryeffectsonconidialgerminationthanmycelialgrowthwiththeexceptionof3%ZhongshengmycinWP.Amongthem,3.0×1010cfu/gBacillusamyloliquefaciensWPand1.0×1011cfu/gB.subtilisWPwerethemosttoxicwithEC50valuesof0.69μg/mL,0.89μg/mLformycelialgrowthand0.19μg/mL,0.039μg/mLforconidialgermination,respectively.TheEC50valuesof3%ZhongshengmycinWP,0.5%berberineAS,and0.4%ostholSLwererangedfrom26.06μg/mLto290.7μg/mLformycelialgrowthand8.29μg/mLto65.22μg/mLforconidialgermination.However,2%Nongkang120ASwasthelowesttoxicsincetheEC50ofmycelialgrowthwashigherthan5000μg/mL.Theprotectivemeasuresforprotectinginoculationonexcisedtwigsshowedthat3.0×1010cfu/gBacillusamyloliquefaciensWPand1.0×1011cfu/gB.subtilisWPhadthehighestprotectioneffectonshootgrowthwith92.7%and86.7%ofcontroleffect,but2%Nongkang120ASshowedtheworstprotectioneffect,whichwasconsistentwiththevirulencetestresults.Therefore,3.0×1010cfu/gB.amyloliquefaciensWPand1.0×1011cfu/gB.subtilisWPcouldbeusedasalternativebiologicalfungicidesforcontrollingAVC.KEYWORDS:Valsamali;pyraclostrobin;resistancerisk;biologicalfungicides;toxicity 目录第一章文献综述....................................................................................................................11.1苹果树腐烂病的研究概况..........................................................................................11.1.1苹果树腐烂病的发生及危害..........................................................................11.1.2苹果树腐烂病的症状......................................................................................11.1.3苹果树腐烂病的病原......................................................................................21.1.4苹果树腐烂病的发病因素..............................................................................31.2苹果树腐烂病的防治概况..........................................................................................41.2.1农业防治..........................................................................................................41.2.2生物防治..........................................................................................................51.2.3化学防治..........................................................................................................51.3甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的研究进展......................................................................61.3.1作用机理..........................................................................................................61.3.2抗药性研究进展..............................................................................................71.3.3吡唑醚菌酯研究现状......................................................................................81.4本论文的研究目的及意义..........................................................................................9第二章苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯敏感性基线的建立..............................................102.1材料与方法..............................................................................................................102.1.1供试菌株........................................................................................................102.1.2供试药剂及培养基........................................................................................102.1.3主要仪器设备................................................................................................102.1.4腐烂病菌对吡唑醚菌酯敏感性测定............................................................112.1.5数据统计和分析............................................................................................112.2结果与分析..............................................................................................................112.2.1腐烂病菌对吡唑醚菌酯敏感性基线的建立................................................112.2.2不同地区腐烂病菌对吡唑醚菌酯的敏感性................................................162.3讨论..........................................................................................................................16第三章苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的抗药性风险评估..............................................183.1材料与方法..............................................................................................................183.1.1供试菌株........................................................................................................183.1.2供试药剂及培养基........................................................................................183.1.3主要仪器设备................................................................................................19 3.1.4药剂驯化获得抗药性菌株............................................................................193.1.5抗药性菌株抗性水平及其遗传稳定性测定................................................193.1.6生长量及繁殖体数量测定............................................................................193.1.7致病力测定....................................................................................................203.1.8对NaCl和SHAM敏感性测定....................................................................203.1.9交互抗药性测定............................................................................................203.1.10数据统计和分析..........................................................................................213.2结果与分析..............................................................................................................213.2.1抗性菌株抗性水平及遗传稳定性测定的结果............................................213.2.2感、抗菌株生长量及繁殖体数量测定的结果............................................213.2.3感、抗菌株致病力测定的结果....................................................................233.2.4感、抗菌株对NaCl和SHAM敏感性测定的结果....................................243.2.5交互抗药性....................................................................................................253.3讨论..........................................................................................................................26第四章6种生物源杀菌剂对苹果树腐烂病菌室内活性评价...........................................284.1材料与方法..............................................................................................................284.1.1供试菌株........................................................................................................284.1.2供试药剂及培养基........................................................................................284.1.3主要仪器设备................................................................................................284.1.46种生物源杀菌剂对腐烂病菌菌丝生长的抑制效果测定.........................284.1.56种生物源杀菌剂对腐烂病菌分生孢子萌发的抑制效果测定.................294.1.66种生物源杀菌剂对苹果离体枝条的保护作用测定.................................304.1.7数据统计和分析............................................................................................304.2结果与分析..............................................................................................................304.2.16种生物源杀菌剂对腐烂病菌菌丝生长的影响.........................................304.2.26种生物源杀菌剂对腐烂病菌分生孢子萌发的影响.................................314.2.36种生物源杀菌剂对苹果离体枝条的保护作用.........................................314.3讨论..........................................................................................................................33第五章全文总结..................................................................................................................345.1本研究获得的主要结果..........................................................................................345.2本文尚待解决的问题..............................................................................................34参考文献..................................................................................................................................35致谢........................................................................................................................................44作者简介..................................................................................................................................45 第一章文献综述1.1苹果树腐烂病的研究概况1.1.1苹果树腐烂病的发生及危害由苹果黑腐皮壳属真菌（Valsamali）侵染引起的苹果树腐烂病是一种毁灭性的枝干病害，造成苹果树皮腐烂坏死（黄丽丽等2001；臧睿等2007；Lietal.2015），俗称“臭皮病”或“烂皮病”。病害轻时引起树皮组织腐烂、树势衰弱、苹果品质和产量下降，严重时引起整树枯死，甚至毁园，给果农造成巨大的经济损失，已严重威胁到我国苹果产业的健康可持续发展（高克祥等1995；李正鹏等2013；Keetal.2013）。苹果树腐烂病是一种世界性的病害，于1903年在日本首次被发现。目前主要分布在中国、日本和韩国（曹克强等2009；Abeetal.2007；Dongetal.2006；Suzaki2008），美国、加拿大、俄罗斯和英国等国家也有少量分布（陈策等1987）。我国在1916年于辽宁省的南部地区第一次发现苹果树腐烂病，至今为止已经出现4次发病高峰期。该病第一次高峰期是发生在1947至1949年间，因为当时处于战争期间，果园疏于管理且冻害严重，腐烂病的发病率接近60%；第2次发病高峰期是在1960年左右，发生原因可能是由于人们盲目的追求苹果高产而造成果树树势衰弱，导致腐烂病大流行；第3次发生是在1976年文革期间，由于果园疏于管理使腐烂病的发生不断加重；第4次发生是在1987年左右，由于自然环境的因素和还未完善的分产到户政策，使国内多个地区腐烂病爆发，严重的地方发病率超过40%。近年来有调查发现，由于不合理施肥和冻害等原因，我国北方出现了第5次发病高峰（罗荣华2004；赵增锋等2011）。王磊在2003和2004年调查发现，陕西关中地区的13~17年生苹果树的平均发病率为19.46%，发病率最高的达92%，基本导致毁园（王磊等2005）。2008年曹克强调查发现，我国陕西、山东、甘肃等苹果主产区的腐烂病总发病率高达52.7%，树龄在4~10年的果树，发病率为26.8%，树龄在11~17年的果树，发病率为54.0%，树龄在18~24年的果树，发病率为59.3%（曹克强等2009）。2014年薛应钰等对甘肃省主要苹果产区的腐烂病发生情况的调查结果显示，腐烂病总发病率为41.09%，尤其长势差的园子有60%树体发病，其中镇原、庆城和庄浪果园的发病率最为严重（薛应钰等2015）。1.1.2苹果树腐烂病的症状腐烂病主要为害苹果树的主干、大枝和侧枝，造成树皮腐烂坏死。当侧枝上的树皮坏死一圈时会终断侧枝营养输送，发病部位以上的树枝就会由于缺失养分导致死亡而不能再结果。当树体主干发病时，整树营养无法正常供给，就会造成果树死亡。苹果树腐烂病在田间可分为溃疡型和枝枯型两种典型症状。1 图1-1苹果树腐烂病的主要症状Fig.1-1ThemainsymptomsoftheappleValsacanker溃疡型主要在苹果树的主干和大枝上发生。在发病初期，发病部位的树皮微隆起，呈现红褐色，病斑边缘具有水渍状，其内部组织松软腐烂变褐。在发病中期，有黄褐色汁液从病部流出，腐烂的树皮极容易剥离，剥开后呈湿腐状，闻起来有酒糟味。在发病后期，腐烂树皮逐渐失水干缩，变为黑褐色，表面产生黑色的分生孢子器。当空气湿度达到一定条件时，黑色的分生孢子器中会溢出黄色的分生孢子角（王金友等1988；王金友等1989）。枝枯型主要在小枝、果苔和干枯的枝杆上发生。在发病初期，病部呈现红褐色，并伴有肿胀潮湿的现象，但病健交界处不明显，发病部位逐渐变干枯死。在发病后期，腐烂树皮表面长出大量分生孢子器，当树皮坏死一圈时，会使小枝枯死，并且病斑向下方的大枝不断延伸，使大枝发病（张善江1993；张王斌等2006）。此外，有研究表明，腐烂病菌也会侵染苹果果实，表现出红褐色与黄褐色相间的波纹状病斑，病健交界清晰，果实腐烂，有酒糟味。1.1.3苹果树腐烂病的病原日本学者1903年发现苹果树腐烂病，将其病原命名为ValsamaliMiyabeetYamada，无性型为CytosporamandshuricaMiura（Ideta1909），Kobayashi等在1970年通过比较苹果树腐烂病病原菌V.mali及其它阔叶树腐烂病病原菌V.ceratosperma(Tode:Fr.)Maire发现它们在形态学上基本相同，认为V.mali和V.ceratosperma为同一个种，并将日本苹果树腐烂病菌更名为V.ceratosperma(Tode:Fr.)Maire（Kobayashi1970）。但是后来许多研究表明，苹果树腐烂病菌和其它阔叶树腐烂病菌不是同一个物种，两者存在较大差异。Kanehira等研究发现这两种腐烂病菌产生的同工酶谱差异较大（Kanehiraetal.1991）。Suzaki等研究发现苹果树腐烂病菌能够降解根皮苷，可对休眠期的苹果枝条致病，而阔叶树腐烂病菌没有此能力（Suzakietal.1997）。Suzaki等还发现苹果树腐烂病菌rDNA-ITS(InternalTranscribedSpacer)区段的PCR产物酶切图谱（AIuI,HaeIII,HpaII,SamI）带型与阔叶树腐烂病菌有差异。Adams等对各类黑腐皮壳属（V.spp.）和其对应的壳囊孢属(C.spp.)rDNA-ITS序列及形态学进行了研究，发现V.ceratosperma(TodeetFr.)Maire具有多个不同谱系，其形态都属于小孢子型（Adamsetal.2005）。王2 旭丽通过比较苹果树腐烂病菌形态特征和ITS序列，发现中国苹果树腐烂病菌无性型可分为：C.schulzeri、C.sacculus和C.persoonii，其对应的有性型分别为V.malicola、V.ceratosperma和V.persoonii（王旭丽2007）。藏睿的研究认为中国苹果树腐烂病菌可分为3个种：ValsamaliMiyabeetYamada，V.malicolaZ.Urb和V.persoonii，其中V.mali又有两个变种：V.malivarmali和V.malivarpyri，ValsamaliMiyabeetYamada是我国苹果树腐烂病最主要的致病菌（臧睿2012），这研究结果与王旭丽的相吻合。1.1.4苹果树腐烂病的发病因素1.1.4.1病害循环苹果树腐烂病的病原菌越冬场所主要在病枝干、果园及周围堆放的病残体上，越冬主要形式包括菌丝体、分生孢子、分生孢子器、子囊孢子和子囊壳等。分生孢子在苹果树腐烂病菌侵染过程中充当主要初侵染源，巨大的数量使其侵染后的发病率远远高于子囊孢子（王金友2006）。每年11月到12月和第二年的2月到3月是病害发生的两个高峰期（杜战涛等2013）。在病原菌孢子入侵时，先在树皮的自然落皮层中营腐生生活，此时处于潜伏状态，外观无明显症状。进入夏季以后，病菌侵入树皮坏死组织使落皮层发生病变，自7月中上旬起，树皮表面形成大量土灰色凹凸不平的隆起斑和片状斑。晚秋至初冬，苹果树进入休眠阶段，生活力下降，病菌在树体内部活动增强，穿透皮层，进入健康的组织，形成坏死斑点，并逐渐扩大病斑，出现病害发展的第一个高峰期（焦浩等2016）。深冬季节，温度较低，病菌扩展非常缓慢，其症状不明显。进入春季以后，随着气温的不断升高，病害扩展迅速，病部皮层大面积溃烂，出现大量枝枯型和溃疡型的典型症状，出现病害发展的第二个高峰期，至5到6月份，发病盛期才结束（陈利锋等2001）。1.1.4.2潜伏侵染苹果树腐烂病菌属于弱寄生性丝状真菌，病菌能通过表皮伤口或者自然孔口入侵皮层组织（柯希望2013）。苹果树自身的抗病能力强弱是被侵染树体是否发病的决定因素。大量研究表明，苹果树腐烂病菌具有潜伏侵染特性。潜伏的病原菌在树体内等待时机，当树势衰弱，其抗病能力下降时就在组织中迅速扩展，导致果树发病。刘福昌等研究发现外观无病的苹果枝条，经低温处理，保湿培养后，能产生腐烂症状，且可以检测到腐烂病菌（刘福昌等1979）。Bills等和Boddy等的研究表明，部分腐烂病菌可寄生于苹果树树皮而并不表现症状，但是当树皮中含水量降低到一定程度时，病原菌就会迅速扩展，形成新病斑（Billsetal.1996；Boddyetal.1983）。Zang等（Zangetal.2012）采用巢氏PCR技术检测无明显症状的苹果树枝条组织中的带菌率，发现供试枝条带菌率高达64.7%。苹果树腐烂病菌潜伏侵染的特性使得生产实践中对腐烂病的防治困难重重。3 1.1.4.3病害流行条件影响腐烂病发生与流行最关键的因素是苹果树树势的强弱。凡是能够导致果树树势衰弱的因素都能诱发腐烂病的发生。果树的负载量、树龄、果园管理水平等因素均与果树树势密切相关，都是影响腐烂病发生的相关因素。树体的负载量过大，会降低树体内储藏的营养物质，树势衰弱，腐烂病便易于发生（李明贤1995）。一般果树大年发病比常年多，发病期较长且危害大；果树小年腐烂病发生相对较轻。树龄越大，树势越弱，苹果树腐烂病发生越重；树势强壮，树体营养水平高，腐烂病就不易发生（陈曲2011）。果园管理水平也直接影响了苹果树的树势。施肥不足，尤其是缺少磷钾肥是影响树势衰弱的主要原因。果树的种植密度和修剪方式与腐烂病的发生密切相关，种植密度过大和不合理的修剪必定会导致果树的树势衰弱，使腐烂病发生加重（刘如香2011）。腐烂病的流行与果园菌源量和各种气象因素也有一定的关系。春秋季清园、烧毁病残体、修整剪锯口和彻底刮除腐烂病斑等措施，能减少初始菌源量，有效降低腐烂病发病率。温度和降雨量是腐烂病病情的重要影响因素，在适宜温度和湿度条件下，温度越高，腐烂病发生越重（Tekauz1974）。冻害和日灼也作为削弱果树树势的因素，其可以制造伤口，增加树皮表面坏死组织，为病原菌顺利侵入树皮内和快速扩展创造条件。果树向阳面的枝干长时间日照容易发生日灼，会使腐烂病发生加重。1.2苹果树腐烂病的防治概况由于苹果树腐烂病菌具有潜伏侵染特性，发病时间与感病时间不一致，发病因素众多，人们对其流行规律还未彻底清楚，再加上目前栽培的苹果树均为腐烂病菌的感病品种，导致该病在防治上困难重重。当前生产上，腐烂病的防治提倡以提高苹果树的树势为中心，清除果园初始病菌为重心，减少田间操作造成的伤口，刮除病斑，涂抹高效低毒的药剂进行综合防治。1.2.1农业防治腐烂病的发生与果园栽培管理、果树树势和病部能否及时刮除治疗有着直接的关系。而加强栽培管理，提高果树自身抗病能力是防治腐烂病的关键（陈亚玲等2008）。果树树势主要与果树负载量、果树生长状况和土壤肥力等因素有关。在果树处于盛果期时，要及时疏花疏果，严格控制负载量，每亩以6000~8000个果实为宜（方芳2011）。采用“秋控春灌”的灌水方法，合理灌溉。秋季控水有利于苹果枝条成熟，春季灌水能够增强果树树势，可在一定程度上减少腐烂病的发生。田间合理施肥对于腐烂病的防治也至关重要。在马宏彪等的研究中发现，苹果叶片在含钾量为1.25%时不发病，但含钾量越低，且树体含氮量过高时，会促进腐烂病发生（马宏彪2016）。因此，在田间施肥时，要注意将各种有机质和农家肥搭配化肥使用，控制氮肥的施用量，保证氮钾肥的比例平衡。同时，做好果园的清理工作也是防治腐烂病的重点。对病树病枝、修剪下来4 的枯枝及刮除病斑后的烂皮等要及时移出果园，焚烧或做深埋处理，以减少果园菌源量。1.2.2生物防治生物防治具有无毒害，无污染，对环境友好，不易产生抗药性等优点，不仅符合人们对绿色健康食品的需求，而且能为未来农业可持续发展提供保障，因此研发高效低毒的生物药剂已经成为植物保护工作者关注的热点。对于腐烂病的生物防治，近年来国内外学者的研究主要包括利用植物源农药及微生物农药两个方面：1、植物源活性物质。段泽敏等（2002）提取了常见植物组织中的有效物质，制成膏剂后作用于腐烂病菌，发现其有效率、病情复发率和伤口治愈率都要优于传统药剂。张义英等（2006）发现骆驼蓬醇提取物对腐烂病菌的菌丝生长抑制作用良好。罗兰等（2006）发现邻烯丙基苯酚能有效抑制腐烂病菌子囊壳的形成并使菌丝细胞壁增厚。郭道森等（2004）发现迷迭香酸对腐烂病菌菌丝生长和分生孢子萌发抑制效果都非常明显。姜玉娟（2010）将白头翁提取物制成涂抹剂，其对腐烂病的防治效果与1.5%噻霉酮水乳剂相当。2、微生物及其次生代谢物。螺旋毛壳ND35β-1-3葡聚糖酶和土壤放线菌Z-6发酵滤液对腐烂病菌均有显著的抑制作用（郭晓等2005；展立然等2008）。有研究报道，哈茨木霉菌T_(88)（Trichodermaharzianum)对腐烂病菌及其他多种病原菌都有明显的抑制作用（高克祥等1999）。植物内生放线菌Hhs.015(BAR1-5)活菌和无菌发酵滤液对腐烂病菌菌丝生长和分生孢子萌发都有明显的抑制作用且有良好的病斑愈合效果（郜佐鹏2009；Lietal.2016）。1.2.3化学防治目前在生产上，因为操作简单，使用方便且见效快，防治苹果树腐烂病的药剂仍然以化学药剂为主(Wangetal.2017)，而主要操作方法是刮除病斑，涂抹药剂。郜左鹏报道了刮治病斑的防治效果显著优于病斑划线法，每年3月份是刮治病斑的最佳时间，此时刮治后的病斑伤口愈合最快（郜佐鹏2009）。焦浩等报到了每年6~8月份，间隔7~10天对苹果树树干刮除粗老翘皮，涂抹药剂，能够有效杀灭皮层内的腐烂病菌（焦浩等2016）。早在上世纪50年代曾尝试采取喷施保护性杀菌剂，以预防腐烂病，但未能获得预期的效果。60年代初人们开始研究铲除性或内吸性的杀菌剂来防治潜伏侵染的病菌。70~80年代，防治腐烂病的主要化学药剂有福美砷、硫酸铜液、石硫合剂和黄腐酸等（方中达1998）。20世纪90年代以后，研发出了对杀灭病原菌孢子效果良好的新型农药，如菌毒清、苯扬粉乳油、施纳宁、烯唑醇、噻霉酮等（丁爱云等1996；史怀宝2009；苏英科等1994；徐超等2005；张王斌等2005）。目前，防治苹果树腐烂病施药混乱，果农不合理，不规范的重复大量使用化学药剂，容易使病原菌产生抗药性，同时也产生了严重的环境污染问题。高毒高残留的化学药剂在农业生产中早已不适用，因此，福美砷已经被禁止使用（曹克强等2009；赵政阳等2007）。苯并咪唑类杀菌剂甲基硫菌灵可以防治苹果树腐烂病（王磊等2009），然而，此类杀菌剂能够预防病菌的侵染，但5 是不能抑制老病斑的扩展（Tamuraetal.2009）。随着苯并咪唑类杀菌剂反复高浓度的使用，在不同病菌中已经产生了不同水平的抗药性（Chenetal.2013）。近年来，三唑类杀菌剂戊唑醇和苯醚甲环唑，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂丁香菌酯和吡唑醚菌酯对苹果树腐烂病的防治具有很好的效果，已成为防治苹果树腐烂病的替代化学药剂（陈亮等2009；郭晓峰等2015；马永强等2012；王磊等2009）。1.3甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的研究进展甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是由真菌的次生代谢物进行改造后形成的一类具有杀菌活性的化合物。20世纪70年代，德国与捷克的科学家先后在不同种类的蘑菇里分离到了黏磨菌素，由于它们都拥有β-甲氧基丙烯酸酯相同的结构单元，故被统称为β-甲氧基丙烯酸酯类（strobilurinA）化合物（耿丙新2014；刘祖明2008）。天然产物具有易挥发，稳定性差等诸多缺点，导致此类化合物不能直接应用。但其作用方式独特，杀菌活性强，很快引起了许多农药公司的关注。20世纪80年代，两家农化公司捷利康和巴斯夫开始将天然化合物strobilurinA用于农药研究中，在1996年分别开发出了首批产品嘧菌酯和醚菌酯，并于同年在德国注册登记，其销售额仅10年左右就超越了三唑类杀菌剂。目前在生产上投入使用的有嘧菌酯、苯醚菌酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯、肟醚菌胺、烯肟菌酯、啶氧菌酯、苯氧菌胺、肟菌酯、氟醚菌酯、醚菌胺、氯啶菌酯、烯肟菌胺和丁香菌酯等十多个品种，已成为销量最高的一类重要的杀菌剂（张鹭等2010），在农药领域开启了一个新的里程碑。此类杀菌剂是一类高效、广谱、低毒、环境友好的内吸性杀菌剂，具有保护、治疗和铲除作用。它们对于农业生产上的多种病原菌均有较好的抑制活性，如子囊菌纲、担子菌纲和半知菌纲，对卵菌纲的病原菌等也有一定的抑制活性。已有大量研究表明，此类杀菌剂可防治多种植物病害，如稻瘟病、霜霉病、锈病、立枯病、网斑病和白粉病等，而且对二羧酰胺类、14α-脱甲基化酶抑制剂类和苯并咪唑类等不同种类杀菌剂产生抗药性的病原菌也都有较好防效（Bartlettetal.2002；Hermsetal.2003；Sauteretal.1999）。1.3.1作用机理甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂主要是影响呼吸作用，阻碍病原菌能量的合成，进而抑制生长，使病原菌能量供应不足而死亡（Bartlettetal.2002；Vonetal.1984）。此类杀菌剂进入病原菌体内后，通过与线粒体复合物Ⅲ（Cytbc1复合体）上的细胞色素b（Cytb）的还原型辅酶Q的氧化位点（Qo位点）相结合阻断ubiquinol的氧化，进而阻碍了电子由Cytb流向Cytcl，导致病原菌的呼吸作用受到抑制，使能量合成遭到破坏（Bartlettetal.2002；Geieretal.1994；Ypemaetal.1999），因此这类杀菌剂又被称为Qo位点抑制剂（QoIs）。QoIs与Cytb相结合阻断电子的传递，并不是直接阻止其与氢醌相结合，而是阻止电子由氢醌（QH2）向Fe-S中心传递，进而干扰了ATP的合成。6 1.3.2抗药性研究进展甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂虽然具有很高的杀菌活性，但是其与苯并咪唑类、14α-脱甲基化酶类抑制剂一样，作用位点单一，具有很高的潜在抗药性风险。此类杀菌剂在欧洲于1996年开始用于小麦白粉病的防治。不幸的是，在德国北部使用两年后就发现了抗性倍数大于500的抗药菌株。到1999年，在德国其它地区以及英国、比利时、法国和丹麦等国家都监测到了甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗性菌株（李志念等2004；Sierotzkietal.2000b）。2002年，Vincelli和Dixon的研究发现，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂对于黑麦草叶斑病的防治失败。2003年，Ma等（Maetal.2003）的研究发现，在没有施用过嘧菌酯的开心果园中，开心果晚疫病菌（Alternariaalternata）对嘧菌酯非常敏感，然而在连续用药4年以后，Alternaria菌株对嘧菌酯敏感性显著降低，其抗性倍数超过了2200倍。近年来，此类杀菌剂在世界范围内得到了的广泛应用，在田间的多种植物上都监测到了抗药性病原菌，如玉米、草莓、小麦、葡萄、鹰嘴豆和香蕉等（Bartlettetal.2002；Ishiietal.2001；Owatietal.2017；Pokornyetal.2016）。近年来，分子生物学技术快速发展，通过基因手段研究杀菌剂的抗性机制已经成为抗药性研究领域最大的热点。研究表明，在大多数情况下，病原菌对QoIs类杀菌剂产生抗药性是由于细胞色素b基因第143位鸟嘌呤（G）突变成胞嘧啶（C），最终导致甘氨酸（GGT）被丙氨酸（GCT）取代（G143A）（Bardasetal.2010；Brasseuretal.1996；Fanetal.2015；Fernández-Ortuñoetal.2008；Fernández-Ortuñoetal.2012；Fraaijeetal.2005；Ishiietal.2001；Ware2006；Yinetal.2012），且在各种病原菌中G143A突变体都表现出高水平的抗药性，原因可能是单个氨基酸发生突变导致细胞色素bc1复合体构象发生改变，从而阻止了药剂与细胞色素b的Qo位点相结合。在一些植物病原菌中，细胞色素b基因129位苯丙氨酸被亮氨酸取代（F129L）、137位甘氨酸被精氨酸取代（G137R）和275位亮氨酸被丝氨酸或苯丙氨酸取代（L275S/F）的突变体也表现出对QoIs类杀菌剂的抗药性，像瓜果腐霉菌（Pythiumaphanidermatum）（Gisietal.2002），稻瘟病菌（Pyriculariagrisea）（Kimetal.2003），茄链格孢菌（Alternariasolani），霜霉病菌（Plasmoparaviticola），网斑病菌（Pyrenophorateres）和偃麦草核腔菌（Pyrenophoratritici-repentis）等（Sierotzkietal.2007），但这些突变都导致较低水平的抗药性。旁路氧化途径（alternativepathwayofrespiration）是呼吸链的一个支路，旁路氧化酶（alternativeoxidase,AOX）是旁路氧化途径的关键酶。AOX在真菌中主要以两种方式存在，在灰霉病菌中，AOX是组成型表达的（Tamuraetal.2015），在稻瘟菌和粗糙脉孢霉菌（Neurosporacrassa）中，AOX被诱导表达，在正常情况下，AOX酶不能被检测到或表达水平很低，若细胞正常电子传递途径被抑制或阻断，AOX才会被诱导表达（Lambowitzetal.1989；Mizutanietal.1995）。已有研究表明，旁路氧化途径可以降7 低病原真菌对QoIs类杀菌剂的敏感性（张雅等2006；Bannoetal.2009；Woodetal.2003）。有研究者认为病原真菌对QoIs类杀菌剂产生抗性可能与其旁路氧化途径有关，旁路氧化途径由AOX催化，电子能够绕过复合物III和复合物IV进行传递，从而缓解QoIs类杀菌剂对病原真菌产生的毒性，引起抗药性的产生，即旁路氧化途径在一定条件下可能会替代线粒体的正常呼吸途径（Ziogasetal.1997）。然而，也有学者认为田间的病原真菌对QoIs类杀菌剂产生抗性不太可能与旁路氧化途径有关，因为该途径在呼吸作用中只是一个分支，不会起到支配的作用，而且植物能够产生（类）黄酮类物质来抑制此途径。所以到目前为止，还未有明确的机制能够证明旁路氧化途径能够导致病原真菌对QoIs类杀菌剂产生抗性。然而，目前尚未在田间发现小麦叶锈病菌（Pucciniarecondite）、苹果白粉病（Podosphaeraleucotricha）以及大豆锈病菌（Phakopsorapachyrhiza）对QoIs类杀菌剂产生抗药性的报道。经大量研究发现，原因可能与在Cytb基因的143位氨基酸之后是否直接存在内含子有关，若Cytb基因143位氨基酸之后直接存在内含子，发生突变就会使内含子剪切错乱，Cytb基因表达错误，从而导致病原菌的死亡（Grassoetal.2006；Kochetal.2015；Sierotzkietal.2007）。1.3.3吡唑醚菌酯研究现状吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）又称为唑菌胺酯，纯品为白色或浅米色无味结晶体，熔点为63.7~65.2℃，沸点为200℃，易溶于丙酮、甲醇等有机溶剂，分子式为C19H18ClN3O4，结构式为（图1-1）：图1-2吡唑醚菌酯结构式Fig.1-2Structureofpyraclostrobin在1993年由德国巴斯夫公司开发，2001年开始投入使用，是一种高效、广谱、低毒，对非靶标生物安全，环境友好的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。吡唑醚菌酯具有良好的内吸作用，可以茎叶喷雾、水面施药和种子处理等方式使用，能够被农作物快速吸收，主要滞留于叶部的蜡质层，还可通过内吸作用传送到叶片的背部，对叶片的正反两面都有防治效果。据报道，吡唑醚菌酯对植物病原真菌引起的病害具有极好的预防、治疗和铲除作用（杨丽娟等2012；Bartlettetal.2002），对孢子萌发和菌丝生长都有较强的抑制作用，现已经被广泛用于由子囊菌、半知菌、担子菌、卵菌等大多数种类病原真菌引起的病害的防治（Ahmedetal.2014；Fraseretal.2016；Patónetal.2017；Zhangetal.8 2016）。王红等（2014）的研究发现，25%吡唑醚菌酯乳油对防治水稻稻瘟病有较好的效果。李哲帅（2015）的研究表明，25%吡唑醚菌酯乳油能很好防治大豆叶斑病，并且对大豆有一定的增产作用。汪云法等（2015）研究发现，25%吡唑醚菌酯乳油2000倍液在3次施药后10d对桃树疮痂病的防效达93.1%。代玉立等（2017）研究发现，吡唑醚菌酯对73株玉米小斑病菌的室内EC50平均值为1.437±1.490µg/mL，其对玉米小斑病的田间防效也比较理想。目前生产上多使用吡唑醚菌酯与其他作用机理不同的药剂复配来防治病害。范子耀等（2011）和张帅等（2013）的研究发现，吡唑醚菌酯与苯醚甲环唑复配使用能有效提高对马铃薯早疫病和山药炭疽病的防效，并且增产率达45%以上。刘吉祥等（2017）研究发现，吡唑醚菌酯与戊唑醇按质量比1∶1复配对葡萄炭疽病有明显的增效作用。杀菌剂抗药性是植物病害防治中所面临的一个重要问题，尤其是大量使用单作用位点的杀菌剂（Vegaetal.2014）。自吡唑醚菌酯投入使用以来，其抗药性问题越来越突出，尤其是近几年，关于吡唑醚菌酯抗药性的报道越来越多。在美国的开心果园中发现了对吡唑醚菌酯、咯菌腈、嘧菌环胺、啶酰菌胺产生多重抗性的开心果晚疫病菌（A.alternata）（Avenotetal.2008；Avenotetal.2015）。在美国草莓上也发现灰霉病菌（Botrytiscinerea）对啶酰菌胺和吡唑醚菌酯已经产生抗性（Fernández-Ortuñoetal.2012；Kimetal.2010；Kimetal.2011；Yinetal.2012）。Fan等在田间发现了梨树上的链格孢菌（A.alternata）抗啶酰菌胺的同时，还抗吡唑醚菌酯和甲基硫菌灵（Fanetal.2015）。像大多数甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂一样，病原菌对吡唑醚菌酯产生抗药性主要是由于基因发生了点突变，已经报道的有细胞色素b基因序列的129位和143位发生点突变（Fernández-Ortuñoetal.2012；Samueletal.2011；Semaretal.2007）。1.4本论文的研究目的及意义由苹果黑腐皮壳属真菌（Valsamali）侵染引起的苹果树腐烂病在我国发生十分严重，病害轻时引起树皮组织腐烂、树势衰弱、苹果品质和产量下降，严重时引起整树枯死，一直是制约我国苹果产业健康发展的主要障碍之一。由于病菌侵染途径多，潜伏性强，且致病机理复杂，导致该病防治非常困难。目前生产上主要采用化学药剂来防治腐烂病。然而，化学药剂的大量重复使用，会导致病原菌抗药性的产生，同时也产生了严重的环境污染问题。因此，本研究通过测定苹果树腐烂病菌对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂吡唑醚菌酯的敏感性，室内诱导获得吡唑醚菌酯的抗性菌株，分析抗性菌株生物适合度及交互抗药性，系统评估了苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的抗药性风险，同时，通过测定不同生物源杀菌剂对苹果树腐烂病菌的毒力及其对接种腐烂病菌离体枝条的保护作用，评价了6种生物源杀菌剂的室内活性，旨在为生产上合理用药及苹果树腐烂病的安全防治提供科学依据，对于制定和实施苹果树腐烂病的防控措施及确保苹果的优质高产具有重要的理论指导意义。9 第二章苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯敏感性基线的建立吡唑醚菌酯是一类重要的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，对植物病原菌具有极好的预防、治疗和铲除作用，能够很好抑制病原菌孢子产生、萌发及菌丝生长，尤其是孢子萌发需要大量能量，使得其对此类杀菌剂极其敏感。自2001年投入使用以来，吡唑醚菌酯现已用于防治多种作物上的病害（柏亚罗2011）。对梨轮纹病菌（Botryosphaeriaberengerianaf.sp.piricola）、柑橘和辣椒炭疽病菌（Colletotrichumgloeosporioides）、香蕉黑星病菌（Macrophomamusae）、茄链格孢（Alternariasolani）等多种病菌都有很好的抑制效果（陈娟芳等2016；范子耀等2011；胡秀荣等2010；蒋军喜等2010；彭埃天等2008；蒲占湑等2014）。该药剂虽然于2013年就已在中国登记来防治苹果树腐烂病，但一直未得到大面积使用，其对苹果树腐烂病菌的敏感性水平也还未见报道。本研究采用菌丝生长速率测定了实验室保存的120株从不同地区采集来的苹果树腐烂病菌对该药剂的敏感性，并比较了不同地区腐烂病菌的敏感性差异，旨在为生产上吡唑醚菌酯对苹果树腐烂病的科学防治提供参考。2.1材料与方法2.1.1供试菌株自2008年至2016年从中国辽宁、山东、甘肃、山西、陕西、新疆6个省份采集来的病样，经组织分离、单菌丝纯化及鉴定，保存的600余份苹果树腐烂病菌菌株中随机挑选出120个菌株，于PDA斜面上4℃保存，用于测定对吡唑醚菌酯的敏感性，建立敏感性基线。2.1.2供试药剂及培养基化学纯吡唑醚菌酯原药（97.5%），由陕西西大华特科技实业有限公司生产，用丙酮溶解，配制成10mg/mL的母液于4℃保存备用；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）用于腐烂病菌菌株培养保存及药效测定。PDA配方：200g马铃薯，20g葡萄糖，15g琼脂粉加去离子水定容至1L，121°C高温高压灭菌30min；酵母甘油琼脂（AEA）培养基用于腐烂病菌对吡唑醚菌酯的敏感性测定。AEA配方：酵母粉5g，硝酸钠6g，磷酸二氢钾1.5g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.25g，甘油20ml，琼脂粉15g，加去离子水定容至1L，调节PH值至7左右，121°C高温高压灭菌25min。2.1.3主要仪器设备高压灭菌锅（LDZX-50KBS，上海）；超净工作台VS-1300L（苏州安泰空气技术10 有限公司）；DGX-9143B型鼓风干燥箱（上海南荣实验室设备有限公司）；万分之一电子天平（PL303，METTLERTOLEDO）；移液器（RAININ，USA）；25℃恒温培养箱；4℃冰箱等。2.1.4腐烂病菌对吡唑醚菌酯敏感性测定为了建立苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的敏感性基线，本实验采用菌丝生长速率法，测定了120株从全国不同地区采集的苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的敏感性。方法如下，从在PDA培养基上活化培养3d的腐烂病菌的菌落边缘用灭菌打孔器打取直径为5mm的菌饼，分别将其倒置转接于含有0，0.000625，0.0025，0.01，0.025，0.04，0.16，0.64，2.56µg/mL吡唑醚菌酯的AEA培养基上（Miguezetal.2004；Wangetal.2014），在25℃恒温培养箱中放置培养3d后，采用十字交叉法测量不同浓度含药培养基的菌落直径，计算出菌丝生长抑制率。每个浓度设置3个重复，实验重复2次。菌丝生长抑制率（%）=［(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)］×100%2.1.5数据统计和分析采用MicrosoftExcel2013进行数据处理，以各药剂浓度的对数值为横坐标（x），菌丝生长抑制率对应的机率值为纵坐标（y），作线性回归分析，计算不同药剂对腐烂病菌的EC250值和决定系数R，根据病原菌对吡唑醚菌酯的敏感性分布建立其对腐烂病菌的敏感性基线；数据显著性差异分析及其他统计学分析通过SPSS16.0完成。2.2结果与分析2.2.1腐烂病菌对吡唑醚菌酯敏感性基线的建立本研究采用菌丝生长速率法共测定了120株分别采自于辽宁、山东、甘肃、山西、陕西、新疆6个省份的苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的敏感性。所有EC50值如表2-1所示，EC50值分布范围在0.00137-0.0240µg/mL之间，平均EC50值为0.00909±0.00552µg/mL，最不敏感的菌株其EC50值是最敏感菌株EC50值的17.5倍。所有苹果树腐烂病菌菌株对吡唑醚菌酯的敏感性频率分布呈连续单峰曲线，近似于正态分布，如图2-1所示，未发现敏感性显著下降的腐烂病菌亚群体，即田间还未出现抗药性菌株。因此，可将平均EC50值作为苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的敏感性基线。11 表2-1120株苹果树腐烂病菌菌株对吡唑醚菌酯的敏感性Table2-1Sensitivityof120Valsamaliisolatestopyraclostrobin决定系数（R2）毒力回归方程菌株采集地点EC50(μg/mL)CoefficientofToxicityregressionIsolatesLocation2determination(R)equation901河南三门峡0.001370.9828Y=0.7842X+7.245XJVM009新疆0.002160.9892Y=1.3761X+8.6677637陕西渭南0.002360.971Y=1.489X+8.911598陕西延安0.002710.9274Y=0.5853X+6.5023753山西运城0.002860.967Y=0.806X+7.050906河南三门峡0.003040.912Y=1.023X+7.575XJVM008新疆0.003110.9737Y=1.1402X+7.8581893河南三门峡0.003150.9908Y=1.1435X+7.8601367新疆伊犁0.003200.947Y=0.336X+5.808XJVM006新疆0.003220.9825Y=1.3187X+8.2872XJVM001新疆0.003290.9864Y=1.3042X+8.2388550陕西咸阳0.003330.9897Y=1.326X+8.2867272山西万荣0.003390.911Y=0.887X+7.191XJVM005新疆0.003420.9649Y=1.1638X+7.8702620陕西咸阳0.003570.9514Y=0.7154X+6.7501754山西运城0.003570.991Y=0.923X+7.259478陕西咸阳0.003610.996Y=1.165X+7.845635陕西渭南0.003820.957Y=0.802X+6.93903-8陕西咸阳0.003820.9804Y=0.6493X+6.5697XJVM004新疆0.00390.9674Y=1.06X+7.5499XJVM007新疆0.003960.9944Y=1.0931X+7.6265748山西运城0.004000.968Y=0.752X+6.803891甘肃天水0.004030.9232Y=1.0982X+7.6298643陕西渭南0.004030.992Y=1.105X+7.646175山东招远0.004100.986Y=1.123X+7.681624陕西咸阳0.004110.9929Y=0.6442X+6.5375903河南三门峡0.004180.9787Y=1.633X+8.8854902河南三门峡0.004180.9889Y=1.7039X+9.0529897河南三门峡0.004300.904Y=1.364X+8.228XJVM003新疆0.004460.9663Y=0.901X+7.118322山西运城0.004470.974Y=1.539X+8.617505陕西咸阳0.004570.918Y=0.960X+7.247186山东烟台0.004870.983Y=0.701X+6.62112 决定系数（R2）毒力回归方程菌株采集地点EC50(μg/mL)CoefficientofToxicityregressionIsolatesLocation2determination(R)equation546陕西咸阳0.004900.9557Y=0.7987X+6.8433511陕西咸阳0.005030.95Y=0.798X+6.834662陕西铜川0.005030.987Y=1.137X+7.613972山东牟平0.005070.964Y=0.829X+6.902639陕西渭南0.005280.9374Y=0.9792X+7.2307983山东烟台0.005310.984Y=0.598X+6.362898河南三门峡0.005410.9519Y=0.8404X+6.9049419辽宁0.005470.9303Y=0.6107X+6.3806910河南三门峡0.005580.988Y=1.247X+7.811585陕西延安0.005630.9818Y=1.5122X+8.401181山东招远0.005680.999Y=0.978X+7.196345山西运城0.005750.989Y=1.103X+7.471894河南三门峡0.005820.97Y=0.7026X+6.5706627陕西咸阳0.005820.9606Y=0.9147X+7.0436895河南三门峡0.006020.9921Y=1.0079X+7.2379877甘肃天水0.006060.9717Y=0.8111X+6.7998987山东烟台0.006130.981Y=1.122X+7.483905河南三门峡0.006240.9491Y=1.4628X+8.2249878甘肃天水0.006420.9607Y=0.8728X+6.9138366新疆伊犁0.006830.991Y=1.463X+8.168889甘肃天水0.006870.9392Y=0.8781X+6.8994231陕西咸阳0.006930.968Y=1.276X+7.755XJVM002新疆0.006980.9649Y=0.7647X+6.6499421辽宁0.007030.9882Y=0.6134X+6.32686陕西宝鸡0.007030.971Y=1.241X+7.672884甘肃天水0.007030.981Y=1.0641X+7.291582陕西延安0.007200.9751Y=0.8909X+6.9073423辽宁0.007640.9793Y=0.6586X+6.3935881甘肃天水0.007650.9679Y=0.8863X+6.8756264陕西渭南0.007950.966Y=1.353X+7.841569陕西咸阳0.007990.9866Y=0.819X+6.7189501陕西咸阳0.008000.947Y=0.784X+6.644588陕西延安0.008250.9759Y=1.0788X+7.2461410辽宁0.008380.9491Y=0.9531X+6.9796886甘肃天水0.008430.9733Y=0.8299X+6.721513 决定系数（R2）毒力回归方程菌株采集地点EC50(μg/mL)CoefficientofToxicityregressionIsolatesLocation2determination(R)equation985山东烟台0.009080.996Y=0.697X+6.424914河南三门峡0.009100.969Y=0.924X+6.887703陕西渭南0.009650.993Y=1.284X+7.588975山东牟平0.009740.932Y=1.046X+7.105974山东牟平0.009860.971Y=1.015X+7.036915河南三门峡0.009890.948Y=0.841X+6.686986山东烟台0.01000.984Y=0.869X+6.739335山西运城0.01000.927Y=1.049X+7.096215陕西渭南0.01010.952Y=0.370X+5.739880甘肃天水0.01030.9899Y=0.9479X+6.8855887甘肃天水0.01030.9245Y=0.9591X+6.9058743山西运城0.01030.97Y=1.170X+7.323896河南三门峡0.01060.902Y=1.026X+7.024437陕西0.01100.914Y=1.060X+7.077517陕西咸阳0.01110.9611Y=1.0654X+7.081363山西运城0.01180.994Y=1.097X+7.116912河南三门峡0.01180.962Y=0.931X+6.797982山东烟台0.01190.986Y=0.627X+6.208416辽宁0.01190.9001Y=1.3792X+7.6533317山西运城0.01210.971Y=0.993X+6.904434陕西0.01250.958Y=1.083X+7.06324山西运城0.01280.978Y=1.576X+7.985908河南三门峡0.01280.9704Y=0.9721X+6.8405885甘肃天水0.01280.964Y=1.0731X+7.0301909河南三门峡0.01290.9707Y=1.1696X+7.2105294山西万荣0.01380.995Y=1.068X+6.985406辽宁0.01380.984Y=0.7858X+6.4597299山西运城0.01390.966Y=1.531X+7.843420辽宁0.01400.9771Y=0.7315X+6.3563890甘肃天水0.01400.9455Y=0.7789X+6.4436913河南三门峡0.01420.967Y=1.436X+7.654879甘肃天水0.01430.9685Y=0.7462X+6.3772883甘肃天水0.01440.9962Y=0.8433X+6.5535973山东牟平0.01470.986Y=1.037X+6.899418辽宁0.01480.9741Y=0.6346X+6.160614 决定系数（R2）毒力回归方程菌株采集地点EC50(μg/mL)CoefficientofToxicityregressionIsolatesLocation2determination(R)equation977山东烟台0.01490.981Y=0.751X+6.374981山东烟台0.01540.964Y=0.693X+6.258565陕西咸阳0.01650.9143Y=1.1401X+7.0324289山西万荣0.01670.983Y=1.051X+6.868888甘肃天水0.01700.9832Y=0.9144X+6.6175980山东烟台0.01760.986Y=0.744X+6.305315山西运城0.01830.968Y=1.275X+7.217876甘肃天水0.01830.999Y=0.861X+6.496976山东牟平0.01850.99Y=0.717X+6.243955河南三门峡0.01880.952Y=0.605X+6.044561陕西咸阳0.02010.9668Y=0.7214X+6.2234422辽宁0.02150.9561Y=0.684X+6.1409899河南三门峡0.02230.964Y=1.277X+7.109967河南三门峡0.02270.963Y=0.607X+5.998659陕西渭南0.02320.973Y=0.706X+6.154426辽宁0.02340.9462Y=1.0385X+6.6926984山东烟台0.02400.965Y=1.284X+7.078注：按照EC50值从小到大进行排序。Note：ThearrangementisaccordingtotheEC50valuefromsmalltolarge.图2-1120株苹果树腐烂病菌菌株对吡唑醚菌酯敏感性的频率分布Fig.2-1FrequenciesdistributionofpyraclostrobinEC50valuesfor120isolatesofValsamalicollectedfromareasinChina15 2.2.2不同地区腐烂病菌对吡唑醚菌酯的敏感性表2-2不同地区苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的敏感性Table2-2SensitivitytopyraclostrobinofValsamalifieldisolatesfromdifferentlocationsinChinaEC50值分布范围平均EC50值地区株数RangeofEC50valuesAverageofEC50valuesregionIsolatenumber(μg/mL)(μg/mL)辽宁100.00547-0.02340.0128±0.0061a山东170.00410-0.02400.0110±0.0058ab甘肃150.00403-0.01840.0105±0.0044ab山西360.00137-0.02270.0094±0.0057ab陕西310.00236-0.02320.0076±0.0050bc新疆110.00216-0.006960.0040±0.0015c注：按照SPSS16.0软件中的Duncan氏新复极差分析法，同列数据后的不同小写字母表示在P=0.05水平上差异显著。Note:DifferentsmalllettersinacolumnaresignificantdifferencebyusingDuncan’sMultipleRangeTestatprobabilityofP=0.05本实验从全国6个地区所采集的120株苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的敏感性存在一定的差异，如表2-2所示，最敏感的是新疆菌株，其EC50平均值为0.0040±0.0015µg/ml，最不敏感的是辽宁菌株，其EC50平均值为0.0128±0.0061µg/ml。新疆地区的菌株同辽宁、山东、甘肃、山西四个地区的菌株在P=0.05水平上差异显著；陕西地区的菌株同辽宁地区的菌株在P=0.05水平上差异显著；其他地区的菌株对吡唑醚菌酯的敏感性差异不显著。2.3讨论在一种新型杀菌剂用于防治某种植物病害之前，建立敏感性基线对于评价其抗药性风险和未来抗药性治理策略的制定具有重要的意义（Chenetal.2013）。吡唑醚菌酯高效、广谱、低毒，低残留，且对作物具有保健作用，虽然其在防治植物病害上具有强大的应用潜力，但是在2015年之前由于价格昂贵，并未大面积使用于田间。2015年国外专利到期，国内企业纷纷登记生产，才得到大范围应用。目前有多种病原菌对吡唑醚菌酯的敏感性基线已经建立（陈杰等2015；梁宏杰等2015）。本研究采用菌丝生长速率法共检测了120株分别采自于中国六个省份的苹果树腐烂病菌对该药剂的敏感性。这些菌株对吡唑醚菌酯的敏感性频率分布呈连续单峰曲线，近似于正态分布，表明对吡唑醚菌酯而言，中国苹果树腐烂病菌还处于野生敏感种群阶段，因此可将吡唑醚菌酯对供试16 菌株的EC50平均值0.00909±0.00552µg/mL作为中国苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的敏感性基线。这个敏感性基线可以用于监测未来田间苹果树腐烂病菌群体对吡唑醚菌酯敏感性的改变。供试菌株中，最不敏感菌株其EC50值是最敏感菌株的17.5倍，且不同地区所采集的菌株对吡唑醚菌酯的敏感性存在一定的差异，这可能与苹果树腐烂病菌不同地区菌株间自然差异和病菌本身生理差异以及病菌种群结构（齐永志等2014）有关，具体原因还有待进一步研究。17 第三章苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的抗药性风险评估吡唑醚菌酯作为甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的重要产品之一，其单剂和复配药剂均能防治多种植物病原菌侵染引起的病害（霍建飞等2018；刘吉祥等2017；张子易等2017）。第二章中敏感性测定结果表明，该药剂对苹果树腐烂病菌也有极好抑制作用。吡唑醚菌酯可直接作用于病原菌靶标，还可通过诱导作物的生理变化来抵抗病菌侵染，有利于促进作物对氮的利用和提高抗病能力，具有保健增产的作用。其高效、广谱、低残留的优点，使得吡唑醚菌酯的市场迅速扩张，已成为全球第二大杀菌剂，仅次于嘧菌酯。一种新型杀菌剂产生抗药性的风险和发展趋势，会直接影响该药剂的使用寿命和产品的收益。在当前杀菌剂的市场预测中，抗药性风险评估是一个重要的组成部分，也是延缓病原菌对杀菌剂产生抗药性的关键依据之一。自吡唑醚菌酯投入使用以来，其抗药性问题越来越严重，尤其是近几年，在国外关于吡唑醚菌酯抗药性的报道越来越多（Avenotetal.2008；Avenotetal.2015；Fanetal.2015；Fernández-Ortuñoetal.2012；Yinetal.2012）。中国自该类药剂登记使用以来，还未有苹果树腐烂病菌对其产生抗药性的报道，但随着吡唑醚菌酯大面积使用，其田间抗药性问题必然会日益突出。因此本研究通过药剂驯化的方法，获得了能稳定遗传的苹果树腐烂病菌抗吡唑醚菌酯的突变体，分析了感、抗菌株的生物适合度和不同杀菌剂之间的交互抗药性，评估了腐烂病菌对吡唑醚菌酯的抗药性风险，为吡唑醚菌酯的科学使用和抗药性治理策略的制定提供参考依据。3.1材料与方法3.1.1供试菌株从第二章中用于测定对吡唑醚菌酯敏感性的120株苹果树腐烂病菌菌株中随机挑选出14株菌株，03-8、XJVM001、XJVM006、878、881、889、891、893、902、910、972、980、982、985作为用于诱导抗药性的亲本菌株。3.1.2供试药剂及培养基化学纯吡唑醚菌酯原药（97.5%），由陕西西大华特科技实业有限公司生产，用丙酮溶解，分别配成10mg/mL和100mg/mL的母液于4℃保存备用；化学纯戊唑醇原药（97%），由江苏中旗科技股份有限公司生产，用丙酮预溶配成10mg/mL的母液于4℃保存备用；化学纯苯醚甲环唑原药（95%），由陕西西大华特科技实业有限公司生产，用丙酮预溶配成10mg/mL的母液于4℃保存备用；化学纯抑霉唑原药（98%），由安徽广信农化股份有限公司生产，用甲醇预溶配成18 10mg/mL的母液于4℃保存备用；化学纯甲基硫菌灵原药（97%），由安徽华星化工有限公司生产，用丙酮预溶配成10mg/mL的母液于4℃保存备用；水杨肟酸（99%）Sigma公司提供，用甲醇溶解配成10mg/mL的母液于4℃保存备用。AEA、PDA培养基用途和配方见第二章2.1.2，PDB液体培养基用于腐烂病菌摇培实验，配方同PDA不加琼脂。3.1.3主要仪器设备恒温培养振荡器（ZHWY200B，上海智诚分析仪器制造有限公司），其他仪器设备见第二章2.1.3。3.1.4药剂驯化获得抗药性菌株将随机选取的14株苹果树腐烂病菌菌株作为亲本菌株在PDA平板上25℃黑暗培养3d后，在菌落边缘用灭菌打孔器打取直径为5mm的菌饼，倒置转接于含80μg/mL吡唑醚菌酯的AEA培养基平板上，每个平板接种7个菌饼且每个菌株接种多个平板，在25℃培养箱中黑暗培养两周后，用灭菌接种针挑取菌落边缘快速生长或者呈扇形的菌落，转接于含有稍高浓度的含药培养基上继续培养，药剂浓度依次提高，分别为100μg/mL，200μg/mL，500μg/mL（Wangetal.2015）。3.1.5抗药性菌株抗性水平及其遗传稳定性测定为了测定抗药性菌株的抗性水平及抗性遗传稳定性，将含药培养基上的菌株转接至不含任何药剂的PDA培养基上培养，连续转接10代，然后采用菌丝生长速率法测定抗性菌株第1代和第10代的EC50，确定其抗性水平和遗传稳定性。抗性菌株的抗性水平计算如下：抗性倍数（RF）=抗性菌株EC50/野生亲本菌株EC50。3.1.6生长量及繁殖体数量测定菌落生长直径测定：分别从活化好的野生亲本菌株XJVM001，972和吡唑醚菌酯抗性菌株XJVM001R1，XJVM001R2，972R菌落边缘用灭菌打孔器打取直径为5mm的菌饼，倒置接种于PDA培养基上，于25℃条件下黑暗培养。分别在培养12h、24h、36h、48h、60h时，采用十字交叉法测量各菌株的菌落直径。每个菌株设置3个重复，实验重复3次。繁殖体数量测定：上述活化好的菌株同样用于繁殖体数量的测定。将上述菌株的培养皿摊开继续放置培养25d后观察其繁殖体产生情况。每个菌株设置3个重复，实验重复3次。菌丝干重测定：在上述活化好的菌株菌落边缘用灭菌打孔器打取直径5mm的菌饼，19 接种到装有100mLPDB培养液的锥形瓶中（每瓶接种5个菌饼），25℃、100r/min条件下振荡培养3d后，用双层无菌纱布过滤菌丝体，然后将其在56℃烘箱中烘干，称量菌丝干重。每个菌株设置3个重复，实验重复3次。3.1.7致病力测定剪取20cm左右的苹果枝条，先用自来水将枝条表面冲洗干净，然后用0.6%次氯酸钠避光消毒10min，再用灭菌的蒸馏水冲洗3次后，置于干燥处晾干，用熔化的石蜡封住枝条两端；利用直径为5mm电烙铁在枝条上相隔10cm处分别烫2个伤口；用灭菌打孔器从25℃活化培养3d的菌落边缘打取直径为5mm的菌饼接在伤口处，每根枝条接一个野生亲本菌株和一个抗性菌株；每个菌接3根枝条，25℃下保湿培养5d后测量病斑长度（韦洁玲2009；臧睿2006），实验重复3次。3.1.8对NaCl和SHAM敏感性测定将抗性菌株和野生亲本菌株分别在不含药的PDA培养基上25℃活化培养3d，在活化好的菌落边缘用灭菌打孔器打取直径5mm的菌饼，接种到含0.1，0.2，0.3mol/LNaCl和100µg/mLSHAM的PDA培养基上，25℃培养至对照长至8cm左右时测量菌落直径，计算出不同处理下的菌丝生长抑制率。每个处理设置3个重复，实验重复3次。3.1.9交互抗药性测定表3-1苹果树腐烂病菌吡唑醚菌酯感、抗菌株对各种药剂敏感性测定所用的浓度Table3-1Concentrationsusedtodeterminethesensitivitytofungicidesinpyraclostrobin-sensitiveand-resistantisolatesofValsamali浓度（Concentrations(µg/ml)）杀菌剂FungicidesXJVM001XJVM001R1XJVM001R2972972R0.000625,0.0025,0.002,0.02,0.2,0.002,0.02,0.2,0.000625,0.0025,0.002,0.02,0.2,吡唑醚菌酯0.01,0.04,0.162,202,200.01,0.04,0.162,200.005,0.01,0.02,0.005,0.01,0.02,0.005,0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.05,0.1,0.2,戊唑醇0.04,0.080.04,0.080.04,0.080.4,0.80.4,0.80.002,0.004,0.002,0.004,0.002,0.004,0.015,0.03,0.015,0.03,0.06,苯醚甲环唑0.008,0.016,0.008,0.016,0.008,0.06,0.12,0.240.0320.0320.016,0.0320.12,0.240.025,0.05,0.1,0.025,0.05,0.1,0.025,0.05,0.1,抑霉唑2,4,8,16,322,4,8,16,320.2,0.40.2,0.40.2,0.440,60,80,40,60,80,40,60,80,40,60,80,40,60,80,甲基硫菌灵120,240120,240120,240120,240120,240将抗性菌株和野生亲本菌株分别在不含药的PDA培养基上25℃活化培养3d，在活化好的菌落边缘用灭菌打孔器打取直径5mm的菌饼，接种到含不同浓度梯度的戊唑醇、苯醚甲环唑、抑霉唑和甲基硫菌灵的PDA培养基上（表3-1），在25℃培养箱中20 放置培养3d后，测量其菌落直径，分别计算出不同吡唑醚菌酯抗性和敏感菌株对其他几种药剂的EC50值，比较各菌株对各药剂的敏感性，实验重复3次。3.1.10数据统计和分析方法同第二章2.1.53.2结果与分析3.2.1抗性菌株抗性水平及遗传稳定性测定的结果本实验对随机选取的14株野生型苹果树腐烂病菌菌株通过长期药剂驯化诱导，仅以亲本菌株XJVM001和972共获得了3株抗性水平各不相同抗性菌株，编号为XJVM001R1、XJVM001R2和972R，其抗性倍数分别是野生亲本菌株的41.0，56.8和22.0倍。将诱导得到的3株抗性菌株在不含任何药剂的空白PDA培养基上连续活化转接10代，其抗性倍数没有显著下降，分别是野生亲本菌株的33.9，52.5和11.7倍，如表3-2所示。表明在无性繁殖条件下，吡唑醚菌酯抗药性菌株的抗性表型能够稳定遗传。表3-2吡唑醚菌酯抗性菌株的抗性水平及遗传稳定性Table3-2LevelandstabilityofpyraclostrobinresistanceECB50(µg/ml)抗性倍数RF菌株来源A第一代第十代第一代第十代IsolateOrigin1stgen.10thgen.1stgen.10thgen.XJVM001Parent0.003290.00301----XJVM001R1PRstrain0.1350.10241.033.9XJVM001R2PRstrain0.1870.15856.852.5972Parent0.005080.00493----972RPRstrain0.1120.057522.011.7注：A野生亲本菌株为田间分离获得，突变体菌株为室内吡唑醚菌酯驯化获得。B抗性倍数（RF）=抗性菌株EC50/野生亲本菌株EC50。Note:AParentalisolateswerecollectedinthefield,PRstrainswereobtainedbygrowingparentalisolatesonpyraclostrobin-amendedmedium.BRF(resistancefactor)=EC50fortheresistantstrain/EC50forthewildparentalisolate.3.2.2感、抗菌株生长量及繁殖体数量测定的结果在25℃条件下黑暗培养时，吡唑醚菌酯抗性菌株与野生亲本菌株相比菌丝较稀疏，并且菌丝生长速率均显著下降（图3-1）。当把培养皿摊开继续培养25d后，抗性菌株与野生亲本菌株产生的繁殖体数量没有显著差异（图3-2，表3-3）。PDB培养液中摇培3d的菌丝干重，抗性菌株均小于野生亲本菌株（表3-3）。21 图3-1吡唑醚菌酯抗性菌株与敏感菌株的菌丝生长速率比较Fig.3-1Comparisonofmycelialgrowthbetweenpyraclostrobin–sensitiveandresistantisolates图3-2吡唑醚菌酯抗性菌株与敏感菌株的繁殖体数量比较Fig.3-2Comparisonofnumberofpropagulebetweenpyraclostrobin–sensitiveandresistantisolates22 表3-3苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯感、抗菌株繁殖体数量、菌丝干重及致病性测定Table3-3Comparisonofpropagule,dryweightandpathogenicitybetweenpyraclostrobin–sensitiveandresistantisolatesofValsamali繁殖体数量（个/皿）菌丝干重（g/瓶）病斑长度（mm）菌株Numberofpropagule/Dryweightofmycelia(gLesionlengthonbranchIsolatesperplate/flask)(mm)XJVM001267.8b0.3071b40.3aXJVM001R1263.6b0.2878c29.2bXJVM001R2265.3b0.2882c28.3b972311.1a0.3129a36.5a972R314.2a0.2792d25.6b注：敏感菌株（XJVM001和972）为田间采集的野生亲本菌株，抗性菌株（XJVM001R1、XJVM001R2和972R）为室内吡唑醚菌酯驯化获得。按照SPSS16.0软件中的Duncan氏新复极差分析法，同列数据后的不同小写字母表示在P=0.05水平上差异显著。Note:Sensitivestrains(XJVM001and972)werewildtypeparentalisolates,resistantstrains(XJVM001R1,XJVM001R2and972R)wereobtainedbygrowingparentalisolatesonpyraclostrobin-amendedmedium.DifferentsmalllettersinacolumnaresignificantdifferencebyusingDuncan’sMultipleRangeTestatprobabilityofP=0.05.图3-3吡唑醚菌酯抗性菌株与敏感菌株的致病力比较Fig.3-3Comparisonofpathogenicitybetweenpyraclostrobin–sensitiveandresistantisolates3.2.3感、抗菌株致病力测定的结果在离体苹果树枝条上接种腐烂病菌抗性菌株和野生亲本菌株，25℃保湿培养5d后23 均能产生典型的腐烂病斑，两株亲本菌株病斑长度分别为40.3mm和36.5mm，三株抗性菌株病斑长度分别为29.2mm、28.3mm和25.6mm。差异分析结果显示，所有抗性菌株产生的病斑都要显著小于野生亲本菌株（图3-3，表3-3）。3.2.4感、抗菌株对NaCl和SHAM敏感性测定的结果抗性菌株与野生亲本菌株在含有NaCl的PDA培养基上生长都受到抑制，在含低浓度0.1mol/LNaCl的培养基上，抗性菌株抑制率与野生亲本菌株无明显差异，然而随着NaCl浓度的升高，在含0.2mol/L和0.3mol/LNaCl的培养基上生长时，抗性菌株抑制率显著大于野生亲本菌株（图3-4）。图3-4吡唑醚菌酯抗性菌株与敏感菌株对渗透压的敏感性差异比较星号表示与敏感菌株相比差异显著（P=0.05）Fig.3-4SensitivitytoosmoticstressofpyraclostrobinresistantmutantsandtheirwildparentalisolatesTheasteriskindicatesasignificantdifferencefromthewild-type(P=0.05)24 在含有100µg/mlSHAM处理的PDA培养基上生长时，吡唑醚菌酯抗性菌株与野生亲本菌株相比，菌丝生长变慢，菌丝生长抑制率较高，均在60%以上，而野生亲本菌株虽被100µg/mlSHAM有抑制，但其抑制率均不到40%，显著小于抗性菌株，表明吡唑醚菌酯抗性菌株对SHAM更敏感（图3-5）。图3-5吡唑醚菌酯抗性菌株与敏感菌株对SHAM的敏感性差异比较星号表示与敏感菌株相比差异显著（P=0.05）Fig.3-5SensitivitytoSHAMofpyraclostrobinresistantmutantsandtheirwildparentalisolatesTheasteriskindicatesasignificantdifferencefromthewild-type(P=0.05)3.2.5交互抗药性测定了吡唑醚菌酯抗性菌株和野生亲本菌株对戊唑醇、苯醚甲环唑、抑霉唑和甲基硫菌灵的敏感性。结果发现这些生产上常用药剂对腐烂病菌菌丝生长都有很好的抑制效果，且吡唑醚菌酯与这几种作用机制不同的杀菌剂之间无交互抗药性（表3-4）。表3-4吡唑醚菌酯与其它杀菌剂之间交互抗药性分析Table3-4Cross-resistancebetweenpyraclostrobinandotherfungicidesinValsamaliEC(μg/ml)50菌株吡唑醚菌酯戊唑醇苯醚甲环唑抑霉唑甲基硫菌灵IsolatesPyraclostrobinTebuconazoleDifenoconazoleImazalilThiophanate-methylXJVM0010.00329d0.0161c0.00531c0.0825c52.5b9720.00508d0.145b0.0557a6.52a47.1dXJVM001R10.135b0.0165c0.00586c0.0548d52.5bXJVM001R20.187a0.0153c0.00418c0.0599d53.8a972R0.112c0.183a0.0330b5.99b48.4c25 注：敏感菌株（XJVM001和972）为田间采集的野生亲本菌株，抗性菌株（XJVM001R1、XJVM001R2和972R）为室内吡唑醚菌酯驯化获得。按照SPSS16.0软件中的Duncan氏新复极差分析法，同列数据后的不同小写字母表示在P=0.05水平上差异显著。Note:Sensitivestrains(XJVM001and972)werewildtypeparentalisolates,resistantstrains(XJVM001R1,XJVM001R2and972R)wereobtainedbygrowingparentalisolatesonpyraclostrobin-amendedmedium.DifferentsmalllettersinacolumnaresignificantdifferencebyusingDuncan’sMultipleRangeTestatprobabilityofP=0.05.3.3讨论在一定的杀菌剂选择压力下，病原菌可能会对其产生抗药性（齐永志等2014）。有很多学者报道了关于室内诱导抗药性菌株的研究。李波涛等（2014）通过室内药剂驯化获得了稻瘟病菌（Pyriculariagrisea）对烯肟菌胺抗性水平大于1000倍的高抗菌株。崔继敏等（2013）通过紫外诱导获得了黄瓜霜霉病菌（Plasmoparaviticola）对双炔酰菌胺抗性菌株。本研究通过随机选取14株野生苹果树腐烂病菌进行室内药剂驯化，最终由亲本菌株XJVM001和972共获得了三株苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的抗性菌株，其他亲本菌株未能获得抗性菌株可能与不同菌株间遗传变异有关（Pangetal.2013）。测定三株抗性菌株对吡唑醚菌酯的敏感性，发现其都达到中等抗性水平。更重要的是，所有抗性菌株在没有任何选择压力的空白PDA培养基上连续活化转接10代仍具有中等水平抗药性，表明所获得的抗药性菌株的抗性表型能够稳定遗传。生物适合度被认为是影响田间抗药性病原菌群体形成的重要因素（Luetal.2011；Zhangetal.2014）。许多研究表明，病原菌在对杀菌剂产生抗药性后，其一些生物学性状会由于遗传变异而发生改变，进而影响抗性菌株与敏感菌株在自然界的竞争力（Ziogasetal.2003）。Markoglou等研究了灰葡萄孢菌（Botrytiscinerea）对吡唑醚菌酯抗性菌株与敏感菌株的适合度，发现大多数抗性菌株的产孢量、孢子萌发率及菌核产量均有所下降，而其他生物学特性没有显著差异（Markoglouetal.2006）。Vega和Dewdney发现柑橘霉心病菌（Alternariaalternata）对嘧菌酯和吡唑醚菌酯的抗性菌株与敏感菌株相比，除致病力改变以外，其他生物学特性并无差异（VegaandDewdney2014）。本研究通过对苹果树腐烂病菌抗吡唑醚菌酯菌株的适合度测定发现，抗性菌株菌落生长直径和菌丝干重都要小于野生亲本菌株，但产生的繁殖体数量没有显著差异。抗性菌株对苹果枝条的致病力降低可能与其生长速率减慢有关系。在含较低浓度的NaCl培养基上，抗性菌株抑制率与野生亲本菌株无显著差异，随着NaCl浓度的升高，抗性菌株抑制率显著大于野生亲本菌株，说明野生菌株的渗透调节能力要强于抗性菌株。在其他的研究中也报道了室内诱导的抗性菌株比野生亲本菌株对渗透压更敏感（张永杰等2004；Kuangetal.2011；Shaoetal.2015）。Ellis等（Ellisetal.1991）认为病原菌由于质膜功能的缺陷会导致对渗透压更敏感。在高渗透压环境中，病菌需要通过合成甘油来维持细胞膨压，从26 而消耗大量的能量，使得其生长受到抑制，抗药性突变和渗透压突变有可能是同源的。本研究的结果支持这一观点，认为由于细胞膜结构发生了损伤，从而导致抗药菌株对渗透压变敏感，适应环境的能力降低。本研究中用相同浓度的SHAM处理不同菌株，抗性菌株对SHAM敏感性明显高于敏感菌株，说明同样浓度的SHAM对抗性菌株伤害更大，抗性菌株更依赖旁路氧化途径提供能量，苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯产生抗药性后旁路氧化途径变强大了。而Sierotzki等（Sierotzkietal.2000a）的研究认为，对于香蕉黑斑病菌（Mycosphaerellafijiensis）的敏感菌株，肟菌酯和SHAM共同作用比单独作用更有效，而对于抗性菌株，两种作用方式并没有明显区别，说明对于肟菌酯的敏感菌株，其旁路氧化途径比抗性菌株更重要。这与本研究结果刚好相反，原因可能是香蕉黑斑病菌AOX基因不被诱导表达，对肟菌酯产生抗药性后，其正常呼吸途径变强，不需要依赖旁路氧化途径，而苹果树腐烂病菌AOX基因能够被诱导表达，经吡唑醚菌酯处理后，正常线粒体呼吸链上电子传递受阻，使得旁路氧化途径增强产生抗药性，但具体的机制还需进一步研究证实。在一种农药尚未大量使用前，明确其与其他药剂间是否存在交互抗药性，有助于评价该药剂的应用前景，为生产上的合理用药提供科学依据。交互抗药性分析发现，吡唑醚菌酯与防治苹果树腐烂病的常用药剂戊唑醇、苯醚甲环唑、抑霉唑和甲基硫菌灵之间都不存在交互抗药性。本研究评估了苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的抗药性风险，结果表明，在药剂选择压力存在的条件下苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯能产生中等水平的抗药性，但抗性菌株适合度较低，竞争力较弱，且与其他防治苹果树腐烂病的常用药剂之间不存在交互抗性，推测其抗药性风险为中低水平。为了延缓苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯抗药性的产生，建议在田间通过轮换使用不同作用机制的药剂，或者将吡唑醚菌酯与其他无交互抗药性的药剂进行复配来防治腐烂病，使得腐烂病菌对吡唑醚菌酯始终保持在高度敏感阶段，这对于延长吡唑醚菌酯的使用寿命是非常必要的。27 第四章6种生物源杀菌剂对苹果树腐烂病菌室内活性评价目前生产上防治苹果树腐烂病施药混乱，果农不合理，不规范的重复大量使用化学药剂，容易使病原菌产生抗药性，同时也产生了严重的环境污染问题，因此寻找防治苹果树腐烂病的新型药剂替代化学药剂成为当前生产上亟需解决的问题。生物农药具有无毒害，无污染，对环境友好，不易产生抗药性等优点，不仅符合人们对绿色健康食品的需求，而且为未来农业可持续发展提供了保障（梁建根等2007）。农业部提出的到2020年化学药剂使用量“零增长”计划，给生物源农药带来了良好的发展机遇（袁善奎等2018）。然而目前生物防治在苹果树腐烂病的防治中还处于起步阶段，市场上所用到的生物农药品种太少，使得其在农药市场占有率一直维持在较低的水平，还未有真正大面积推广应用于苹果树腐烂病防治的生物药剂。本研究通过测定6种生物源杀菌剂对腐烂病菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制效果及其对接种腐烂病菌离体枝条的保护作用，旨在筛选出高效低毒的替代生物源杀菌剂，为生产上苹果树腐烂病的安全防治提供科学依据。4.1材料与方法4.1.1供试菌株苹果树腐烂病菌（Valsamali）03-8分离株，采自于陕西省乾县，由西北农林科技大学果树病害病原生物学及综合治理研究室提供，于PDA斜面上4℃保存备用。4.1.2供试药剂及培养基1000亿/克枯草芽孢杆菌WP，山东玉成生化农药有限公司生产；3%中生菌素WP，福建凯立生物制品有限公司生产；0.4%蛇床子素SL，河北馥稷生物科技有限公司生产；300亿/克解淀粉芽孢杆菌WP，杨凌绿都生物科技有限公司生产；0.5%小檗碱AS，河北馥稷生物科技有限公司生产；2%农抗120AS，陕西麦可罗生物科技有限公司生产。PDA培养基用途和配方见第二章2.1.2。4.1.3主要仪器设备CX23LEDRFS1C型生物显微镜（奥林巴斯（广州）工业有限公司），其他仪器设备见第二章2.1.3。4.1.46种生物源杀菌剂对腐烂病菌菌丝生长的抑制效果测定采用菌丝生长速率法（孙广宇等2002），将6种供试生物源杀菌剂用灭菌水稀释成不同浓度的药液，吸取3mL药液加入27mL灭菌后冷却至45℃左右的PDA培养基28 中，充分混合均匀，倒入灭菌培养皿制成含药平板（每皿10mL左右），终浓度如表4-1所示。每种药剂设置5~6个浓度，并以加入无菌水的PDA培养基作为空白对照，每个浓度设3次重复，试验重复3次。用灭菌的打孔器从25℃黑暗培养3d的腐烂病菌菌落边缘打取直径为5mm的菌饼，倒置接种于含药平板中央，于25℃黑暗培养3d后，利用十字交叉法测量皿内菌落直径，计算出菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率（%）=［(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)］×100%表4-1苹果树腐烂病菌对各杀菌剂敏感性测定浓度Table4-1Concentrationsusedtodeterminethesensitivityto6fungicidesofValsamali菌丝生长毒力测定浓度（µg/ml）分生孢子萌发毒力测定浓度（µg/ml）杀菌剂ConcentrationsofmycelialgrowthConcentrationsofconidialgerminationFungicide（µg/ml）（µg/ml）1000亿/克枯草芽孢杆菌WP0.064,0.32,1.6,8,40,2000.01,0.03,0.1,0.3,0.93%中生菌素WP5,10,20,160,2505,10,20,60,800.4%蛇床子素SL62.5,125,250,500,1000,20003.125,6.25,12.5,18.75,25300亿/克解淀粉芽孢杆菌WP0.02,0.2,2,20,2000.03125,0.125,0.5,2,80.5%小檗碱AS22.2,66.6,200,600,180025,50,100,200,3002%农抗120AS1280,3200,8000,20000,5000016,80,400,2000,100004.1.56种生物源杀菌剂对腐烂病菌分生孢子萌发的抑制效果测定病原菌分生孢子悬浮液的制备：将活化培养3d的腐烂病菌打取直径为5mm的菌饼倒置接种于空白PDA培养基上，置于25℃恒温培养箱黑暗培养至长满整个培养皿后，将培养皿摊开于常温放置培养。当培养皿内长出黄色分生孢子角时，在无菌操作台内，用酒精灯烧过的接种针挑取皿内的分生孢子角悬浮于20mL灭菌吐温水中，充分混匀后，用显微镜观察孢子浓度，配制成1×105~3×105个/mL分生孢子悬浮液备用（王磊等2009）。采用玻片法（孙广宇等2002）：将6种供试生物源杀菌剂用灭菌水稀释成不同浓度的药液，用移液枪吸取1mL药液加入灭菌后冷却至45℃左右的9mLPDA培养基中充分混匀，倒入培养皿中制成含药培养基，终浓度如表4-1所示。切取1cm2左右的含药培养基放置于载玻片上，滴入25μL配制好的分生孢子悬浮液，用灭菌涂布器轻轻涂抹均匀，以无菌水作空白对照，每个浓度设3次重复，试验重复3次。于25℃黑暗培养24h后，在普通光学显微镜下统计分生孢子的萌发情况（萌发标准为芽管的长度超过分生孢子直径的一半），每个玻片观察5个视野，每个视野里统计50个分生孢子，计算出分生孢子萌发率和萌发抑制率。分生孢子萌发率（%）=已萌发的孢子数/孢子总数×100%29 分生孢子萌发抑制率（%）=（对照萌发率-处理萌发率）/对照萌发率×100%4.1.66种生物源杀菌剂对苹果离体枝条的保护作用测定采用离体枝条烫伤法（孙广宇等2002），参照臧睿等（2007）苹果离体枝条的接种方法，剪取40cm左右的苹果枝条，先用自来水将表面冲洗干净，然后用0.6%次氯酸钠避光消毒10min，再用灭菌蒸馏水冲洗3次后，置于干燥处晾干，用熔化的石蜡封住枝条两端。利用直径为5mm的电烙铁烫伤枝条后，将不同浓度的药液涂抹于伤口处，保湿培养1d后接种直径为5mm的腐烂病菌菌饼。每种药剂接种3根枝条，每根枝条接种3个点，每种药剂共接种9个点，以涂抹无菌水的枝条作为空白对照。25℃保湿培养10d后，测量枝条上病斑长度，计算防治效果。防治效果(%)=［(对照病斑长度-处理病斑长度)/(对照病斑长度-菌饼直径)］×100%4.1.7数据统计和分析方法同第二章2.1.54.2结果与分析4.2.16种生物源杀菌剂对腐烂病菌菌丝生长的影响从图4-1和表4-2可以看出，6种生物源杀菌剂对腐烂病菌菌丝生长均表现出一定的抑制效果。300亿/克解淀粉芽孢杆菌WP和1000亿/克枯草芽孢杆菌WP对病菌菌丝生长的抑制作用最强，EC50分别为0.69μg/mL和0.89μg/mL；其次是3%中生菌素WP、0.5%小檗碱AS和0.4%蛇床子素SL，EC50分别为26.06μg/mL、168.9μg/mL和290.7μg/mL；2%农抗120AS对菌丝生长抑制效果最差，其EC50为5180μg/mL。表4-26种生物源杀菌剂对苹果树腐烂病菌菌丝生长的影响Table4-2Effectof6biologicalfungicidesonmyceliumgrowthofValsamali决定系数（R2）毒力回归方程杀菌剂EC50(μg/mL)CoefficientofToxicityregressionFungicidedetermination(R2)equation300亿/克解淀粉芽孢杆菌WP0.690.9729Y=0.3602X+5.05791000亿/克枯草芽孢杆菌WP0.890.9774Y=0.6726X+5.03263%中生菌素WP26.060.9547Y=1.8004X+2.45060.5%小檗碱AS168.90.9869Y=1.7272X+1.15230.4%蛇床子素SL290.70.9778Y=1.8405X+0.46612%农抗120AS51800.9433Y=1.2127X+0.495630 图4-16种生物源杀菌剂对苹果树腐烂病菌菌丝生长的影响Fig.4-1Effectof6biologicalfungicidesonmyceliumgrowthofValsamali4.2.26种生物源杀菌剂对腐烂病菌分生孢子萌发的影响从表4-3可以看出，6种生物源杀菌剂对腐烂病菌分生孢子萌发均表现出一定的抑制效果。1000亿/克枯草芽孢杆菌WP和300亿/克解淀粉芽孢杆菌WP对病菌菌丝生长的抑制作用最强，EC50分别为0.039μg/mL和0.19μg/mL；0.4%蛇床子素SL、3%中生菌素WP、2%农抗120AS和0.5%小檗碱AS对分生孢子萌发抑制效果均比较理想，EC50分别为8.29μg/mL、36.08μg/mL、59.76μg/mL和65.22μg/mL。除了3%中生菌素WP对病菌菌丝生长抑制效果要好于分生孢子萌发以外，其他所有药剂对分生孢子萌发抑制率都要远远大于菌丝生长，说明腐烂病菌分生孢子比菌丝对所测试大多数药剂更敏感。表4-36种生物源杀菌剂对苹果树腐烂病菌分生孢子萌发的影响Table4-3Effectof6biologicalfungicidesonconidiagerminationofValsamali决定系数（R2）毒力回归方程杀菌剂EC50(μg/mL)CoefficientofToxicityregressionFungicidedetermination(R2)equation1000亿/克枯草芽孢杆菌WP0.0390.9715Y=1.7491X+7.4557300亿/克解淀粉芽孢杆菌WP0.190.9624Y=1.3247X+5.96570.4%蛇床子素SL8.290.9908Y=4.2549X+1.09253%中生菌素WP36.080.9964Y=1.4104X+2.80862%农抗120AS59.760.9726Y=0.8637X+3.46570.5%小檗碱AS65.220.9769Y=2.9704X-0.38954.2.36种生物源杀菌剂对苹果离体枝条的保护作用6种生物源杀菌剂对苹果离体枝条的保护作用结果如表4-4所示，1000亿/克枯草芽31 孢杆菌WP和300亿/克解淀粉芽孢杆菌WP的保护作用最强，其防治效果分别为92.7%和86.7%，从图4-2可以看出涂抹这两种药剂的枝条病斑要显著小于其他药剂和对照；其次是0.4%蛇床子素SL、3%中生菌素WP和0.5%小檗碱AS，其防治效果为70.8%、51.8%和43.5%；2%农抗120AS保护作用较差，其防治效果为19.9%。表4-46种生物源杀菌剂在离体枝条上对苹果树腐烂病的防治效果Table4-4Controleffectof6biologicalfungicidesonexcisedtwigsinoculatedwithValsamali杀菌剂稀释倍数平均病斑长度（mm）防治效果（%）FungicideDilutiontimeAveragelesionlengthControleffect(%)1000亿/克枯草芽孢杆菌WP59.8±2.992.7a300亿/克解淀粉芽孢杆菌WP513.8±1.986.7b0.4%蛇床子素SL524.2±6.770.8c3%中生菌素WP536.8±1.551.8d0.5%小檗碱AS542.2±0.843.5e2%农抗120AS557.7±3.519.9fCK—70.9±5.9—注：平均病斑长度为“平均数±标准误”，按照SPSS16.0软件中的Duncan氏新复极差分析法，同列数据后的不同小写字母表示在P=0.05水平上差异显著。Note:Averagelesionlengthdatainthetableis"mean±SD",differentsmalllettersinacolumnaresignificantdifferencebyusingDuncan’sMultipleRangeTestatprobabilityofP=0.05.图4-26种生物源杀菌剂对接种苹果树腐烂病菌离体枝条上病斑形成的影响Fig.4-2Effectsof6biologicalfungicidesonthedevelopmentoflesionscausedbyValsamaliinexcisedtwigs注：A：CK；B：枯草芽孢杆菌；C：解淀粉芽孢杆菌；D：蛇床子素；E：中生菌素；F：小檗碱；G：农抗120。32 Note:A:CK;B:Bacillussubtilis;C:Bacillusamyloliquefaciens;D:osthol;E:Zhongshengmycin;F:berberine;G:Nongkang120.4.3讨论筛选出高效低毒的药剂，结合刮治病斑技术，杀灭苹果树枝干表面和潜伏侵染的腐烂病菌，对防治苹果树腐烂病至关重要。生物药剂使用安全，可逐渐取代生产上常用的有毒化学药剂，近年来已成为植物病害防治中的热点，有广阔的推广和应用前景。本研究通过测定6种生物源杀菌剂对腐烂病菌菌丝生长和分生孢子萌发抑制效果及其对接种腐烂病菌离体枝条的保护作用，筛选出了室内防效最强的两种药剂，分别为300亿/克解淀粉芽孢杆菌WP和1000亿/克枯草芽孢杆菌WP，其EC50均小于1μg/mL，尤其是对分生孢子毒力更强，EC50均小于0.2μg/mL，离体枝条保护作用结果显示，其室内防效均高于86%，对苹果树腐烂病菌已达到高度敏感毒力水平。芽孢杆菌属的细菌抗逆性和适应性强，营养简单且繁殖快，易于在环境中存活和定殖，生防作用原理主要为与病原菌空间和营养物质的竞争、通过自身代谢活动产生抑菌物质和诱导植物抗病性，已有大田应用表明其能防治多种病害且可与化学农药混合使用，防效稳定（黄海等2015；Elliottetal.1975）。吉沐祥等（2016）研究结果显示，1.0×1011cfu/g枯草芽孢杆菌DJ-6WP对葡萄霜霉病菌（Plasmoparaviticola）在室内和田间均具有很好的防效。全鑫等（2011）研究认为，5%井岗霉素WP与200亿孢子/g枯草芽孢杆菌按1:1复配具有增效作用，是一种防治小麦纹枯病的理想药剂。毒性较强的药剂为0.4%蛇床子素SL，其对抑制分生孢子萌发EC50低于10μg/mL，对苹果离体枝条的防效达到70%，有较好的抑菌效果和保护作用。蛇床子素有着较广谱的抑菌活性，能引起病原菌相关细胞壁水解酶基因的表达，达到抑菌作用（石志琦等2004）。3%中生菌素WP和0.5%小檗碱AS对腐烂病菌也有一定的抑菌效果，其对苹果离体枝条保护作用的防效高于40%。而2%农抗120AS对腐烂病菌抑制效果最差，其对抑制菌丝生长的EC50超过5000μg/mL，对苹果离体枝条的室内防效只有20%左右，这与焦浩等（2015）的田间试验防效较差相吻合。结果表明，300亿/克解淀粉芽孢杆菌WP和1000亿/克枯草芽孢杆菌WP在室内对苹果树腐烂病菌高度敏感，有极强的抑菌作用，已超过生产上常用的化学药剂甲基硫菌灵和菌毒清的室内毒力（郭晓峰等2015；王磊等2009），可将这两种药剂作为防治苹果树腐烂病的替代生物源药剂。然而，老病斑不能根治，新病斑又不断形成导致苹果树腐烂病连年发生且不断加重。当前对于苹果树腐烂病的防治，主要操作方法是涂抹药剂，这就要求所用药剂不仅高效、低毒、低残留，并且对伤口的愈合效果和田间可操作性也有了较高要求。而本次试验所选用药剂都为生物源杀菌剂，田间可操作性受环境影响大，其稳定性、速效性较差，离体枝条治疗作用效果没有保护作用效果明显（数据未显示），试验都在室内完成，其田间防效还有待进一步试验验证。33 第五章全文总结5.1本研究获得的主要结果（1）本研究采用菌丝生长速率法共测定了120株分别采自于辽宁、山东、甘肃、山西、陕西、新疆6个省份的苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的敏感性。结果表明，吡唑醚菌酯对所有供试菌株均有极好的抑制作用，EC50值分布范围在0.00137-0.0240µg/mL之间，平均EC50值为0.00909±0.00552µg/mL。不同菌株间EC50值差异较小，最不敏感菌株的EC50值是最敏感菌株的17.5倍。不同地区间的菌株对吡唑醚菌酯的敏感性存在一定的差异，最敏感的是新疆菌株，最不敏感的是辽宁菌株，未发现敏感性显著下降的腐烂病菌亚群体。可将平均EC50值作为苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯的敏感性基线。这个敏感性基线可以用于监测未来田间苹果树腐烂病菌群体对吡唑醚菌酯敏感性的改变，为生产上吡唑醚菌酯对苹果树腐烂病的科学防治提供参考。（2）通过室内药剂驯化首次获得了苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯能够稳定遗传的抗性菌株。生物适合度分析结果显示，抗性菌株产繁殖体数量与野生亲本菌株相比无明显差异，但菌落生长直径、菌丝干重和致病力显著降低。与亲本菌株相比，吡唑醚菌酯抗性菌株对NaCl和SHAM更敏感。交互抗药性结果显示，吡唑醚菌酯与其他几种供试药剂之间不存在交互抗药性。以上结果表明，苹果树腐烂病菌对吡唑醚菌酯存在中低水平的抗药性风险。（3）通过测定6种生物源杀菌剂对苹果树腐烂病菌菌丝生长和分生孢子萌发抑制效果及其对离体枝条的保护作用，筛选出了室内防效最强的两种药剂，分别为300亿/克解淀粉芽孢杆菌WP和1000亿/克枯草芽孢杆菌WP，其对菌丝生长的EC50均小于1μg/mL，对分生孢子萌发的EC50均小于0.2μg/mL，离体枝条保护作用结果显示，其室内防效均分别为92.7%和86.7%，可将这两种药剂作为防治苹果树腐烂病的替代生物源药剂。5.2本文尚待解决的问题（1）本研究对所获得的吡唑醚菌酯抗性菌株做了生物适合度及交互抗药性分析，评估了吡唑醚菌酯存在中低水平的抗药性风险，其抗药性分子机制还需通过分子生物学技术进一步研究。（2）本研究通过室内活性评价寻找到了两种防治苹果树腐烂病的替代生物源药剂，后续要进一步试验验证其大田防效及田间可操作性。34 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致谢光阴似箭，岁月如梭，西农三年的研究生生活转瞬即逝。一路走来，有过成功与失败，也有过挫折与彷徨，有太多人的关心和帮助，给我留下了一份珍贵的回忆。在即将离别之际，我要表达我最诚挚的感谢。首先，我要感谢我的导师黄丽丽教授。三年来，黄老师始终像亲人一样给予了我无微不至的关怀和帮助。黄老师严谨的工作作风，敏锐的科研洞察力、精益求精的治学态度，诲人不倦的高尚师德，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。这些都将成为宝贵的财富让我受益终身。值此论文即将完成之际，谨向导师表达我最诚挚的敬意和衷心的感谢！其次，我要感谢冯浩老师，从论文的选题到文章的修改都凝结了冯老师的心血和智慧结晶！感谢课题组的高小宁老师，秦虎强老师，徐亮胜老师，颜霞老师，王娜娜老师等所有老师们在我实验和生活中给予的热忱帮助与支持！特别感谢农药中心的王勇老师为本实验的具体实施和顺利进行提出宝贵意见以及无微不至的关怀！再次，感谢本实验室的李正鹏、吴玉星、许铭、聂嘉俊、冯雅琼、伏波、朱百涛、李海录、高双、刘娟等师兄师姐，同窗陈霁良、宋艳艳、张亚男、张楠、陈晓宇、宋琳琳，王凯、谢世昌、王一波、祝山等师弟，孙红云、张迪、孟香、郭斐然等师妹，舍友王含、陈遇嘉、周冉，本科生刘召阳、胡建邦、王帅以及每一位指导、帮助、陪伴我的伙伴们，感谢你们陪我度过了美好而充实的三年研究生时光。最后，感谢生物农药在特色经济作物产业上的应用技术集成与示范推广项目（2016TZC-N-3-2），苹果化肥农药减施增效技术集成研究与示范项目（2016YFD0201100）化学肥料和农药减施增效综合技术研发专项对本研究的资金支持。44 作者简介王帅，男，汉族，1992年10月生，安徽省安庆市怀宁县人，中共党员。2011年9月至2015年7月，安徽农业大学植物保护学院学习，获农学学士学位。2015年9月至2018年7月，西北农林科技大学植物保护学院学习，攻读农学硕士学位。攻读硕士期间，主要从事植物病害综合治理研究。攻读硕士期间发表论文：1.王帅,刘召阳,高小宁,冯浩,秦虎强,黄丽丽.10种生物源杀菌剂对苹果树腐烂病菌的室内活性评价.西北林学院学报（已接受）。2.ShuaiWang,HaoFeng,ZhaoyangLiu,XiaoningGao,YongWang,LiliHuang.BaselinesensitivityandresistanceriskassessmentofValsamalitopyraclostrobin.EuropeanJournalofPlantPathology(Underreview).3.刘娟,冯浩,王帅,高小宁,黄丽丽.苹果树腐烂病菌对苯醚甲环唑的敏感性研究.植物保护（修改后发表）。45