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分类号：S482.292学校代码：10712UDC：632研究生学号：2015060075密级：公开2018届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文天名精内酯酮对小麦全蚀病菌呼吸链的影响学科专业：农药学研究方向：农药毒理学研究生王梅指导教师：张兴教授完成时间：2018年11月中国陕西杨凌 Classificationcode:S482.292Universitycode:10712UDC:632Postgraduatenumber:2015060075Confidentialitylevel:OpenDissertationforDoctorDegreeNorthwestA＆FUniversityin2018EFFECTOFCARABRONEONRESPIRATORYCHAININGAEUMANNOMYCESTRITICIMajor:PesticideScienceResearchfield:PesticideToxicologyNameofPostgraduate:WangMeiAdviser:Prof.ZhangXingDateofsubmission:November2018YanglingShaanxiChina 本论文资助项目：国家自然科学基金：植物源活性物质天名精内酯酮抑菌作用机理研究（31272074）ThisstudywassupportedbytheNaturalScienceFoundationofChina:FungicidalMechanismResearchofBotanicalActiveCompoundCarabrone(31272074) 天名精内酯酮对小麦全蚀病菌呼吸链的影响摘要小麦全蚀病是由小麦全蚀病菌（Gaeumannomycesgraminisvar.triticiWalker）引起的一种分布较广、为害性较强的世界性病害，该病为一种土传病害，一旦发生较难根除。天名精内酯酮是一种倍半萜内酯类化合物，广泛分布于菊科天名精属植物中，对小麦全蚀病菌具有显著抑制作用，具有进一步开发利用的价值，但该化合物对小麦全蚀病菌的抑菌机制尚不清楚。课题组前期经荧光示踪法、免疫荧光法以及免疫金法亚细胞定位等研究中发现天名精内酯酮在小麦全蚀病菌中作用的细胞器为线粒体，且对生物氧化有一定影响。本研究以小麦全蚀病菌为供试菌株，从组织病理学观测、生化与分子生物学水平研究以及同源模建与分子对接等手段对天名精内酯酮作用靶标进行初步鉴定。取得如下主要结果：1、测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌的抑菌活性以及与线粒体呼吸链旁路呼吸酶抑制剂水杨肟酸（SHAM）的增效作用。结果表明：天名精内酯酮对小麦全蚀病菌有显著的抑制作用，EC50为40.30µg/mL。天名精内酯酮与SHAM的共毒系数为146.1显著大于120，表明天名精内酯酮与SHAM有显著增效作用。因此，推测天名精内酯酮对供试菌株线粒体呼吸链有显著抑制作用。2、测定天名精内酯酮对供试菌株线粒体呼吸链复合酶I、II、III、IV、V、I+III、II+III以及柠檬酸合酶（CS）的浓度和时间效应，并通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析了相关酶基因mRNA的相对表达量。结果表明：天名精内酯酮处理供试菌株后，呼吸链复合酶活性受到不同程度的抑制，尤其是复合酶III、I+III和II+III。EC30、EC50和EC70浓度处理下，天名精内酯酮可致供试菌株呼吸链复合酶III的活性分别降低了约30%、60%、87%，复合酶I+III的活性分别降低了26%、45%和76%，复合酶II+III的活性分别降低了50%、60%、85%。供试菌株呼吸链复合酶III、I+III和II+III的活性与天名精内酯酮处理浓度和时间呈负相关；且线粒体呼吸链复合酶III基因GgCyc对天名精内酯酮较为敏感。由此推测呼吸链复合酶III是天名精内酯酮潜在靶蛋白之一。3、建立小麦全蚀病菌原生质体遗传转化体系，并将潮霉素磷酸转移酶基因（hph）转入供试菌株基因组DNA中。结果表明：小麦全蚀病菌产生原生质体较佳条件为：1mL1.4%裂解酶中，0.035g菌丝在31℃、90rpm酶解2.2h，产生的原生质体为9.83×107原生质体/mL，原生质体活力达到96.27%。在此条件下转化hph，转化率为46-54个转化子/µgDNA。小麦全蚀病菌原生质体遗传转化体系的建立为构建小麦全蚀病菌突变菌库奠定基础。4、构建成功供试菌株呼吸链复合酶III基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp的RNAi以 及过表达突变菌株，并进一步测定了突变菌株菌丝生长速率、菌落形态以及对H2O2和天名精内酯酮的敏感性。结果表明：沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb和∆GgIsp的菌丝变细，端部分枝减少，菌丝生长速率较慢，对H2O2产生的氧化压敏感性有一定程度降低。沉默突变菌株∆GgIsp对天名精内酯酮的敏感性显著降低，EC50为156.18µg/mL，而过表达突变菌株OEIsp对天名精内酯酮较为敏感EC50为25.88µg/mL。由此推测，复合酶III铁硫蛋白亚基是天名精内酯酮潜在靶标之一。5、测定野生型菌株及突变菌株的黑色素含量、过氧化物酶、漆酶、菌株致病性、离体和活体条件下呼吸链复合酶III活性以及线粒体氧消耗速率。结果表明：（1）与野生型和过表达菌株相比，天名精内酯酮（100µg/mL）处理后，沉默菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp以及天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1（实验室保存）的黑色素含量显著增加（约50-100%）。（2）天名精内酯酮EC80处理后，野生型菌株及突变菌株的过氧化物酶活性显著增加，而∆GgIsp的过氧化物酶活性与对照相比无显著差异。∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp和24-HN-1的漆酶活性显著降低（约47，37，41和44%），其致病力较弱与漆酶活性一致。（3）在离体条件下，用天名精内酯酮（0、EC20、EC80）处理后，除了∆GgIsp和24-HN-1呼吸链复合酶III活性并无显著变化，其余菌株呼吸链复合酶III活性均显著降低；在活体条件下，天名精内酯酮EC20处理后，呼吸链复合酶III活性均有一定程度增加，EC80处理后，复合酶III活性显著受到抑制，但是∆GgIsp和24-HN-1呼吸链复合酶III活性变化并不显著。（4）抗霉素A（20µg/mL）处理菌株后，小麦全蚀病菌野生型菌株、∆GgCytc1、∆GgIsp、24-HN-1、OECytc1、OECytb和OEIsp的线粒体氧消耗速率显著受到抑制（约95、89、92、58、92、92和88%），而沉默突变菌株∆GgCytb的线粒体氧消耗速率无明显变化；天名精内酯酮（EC80）处理菌株后，小麦全蚀病菌野生型菌株、∆GgCytc1、∆GgCytb、24-HN-1、OECytc1、OECytb和OEIsp的线粒体氧消耗速率显著受到抑制（约81、77、78、58、72、73和70%），而沉默突变菌株∆GgIsp的线粒体氧消耗速率无显著变化。由上述结果推测铁硫蛋白亚基是天名精内酯酮的潜在靶标之一。6、以酵母（Saccharomycescerevisiae）呼吸链复合酶III细胞色素c1（Cytc1），细胞色素b（Cytb）和铁硫蛋白（ISP）亚基的三维结构为模板，通过SWISS-MODEL软件对供试菌株Cytc1、Cytb和ISP亚基进行了同源模建以及活性腔预测，并将天名精内酯酮分别与Cytc1、Cytb和ISP亚基的活性腔进行分子对接。结果表明：Cytc1、Cytb和ISP亚基活性腔中的八个氨基酸残基（Tyr200、Arg194、Gly47、Gln43、Leu225、Arg171、Gln166和Tyr230）可能为天名精内酯酮的结合位点。综上所述，天名精内酯酮对供试菌株线粒体呼吸链有显著抑制作用，且呼吸链复合酶III是其潜在的靶蛋白之一。结合课题组前期研究结果推测天名精内酯酮作用机制为：天名精内酯酮在供试菌株线粒体中富集，影响呼吸链复合酶活性，尤其是复合酶III，阻断呼吸链电子传递，致能量形成受阻，线粒体中积累大量ROS，引起供试菌株一系列的 氧化胁迫，最终线粒体释放凋亡因子，引起细胞凋亡而达到抑菌目的。关键词：天名精内酯酮；小麦全蚀病菌；线粒体呼吸链；细胞色素bc1复合体；RNAi EFFECTOFCARABRONEONRESPIRATORYCHAININGAEUMANNOMYCESTRITICIABSTRACTTake-all,causedbyGaeumannomycestritici,isoneofthemostimportantwheatrootdiseasesworldwide,asitresultsinseriousyieldlosses.Carabrone,abotanicalbicyclicsesquiterpeniclactoneisolatedfromCarpesiummacrocephalum,whichiswidelydistributedinAsiaandEurope,isapromisingfungicidalagentthatisenvironmentallyfriendlyandcaneffectivelycontrolG.tritici.However,themechanismofactionofcarabroneagainstG.triticiremainslargelyunclear.Inourpreviousstudy,weidentifiedthemitochondriaasthesubcellularlocationofcarabronebyconfocalmicroscopicdetectionofafluorescently-labeledmolecule,andcarabronehasasignificanteffectonbiologicaloxidation.WithG.triticiasthetargetorganism,thisstudyhasconfirmedtheantifungalactivityofcarabroneagainstG.triticiandcompletedthehistopathologyobservationonthestrainaftertreatmentbycarabrone.ThenwithantimycinAasapositivecontrol,weperformedtheresearchoneffectsonmitochondrialrespiratorychainbycarabrone.Finally,weexploredthefunctionalanalysisofgenesGgCytc1,GgCytb,andGgIspofthemitochondrialrespiratorychaincytochromebc1complexinG.triticibyRNAsilencingandoverexpressionasapossibletargetofcarabrone.Followingresultswereobtained:1.TheactivityofcarabroneagainstG.triticiwasconfirmed.ThepotentiationoftheeffectofcarabroneinG.triticibysalicylhydroxamicacid(SHAM)wasmeasuredaswell.CarabroneresultedinsignificantinhibitionofG.triticiwithEC50valueof40.30µg/mL.FormixtureofcarabroneandSHAM(1:3),thevalueofCTCwas146.1,whichissignificantlygreaterthan120,indicatedthatthemixtureofcarabroneandSHAMagainstG.triticishowedasynergisticeffect,andcarabronehasasignificantinhibitiononmitochondrialrespiratorychaininG.tritici.2.TheactivityofmitochondrialrespiratorychaincomplexesI,II,III,IV,V,I+III,II+IIIandcitratesynthase(CS)wasmeasured,andquantitativereal-timepolymerasechainreaction(qRT-PCR)analysiswasperformedwhentreatedwithcarabrone.TheactivityofrespiratorychaincomplexesI-Vwereinhibited,especiallycomplexIII,I+IIIandII+III,andtheactivityofCSdidnotchangesignificantly.Comparedwiththecontrol,theactivityofcomplexIII(30,60and87%,respectively),complexI+III(26,45and76%,respectively)andcomplexII+III(50%,60%and85%)decreasedsignificantlyfollowingtreatmentwithcarabroneatEC30,EC50andEC70.TheactivityofcomplexesIII,I+IIIandII+IIIinG.triticiwereapproximately negativelycorrelatedwiththetreatmentofcarabroneinconcentrationandtime.ThegeneGgCycofrespiratorychaincomplexIIIinG.triticiwashighlysensitivetocarabronbyqRT-PCR.TheseresultsdeclaredthatrespiratorychaincomplexIIIinG.triticiishighlysensitivetocarabrone.3.Anoptimisedpolyethyleneglycol(PEG)-mediatedprotoplasttransformationsystemforG.triticiwasestablished,andthegenesofhygromycinphosphotransferaseweretransformedtoG.tritici.Thefinaloptimizedconditionsweredeterminedtobe:1mLof1.4%lysingenzymereactingwith0.035gofhyphaeat31◦Cfor2.2hat90rpm.Theyieldofprotoplastwas9.83×107protoplasts/mL,andtheprotoplastvitalitywashigh,reaching96.27%undertheoptimizedconditions.Undertheoptimalconditions,thegenesofhygromycinphosphotransferaseweresuccessfullyinsertedintothegenomeofG.tritici,withthehighesttransformationfrequency(46–54transformants/µgDNA).Theestablishmentofprotoplasttransformationlaidafoundationfortheconstructionofmutants’bankofG.tritici.4.ThegenesGgCytc1,GgCytb,andGgIspofthemitochondrialrespiratorychaincomplexIIIinG.triticiweresilencedandoverexpressed,andmutantsweresuccessfullyobtained.Thegrowthrate,colonymorphologyandsensitivitytocarabroneandH2O2ofthewildtypestrainandmutantsweredetermined.Theresultsshowedthatthesilencingmutants∆GgCytc1、∆GgCytband∆GgIsphaslesssensitivetoH2O2,andthatthehyphaewerethinwithhyphalbranchingreducingcomparedwiththewild-typestrainandtheoverexpressionmutants.Thesilencingmutant∆GgIspislesssensitivetocarabronewithEC50valueof156.18µg/mL,andtheoverexpressionmutantOEIspissignificantlysensitivetocarabronewithEC50valueof25.88µg/mL.TheresultsdeclaredthatGgIspissensitivetocarabroneandthesubunitRieskeisapotentialtargetofcarabrone.5.Theactivityofperoxidase,laccase,andmitochondrialrespiratorychaincomplexIII,melaninconcentration,pathogenicity,andtheratesofmitochondrialrespirationinthewildtypestrainandthemutantswereassessed.(1)Comparedwiththewild-typestrainandoverexpressionmutants,theproductionofmelanininthestraintreatedwithcarabrone(100μg/mL),silencingmutants∆GgCytc1,∆GgCytb,∆GgIsp,andcarabrone-resistantisolate24-HN-1(Laboratorypreservation)weresignificantlyincreased(50-100%).(2)Theactivitiesoflaccaseweresignificantlyinhibitedin∆GgCytc1,∆GgCytb,∆GgIspand24-HN-1(47,37,41,and44%),whichwasconsistentwithpathogenicity.Theactivityofperoxidasewassignificantlyincreasedinwildtypestrainandthemutants,exceptfor∆GgIsp,whentreatedwithcarabrone(EC80).(3)TheactivitiesofrespiratorychaincomplexIIIofwildtypestrainandmutantsweresignificantlydecreased,exceptfor∆GgIspand24-HN-1,whentreatedwithcarabrone(0,EC20,EC80)invitroandinvivo.(4)FollowingtreatmentwithantimycinA(20 μg/mL),theratesofmitochondrialrespirationofthe∆GgCytbhadnosignicantchange,andotherstrainsweresignificantlyinhibited.Theratesofmitochondrialrespirationofthewild-typestrain,∆GgCytc1,∆GgCytb,24-HN-1,OECytc1,OECytb,andOEIspweresignificantlyinhibitedfollowingtreatmentwithcarabroneatEC80(approximately81,77,79,57,72,73,and72%,respectively),while∆GgIsphadnoeffectcomparedwiththecontrol.Theresultsdeclaredthat∆GgIspisinsensitivetocarabroneandthesubunitRieskeisapotentialtargetofcarabrone.6.With3DstructureofSaccharomycescerevisiaerespiratorychaincomplexIIIcytochromec1(Cytc1),cytochromeb(Cytb)andRieske(ISP)subunitastemplate,homologousmodelingofCytc1andISPsubunitfromG.tritici,andCytbsubunitfromNeurosporacrassawereconductedthroughtheSwissModelsoftware.Basedonthereliablehomologousmodel,activebindingcavitiesofCytc1,CytbandISPsubunitwerepredicted.Then,thecarabroneweredockedflexiblywiththebindingcavitiesinCytc1,CytbandISPrespectively,andeightaminoacidresidues(Tyr200、Arg194、Gly47、Gln43、Leu225、Arg171、Gln166andTyr230)weretheimportantbindingsitestocombinecarabrone.Inconclusion,thisstudyproposedthemechanismofcarabroneagainstG.triticiasfollowing:carabroneenrichedinthemitochondria,whichaffectedtherespiratorychaincomplexIII,leadingtoelectronswereunabletotransfer,thenlotsofROSweregeneratedbyrespiratorychaincomplexIII.MoreROSwouldbeaccumulatedinmitochondrial,andaseriesofoxidativestresseswereproduced.Finally,apoptosisfactorwasreleasedinmitochondria,causingcelldeathofG.tritici.KEYWORDS:carabrone,Gaeumannomycestritici,mitochondrialrespiratorychain,cytochromebc1,RNAi 目录第一章文献综述......................................................................................................................11.1小麦全蚀病研究概况..................................................................................................11.1.1小麦全蚀病的发生和危害...................................................................................11.1.2全蚀病菌研究概况...............................................................................................11.1.3小麦全蚀病的防治方法.......................................................................................21.2植物源杀菌剂研究进展..............................................................................................21.2.1抑菌植物的筛选...................................................................................................31.2.2植物源抑菌活性成分的研究进展.......................................................................51.3倍半萜内酯类化合物研究进展..................................................................................51.3.1倍半萜内酯类化合物生物活性研究进展...........................................................61.3.2倍半萜内酯类化合物作用机制研究进展...........................................................61.3.3天名精内酯酮研究现状.......................................................................................71.4线粒体呼吸链研究现状..............................................................................................91.4.1线粒体呼吸链复合酶研究现状.........................................................................111.4.2线粒体活性氧的产生.........................................................................................151.5呼吸链复合酶III抑制剂研究进展..........................................................................161.5.1Qi位点抑制剂研究进展......................................................................................171.5.2Qo位点抑制剂研究进展......................................................................................191.6问题的提出及论文设计思路....................................................................................22第二章天名精内酯酮对小麦全蚀病菌呼吸链复合酶的影响............................................242.1材料方法....................................................................................................................242.1.1供试材料.............................................................................................................242.1.2主要仪器及设备.................................................................................................252.1.3试验方法.............................................................................................................252.1.4结果统计与分析.................................................................................................312.2结果与分析................................................................................................................312.2.1天名精内酯酮与SHAM的增效作用................................................................312.2.2天名精内酯酮对呼吸链复合酶I、II活性的影响...........................................322.2.3天名精内酯酮对呼吸链复合酶IV、V、CS活性的影响...............................332.2.4天名精内酯酮对呼吸链复合酶III、I+III、II+III活性的影响.......................352.2.5呼吸链复合酶基因qRT-PCR分析....................................................................372.3讨论............................................................................................................................392.3.1天名精内酯酮对呼吸链有显著的抑制作用.....................................................392.3.2天名精内酯酮与呼吸链复合酶III的互作有待深入研究...............................39 2.4小结............................................................................................................................41第三章小麦全蚀病菌原生质体遗传转化体系的建立........................................................423.1材料方法....................................................................................................................423.1.1供试材料.............................................................................................................423.1.2供试设备及试剂.................................................................................................423.1.3试验方法.............................................................................................................433.2结果与分析................................................................................................................493.2.1培养基对原生质体制备的影响.........................................................................493.2.2温度对原生质体制备的影响.............................................................................503.2.3酶对原生质体制备的影响.................................................................................503.2.4酶解时间对原生质体制备的影响.....................................................................503.2.5菌丝体重量对原生质体制备的影响.................................................................513.2.6摇床转速对原生质体制备的影响.....................................................................513.2.7酶浓度对原生质体制备的影响.........................................................................523.2.8原生质体产生条件的优化.................................................................................533.2.9转化子筛选.........................................................................................................56图3-4转化子在选择培养基上生长......................................................................................563.2.10Southern杂交和PCR验证...............................................................................573.3讨论............................................................................................................................573.3.1原生质体制备在PEG介导小麦全蚀病菌转化中至关重要............................573.3.2原生质体浓度对丝状真菌转化率有重要影响.................................................593.4小结............................................................................................................................59第四章Ggcytc1、Ggcytb、GgISP沉默和过表达载体的构建及突变体筛选....................614.1材料方法....................................................................................................................614.1.1供试材料.............................................................................................................614.1.2供试设备及试剂.................................................................................................634.1.3试验方法.............................................................................................................634.2试验结果....................................................................................................................744.2.1GgCytc1，GgCytb及GgIsp基因鉴定及序列分析...........................................744.2.2沉默和过表达载体PCR验证............................................................................764.2.3沉默和过表达转化子PCR验证........................................................................774.2.4沉默和过表达转化子RT-PCR验证..................................................................774.2.5沉默和过表达转化子DNA水平验证...............................................................784.3讨论............................................................................................................................794.4小结............................................................................................................................80 第五章突变菌株生理生化指标测定....................................................................................815.1材料方法....................................................................................................................815.1.1供试材料.............................................................................................................815.1.2主要仪器及设备.................................................................................................825.1.3试验方法.............................................................................................................835.2结果与分析................................................................................................................855.2.1菌丝生长速率测定.............................................................................................855.2.2菌株对天名精内酯酮和H2O2敏感性测定.......................................................865.2.3菌丝形态显微观察.............................................................................................875.2.4黑色素含量测定.................................................................................................895.2.5过氧化物酶和漆酶活性测定.............................................................................905.2.6突变菌株GgLac基因RT-PCR分析.................................................................915.2.7线粒体呼吸链复合酶III活性测定...................................................................925.2.8菌株致病性及天名精内酯酮的活体抑菌活性测定.........................................945.2.9线粒体氧消耗速率测定.....................................................................................965.3讨论............................................................................................................................985.3.1GgLac可能是供试菌株致病相关基因..............................................................985.3.2GgCytc1、GgCytb和GgIsp对菌丝生长、黑色素含量、致病性有重要影响985.3.3天名精内酯酮对呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基有重要影响.......................995.4小结..........................................................................................................................100第六章Cytc1、Cytb和ISP亚基的同源建模与分子对接................................................1026.1材料方法..................................................................................................................1026.1.1供试材料...........................................................................................................1026.1.2试验方法...........................................................................................................1036.2结果与分析..............................................................................................................1046.2.1模板蛋白序列的搜索.......................................................................................1046.2.2目的蛋白序列与模板蛋白序列的比对...........................................................1056.2.3三维模型的构建...............................................................................................1066.2.4模型评估...........................................................................................................1076.2.5Cytc1、Cytb和ISP三维结构活性腔的确定...................................................1116.2.6天名精内酯酮与Cytc1、Cytb和ISP亚基三维结构模型的分子对接........1126.3讨论..........................................................................................................................1156.4小结..........................................................................................................................116第七章讨论与结论..............................................................................................................1177.1讨论..........................................................................................................................117 7.1.1呼吸链复合酶III是天名精内酯酮的潜在靶蛋白之一.................................1177.1.2天名精内酯酮与抗霉素A可能作用于复合酶III的不同亚基.....................1177.1.3铁硫蛋白亚基是天名精内酯酮潜在靶标之一...............................................1187.1.4天名精内酯酮抑菌机制推测...........................................................................1187.2主要结论..................................................................................................................1207.3本研究创新点..........................................................................................................1217.4有待进一步解决的问题..........................................................................................121参考文献................................................................................................................................122附录一缓冲液的配置..........................................................................................................140附录二小麦全蚀病菌总RNA提取...................................................................................142附录三小麦全蚀病菌基因组DNA提取...........................................................................143附录四Southern杂交所用试剂配制及步骤......................................................................144附录五普通琼脂糖凝胶DNA回收...................................................................................148附录六大肠杆菌感受态的制备..........................................................................................149附录七大肠杆菌质粒提取..................................................................................................150致谢......................................................................................................................................152作者简介................................................................................................................................153 第一章文献综述1.1小麦全蚀病研究概况小麦全蚀病是由小麦全蚀病菌（Gaeumannomycestritici）引起的，又称为小麦立枯病、黑脚病。小麦全蚀病是一种典型的土传根部病害，病菌菌丝从小麦的根部和茎基部1-2节侵入，在根部进行大量繁殖，导致根部导管堵塞，不能正常运输营养和水分，使麦株黄叶增多，分蘖减少。全蚀病菌在小麦的整个生长期均可侵染，苗期病株矮小，下部黄叶多，种子根和地中茎变成灰黑色，严重时造成麦苗连片枯死。拔节期冬麦病苗返青迟缓、分蘖少，病株根部大部分变黑，有时候在茎基部及叶鞘内侧出现较明显灰黑色菌丝层。成株期的症状比较明显，在小麦田形成矮化中心，分蘖明显减少，并且提前成熟，在小麦抽穗期出现典型的“白穗”症状。由于病株的养分和水供应不足，多呈现出矮小，穗数少且不实，千粒重明显降低，造成减产，一般减产达20-50%左右，严重着甚至绝收。1.1.1小麦全蚀病的发生和危害小麦全蚀病首次是1852年在南澳大利亚发现的，直到1870年被命名为全蚀病，目前是全世界小麦种植区小麦上最严重的土传根部病害（AsherandShipton1982;Cook2003）。我国最早在1931年浙江小麦种植区发现全蚀病，之后在全国小麦种植区均有发现（高照良和商鸿生1999）。小麦全蚀病菌也会导致大麦、黑麦和相关禾草的根腐病，但对小麦引起的危害最为严重。研究者对小麦全蚀病菌的研究比较早，也比较多，早在二十世纪中期Garrett就推出将根部病害和土传病原菌的研究作为一个独立的科学领域（AsherandShipton1982;Garrett1956）。长期以来，小麦全蚀病在我国小麦种植区危害较为严重，造成严重减产。因此，深入了解小麦全蚀病的发生规律以及防治措施，进一步明确小麦抗病机制与病菌致病机制，对于控制小麦全蚀病危害具有重要意义。1.1.2全蚀病菌研究概况小麦全蚀病菌（Gaeumannomycestritici）是禾顶囊壳小麦变种，属于子囊菌亚门真菌，是土壤寄居菌，只能在土壤中的病残体上腐生或休眠，过度到下季小麦上，完成其侵染循环。同时，在小麦成熟前或收获后，病茬上产生大量有性世代—子囊壳，在潮湿或有微雨的条件下，子囊壳破裂喷射出大量的子囊孢子，其中一部分子囊孢子落于本田，另一部分随气流带往其他田地，其传播方式和病残体也不尽完全相同，在自然条件下尚未发现其无性阶段。小麦全蚀病菌在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上菌丝为褐色，菌丝束明显，人工培养易产生子囊壳，其主要靠菌丝侵染寄主，在苗期和成株期均可发病。小麦全蚀病菌能引起严重的小麦根部病害，在全世界小麦种植区发生较为普遍，病原菌感染易感宿主，导致植株根系发黑，严重矮化和过早死亡等。全蚀病菌不仅能侵染1 小麦、黑麦、大麦和燕麦还可以侵染禾本科杂草或谷物的根导致黑脚病（Cook2003;McMillanetal.2015;Keenanetal.2015）。小麦全蚀病菌能引起禾谷类作物严重的根部病害，其分类水平一直是几十年来研究的课题。根据形态学、致病性和寄主选择性，可以分为四个变种（Turner1940;Walker1972;Yao1992）。小麦全蚀病菌禾谷变种（G.graminisvar.graminis（Ggg）），能引起水稻冠（黑）鞘腐病，狗牙草顶枯病和根腐病以及奥古斯丁或其他暖季型草坪草的根系衰退（Walker1972;Elliott1991;WardandBateman1999）。Ggg是最没有侵略性的变种，经常被发现腐生在谷物，草和大豆中的一个致病力较弱的病原菌（Walker1980;Royetal.1982;WardandBateman1999）。小麦全蚀病菌燕麦变种（G.graminisvar.avenae（Gga））能引起燕麦和草坪全蚀病，也能侵染小麦、黑麦和大麦。小麦全蚀病菌小麦变种（G.graminisvar.tritici（Ggt））是最具侵略性的变种，是引起小麦全蚀病的主要变种。它主要侵染小麦，同时，也可以侵染小黑麦、大麦和燕麦等谷物和草（Walker1980;WardandBateman1999;FreemanandWard2004）。小麦全蚀病菌玉米变种（G.graminisvar.maydis（Ggm））能引起玉米全蚀病，也能轻微侵染高粱等谷类（Yao1992）。上述小麦全蚀病菌变种的分类是根据不同的病菌侵染寄主后的症状、病菌的寄主范围、培养条件和病菌的形态特征等，但是这种分类过程繁杂且耗时，在许多情况下是不确定的。直到2016年，研究者在利用ITS（5.8SrDNA和28SrDNA基因间隔序列）的扩增等方法发现Ggt和Gga变种不同于G.graminis，并且将G.graminisvar.tritici和G.graminisvar.avenae分别重新命名为G.tritici和G.avenae（Hernández-Restrepoetal.2016）。1.1.3小麦全蚀病的防治方法小麦全蚀病的侵染源主要来源于土壤，其与小麦长期的共生，且寄主范围较广，病害一旦发生就难以根治。小麦全蚀病菌是一种非专化寄生菌，对小麦品种并无严格选择性，难以培育出抗性良好的高抗品种，且至今为止，国内外市场上并没有对该病防治效果很好的杀菌剂。因此，在农业生产中，首先，要严格控制好检疫。其次，种植高产耐病品种。最后，加强栽培管理，适当的进行轮作，根据麦田土壤和气候的不同，从作物、小麦或其他易感的禾本科作物轮作一年或二年，也可以通过连续种植小麦和大麦来管理，导致小麦全蚀病的发病率自然下降，恢复作物的产量（ThomashowandWeller1988）。在生物防治方面，荧光假单胞菌和木霉菌对小麦全蚀病菌均有一定的抑制作用。同时，提倡施用沤制的堆肥，采用配方施肥技术，增加土壤根际微生物。在化学防治方面，迫切的需要一种能有效防治小麦全蚀病菌，并且低毒、对环境友好的新型杀菌剂。1.2植物源杀菌剂研究进展从植物中提取和分离出活性物质是创制新农药的一个重要途径，也是目前的一个研究热点。植物源杀菌剂通常是由多种不同作用方式的混合物构成，对病原菌是多作用位点，因此，不易产生抗药性（BrentandHollomon2007;MiresmailliandIsman2014）。2 据报道，全球有6300多种高等植物具有防治有害生物的潜力，其中杀菌植物2000多种（于宏伟等2009）。我国是一个植物资源大国，具有很大优势开发植物源农药。国外研究者对植物源活性物质也进行了大量的研究。在欧洲，虎杖（Reynoutriajaponica）的提取物被用来广泛防治真菌，该提取物对白粉病特别有效，通过诱导植物防御机制来达到保护植物作用，该提取物的主要活性化合物是大黄素类物质（Dayanetal.2009）。Singh等1983年发现，大蒜Alliumsativum、印楝Azadirachtaindica和姜Zingiberofficinale对豌豆白粉病Erysiphepolygonl有很好的活性（SinghandSingh1983）。Karade研究发现，薄荷叶Menthaarvensis提取物对链格孢菌Alternariaalternata有很好的活性（KaradeandKalekar2000）。目前，我国很多科研机构和企业都在进行植物源农药的开发研究，并且已经有多种植物源活性成分的杀菌剂取得登记，如0.6%苦参碱水剂、0.8%大黄素甲醚悬浮剂、1%蛇床子素水乳剂、4%小檗碱水剂、0.28%[0.16%+0.12%]黄岑苷·黄酮水剂、2.1%[2%+0.1%]丁子香酚·香芹酚水剂、0.05%大蒜素浓乳剂等。1.2.1抑菌植物的筛选1.2.1.1抗真菌植物的筛选细辛Asarumsieboldii是马兜铃科细辛属的植物，在1970年描述的日本细辛属植物中，无疑是一个以其独特的花结构而闻名，在其属中是最不寻常的物种之一。在我国，细辛主要分布在云南、四川、陕西、辽宁、黑龙江、浙江等地，多生长在林下潮湿的腐殖中。早在《神农本草经》中有记载，细辛是常用中药。王树桐等在2004年研究发现，细辛和丁香的醇提物对番茄灰霉病菌（Botrytiscinerea）有较强的抑制作用（王树桐等2004）。研究发现，丁香Syringaoblata、细辛A.sieboldii、甘草Glycyrrhizauralensis、黄连Coptischinensis、苦参Sophoraflavescens、蛇床子Fructuscnidii对辣椒疫病菌Phytophthoracapsici、番茄灰霉病菌B.cinerea、茄黄萎病菌Verticilliumdahliae、黄瓜枯萎病菌Fusariumoxysporum和黄瓜菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum的菌落生长有明显的抑制作用（黄奔立等2006）。张淑红等（2006）研究表明，细辛提取物对茄黄萎病菌V.dahliae的菌丝生长抑制作用较强，抑制效果在65%以上。蛇床子F.cnidii为伞形科植物，一年生草本植物，其果实在医学上有广泛的应用，具有许多抗炎、抗肿瘤的作用，其是多年生草本植物的重要传统药材，广泛用于皮肤和妇科疾病（Wangetal.2008）。据报道，蛇床子甲醇提取物对须发癣菌有较强抑制作用。余伯阳等（1991）年研究发现，蛇床子水煎液对羊毛状小孢子Microsporonlanosum和絮状表皮癣菌Epidermophytonfloccosum有抑制作用。周宝利等（2012）研究发现，蛇床子水提物对番茄灰霉病菌B.cinerea的菌丝抑制效果最差，而醇提物对番茄灰霉病菌的菌丝抑制效果较好。同时，具有杀真菌的植物还有小蘖Berberiskawakamii、姜Z.officinale、桉树Eucalyptusrobusta、金盏花Calendulaofficinalis等。1.2.1.2抗细菌植物的筛选3 夹竹桃Neriumoleander是一种夹竹桃科的常绿灌木或小乔木，具观赏价值的中草药。原产于非洲北部和地中海地区，广泛种植于温带和亚热带地区，花期较长，耐高温、耐盐和耐旱。许多品种是根据其单花或双花的颜色选择的，也有完全绿色和多年生的品种（Vilaetal.2010）。夹竹桃在医药方面研究较深，能产生具有生物活性的次生代谢物，主要是胡萝卜苷、黄酮和萜类化合物，因此对制药工业具有重要的经济意义（Fuetal.2005）。夹竹桃苷已被确定为一种有效的抗肿瘤化合物。研究者利用夹竹桃叶提取物对大肠埃希氏菌Escherichiacoli、普通变形杆菌Proteusvulgaris、铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa、金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus、粪肠球菌Enterococcusfaecalis、八叠球菌Sarcinalutea的活性进行测定，发现夹竹桃叶醇提取液的抑菌效果最好，其中浓度70%乙醇提取液的抑菌效果最为明显。夹竹桃对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌和八叠球菌的抑制作用比较明显。研究表明，夹竹桃叶提取物对革兰氏阳性菌具有较强的抑菌效果，而对革兰氏阴性菌的抑菌作用不显著（李昌灵等2008）。穿心莲Andrographispaniculata的主要成分为甾醇、生物碱、内酯、黄酮类化合物以及少量蛋白质和维生素。Singha等（2003）研究发现，穿心莲的水提物对枯草杆菌Bacillussubtil、金色葡萄球菌S.aureus、大肠杆菌E.coli、绿脓假单胞菌Pseudomonasaeruginosa和白念珠菌Candidaalbicans有显著抑制作用。同时，有研究表明，穿心莲提取物对金色葡萄球菌S.aureus、枯草杆菌B.subtil、大肠杆菌E.coli、黑曲霉Aspergillusniger、青霉Penicillium都有抑菌效果，而且对细菌的抑制效果强于真菌（刘志祥等2009）。具有杀细菌的植物还有大蒜A.sativum、荆芥Fineleafschizonepeta、仙鹤草Agrimoniapilosa、洋葱Alliumcepa、半枝莲Scutellaruabarbata等。1.2.1.3抗病毒植物的筛选商陆Phytolacca属多年生粗壮草本植物。在我国河南、湖北、山东、浙江、江西等地区均有分布，我国现有分布的品种中主要有商陆和垂序商陆（美商陆，美洲商陆，十蕊商陆），商陆的主要有效成分包括多种皂甙、商陆碱、商陆素及硝酸钾等。据研究发现，美洲商陆是首次发现含有病毒抑制剂的植物。虽然其他物种如甜菜Betavulgaris、菠菜Spinaciaoleracea、洋石竹Dianthuscaryophyllus等的汁液中的物质也会抑制植物病毒传播，但商陆提取物可能是迄今为止对病毒最有效的植物源活性物质（Tomlinsonetal.1974）。Lin研究发现，美商陆能产生三种商陆抗病毒蛋白（Phytolaccaanti-viralprotein,PAP）。从叶中分离出29kDaPAP和30kDaPAP-II，从商陆的种子中分离出30kDaPAP-S；研究表明PAP在商陆的整个生长发育期都在不断合成，而PAP-II随着商陆年龄的增加才合成（Linetal.1991）。葛永辉等（2013）研究发现，垂序商陆果实和枝叶的正丁醇萃取部分，枝叶的乙酸乙酯萃取部分提取物对烟草花叶病毒（tobaccomosaicvirus，TMV）表现出了一定的钝化作用，含有4个三萜皂苷类化合物的组分具有较强的体外抑制TMV增殖作用。具有抗病毒的植物还有银杏Ginkgobiloba、甘草G.uralensis、4 连翘Forsythiasuspensa、红花马齿苋Portulacasplendens、红叶藜Chenopodiumrubrum等。1.2.1.4杀线虫植物的筛选万寿菊属植物Tagetes，是菊科中的一个属，为一年生、分枝、直立或披散草本植物。该属共有46种植物，分布于热带美洲，其中有14种可防治线虫。Rajvanshi报道，万寿菊中的T.patula的水提物中有一种碱性的化学成分，能有效的抗线虫（Rajvanshietal.1985）。万寿菊属植物中的T.erecta、T.minuta均能很好的防治多种线虫，Mateeva等作了相关研究，这些植物对控制线虫严重发生与危害，减轻环境污染等起了很大作用（Mateeva1995）。Nandal（1986）研究发现，用蓖麻Ricinuscommunis叶提取液灌根，可有效的防治爪哇根结线虫Meloidogynejavanica，减少了线虫对植株根的损伤。同时，具有杀线虫的植物还有印楝A.indica、苦郎树Clerodendruminerme、侧柏Platycladusorientalis等。1.2.2植物源抑菌活性成分的研究进展从抑菌植物中提取分离的活性成分结构类型有：萜类、生物碱类、黄酮类、酚类、醇类等。大多数抑菌植物中同时含有几种不同类型的活性成分物质。萜类化合物的抑菌作用研究较多。辐射松（Pinusradiata）、黄芩属（Scutellaria）、常山（clerodenrumuncinatum）和天明精属（Carpesium）等中提取分离到萜类化合物（Coleetal.1991）。Picman（1986）研究发现，60%以上的倍半萜类化合物具有很好的抑菌活性。生物碱是分布最广的含氮次生代谢物，存在于约20%的有花植物中（WippichandWink1985）。目前，研究较多的具有抑菌作用的生物碱有小檗碱、喹嗪生物碱、芦竹碱等，分别从黄连、羽扇豆、芦竹等植物中提取分离得到。黄酮类具有很强的抑菌活性，如从刺桐（Erythrinavariegata）、甘草（Glycyrrhizauralensis）大豆黄（Glycinemax）和鹰嘴豆（Cicerarietinum）等植物中提取分离的黄酮类物质具有很好的抑菌活性。芒果皮、大蒜、茶叶、樱桃树等植物中分离得到的酚、醇类化合物如大蒜素、茶多酚、苯甲醇化合物等具有很好的抑菌活性。同时，从植物中提取分离得到某些脂肪和蛋白质类物质具有很好的抑菌活性（韩建华2002）。1.3倍半萜内酯类化合物研究进展萜类化合物在自然界中分布较为广泛，存在于多种植物与微生物的次级代谢产物中。倍半萜类化合物是由三分子异戊二烯单元聚合而来，含有内酯环的倍半萜称之为倍半萜内酯。倍半萜内酯类化合物多存在于木兰科、八角科以及菊科等多种植物中，是多种药用植物的重要活性成分（刘清华等2007;胡岩等2010;杨茜2012）。近年来国内外研究表明，倍半萜内酯类成分在强心、抗肿瘤、抗炎、抑菌等方面均具有较好的生物活性（Barsbyetal.1993;Evstratovaetal.1974;Huangetal.2013）。研究发现α-亚甲基-γ丁内5 酯环是倍半萜内酯的有效基团，迄今为止发现较多的倍半萜内酯类化合物具有良好的生理活性，是研究和开发新药的重要来源。新农药的创制的重要途径之一便是对天然产物的研究与利用，除了直接将其开发成农药外，更重要的是发现和确证结构新颖的天然产物的分子靶标，为新农药的分子设计提供支持。倍半萜内酯类植物次生代谢产物的结构类型丰富、化合物数量庞大、生物活性多样，是植物自身产生的典型的先天防御物质（phytoanticipin），在新农药创制上具有重要潜质（Dixon2001;Chadwicketal.2013）。1.3.1倍半萜内酯类化合物生物活性研究进展倍半萜内酯是菊科植物中最具特色的次生代谢产物，同时，在爵床科、苋科、伞形科和木兰科这几个植物科中也曾报道过。倍半萜内酯类化合物具有多种化学结构和广泛的生物活性，包括抗肿瘤、昆虫拒食、植物生长调节、抗细菌、抗真菌和细胞毒性等（Baruahetal.1994;Görenetal.1996;MansillaandPalenzuela1999;Neerman2003）。异土木香内酯（isoalantolactone）是一类倍半萜类化合物，是总状土木香Inularacemosa（菊科）中的主要成分。同时，发现异土木香内酯对3种土壤植物病原真菌小麦全蚀病菌G.tritici、小麦纹枯病菌Rhizoctoniacerealis和辣椒疫霉病菌P.capsici具有很好的抑制作用（Mishra2001）。Ahmed和Abdelgaleil从荷花玉兰Magnoliagrandiflora中分离得到的倍半萜内酯为广木香内酯（costunolide）、小白菊内酯（parthenolide）以及1，10-环氧基-小白菊内酯（1，10-epoxyparthenolide）。通过试验测定表明，广木香内酯对黑孢子菌Nigrosporaspp、立枯丝核菌Rhizocotoniasolani和长蠕孢属Helminthosporiumspp的抗真菌活性最强，EC50值分别为0.48、2.92和2.96µg/mL。而小白菊内酯对链格孢菌A.alternata和镰刀菌Fusariumculmorium表现出较高的抗真菌活性，EC50值分别为4.07和50.27µg/mL。这三种倍半萜内酯类化合物对长蠕孢属Helminthosporiumspp的抗真菌活性均高于对照杀菌剂甲基托布津（thiophanate-methyl）（AhmedandAbdelgaleil2005）。Kumari等从树斑鸠菊（Vernoniaarborea）中分离得到的倍半萜内酯zaluzaninD，并对该化合物进行了抗真菌活性研究。表明其对灰葡萄孢菌B.cinerea、月状弯孢菌Curvularialunata以及立枯丝核菌Rhizoctoniasolani有很好的抑菌活性（Kumarietal.2003）。去氢木香内酯（dehydrocostuslactone）属于愈创木烷型倍半萜，对6种植物病原物真菌的孢子萌发有强烈抑制作用（Wedgeetal.2000）。Calera等从一种墨西哥菊Ratibidamexicana中分离得到的isoalloalantolactone和另一种桉烷型化合物，并对其进行抑菌活性测定，发现这两种倍半萜内酯对不同的镰刀菌属真菌、腐霉属真菌和长蠕孢属真菌的菌丝生长有很好的抑制作用（Caleraetal.1995）。目前，已报道的具有杀菌活性的倍半萜内酯类化合物多为吉玛烷型、愈创木烷型、伪愈创木烷型、桉叶烷型和卡拉布烷型倍半萜。1.3.2倍半萜内酯类化合物作用机制研究进展倍半萜内酯类化合物广泛存在于植物、微生物、及某些昆虫体内，具有多种生物活性。目前，有关倍半萜内酯类化合物的作用机制在医药上已有较深入的研究。研究发现，6 有些倍半萜内酯具有较强的抗炎、抗肿瘤活性，α-亚甲基-γ-丁内酯结构环是倍半萜内酯具有抗肿瘤活性的有效基团。倍半萜内酯影响转录因子和许多酶系统导致细胞毒效应，对细胞内各种靶结构造成干扰（Schmidt1999;SchmidtandHeilmann2015）。倍半萜内酯中的α-亚甲基-γ-内酯活性基团发生亲电加成反应以及细胞内硫醇的亲核反应构成这个细胞毒性的分子机制（Hanetal.2009;Liuetal.2009）。小白菊内酯的抗炎作用可能与转录因子kappaB（NF-Кb）的抑制有关。蛋白NF-Кb是人类免疫应答的中心介质，在大多数细胞类型中，这种蛋白由一个p50和一个p65亚基组成。NF-Кb通过调节细胞因子及其受体、细胞黏附分子、环氧合酶Ⅱ和诱导型一氧化氮合酶等多种炎症介质和炎症因子的表达，在调节炎症过程中起关键作用（KarinandDelhase2000）。大多数转录因子NF-Кb抑制剂具有两个反应中心，分别是α-亚甲基-γ-丁内酯和α，β-或α，β，γ，δ-不饱和羰基。研究结果表明，小白菊内酯不仅抑制DNA和NF-Кb的结合，还抑制IКB-激酶活性，但前者在抑制中起了主要作用（García-Piñeres2004）。Rüngeler等选择了28种倍半萜内酯类化合物包括吉玛烷型、愈创木烷型、伪愈创木烷型、桉叶烷型和苍耳烷型等结构类型，测定化合物抑制NF-Кb的能力。试验揭示了倍半萜内酯类化合物抑制转录因子NF-Кb通过选择性烷基化其p65亚基，可能与半胱氨酸残基反应（Rüngeleretal.1999）。小白菊内酯对微管蛋白羧肽酶有一定的抑制作用，该化合物的这种抑制作用是一种新的、特别的属性，与其对核因子NF-Кb通路的作用无关。微管蛋白羧肽酶的抑制可能是小白菊内酯抗癌特性的潜在机制之一（Fonroseetal.2007）。广木香内酯和小白菊内酯均可以显著抑制分泌型碱性磷酸酶，广木香内酯也可以抑制NF-Кb与DNA的结合并呈剂量依赖性（王毅2002）。同时，广木香内酯还抑制AP-1转录因子的活性，抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的磷酸化（Kangetal.2004）。目前为止，倍半萜内酯类的化合物杀菌和抗癌作用靶点尚不明确，但这些化合物中含有的α-亚甲基-γ-丁内酯结构与其生物活性有关。倍半萜内酯类化合物在农用中较少，目前报道的有小白菊内酯对水稻白叶枯病菌的抑菌作用。Xu等（2018）研究了小白菊内酯对水稻白叶枯病菌的抑制效果，离体条件下，小白菊内酯对水稻白叶枯病菌抑制效果较强，活体条件下该化合物对水稻白叶枯病菌有一定的治疗作用，但保护作用一般。通过研究小白菊内酯对水稻白叶枯病菌的抑菌机制，表明小白菊内酯能够与病菌中的谷胱甘肽和半胱氨酸等具有游离巯基的化合物发生反应，扰乱菌体还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽平衡，造成氧化胁迫，从而起到抑菌作用。1.3.3天名精内酯酮研究现状天名精内酯酮（图1-1）是从菊科天名精属大花金挖耳Carpesiummacrocephalum中分离提取得到的一种主要抑菌活性成分，大花金挖耳广泛分布于亚洲和欧洲（Minatoetal.1964;Fengetal.2010;Zhangetal.2015）。天名精内酯酮为卡拉布烷型倍半萜内酯类化7 合物，其特有的三元环桥连六元环的结构特征和优异的生物活性在新农药创制上具有重要潜质（冯俊涛2006）。西北农林科技大学无公害农药研究服务中心首次报道了天名精内酯酮对小麦全蚀病菌G.tritici、灰霉病菌B.cinerea、炭疽病菌Colletotrichumlagenarium、枯萎病菌F.oxysporum、小麦纹枯病菌R.cerealis、辣椒疫霉P.capsici等19种植物病原真菌有很好的抑制效果，尤其是对小麦全蚀病菌具有显著抑菌活性。王箐霞（2007）测定了天名精内酯酮对玉米大斑病菌Setosphaeriaturcicaa、番茄叶霉病菌Fulviafulva、黄瓜炭疽病菌等6种供试病原真菌孢子萌发的抑制作用，其中对黄瓜炭疽病菌的孢子毒力最高，EC50为6.9mg/L。通过盆栽试验，表明天名精内酯酮对小麦全蚀病、小麦白粉病、辣椒疫霉病和黄瓜炭疽病具有很好的保护和治疗效果，其中对小麦全蚀病的药效较好，在1000mg/L剂量下，对小麦全蚀病的保护和治疗的效果为85.48%和64.98%；其次，对小麦白粉病的保护和治疗效果为73.68%和46.95%；对黄瓜炭疽病的保护和治疗效果为50.01%和46.49%；对辣椒疫霉病的保护和治疗效果为48.06%和39.75%。在室内盆栽试验基础上，通过天名精内酯酮灌根法防治小麦白粉病，在1000mg/L的剂量下，保护和治疗效果分别为80.43%和82.69%；通过活体组织法测定发现，在1000mg/L剂量下，天名精内酯酮对番茄灰霉病的保护和治疗效果分别为45.5%和19.9%（冯俊涛2006;王艳梅2009;韩兴帅等2014）。试验表明天名精内酯酮具有良好的保护和治疗效果并且有较优的内吸性及向上传导性。冯俊涛等（2007）通过对天名精内酯酮结构式中可能的活性基团进行修饰，发现该化合物分子中的α-亚甲基-γ-丁内酯结构和4位羰基结构对其活性有重要影响，是其活性基团。天名精内酯酮不仅对供试菌株有显著抑制作用，还具有较低毒性、环境友好等特点（Fengetal.2010;Wangetal.2014a,2014b），因此，该化合物有潜力开发为一种新型的植物源杀菌剂。考虑到天名精内酯酮结构的独特性和对环境的友好性，通过开展该化合物的分子靶标研究工作，不仅能以此为模型的农药分子设计提供靶标上的支持，而且还可以发掘天然产物的利用潜力，提升对天然活性物质的利用水平。OOO114图1-1天名精内酯酮分子结构Fig.1-1Thestructureofcarabrone杀菌剂作用机理的研究为化合物的应用和新农药创制奠定基础，课题组前期就天名精内酯酮对小麦全蚀病菌的抑菌机理进行了初探。通过高效液相色谱法检测发现天名精内酯酮在双子叶作物黄瓜和单子叶作物小麦中具有较优的内吸活性，并且从根部向上传导。生理生化研究结果表明，天名精内酯酮对小麦全蚀病菌生物氧化过程存在显著影响。通过超微结构观察发现天名精内酯酮对病原真菌线粒体结构产生严重影响，天名精内酯酮处理病菌后，线粒体发生肿胀、脊消失使其空泡化、出现髓鞘样结构等（冯俊涛2006；8 王艳梅2009）。同时，利用荧光示踪法、免疫荧光法以及免疫金法亚细胞定位，表明天名精内酯酮在小麦全蚀病菌中作用的细胞器为线粒体（Wangetal.2018）。1.4线粒体呼吸链研究现状线粒体是真核细胞中必不可少的细胞器，它是酶的机器—氧化磷酸化系统（OXPHOS），负责三磷酸腺苷（ATP）的有氧生产。线粒体内有重要的细胞反应，包括线粒体呼吸链能量的产生、调节细胞死亡、钙代谢和活性氧产生。三羧酸循环又称为柠檬酸循环（TCAcycle）是发生在线粒体中重要代谢途径，是糖类、脂类和氨基酸的联系枢纽和共同代谢途径。三羧酸循环中产生的NADH和FADH2进入电子传递链产生大量的ATP。线粒体呼吸链由五个复合酶（复合酶I-V）嵌入线粒体内膜，催化Krebs循环与氧反应产生的高能化合物的还原等价物的转移，最终通过线粒体内膜产生电化学梯度，驱动ATP合成酶合成ATP。如图1-2，线粒体电子传递链中，有两条呼吸途径，即电子从呼吸链复合酶I→泛醌（Q）→复合酶III→细胞色素c→复合酶IV或者电子从呼吸链复合酶II→Q→复合酶III→细胞色素c→复合酶IV。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和还原型黄素二核苷酸（FADH2）产生的电子通过呼吸链复合酶I到IV，最终传递给氧气。呼吸链复合酶Ⅰ至IV之间的电子转移涉及位于内膜内的移动电子载体泛醌和细胞色素c，细胞色素c是位于膜间间隙的一种小的非膜锚定蛋白。线粒体内膜的呼吸复合酶是由两种来源的蛋白质组成的多亚基复合体。大部分蛋白质编码于细胞核DNA中，在细胞质核糖体上合成，并导入线粒体。哺乳动物线粒体基因组编码13种疏水膜蛋白（表1-1），且这些膜蛋白均是线粒体内膜的呼吸链复合酶的亚基（Andersonetal.1981;Andersonetal.1982）。其中，呼吸链复合酶I中，有7个亚基由线粒体编码即ND1-ND6和ND4L，在牛线粒体中这7个亚基给复合酶I的膜臂上贡献约60条跨膜a-螺旋（Carrolletal.2006）。呼吸链复合酶Ⅲ中的11个亚基，只有细胞色素b亚基是线粒体DNA编码的，是复合体III的功能亚基（Iwataetal.1998）。呼吸链复合酶IV由13个亚基组成，其中亚基CoxI，CoxII和CoxIII由线粒体编码，且是呼吸链复合酶IV的催化核心（Tsukiharaetal.1996）。在呼吸链ATP合酶中，亚基ATPase-6和ATPase-8由线粒体DNA编码，它们构成了ATP合酶中Fo质子移位区的一部分（FearnleyandWalker1986;Chenetal.2007）。线粒体呼吸链功能障碍是人类多种疾病的关键因素，包括线粒体和核DNA突变引起的原发性线粒体疾病，如老化、糖尿病、癌症和药物毒性、以及一些神经退行性疾病，包括帕金森病和阿尔茨海默病（DimauroandSchon2003;Miróetal.2003;Balabanetal.2005;LinandBeal2006;Hauptmannetal.2009;ChandraandSingh2011;Szendroedietal.2012）。然而，线粒体改变的机制和导致代谢紊乱的途径仍有待确定。有相当多的证据表明，线粒体主要通过线粒体DNA（mtDNA）突变的积累、活性氧的产生、线粒体代谢异常和钙储存的改变而导致神经元老化和与年龄有关的神经退行性疾9 病（LinandBeal2006;Reddy2008）。线粒体也是细胞死亡的关键调节因子，程序性细胞死亡被认为在衰老中发挥着重要作用。细胞死亡也与其他几个与衰老有关的过程有关，包括：增加活性氧（ROS）生成，可能导致线粒体分裂，促进神经细胞死亡（Yoonetal.2006;Benardetal.2007）；胞浆中Ca2+水平升高，线粒体Ca2+缓冲改变，这可能有利于引起线粒体去极化或增强线粒体通透性转变的激活（Satrústeguietal.1996;Crompton2004）。线粒体功能是生物体内代谢平衡的基础。线粒体除了将营养物质转化为能量分子ATP外，它还产生活性氧等中间产物，作为第二信使来介导信号转导和代谢。线粒体ROS的产生曾是传统衰老理论的核心，在这一理论中，ROS诱导的氧化损伤促进了衰老过程；因此，防止衰老可以通过抑制或清除体内ROS的措施（RistowandSchmeisser2011;GemsandDe2013）。低浓度的ROS是线粒体中一种信号分子，与最近研究一致，线粒体ROS可以作为第二代信使来改善代谢的稳态和信号传导，甚至延缓衰老的进程（RistowandSchmeisser2011）。线粒体中的ROS大部分来自于呼吸链复合酶I和III中，并且经过超氧化物歧化酶（SOD）分解为H2O2，一部分的H2O2直接通过线粒体膜或者是线粒体膜通透性转换孔释放到细胞基质中，另一部分的H2O2经过谷胱甘肽过氧化物酶以及过氧化氢酶等分解为H2O（图1-2）。线粒体外膜膜间隙++CytcH++H2O2H+HHHe-QVIIIIIIIVe-H+ADP+PiATP+O2H2ONADHNAD琥珀酸延胡索酸线粒体膜通透性转换孔TCA循环ROS柠檬酸合酶SODH2O2乙酰辅酶A草酰乙酸过氧化氢酶等H2O线粒体基质线粒体内膜图1-2线粒体呼吸和抗氧化防御的示意图Fig.1-2Therespirationandantioxidantdefensesinmitochondria10 表1-1牛线粒体DNA编码的呼吸链复合酶相关亚基Table1-1ThesubunitsofbovinerespiratorycomplexesthatareencodedinmitochondrialDNA蛋白亚基ProteinSubunit复合酶I（CI）ND1复合酶I（CI）ND2复合酶I（CI）ND3复合酶I（CI）ND4L复合酶I（CI）ND4复合酶I（CI）ND5复合酶I（CI）ND6复合酶III（CIII）Cytb复合酶IV（CIV）CoxI复合酶IV（CIV）CoxII复合酶IV（CIV）CoxIIIATP合成酶（CV）ATPase-6ATP合成酶（CV）ATPase-81.4.1线粒体呼吸链复合酶研究现状1.4.1.1线粒体呼吸链复合酶Ｉ线粒体呼吸链复合酶I又称为NADH：泛醌氧化还原酶，是线粒体和许多细菌呼吸链的关键酶之一。呼吸链复合酶I通过膜将电子2H+/e-从NADH转移到泛醌（Galkin1999）。真核生物线粒体呼吸链复合酶I有35个以上的亚基，分子量约为1MDa，而最小细菌线粒体呼吸链复合酶I有14个亚基，分子量约为600kDa。在真核生物线粒体呼吸链复合酶I中发现的附加亚基被称为附属亚基或额外亚基，而与最小细菌线粒体呼吸链复合酶I相同的亚基被称为保守亚基。在过去的30年里，研究者做出巨大的努力确定不同物种线粒体呼吸链复合酶I的结构。线粒体呼吸链复合酶I是一个L型的分子结构，一个臂与线粒体内膜结合，另一个臂伸入到线粒体基质中（Böttcheretal.2002）。呼吸链复合酶I是一种较大、多亚基膜蛋白，在电子显微镜下，呼吸链复合酶I结构表现出高度的变异。部分变化可以反映呼吸链复合酶I在其功能周期中构象谱的一部分。其他的变化可能来自被洗涤剂从膜上去除时或者在电子显微镜制样过程中，造成呼吸链复合酶I结构不稳定。由于对线粒体复合酶I的功能机制缺乏了解，Bostina曾试图通过添加抑制剂或底物来稳定电子显微镜中的线粒体复合酶I，但并未尝试成功（Bostina2004）。呼吸链复合酶I是一种高度动态的酶，在电子显微镜下制备时会呈现一系列的11 构象。为了获得呼吸链复合酶I结构，必须采用可靠的方法来分离不同的构象。通过利用随机圆锥重建技术，计算具有一致结构域呼吸链复合酶I的三维重构图。通过X射线晶体结构与嗜热栖热菌Thermusthermophilus呼吸链复合酶I的亲水臂相对应，确定了已知的氧化还原辅助因子的位置：一种非共价结合的黄素单核苷酸（FMN），两个[2Fe-2S]型铁硫中心，命名为N1a和N1b，5个[4Fe-4S]型铁硫中心命名为N3，N4，N5，N6a和N6b（SazanovandHinchliffe2006）。另一个命名为N7的[4Fe-4S]型铁硫中心仅存在于某些细菌中（Nakamaru-Ogisoetal.2005）。该结构支持这样的观点，即除了N1a和N7外，它们形成了一条途径，使电子从位于亲水臂末端的NADH结合位点转移到位于亲水臂和膜臂界面的一个或多个Q位点。在这条途径上，铁硫中心N4，N5和N6a的顺序目前正在探讨中（Yakovlevetal.2007;OhnishiandNakamaru-Ogiso2008），铁硫中心N1a接近FMN，但与主电子转移途径分离（IngledewandOhnishi1980）。呼吸链复合酶I由水溶性和膜结构域组成，前者含有FMN和8~9个铁硫中心，后者未发现氧化还原中心。目前，通过膜的质子转移与内部电子转移的耦合机制仍不清楚。在科学研究中通常将鱼藤酮作为呼吸链复合酶I的抑制剂。1.4.1.2线粒体呼吸链复合酶II线粒体呼吸链复合酶II又称为琥珀酸：泛醌氧化还原酶，是一个完整的膜蛋白复合酶，是三羧酸循环中催化琥珀酸盐氧化生成延胡索酸盐的关键膜复合物。在酵母中，线粒体呼吸复合酶II有四个亚基：两种亲水性蛋白质（铁硫蛋白，IP）和黄素蛋白（FP），以及两种跨膜蛋白（CybS和CybL）。琥珀酸盐氧化是将线粒体内膜上的泛醌还原成泛醇，作为呼吸电子传递链一部分，电子通过黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）从琥珀酸转移到泛醌。[2Fe2S]、[4Fe4S]和血红素组成了呼吸链复合酶II的主要部分（Hägerhäll1997）。琥珀酸：泛醌氧化还原酶通常由可溶性催化二聚体和完整的膜区组成，可溶性催化二聚体由亚基A与共价结合的FAD辅助因子和亚基B组成，亚基B含有三个铁硫中心，即[2Fe2S]、[4Fe4S]和[3Fe4S]（Hägerhäll1997）。将复合酶II锚定在内膜上的整体膜区包含一个或两个带有或不含血红素基团的疏水肽。琥珀酸酯：泛醌氧化还原酶根据其疏水亚基和血红素基的数量可分为五种类型（A-E）；线粒体琥珀酸酯：泛醌氧化还原酶属C型，含有一个血红素分子和两个跨膜蛋白：大细胞色素b结合蛋白（CybL或亚基C）和小细胞色素b结合蛋白（CybS或亚基D）（Lemosetal.2002）。Iverson等曾报道，只有原核生物琥珀酸：泛醌氧化还原酶的结构（类型B，D和C），与线粒体琥珀酸：泛醌氧化还原酶具有相似的酶功能（Iversonetal.1999;Yankovskayaetal.2003）。目前，仍在深入研究呼吸链复合酶II还原泛醌的机理以及呼吸链复合酶II与复合酶Ⅲ之间泛醌过渡的过程。1.4.1.3线粒体呼吸链复合酶III线粒体呼吸链复合酶III又称为细胞色素bc1复合体（泛醌-细胞色素c氧化还原酶），在生物体内以二聚体的形式存在，是线粒体和许多原核生物能量守恒电子传递链中一种12 完整的膜蛋白，有三个功能亚基主要负责电子的传递即细胞色素b，铁硫蛋白（ISP）和细胞色素c1亚基，其中细胞色素b亚基由线粒体DNA编码，细胞色素b亚基中含有两个b型血红素（bL/b566和bH/b562）（AndandGennis1994）。呼吸链复合酶III催化电子从泛醌转移到水溶性细胞色素c，这种电子转移与两个质子在氧化后线粒体膜上的转移相耦合。该复合酶中Q循环机制是一种定量解释质子与电子转运的机理，每两个电子从泛醌转移到细胞色素c，同时，四个质子从线粒体基质中转移到带正电荷膜的一侧（Trumpower1990）。电子在醌的氧化位点（Qo）发生了一个分叉电子转移反应，即第一个电子从Qo位点转移到铁硫蛋白，然后转移到细胞色素c1，从细胞色素c1转移到细胞色素c如图1-3。醌在Qo位点发生氧化时形成一个中间产物，半醌；第二电子从Qo位点转移到细胞色素b的血红素bL（b-566），然后转移到血红素bH（b-562），最后在醌的Qi位点，醌被还原为氢醌（QH2），氢醌再次进入醌的氧化位点Qo，这样不断的进行循环，就是Q的循环机制。因此，在Qo和Qi位点均有不同的抑制剂，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂等为Qo抑制剂，抗霉素A等为Qi抑制剂（Kotiahoetal.2008;Bartlettetal.2002）。4H+Cytc线粒体膜间隙e-++++++++Cytc1e-内膜ISPe-Qo-siteQoe-b-566Qe-QH2b-562e-Qi-siteQi--------Cytb线粒体基质2H+图1-3线粒体呼吸链复合体III电子传递示意图Fig.1-3ThetransmissionofelectroninmitochondrialrespiratorychaincomplexIII铁硫蛋白即为含有铁硫簇的蛋白，铁硫簇是存在于生物体中最古老、最普遍的物质之一，是一类具有重要生物功能的金属酶，最主要作用是呼吸链电子的传递，还包括细胞信号传导、维持酶结构、基因表达与调控以及催化作用等。在线粒体呼吸链中复合酶I、II和III中均含有铁硫中心，复合酶I中含有8-9个铁硫中心，复合酶II中含有3个铁硫中心，复合酶III中含有1个铁硫中心，铁硫蛋白亚基活性中心是含有一个或者多个铁硫簇，而不是血红素。X射线晶体学研究表明，线粒体呼吸链复合酶III中铁硫蛋13 白的构象取决于晶体形态和结构以及Qo位点是否有抑制剂存在（Iwataetal.1998;Kimetal.1998）。复合酶III晶体结构表明，在不同抑制剂存在和不存在的情况下，铁硫蛋白外部结构域在配合物中呈现两种构象。在牛P6522晶体中，铁硫蛋白亚基是一个[2Fe2S]结构，靠近细胞色素c1，称为c1状态。然而，当标桩菌素存在的情况下，铁硫蛋白亚基靠近细胞色素b的血红素bL，称为b状态（图1-4）。标桩菌素为呼吸链复合体IIIQo位点的抑制剂（Zhangetal.1998;Hunteetal.2000）。在电子传递的基础上，研究者曾提出了一种适用于呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基的移动穿梭机制。铁硫蛋白最初在b状态，QHo2在Qo位点把电子转移给氧化中心的[2Fe2S]。铁硫蛋白紧接着旋转57到c1状态，并将[2Fe2S]还原把电子转移到细胞色素c1（Iwataetal.1998;Zhangetal.1998）。这种移动穿梭机制得到了交联和突变研究的支持，该研究使铁硫蛋白固定或改变了颈部的构象（Xiaetal.1997;Xiaoetal.2000;DarrouzetandDaldal2002）。这两种铁硫蛋白构象与泛醌类似物抑制剂的三种结合位置，都符合Q循环电子转移与质子转移机制。因此，研究者认为细胞色素bc1复合物中电子转移机制需要一个与铁硫蛋白运动有关的剧烈构象变化（Zhangetal.1998）。图1-4在整个二聚体中Rieske蛋白的两个构象。（引自Zhangetal.1998）Figure1-4TwoconformationsoftheRieskeproteinshowninthecontextoftheentiredimmer.1.4.1.4线粒体呼吸链复合酶IV线粒体呼吸链复合酶IV又称为细胞色素c氧化酶（COX），是线粒体电子传递链末端复合酶，能消耗有机体超过90%的氧气。呼吸链复合酶IV属于铜-血红素氧化酶家族，整个催化循环均参与质子的转运，其中每泵出膜间隙两个质子需要传递两个电子。哺乳动物呼吸链复合酶IV由13个亚基组成，其中亚基CoxI，CoxII和CoxIII位于催化核14 心，且由线粒体DNA编码（Tsukiharaetal.1996）。呼吸链复合酶IV在维持细胞内稳态和健康方面起着关键作用。研究表明，缺乏COX可以引起严重疾病，如亚急性坏死性脑病（Lombesetal.1991;Adamsetal.1997），线粒体肌病等（Wadaetal.1996）。此外，基因SCO2（合成细胞色素c氧化酶2）突变，导致致命性婴儿心脑肌病（Papadopoulouetal.1999）。心肌和骨骼肌线粒体具有独特的特性，通过复合酶IV调节呼吸（Rossignoletal.1999）。在正常生理条件下，呼吸链复合酶I、III和IV形成不同的超复合体，使底物之间的距离缩小，更有利于电子快速传递（Genovaetal.2003）。超复合体的另一个主要功能是增加呼吸链复合酶I、III和IV的稳定性和协助组装性（Schäggeretal.2004）。在一些线粒体呼吸链功能障碍的患者中，缺乏完全组装的复合酶III会导致复合酶I不稳定，表明呼吸链复合酶在超复合结构中存在对稳定性及其重要性（Acı́n-Pérezetal.2004）。1.4.1.5线粒体呼吸链复合酶V线粒体呼吸链复合酶V又称为ATP合酶或FoF1-ATP合酶，是细胞里一台出色的旋转发动机，把细胞中二磷酸腺苷和无机磷酸盐合成ATP的过程。呼吸链复合酶V是线粒体中必不可少的一种酶，在ATP产生和线粒体膜电位维持中起着重要作用（Zhouetal.2015）。ATP合酶由位于线粒体基质中的亲水催化单元F1和膜结构域Fo组成，后者锚定在线粒体内膜上，介导间接参与ATP合成的质子传导（Fillingame1999;Pedersenetal.2000）。Boyer曾说，“所有的酶都很漂亮，但ATP合成酶是最美丽的，也是最不寻常和最重要的酶之一”（Boyer1997）。ATP合酶可以被认为是由两个发电机组成的复合物—ATP驱动的F1发电机和质子驱动的Fo发电机，它们在相反方向旋转。ATP合酶合成ATP的能量来源于质子跨膜电化学势梯度（Mitchell1961）。呼吸链复合酶V合成的ATP支持几乎所有需要能量的细胞活动。ATP合成酶是地球上最普遍，最丰富的蛋白质之一，其合成ATP是生物界最普遍的化学反应。从大肠杆菌E.coli到植物和哺乳动物中，该酶是进化过程中最保守的酶之一（Kanazawaetal.1981;Walkeretal.1985;Hudsonetal.1987）。线粒体呼吸链复合酶V利用自身亚基的物理旋转作为催化形成ATP，这是一种新机制，不同于任何已知的酶。ATP合酶是一种结构复杂的大蛋白复合物(~500kDa)，其主要部分由~3500个氨基酸组成的微型发动机（Abrahamsetal.1994）。研究表明，ATP合酶参与线粒体嵴形态的形成，为了增加线粒体合成ATP的能力，线粒体内膜折叠形成嵴。1.4.2线粒体活性氧的产生线粒体除了具有形成ATP的“经典”功能外，还在细胞凋亡、活性氮（RNS）和活性氧（ROS）生成、电信号传导和钙稳态等方面发挥着重要作用（Duchenetal.2008;Willemsetal.2008）。在大多数细胞中，线粒体是活性氧的主要来源，这是氧化磷酸化过程中的分子氧的不完全还原生成。ROS包括羟基自由基（•OH）、超氧阴离子（O●−2），以及原15 子分子如单线态氧（1O2）和过氧化氢（H2O2），虽然低浓度的ROS起着有益作用，但线粒体中活性氧的过度生成与病理条件有关（Sharmaetal.2012;Muñozetal.2015）。线粒体呼吸链产生的低浓度活性氧、氮物种以及其他来源的ROS和RNS通过氧化特定蛋白质上巯基作为氧化还原信号。并不是所有蛋白质的巯基都参与该过程，因为在生理浓度下，大多数蛋白质巯基与ROS和RNS没有明显的反应（WinterbournandHampton2008）。只有特定蛋白质巯基被认为能与ROS发生发应，多为那些可接触到的和低磷酸化靶蛋白分子上特定丝氨酸/苏氨酸的蛋白质巯基（Rhee2006）。活性氧产生与神经变性和衰老等病理改变有关，呼吸链复合酶I和III被鉴定为ROS产生的主要部位（Turrens2003）。研究表明，呼吸链复合酶I主要在线粒体基质中产生ROS（MiwaandBrand2003）。呼吸链复合酶III在线粒体内膜的两侧均产生ROS（Mulleretal.2004）。线粒体呼吸链复合酶III在抑制剂存在的条件下（如：抗霉素A和甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂等），在线粒体内产生大量ROS，而复合酶I在电子传递受阻的条件下以高速率产生ROS。多年来，呼吸链复合酶I电子传递链中的主要辅因子都被认为是ROS产生的场所如：黄素单核苷酸（GalkinandBrandt2005;KussmaulandHirst2006）、铁硫簇N2和N1a（Genovaetal.2001;Kushnarevaetal.2002），以及在泛醌还原过程中形成的半醌自由基（LambertandBrand2004）。同样的也有研究表明，ROS的主要来源是线粒体复合酶III中的泛醌氧化位点（Boverisetal.1976）。正常生理条件下的ROS可以促进细胞增殖和分化（Trachoothametal.2009），而过量ROS可以导致细胞中的脂质，蛋白质和DNA氧化损伤（Perryetal.2000）。因此，平衡ROS产生与消除对正常细胞的生长和存活至关重要。1.5呼吸链复合酶III抑制剂研究进展呼吸链复合酶III的抑制剂主要分为两大类，I类为Qo位点抑制剂如甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，II类为Qi位点抑制剂如抗霉素A。Qo位点抑制剂根据对细胞色素b亚基中bL血红素和铁硫蛋白亚基（ISP）的影响，进一步将其分为三个亚类（JagowandLink1986）。Ia类：只作用于bL血红素。Ib类：引起ISP的电子顺磁共振光谱变化如5-十一基-6-羟基-4，7-二氧苯并噻唑。Ic类：既作用于bL血红素，又作用于ISP如标桩菌素。此外，Ib和Ic类抑制剂常常导致ISP的氧化还原电位升高，在不同构像的晶体结构中，观察到ISP可溶结构域的多种取向和位置（Xiaetal.1997;Zhangetal.1998;Iwataetal.1998）。Qo位点抑制剂存在的情况下，ISP可溶结构域至少有两种构像，即固定和松散状态（Kimetal.1998;Brugnaetal.2000）。在固定状态下，ISP的[2Fe-2S]与细胞色素b紧密结合，非常接近Qo位点。在松散状态下，ISP并没有处在细胞色素c1和细胞色素b之间的特定位置。Ib和Ic类抑制剂的结合有利于ISP处于固定状态下，而Ia类抑制剂的结合促进了ISP处于松散状态。目前，关于ISP移动穿梭机制仍不清楚。16 1.5.1Qi位点抑制剂研究进展目前，已知的作用于Qi位点的抑制剂较少，主要有抗霉素A。抗霉素A（AntimycinA）是线粒体呼吸链复合酶III的抑制剂，结合于细胞色素b亚基Qi位点，因此，几乎对所有生物的呼吸链均有抑制作用，该活性物质是呼吸链不可逆抑制剂（Schillingetal.1970）。抗霉素A（图1-5）是一类具有大环二内酯结构的天然产物，该类化合物首次发现在1948年，Leben等在美国威斯康星大学发现一株链霉菌并且能抑制苹果黑星病菌，接着从其发酵液中提取得到一种活性物质，发现它对大多数的真菌及部分细菌有抑制作用。当时，并没有分离得到纯化合物，但由于其活性较高，将其中有生物活性的物质称为Antimycin（LebenandKeitt1950;杨永青和伍贻康2006）。一年后，Dunshee等从活性物质中分离纯化出一种化合物，命名为AntimycinA（Dunsheeetal.1949）。随着，又连续的分离出AntimycinA1-A4化合物（Rieske1967）。AntimycinsA5-A6于1970年，Berti等研究发现（Schillingetal.1970）。AntimycinsA7和A8是Barrow等在1997年研究发现（Barrowetal.2010）。随后，陆续的研究发现了AntimycinsA9，A10-A17（Shiomietal.2005;Hosotanietal.2005）。AntimycinA18由孙承航课题组于2010年分离得到（Yanetal.2010）。直到2010年，Zheng等利用高效反向色谱仪从产生AntimycinA发酵液中纯化得到8种成分，分别为AntimycinA1-A3，A8（Wangetal.2010）。迄今为止，AntimycinA类化合物已被发现达46种如AntimycinsA1-A8，A10（均含两个成分），AntimycinsA9，A11-A20（均含单组分）（闫蕾蕾等2011;LebenandKeitt1950）。以上化合物按照发现顺序而命名的，详细信息见表1-2。值得注意的是AntimycinA混合物中最主要的成分是AntimycinA3b，文献中相关生物活性研究的大都是AntimycinA3b（杨永青和伍贻康2006）。OHOOHNNOHOR2OR1图1-5AntimycinA的结构式Fig.1-5ThestructureofantimycinA17 表1-2AntimycinA系列化合物的发现Table1-2DiscoveryofantimycinA菌株产生菌来源成分活性发现时StrainsSourceComponentActivity间YearAntimycinA及AntimycinA由Streptomycessp.—抗真菌1949A1-A4组成Streptomycessp.AntimycinsA5-A6组成，同时发现——1970AY-B-265已知成分A1-A4ATP-柠檬酸Streptomycessp.台湾南投县AntimycinsA7-A8，同时发现已知裂解酶抑制1997SC2221dandah山土样成分A1-A4活性Streptomycessp.中国云南楚雄山AntimycinA9，同时发现已知成分杀虫2005K01-0031土样A3、A4、A7Streptomycessp.日本京都和大阪AntimycinA10-A16，同时发现已SPA-10191和抗真菌2005土样知成分A1-A4SPA-8893Streptomycessp.中国新疆天山土AntimycinA17抗真菌2005GAAS7310样S．albidoflavus中国广西红树植AntimycinA18抗真菌2010I07A-01824物木榄叶S.antibioticusAntimycinA19，AntimycinA20同中国广东红树林抗真菌2011H74-18时发现A1a，A1b，A2a，A3a，A3bStreptomycessp.日本札幌市土样Deisovaleryl-blastomycin抗真菌19765140-A1Streptomycessp.海洋来源的放线UranchimycinA,UranchimycinB抗真菌1993Ni-80菌Streptomycessp.KitamycinA,KitamycinB,日本冈山土样抗真菌1999K385同时发现A1，A2a，A3，A4aStreptomycessp.海洋来源样品UranchimycinC，UranchimycinD抗真菌2006B1751和AdM21Streptomycessp.海洋来源样品KitamycinsA-J抗真菌2009CNQ431（引自程华等2017）18 1.5.2Qo位点抑制剂研究进展1.5.2.1甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的发现及现状甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂在农业防治中是一类极其重要的杀菌剂，受一种天然杀菌衍生物β-甲氧基-丙烯酸启发而发现的，是从两种担子菌附胞球果菌Strobilurustenacellus和小奥德蘑Oudemansiellamucida产生的次级代谢物中分离得到的两种化合物即嗜球果伞素A和小奥德蘑素A；而粘噻唑是从一种细菌黄褐粘球菌Myxococcusfulvus中分离得到的（图1-6）。这三种化合物对光极其敏感，易分解，后经先正达、巴斯夫等公司在其结构基础上进行一系列改造后，研发出甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。嘧菌酯和醚菌酯分别由先正达和巴斯夫研制，在1996年开始销售。到2002年市场上就有六种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂及嘧菌酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯、肟菌酯、啶氧菌酯和苯氧菌胺，杜邦，拜耳等公司也参与了该类杀菌剂的研发。OMeOMeSNOMeMeO2CMeOCOMeNS2OMe嗜球果伞素AMeO2C小奥德蘑素A粘噻唑图1-6嗜球果伞素A、小奥德蘑素A和粘噻唑结构式Fig.1-6ThestructuresofstrobilurinA,oudemansinAandmyxothiazol1.5.2.2甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗性的产生甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂通过抑制病原菌线粒体呼吸链复合酶III细胞色素b亚基上的Qo位点，阻止电子从细胞色素b到铁硫蛋白的传递，使呼吸链电子传递受阻，从而使病菌能量形成受阻，达到抑菌作用（Kunzetal.1998;Sierotzkietal.2000;Kimetal.2003）。表1-3已报道对Qo抑制剂产生抗性的植物病原菌Table1-3PathogensproducingresistancetoQoinhibitors抗性病原菌病原菌中文名称寄主地理分布ThetypeofPathogensPathogensinChinaHostDistributionresistanceAlternariaalternate,Alternariatenussima链格孢病菌阿月浑子美国G143AAlternariaarborescens马铃薯、番Alternariaalternata早疫病菌欧盟G143A茄Alternariaalternateapplepathotype黑斑病菌梨日本19 抗性病原菌病原菌中文名称寄主地理分布ThetypeofPathogensPathogensinChinaHostDistributionresistanceAlternariaalternatetangerinepathotype褐斑病菌柑橘日本Alternariamali斑点落叶病菌苹果美国G143AAlternariasolani早疫病菌马铃薯美国F129LAscochytarabiei凋萎病菌鹰嘴豆美国G143ABlumeriagraminis白粉病菌小麦、大麦欧盟G143ABipolarisspicifera叶枯病菌狗牙根日本Botrytiscinerea灰霉病菌草莓欧盟G143ABotrytissquamosa白斑叶枯病菌大蒜日本Cercosporasojina灰斑病菌大豆美国G143ACercosporabeticola褐斑病菌甜菜美国G143ACercosporazeae-maydis斑点病菌玉米日本Cercosporacassiicola褐斑轮纹病菌番茄日本Cercosporacassiicola黑枯病菌茄子、圆椒日本Cladosporiumcarpophilum疮痂病菌杏美国Colletotrichumgraminicola炭疽病菌草坪美国G143AColletotrichumcoccodes炭疽病菌马铃薯日本Colletotrichumgloeosporioides炭疽病菌苹果、草莓日本G143AColletotrichumcereal炭疽病菌栗子日本Corynesporacassiicola褐斑病菌、耙点病菌黄瓜、大豆日本、巴西G143ADidymellabryoniae蔓枯病菌瓜类美国G143AErysiphenecator白粉病菌葡萄美国、欧盟G143AFusicladosporiumcarpophilum黑星病菌杏仁日本Microdochiumnivale雪腐叶枯病菌小麦欧盟、日本G143AMicrodochiummajus赤霉病菌小麦欧盟日本G143AMoniliniafructicola褐腐病菌桃日本Monilinialaxa褐腐病菌樱桃日本中南美洲、柬Mycosphaerellafijiensis黑条叶斑病菌香蕉G143A埔寨、菲律宾Mycosphaerellagraminicola壳针孢叶斑病菌小麦欧盟G143A南美、澳大利Mycosphaerellamusicola黄条叶斑病菌香蕉G143A亚Mycovellosiellanattrassii叶霉病菌茄子日本G143A20 抗性病原菌病原菌中文名称寄主地理分布ThetypeofPathogensPathogensinChinaHostDistributionresistancePassalorafulva叶霉病菌番茄日本F129LPestalotiopsislongiseta轮斑病菌茶日本Phaeosphaerianodorum颖枯病菌小麦欧盟G143AG143A和Plasmoparaviticola霜霉病菌葡萄欧盟F129LPodosphaeraxanthii白粉病菌瓜类日本Podosphaeraleucotricha白粉病菌苹果日本Pseudoperonosporacubensis霜霉病菌瓜类欧盟、亚洲G143APucciniahoriana白色锈病病菌菊花日本Pyrenophorateres网斑病菌大麦欧盟F129LG143A、Pyrenophoratritici-repentis黄斑病菌小麦欧盟F129L和G137RG143A和Pyriculariagrisea灰斑病菌草坪美国F129LPyriculariaoryzae稻瘟病菌水稻日本G143APythiumaphanidermatum腐霉枯萎病菌草坪美国F129LRamulariaareola灰霉病菌棉花巴西Ramulariacollo-cygni柱隔孢叶斑病大麦欧盟G143ARhynchosporiumsecalis云纹病菌大麦欧盟G143ARhizoctoniasolaniAG1.1A纹枯病菌水稻美国F129LSphaerothecafuligine白粉病菌瓜类欧盟、亚洲G143ASphaerothecaaphanisvar.aphanis白粉病菌草莓日本Stemphyliumvesicarium褐斑病菌芦笋、梨欧盟G143AVenturiainaequalis黑星病菌苹果欧盟G143AVenturiapirina黑星病菌梨美国G143A（引自何秀玲和张一宾2013）目前，部分植物病原菌如稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）、小麦壳针孢（Septoriatritici）、灰霉病菌（B.cinerea）和苹果黑星菌（Venturiainaequalis）通过诱导线粒体旁路氧化酶途径来对该类杀菌剂表现出抗性，表明线粒体呼吸链电子传递具有交替氧化酶途径，其ATP合成是通过规避线粒体呼吸链复合酶III来维持（Jinetal.2009）。虽然，交替氧化酶途径在离体条件下发挥重要作用，但并没有降低甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂田21 间的有效性（Kimetal.2003）。Olaya和Mizutani认为植物抗氧剂，如宿主中的黄酮，使活性氧在Qo抑制作用中达到足以诱导交替氧化酶途径（Mizutanietal.1996;OlayaandKoller1999）。植物病原菌对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂产生抗性的主要原因是呼吸链复合酶III细胞色素b发生了点突变。Qo抑制剂产生抗性的突变菌株首次在谷类中发现，1998年在德国北部发现了抗Qo抑制剂的禾本科白粉病菌（Erysiphegraminis）。从那时起，Qo抑制剂的抗药性逐渐在其他病原菌中被检测到，由点突变而产生的耐药性，通过定量聚合酶链反应（Q-PCR）方法来检测（Willeetal.2002）。1999年，首次观察到大麦白粉病对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂产生抗性，到2001年在欧洲部分地区可以检测到耐Qo杀菌剂的大麦白粉病。1999年，意大利和法国的三个试验场首次发现了葡萄霜霉病的Qo抑制剂抗性（Gisietal.2000;Heaneyetal.2000）。对大多数抗Qo抑制剂的病原菌来说，产生抗药性的主要原因是呼吸链复合酶III细胞色素b蛋白143位甘氨酸突变为丙氨酸（G143A）。在小麦白粉病菌（E.graminis）、葡萄霜霉病菌（Plasmoparaviticola）、黄瓜霜霉病菌（Pseudoperonosporacubensis）、黑叶条纹病菌（Mycosphaerellafijiensis）、黄瓜白粉病菌（Sphaerothecafuliginea）以及蔓枯病菌（Didymellabryoniae）等抗Qo抑制剂的菌株中均发现了这一位点突变（Heaneyetal.2000;Sierotzkietal.2000;2015）。病原菌的G143A突变是Qo类杀菌剂产生高抗性的主要原因（Gisietal.2000）。第二个靶位点突变，即在复合酶III细胞色素b的129位亮氨酸取代苯丙氨酸（F129L），在一株降低Qo抑制剂敏感性的瓜果腐霉（Pythiumaphanidermatum）中已鉴定出（Bartlettetal.2002）。表1-3中列出了对Qo抑制剂产生抗性的植物病原真菌，可以发现病原菌的抗性类型主要为G143A，而F129L和G137R则较少。1.6问题的提出及论文设计思路天名精内酯酮是卡拉布烷型倍半萜内酯类化合物，广泛分布于菊科天名精属植物及其相近属植物中。西北农林科技大学无公害农药研究服务中心对天名精内酯酮进行大量的研究，发现天名精内酯酮具有良好的内吸传导性，对多种病原菌菌丝生长和孢子萌发均有较强的抑制作用。同时，通过活体盆栽试验，发现该化合物对小麦全蚀病、小麦白粉病、黄瓜炭疽病等具有较好的保护和治疗效果，且经过亚细胞定位等研究表明天名精内酯酮在供试菌株中作用的细胞器为线粒体，但其抑菌机制尚不清楚。目前，天名精内酯酮抑菌机制方面仍存在以下问题：（1）天名精内酯酮作用的细胞器为线粒体且对生物氧化有显著抑制作用，但其抑制成因还需进一步明确。（2）对于天名精内酯酮的作用靶标，目前还尚不清楚。基于此，本文将从以下几个方面开展研究工作：（1）明确天名精内酯酮与水杨肟酸对供试菌株呼吸链的增效作用。（2）明确天名精内酯酮对供试菌株呼吸链复合酶活性及其相关基因mRNA表达水22 平的影响。（3）采用RNAi和过表达技术对疑似靶蛋白的功能亚基基因进行沉默和过表达并获得突变菌株，对突变菌株与小麦全蚀病菌野生型菌株以及天名精内酯酮抗性菌株进行生理生化指标测定。（4）利用同源模建对疑似靶蛋白的功能亚基进行三维结构模建，并通过分子对接手段对天名精内酯酮与模建的三维结构进行对接，预测其可能结合的氨基酸位点。技术路线如下图：天名精内酯酮SHAM处理小麦全蚀病菌线粒体呼吸链酶活测定RT-PCR分析小麦全蚀病菌原生质体产生条件优化疑似靶蛋白遗传转化体功能亚基功能基因系的建立沉默过表达同源模建与药剂对突变菌株分子对接生化指标分析推测抑菌机理图1-7本论文的研究路线图Fig.1-7RoadmapforResearchofthisthesis23 第二章天名精内酯酮对小麦全蚀病菌呼吸链复合酶的影响课题组前期研究发现天名精内酯酮对小麦全蚀病菌生物氧化有显著影响，天名精内酯酮处理小麦全蚀病菌后，线粒体出现肿胀、空泡化等现象（王艳梅2009）。通过荧光示踪法、免疫荧光法以及免疫胶体金亚细胞定位发现天名精内酯酮作用的亚细胞器为线粒体（Wangetal.2018）。基于前期研究的基础上，本章节首先测定天名精内酯酮与SHAM的增效作用。其次，测定天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体呼吸链复合酶活性的影响，以及通过实时荧光定量PCR分析小麦全蚀病菌线粒体呼吸链复合酶相关亚基基因的mRNA表达水平。2.1材料方法2.1.1供试材料2.1.1.1供试菌株供试病原菌小麦全蚀病菌（Gaeumannomycestritici），（NumberACCC30310）从中国农业微生物菌种保藏管理中心购买（ACCC,Beijing,China,www.accc.org.cn/search/accc/show.asp?jzbc=30310）。小麦全蚀病菌的序列号可以在NCBI数据库中找到GgNus（XM_009229226），GgSdcb（XM_009223877），GgCyc（XM_009221216），GgCyo（XM_009231707），GgAsa（XM_009227181），GgCis（XM_009230870），18SrRNA（U08320）。小麦全蚀病菌使用前，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中室温下生长5-7天。小麦全蚀病菌大量菌丝体在马铃薯葡萄糖液体培养基中进行发酵，在室温摇床175rpm培养5天后收集菌丝体。菌株在30%甘油溶液中-80℃冷冻保存。2.1.1.2供试样品供试药剂天名精内酯酮（纯度>98%）由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供。氰化钾（KCN）由西北农林科技大学植物保护学院张雅林教授惠赠。氧化型细胞色素c来源于马心、水杨肟酸（SHAM）、癸基泛醌、抗霉素A、鱼藤酮、丙酮酸激酶、草酰乙酸、乳酸脱氢酶、寡霉素、NADH、2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）、乙酰CoA（锂盐）、ATP（二钠）、琥珀酸、磷烯醇丙酮酸（单钾盐）等试剂均购自Sigma。无水乙醇、蔗糖、HEPES、EDTA、EGTA、Tris、吐温20、连二亚硫酸钠、硼氢化钾等试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。葡萄糖、琼脂、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠、氯化钙等均购自杨凌天成化玻站。总RNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）、cDNA反转录试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）、实时荧光定量PCR（宝生物工程（大连）有限公司）。本试验中所用到的缓冲液的配置见附录一。24 2.1.1.3培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）：200g土豆，20g葡萄糖，17g琼脂，1000mL蒸馏水，120℃灭菌20min。马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB培养基）：200g土豆，20g葡萄糖，1000mL蒸馏水，120℃灭菌20min。2.1.2主要仪器及设备仪器设备：酶标仪（SpectraMaxplus384，MolecularDevices,美国）、Q6荧光定量PCR（QuantStudio6Flex，LifeTechnologies，新加坡）、细胞破碎仪（宁波科学生物科技有限公司）、超纯水器、高压灭菌锅、无菌超净工作台、冰箱、烘箱、分析天平、100mL烧杯、250mL烧杯、100mL量筒、300mL三角瓶、1000mL容量瓶、96孔酶标板、移液枪等。2.1.3试验方法2.1.3.1水杨肟酸的增效作用参考文献Sunetal.（1960）方法，略作修改。分别将天名精内酯酮和SHAM配成母液，溶剂的浓度从未超过测试溶液的1%。通过试验发现溶剂浓度不影响小麦全蚀病菌生长期的各个阶段。相同浓度的溶剂作为对照。当PDA冷却到约50℃，将母液稀释为所需要的浓度和PDA混匀后倒入灭菌的培养皿中，使最终培养基中天名精内酯酮浓度为9.375、18.75、37.5、75、150μg/mL，SHAM的浓度为80、120、160、200、240μg/mL，天名精内酯酮+SHAM（1:3）的浓度为20、40、60、80、100μg/mL。待含药平板冷却凝固后，在已生长7天的小麦全蚀病菌边缘，用打孔器切取直径为5mm的菌饼，并转接至含药平板的正中心。每浓度3个重复，整个试验重复3次。接菌后的平板于25℃培养5d，当对照菌落直径大于平板直径2/3以上。采用十字交叉法，从两个垂直方向测量菌落直径，并扣除菌饼的5mm直径。对每个浓度的菌丝生长校正抑制率与浓度对数进行线性回归，求得回归方程，并进行EC50以及共毒系数的计算。菌落生长直径（mm）=测量直径（mm）-打孔器直径（mm）2-1-1对照直径-处理直径抑制率(%)=×1002-1-2对照直径混合物的实际毒力指数共毒系数=×1002-1-3混合物的理论毒力指数当共毒系数（CTC）>120，有显著的增效作用；当CTC<80，有拮抗作用；当8098%）由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供。质粒Psilent-1（含有潮霉素磷酸转移酶基因hph），由西北农林科技大学许金荣老师实验室惠赠。3.1.2供试设备及试剂主要设备：高速低温离心机、whatman滤纸、microcloth滤膜、杂交炉、杂交管、玻璃三角瓶（250mL）、电子天平（万分之一克）、移液枪（10、20、100、200、1000μL德国Eppendorf公司）、UV-9100分光光度计（LabTech）等。主要试剂：潮霉素B购买于Biotopped；裂解酶（L），崩溃酶（D）购买于Sigma-Aldrich（USA）；蜗牛酶（S）和氨苄青霉素（Amp）购买于北京索莱宝科技有限公司；PrimeSTARMax（宝生物工程（大连）有限公司），TIANquickMidiPurificationkit（天根生化科技42 （北京）有限公司），PlantGenomicDNAKit（康为世纪生物科技有限公司），DIG-HighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI（DIG试剂盒）购于罗氏诊断产品有限公司（Roche）。3.1.3试验方法3.1.3.1培养基及主要溶液配方1、PDA培养基（见第二章）2、PDB液体培养基见（第二章）3、燕麦液体培养基（OB）燕麦片100g纯水1L沸水浴30分钟后用纱布过滤收集液体，补水到2L，121℃高压灭菌30min后室温保存。4、5×YEG液体培养基YeastExtract5gTryptone5g葡萄糖10g补纯水到1L121℃高压灭菌20min后室温保存。5、CM液体培养基葡萄糖10gPeptone2gYeastExtract1gAcidhydrolyzedcasein1gNaNO36gKCl0.5gMgSO4•7H2O1gKH2PO41.5g补纯水到1L121℃高压灭菌20min后室温保存。6、1M山梨醇山梨醇182.17g补纯水到1L121℃高压灭菌20min后室温保存。7、菌丝体裂解液43 Lysingenzyme200mg1M山梨醇40mL振荡摇匀后，过滤除菌。8、0.5MTris-Cl（pH8.0）Tris30.25g纯水400mL先加入8mL浓盐酸，待溶液冷却到室温后再缓慢加入浓盐酸直到pH值为8.0，加水定容到500mL并121℃高压灭菌20min后室温保存。9、STCbufferSucrose200g0.5MTris-Cl（pH8.0）100mLCaCl25.55g补纯水到1L121℃高压灭菌20min后4℃保存。10、40%PTCPEG800040g补STC到100mL在65℃水浴锅中加速溶解，121℃高压灭菌20min后4℃保存。11、TB3液体培养基YeastExtract3gAcidhydrolyzedcasein3gSucrose200g补纯水到1L121℃高压灭菌20min后4℃保存。12、BottomAgar和TopAgar培养基YeastExtract3gAcidhydrolyzedcasein3gSucrose200g琼脂10g/15g补纯水到1LBottomAgar和TopAgar加入琼脂分别为10g/L和15g/L，121℃高压灭菌20min后室温保存。13、0.5MEDTA（pH8.0）EDTANa2·2H2O93.06g纯水400mL44 NaOH10g用NaOH溶液调节pH值为8.0，补纯水到500mL，121℃高压灭菌20min后室温保存。14、50×TAEbufferTris242g冰醋酸51.1mL0.5MEDTA（pH8.0）100mL121℃高压灭菌20min，将50×TAE稀释50倍后使用。15、Amp（100mg/mL）Amp500mg补蒸馏水至5mL溶解完全后用细菌过滤器除菌，保存于4℃。3.1.3.2潮霉素磷酸转移酶基因（HPH）扩增潮霉素磷酸转移酶基因（hph）片段长为1790bp，包含启动子区域从质粒pSilent-1中扩增得到（Nakayashikietal.2005;Chenetal.2015;TetoryaandRajam2017）。PCR扩增hph片段（1790bp），以质粒pSilent-1为模板用引物HygbF和HygbR（引物见表3-1）扩增潮霉素抗性基因（hph）片段（包含启动子），并用PCR产物回收试剂盒TIANquickMidiPurificationkit进行回收。PCR体系（25μL）单位μLPrimeSTARMax12.5RNasefreedH2O10引物HygbF（10μM）0.75引物HygbR（10μM）0.75DNA模板1PCR程序95℃3min98℃10s55℃5s32cycles72℃2min72℃5min16℃forever45 表3-1本章节中使用到的引物Table3-1Oligonucleotideprimersusedinthisstudy引物序列（5’-3’）备注Sequence(5'-3')PrimerUseHygbFTAACCGTATTACCGCCTTTG扩增hph片段（1790bp）HygbRTCGGCATCTACTCTATTCCTTTYzbFGTCCTGCGGGTAAATAGC验证hph片段是否成功转入（592YzbRGCTCCATACAAGCCAACCbp）表注：F，正向引物；R：反向引物Note:F,forwardprimer;R,reverseprimer3.1.3.3原生质体的制备（1）小麦全蚀病菌在PDA培养基中生长5-7天后，用灭菌的蒸馏水收集菌丝体并转接到50mLPDB液体培养基中175rpm25（±1）℃培养2d。（2）加入50mLCM培养基，175rpm25（±1）℃继续培养2d。（3）用滤布过滤收集菌丝体并用1M山梨醇冲洗菌丝体2-3次。然后将菌丝体与菌丝体裂解液混匀，30℃90rpm裂解2h。（4）用一层滤布和两层擦镜纸过滤原生质体，并将滤液5000rpm离心5min。（5）倒掉上清液，用20mLSTC悬浮原生质体，将悬浮液5000rpm离心5min。（6）倒掉上清液，将原生质体用2mLSTC重新悬浮，然后放置于冰上。（7）最后，通过显微镜观察并采用血球计数板将原生质体稀释为107原生质体/mL。3.1.3.4培养基对原生质体的影响小麦全蚀病菌在PDA培养基中生长5-7天后，用灭菌的蒸馏水收集菌丝体并分别转接到50mLPDB，OB和5×YEG液体培养基中，在摇床175rpm25（±1）℃培养2d，分别加入50mLCM培养基，175rpm25（±1）℃继续培养2d。其余步骤和上面原生质体制备3.1.3.3的步骤一致。3.1.3.5消化温度对原生质体制备的影响小麦全蚀病菌在PDA培养基中生长5-7天后，用灭菌的蒸馏水收集菌丝体并分别转接到50mLOB液体培养基中，在摇床175rpm25（±1）℃培养2d，加入50mLCM培养基，175rpm25（±1）℃继续培养2d。收集小麦全蚀病菌菌丝体，分别在26、28、30、32和34℃下进行酶解，释放原生质体，其余步骤和上面原生质体制备3.1.3.3的步骤一致。3.1.3.6酶对原生质体制备的影响小麦全蚀病菌在OB培养液中进行培养，并收集菌丝体。分别用不同的酶和不同组合的酶0.25%L、0.25%D、0.25%S、0.25%L+0.25%D、0.25%L+0.25%S、0.25%D+0.25%S和0.25%L+0.25%D+0.25%S裂解小麦全蚀病菌菌丝体，30℃90rpm裂解2h，其余步46 骤和上面原生质体制备3.1.3.3的步骤一致。3.1.3.7酶消化时间对原生质体制备的影响采用0.5%裂解酶裂解小麦全蚀病菌菌丝体，30℃90rpm分别裂解1、1.5、2、2.5和3h，其余步骤和上面原生质体制备3.1.3.3的步骤一致。3.1.3.8菌丝体的重量对原生质体制备的影响采用0.5%裂解酶裂解小麦全蚀病菌菌丝体，30℃90rpm裂解2h，分别测定不同重量菌丝体0.01、0.02、0.03、0.035、0.04、0.05和0.06克/毫升对原生质体制备的影响，其余步骤和上面原生质体制备3.1.3.3的步骤一致。3.1.3.9转速对原生质体制备的影响小麦全蚀病菌在OB培养液中进行培养，并收集菌丝体。裂解酶在30℃的条件下，分别在不同转速30、60、90、120和150rpm，裂解菌丝体，释放原生质体。同时，测定转速对原生质体活性的影响（Jiaetal.2016），其余步骤和上面原生质体制备3.1.3.3的步骤一致。3.1.3.10不同酶浓度对原生质体制备的影响酶是制备高效原生质体的关键因素，通过上述试验选择出裂解酶（L）能较好的酶解小麦全蚀病菌菌丝体。因此，通过试验设计一系列裂解酶的浓度0.125%、0.25%、0.5%、1%和2%裂解菌丝体，30℃90rpm裂解2h，其余步骤和上面原生质体制备3.1.3.3的步骤一致。3.1.3.11响应面（RSM）试验设计在多因素数量处理试验的分析中，可以分析试验指标（因变量）与多个试验因素（自变量）间的回归关系，这种回归可能是曲线或曲面的关系，因而称为响应面分析。根据上述一系列单因素试验结果，三个主要的因子温度（X1），酶解时间（X2）和裂解酶浓度（X3）被选择为单独的变量。表3-2为三个变量在试验设计中的因素和水平。为了选出小麦全蚀病菌原生质体制备过程中最佳的酶解温度、酶解时间以及裂解酶浓度，根据软件DesignExpertversion8.05一共设计15组试验，包括三个中心点（试验号4、11和12）（表3-3）。表3-2试验设计中的因素和水平Table3-2Factorsandtheirlevelsinfullfactorialdesign水平因素变量SelectedlevelsFactorsVariables-101温度（℃）X1283032酶解时间（h）X222.53裂解酶浓度（%）X30.51247 表3-3Box-Behnken试验设计以及实验值和预测值Table3-3ExperimentaldesignbyusingBox-Behnkendesign,experimentalvalueandpredictedvalue试验因素水平实际试验值试验预测值ExperimentalvaluePredictedvalue残值号X1X2X3ResidualRun(107protoplasts/mL)a(107protoplasts/mL)10-1-18.058.07-0.022-10-15.695.77-0.0831-109.149.41-0.2740009.339.37-0.04510-18.217.930.2861018.698.590.107-1-105.975.850.128-1015.435.71-0.2890-118.768.570.19101108.028.13-0.11110009.239.37-0.14120009.569.370.191301-17.848.03-0.19140118.158.130.0215-1106.926.650.27标注：a表中的数据为三次试验平均值。其他条件：不同浓度的裂解酶裂解0.035g小麦全蚀病菌菌丝体，转速为90rpm，小麦全蚀病菌菌丝体从OB培养基中获得。aDatainthetablewereaverageofthreereplicates.Theotherconditions:differentconcentrationsoflysingenzymetodigest0.035gmyceliain90rpm,themyceliaofG.triticiwereculturedinOBmedium.3.1.3.12转化取200µL制备好的原生质体于50mL离心管中，加入10µgDNA（潮霉素磷酸转移酶基因片段，hph），轻轻混合后，在室温下孵育温20min。然后加入1.25mL40%PTC（过滤除菌），轻轻混合，在室温下孵育20min。加入10mLTB3（50µg/mLAmp），摇床（100rpm）25（±1）℃培养12h，5000rpm离心5min。弃去上清液，用200µLSTC悬浮原生质体。然后加入10mLBottomagar（50µg/mL潮霉素B），轻轻混匀后倒入灭菌的培养皿中，25（±1）℃培养12h后，在上面铺一层10mLTopagar（100µg/mL潮霉素B）。4-5天后，筛选转化子并转移到含有潮霉素B的PDA培养基中。48 3.1.3.13Southern杂交和PCR检测通过用地高辛标记的试剂盒（DIG-HighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI）对转化子进行Southern杂交分析（Chengetal.2015）。将野生型小麦全蚀病菌和4株转化子转接于PDA平板中，25（±1）℃培养7天后用灭菌蒸馏水收集菌丝体，然后转接于含100mLPDB的三角瓶中，在摇床（175rpm）25（±1）℃培养5天后，真空抽滤收集菌丝体。对选取的小麦全蚀病菌野生型菌株和4株转化子，用试剂盒PlantGenomicDNAKit提取其基因组DNA（DNA提取见附录三），分别取15µg基因组DNA用HindIII（Takara）进行过夜酶切，并将酶切后的基因组在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳。DNA片段转移到尼龙膜上（Amersham，Buckinghamshire，英国），并用标记的探针进行杂交（514bp），探针由引物YzbF/R从质粒psilent-1中扩增获得。Southern杂交的具体操作见附录四。同时，以上述提取到的小麦全蚀病菌野生型菌株和4株转化子的基因组DNA为模板，用引物YzbF和YzbR（表3-1）进行PCR扩增，验证基因hph是否成功转入小麦全蚀病菌中。PCR体系（25μL）单位μLPrimeSTARMax12.5RNasefreedH2O10引物HygbF（10μM）0.75引物HygbR（10μM）0.75DNA模板1PCR程序95℃3min98℃10s55℃5s72℃50s32cycles72℃5min16℃foreverPCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统拍照。3.1.3.14结果统计分析结果使用SPSS单因素方差分析进行统计分析及各组间差异显著性分析，显著性水平为P<0.05。结果表示为平均值±标准误。3.2结果与分析3.2.1培养基对原生质体制备的影响小麦全蚀病菌在不同的培养液5×YEG，PDB和OB中培养，过滤并收集菌丝体。用裂49 解酶裂解菌丝体释放原生质体的产量分别为1.05×107，1.87×107和4.58×107原生质体/mL（图3-1A）。结果表明，在培养液OB中，菌丝体释放的原生质体数量最多，因此，OB是小麦全蚀病菌菌丝体生长的最佳培养液。3.2.2温度对原生质体制备的影响小麦全蚀病菌在培养液OB中培养后，过滤并收集菌丝体。将菌丝体用裂解酶进行酶解，经过一系列温度测试，结果表明温度为30-32℃之间时，裂解酶的活性最好。当温度低于30℃或者高于32℃时，裂解酶的活性显著的下降（图3-1B）。因此，我们选择30-32℃为小麦全蚀病菌菌丝体裂解酶的裂解温度。3.2.3酶对原生质体制备的影响小麦全蚀病菌在培养液OB中培养后，过滤并收集菌丝体。将菌丝体用不同的酶及酶组合进行酶解，结果显示经0.25%S+0.25%D+0.25%L裂解小麦全蚀病菌菌丝体后，原生质体释放量为2.68×107原生质体/mL，显著高于0.25%L（2.07×107原生质体/mL）。0.25%L裂解菌丝体后，原生质体的释放量显著高于酶0.25%D（0.17×107原生质体/mL）和0.25%S（0.03×107原生质体/mL）。0.25%L，0.25%S+0.25%L（2.10×107原生质体/mL）和0.25%L+0.25%D（2.37×107原生质体/mL）裂解小麦全蚀病菌菌丝体后，原生质体的释放量没有显著的差异（表3-4）。表3-4酶对原生质体产生的影响Table3-4Effectsofenzymeonprotoplastyield处理原生质体产量（107原生质体/mL）TreatmentaProtoplastyield(107protoplasts/mL)0.25%Lb2.07±0.02b0.25%Dc0.17±0.02d0.25%Sd0.03±0.02d0.25%S+0.25%L2.10±0.28ab0.25%S+0.25%D1.38±0.17c0.25%L+0.25%D2.37±0.27ab0.25%S+0.25%D+0.25%L2.68±0.24a注:a菌丝裂解酶：0.25%裂解酶溶于1mol/L山梨醇；bL裂解酶；cD崩溃酶；dS蜗牛酶。数据为平均值±标准值（SD），试验重复3次。同样的小写字母代表活性之间没有显著性的差异（P<0.05）。aMycelialysate:1mol/Lsorbitolcontains0.25%enzyme.bLmeanslysingenzyme.cDmeansdriselase.dSmeanssnailase.Datarepresentthemean±standarderrors(SE)of3independentexperiments.Differentlowercaselettersindicatesignificantdifference(P<0.05).3.2.4酶解时间对原生质体制备的影响通过测定不同酶解时间下（1、1.5、2、2.5、和3h）小麦全蚀病菌菌丝体经0.5%裂50 解酶裂解后对原生质体释放量的影响。图3-1C显示随着时间的增加，小麦全蚀病菌原声质体的释放量也随着增加，当病菌裂解2.5h后，原生质体的释放量显著降低。用0.5%裂解酶裂解菌丝体2和2.5h后，原生质体的释放量分别为8.03×107原生质体/mL和8.45×107原生质体/mL，两者之间并没有显著的差异。因此，0.5%裂解酶裂解小麦全蚀病菌菌丝体最佳的时间为2-2.5h之间。图3-1培养基、温度和酶解时间对原生质体产生的影响。（A）培养基对小麦全蚀病菌原生质体产生的影响；（B）温度对小麦全蚀病菌原生质体产生的影响；（C）裂解酶酶解时间对小麦全蚀病菌原生质体产生的影响。数据为平均值±标准值（SD），试验重复3次。不同的小写字母代表活性之间有显著性的差异（P<0.05）。Figure3-1(A)Effectsofmediaonprotoplastyield;(B)Effectsofdigestingtemperatureonprotoplastyield;(C)Effectsofenzymolysistimeonprotoplastyield.Datarepresentthemean±standarderrors(SE)of3independentexperiments.Differentlowercaselettersindicatesignificantdifference(P<0.05)3.2.5菌丝体重量对原生质体制备的影响测定不同重量的小麦全蚀病菌菌丝体0.01、0.02、0.03、0.035、0.04、0.05、0.06g/mL经0.5%裂解酶在30℃裂解2h后，菌丝体原生质体的释放量分别为0.85、3.67、7.07、12.67、9.5、7.9、5.27×107原生质体/mL。结果显示当小麦全蚀病菌菌丝体的重量为0.035g/mL湿菌丝体经0.5%裂解酶在30℃裂解2h后，释放的原声质体的量达到最大，当菌丝体的重量低于或者高于0.035g/mL时，原生质体的释放量都显著的减少。因此，最佳的小麦全蚀病菌菌丝体的重量为1mL0.5%裂解酶裂解0.035g湿菌丝体，原生质体的释放量达到最大（图3-2A）。3.2.6摇床转速对原生质体制备的影响小麦全蚀病菌菌丝体经0.5%裂解酶在30℃进行酶解，转速分别为30、60、90、120和150rpm酶解2h，测定不同酶解转速下菌丝体原生质体的产量分别为5.37、6.05、7.93、51 8.07和9.18×107原生质体/mL。在150rpm孵育后的原生质体产量远远高于其它转速下的产量，而90和120rpm酶解后的原生质体产量没有显著的差异。尽管转速在150rpm时的原生质体产量最高，但是，经试验测定150rpm酶解后的原生质体的活性仅仅为90.28%。当转速为90rpm时，原生质体的活性为96%，同时，原生质体释放量也较高为7.93×107原生质体/mL，因此，在小麦全蚀病菌菌丝体酶解释放原生质体的过程，最佳的摇床转速为90rpm（图3-2B）。3.2.7酶浓度对原生质体制备的影响小麦全蚀病菌经过一系列裂解酶浓度0.125、0.25、0.5、1和2%在90rpm裂解菌丝体后，原声质体的释放量分别为1.81、2.30、7.13、9.12和8.60×107原生质体/mL。结果显示1%和2%裂解酶酶解小麦全蚀病菌菌丝体后，原生质体的释放量没有显著的差异，但却显著高于其余酶解浓度下的原生质体释放量。0.5%裂解酶酶解小麦全蚀病菌菌丝体后，原生质体的释放量显著高于0.125%和0.25%浓度下裂解酶释放原生质体的量（图3-2C）。图3-2菌丝体重量、转速和裂解酶浓度对原生质体产生的影响。（A）小麦全蚀病菌菌丝体重量对原生质体产生的影响；（B）转速对小麦全蚀病菌原生质体产生的影响；（C）裂解酶浓度对小麦全蚀病菌原生质体产生的影响。数据为平均值±标准值（SD），试验重复3次。不同的小写字母代表活性之间有显著差异性（P<0.05）。Figure3-2(A)Effectsofmyceliaweightonprotoplastyield.(B)Effectsofrotationalspeedonprotoplastisolation.(C)Effectsofconcentrationoflysingenzymeonprotoplastyield.Datarepresentthemean±standarderrors(SE)of3independentexperiments.Differentlowercaselettersindicatesignificantdifference(P<0.05).52 3.2.8原生质体产生条件的优化通过上述一系列单因素试验，最后选出三个独立因素即酶解温度、酶解时间和裂解酶浓度进行RSM优化，确定小麦全蚀病菌产生原生质体的最佳条件。三个独立因素酶解温度、酶解时间和裂解酶浓度的因素水平在表3-2中给出。通过软件Box-Behnkendesign将三个因素进行不同的试验组合，一共有15个组合（表3-3）。每个组合下小麦全蚀病菌释放原生质体的实验值和预测值均在表3-3中给出；预测值根据下面的二次回归方程式计算得出：Y=9.37+1.26χ221–0.12χ2+0.15χ3–0.52χ1χ2+0.18χ1χ3–0.10χ2χ3–1.53χ1–0.33χ2–0.84χ23-1-13Y为原生质体的预测值；χ1，χ2和χ3分别为酶解温度，酶解时间和裂解酶浓度。二次回归模型的方差分析表明，该模型具有显著差异性，Fish’sFtest（Fmodel=均方回归/均方残差=29.06），且具有非常低的P值[(Pmodel>F)=0.0009]（表3-5）。二次回归模型的拟合度由决定系数R2（0.9812）检验，表明该模型可解释98%的响应变异。变异系数（CV）与试验的可靠性和精密度有关，CV值越高，试验的可靠性越低。在此，CV（3.89%）值较低，表明试验具有较好的可靠性和精密度。二次回归模型的试验结果表明，χ1的线性系数显著高于其它因素，即酶解温度对原生质体产量的影响较大。χ1χ2，χ1χ3和χ2χ3的互作系数不显著，说明两个变量的交互作用对原生质体产量的影响不大。由回归模型描述的三维响应面图和二维等高线图，用以揭示每个响应上的自变量的最佳值。根据三维响应面图和相应的二维等高线图，预测了自变量和最大响应的最优值，进一步分析每个自变量之间的相互作用（图3-3）。每个等高线图代表一个响应值，该响应值由成对因素组合，另一个因子保持在零水平。从图3-3中得出小麦全蚀病菌产生原生质体的最佳条件为：酶解温度30~32℃（图3-3A，B），酶解时间2–2.5h（图3-3A，C）和裂解酶浓度0.88–1.63%（图3-3B，C）。通过软件DesignExpert的分析，得出了实际机组自变量的最优值：酶解温度31℃，酶解时间2.2h和裂解酶浓度1.4%。经该模型预测，小麦全蚀病菌采用上述最佳条件下产生的原生质体最大产量为9.76×107原生质体/mL。通过使用上述优化后的试验条件进行验证，小麦全蚀病菌产生的原生质体为9.83×107原生质体/mL与预测值几乎一致（9.76×107protoplasts/mL），清楚地证明了该模型的正确性和可行性。因此，该模型对小麦全蚀病菌原生质体产量的预测是准确可靠的。同时，在优化条件下，小麦全蚀病菌原生质体的活力较高，达到96.27%。53 表3-5二次模型的方差分析Table3-5TheANOVAofthequadraticmodelP值类型平方和自由度Degree均方F值P-valueProb>SourceSumofsquaresoffreedomMeansquareFvalueFModel24.8592.7629.060.0009X112.63112.63132.87<0.0001X20.1210.121.290.3076X30.1910.192.020.2142X1X21.0711.0711.270.0202X1X30.1410.141.440.2838X2X30.0410.040.420.5451X218.6218.6290.720.0002X20.4110.414.310.09262X232.6112.6127.450.0034Residual0.4850.095LackofFit0.4230.144.860.1752PureError0.05720.029Total25.3214注：R2=0.9812,校正R2=0.9475,CV=3.89%R2=0.9812,adjustedR2=0.9475,CV=3.89%54 图3-3响应面和等高线结果分析。（A）小麦全蚀病菌原生质体产生过程中酶解时间和温度的等高线和响应面图。（B）小麦全蚀病菌原生质体产生过程中酶解浓度和温度的等高线和响应面图。（C）小麦全蚀病菌原生质体产生过程中酶解浓度和酶解时间的等高线和响应面图。Figure3-3Responsesurfacesandcontourplotsshowing:(A)thecombinedeffectoftemperatureandenzymelysistimeontheprotoplastyield;(B)thecombinedeffectoftemperatureandlysingenzymeconcentrationontheprotoplastyield;and(C)thecombinedeffectofenzymelysistimeandlysingenzymeconcentrationontheprotoplastyield.55 3.2.9转化子筛选用灭菌牙签挑取在选择培养基上生长的转化子（图3-4）于PDA培养基中（100μg/mL潮霉素B）。连续转接五代到PDA平板含100μg/mL潮霉素B，试验发现超过98%转化子能够在含有潮霉素B的PDA平板中稳定生长，表明试验获得了阳性转化子。在转化过程中加入不同的DNA量（4、6、8μg），结果发现加入6μgDNA小麦全蚀病菌原生质体的转化率最高，获得的转化子较多，达到约54个转化子/μgNDA（表3-6）。图3-4转化子在选择培养基上生长Figure3-4Transformantsgrowingonselectivemedium表3-6小麦全蚀病菌的转化率Table3-6TransformationefficiencyofG.triticiDNA量（μg）转化率（转化子/μgDNA）转化子数量AccountoftransformDNATransformationefficiencyAccountoftransformants(μg)(transformants/μgDNA)4185.00±5.5146.25±1.38b6324.00±3.6154.00±0.60a8391.33±4.3348.92±0.54b注：数据为平均值±标准值（SD），试验重复3次。不同的小写字母之间代表有显著性的差异（P<0.05）。Datarepresentthemean±standarderrors(SE)of3independentexperiments.Differentlowercaselettersindicatesignificantdifference(P<0.05).56 3.2.10Southern杂交和PCR验证通过PCR和Southern杂交验证基因hph是否成功整合到小麦全蚀病菌基因组中。如图3-5A所示，通过用引物YzbR和YzbF，以野生型菌株和转化子的基因组DNA为模板进行PCR扩增，在4株转化子中有514bp片段成功的被扩增出来。而以野生型小麦全蚀病菌的基因组DNA为模板并没有扩增出相应的片段。同样的，以野生型菌株和4株转化子的DNA为模板，经过Southern杂交如图3-5B所示，探针在4个转化子中检测到一条单带约为514bp，而小麦全蚀病菌野生型菌株中并没有检测到条带，这与PCR的结果一致。结果表明，潮霉素抗性基因片段已成功转入小麦全蚀病菌转化子基因组DNA中。图3-5PCR和Southern杂交验证基因（hph）是否整合到小麦全蚀病菌基因组DNA中。（A）泳道M：Mark2000；泳道1：小麦全蚀病菌野生型菌株；泳道2-5：4株转化子；分别提取野生型菌株以及4株转化子的DNA，以引物Yzb-F/R进行扩增。（B）泳道M：空白；泳道1：小麦全蚀病菌野生型菌株；泳道2-5：4株转化子；分别提取野生型菌株以及4株转化子的DNA，以潮霉素磷酸转移酶基因（hph）作为探针（潮霉素磷酸转移酶基因（hph）用引物Yzb-F/R扩增），进行杂交。Figure3-5Southernblothybridizationanalysisofstrainsusingtheregionofhygromycinphosphotransferasegeneasaprobe.(A)StrainswereidentifiedbyPCRwithprimersofYzb-F/RusinggenomicDNAastemplate.(B)Southernblothybridizationanalysisofstrainsusingtheregionofhygromycinphosphotransferasegeneasaprobe,whichwasamplifiedwithprimersofYzb-F/R.LaneM:DNAMarker2000;Lane1:G.tritici;Lanes2-5:hphtransformants.3.3讨论3.3.1原生质体制备在PEG介导小麦全蚀病菌转化中至关重要自从1973年第一次报道DNA介导真菌转化（Mishraetal.1973），随后，出现一大批真菌转化如核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）和米曲霉（Aspergillusoryzae）不仅仅是PEG介导原生质体转化，也有根癌农杆菌介导，基因枪法和电穿孔转化以及限制性内切酶介57 导的转化（Geetal.2013;Zhangetal.2016a;Nguyenetal.2017）。根癌农杆菌介导转化最开始是运用在植物中的转化，近年来才慢慢在真菌中也开始使用根癌农杆菌介导转化（李白沙等2014）。基因枪法和电穿孔转化对仪器要求较高，需要有专业的仪器和设备。限制性内切酶介导真菌转化过程与PEG介导转化类似，但是其介导转化后的假阳性转化子较多。目前，在真菌转化过程中运用较多的方法为PEG介导原生质体以及根癌农杆菌介导的转化。PEG介导原生质体转化是研究丝状真菌基因功能的重要方法（Irieetal.2001）。在1985年Yamakawa等曾提出PEG处理完整细胞（试验用到的菌为酿酒酵母Saccharomycescerevisiae）是成功转化所需的最小条件，且PEG转化方法快速，操作简单（Yamakawaetal.1985）。原生质体的制备是丝状真菌PEG介导原生质体转化过程中关键步骤。原生质体的质量和数量对转化是否成功至关重要，但其质量和数量受许多因素或条件影响着。不同真菌原生质体形成的条件是不相同的，比如遗传背景的特性，生理生化特性，细胞壁结构等不相同。本章节中，为了获得数量较多和质量较好的小麦全蚀病菌原生质体，通过一系列单因素和RSM试验，获得小麦全蚀病菌原生质体产生的较佳条件。培养基对原生质体的制备至关重要，本研究中培养液OB培养的菌丝体幼嫩可以大大提高原生质体产量。裂解酶在原生质体制备的过程中发挥了极其重要的作用。目前，研究者可以选择的酶较多，蜗牛酶、崩溃酶以及裂解酶是较为常用的酶（黄亚丽等2007）。就小麦全蚀病菌原生质体制备来说，裂解酶与崩溃酶和蜗牛酶相比具有较好的裂解菌丝体效果，0.25%裂解酶、0.25%蜗牛酶+0.25%裂解酶和0.25%裂解酶+0.25%崩溃酶之间没有显著的差异性。0.25%蜗牛酶+0.25%崩溃酶+0.25%裂解酶可以裂解菌丝体释放大量的原生质体（2.68×107原生质体/mL），显著高于0.25%裂解酶（2.07×107原生质体/mL）裂解菌丝体所释放的原生质体（表3-4）。基于Box-Behnken设计，采用响应面法进一步优化了温度、酶解时间和裂解酶浓度。RSM是优化小麦全蚀病菌原生质体产量的有效统计工具。RSM模型方程表明，温度、酶解时间和酶解浓度与酶解效果为正相关，温度和酶浓度之间为正相关，而温度、裂解酶浓度浓度与酶解时间成负相关。理论上，在上述优化后条件下，小麦全蚀病菌原生质体产量的预测值可达9.76×107原生质体/mL。经验证，小麦全蚀病菌原生质体的产量为9.83×107原生质体/mL，这也证实该模型能够准确预测小麦全蚀病菌原生质体的产量。本章节中，通过上述描述的PEG介导小麦全蚀病菌遗传转化体系，成功的从质粒pSilent-1中扩增出来hph基因片段（1790bp）转入小麦全蚀病菌基因组中。测试小麦全蚀病菌对潮霉素B的敏感性（表3-7）；试验发现小麦全蚀病菌对潮霉素B较为敏感（100µg/mL潮霉素B就可以100%致死）。因此，在PEG介导的小麦全蚀病菌原生质体遗传转化体系中选择潮霉素B对转化子进行筛选。58 表3-7潮霉素B对小麦全蚀病菌菌丝生长的影响Table3-7TheeffectofhygromycinBonthemycelialgrowthofG.tritici.浓度抑制率（%）回归方程EC50（95%置信相关系化合物限）ConcentrationsInhibition(%),Regression数Compounds(μg/mL)mean±SDequation(Y=)EC50(μg/mL)r1037.31±2.142044.78±1.47Hygromycin21.924063.06±1.393.39+1.22x0.9863B(18.11-25.78)6071.81±2.108077.03±1.0510085.13±1.21注：数据为平均值±标准值（SD），试验重复3次。EC50通过DPS计算得出。Datarepresentsthemeanvalueoftriplication.TheEC50wasassessedbasedonlog-transformationanalysis.3.3.2原生质体浓度对丝状真菌转化率有重要影响在丝状真菌转化过程中，原生质体浓度低于106原生质体/mL或高于108原生质体/mL时，转化效率均很低，最适合丝状真菌转化的原生质体浓度为107原生质体/mL（Houetal.2013）。PEG介导原生质体转化系统增加了细胞与DNA的结合，更容易获得阳性转化子，其在未来真菌细胞基因水平研究中起着极其重要的作用（Zhangetal.2016b）。物种间由于不同长度的基因片段被用于转化而受到一定限制（Maieretal.2005;Schaefer2001）。本章节描述了基于PEG介导小麦全蚀病菌遗传转化体系的建立，通过对原生质体制备过程中一系列条件进行优化，最终将hph转入小麦全蚀病菌基因组中，转化率高达46-54个转化子/µgDNA。原生质体浓度在107原生质体/mL时，核盘菌（S.sclerotiorum）的转化率高达60-85个转化子/µgDNA（Geetal.2013），而在禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）中，转化率达40-50个转化子/µgDNA（Houetal.2013）。3.4小结本研究通过对小麦全蚀病菌遗传转化体系的建立，并将潮霉素磷酸转移酶基因（hph）转入小麦全蚀病菌基因组中，主要得到以下结论：（1）建立小麦全蚀病菌遗传转化体系并对原生质体制备过程中多种条件进行优化，如培养基、温度、酶、酶解时间、酶解浓度、转速等。同时进行响应面分析得出小麦全蚀病菌产生原生质体较佳条件为：1mL1.4%裂解酶中，0.035g小麦全蚀病菌菌丝在31℃作用下，90rpm酶解2.2h。在上述条件下，产生9.83×107原生质体/mL原生质体，活力达到96.27%。59 （2）从质粒pSilent-1中扩增得到潮霉素磷酸转移酶基因（hph）片段，将基因hph通过上述优化后条件转入小麦全蚀病菌基因组中，经PCR和Southern杂交验证，基因hph片段成功转入小麦全蚀病菌基因组中，转化率为46-54个转化子/µgDNA。本章节中小麦全蚀病菌原生质体遗传转化体系的建立为下章节构建小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III功能亚基基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp的沉默和过表达突变菌株奠定基础。60 第四章Ggcytc1、Ggcytb、GgISP沉默和过表达载体的构建及突变体筛选RNA干扰或是RNA沉默（RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的基因沉默现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能（Carreras-Villaseñoretal.2013）。RNA沉默途径与小RNA（20-30核苷酸）相关，它们是通过各种机制灭活同源序列的特异性因子。目前为止，至少有三类小RNA已被确定分别为siRNA、miRNAs和piRNAs。这些小RNA分子贯穿于整个RNA沉默过程，在RNA沉默过程中起重要作用，可以直接诱导一多组分复合物一RNA诱导沉默复合物（RISC）结合外源RNA（Moazed2009）。发夹式RNAi或反义结构或其他形式的siRNA分子针对害虫或疾病目标基因表达已被用于控制植物中的病虫害（Chengetal.2015）。RNAi技术已在子囊菌中应用且相关的现象均被描述，研究表明，RNAi途径参与各种发育和生理过程，包括基因调控、基因组稳定性、外来核酸的入侵防御，异染色质的形成等（Chenetal.2015）。本研究以小麦全蚀病菌呼吸链复合酶IIIGgcytc1、Ggcytb、GgISP为目标基因，通过小麦全蚀病菌原生质体遗传转化，构建Ggcytc1、Ggcytb、GgISP的沉默和过表达突变菌株，为下章节突变菌株生理生化指标的分析，明确天名精内酯酮对线粒体呼吸链复合酶III功能亚基的影响奠定基础。4.1材料方法4.1.1供试材料4.1.1.1供试菌株小麦全蚀病菌Gaeumannomycestritici（NumberACCC30310），从中国农业微生物菌种保藏管理中心购买。本文中用小麦全蚀病菌（No.ACCC30310）进行转化。天名精内酯酮耐药性菌株24-HN-1由实验室保存（张莹2016）。菌株接种于PDA于25℃培养5天。大量收获菌丝：将菌丝接种于液体培养基PDB中，175rpm，25℃培养5天。本章节所获得的沉默和过表达突变菌株均保存于30%甘油中于-80℃冰箱中。相关基因在GenBank数据库登录号为GgCytc1（XM_009219003.1），GgCytb（KY498478.1），GgIsp（XM_009221216.1）和内参基因18SrRNA（U08320）。酵母XK1-25菌株（酵母色氨酸（Trp）营养缺陷型菌株），由西北农林科技大学植物保护学院许金荣老师实验室惠赠。大肠杆菌菌株E.coliDH5α，本实验室保存。4.1.1.2供试样品61 供试药剂天名精内酯酮（纯度>98%）由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供。质粒Psilent-1（含有潮霉素磷酸转移酶基因hph）（图4-1），具有潮霉素抗性（大肠杆菌中为氨苄青霉素（AMP+）抗性），由西北农林科技大学植物保护学院许金荣老师实验室惠赠。载体PFL2，含有neo基因（新霉素磷酸转移酶基因）（图4-2），具有G418抗性（大肠杆菌中为氨苄青霉素（AMP+）抗性），由西北农林科技大学植物保护学院许金荣老师实验室惠赠。图4-1pSilent-1载体结构示意图。Figure4-1AmapofthesilencingvectorpSilent-1.62 图4-2PFL2载体结构示意图。Figure4-2AmapoftheoverexpressionvectorPFL2.4.1.2供试设备及试剂主要设备：高速低温离心机、普通离心机、恒温摇床、无菌超净工作台、超净工作台、移液器、PCR仪、涡旋仪、紫外凝胶成像系统、电泳仪、低温冰箱（-20℃、-80℃）、高压灭菌锅、水浴锅、紫外分光光度计、电击杯、电击转化仪、恒温培养箱、烘箱、电子天平（万分之一克）等。主要试剂：三氯甲烷、葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、琼脂粉、均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；潮霉素B购买于Biotopped；鲑鱼精DNA、LiAc、G418、TrpDOsupplement、无氨基氮源（含硫氨酸）（YNB）、氨苄青霉素（Amp）购买于Solarbio；DNAMarker、6×Loadingbuffer、10×Loadingbuffer、限制性内切酶（Xhol、HindIII、KpnI、SphI）、PrimeSTARMax等试剂购于Takara；RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒均购于Tiangen；基因组DNA提取试剂盒购于CWBIO。4.1.3试验方法4.1.3.1培养基及主要溶液配方1、PDA培养基（见第二章）2、PDB培养基（见第二章）63 3、LB固体培养基（见第三章）4、LB液体培养基（见第三章）5、Amp配制（见第三章）6、YPD固体培养基YeastExtract10gPeptone20g琼脂20g定容至900mL（YPD液体培养基不加Agar，其他均一样）121℃高压灭菌20min后，在加入100mL单独灭菌的20%葡萄糖。7、SD-Trp培养基无氨基氮源（含硫氨酸）6.7g葡萄糖20g琼脂20gTrpDOsupplement0.74g加水至1000mL121℃高压灭菌20min后备用。8、1MLiAcLiAc10.2g加水至100mL细菌过滤器除菌后，4℃保存，100mM的LiAc只需要将1M的LiAc稀释10倍后备用。9、PEG3350（50%W/V）PEG335025g加水至50mL65℃水浴加速溶解，121℃灭菌20min后，4℃保存。10、TE缓冲液配方0.5MTris-Cl（pH8.0）10mL0.5MEDTA（pH8.0）1mL加水至500mL121℃灭菌20min后，室温保存。11、鲑鱼精DNA（2mg/mL）鲑鱼精DNA2mg加TE缓冲液至1mL振荡溶解后，用注射器剧烈抽吸30-40次，沸水浴20min后，迅速置于冰上降温，分装100µL到1.5mL离心管中-80℃保存。64 12、G418（100mg/mL）G4182g补蒸馏水至20mL溶解完全后用细菌过滤器除菌，保存于4℃。13、CTAB抽提液0.5MTris-Cl（pH=8.0）100mL0.5MEDTA（pH=8.0）20mLCTAB10gNaCl40.54g补蒸馏水至500mL121℃高压湿热灭菌20min，保存于室温。4.1.3.2扩增沉默载体需要的目的条带（1）将PDA中生长5天的小麦全蚀病菌转接于PDB中进行扩大培养。（2）收集小麦全蚀病菌菌丝体，并提取RNA（见附录二）。（3）将RNA反转录为cDNA（见第三章）。（4）进行PCR扩增小麦全蚀病菌线粒体呼吸链复合酶III功能亚基基因的目的片段细胞色素c1（GgCytc1，375bp），细胞色素b（GgCytb，387bp）和铁硫蛋白（GgIsp，389bp），所用到的引物见表4-1，由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。PCR体系（25μL）单位μLPrimeSTARMax12.5RNasefreedH2O8引物（10μM）0.75引物（10μM）0.75cDNA模板3PCR程序95℃3min98℃10s55℃5s32cycles72℃30s72℃5min16℃forever将PCR产物进行胶回收（见附录五）。65 表4-1本章中所用到的引物Table4-1Oligonucleotideprimersusedinthisstudy.引物序列（5'-3'）备注PrimerSequence(5'-3')RelevantcharacteristicsGgCytc-FACACGGAGCCCAACGACCAGPCR扩增GgCytc1片段GgCytc-RCGGCAGCCCAGTTGAGAAAZGgCytc-FCCGCTCGAGACACGGAGCCCAACGACCAGPCR扩增基因GgCytc1的正ZGgCytc-RCCCAAGCTTCGGCAGCCCAGTTGAGAAA向片段用于沉默载体的构建FGgCytc-FCGGGGTACCACACGGAGCCCAACGACCAGPCR扩增基因GgCytc1的反FGgCytc-RACATGCATGCCGGCAGCCCAGTTGAGAAA向片段用于沉默载体的构建GgIsp-FGAGATCGAGGAGGCGAACAAPCR扩增GgIsp片段GgIsp-RGAGGGACCAACAAAGGGAAAAZGgIsp-FCCGCTCGAGGAGATCGAGGAGGCGAACAAPCR扩增基因GgIsp的正ZGgIsp-RCCCAAGCTTGAGGGACCAACAAAGGGAAAA向片段用于沉默载体的构建FGgIsp-FCGGGGTACCGAGATCGAGGAGGCGAACAAPCR扩增基因GgIsp的反FGgIsp-RACATGCATGCGAGGGACCAACAAAGGGAAAA向片段用于沉默载体的构建GgCytb-FGACTTTGAGGCGGTTGCGPCR扩增GgCytb片段GgCytb-RGCGGTCCTTGTTGACATACAZGgCytb-FCCGCTCGAGGACTTTGAGGCGGTTGCGPCR扩增基因GgCytb的正向ZGgCytb-RCCCAAGCTTGCGGTCCTTGTTGACATACA片段用于沉默载体的构建FGgCytb-FCGGGGTACCGACTTTGAGGCGGTTGCGPCR扩增基因GgCytb的反向FGgCytb-RACATGCATGCGCGGTCCTTGTTGACATACA片段用于沉默载体的构建PScheck1FATGAGCAAGCGGACGGAGTGPCR检测沉默载体中目的PScheck1RCTTGTCAGTCCCTTCCATTTATTT基因GgCytc1、GgIsp和GgCytb的正向片段66 引物序列（5'-3'）备注PScheck2FCTGGAGGATACAGGTGAGCCPCR检测沉默载体中目的PScheck2RGGAGCATTCACTAGGCAACCA基因GgCytc1、GgIsp和GgCytb的反向片段OECytc-FCAGATCTTGGCTTTCGTAGGAACCCAATCTTCAATGTTGGCGGCGAGGTGCCTGCPCR扩增基因GgCytc1的OECytc-RCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGC片段用于过表达载体的构建TCACACGGCGAATAGTCTCCTCACCCCAGATCTTGGCTTTCGTAGGAACCCAATCTTCAOECytb-FATGACCCTGTCAGGCGTGGAAPCR扩增基因GgCytb的片CACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGC段用于过表达载体的构建OECytb-RTCACTAGCTTCGCCCCGGTCCGCTGCCAGATCTTGGCTTTCGTAGGAACCCAATCTTCAOEIsp-FATGGCGCCCCTCACGAACGPCR扩增基因GgIsp的片CACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGC段用于过表达载体的构建OEIsp-RTCACACCGATGATCAGCTTGTCGTCCpFLcheck-FTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCAPCR检测过表达载体中目的基因GgCytc1、GgIsp和pFLcheck-RCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGgCytb的片段注：F，正向引物；R，反向引物。F,forwardprimer;R,reverseprimer.4.1.3.3构建沉默载体（1）将目的基因反向片段插入质粒pSilent-1中将质粒pSilent-1和目的基因反向片段进行双酶切双酶切体系（20μL）单位μLKpnI1SphI110×K1质粒pSilent-1767 RNasefreedH2O10双酶切体系（20μL）单位μLKpnI1SphI110×K1目的基因反向片段5RNasefreedH2O1237℃酶切3h，置于冰上，每管加2µL10×loadingbuffer，进行纯化回收，并进行T4连接：T4连接体系（10μL）单位μLT4酶110×T4buffer1双酶切后的质粒3双酶切后的反向目的片段516℃连接12h。（2）大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备见附录六。（3）转化①从-80℃冰箱中取100μL感受态细胞悬液，室温下解冻，解冻后立即置冰上；②加入质粒DNA溶液（5μL），轻轻摇匀，冰上放置30min；③℃42水浴中热击90s或37℃水浴5min，热击后迅速置于冰上冷却3-5min；④向管中加入1mLLB液体培养基（不含Amp），混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态；⑤将上述菌液摇匀后取100μL涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h；⑥以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同；此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现；⑦以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μL菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落；⑧挑取克隆子进行菌落PCR验证，并测序。（4）对测序验证正确的菌落进行提取质粒见附录七。并分别命名重组质粒为pS-FX-Cytc1、pS-FX-Cytb和pS-FX-Isp。（5）将目的基因正向片段分别插入重组质粒中68 分别将重组质粒和目的基因正向片段进行双酶切双酶切体系（20μL）单位μLXhol1HindIII110×M2重组质粒7RNasefreedH2O9双酶切体系（20μL）单位μLXhol1HindIII110×M2目的基因正向片段5RNasefreedH2O1137℃酶切3h，置于冰上，每管加2µL10×loadingbuffer，进行纯化回收，并进行T4连接：T4连接体系（10μL）单位μLT4酶110×T4buffer1双酶切后的重组质粒3双酶切后的正向目的片段516℃连接12h。（6）转化并挑取转化子进行菌落PCR验证和测序，将测序正确的菌进行质粒提取，并将构建好的质粒（沉默载体）命名为pSilent-GgCytc1、pSilent-GgCytb和pSilent-GgIsp。69 菌落PCR如下：PCR体系（25μL）单位μLEsTapMix12.5引物（10μM）0.75引物（10μM）0.75菌液模板2ddH2O9PCR程序95℃10min95℃30s55℃30s32cycles72℃1min72℃5min16℃forever4.1.3.4小麦全蚀病菌野生型菌株原生质体制备和沉默载体转化（见第三章）4.1.3.5沉默转化子的筛选将室温下摇培大约20h的原生质体培养物于室温5000rpm离心5min。弃去上清液，用200µLSTC悬浮原生质体。然后加入10mLBottomagar（50µg/mL潮霉素B），轻轻混匀后倒入灭菌的培养皿中，25（±1）℃培养12h后，在上面铺一层10mLTopagar（100µg/mL潮霉素B）。4-5天后，筛选转化子并转移到含有潮霉素B的PDA培养基中。4.1.3.6沉默转化子小量DNA的快速提取将在含潮霉素B的筛选培养基上长出的转化子，继续转接6-7代在含有潮霉素B的筛选培养基中。随后，用无菌牙签在PDA平板上生长5d的可能的阳性转化子的菌丝转移至无菌的2mL的离心管中。在2mL的离心管中加入600µL的CTAB和600µL的酚：氯仿：异戊醇（25：4：1），然后加入少量无菌石英砂，用封口膜封住管口，防止液体泄漏。置于25℃摇床中，220rpm摇90min。室温下12000rpm离心10min，将上清液转移至无菌1.5mL的离心管中。在1.5mL的离心管中加入1/10体积的3mol/L的NaAc（pH=5.2）混匀，然后加入相同体积的异丙醇，-20℃静置1h以上。4℃，12000rpm离心10min。弃上清，用70%和100%的乙醇洗涤，室温离心5min，倒掉100%的乙醇，吹干，加入适量1×TE溶解DNA。溶解后的DNA于-20℃保藏，备用。4.1.3.7沉默转化子的初步鉴定分别用引物PScheck1F/R和PScheck2F/R对上述提取的基因组DNA进行验证，每个基因沉默转化子选出初步验证正确的3-5株菌，进行进一步的验证。70 4.1.3.8沉默转化子的RT-PCR验证小麦全蚀病菌野生型及突变菌株的RNA提取见附录二。反转录cDNA见第二章。RT-PCR在AppliedBiosystemsQuantStudioTM6FlexReal-TimePCR系统中进行。反应混合液的配置根据实时荧光定量PCR试剂盒（TaKaRa,China）说明书进行。以小麦全蚀病菌18SrRNA为内参基因，引物见表2-2。基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp的引物见表4-1。反应体系为20µL，包括PremixExTaqTM（2X）10µL、上、下游引物各0.8µL、ROXReferenceDye0.4µL、模板2.0µL，灭菌蒸馏水6.0µL，混合均匀。置实时荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。实验采用两步PCR扩增法，设置参数为：95℃30s，预变性，95℃5s，60℃34s，循环数40；反应过程中，系统自动对获得的信号、数据进行处理。4.1.3.9扩增过表达载体需要的目的条带和PFL2酶切过表达基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp使用PFL2载体中RP27强启动子启动基因进行表达，因而需扩增目的基因的编码区。呼吸链复合酶III目的基因编码区GgCytc1（978bp），GgCytb（1320bp）和GgIsp（726bp），所用到的引物见表4-1，由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。通过PEG介导同源重组在酵母中热激转化将基因连接到PFL2载体上，因而需要在上下游引物前后加上对应酶切位点（XhoI）前后的同源序列（对应基因引物5’端序列）。以野生型小麦全蚀病菌ACCC30310基因组DNA为模板（基因组DNA提取见附录三），用引物OECytc-F/R，OECytb-F/R和OEIsp-F/R扩增过表达基因片段，扩增完胶回收基因片段。用内切酶XhoI快速酶切PFL2质粒：双酶切体系（20μL）单位μLXhol1BufferH2质粒PFL27RNasefreedH2O1037℃酶切3h，置于冰上，每管加2µL10×loadingbuffer，进行胶回收线性片段（见附录五）。4.1.3.10酵母热激转化（1）在超净工作台中活化酵母菌株XK1-25，在YPD平板上划线，吹干后30℃培养3-4天至长出单菌落约2-3mm。（2）挑取一个单菌到50mLYPD培养基中，在30℃，220rpm摇床中摇12h至OD达到1.0以上。71 （3）吸10mL菌液于90mLYPD瓶中，在30℃，220rpm摇床中摇2～3h。（4）OD达到0.6后将菌液移入已灭菌的50mL预冷的离心管中，置于冰上冷却15min，4℃，4000rpm离心5min。（5）倒上清，加入30mL预冷的无菌水，悬浮菌体，4℃，4000rpm离心5min。（6）倒上清，用预冷的1mL100mMLiAc悬浮菌体，转移至1.5mL离心管（预冷）。（7）4℃，5000rpm离心15sec。（8）倒上清，加400μL预冷的100mMLiAc悬浮菌体，酵母感受态制备完毕。取50μL分装到1.5mL离心管（灭菌），存于-80℃保存。（9）取已分装好的酵母感受态，微离，倒上清。按以下顺序添加试剂：PEG3350（50%W/V）240μL1MLiAc36μL鲑鱼精DNA（2mg/mL）25μL质粒DNA0.7μg基因片段2μg（载体：插入片段=1:3-5）（10）震荡1-2min（剧烈），使混和均匀。（11）在30℃恒温水浴锅中，静置30min。（12）转移到42℃恒温水浴锅中静置40min。（13）8000rpm离心15sec。（14）倒上清，加300μL无菌水悬浮菌体。（15）吸100μL用涂布器（灼烧灭菌）平铺到SD-trp板上，在30℃恒温培养箱培养2-3天长出转化子。4.1.3.11酵母菌落PCR检测等到SD-trp板上长出单菌落后，挑取单菌落为模板，用PFL2上引物pFLcheck-F/R，做PCR检测，体系如下：组份（总50μL）单位（μL）10×TRANSEasyTaqbuffer5dNTPs（2.5mM）4Primer11Primer21TRANSEasyTaq0.5模板1无菌水37.5PCR反应程序：72 PCR程序95℃3min95℃30s58℃40s35cycles72℃30s72℃10min4℃forever挑选3-4个阳性的菌落，用灭过菌的枪头粘取并打入10mLYPD液体培养基（需加入已灭菌20%葡萄糖，比例为YPD：20%葡萄糖=9:1），用50mL离心管中在30℃，220rpm的恒温摇床中摇培12h，准备提取酵母质粒。4.1.3.12酵母质粒提取（1）将在30℃，220rpm的恒温摇床中摇培12h的酵母菌液倒入2mL离心管中，12000rpm离心1min，倒上清并收集菌体，重复该操作一次菌体量加倍。（2）依次加入400μLYE裂解液，200μL酚，200μL氯仿，在震荡仪上震荡30min。（3）65℃恒温水浴锅中静置5min。（4）12000rpm离心5min，收集上清液到另一个无菌1.5mL的离心管中。（5）加入2倍体积的无水乙醇，混合均匀后4℃静置30min，12000rpm离心1min见白色DNA沉淀。（6）倒上清，用75%的酒精洗涤一次，倒掉酒精放在通风处吹干。（7）待酒精吹干后，用50-100μL无菌水溶解。4.1.3.13酵母质粒电击转化（1）DH5α感受态制备（见附录六）。（2）将电击杯用75%乙醇浸泡2h，取出后放入到无水乙醇中润洗，然后将润洗好的电击杯放在通风处吹干，此时从-80℃冰箱取出DH5α大肠感受态，一同置于冰上预冷。（3）在超净工作台中将LB液体培养基分装到2mL已灭菌离心管中，置于37℃恒温水浴锅中。（4）待DH5α大肠感受态融化后，吸取3μL酵母质粒，吹打混匀，注意不要产生气泡。（5）混合均匀后转移至电击杯中，不要产生气泡，待液面平整后推入电转仪中。（6）将电压调至2500V，电击时间设为5毫秒，快速双击，听见“嘀”一声则电击成功，若是听见击穿爆炸声则为失败。电击成功后，将菌液倒入预热的LB液体培养基中，反复几次，将尽量多的感受态细胞倒入离心管中。（7）将离心管在37℃，150rpm的恒温摇床中摇培1h。73 （8）将离心管在12000rpm离心机中离心1min，倒上清，加入300μL的无菌水吹打混合均匀。（9）在超净工作台中取100μL的菌液，用涂布器涂匀在LB平板（Amp100ug/mL）上，吹干后放入37℃恒温培养箱中培养20h。（10）待长出单菌落，挑取单菌落进行PCR检测。4.1.3.14大肠杆菌菌落PCR检测方法同4.1.3.3菌落PCR检测。4.1.3.15阳性大肠杆菌质粒提取及测序每个基因挑选3个阳性大肠单菌落送测序，与网站上GgCytc1、GgCytb和GgIsp序列比对，将测序正确的菌进行质粒提取见附录七，并将构建好的质粒（过表达载体）命名为OE-Cytc1，OE-Cytb和OE-Isp。4.1.3.16过表达载体转入小麦全蚀病菌野生型菌株见第三章4.1.3.17过表达转化子的筛选方法同4.1.3.54.1.3.18过表达转化子小量DNA的快速提取方法同4.1.3.64.1.3.19过表达转化子的初步鉴定方法同4.1.3.74.1.3.20过表达转化子的RT-PCR验证方法同4.1.3.84.1.3.21过表达转化子的DNA水平的验证以DNA为模板，其余方法同4.1.3.84.2试验结果4.2.1GgCytc1，GgCytb及GgIsp基因鉴定及序列分析4.2.1.1小麦全蚀病菌GgCytc1基因的鉴定及序列分析通过在NCBI中对小麦全蚀病菌线粒体呼吸链复合酶III细胞色素c1亚基基因GgCytc1进行搜寻，得到GgCytc1基因全长为1912bp，编码325个氨基酸，含有5个内含子（XM_009219003.1）。利用MEGA软件将细胞色素c1亚基与其他病原真菌同源序列比对发现，与酿酒酵母Saccharomycescerevisiae的同源蛋白呼吸链复合酶III细胞色素c1亚基有59%的相似性，与粗糙脉孢菌Neurosporacrassa的呼吸链复合酶III细胞色素c1亚基的同源性有83%的相似性，与草地早熟禾夏季斑枯病菌Magnaporthiopsispoae和稻瘟病菌Magnaportheoryzae的同源蛋白分别为95%和88%的相似性。通过分析GgCytc1基因与其他真菌同源蛋白比对发现，与N.crassa、M.poae和M.oryzae的亲缘74 关系最近（图4-3）。图4-3小麦全蚀病菌GgCytc1基因系统发育树Figure4-3PhylogenetictreeofGgCytc1proteinsfromotherfungi4.2.1.2粗糙脉孢菌GgCytb基因的鉴定及序列分析由于小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III细胞色素b亚基的基因序列未知，因此根据已知粗糙脉孢菌（N.crassa）呼吸链复合酶III细胞色素b亚基基因进行扩增得到小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III细胞色素b基因。通过对粗糙脉孢菌呼吸链复合酶III细胞色素b亚基基因NcCytb在NCBI中行BLAST，得到NcCytb基因全长为3748bp，编码385个氨基酸，含有3个内含子（KY498478.1）。通过将N.crassa的细胞色素b亚基在NCBI中进行同源序列比对发现，与C.thermophilum和M.grisea的呼吸链复合酶III的细胞色素b亚基同源性最高，分别有93%和89%相似性；与C.beticola和P.chrysogenum的细胞色素b亚基同源性能达到83%和82%。N.crassa的亚基细胞色素b与S.cerevisiae的同源蛋白有61%的相似性。通过对N.crassa的细胞色素b亚基进行同源比对，发现其在不同菌中有高度的保守性（图4-4）。图4-4粗糙脉孢菌GgCytb基因系统发育树Figure4-4PhylogenetictreeofGgCytbproteinsfromotherfungi75 4.2.1.3小麦全蚀病菌GgIsp基因的鉴定及序列分析通过在NCBI中对小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基基因GgIsp进行搜寻，得到GgIsp基因全长为2307bp，编码241个氨基酸，含有3个内含子（XM_009221216.1）。利用MEGA软件将小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基与其他病原真菌同源序列比对发现，其与酿酒酵母S.cerevisiae的同源蛋白呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基有64%的相似性，与粗糙脉孢菌N.crassa的同源蛋白有81%的相似性，与草地早熟禾夏季斑枯病菌M.poae和稻瘟病菌M.oryzae的同源蛋白分别为87%和81%的相似性。通过分析GgIsp基因与其他真菌同源蛋白比对发现，与M.poae和M.oryzae的亲缘关系最近（图4-5）。图4-5小麦全蚀病菌GgIsp基因系统发育树Figure4-5PhylogenetictreeofGgIspproteinsfromotherfungi4.2.2沉默和过表达载体PCR验证将构建好的沉默载体pSilent-GgCytc1、pSilent-GgCytb、pSilent-GgIsp和过表达载体OE-Cytc1、OE-Cytb、OE-Isp分别用引物PScheck-1F/R和pFLcheck-F/R进行PCR验证。经PCR验证构建的沉默和过表达载体是正确的，结果如图4-6，pSilent-GgCytc（1964bp）、pSilent-GgCytb（976bp）、pSilent-GgIsp（978）、OE-Cytc1（2148bp）、OE-Cytb（2490bp）、OE-Isp（1896bp）。图4-6重组载体PCR验证。重组后的沉默载体（泳道1:pSilent-GgCytc1；泳道2:pSilent-GgCytb；泳道3:pSilent-GgIsp）用引物PScheck-1F/R进行PCR验证。重组后的过表达载体（泳道4:OE-Cytc1；泳道5:OE-Cytb；泳道6:OE-Isp）用引物pFLcheck-F/R进行PCR验证。泳道M：Marker2000。Figure4-6RecombinedvectorswereidentifiedbyPCR.Recombinedsilencingplasmid(lane1:pSilent-GgCytc1,lane2:pSilent-GgCytb,lane3:pSilent-GgIsp)wereidentifiedbyPCRwithprimersofPScheck-1F/R.Theoverexpressionvectors(lane4:OE-Cytc1,lane5:OE-Cytb,lane6:OE-Isp)wereidentifiedbyPCRwithprimersofpFLcheck-F/R.laneM:Marker2000.76 4.2.3沉默和过表达转化子PCR验证各挑选5个阳性转化子进行PCR验证，分别用引物PScheck-1F/R和pFLcheck-F/R进行沉默转化子和过表达转化子的PCR验证如图4-7。将初步PCR验证正确的沉默转化子分别命名为∆GgCytc1、∆GgCytb和∆GgIsp；将初步PCR验证正确的过表达转化子分别命名为OECytc1、OECytb和OEIsp。图4-7转化子的PCR验证。以沉默突变体（A）∆GgCytc1、（B）∆GgCytb、（C）∆GgIsp的基因组DNA为模板，用引物PScheck-1F/R进行PCR验证。以过表达突变体（D）OECytc1、（E）OECytb、（F）OEIsp的基因组DNA为模板，用引物pFLcheck-F/R进行PCR验证。Marker2000。Figure4-7MutantswereidentifiedbyPCR.Silencingmutants(A)∆GgCytc1,(B)∆GgCytb,(C)∆GgIspwereidentifiedbyPCRwithprimersofPScheck-1F/RusinggeomicDNAastemplate.Overexpressionmutants(D)OECytc1,(E)OECytb,(F)OEIspwereidentifiedbyPCRwithprimersofpFLcheck-F/RusinggenomicDNAastemplate.Marker2000.4.2.4沉默和过表达转化子RT-PCR验证为明确基因沉默和过表达后，目的基因Ggcytc1，GgCytb，GgIsp在沉默菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp和过表达菌株OECytc1、OECytb和OEIsp中的表达水平，因此使用实时荧光实时定量PCR测定目的基因mRNA表达水平。以小麦全蚀病菌18sRNA为内参基因。与小麦全蚀病菌野生型菌株相比，目的基因GgCytc1在沉默菌株∆GgCytc1中显著的下调，下调了94%，而在过表达菌株OECytc1中上调了约7倍（图4-8A）。目的基因GgCytb在沉默菌株∆GgCytb中下调约70%，而在过表达菌株OECytb中上调了约3倍（图4-8B）。与野生型菌株相比，目的基因GgIsp在沉默菌株∆GgIsp中显著地下调了97%，而在过表达菌株OEIsp中上调了约6倍（图4-8C）。77 图4-8mRNA表达水平。目的基因（A）GgCytc1、（B）GgCytb和（C）GgIsp在沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp和过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp中的mRNA表达水平。18SrRNA为内参基因，数据为三次试验的平均值±SDs。Figure4-8ThemRNAexpressionlevel.TherelativemRNAexpressionlevelsof(A)GgCytc1,(B)GgCytband(C)GgIspinthewildtype,silencingtransformant∆GgCytc1,∆GgCytb,∆GgIspandoverexpressiontransformantOECytc1,OECytbandOEIsp.Expressionofthe18SrRNAgenewasusedasthereference.Barsrepresentmeanvalues±SDsofthreeindependentexperiments.4.2.5沉默和过表达转化子DNA水平验证经实时荧光定量PCR分析基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp在小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp，天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1以及过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp中的DNA含量。与野生型菌株相比，基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp的DNA含量在菌株中均变化较少（约0.78-1.25倍）。与野生型菌株相比，基因GgCytc1和GgCytb的DNA含量在24-HN-1中均有所下降（分别约20%），而基因GgIsp的DNA含量在24-HN-1中增加了约22%（图4-9）。实时荧光定量PCR的结果表明RNAi能有效的降低目的基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp在相应的沉默突变菌株中mRNA的表达，但DNA水平无显著变化，这与之前研究一致（Nakayashikietal.2005）。同样的，与野生型菌株相比，过表达能有效上调目的基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp在相应过表达突变菌株中的mRNA表达量，但其DNA水平无显著变化。因此，把目的基因沉默或者过表达后，目的基因的DNA水平在沉默和过78 表达突变体中无显著上调或抑制。结果表明，经RNAi和过表达技术，目的基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp在相应的沉默和过表达突变菌株中成功进行表达。图4-9DNA水平检测。基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp在沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp和过表达突变菌株OECytc1、OECytb、OEIsp以及天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1中的DNA水平。18SrRNA为内参基因，数据为三次试验的平均值±SDs。Figure4-9TheamountofDNA.TherelativeDNAexpressionlevelsofGgCytc1,GgCytbandGgIspinthewildtype,∆GgCytc1,∆GgCytb,∆GgIsp,24-HN-1,OECytc1,OECytbandOEIsp.Expressionofthe18SrRNAgenewasusedasthereference.Barsrepresentmeanvalues±SDsofthreeindependentexperiments.4.3讨论随着越来越多基因组被测序，功能基因组学研究通过鉴定目标基因功能成为一个研究热点。其中通过RNAi技术，能够特异性达到抑制靶基因，操作简单，在基因功能领域应用十分广泛。RNAi是通过构建一个与目标基因mRNA同源互补的dsRNA，通过原生质体转化导入，进入体内后特异性识别和降解目标基因mRNA，使病菌表现出目标基因缺失症状，它是一种转录后水平的基因沉默。基因沉默现象首次是Jorgensen等在研究矮牵牛花的色素试验中发现（Jorgensenetal.1990）。在真菌中Romano等在研究粗糙链胞菌试验中是第一次发现该现象（RomanoandMacino1992）。这之前，研究者只是发现了基因沉默现象，但是对于基因沉默的具体机理并不了解。直到1998年，Fire等研究发现，基因沉默现象主要是在体内形成与靶基因mRNA同源的正义链和反义链（Fire79 etal.1998）。随后，在真菌、植物、昆虫等真核生物中发现均存在基因沉默现象。真菌中基因抑制和RNAi与植物中共抑制极有可能是共同的分子机制。表明生物在进化早期阶段就获得了这种机制，且用于生物体自我防御如病毒入侵以及自身基因调控等都具有重要意义。随着转基因技术的广泛应用，研究还发现转入的基因可被机体当作外源遗传物质诱导其自身沉默。本文通过发卡RNAi载体构建达到沉默小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III功能基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp，能有效降低靶基因mRNA表达水平。以期进一步探讨天名精内酯酮对小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III细胞色素c1、细胞色素b和铁硫蛋白亚基的影响。RNA沉默机制已作为一种有效的阐明基因功能的遗传工具，在丝状真菌中通过利用hpRNA表达质粒或者相反的双启动子系统（Nakayashikietal.2005）。对于某些关键基因如本研究中GgCytc1、GgCytb和GgIsp，由于敲出后导致菌体死亡，因此通过基因沉默方法达到研究该基因的目的。在丝状真菌中，RNAi机制调节着深绿木霉（Trichodermaatroviride）的生长与发展（Carreras-Villaseñoretal.2013）。在起卷枝毛霉（Mucorcircinelloides）中RNAi途径中的内源基因调控其生长阶段以及生理和发育过程（Nicolásetal.2015）。而在禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）RNAi通路的核心组件成分已由Chen等探讨，表明沉默过程中Dicer蛋白Fgdicer2和Argonaute蛋白Fgago1起着重要作用（Chenetal.2015）。有研究者支持RNAi可作为一种化学疗法防治植物病害虫的观点（Kochetal.2016）。4.4小结本章节针对小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III功能基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp进行RNAi和过表达并获得转化子，并对沉默和过表达转化子进行了验证。主要得到以下结果：（1）经PCR、RT-PCR以及DNA水平验证，成功获得小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III基因GgCytc1、GgCytb以及GgIsp的沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb和∆GgIsp。（2）经PCR、RT-PCR以及DNA水平验证，成功获得小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III基因GgCytc1、GgCytb以及GgIsp的过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp。本章节中小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III功能亚基基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp沉默和过表达突变菌株的获得，为下章节中分析该突变菌株生理生化指标，以期进一步明确天名精内酯酮对呼吸链复合酶III的影响奠定基础。80 第五章突变菌株生理生化指标测定天名精内酯酮是从菊科大花金挖耳中分离得到的一种倍半萜类化合物，经西北农林科技大学无公害农药研究服务中心前期研究发现，该化合物对小麦全蚀病菌有很好的抑制作用。通过亚细胞定位等研究发现天名精内酯酮作用的细胞器为线粒体，且对生物氧化有显著抑制作用。在前期研究基础上，进一步明确天名精内酯酮对小麦全蚀病菌呼吸链复合酶活性的影响，结果表明呼吸链复合酶III对天名精内酯酮较为敏感，是天名精内酯酮的潜在靶蛋白之一。因此，本研究对小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，以及第四章中获得的小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III三个功能亚基基因（GgCytc1、GgCytb和GgIsp）的沉默突变体菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp和过表达突变体菌株OECytc1、OECytb、OEIsp以及天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1进行生理生化指标测定。试验主要测定小麦全蚀病菌野生型菌株与突变菌株对天名精内酯酮的敏感性、菌丝生长速率、氧化压胁迫敏感性、菌丝形态显微观察、漆酶和过氧化物酶的活性、黑色素含量、离体和活体条件下线粒体呼吸链复合酶III的活性、菌株致病性以及分别用天名精内酯酮和抗霉素A处理后菌株线粒体氧消耗速率的变化，以期明确天名精内酯酮对供试菌株线粒体呼吸链复合酶III功能亚基的影响。5.1材料方法5.1.1供试材料5.1.1.1供试菌株供试病原菌小麦全蚀病菌（Gaeumannomycestritici），（NumberACCC30310）从中国农业微生物菌种保藏管理中心购买（ACCC,Beijing,China,www.accc.org.cn/search/accc/show.asp?jzbc=30310）。本文所用到的菌株（表5-1），其中∆GgPsilent和OEpFL2分别是将沉默（Psilent-1）和过表达（pFL2）空载体转入小麦全蚀病菌野生型菌株（ACCC30310）后获得的的突变菌株，经比较发现空载体突变菌株与小麦全蚀病菌野生型菌株对天名精内酯酮的敏感性以及生理生化指标无显著变化。菌株24-HN-1为天名精内酯酮抗性菌株，由实验室保存，具体的诱导突变过程详见文献张莹（2016）。本章所用到的菌株在30%甘油溶液中-80℃冷冻保存。81 表5-1本文中所用到的菌株Table5-1ListofG.triticiisolatesusedinthisstudy.菌株有效中浓度突变基因来源IsolateECa(µg/mL)CIIIMutationbSourceorreference50ACCC3031040.30-Thisstudy∆GgPsilent41.51-Thisstudy∆GgCytc1104.94Silence(Cytc1)Thisstudy∆GgCytb103.19Silence(Cytb)Thisstudy∆GgIsp156.18Silence(Isp)Thisstudy24-HN-1182.73Carabrone-resistantisolate张莹2016OEpFL239.95-ThisstudyOECytc132.44Overexpression(Cytc1)ThisstudyOECytb30.02Overexpression(Cytb)ThisstudyOEIsp25.88Overexpression(ISP)Thisstudy注：a天名精内酯酮抑制菌丝生长的的有效中浓度。b小麦全蚀病菌中线粒体呼吸链复合体III。aEffectiveConcentrationofcarabronecausing50%inhibitionofgrowth.bMitochondrialrespiratorychaincomplexIIIinG.tritici.5.1.1.2供试样品供试药剂天名精内酯酮（纯度>98%）由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供。氰化钾（KCN）由西北农林科技大学植物保护学院张雅林教授惠赠。氧化型细胞色素c来源于马心、癸基泛醌、抗霉素A等试剂均购自sigma。无水乙醇、蔗糖、HEPES、EDTA、EGTA、Tris、吐温20、连二亚硫酸钠、硼氢化钾等试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。葡萄糖、琼脂、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠、氯化钙等均购自杨凌天成化玻站。总RNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）、cDNA反转录试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）。5.1.1.3培养基PDA培养基见第二章。PDB培养基见第二章。5.1.2主要仪器及设备仪器设备：酶标仪（SpectraMaxplus384，MolecularDevices，美国）、场发射扫描电子显微镜（日本日立公司）、液相氧电极（HansatechInstruments，英国）、细胞破碎仪（宁波科学生物科技有限公司）、超纯水器、高压灭菌锅、无菌超净工作台、冰箱、烘箱、分析天平、100mL烧杯、250mL烧杯、100mL量筒、300mL三角瓶、1000mL82 容量瓶、96孔酶标板、移液枪等。5.1.3试验方法5.1.3.1DNA和RNA提取DNA和RNA提取见附录二和附录三。5.1.3.2菌株形态及生长速率测定小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310以及天名精内酯酮（100µg/mL）处理后的菌株、沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp、天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，和过表达突变菌株OECytc1、OECytb、OEIsp在PDA培养基上25℃培养。分别测定菌株在1、2、3、4、5、6、7天平均菌落直径（减去打孔器直径）。5.1.3.3菌株对天名精内酯酮和H2O2敏感性测定小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310以及沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp，天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，和过表达突变菌株OECytc1、OECytb、OEIsp在PDA培养基上25℃培养7天，分别将菌株转接在含有100μg/mL的天名精内酯酮和10mM的H2O2的PDA平板上，生长7天并拍照。每个菌株三个重复，整个试验重复三次。5.1.3.4菌丝端部扫描电镜观察小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp，天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp在PDA培养基上25℃培养7天，将菌株转接在较薄的含有100μg/mL的天名精内酯酮和10mM的H2O2的PDA平板上，25℃培养3-4天，用于扫描电镜的观察。扫描电镜样品制备根据Cleary等方法进行（Clearyetal.2013）。5.1.3.5黑色素含量的测定黑色素含量根据Frederick等的方法测定（Fredericketal.1999）。为标准曲线制备黑色素，将8个小麦全蚀病菌野生型菌株的菌饼（5mm）转接于PDB液体培养基中，175rpm25℃培养5天。培养液用灭菌的纱布过滤，并用4mol/LHCl的酸化；4℃沉淀4天，5000g离心15min收集黑色素。沉淀用0.1mol/LHCl清洗3次，接着用灭菌的蒸馏水冲洗3次。低压过夜冻干，保存于-20℃。分别称取于2mL离心管中，加入1mLAzureA（Sigma）溶液（33mg/mLin0.2mol/LHCl），孵育30min，用0.45μm滤膜过滤。黑色素浓度是由天青A在628nm处的滤液吸收减少而确定的。分别测定小麦全蚀病菌野生型菌株和天名精内酯酮（100µg/mL）处理后的菌株，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgIsp、∆GgCytb，天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1和过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp在3、4、5、6、7天的黑色素的产量。菌丝分别通过灭菌的纱布过滤并低压过夜冻干，称取2mg用于测定黑色素的量。5.1.3.6过氧化物和漆酶活性测定83 小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp，天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp的胞外过氧化物酶和漆酶的活性用酶标仪SpectraMaxplus384（MolecularDevices，USA）测定。胞外过氧化物酶和漆酶的活性根据Chi等的方法测定（Chietal.2009）。将菌株在PDB培养液中培养5天后分别加入天名精内酯酮（0、EC20和EC80）和抗霉素A（20μg/mL），继续培养12h后，用灭菌的纱布过滤菌丝体，收集滤液，并将滤液4℃5000g离心1min，收集上清液用于测定胞外过氧化物酶和漆酶活性。1mL的反应液中包含50mM醋酸缓冲液（pH5.0），10mMABTS，200μL菌丝培养滤液，25℃孵育5min，分别加入和不加3mMH2O2，在420nm下来测定胞外过氧化物酶和漆酶的活性。5.1.3.7突变菌株基因GgLac的mRNA相对表达量测定小麦全蚀病菌野生型菌株及突变菌株的RNA提取见附录二。反转录cDNA见第二章。RT-PCR在AppliedBiosystemsQuantStudioTM6FlexReal-TimePCR系统中进行。以18SrRNA为内参基因，引物见表2-2，而基因GgLac用引物LacF5'AAGAGCGTCAGGGTCAGC3'和LacR5'CGGTCGGGAAGATGGACT3'进行扩增。其他步骤详见4.1.3.8。5.1.3.8呼吸链复合酶III活性测定小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp，天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，以及过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp线粒体呼吸链复合体III的活性用酶标仪SpectraMaxplus384（MolecularDevices，USA）测定。具体方法见第二章2.1.3.5。5.1.3.9菌株致病性及天名精内酯酮活体抑菌活性测定测定小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp，天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp对小麦的致病力。小麦种子用5%的次氯酸钠溶液消毒5min后用灭菌水冲洗两次。将种子催芽2天后，每个种子正下方2cm左右放一个菌株的菌饼（5mm），种子上方再覆盖2cm厚的沙子。菌饼来于PDA培养基中生长7天的菌落边缘（对照用灭菌的PDA菌饼）。每个处理重复三次，每盆含有9个发芽的小麦种子。在接种21-25天后，根据Chng等方法测定小麦苗高，根长，苗重和根部感病面积所占百分比（Chngetal.2005）。天名精内酯酮保护效果：将催芽2天后的种子浸药（天名精内酯酮1000mg/L），其余步骤一致；天名精内酯酮治疗效果：小麦苗生长30天后，对不同病菌侵染后的麦苗根部进行灌药（天名精内酯酮1000mg/L和三唑酮150mg/L），7天后洗根并进行拍照。5.1.3.10线粒体氧消耗速率测定84 线粒体氧消耗速率利用液相氧电极根据Ferguson等方法测定（Fergusonetal.2005）。小麦全蚀病菌野生型菌株，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp，天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp在PDA培养基中培养7天后，用灭菌水冲洗菌丝并转移到100mLPDB培养液中，培养5天后分别加入天名精内酯酮（0、EC20和EC80）和抗霉素A（20µg/mL），继续培养12小时后，根据Tamuraetal.（1999）andFrazierandThorburn（2012）方法提取线粒体蛋白并依据Bradford（1976）测定其蛋白含量。在液相氧电极反应室中加入反应介质（0.4Mmannitol，0.2Msucrose，10mMKCl，10mMMgCl2，50mMpotassiumphosphate，and10mMTris，pH7.4），快速地加入线粒体蛋白（800µg），使最终反应室中的体积为2mL，启动反应，监测8-10min内氧含量的变化。5.2结果与分析5.2.1菌丝生长速率测定测定小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310以及沉默和过表达突变菌株，天名精内酯酮抗性菌株和天名精内酯酮（100µg/mL）处理后野生型菌株菌丝生长速率。结果显示，与野生型菌株相比，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb和∆GgIsp菌丝生长速率明显缓慢（约0.75cm/d），尤其是抗性菌株24-HN-1的菌丝生长最慢（0.6cm/d）。菌丝生长速率在天名精内酯酮处理后菌株（0.7cm/d）与沉默突变菌株和抗性菌株之间无显著差异。过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp的菌丝生长速率与野生型菌株之间无明显差异（约1.0cm/d）（图5-1）。结果表明基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp对小麦全蚀病菌菌丝生长速率有显著影响，当基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp沉默后，沉默突变体菌株生长速率明显变慢。图5-1菌丝生长速率测定。C：天名精内酯酮（100µg/mL）；小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1，∆GgCytb，∆GgIsp以及抗性菌株24-HN-1，和过表达突变菌株OECytc1，85 OECytb和OEIsp菌丝生长速率测定。Figure5-1Mycelialgrowthrate.C:Carabrone(100µg/mL);Themycelialgrowthrateofthewild-typestrainACCC30310,the∆GgCytc1,∆GgCytb,∆GgIsp,24-HN-1,OECytc1,OECytbandOEIspmutants.5.2.2菌株对天名精内酯酮和H2O2敏感性测定为明确小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp对天名精内酯酮和H2O2的敏感性。经100μg/mL天名精内酯酮和10mMH2O2处理后，野生型菌株ACCC30310和过表达突变菌株OECytc1、OECytb、OEIsp菌丝生长明显受到抑制。与野生型菌株相比，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp和天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1对天名精内酯酮和H2O2的敏感性有一定程度下降，相比而言，∆GgIsp对天明精内酯酮的敏感性显著降低。与对照相比，经10mMH2O2处理后，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp和抗性菌株24-HN-1并没有受到显著抑制。结果表明，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp对H2O2产生的氧化压敏感性显著降低。过表达突变菌株对天名精内酯酮和H2O2的敏感性与沉默突变菌株相比有很大程度的恢复，与野生型菌株无显著差异（图5-2）。86 图5-2菌株形态观察及敏感性测定。小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp，天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，和过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp的形态观察以及对天名精内酯酮（100μg/mL）和过氧化氢（10mM）的敏感性测定。菌株在PDA培养基中生长。Figure5-2Mutantswithalteredsensitivityincolonymorphology.Sensitivityofthewild-typestrainACCC30310,thesilencedmutants∆GgCytc1,∆GgCytb,∆GgIsp,carabrone-resistantisolate24-HN-1,andtheoverexpressionmutantsOECytc1,OECytb,OEIsptocarabrone(100μg/mL)andH2O2(10mM).Culturesweregrownonpotatodextroseagar(PDA).5.2.3菌丝形态显微观察明确天名精内酯酮和过氧化氢对小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp，天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，以及过表达突变菌株OECytc1、OECytb、OEIsp菌丝的影响。经扫描电子显微镜观察发现，未经药剂处理的沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp的菌丝相对于小麦全蚀病菌野生型菌丝变细，且端部分枝明显减少。天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1的菌丝由多个菌丝紧紧的缠绕在一起，形成一个较粗的菌丝体向前延伸。经天名精内酯酮（100μg/mL）和过氧化氢（10mM）处理后，小麦全蚀病菌野生型菌株的菌丝由多个菌丝扭曲、缠绕在一起，且端部分枝减少。与对照相比，经天名精内酯酮和过氧化氢处理后的沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb和∆GgIsp的菌丝无显著变化。过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp的菌丝体与野生型菌株相比无显著差异，但经天名精内酯酮和过氧化氢处理87 后，过表达突变菌株的菌丝发生明显的断裂和扭曲等现象（图5-3）。图5-3菌株扫描电镜观察。小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1，∆GgCytb，∆GgIsp以及抗性菌株24-HN-1，和过表达突变菌株OECytc1，OECytb和OEIsp经天名精内酯酮（100μg/mL）和H2O2（10mM）处理后，菌丝端部观察。菌株在PDA培养基中生长4天。Bar,100μm。Figure5-3Mutantswithalteredsensitivityinhyphalgrowth.HyphaltipbranchingpatternsofACCC30310,∆GgCytc1,∆GgCytb,∆GgIsp,24-HN-1,OECytc1,OECytbandOEIspmutantsfollowingtreatmentwithcarabrone(100μg/mL)andH2O2(10mM)onPDAfor4day.Bar,100μm.88 5.2.4黑色素含量测定菌株黑色素含量通过天青A结合的方法测定。小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp和天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，以及过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp在PDB培养液中分别培养3、4、5、6、7天后测定其黑色素含量。结果显示，各个菌株在PDB中培养5天后，黑色素积累量达到最高，随着时间增加黑色素的含量慢慢开始趋于稳定。天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1产生的黑色素约140μg/mgD.W.显著高于其他菌株。其次为天名精内酯酮（100µg/mL）处理后的菌株，其与沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb和∆GgIsp的黑色素含量并无显著差异，约为120µg/mLD.W.。随后为过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp的黑色素含量约80μg/mgD.W.，而小麦全蚀病菌野生型菌株产生的黑色素较少约为70μg/mgD.W.（图5-4）。图5-4黑色素含量测定。C：天名精内酯酮（100µg/mL）；小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1，∆GgCytb，∆GgIsp以及天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，和过表达突变菌株OECytc1，OECytb和OEIsp的黑色素含量测定。菌株在PDB中培养。黑色素通过天青A结合的方法测定。误差为标准差，数据为三次试验的平均值。Figure5-4Thedeterminationofmelanin.C:Carabrone(100µg/mL);Thedeterminationofmelanininthewild-typestrainG.tritici,∆GgCytc1,∆GgCytb,∆GgIsp,24-HN-1,OECytc1,OECytbandOEIspmutants.ThestrainswereculturedinPDB.MelaninwasmeasuredbyAzureAbindingtohyphae.Errorbarsrepresentstandarddeviation(SD)andeachpointistheaverageoftriplicatecultures.89 5.2.5过氧化物酶和漆酶活性测定小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310以及突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp、24-HN-1、OECytc1、OECytb和OEIsp经天名精内酯酮（0、EC20、EC80）和抗霉素A（20μg/mL）处理后，分别测定其过氧化物酶活性。如图5-5A所示，天名精内酯酮EC20处理菌株后，ACCC30310、∆GgCytc1、OECytc1、OECytb和OEIsp的过氧化物酶活有一定程度的增加，而∆GgCytb、∆GgIsp、24-HN-1的过氧化酶活性与对照相比，无显著差异。天名精内酯酮EC80处理菌株后，ACCC30310、∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp、24-HN-1、OECytc1、OECytb和OEIsp的过氧化物酶活性均增加（约136、98、75、20、11、109、92和68%），可以看出∆GgIsp和24-HN-1的过氧化物酶活与天名精内酯酮EC20处理后的活性之间并无显著差异。抗霉素A（20μg/mL）处理菌株后，ACCC30310、∆GgCytc1、∆GgIsp、24-HN-1、OECytc1和OEIsp的过氧化物酶活显著增加（约80-140%），而OECytb的过氧化物酶增加了50%，沉默突变菌株∆GgCytb与对照相比无显著变化。如图5-5B所示，小麦全蚀病菌野生型菌株的漆酶活性为4.3U/mL。与野生型菌株相比，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp和天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1的漆酶活性显著受到抑制（约47，37，41和44%）。与小麦全蚀病菌野生型菌株相比，过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp的漆酶活性变化较小，并无显著差异。90 图5-5过氧化物酶和漆酶活性测定。（A）小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp以及天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，和过表达突变菌株OECytc1、OECytb、OEIsp经天名精内酯酮（0、EC20、EC80）和抗霉素A（20μg/mL）处理后的胞外过氧化物酶活性测定。（B）小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp以及天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，和过表达突变菌株OECytc1、OECytb、OEIsp漆酶活性测定，通过ABTS的氧化（加或者不加H2O2）在PDB培养液中培养。误差为标准差，数据为三次试验的平均值。Figure5-5Theactivityofextracellularperoxidaseandlaccase.(A)theextracellularperoxidaseactivityweremeasuredbyABTSoxidizingtestwithH2O2inwildtypestrain,∆GgCytc1,∆GgCytb,∆GgIsp,24-HN-1,OECytc1,OECytbandOEIspfollowingtreatmentwithcarabrone(control,EC20,EC80)andantimycinA(20μg/mL).(B)Laccaseactivityofwildtypestrain,∆GgCytc1,∆GgCytb,∆GgIsp,24-HN-1,OECytc1,OECytbandOEIspweremeasuredbyABTSoxidizingtestwithoutH2O2supplementedconditioninculturesgrowninPDB.Errorbarsrepresentstandarddeviation(SD)andeachpointistheaverageoftriplicatecultures.5.2.6突变菌株GgLac基因RT-PCR分析基因GgLac可能与小麦全蚀病菌的致病性有关，测定野生型菌株以及突变菌株GgLac基因mRNA的表达水平。试验表明，与野生型菌株相比，GgLac在沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp和天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1中的mRNA表达量显著下调，分别下调了30%、24%、28%和35%。与小麦全蚀病菌野生型菌株相比，GgLac在过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp中无显著变化（图5-6）。91 图5-6突变菌株GgLac基因的相对表达。通过RT-PCR测定基因GgLac在ACCC30310、∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp、24-HN-1、OECytc1、OECytb和OEIsp中的相对表达量。Figure5-6ExpressionofgeneGgLacinmutants.TherelativemRNAexpressionlevelsofGgLacintheACCC30310,∆GgCytc1,∆GgCytb,∆GgIsp,24-HN-1,OECytc1,OECytbandOEIsp.5.2.7线粒体呼吸链复合酶III活性测定小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310呼吸链复合体III的活性为61nmol/min/mg。与野生型菌株相比，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp和天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1呼吸链复合酶III的活性显著抑制（42，59，68和77%）；与野生型菌株相比，过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp呼吸链复合酶III的活性无显著变化。在离体条件下，与对照相比，天名精内酯酮EC20和EC80处理菌株后，ACCC30310、∆GgCytc1、∆GgCytb、OECytc1、OECytb和OEIsp呼吸链复合酶III的活性均降低（分别约30-45%和70-80%），而沉默突变菌株∆GgIsp和抗性菌株24-HN-1呼吸链复合酶III活性无显著变化。在离体条件下，抗霉素A（20μg/mL）处理菌株后，与对照相比，ACCC30310、∆GgCytc1、∆GgIsp、24-HN-1、OECytc1、OECytb和OEIsp呼吸链复合酶III的活性显著降低（约65-80%），而∆GgCytb与对照之间无显著差异（图5-7A）。在活体条件下，与对照相比，用天名精内酯酮EC20处理菌株后，ACCC30310、∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp、24-HN-1、OECytc1、OECytb和OEIsp呼吸链复合酶III的活性均升高（约32、47、38、16，9、14、14和11%）。在活体条件下，与对照相比，用天名精内酯酮EC80处理菌株后，ACCC30310、∆GgCytc1、∆GgCytb、OECytc1、OECytb和OEIsp呼吸链复合酶III的活性均降低（约61，44，32，46，51和51%），值得注意的是，24-HN-1和∆GgIsp呼吸链复合酶III的活性与对照相比无显著差异。在活体条件下，抗霉素A（20μg/mL）处理菌株后，与对照相比，ACCC30310、∆GgCytc1、∆GgIsp、24-HN-1、OECytc1、OECytb和OEIsp呼吸链复合酶III的活性显著降低（约50-65%），而∆GgCytb呼吸链复合酶III活性与对照相比无显著差异（图5-7B）。92 图5-7线粒体呼吸链复合酶III活性测定。（A）离体条件下小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp以及天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，和过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp经天名精内酯酮（0、EC20、EC80）和抗霉素A（20μg/mL）处理后呼吸链复合酶III的活性测定。（B）活体条件下菌株经天名精内酯酮（0、EC20、EC80）和抗霉素A（20μg/mL）处理后呼吸链复合酶III的活性测定。误差为标准差，数据为三次试验的平均值。Figure5-7TheactivityofmitochondrialrespiratorychaincomplexIII.(A)TheactivityofmitochondrialrespiratorychaincomplexIIIwasmeasuredwithcarabrone(control,EC20,andEC80)andantimycinA(20µg/mL)invitroinwildtypestrain,∆GgCytc1,∆GgCytb,∆GgIsp,24-HN-1,OECytc1,OECytbandOEIsp.(B)TheactivityofmitochondrialrespiratorychaincomplexIIIwasmeasuredwithcarabrone(control,EC20,andEC80)andantimycinA(20µg/mL)invivoinwildtypestrain,∆GgCytc1,∆GgCytb,∆GgIsp,24-HN-1,OECytc1,OECytbandOEIsp.Errorbarsrepresentstandarddeviation(SD)andeachpointistheaverageoftriplicatecultures.93 5.2.8菌株致病性及天名精内酯酮的活体抑菌活性测定通过显微电镜观察发现与对照小麦相比，小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp，天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，以及过表达突变菌株OECytc1、OECytb、OEIsp均能侵染小麦根部，使其发生病害，并且使小麦种子的发芽率、小麦苗高、根长等受到影响。与沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp和天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1相比，小麦全蚀病菌野生型菌株和过表达突变菌株OECytc1、OECytb、OEIsp能显著降低小麦幼苗苗高，根长和苗重（表5-2）。沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp以及24-HN-1能引起小麦根部变色，但并不明显，而ACCC30310、OECytc1、OECytb和OEIsp侵染小麦后，使小麦根部的颜色明显变为褐色，并导致根部坏死（图5-8）。结果显示，小麦全蚀病菌野生型菌株，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp，天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，以及过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp使小麦幼苗根部感病，感病面积分别为46.53，8.99，5.46，5.92，3.50，37.66，21.45和42.53%（表5-2）。小麦全蚀病菌野生型菌株和过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp侵染小麦后，使小麦根部发病较为严重，而沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp和天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1对小麦幼苗的致病性较弱（表5-2，图5-8）。同时，试验表明，天名精内酯酮（1000mg/L）处理后，对小麦全蚀病菌野生型菌株以及突变菌株均有很好的抑制作用，小麦的根部并无变色和坏死，对小麦有很好的保护和治疗效果与对照药剂三唑酮（150mg/L）处理之间无显著差异（图5-8）。94 表5-2小麦全蚀病菌野生型菌株与突变菌株对小麦的致病性测定Table5-2Pathogenicityofwild-typeandmutantstrainsofG.tritici菌株种子发芽率（%）苗高苗重根长根部感染面积（%）Rootareaaffected(%)StrainsSeedsgerminated(%)HeightofseedlingaSeedlingweightbRootLengthsa清水对照Uninfected73.33±3.85a36.83±2.02a0.50±0.08a21.00±2.08a0eACCC3031051.11±2.22c19.33±1.53f0.21±0.01c8.67±0.17e46.53±2.49a∆GgCytc157.78±4.44bc27.03±2.00d0.32±0.03b15.17±1.01c8.99±1.96d∆GgCytb55.56±4.44bc30.67±1.73bc0.36±0.03b18.33±1.30b5.46±0.62de∆GgIsp57.78±2.22bc28.67±1.53cd0.32±0.01b16.33±1.32bc5.92±0.42de24-HN-164.44±3.81ab31.17±0.76b0.33±0.02b15.33±0.73c3.50±0.31deOECytc153.16±1.78c24.27±0.64e0.27±0.01bc9.5±0.43de37.66±2.98bOECytb56.07±2.32bc25.20±0.49de0.30±0.02bc11.50±0.55d21.45±2.32cOEIsp52.49±1.58c22.67±1.10e0.26±0.02bc9.33±0.29de42.53±1.79ab注：a平均每个植株（cm）。b平均每个植株重量（g）。数据为三次试验的平均值±标准差。不同的小写字母代表有显著的差异（P<0.05）。aAverageperplant(cm).bAverageD.W.perplant(g).Datarepresentthemean±standarddeviation(SD)ofthreeindependentexperiments.Differentlowercaselettersindicatesignificantdifference(P<0.05).95 图5-8菌株致病性及天名精内酯酮的活体抑菌活性测定。小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp以及天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，和过表达突变菌株OECytc1、OECytb、OEIsp对小麦的致病力测定。Figure5-8Infectionassayswithwheatseedlings.Thepathogenicityofwildtypestrain(ACCC30310),∆GgCytc1,∆GgCytb,∆GgIsp,24-HN-1,OECytc1,OECytbandOEIspforwheat.5.2.9线粒体氧消耗速率测定经天名精内酯酮（0、EC20、EC80）和抗霉素A（20µg/mL）处理小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp，天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，以及过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp后，分别测定其线粒体96 氧消耗速率。如图5-9所示，天名精内酯酮EC20处理菌株后，所有菌株线粒体氧消耗速率均有一定程度的增加。结果表明，低浓度的天名精内酯酮对供试菌株线粒体电子传递链有一定刺激作用，因而启动旁路呼吸酶途径，导致线粒体氧消耗速率增加（Laties1982;VanlerbergheandOrdog2002）。与对照相比，天名精内酯酮EC80处理菌株后，小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb以及过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp的线粒体氧消耗速率显著降低，分别降低了约81，77，79，72，73和72%，而沉默突变菌株∆GgIsp和天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1线粒体呼吸链氧消耗速率无显著变化。抗霉素A是线粒体呼吸链复合体III的细胞色素b亚基上的抑制剂，即Qi抑制剂。抗霉素A（20µg/mL）处理菌株后，小麦全蚀病菌野生型菌株，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgIsp，天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，以及过表达突变菌株OECytc1、OECytb和OEIsp的线粒体氧消耗速率显著降低，分别降低了约95，90，92，57，92，93和90%；然而，用抗霉素A（20µg/mL）处理沉默突变菌株∆GgCytb后，与对照相比，∆GgCytb的线粒体氧消耗速率无显著变化（图5-9）。图5-9线粒体氧消耗速率测定。小麦全蚀病菌野生型菌株ACCC30310，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp以及天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1，和过表达突变菌株OECytc1、OECytb、OEIsp经天名精内酯酮（0、EC20、EC80）和抗霉素A（20µg/mL）处理后，测定菌株线粒体氧消耗速率。试验数据为三次试验的平均值±标准差。Figure5-9Ratesofmitochondrialrespiration.TheratesofmitochondrialrespirationweremensuratedbytheClark-typeoxygenelectrodeinwildtypestrain(ACCC30310),∆GgCytc1,∆GgCytb,∆GgIsp,24-HN-1,OECytc1,OECytbandOEIspfollowingtreatmentwithcarabrone(control,EC20andEC80)andantimycinA(20µg/mL).Barsrepresentmeanvalues±SDsofthreeindependentexperiments.97 5.3讨论5.3.1GgLac可能是供试菌株致病相关基因漆酶又称为对苯二酚氧化还原酶，或被称为大蓝色铜蛋白质或蓝色铜氧化酶，是一类广泛分布于自然界的酚类氧化酶。漆酶是在日本漆树分泌物中发现的一种含铜多酚氧化酶，氧化酚类、多酚、芳香胺和不同的非酚类底物。漆酶是蓝色含铜氧化酶家族的一部分，每种酶都以共价方式配位，与其各自的组氨酸和半胱氨酸结合在一起（Reinhammer1984）。目前，虽然对漆酶具体生理功能尚不完全了解，但有一些迹象表明漆酶参与了微生物的形态变化如真菌孢子发育、黑色素化以及木质素和腐殖质等复杂有机物的形成或降解（Dean1994;DehorterandBlondeau1992;FilipandPreusse1985;Thurston1994）。Salas等在1996年研究发现，在新型隐球菌Cryptococcusneoformans中，漆酶与黑色素形成有关，而黑色素缺失突变体的毒力比产黑色素菌株的弱。同时，证明了C.neoformans中漆酶基因CNLAC1对其毒力产生有极其重要作用（Salasetal.1996）。C.neoformans中漆酶被认为能催化某些儿茶酚胺的氧化生成醌类化合物，如脱羧多巴氯，然后自发地聚合成深棕色的黑色素类化合物，该色素可保护真菌免受宿主细胞的氮氧基氧化攻击。众所周知，黑色素是保护真菌免受环境压力，如紫外辐射、高温、抗菌药物以及溶解酶等（Fredericketal.1999）。在一些真菌中，病菌黑色素化是致病的必要条件（Salasetal.1996;Williamsonetal.1998），如稻瘟病菌Magnaporthegrisea以及一些炭疽病菌Colletotrichum（HowardandValent1996;Henson1999）。对于某些病原菌，缺失黑色素突变体仍然有能力在宿主中进行定植和破坏，因此黑色素并不是必需的毒力因子，（Fredericketal.1999;RehnstromandFree1996;Tanabeetal.2009;Zimmermanetal.1995）。LitvintsevaandHenson研究表明，漆酶可能有助于系统发育研究，如检测禾本科植物亚种、品种或菌株之间的细微差异，而传统的18SrRNA基因或其区域测序无法检测到这些差异（LitvintsevaandHenson2002）。烟曲霉Aspergillusfumigatus、中华根瘤菌Sinorhizobiummeliloti、板栗疫病Cryphonectriaparasitica、白腐病Heterobasidionannosum等的漆酶基因都与病原菌的致病力相关（詹旭2011）。在野生型小麦全蚀病菌G.tritici中，菌丝在PDA培养基中培养为褐色，其至少有三个不同的漆酶基因（Hensonetal.1999）。5.3.2GgCytc1、GgCytb和GgIsp对菌丝生长、黑色素含量、致病性有重要影响GgCytc1、GgCytb和GgIsp为线粒体呼吸链复合体III功能亚基细胞色素c1、细胞色素b和铁硫蛋白的基因，当基因被沉默后，会影响呼吸链电子传递以及三磷酸腺苷（ATP）的合成（Moghaddasetal.2008）。与小麦全蚀病菌野生型菌株相比，沉默突变体∆GgCytc1、∆GgCytb和∆GgIsp的菌丝生长速率明显受到抑制（约25%），且菌丝明显变细，端部分枝减少（图5-1、5-3）。相比于小麦全蚀病菌野生型菌株，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb和∆GgIsp对天名精内酯酮（100µg/mL）和H2O2（10mM）的敏感性降低（图98 5-2）。天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1的菌丝在生长过程中产生较多的黑色素，天名精内酯酮处理后的菌株以及沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb和OEIsp产生的黑色素含量次于抗性菌株，其次为过表达突变菌株OECytc1、OECytb和∆GgIsp，而小麦全蚀病菌野生型菌株则产生较少的黑色素（图5-4），这与文献报道结果一致，真菌黑色素是一种聚合色素保护菌株免受环境压力（BellandWheeler1986）。与野生型菌株相比，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp和天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1的漆酶活性显著降低（约47，37，41和44%）（图5-5B），漆酶活性降低可能会导致菌株毒力降低（Mendgenetal.1996;Kunzetal.1998）。在此基础上通过试验发现，沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp和天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1对小麦的致病力较弱且无显著差异，与漆酶活性是一致的（图5-8）。沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp的致病力较弱，一方面可能与漆酶的活性相关，另一方面可能是基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp沉默后，菌株呼吸链电子传递效率较低，能量供应不足，以致沉默突变菌株的致病力较弱。5.3.3天名精内酯酮对呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基有重要影响过氧化物酶是活性氧（ROS）的主要清洁剂，ROS主要由氧化磷酸化系统中分子氧的不完全还原产生（Muñozetal.2015;Sharmaetal.2012），其主要产生场所是线粒体呼吸链复合酶Ⅲ中泛醌的氧化位点（Boverisetal.1976;Cadenasetal.1977）。抗霉素A是呼吸链复合酶III细胞色素b抑制剂（Gaoetal.2002），经抗霉素A处理沉默突变菌株∆GgCytb后，其过氧化物酶活有一定的变化，但变化并不显著，推测∆GgCytb对抗霉素A不敏感。同样经天名精内酯酮EC80处理菌株后，∆GgIsp过氧化物酶活性变化亦不显著，而其他菌株的过氧化物酶活显著升高（约60-140%）（图5-5A），该结果与早期研究一致，当生物体受到生物或非生物胁迫时，会产生大量ROS，同时，过氧化物酶的活性被显著激活（Allen1995;Melonietal.2003），由此推测∆GgIsp对天名精内酯酮不敏感。大量证据表明，抑制剂处理有机体后或随着有机体年龄增加，线粒体氧消耗速率会明显的下降，同时线粒体复合体酶活也会发生显著变化（Fergusonetal.2005;Schwarzeetal.1998）。本研究结果与其一致，与对照相比，天名精内酯酮EC20处理菌株后，ACCC30310，∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp、OECytc1、OECytb和OEIsp的线粒体呼吸链氧消耗速率发生不同程度的增加，这与线粒体呼吸链复合酶III活体条件下的酶活结果一致，低浓度的天名精内酯酮能使线粒体氧化呼吸旁路启动。抗霉素A（20µg/mL）处理菌株后，ACCC30310，∆GgCytc1、∆GgIsp、24-HN-1、OECytc1、OECytb和OEIsp的线粒体氧消耗速率发生显著抑制（57%-95%），而沉默突变菌株∆GgCytb的线粒体氧消耗速率无显著变化，与文献报道一致，抗霉素A是线粒体呼吸链复合体III细胞色素b亚基的抑制剂（Gaoetal.2002;Kotiahoetal.2008）。天名精内酯酮EC80处理后，99 ACCC30310，∆GgCytc1、∆GgCyb、24-HN-1、OECytc1、OECytb和OEIsp的线粒体氧消耗速率发生显著抑制（57%-81%），而沉默突变菌株∆GgIsp的线粒体氧消耗速率无显著变化（图5-9）。因此，推测小麦全蚀病菌线粒体呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基是天名精内酯酮的潜在靶标之一。铁硫蛋白即为含有铁硫簇的蛋白，在生物中是最重要、最普遍的古老物质之一，是一类具有重要生物功能的金属酶，最主要的作用是呼吸链电子传递（XuandMøller2011）。铁硫蛋白的活性中心是含有一个或者多个铁硫簇，而不是血红素，铁硫簇的结构具有多样性，目前发现与铁硫蛋白中铁配位的最常见的是半胱氨酸，通过硫与蛋白质的半胱氨酸残基相连（图5-10），但是，除了半胱氨酸外，还有其他的氨基酸可以与铁发生配位作用，比如组氨酸连接[2Fe-2S]或者[4Fe-4S]，以及氧原子连接到[4Fe-4S]与铁配位（刘青2010）。本章节结果表明当铁硫蛋白亚基基因GgIsp沉默后，沉默突变菌株∆GgIsp对天名精内酯酮的敏感性显著降低，且呼吸链复合酶III活性也显著降低。与此同时，∆GgIsp的过氧化物酶和黑色素含量显著高于小麦全蚀病菌野生型菌株，表明∆GgIsp中有大量ROS积累，黑色素含量升高是菌株受到胁迫，自我保护的一种现象。天名精内酯酮（EC80）处理后，∆GgIsp氧消耗速率并无显著变化，而其他菌株的线粒体氧消耗速率显著受到抑制。试验表明∆GgIsp对天名精内酯酮并不敏感，因此，本研究推测天名精内酯酮可能与供试菌株呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基活性中心发生反应，导致铁硫蛋白活性中心坍塌，起不到传递电子的功能，从而使呼吸链电子传递受阻，呼吸链复合酶III活性降低，线粒体内ROS堆积，引起一系列氧化胁迫，最终线粒体释放凋亡因子，引起细胞死亡而达到抑菌目的。图5-10铁硫蛋白结构图（引自刘青2010）Figure5-10Thestructureofiron-sulferproteins5.4小结本研究以第四章中获得的GgCytc1、GgCytb和GgIsp沉默和过表达突变菌株为基础，测定其对天名精内酯酮的敏感性以及生理生化指标的变化，并与小麦全蚀病菌野生型菌100 株，天名精内酯酮抗性菌株24-HN-1进行比较。主要取得以下结论：（1）基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp对菌株的生长极其重要，基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp沉默后，菌株菌丝变细，端部分枝减少，菌丝生长速率缓慢；同时，沉默突变菌株对过氧化氢产生的氧化压敏感性显著的降低；沉默突变菌株∆GgIsp对天名精内酯酮的敏感性显著降低。（2）∆GgCytc1、∆GgCytb、∆GgIsp和24-HN-1的漆酶活性较低，致病力较弱。经天名精内酯酮处理后，∆GgIsp的过氧化物酶活性与对照相比无显著差异，而其余菌株的过氧化物酶活性显著升高。离体条件下，ACCC30310、OECytc1、OECytb、OEIsp、∆GgCytc1和∆GgCytb随着天名精内酯酮浓度增加，呼吸链复合酶III活性显著降低，∆GgIsp和24-HN-1呼吸链复合酶III的活性显著低于野生型菌株，且随着天名精内酯酮浓度增加，其酶活变化并不显著；活体条件下，天名精内酯酮EC20处理菌株后，菌株呼吸链复合酶III活性显著增加，EC80处理后，菌株呼吸链复合酶III活性降低，但∆GgIsp和24-HN-1呼吸链复合酶III活性无显著变化。表明，沉默突变菌株∆GgIsp对天名精内酯酮的敏感性较低。（3）天名精内酯酮（0、EC20、EC80）和抗霉素A（20µg/mL）处理菌株后，沉默突变菌株∆GgCytb对抗霉素A不敏感，由于抗霉素A作用于呼吸链复合酶III细胞色素b亚基。同时发现沉默突变菌株∆GgIsp对高浓度的天名精内酯酮（EC80）不敏感，因此，推测天名精内酯酮可能作用于呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基。101 第六章Cytc1、Cytb和ISP亚基的同源建模与分子对接利用分子对接方法预测化合物与靶标的结合是对杀菌剂抑菌机理的基础探索，同时，能够为杀菌剂先导化合物的设计提供指导。本章节主要以同源建模的方法预测小麦全蚀病菌线粒体呼吸链复合酶III细胞色素c1（Cytc1）和铁硫蛋白（ISP）亚基以及粗糙脉孢菌线粒体呼吸链复合酶III细胞色素b（Cytb）亚基的三维结构模型，以及对其三维结构模型的活性腔进行预测。同时，使用AutoDockTools1.5.6分子对接软件研究天名精内酯酮与其可能的作用靶标线粒体呼吸链复合酶IIICytc1、Cytb和ISP亚基之间的结合模式。6.1材料方法6.1.1供试材料供试化合物：天名精内酯酮（纯度>98%）由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供，其化学结构见图1-1。天名精内酯酮的三维结构已知，在NCBI的化合物数据库PubChemCompound（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound）搜索化合物名称下载相应三维结构模型文件。小麦全蚀病菌线粒体呼吸链复合酶III细胞色素c1亚基（Cytc1）氨基酸序列，来自NCBI（XP_009217267.1），其序列如下：MLAARCLRSAPTRAFPRNGALNTVKRSISSSSSGAAEASPRNLNIAAVASTAVAVGSAAWYYHLYGTTAHAMTPAEEGLHPTKYPWVHEQWFKTFDHQALRRGFQVYREVCASCHSLSRVPYRSLVGTILTVDEAKALAEENEYDTEPNDQGEIEKRPGKLSDYLPAPYPNDEAARFSNNGALPPDLSLIIKARHGGCDYVFSLLTGYPEEPPAGAQVGDGLNFNPYFPGTGIAMARVLYDDLVEYEDETPASASQMAKDVVEFLNWAAEPEMDDRKRMGFKVLVVTSALFAMSVWVKRYKWAYMKTRKITYDPPKAAGEETIRR粗糙链孢菌（Neurosporacrassa）线粒体呼吸链复合酶III细胞色素b亚基（Cytb）氨基酸序列，来自NCBI（ARK15004.1），其序列如下：MRLLKSHPLLKLVNSYLIDASQPSNISYLWNFGSLLACCLIIQIVTGVTLAMHYSPNVLEAFNSIEHIMRDVNNGWLVRYLHSNTASAFFFLVYLHIGRGMYYGSYRAPRTLVWAIGTVILILMMATAFLGYVLPYGQMSLWGATVITNLISAIPWIGQDIVEFIWGGFSVNNATLNRFFALHFVLPFILAALVLMHLIALHDTAGSSNPLGVSGNYDRITFAPYYLFKDLITIFIFIYVLSSFVFFMPNVLGDSENYIMANPMQTPPAIVPEWYLLPFYAILRSIPNKLLGVIAMFSAILAIMLLPITDLGRSKGLQFRPLSKFAFWAFVVNFLILMKLGACHVESPFIELGQFSTIFYFSYFIFIVPVLSLIENTLVDLNYLK小麦全蚀病菌线粒体呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基（ISP）氨基酸序列，来自NCBI102 （XP_009219480.1），其序列如下：MAPLTNATRALARSAVVPRCSSTAASAAPMARALSTTPAQNGSSSSTFSSPFRGETAGSKIPDWSKYLAPKSSQTANQVFSYFMVGTMGAISAAGAKSTVQEFLVNMSASADVLAMAKVEVDLNTIPEGKNVIIKWRGKPVFIRHRTPSEIEEANKVDVKALRDPQTDDDRVQKPEWLVMLGVCTHLGCVPIGEAGDYGGWFCPCHGSHYDISGRIRKGPAPLNLEIPAYDFPEDDKLIIG酵母（Saccharomycescerevisiae）线粒体呼吸链复合酶IIICytc1三维晶体构型：由蛋白质数据库（RCSB-PDB）获得（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do），其PDBID编号为：1kb9.1.D。其氨基酸序列如下：MFSNLSKRWAQRTLSKSFYSTATGAASKSGKLTQKLVTAGVAAAGITASTLLYADSLTAEAMTAAEHGLHAPAYAWSHNGPFETFDHASIRRGYQVYREVCAACHSLDRVAWRTLVGVSHTNEEVRNMAEEFEYDDEPDEQGNPKKRPGKLSDYIPGPYPNEQAARAANQGALPPDLSLIVKARHGGCDYIFSLLTGYPDEPPAGVALPPGSNYNPYFPGGSIAMARVLFDDMVEYEDGTPATTSQMAKDVTTFLNWCAEPEHDERKRLGLKTVIILSSLYLLSIWVKKFKWAGIKTRKFVFNPPKPRK酵母呼吸链复合酶IIICytb三维晶体构型：由蛋白质数据库获得，其PDBID编号为：1kb9.1.C。其氨基酸序列如下：MAFRKSNVYLSLVNSYVIDSPQPSSINYWWNMGSLLGLCLVIQIVTGIFMAMHYSSNIELAFSSVEHIMRDVHNGYILRYLHANGASFFFMVMFMHMAKGLYYGSYRSPRVTLWNVGVIIFILTIATAFLGYCCVYGQMSHWGATVITNLFSAIPFVGNDIVSWLWGGFSVSNPTIQRFFALHYLVPFIIAAMVIMHLMALHIHGSSNPLGITGNLDRIPMHSYFIFKDLVTVFLFMLILALFVFYSPNTLGHPDNYIPGNPLVTPASIVPEWYLLPFYAILRSIPDKLLGVITMFAAILVLLVLPFTDRSVVRGNTFKVLSKFFFFIFVFNFVLLGQIGACHVEVPYVLMGQIATFIYFAYFLIIVPVISTIENVLFYIGRVNK酵母呼吸链复合酶IIIISP三维晶体构型：由蛋白质数据库获得，其PDBID编号为：1kb9.1.E。其氨基酸序列如下：MLGIRSSVKTCFKPMSLTSKRLISQSLLASKSTYRTPNFDDVLKENNDADKGRSYAYFMVGAMGLLSSAGAKSTVETFISSMTATADVLAMAKVEVNLAAIPLGKNVVVKWQGKPVFIRHRTPHEIQEANSVDMSALKDPQTDADRVKDPQWLIMLGICTHLGCVPIGEAGDFGGWFCPCHGSHYDISGRIRKGPAPLNLEIPAYEFDGDKVIVG6.1.2试验方法6.1.2.1呼吸链复合酶IIICytc1、Cytb、ISP亚基同源建模序列比对：在NCBI数据库中对小麦全蚀病菌线粒体呼吸链复合酶IIICytc1和ISP以及粗糙脉孢菌线粒体呼吸链复合酶IIICytb亚基氨基酸序列进行比对，根据比对结果，103 选取同源率较高的酵母呼吸链复合酶IIICytc1、Cytb、ISP亚基作为模板。模型的构建：通过在线软件SWISS-MODEL（瑞士生物信息研究所研发https://www.swissmodel.expasy.org）进行目标蛋白Cytc1、Cytb和ISP三维结构模型的同源模建。具体的操作步骤如下：输入目标蛋白的氨基酸序列于在线软件SWISS-MODEL中，按照软件命令SearchforTemplates从已知的蛋白结构中搜索目标序列模板，选中同源性较高的模板，点击BuildModels建立目标蛋白的三维结构模型。模型的评估：利用在线软件SWISS-MODEL和SAVESv5.0（https://servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/）对小麦全蚀病菌线粒体呼吸链复合酶IIICytc1、ISP亚基以及粗糙脉孢菌呼吸链复合酶IIICytb亚基构建的三维结构模型的合理性和可信度进行评估。6.1.2.2呼吸链复合酶IIICytc1、Cytb、ISP亚基三维结构模型活性腔的确定天名精内酯酮与小麦全蚀病菌呼吸链复合酶IIICytc1和ISP亚基以及粗糙脉孢菌呼吸链复合酶IIICytb亚基进行对接前，需要对Cytc1、Cytb和ISP亚基三维结构模型的活性腔进行预测。在软件MolegroVirtualDocker中导入目的亚基的PDB结构，通过软件的活性腔预测功能DetectCavities预测靶标蛋白可能的活性位点，并将活性位点与前期盲接的结果进行对比，从而确定小分子化合物与靶标蛋白最合适的结合区域。在分子对接时，小分子会在此活性腔内尝试各种对接，以搜寻最好的结合模式。6.1.2.3天名精内酯酮与Cytc1、Cytb和ISP亚基三维结构模型的分子对接采用软件AutoDockTools对天名精内酯酮与呼吸链复合酶III亚基Cytc1、Cytb和ISP分别进行分子对接。准备受体：去掉Cytc1、Cytb和ISP三个靶标蛋白的水分子，之后进行加氢和加电荷，并计算电荷，设置原子格式并以PDBQT格式存储。准备配体：设置天名精内酯酮分子可扭转键保持柔性，添加氢和电荷，最后以PDBQT格式存储。准备参数文件：使用AutoGrid进行能量格点计算，根据预测的活性腔坐标文件设置GirdBox中心坐标Cytc1为-30.101，18.726，4.911，Cytb为235.122，277.368，239.662，ISP为14.911，14.911，30.082，盒子大小为50×50×50个网格点，每个小网格点的距离为0.0375nm。使用AutoDock搜索网格范围内受体，采用拉马克遗传算法进行构象搜索，初始种群数设置为150，能量评定最大次数为2500000，每个小分子配体都设定得到10个构象，其他参数选择默认值。分子对接计算：运行AutoGrid进行格点中相关能量的计算，运行AutoDock进行构象搜索，进行半柔性对接，评分函数为半经验的自由能计算方法。6.2结果与分析6.2.1模板蛋白序列的搜索同源建模中最重要的一个问题是模板的选择，主要涉及以下因素：目的蛋白与模板的同源性以及二者序列的一致性、模板长度、模板氨基酸残基的完整程度、有无配基、104 分辨率大小和来源物种等。根据在线软件SWISS-MODEL匹配出的结果，选择相似度最高的前五个模板如表6-1所示。依据目标蛋白Cytc1、Cytb和ISP的氨基酸序列，分别发现27、50和50条相似的模板信息。根据软件所分析的数据，其中亚基Cytc1模板ID为1kb9.1.D的序列，同源性达到65.31%，亚基Cytb模板ID为1kb9.1.C的序列，同源性达到60.74，亚基ISP模板ID为1kb9.1.E的序列，同源性达到69.06。表6-1使用SWISS-MODEL软件分析与Cytc1、Cytb和ISP亚基氨基酸序列相似的蛋白模板Table6-1ThesimilartemplatesmatchingofaminoacidsequenceofCytc1、CytbandISPsubunit.模板序列相似度（%）Oligo状态描述TamplateSequenceIdentity(%)OligoStateDescription1kb9.1.D65.31Hetero-11-merCytochromec1,hemeprotein1kyo.1.D65.31Hetero-23-merCytochromec1,hemeprotein1ezv.1.D65.31Hetero-20-merCytochromec11kb9.1.D65.02Hetero-11-merCytochromec1,hemeprotein1kyo.1.D65.02Hetero-23-merCytochromec1,hemeprotein3cx5.1.C61.01Hetero-23-merCytochromeb1kb9.1.C60.74Hetero-11-merCytochromeb5xte.1.I53.89Hetero-22-merCytochromeb3hli.1.C53.62Hetero-20-merCytochromeb1bcc.1.M53.62Hetero-20-mercytochromebUbiquinol-cytochromecreductase1kb9.1.E69.06Hetero-11-meriron-sulfursubunitCytochromebc1complexsubunitRieske,3h1k.1.O59.67Hetero-20-mermitochondrialCytochromebc1complexsubunitRieske,3h1i.1.E59.67Hetero-20-mermitochondrialCytochromebc1complexsubunitRieske,3h1k.1.E59.67Hetero-20-mermitochondrialCytochromebc1complexsubunitRieske,5gpn.17.A56.70monomermitochondrial6.2.2目的蛋白序列与模板蛋白序列的比对使用NCBI中的BLAST程序，将PDB数据库中已知的酵母线粒体呼吸链复合酶IIICytc1、Cytb和ISP亚基的氨基酸序列与目的亚基氨基酸序列进行比对，结果如图6-1105 所示。一般情况下，目的蛋白质与模板蛋白质的一级氨基酸序列同源性大于60%时，BLAST可以轻易识别出正确模板，且序列对比结果很好；当序列同源性大于25%而小于60%时，但仍在模糊区之上，BLAST仍能够有效地识别出正确的模板。通过BLAST发现，目的亚基氨基酸序列与酵母呼吸链复合酶IIICytc1（图6-1A）、Cytb（图6-1B）和ISP（图6-1C）的氨基酸同源性均高于60%。因此，基于酵母呼吸链复合酶IIICytc1、Cytb和ISP亚基（PDB：1kb9.1.D；1kb9.1.C；1kb9.1.E）为模板构建目的亚基三维结构是可行的。图6-1目的蛋白与模板蛋白序列比对。（A）小麦全蚀病菌复合酶IIICytc1亚基（GgCytc1）与酵母复合酶IIICytc1亚基（YcCytc1）序列比对。（B）粗糙脉孢菌复合酶IIICytb亚基（NcCytb）与酵母复合酶IIICytb亚基（YcCytb）序列比对。（C）小麦全蚀病菌复合酶IIIISP亚基（GgIsp）与酵母复合酶IIIISP亚基（YcIsp）序列比对。Figure6-1SequencealignmentoftargetsubunitCytc1,Cytb,ISPandtemplatesubunitinS.cerevisiae.(A)SequencealignmentofCytc1subunitofG.triticiandS.cerevisiae.(B)SequencealignmentofCytbsubunitofN.crassaandS.cerevisiae.(C)SequencealignmentofISPsubunitofG.triticiandS.cerevisiae.6.2.3三维模型的构建基于目的蛋白Cytc1、Cytb和ISP序列与模板蛋白序列的比对结果，以酵母呼吸链复合酶III亚基Cytc1（PDB：1kb9.1.D）、Cytb（PDB：1kb9.1.C）和ISP（PDB：1kb9.1.E）为模板，利用SWISS-MODEL程序构建了目的蛋白亚基Cytc1（图6-2A）、Cytb（图6-2B）106 和ISP（图6-2C）的三维结构模型。进一步以同源蛋白亚基三维结构重叠的方法比对酵母与目的亚基Cytc1（图6-3A）、Cytb（图6-3B）和ISP（图6-3C）的三维结构发现其结构十分相似。图6-2Cytc1、Cytb和ISP亚基模建的三维结构模型。（A）小麦全蚀病菌复合酶IIICytc1亚基模建的三维结构模型。（B）粗糙脉孢菌复合酶IIICytb亚基模建的三维结构模型。（C）小麦全蚀病菌复合酶IIIISP亚基模建的三维结构模型。Figure6-23DstructuremodelofsubunitCytc1,CytbandISP.(A)3DstructuremodelofCytc1subunitofG.tritici.(B)3DstructuremodelofCytbsubunitofN.crassa.(C)3DstructuremodelofISPsubunitofG.tritici.图6-3酿酒酵母与模建的目的亚基三维结构比对。（A）酿酒酵母与模建的小麦全蚀病菌Cytc1亚基三维结构比对。（B）酿酒酵母与模建的粗糙脉孢菌Cytb亚基三维结构比对。（C）酿酒酵母与模建的小麦全蚀病菌ISP亚基三维结构比对。其中绿色的三维结构为模建的目的亚基三维结构；红色为模板酿酒酵母亚基三维结构。Figure6-3StructurealignmentoftargetsubunitandtemplatesubunitofS.cerevisiae.(A)StructurealignmentofCytc1subunitofS.cerevisiaeandG.tritici.(B)StructurealignmentofCytbsubunitofS.cerevisiaeandN.crassa.(C)StructurealignmentofISPsubunitofS.cerevisiaeandG.tritici.Thegreenrepresentsthestructureoftargetsubunit,andtheredrepresentsthestructureofsubunitofS.cerevisiae.6.2.4模型评估通过软件SWISS-MODEL对目的亚基Cytc1、Cytb和ISP模建的三维模型进行评估。107 GMQE是一种来自目标模板对准结合性质的质量评估，其范围为0-1，越高越好。QMEAN是一个综合计分功能全局和局部模型的质量评估，其一般由4个结构描述：扭转角分布，成对原子距离依赖性电位，C-β相互作用，潜在溶合残留物的埋藏情况，其值一般在4以内，越贴近0最好。结果表明模建的Cytc1亚基三维结构GMQE值为0.69，QMEAN值为-0.68（图6-4A）；Cytb亚基三维结构GMQE值为0.79，QMEAN值为-3.60（图6-4B）；ISP亚基三维结构GMQE值为0.70，QMEAN值为-1.23（图6-4C）。其次，从表6-2中还可以看出，Cytc1序列同源性为65.31%，序列相似度为51%，建模的方法为X-ray，序列覆盖度为75%，分辨率为2.3Å。Cytb序列同源性为60.74%，序列相似度为49%，建模的方法为X-ray，序列覆盖度为98%，分辨率为2.3Å。ISP序列同源性为69.06%，序列相似度为53%，建模的方法为X-ray，序列覆盖度为75%，分辨率为2.3Å。这些结果均表明目的亚基Cytc1、Cytb和ISP模建的结果可靠。表6-2Cytc1、Cytb和ISP亚基三维结构模型所用模建模板的基本情况Table6-2FundamentalstateofmoldbuildingtemplateusedinthesubunitCytc1,CytbandISP序列相似Oligo搜索方序列相似性模板度状态式方法分辨率范围覆盖度描述SequenceTemplateSequenceOligoFoundMethodResolutionRangeCoverageDecriptionSimilarityIdentityStatebyhetero-Cytochrom1kb9.1.D65.31%BlastX-ray2.30Å0.5172-3160.7511-merec1Hetero-Cytochrom1kb9.1.C60.74%BlastX-ray2.30Å0.491-3780.9811-merebHetero-iron-sulfur1kb9.1.E69.06%BlastX-ray2.30Å0.5360-2410.7511-mersubunit108 图6-4Cytc1、Cytb和ISP亚基三维结构模建模型的质量评估。（A）小麦全蚀病菌线粒体复合酶IIICytc1亚基三维模建模型的质量评估。（B）粗糙脉孢菌线粒体复合酶IIICytb亚基三维模建模型的质量评估。（C）小麦全蚀病菌线粒体复合酶IIIISP亚基三维模建模型的质量评估。Figure6-4QualityevaluationofthemodelofsubunitCytc1,CytbandISP.(A)QualityevaluationofthemodelofG.triticicomplexIIIsubunitCytc1.(B)QualityevaluationofthemodelofN.crassacomplexIIIsubunitCytb.(C)QualityevaluationofthemodelofG.triticicomplexIIIsubunitISP.此外，通过在线模型评估软件SAVESv5.0中的Procheck程序对构建的小麦全蚀病菌线粒体复合酶IIICytc1和ISP亚基，以及粗糙脉孢菌呼吸链复合酶IIICytb亚基三维结构模建模型进行可靠性和合理性评估，结果如图6-5所示。Ramachandran图（拉氏图）可以直观的反映出目的亚基主链中氨基酸残基的二面角，从而对目的亚基氨基酸残基构象上的可行性进行衡量。在Ramachandran图中，φ（phi）和ψ（psi）分别表示肽链中一个肽单位α碳的右边C-C键旋转角度与α碳的左边C-N键旋转角度。一般来说，C-C键与C-N键都是可以自由转动的，但由于肽键的旋转会影响到其他残基的转动，因此，需要综合考虑蛋白质各个基团的作用力相互作用与空间的影响，Ramachandran图中也相应的显示出了构象上的氨基酸允许区域和不允许区域（冯明星2018）。从小麦全蚀病菌线粒体呼吸链复合酶IIICytc1和ISP亚基以及粗糙脉孢菌呼吸链复109 合酶IIICytb亚基三维结构模建评估结果来看，氨基酸残基主要聚集在-70与135度处，与目的亚基Cytc1、Cytb和ISP中存着大量的α螺旋和β折叠的结果一致（图6-5）。而且图中黄色、绿色和红色区域在空间构像中可以稳定存在。从图中可以看出，Cytc1亚基共有245个氨基酸残基，其中208个氨基酸残基处于核心区，13个氨基酸残基处于最大允许区，1个氨基酸残基处于一般允许区，只有一个氨基酸残基处于不允许区，分别占总氨基酸残基的92.8%，6.2%，0.5%和0.5%（图6-5A）。Cytb亚基共有378个氨基酸残基，其中314个氨基酸残基处于核心区，19个氨基酸残基处于最大允许区，0个氨基酸残基处于一般允许区，只有1个氨基酸残基处于不允许区，分别占总氨基酸残基的94.0%，5.7%，0.0%和0.3%（图6-5B）。ISP亚基共有183个氨基酸残基，其中135个氨基酸残基处于核心区，17个氨基酸残基处于最大允许区，1个氨基酸残基处于一般允许区，只有0个氨基酸残基处于不允许区，分别占总氨基酸残基的88.2%，11.1%，0.7%和0.0%（图6-5C）。表明三维结构模建尽管有存在不合理区域，但其所占比少于百分之一，从空间构象中来讲是可以稳定存在。因此，与SWISS-MODEL的评估结果一致小麦全蚀病菌呼吸链复合酶IIICytc1和ISP亚基以及粗糙脉孢菌呼吸链复合酶IIICytb亚基三维结构模建模型具有合理性和可靠性。图6-5应用SAVESv5.0软件对Cytc1、Cytb和ISP亚基三维结构模建模型进行质量评估。应用SAVESv5.0软件对小麦全蚀病菌呼吸链复合酶IIICytc1（A）、粗糙脉孢菌呼吸链复合酶IIICytb（B）和小麦全蚀病菌呼吸链复合酶IIIISP亚基三维结构模建模型进行质量评估。Figure6-5QualityevaluationofthemodelofsubunitCytc1,CytbandISPusingtheSAVESv5.0software.QualityevaluationofthemodelofG.triticicomplexIIIsubunitCytc1(A),N.crassacomplexIIIsubunit110 Cytb(B)andG.triticicomplxIIIsubunitISP(C)usingtheSAVESv5.0software.6.2.5Cytc1、Cytb和ISP三维结构活性腔的确定蛋白质的活性位点通常是蛋白质表面有一个可让底物结合和嵌入的凹陷或裂隙，底物通过不同的作用力与活性位点上氨基酸残基结合，如：氢键、范德华力、离子键或偶极-偶极等。例如，底物有可能通过氢键结合在丝氨酸残基上，也可通过范德华力结合在苯丙氨酸残基上，或通过离子键结合在天冬氨酸残基上。这些相互作用力必须足够大才能使底物在酶催化反应中与受体充分结合，一旦有产物生成，这些结合作用减弱以保证产物能解离出来。分子对接中要确定大分子的活性腔，如果不知道活性腔则可用盲接的方法，但可靠性较低。本研究利用MolegroVirtualDocker软件对小麦全蚀病菌呼吸链复合酶IIICytc1和ISP亚基，以及粗糙脉孢菌呼吸链复合酶IIICytb亚基三维结构模型进行活性腔预测。Cytc1亚基活性腔的预测结果如图6-6A所示，Cytb亚基活性腔的预测结果如图6-6B所示，ISP亚基活性腔的预测结果如图6-6C所示。111 图6-6Cytc1、Cytb和ISP亚基三维结构模型活性腔预测结果。小麦全蚀病菌呼吸链复合酶IIICytc1（A），粗糙脉孢菌呼吸链复合酶IIICytb（B）和小麦全蚀病菌呼吸链复合酶IIIISP（C）亚基活性腔预测结果。绿色为活性腔的结构域。Figure6-6Activitybindingsitemapsofthe3DmodelofsubunitCytc1,CytbandISP.Activitybindingsitemapsofthe3DmodelofcomplexIIIsubunit(A)Cytc1inG.tritici,(B)CytbinN.crassaand(C)ISPinG.tritici.Greenisthestructuraldomainofactivitycavity.6.2.6天名精内酯酮与Cytc1、Cytb和ISP亚基三维结构模型的分子对接使用软件AutoDockTools和Pymol分析天名精内酯酮与目的亚基Cytc1、Cytb和ISP的分子对接结果。选择天名精内酯酮结合于目的亚基结合能最低的构像进行分析，该能反映了配体与蛋白质之间结合的难易程度，结合能越小，相互作用能越小，表明配体和蛋白质越容易结合，形成的结构越稳定。如图所示，天名精内酯酮均进入了呼吸链复合酶III亚基Cytc1（6-7A），Cytb（6-7B）和ISP（6-7C）的活性口袋中。天名精内酯酮与目的亚基结合后模型放大，更能清楚看出天名精内酯酮分别位于呼吸链复合酶III亚基Cytc1（6-8A），Cytb（6-8B）和ISP（6-8C）的活性腔中。112 图6-7天名精内酯酮与Cytc1、Cytb和ISP亚基三维结构模型分子对接宏观图。（A）天名精内酯酮与小麦全蚀病菌复合酶IIICytc1亚基三维模型分子对接宏观图。（B）天名精内酯酮与粗糙脉孢菌复合酶IIICytb亚基三维模型分子对接宏观图。（C）天名精内酯酮与小麦全蚀病菌复合酶IIIISP亚基三维模型分子对接宏观图。红色的为天名精内酯酮。Figure6-7Flexibledockingprofileofcarabronewiththe3DmodelofsubunitCytc1,CytbandISP.(A)Flexibledockingprofileofcarabronewiththe3DmodelofG.triticicomplexIIIsubunitCytc1.(A)Flexibledockingprofileofcarabronewiththe3DmodelofN.crassacomplexIIIsubunitCytb.(C)Flexibledockingprofileofcarabronewiththe3DmodelofG.triticicomplexIIIsubunitISP.Theredisthecarabrone.图6-8天名精内酯酮与Cytc1、Cytb和ISP亚基三维结构模型分子对接局部放大图。（A）天名精内酯酮与小麦全蚀病菌复合酶IIICytc1亚基三维模型分子对接局部放大图。（B）天名精内酯酮与粗糙脉孢菌复合酶IIICytb亚基三维模型分子对接局部放大图。（C）天名精内酯酮与小麦全蚀病菌复合酶IIIISP亚基三维模型分子对接局部放大图。红色的为天名精内酯酮。Figure6-8Partialenlargeddrawingofflexibledockingofcarabronewiththe3DmodelofsubunitCytc1,CytbandISP.(A)Partialenlargeddrawingofflexibledockingofcarabronewiththe3DmodelofG.triticicomplexIIIsubunitCytc1.(B)Partialenlargeddrawingofflexibledockingofcarabronewiththe3DmodelofN.crassacomplexIIIsubunitCytb.(C)Partialenlargeddrawingofflexibledockingofcarabronewiththe3DmodelofG.triticicomplexIIIsubunitISP.Theredisthecarabrone.通过对天名精内酯酮与小麦全蚀病菌呼吸链复合酶IIICytc1和ISP亚基以及粗糙脉孢菌呼吸链复合酶IIICytb亚基分子对接模型结合能最低的构像以及与活性腔中氨基酸残基的结合进行分析。对于小麦全蚀病菌复合酶IIICytc1亚基三维结构模型活性腔来说，天名精内酯酮与Tyr200和Arg194产生氢键作用（图6-9A）。就粗糙脉孢菌复合酶IIICytb亚基三维结构模型活性腔来说，天名精内酯酮与Gly47和Gln43产生氢键作用113 （图6-9B）。而对于小麦全蚀病菌复合酶IIIISP亚基三维结构模型活性腔来说，天名精内酯酮与Leu225、Arg171、Gln166和Tyr230产生氢键作用（图6-9C）。由表6-3可知，天名精内酯酮与复合酶IIICytc1、Cytb和ISP亚基三维结构模型主要通过以下几种关键的氨基酸残基产生氢键作用，分别为酪氨酸（Tyr）、精氨酸（Arg）、甘氨酸（Gly）、谷氨酰胺（Gln）和亮氨酸（Leu）。天名精内酯酮与粗糙脉孢菌复合酶IIICytb的三维模型的结合能（-8.5kcal/mol）和抑制常数（0.59μM）较低，优于与小麦全蚀病菌复合酶IIICytc1和ISP亚基三维模型的结合。图6-9天名精内酯酮与Cytc1、Cytb和ISP亚基三维结构模型分子对接氨基酸残基分布图。（A）天名精内酯酮与小麦全蚀病菌复合酶IIICytc1亚基三维模型分子对接氨基酸残基分布图。（B）天名精内酯酮与粗糙脉孢菌复合酶IIICytb亚基三维模型分子对接氨基酸残基分布图。（C）天名精内酯酮与小麦全蚀病菌复合酶IIIISP亚基三维模型分子对接氨基酸残基分布图。红色的为天名精内酯酮。Figure6-9Aminoacidresiduesdistributionofflexibledockingofcarabronewiththe3DmodelofsubunitCytc1,CytbandISP.(A)Aminoacidresiduesdistributionofflexibledockingofcarabronewiththe3DmodelofG.triticicomplexIIIsubunitCytc1.(B)Aminoacidresiduesdistributionofflexibledockingofcarabronewiththe3DmodelofN.crassacomplexIIIsubunitCytb.(C)Aminoacidresiduesdistributionofflexibledockingofcarabronewiththe3DmodelofG.triticicomplexIIIsubunitISP.Theredisthecarabrone.表6-3天名精内酯酮与Cytc1、Cytb和ISP亚基三维结构模型的对接位点Table6-3DockingsiteofcarabronewiththemodelofsubunitCytc1,CytbandISP目的亚结合能抑制常数基化合物（kcal/mol）（μM）对接位点TargetCompoundsBindingenergyInhibconstantDockingsitesubunit(kcal/mol)(μM)Cytc1天名精内酯-7.881.67Tyr200，Arg194Cytb-8.5酮0.59Gly47，Gln43ISP-6.4Carabrone20.49Leu225，Arg171，Gln166，Tyr230114 6.3讨论目前，通过X射线晶体衍射和核磁共振等方法提供了大量蛋白质三维结构的信息，蛋白质三维结构的明确为进一步研究药剂与蛋白质分子的结合方式奠定基础。到目前为止，蛋白质数据库包含了120000多个具有原子分辨率的蛋白质的信息，数据量继续呈指数增长（Varfolomeevetal.2016）。当蛋白质的同源性高于30%时，称为同源蛋白，可能由共同的祖先进化而来。由于同源蛋白的三维结构相似且具有类似的功能，且功能区的序列高度保守，可以利用已知三维结构的同源蛋白通过同源模建，借助计算机辅助分子模拟，预测目的蛋白的三维结构模型（Kriegeretal.2003）。分子对接是通过目的蛋白质特征以及蛋白质和药物之间的相互作用方式来预测其结合模式，以及进行药物设计的一种理论模拟方法。近二十年来，分子对接已成为计算机辅助药物研究领域的一项重要技术。对接模拟有两种基本方法：一种是探索系统可用构象空间的搜索方法，另一种是评估每一构象的能量学的力场。考虑到将计算工作量降到最低的愿望，这两个元素之间有一种权衡。研究者可以选择使用高度复杂的力场，而只搜索构象空间的一小部分，采用分子动力学和自由能微扰等方法，利用物理上的能量函数与全原子模拟相结合的方法，对分子过程的能量学进行精确的估计（Wangetal.2001）。然而，这些方法目前计算量太大，不允许蛋白质配体盲目对接，计算对接通常是通过使用更简单的力场和探索更宽的构象空间来实现的，这是AutoDock软件和其他计算性对接方法所采用的方法，它们可以预测结合构象，而不需要事先知道蛋白质活性腔的位置（Halperinetal.2010;Tayloretal.2002）。经验自由能力场定义了配体-蛋白质相互作用的简单功能形式，半经验自由能力场是传统分子力学力场与经验重量或经验泛函形式相结合的产物（Tayloretal.2002;BrooijmansandKuntz2003）。这些力场提供了一种基于经验记分对潜在抑制剂候选态或束缚态进行排序的快速方法。在某些情况下，这个分数可以被校准以得到束缚自由能的估计值。AutoDock使用分子力学的方法来评估焓的贡献，如分散/斥力和氢键，并用经验方法来评估溶胶和构象迁移率变化的熵贡献。基于对一组已知结合常数的校准，将经验权重应用于每个组件，最后的半经验力场被设计成一个结合常数的估计。本章研究主要通过已知的酵母线粒体呼吸链复合酶IIICytc1、Cytb和ISP亚基的三维结构为模板，对小麦全蚀病菌线粒体复合酶IIICytc1和ISP亚基以及粗糙脉孢菌线粒体复合酶IIICytb亚基进行同源模建，获得可靠稳定的三维模型。通过软件AutoDockTools对小麦全蚀病菌复合酶IIICytc1和ISP亚基，以及粗糙脉孢菌复合酶IIICytb亚基三维结构模型的活性腔进行预测，并将天名精内酯酮与目的亚基活性腔进行分子对接。根据分子对接后三维结构模型的结合能以及抑制常数等对其进行评估，天名精内酯酮与目的亚基三维结构模型的分子对接结果可靠性较高。天名精内酯酮对粗糙脉孢菌线粒体复合酶IIICytb亚基的结合能较低（-8.5kcal/mol），且抑制常数也较低（0.59μM），115 表明天名精内酯酮对Cytb亚基的结合性较好。通过进一步分析发现，天名精内酯酮与Cytb亚基结合的位点为醌的还原位点（Qi），在该结合位点的抑制剂有抗霉素A（Gaoetal.2002）等。天名精内酯酮与小麦全蚀病菌呼吸链复合酶IIIISP亚基的结合较差，一种可能是天名精内酯酮与ISP的结合确实较差，该化合物不作用在ISP亚基上，而另一种可能是在生物体中ISP以移动穿梭机制存在，分子对接时，ISP的三维结构并没有发生移动穿梭等机制（Iwataetal.1998）。总的来说，小麦全蚀病菌线粒体复合酶IIICytc1和ISP亚基以及粗糙脉孢菌线粒体复合酶IIICytb亚基三维结构活性腔中的8个氨基酸残基（Tyr200、Arg194、Gly47、Gln43、Leu225、Arg171、Gln166和Tyr230）为天名精内酯酮抑菌活性的重要结合位点。6.4小结本章主要对小麦全蚀病菌线粒体复合酶IIICytc1和ISP亚基以及粗糙脉孢菌线粒体复合酶IIICytb亚基同源模建以及与天名精内酯酮进行分子对接，主要得到以下结论：（1）通过已知酵母（S.cerevisiae）线粒体复合酶IIICytc1、Cytb和ISP亚基三维结构模型为模板，借助在线软件SWISS-MODEL对目的亚基Cytc1、Cytb和ISP进行同源模建，并对模建的三维结构模型进行评估，结果表明Cytc1、Cytb和ISP亚基三维结构模型稳定性较高。（2）预测目的亚基Cytc1、Cytb和ISP三维结构模型的活性腔，并与天名精内酯酮进行对接，且评价对接后三维结构模型的结合能和抑制常数，结果表明天名精内酯酮与目的亚基Cytc1、Cytb和ISP分子对接可靠性较高。通过分子对接预测目的亚基Cytc1、Cytb和ISP三维结构模型活性腔的8个氨基酸残基（Tyr200、Arg194、Gly47、Gln43、Leu225、Arg171、Gln166和Tyr230）可能是天名精内酯酮抑菌作用的重要位点。116 第七章讨论与结论7.1讨论7.1.1呼吸链复合酶III是天名精内酯酮的潜在靶蛋白之一课题组前期通过荧光示踪法、免疫荧光法以及免疫胶体金法亚细胞定位等研究发现，天名精内酯酮在供试菌株中作用的细胞器为线粒体（Wangetal.2018）。本研究测定天名精内酯酮与线粒体呼吸链旁路呼吸抑制剂SHAM有显著增效作用，表明天名精内酯酮对供试菌株呼吸链有显著抑制作用。在此基础上，测定天名精内酯酮处理浓度和时间与供试菌株呼吸链复合酶III、I+III、II+III活性近似成负相关，而呼吸链其他酶变化并不显著。进一步通过RT-PCR测定供试菌株呼吸链复合酶III基因对天名精内酯酮较为敏感。上述结果表明供试菌株呼吸链复合酶III是天名精内酯酮的潜在靶蛋白之一。线粒体呼吸链复合酶III是产生ROS的主要场所（Mulleretal.2004），试验测定天名精内酯酮处理供试菌株后，线粒体ROS显著升高，引起线粒体内一系列氧化胁迫，直接导致线粒体发生病变，最终引起菌株细胞凋亡，这也再次证实了呼吸链复合酶III是天名精内酯酮的潜在靶蛋白之一（王兰英2018）。目前为止，呼吸链复合酶III的抑制剂较多，尤其是甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是杀菌剂的一个里程碑。就作用位点来说呼吸链复合酶III的抑制剂主要分为两种类型即细胞色素b亚基上醌的氧化位点（Qo）和醌的还原位点（Qi）抑制剂，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂为Qo位点抑制剂，抗霉素A为Qi位点抑制剂（Kotiahoetal.2008）。天名精内酯酮的化学结构与已报道的呼吸链复合酶III的抑制剂结构并不属于同一类化合物，因此，天名精内酯酮对呼吸链复合酶III的作用位点可能不同于已知的抑制剂。7.1.2天名精内酯酮与抗霉素A可能作用于复合酶III的不同亚基本研究明确天名精内酯酮与水杨肟酸的增效作用，发现天名精内酯酮对线粒体呼吸链有显著抑制作用。测定线粒体呼吸链复合酶活性和相关基因实时定量PCR，表明线粒体呼吸链复合酶III对天名精内酯酮较为敏感。因此，推测天名精内酯酮主要抑制小麦全蚀病菌线粒体呼吸链复合酶III的活性，使呼吸链电子传递受阻而产生抑菌作用。在酶活和实时定量PCR试验基础上，本研究进一步对小麦全蚀病菌线粒体呼吸链复合酶III功能亚基基因细胞色素c1（GgCytc1），细胞色素b（GgCytb）和铁硫蛋白（GgISP）进行沉默和过表达载体的构建并获得沉默和过表达突变菌株。通过对小麦全蚀病菌野生型菌株和突变菌株进行生理生化指标测定，发现沉默突变菌株∆GgIsp对天名精内酯酮的敏感性显著降低，而OEIsp对天名精内酯酮极为敏感。天名精内酯酮EC80处理后，∆GgIsp的呼吸链复合酶III活性以及线粒体氧消耗速率无显著变化。表明小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基对天明精内酯酮较为敏感。因此，推测天名精内酯酮极117 有可能与靶标菌呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基活性中心发生反应，铁硫蛋白亚基失活，进一步使靶标菌的电子传递链受阻而达到抑菌作用。关于抗霉素A的作用机理目前较为清楚，其主要是抑制生物体呼吸链复合酶III的细胞色素b亚基（Qi抑制剂），进而抑制线粒体呼吸链而影响氧化磷酸化及ATP的形成。本研究通过用抗霉素A为阳性对照，发现小麦全蚀病菌线粒体呼吸链复合酶III对抗霉素A和天明精内酯酮较为敏感有类似的抑制作用。用抗霉素A和天名精内酯酮处理沉默突变菌株∆GgCytc1、∆GgCytb和∆GgIsp后，突变菌株呼吸速率有一定的差异。抗霉素A对沉默突变菌株∆GgCytb的线粒体氧消耗速率无显著抑制作用，而天名精内酯酮对沉默菌株∆GgIsp的线粒体氧消耗速率无显著抑制作用，表明抗霉素A和天名精内酯酮对线粒体呼吸链复合酶III均有一定程度的抑制作用，但是作用于呼吸链复合酶III的不同亚基。7.1.3铁硫蛋白亚基是天名精内酯酮潜在靶标之一在牛心呼吸链复合酶III三维晶体结构中，无抑制剂存在时，铁硫蛋白亚基靠近细胞色素c1，而当抑制剂如标桩菌素或者粘噻唑存在的情况下，铁硫蛋白亚基靠近细胞色素b亚基血红素b566的位置。标桩菌素是复合酶IIIQo位点抑制剂，其主要通过两个氢键分别与细胞色素b和铁硫蛋白亚基结合，一个是其4位的羰基氧与铁硫蛋白亚基中的His181以氢键结合，另一个是其8位的羟基与细胞色素b亚基中Glu272以氢键结合。粘噻唑以及其他甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂亦是呼吸链复合酶IIIQo位点抑制剂，其也是主要通过两个氢键分别与复合酶III细胞色素b和铁硫蛋白亚基结合（闫晓静等2006）。由上述可知，复合酶III铁硫蛋白亚基是一个较活跃，重要的杀菌剂靶点。铁硫蛋白亚基在生物体中有一个显著的特性即通过移动穿梭机制进行电子传递（Xiaetal.1997），这也可以解释在分子对接结果中，天名精内酯酮对铁硫蛋白亚基的结合性并不是很好，而与细胞色素b亚基的结合较好。本研究采用RNAi和过表达技术对供试菌株呼吸链复合酶III功能亚基基因GgCytc1、GGCytb和GgIsp进行沉默和过表达并对获得的突变菌株进行生理生化指标比较。通过试验发现沉默突变菌株∆GgIsp对天名精内酯酮的敏感性显著降低，其呼吸链复合酶III的活性显著下降，而过表达突变菌株OEIsp对天名精内酯酮极为敏感。天名精内酯酮EC80处理后，∆GgIsp呼吸链复合酶III活性以及线粒体氧消耗速率无显著变化。结果表明，复合酶III铁硫蛋白亚基对天名精内酯酮较为敏感，是其潜在的靶标之一。天名精内酯酮极有可能作用于供试菌株呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基。7.1.4天名精内酯酮抑菌机制推测经课题组前期的研究发现，天名精内酯酮对小麦全蚀病菌的生物氧化有显著抑制作用，接着通过亚细胞定位发现天名精内酯酮作用的细胞器为线粒体，进而对线粒体呼吸链复合酶活性测定，虽然天名精内酯酮对呼吸链复合酶I、II、III和IV均有一定的抑制118 作用，但是对供试菌株呼吸链复合酶III活性的抑制作用较为显著（许丹2011;Wangetal.2017;2018）。与此同时，天名精内酯酮处理供试菌株后，线粒体内的ROS含量显著的升高（杨春白云2016），有研究者认为呼吸链复合酶III是线粒体中ROS的主要产生场所（Boverisetal.1976），再次证实了呼吸链复合酶III对天名精内酯酮较为敏感，是其潜在靶蛋白之一。因此，本研究在明确了呼吸链复合酶III对天名精内酯酮较为敏感的基础上，对呼吸链复合酶III的基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp进行沉默和过表达并获突变菌株。通过对菌株生理生化指标测定表明铁硫蛋白亚基沉默突变体对天名精内酯酮并不敏感，高浓度的天名精内酯酮（EC80）处理菌株后，铁硫蛋白亚基沉默突变体的线粒体氧消耗速率并没有发生显著抑制。因此，推测供试菌株呼吸链复合酶III的铁硫蛋白亚基对天名精内酯酮较为敏感，极有可能是天名精内酯酮潜在作用位点之一。铁硫簇是铁硫蛋白的活性中心，最常见的是[2Fe2S]和[4Fe4S]，含有铁硫簇的蛋白称为铁硫蛋白（图5-10）。目前，已经发现超过120种铁硫蛋白，其参与线粒体的电子传递、催化作用以及对基因表达的调控等作用，但是最主要功能为参与线粒体电子传递（XuandMøller2011）。研究发现在真核生物中，铁硫簇在细胞中有两条合成途径，分别在线粒体和细胞质中进行合成铁硫簇，其中，铁硫簇合成的最主要的途径是在线粒体中进行，并且其生物合成过程具有高度的保守性（Amelaetal.2013）。在人细胞中发现数十种铁硫蛋白，分布在线粒体内的有呼吸链复合酶I（8个铁硫中心）、复合酶II（3个铁硫中心）、复合酶III（1个铁硫中心）、铁氧化还原蛋白、硫辛酸、生物素合成酶以及顺乌头酸酶，但其中参与呼吸链电子传递的只有呼吸链复合酶I、II和III中的铁硫蛋白。H+H+CytcH+FMNCytc1Cytbe-hemeaCys-SSS-CysCys-SSS-Cyshemea-CuBFeFeFeXFe3Cys-SXSS-Cyse-Cys-SSS-CysCIVCVCICIII-H+Qe1/2O+2H+HO22HTCA2ScyclePODROS+S+H2O--+SODFADeO2+2HH2O2+O2Cys-SSS-CysCATFeFecaspaseXHO-Cys-SSS-CysH2O+O2CII线粒体基质线粒体凋亡膜间隙图7-1天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体作用机理推测Fig.7-1SupposedschemeofmechanismofcarabroneagainstmitochondrialinG.tritici因此，如图7-1所示，天名精内酯酮极可能与靶标菌呼吸链复合酶I、II和III中的铁硫蛋白活性中心发生反应，导致铁硫蛋白活性中心坍塌而失去传递电子的功能，进而使线粒体内ROS积累，过氧化物酶活性升高、引起靶标菌一系列氧化胁迫，最终线粒119 体释放凋亡因子引起靶标菌死亡而达到抑菌作用。线粒体呼吸链电子传递有两条途径，电子从复合酶I→复合酶III→复合酶IV或者从复合酶II→复合酶III→复合酶IV最后传递给氧。这与第二章的结果一致，天名精内酯酮处理靶标菌后，发现呼吸链复合酶I、II和III活性都有不同程度的抑制，然而，复合酶III活性降低最为显著。再者，靶标菌体内铁硫簇很多，为什么天名精内酯酮只与呼吸链复合酶中的铁硫簇活性中心发生反应呢？笔者通过查阅文献发现，其一，虽然靶标菌细胞质和线粒体中均含有铁硫簇，但是线粒体是铁硫簇的主要活动场所。虽然细胞质和线粒体中都可以合成铁硫蛋白，但是细胞质中合成铁硫蛋白的某些物质，还是在线粒体中合成并转运到细胞质中，如在线粒体中合成铁硫蛋白过程会产生一种含硫复合物（X-S），现已证实，X-S被运输载体转运到细胞质中，并调控胞质中铁硫蛋白的合成（Molina-Navarroetal.2006;Uzarskaetal.2013;郑华珍等2015）。其二，铁硫蛋白最主要的功能是在呼吸链中起着电子传递作用，其铁离子通过在Fe2+和Fe3+间互相转换进行电子的传递（VenkateswaraandHolm2004），并且其在生物体中进行电子传递时不断的进行移动穿梭。笔者推测铁硫蛋白在进行电子传递时，在Fe2+和Fe3+之间转换过程中可能有某一个不稳定态，或者在其移动穿梭过程中的某一个构像与天名精内酯酮发生反应。这就可以解释靶标菌的细胞质和线粒体中均有铁硫蛋白的分布，而天名精内酯酮只作用于线粒体中。7.2主要结论本文通过天名精内酯酮对小麦全蚀病菌呼吸链的作用机制研究，主要进行以下试验：天名精内酯酮与SHAM对靶标菌线粒体呼吸链的增效作用、靶标菌线粒体呼吸链复合酶活性测定以及相关复合酶基因实时荧光定量PCR，比较了天名精内酯酮和抗霉素A对供试菌株呼吸链复合酶III的影响。随后，利用RNAi、过表达技术以及同源模建与分子对接等进一步明确天名精内酯酮对靶标菌呼吸链复合酶III功能亚基的影响，主要得到以下结论：（1）天名精内酯酮与SHAM有显著增效作用，表明天名精内酯酮对小麦全蚀病菌线粒体呼吸链有显著抑制作用。（2）天名精内酯酮处理浓度和时间与靶标菌呼吸链复合酶III、I+III、II+III活性成负相关，且复合酶III基因GgCyc对天名精内酯酮较为敏感，表明小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III对天名精内酯酮较为敏感，是其潜在靶蛋白之一。（3）抗霉素A与天名精内酯酮的作用机理不一致，可能作用于靶标菌呼吸链复合酶III的不同亚基。（4）基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp对菌株的生长极其重要，当基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp沉默后，菌株的菌丝变细、端部分枝减少、菌丝的生长速率缓慢、对过氧化氢产生的氧化压敏感性显著的降低、漆酶活性降低、致病力较弱。沉默菌株∆GgIsp对天名精内酯酮的敏感性显著降低，EC50为156.18μg/mL，过表达菌株OEIsp对天名精120 内酯酮极敏感EC50为25.88μg/mL。（5）沉默突变菌株∆GgIsp呼吸链复合酶III活性较低，天名精内酯酮EC80处理后，其呼吸链复合酶III活性以及线粒体氧消耗速率无显著变化，即∆GgISP对天名精内酯酮并不敏感，推测复合酶III铁硫蛋白亚基是天名精内酯酮的潜在靶标之一。（6）本研究推测天名精内酯酮的抑菌机理为：天名精内酯酮主要进入供试菌株线粒体中，并与呼吸链复合酶III中铁硫蛋白亚基发生反应，显著抑制复合酶III活性，使呼吸链电子传递受阻，线粒体ROS堆积，引起病菌一系列氧化胁迫，最终线粒体释放凋亡因子，引起细胞凋亡而达到抑菌作用。7.3本研究创新点（1）本研究明确天名精内酯酮对呼吸链有显著抑制作用。（2）本研究初步明确呼吸链复合酶III铁硫蛋白亚基是天名精内酯酮靶标之一。（3）本研究对小麦全蚀病菌进行遗传转化体系的构建和优化，并利用RNAi和过表达技术首次对小麦全蚀病菌呼吸链复合酶III基因GgCytc1、GgCytb和GgIsp进行沉默和过表达，为小麦全蚀病菌突变菌库的构建奠定基础。7.4有待进一步解决的问题（1）与潜在靶蛋白亚基相关性分析（微量热泳动分析）本论文以小麦全蚀病菌为供试菌株，初步研究了天名精内酯酮对供试菌株呼吸链的抑菌机制。还需要大量的试验来明确天名精内酯酮与潜在靶标的相互作用。下一步可以利用微量热泳动技术检测由于结合而引起的生物分子的大小、电荷和水化层的变化以及蛋白-蛋白之间的相互作用。（2）与潜在靶蛋白亚基晶体制备与分析本研究中并未对呼吸链复合酶III以及其与天名精内酯酮结合的晶体结构进行分离。在今后研究中，可以尝试对天名精内酯酮与靶蛋白结合的晶体结构进行分离纯化，得到药剂与蛋白晶体结构，进一步验证天名精内酯酮对供试菌株的抑菌机制。121 参考文献程华,聂忍,汪万强,黄琳,刘科,陈宬等.2017.抗霉素A结构改造的研究进展.有机化学,37(6),1368-1381.冯俊涛.2006.大花金挖耳杀菌作用研究.[博士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.冯俊涛,张亚梅,王俊儒,张兴.2007.天名精内酯酮衍生物合成及其抑菌活性.农药学学报,9(2),185-188.冯明星.2018.杠柳新苷类杀虫活性化合物作用靶标的鉴定和验证.[博士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.高照良,商鸿生.1999.小麦全蚀病发病因素研究进展.麦类作物学报,19(6),63-65.谷超.2014.天名精内酯酮荧光标记物的合成及其在小麦全蚀病菌中的初步定位.[硕士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.葛永辉,张婕,刘开兴,向章敏,耿召良.2013.垂序商陆抗烟草花叶病毒活性物质提取及分离.农药,52(9),680-683.韩兴帅,许丹,冯俊涛,张兴.2014.天名精内酯酮的抑菌活性.西北农林科技大学学报（自然科学版）,42(8),178–184.韩建华.2002.植物源抑菌活性物质初步研究.[硕士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.黄奔立,朱华,顾艳,许云东,沈明星,陆长婴.2006.中草药对5种蔬菜病菌的抑制作用.扬州大学学报(农业与生命科学版),27(3),84-86.胡岩,段天璇,曹枫,于继平,黄建梅.2010.八角科植物果皮化学成分的LC-MS图谱特征及其在分类和药材鉴别上的意义.中国中药杂志,35(14),1836-1839.何秀玲,张一宾.2013.甲氧基丙烯酸酯类和酰胺类杀菌剂品种市场和抗性发展情况.世界农药,35(3),14-19.黄亚丽,叶婧,蒋细良,朱昌雄.2007.真菌遗传转化系统的研究进展.微生物学通报,34(6),1213-1217.金丽华,陈长军,王建新,陈雨,周明国.2007.嘧菌酯及SHAM对4种植物病原真菌的活性和作用方式研究.中国农业科学,40(10),2206-2213.刘清华,杨峻山,索茂荣.2007.斑鸠菊属的倍半萜内酯类及甾体皂苷类化学成分及药理活性研究进展.中国中药杂志,32(1),10-17.刘青.2010.高氧化还原电位铁硫蛋白铁硫簇结构稳定性的研究.[硕士学位论文].长沙:中南大学.李昌灵,牛友芽,刘胜贵.2008.夹竹桃叶提取物的抑菌作用研究.安徽农业科学,36(2),575-577.李白沙,张柳霞,张新忠,韩振海,王忆.2014.山定子遗传转化体系的优化.农业生物技术学报,22(3),265-272.刘志祥,曾超珍,张映辉.2009.穿心莲提取物体外抗菌活性及稳定性的研究.北方园艺,2009(1),105-106.王树桐,曹克强,胡同乐,甄文超,付忠仿.2004.对番茄灰霉病菌有抑菌活性的丁香和细辛提取物提取条件研究.河北农业大学学报,27(1),69-72.王箐霞.2007.大花金挖耳茎叶杀菌活性成分研究.[硕士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.王艳梅.2009.天名精内酯酮对5种植物病害的药效及对小麦全蚀病菌生长发育的影响.[硕士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.122 王兰英.2018.天名精内酯酮在小麦全蚀病菌内亚细胞定位及对菌体细胞凋亡的诱导.[博士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.王毅.2002.荷花玉兰中的广木香内酯通过抑制IKB的磷酸化而抑制NF-КB.国际中医中药杂志,24(1),27-28.汪浩,赖多,徐汉虹.2012.RNA干扰在害虫防治和杀虫剂靶标筛选中的应用前景.世界农药,34(3),16-22.许丹.2011.天名精内酯酮抑菌机理初步研究.[硕士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.闫蕾蕾,韩宁宁,何琪杨,陈杰,阳素娥,刘少伟等.2011.新天然来源抗生素-抗霉素A18的抗肿瘤活性及其产生菌107a-01824的生物学特征.中国抗生素杂志,36(4),269-275.闫晓静,金淑惠,陈馥衡,王道全.2006.Strobilurin类杀菌剂作用靶标的研究进展.农药学学报,8(4),299-305.杨维,朱洁,戴贤君.2014.旁路氧化抑制剂对2种strobilurin类杀菌剂的增效作用.农药,53(6),439-441.杨茜.2012.金沸草含量测定以及倍半萜内酯类成分的药动学研究.[硕士学位论文].上海:第二军医大学.杨春白云.2016.2种内酯类化合物对2种植物病原菌生理生化指标的影响.[硕士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.杨永青,伍贻康.2006.抗霉素合成概览.有机化学,26(10),1370-1378.于宏伟,刘会茹,常永芳,王景翔,谷维娜,苗瑞.2009.植物源农药的研究进展.安徽农业科学,37(16),7550-7551.余伯阳,蔡金娜.1991.蛇床子质量的研究—抗菌作用的比较.中国药科大学学报,16(8),451-453.郑华珍,赵炜,刘新光.2015.铁硫蛋白的生物合成及相关疾病.中国生物化学与分子生物学报,31(6),566-574.周宝利,尚淼,孟思达,陈志霞,李兴宝,李沛瑶.2012.蛇床子提取物对番茄灰霉病菌的抑制效果.西北农业学报,21(2),137-141.詹旭.2011.玉米大斑病菌漆酶基因StLAC在黑色素合成中的功能分析.[硕士学位论文].河北农业大学.张莹.2016.小麦全蚀病菌对天名精内酯酮的抗药性菌株选育.[硕士学位论文].杨凌:西北农林科技大学.张淑红,周宝利,张磊,付亚文.2006.不同提取条件对植物提取物抑制茄子黄萎病菌活性的影响.沈阳农业大学学报,37(4),645-647.Abrahams,J.P.,Leslie,A.G.W.,Lutter,R.,Walker,J.E.1994.Structureat2.8Å|resolutionofF1-ATPasefrombovineheartmitochondria.Nature,370(6491),621-628.Acı́n-Pérez,R.,Bayona-Bafaluy,M.P.,Fernández-Silva,P.,Moreno-Loshuertos,R.,Pérez-Martos,A.,Bruno,C.,Moraes,C.T.,Enríquez1,J.A.2004.RespiratorycomplexIIIisrequiredtomaintaincomplexIinmammalianmitochondria.MolecularCell,13(6),805-815.Adams,P.L.,Lightowlers,R.N.,Turnbull,D.M.1997.Molecularanalysisofcytochromec,oxidasedeficiencyinleigh'ssyndrome.AnnalsofNeurology,41(2),268-270.Asher,J.C.,Shipton,P.J.1982.Biologyandcontroloftake-all.NewPhytologist,91(4),773.Ahmed,S.M.,Abdelgaleil,S.A.M.2005.AntifungalactivityofextractsandsesquiterpenelactonesfromMagnoliagrandifloraL.(Magnoliaceae).InternationalJournalofAgricultureandBiology,4,123 638-642.Allen,R.D.1995.Dissectionofoxidativestresstoleranceusingtransgenicplants.PlantPhysiology,107(4),1049-1054.Amela,I.,Delicado,P.,Gómez,A.,Querol,E.,Cedano,J.2013.Adynamicmodeloftheproteinsthatformtheinitialiron-sulfurclusterbiogenesismachineryinyeastmitochondria.ProteinJournal,32(3),183-196.And,B.L.T.,Gennis,R.B.1994.Energytransductionbycytochromecomplexesinmitochondrialandbacterialrespiration:theenzymologyofcouplingelectrontransferreactionstotransmembraneprotontranslocation.AnnualReviewofBiochemistry,63(63),675-716.Anderson,S.,Bankier,A.T.,Barrell,B.G.,deBruijn,M.H.,Coulson,A.R.,Drouin,J.,Eperon,I.C.,Nierlich,D.P.,Roe,B.A.,Sanger,F.,Schreier,P.H.,Smith,A.J.,Staden,R.,Young,I.G.1981.Sequenceandorganizationofthehumanmitochondrialgenome.Nature,290(5806),457-465.Anderson,S.,deBruijn,M.H.,Coulson,A.R.,Eperon,I.C.,Sanger,F.,Young,I.G.1982.CompletesequenceofbovinemitochondrialDNAconservedfeaturesofthemammalianmitochondrialgenome.JournalofMolecularBiology,156(4),683-717.Balaban,R.S.,Nemoto,S.,Finkel,T.2005.Mitochondria,oxidants,andaging.Cell,120(4),483-495.Barrow,C.J.,Oleynek,J.J.,Marinelli,V.,Sun,H.H.,Kaplita,P.,Sedlock,D.M.,etal.2010.Cheminformabstract:antimycins,inhibitorsofATP-citratelyase,fromaStreptomycessp.Cheminform,29(9).Barrientos,A.2002.InvivoandinorganelloassessmentofOXPHOSactivities.Methods,26(4),307-316.Bartlett,D.W.,Clough,J.M.,Godwin,J.R.,Hall,A.A.,Hamer,M.,Parr-Dobrzanski,B.2002.Thestrobilurinfungicides.PestManagementScience,58(7),649-662.Baruah,N.C.,Sarma,J.C.,Barua,N.C.,Sarma,S.,Sharma,R.P.1994.GerminationandgrowthinhibitorysesquiterpenelactonesandaflavonefromTithoniadiversifolia.Phytochemistry,36(1),29-36.Barsby,R.W.,Salan,U.,Knight,D.W.,Hoult,J.R.1993.Feverfewandvascularsmoothmuscle:extractsfromfreshanddriedplantshowopposingpharmacologicalprofiles,dependentuponsesquiterpenelactonecontent.PlantaMedica,59(01),20-25.Bell,A.A.,Wheeler,M.H.1986.Biosynthesisandfunctionsoffungalmelanins.AnnualReviewofPhytopathology,24(1),411-451.Benard,G.,Bellance,N.,James,D.,Parrone,P.,Fernandez,H.,Letellier,T.,Rossignol,R.2007.Mitochondrialbioenergeticsandstructuralnetworkorganization.JournalofCellScience,120(5),838-848.Boonstra,J.,Post,J.A.2004.Moleculareventsassociatedwithreactiveoxygenspeciesandcellcycleprogressioninmammaliancells.Gene,337(35),1-13.Bostina,M.2004.DeterminationofthestructureofcomplexIofyarrowialipolyticabysingleparticleanalysis.ChemicalEngineeringandProcessing,39(39),149-159.Böttcher,B.,Scheide,D.,Hesterberg,M.,Nagel-Steger,L.,Friedrich,T.2002.Anovel,enzymaticallyactiveconformationoftheescherichiacoliNADH:ubiquinoneoxidoreductase(complexI).JournalofBiologicalChemistry,277(20),17970.Bowyer,P.,Musker,R.,Osbourn,A.E.,Clarke,B.,Caten,C.,Daniels,M.J.1992.ProductionofmutantsofGaeumannomycesgraminisvar.triticiandvar.avenaeby4-nitroquinolene-oxidetreatmentof124 protoplasts.FungalGeneticsReports,39(1),13-14.Boveris,A.,Cadenas,E.1975.Mitochondrialproductionofsuperoxideanionsanditsrelationshiptotheantimycininsensitiverespiration.FEBSLetters,54(3),311-314.Boveris,A.,Cadenas,E.,Stoppani,A.O.M.1976.Roleofubiquinoneinthemitochondrialgenerationofhydrogenperoxide.BiochemicalJournal,156(2),435-444.Boyer,P.D.1997.TheATPsynthase-asplendidmolecularmachine.AnnualReviewofBiochemistry,66(66),717-749.Bradford,M.M.1976.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.AnalyticalBiochemistry,72,248-254.Brent,K.J.,Hollomon,D.W.2007.FungicideResistanceinCropPathogens:HowCanitbeManaged?2ndedn.Brussels:CropLifeInternational:FRACMonograph1.Brooijmans,N.,Kuntz,I.D.2003.Molecularrecognitionanddockingalgorithms.AnnualReviewofBiophysicsandBiomolecularStructure,32(32),335-373.Brugna,M.,Rodgers,S.,Schricker,A.,Montoya,G.,Kazmeier,M.,Nitschke,W.,Sinning,I.2000.Aspectroscopicmethodforobservingthedomainmovementoftherieskeiron-sulfurprotein.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,97(5),2069-2074.Carreras-Villaseñor,N.,Esquivel-Naranjo,E.U.,Villalobos-Escobedo,J.M.,Abreu-Goodger,C.,Herrera-Estrella,A.2013.TheRNAimachineryregulatesgrowthanddevelopmentinthefilamentousfungusTrichodermaatroviride.MolecularMicrobiology,89(1),96-112.Carroll,J.,Fearnley,I.M.,Skehel,J.M.,Shannon,R.J.,Hirst,J.,Walker,J.E.2006.BovinecomplexIisacomplexof45differentsubunits.JournalofBiologicalChemistry,281(43):32724-32727.Cadenas,E.,Boveris,A.,Ragan,C.I.,Stoppani,A.O.1977.ProductionofsuperoxideradicalsandhydrogenperoxidebyNADH-ubiquinonereductaseandubiquinol-cytochromecreductasefrombeef-heartmitochondria.ArchivesofBiochemistryandBiophysics,180(2),248-257.Calera,M.R.,Soto,F.,Sanchez,P.,Bye,R.,Hernandezbautista,B.,Anaya,A.L.,Lotina-Hennsen,B.,Mata,R.1996.BiochemicallyactivesesquiterpenelactonesfromRatibidamexicana.Phytochemistry,27(2),419-425.Chadwick,M.,Trewin,H.,Gawthrop,F.,Wagstaff,C.2013.Sesquiterpenoidslactones:benefitstoplantsandpeople.InternationalJournalofMolecularSciences,14(6),12780.Chandra,D.,Singh,K.K.2011.GeneticinsightsintoOXPHOSdefectanditsroleincancer.BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-Bioenergetics,1807(6),620-625.Chew,S.C.,Tan,C.P.,Nyam,K.L.2017.Optimizationofneutralizationparametersinchemicalrefiningofkenafseedoilbyresponsesurfacemethodology.IndustrialCropsandProducts,95,742-750.Chen,Y.,Gao,Q.,Huang,M.,Liu,Y.,Liu,Z.,Liu,X.,Ma,Z.2015.CharacterizationofRNAsilencingcomponentsintheplantpathogenicfungusFusariumgraminearum.ScientificReports,5,12500.Chen,R.,Runswick,M.J.,Carroll,J.,Fearnley,I.M.,Walker,J.E.2007.AssociationoftwoproteolipidsofunknownfunctionwithATPsynthasefrombovineheartmitochondria.FebsLetters,581(17),3145-3148.Cheng,W.,Song,X.S.,Li,H.P.,Cao,L.H.,Sun,K.,Qiu,X.L.,Xu,Y.B.,Yang,P.,Huang,T.,Zhang,J.B.,Qu,B.,Liao,Y.C.2015.Host-inducedgenesilencingofanessentialchitinsynthasegeneconfersdurableresistancetoFusariumheadblightandseedlingblightinwheat.PlantBiotechnologyJournal,125 13(9),1335-1345.Chi,M.H.,Park,S.Y.,Kim,S.,Lee,Y.H.2009.Anovelpathogenicitygeneisrequiredinthericeblastfungustosuppressthebasaldefensesofthehost.PLoSPathogens,5(4),e1000401.Chin,K.M.,Chavaillaz,D.,Kaesbohrer,M.,Staub,T.,Felsenstein,F.G.2001.CharacterizingresistanceriskofErysiphegraminisf.sp.triticitostrobilurins.CropProtection,20(2),87-96.Chivasa,S.,Murphy,A.M.,Naylor,M.,Carr,J.P.1997.Salicylicacidinterfereswithtobaccomosaicvirusreplicationviaanovelsalicylhydroxamicacid-sensitivemechanism.PlantCell,9(4),547-557.Chng,S.F.,Cromey,M.G.,Butler,R.C.2005.EvaluationofthesusceptibilityofvariousgrassspeciestoGaeumannomycesgraminisvar.tritici.NewZealandPlantProtection,58,261-267.Cook,R.J.2003.Take-allofwheat.PhysiologicalandMolecularPlantPathology,62(2),73-86.Cole,M.D.,Bridge,P.D.,Dellar,J.E.,Fellows,L.E.,Cornish,M.C.,Anderson,J.C.1991.Antifungalactivityofneo-clerodanediterpenoidsfromscutellaria.Phytochemistry,30(4),1125-1127.Crompton,M.2004.Mitochondriaandaging:aroleforthepermeabilitytransition?Agingcell,3(1):3.Cleary,M.R.,Daniel,G.,Stenlid,J.2013.LightandscanningelectronmicroscopystudiesoftheearlyinfectionstagesofHymenoscyphuspseudoalbidusonFraxinusexcelsior.PlantPathology,62(6),1294-1301.Darrouzet,E.,Daldal,F.2002.Movementoftheiron-sulfursubunitbeyondtheefloopofcytochromebisrequiredformultipleturnoversofthebc1complexbutnotforsingleturnoverQositecatalysis.JournalofBiologicalChemistry,277(5),3471.Dayan,F.E.,Cantrell,C.L.,Duke,S.O.2009.Naturalproductsincropprotection.BioorganicandMedicinalChemistry,17(12),4022-4034.Dehorter,B.,Blondeau,R.1992.ExtracellularenzymeactivitiesduringhumicaciddegradationbythewhiterotfungiPhanerochaetechrysosporiumandTrametesversicolor.FemsMicrobiologyLetters,94(3),209-215.Dean,J.F.D.1994.Laccaseandthedepositionoflignininvascularplant.Holzforschung-InternationalJournaloftheBiology,Chemistry,PhysicsandTechnologyofWood,48(s1),21-33.Dimauro,S.,Schon,E.A.2003.Mitochondrialrespiratory-chaindiseases.NewEnglandJournalofMedicine,348(26),2656-2668.Dixon,R.A.2001.Naturalproductsandplantdiseaseresistance.Nature,411(6839),843-847.Duchen,M.R.,Verkhratsky,A.,Muallem,S.2008.Mitochondriaandcalciuminhealthanddisease.CellCalcium,44(1),1-5.Dunshee,B.R.,Leben,C.,Keitt,G.W.,Strong,F.M.1949.TheisolationandpropertiesofantimycinA.JournaloftheAmericanChemicalSociety,71(7),2436-2437.Elliott,M.L.1991.Determinationofanetiologicalagentofbermudagrassdecline.Phytopathology,81(11),1380-1384.Efremov,R.G.,Sazanov,L.A.2011.StructureofthemembranedomainofrespiratorycomplexI.Nature,476(7361),414-420.Evstratova,R.I.,Sheichenko,V.I.,Rybalko,K.S.1974.Sesquiterpenelactonesfrominulajaponica.ChemistryofNaturalCompounds,10(6),752-754.Fearnley,I.M.,Walker,J.E.1986.TwooverlappinggenesinbovinemitochondrialDNAencodemembranecomponentsofATPsynthase.EmboJournal,5(8),2003-2008.126 Feng,J.T.,Ma,Z.Q.,Li,J.H.,He,J.,Xu,H.,Zhang,X.2010.Synthesisandantifungalactivityofcarabronederivatives.Molecules,15(9),6485-6492.Ferguson,M.,Mockett,R.,Shen,Y.,Orr,W.,Sohal,R.2005.Age-associateddeclineinmitochondrialrespirationandelectrontransportinDrosophilamelanogaster.BiochemicalJournal,390(2),501-511.Fincham,J.R.1989.Transformationinfungi.MicrobiologicalReviews,55(2),148-170.Fire,A.,Xu,S.,Montgomery,M.K,Kostas,S.A.,Driver,S.E.,Mello,C.C.1998.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature,391(6669),806.Filip,Z.,Preusse,T.1985.Phenoloxidierendeenzyme-ihreeigenschaftenundwirkungenimboden.Pedobiologia,28,133-142.Fillingame,R.H.1999.Molecularrotarymotors.Science,286(5445),1687-1688.Fonrose,X.,Ausseil,F.,Soleilhac,E.,Masson,V.,David,B.,Pouny,I.,Cintrat,J.C.,Rousseau,B.,Barette,C.,Massiot,G.,Lafanechère,L.2007.Parthenolideinhibitstubulincarboxypeptidaseactivity.CancerResearch,67(7),3371-3378.Frazier,A.E.,Thorburn,D.R.2012.Biochemicalanalysesoftheelectrontransportchaincomplexesbyspectrophotometry,MitochondrialDisorders:BiochemicalandMolecularAnalysis.NewJersey,NJ:HumanaPress,49-62.Frederick,B.A.,Caesar-Tonthat,T.C.,Wheeler.M.H.,Sheehan,K.B.,Edens,W.A.,Henson,J.M.1999.IsolationandcharacterisationofGaeumannomycesgraminisvar.graminismelaninmutants.MycologicalResearch,103(1),99-110.Freeman,J.,Ward,E.2004.Gaeumannomycesgraminis,thetake-allfungusanditsrelatives.MolecularPlantPathology,5(4),235-252.Fu,L.,Zhang,S.,Li,N.,Wang,J.,Zhao,M.,Sakai,J.,Hasegawa,T.,Mitsui,T.,Kataoka,T.,Oka,S.,Kiuchi,M.,Hirose,K.,Ando,M.2005.ThreenewtriterpenesfromNeriumoleanderandbiologicalactivityoftheisolatedcompounds.JournalofNaturalProducts,68(2),198-206.Galkin,A.1999.H+/2e-stoichiometryinNADH-quinonereductasereactionscatalyzedbythebovineheartsubmitochondrialparticles.FEBSLetters,451(2),157-161.Galkin,A.,Brandt,U.2005.SuperoxideradicalformationbypurecomplexI(NADH:ubiquinoneoxidoreductase)fromYarrowialipolytica.JournalofBiologicalChemistry,280(34),30129-30135.Garrett,S.D.1956.Biologyofroot-infectingfungi.SoilScience,82(1),97.García-Piñeres,A.J.,Lindenmeyer,M.T.,Merfort,I.2004.Roleofcysteineresiduesofp65/nf-kappabontheinhibitionbythesesquiterpenelactoneparthenolideandN-ethylmaleimide,andonitstransactivatingpotential.LifeSciences,75(7),841-856.Gao,X.,Wen,X.,Yu,C.A.,Esser,L.,Tsao,S.,Quinn,B.,Zhang,L.,Yu,L.,Xia,D.2002.Thecrystalstructureofmitochondrialcytochromebc1incomplexwithfamoxadone:theroleofaromatic-aromaticinteractionininhibition.Biochemistry,41(39),11692-11702.Gisi,U.,Chin,K.M.,Knapova,G.,Kung,F.R.,Mohr,U.,Parisi,S.,Sierotzki,H.,Steinfeld,U.2000.Recentdevelopmentsinelucidatingmodesofresistancetophenylamide,DMIandstrobilurinfungicides.CropProtection,19(8),863-872.Ge,Y.,Cao,Z.,Song,P.,Zhu,G.2015.IdentificationandcharacterizationofanovelcitratesynthasefromStreptomycesdiastaticusNo.7strainM1033.BiotechnologyandAppliedBiochemistry,62(3),300-308.127 Ge,C.Y.,Duan,Y.B.,Zhou,M.G.,Chen,C.J.2013.AprotoplasttransformationsystemforgenedeletionandcomplementationinSclerotiniasclerotiorum.JournalofPhytopathology,161(11-12),800-806.Gems,D.,De,I.G.Y.2013.Alternativeperspectivesonagingincaenorhabditiselegans:reactiveoxygenspeciesorhyperfunction?AntioxidRedoxSignal,19(3),321-329.Genova,M.L.,Ventura,B.,Giuliano,G.,Bovina,C.,Formiggini,G.,Parenti,C.G.,Lenaz,G.2001.ThesiteofproductionofsuperoxideradicalinmitochondrialcomplexIisnotaboundubisemiquinonebutpresumablyiron-sulfurclusterN2.FebsLetters,505(3),364-368.Genova,M.L.,Bianchi,C.,Lenaz,G.2003.Structuralorganizationofthemitochondrialrespiratorychain.ItalianJournalofBiochemistry,52(1),58-61.Ghezzi,D.,Zeviani,M.2012.AssemblyFactorsofHumanMitochondrialRespiratoryChainComplexes:PhysiologyandPathophysiology,MitochondrialOxidativePhosphorylation.NewYork,NY:SpringerVerlag,65-106.Gören,N.,Woerdenbag,H.J.,Bozok-Johansson,C.1996.CytotoxicandantibacterialactivitiesofsesquiterpenelactonesisolatedfromTanacetumpraeteritumsubsp.praeteritum.PlantaMedica,62(5),419-422.Hägerhäll,C.1997.Succinate:quinoneoxidoreductases.variationsonaconservedtheme.BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-Bioenergetics,1320(2),107-141.Halperin,I.,Ma,B.,Wolfson,H.,Nussinov,R.2010.Principlesofdocking:anoverviewofsearchalgorithmsandaguidetoscoringfunctions.Proteins-structureFunctionandBioinformatics,47(4),409-443.Han,C.,Barrios,F.J.,Riofski,M.V.,Colby,D.A.2009.Semisyntheticderivativesofsesquiterpenelactonesbypalladium-catalyzedarylationofthea-methylene-c-lactonesubstructure.JournalofOrganicChemistry,74(18),7176-7179.Hauptmann,S.,Scherping,I.,Dröse,S.,Brandt,U.,Schulz,K.L.,Jendrach,M.,Leuner,K.,Eckert,A.,Müller,W.E.2009.Mitochondrialdysfunction:anearlyeventinalzheimerpathologyaccumulateswithageinADtransgenicmice.NeurobiologyofAging,30(10),1574-1586.Henson,J.M.,Blake,N.K.,Pilgeram,A.L.1988.TransformationofGaeumannomycesgraministobenomylresistance.CurrentGenetics,14(2),113-117.Henson,J.M.,Butler,M.J.,Day,A.W.1999.Thedarksideofthemycelium:melaninsofphytopathogenicfungi.AnnualReviewofPhytopathology,37(4),447-471.Hernández-Restrepo,M.,Groenewald,J.Z.,Elliott,M.L.,Canning,G.,McMillan,V.E.,Crous,P.W.2016.Take-allornothing.StudiesinMycology,83,19-48.Heaney,S.P.,Hall,A.A.,Davies,S.A.,Olaya,G.2000.ResistancetofungicidesintheQol-STARcross-resistancegroup:currentperspectives,inProcBCPCConf-PestsandDiseases,BCPC,Farnham,Surrey,UK,pp755-762.Hosotani,N.,Kumagai,K.,Nakagawa,H.,Shimatani,T.,Saji,I.2005.AntimycinsA10A16,sevennewantimycinantibioticsproducedbyStreptomycesspp.spa-10191andspa-8893.JournalofAntibiotics,58(7),460-467.Howard,R.J.,Valent,B.1996.Breakingandentering:hostpenetrationbythefungalriceblastpathogenMagnaporthegrisea.AnnualReviewofMicrobiology,50(50),491-512.Hou,Y.P.,Gao,T.,Zheng,Z.T.,Chen,C.J.,Zhou,M.G.2013.Aneconomicandhighlyefficientsystem128 ofprotoplasttransformationforFusariumgraminearum.Mycosystema,32,891-898.Hu,G.P.,Zhao,Y.,Song,F.Q.,Liu,B.,Vasseur,L.,Douglas,C.,You,M.S.2014.Isolation,identificationandcyfluthrin-degradingpotentialofanovelLysinibacillussphaericusstrain,FLQ-11-1.ResearchinMicrobiology,165(2),110-118.Huang,C.C.,Lin,K.J.,Cheng,Y.W.,Hsu,C.A.,Yang,S.S.,Shyur,L.F.2013.Hepatoprotectiveeffectandmechanisticinsightsofdeoxyelephantopin,aphyto-sesquiterpenelactone,againstfulminanthepatitis.JournalofNutritionalBiochemistry,24(3),516-530.Hudson,G.S.,Mason,J.G.,Holton,T.A.,Koller,B.,Cox,G.B.,Whitfeld,P.R.,Bottomley,W.1987.AgeneclusterinthespinachandpeachloroplastgenomesencodingoneCF1andthreeCF0subunitsoftheH+-ATPsynthasecomplexandtheribosomalproteinS2.JournalofMolecularBiology,196(2),283-298.Hunte,C.,Koepke,J.,Lange,C.,Rossmanith,T,Michel,H.2000.Structureat2.3Åresolutionofthecytochromebc1complexfromtheyeastsaccharomycescerevisiaeco-crystallizedwithanantibodyFvfragment.Structure,8(6),669-684.Hunte,C.,Palsdottir,H.,Trumpower,B.L.2003.Protonmotivepathwaysandmechanismsinthecytochromebc1complex.FebsLetters545(1),39-46.Ingledew,W.J.,Ohnishi,T.1980.Ananalysisofsomethermodynamicpropertiesofiron-sulphurcentresinsiteIofmitochondria.BiochemicalJournal,186(1),111-117.Inoue,K.,Tsurumi,T.,Ishii,H.,Park,P.,Ikeda,K.2011.CytologicalevaluationoftheeffectofazoxystrobinandalternativeoxidaseinhibitorsinBotrytiscinerea.FemsMicrobiologyLetters,326(1),83-90.Irie,T.,Honda,Y.,Watanabe,T.,Kuwahara,M.2001.EfficienttransformationoffilamentousfungusPleurotusostreatususingsingle-strandedcarrierDNA.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,55(5),563-565.Iverson,T.M.,Lunachavez,C.,Cecchini,G.,Rees,D.C.1999.Structureoftheescherichiacolifumaratereductaserespiratorycomplex.Science,284(5422),1961-1966.Iwata,S.,Lee,J.W.,Okada,K.,Lee,J.K.,Iwata,M.,Rasmussen,B.,Link,T.A.,Ramaswamy,S.Jap,B.K.1998.Completestructureofthe11-subunitbovinemitochondrialcytochromebc1complex.Science,281(5373),64-71.Jagow,G.V.,Link,T.A.1986.Useofspecificinhibitorsonthemitochondrialbc1complex.MethodsinEnzymology,126(4),253-271.Jin,L.H.,Chen,Y.,Chen,C.J.,Wang,J.X.,Zhou,M.G.2009.Activityofazoxystrobinandshamtofourphytopathogens.JournalofIntegrativeAgriculture,8(7),835-842.Jorgensen,W.L.,Briggs,J.M.,Contreras,M.L.1990.Relativepartitioncoefficientsfororganicsolutesfromfluidsimulations.JournalofPhysicalChemistry,94(4),1683-1686.Jia,X.,Zhang,X.,Qu,J.,Han,R.2016.Optimizationconditionsofwheatmesophyllprotoplastisolation.AgriculturalSciences,7(12),850-858.Kanazawa,H.,Kayano,T.,Mabuchi,K.,Futai,M.1981.Nucleotidesequenceofthegenescodingforα,βandγsubunitsoftheproton-translocatingatpaseof.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,103(2),604-612.Karade,V.M.,Kalekar,A.R.2000.Effectofdifferentsolventleafextractsofpudina(M.arvensis)against129 Alternariaalternata(Fr.)keissler.JournalofMaharashtraAgriculturalUniversities.Karin,M.,Delhase,M.2000.TheIkappabkinase(IKK)andnf-kappab:keyelementsofproinflammatorysignalling.SeminarsinImmunology,12(1),85-98.Kang,J.S.,Yoon,Y.D.,Lee,K.H.,Park,S.K.,Kim,H.M.2004.Costunolideinhibitsinterleukin-1betaexpressionbydown-regulationofAP-1andMAPKactivityinLPS-stimulatedraw264.7cells.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,313(1),171-177.Keenan,S.,Cromey,M.G.,Harrow,S.A.,Bithell,S.L.,Butler,R.C.,Beard,S.S.,Pitman,A.R.2015.QuantitativePCRtodetectGaeumannomycesgraminisvar.triticiinsymptomaticandnon-symptomaticwheatroots.AustralasianPlantPathology,44(6),591-597.Kim,H.,Xia,D.,Yu,C.A.,Xia,J.Z.,Kachurin,A.M.,Zhang,L.,Yu,L.,Deisenhofer,J.1998.Inhibitorbindingchangesdomainmobilityintheiron–sulfurproteinofthemitochondrialbc1complexfrombovineheart.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,95(14),8026-8033.Kim,Y.S.,Dixon,E.W.,Vincelli,P.,Farman,M.L.2003.Fieldresistancetostrobilurin(QoI)fungicidesinPyriculariagriseacausedbymutationsinthemitochondrialcytochromebgene.Phytopathology,93(7),891-900.Kotiaho,M.,Aittamaa,M.,Andersson,M.A.,Mikkola,R.,Valkonen,J.P.T.,Salkinoja-Salonen,M.2008.AntimycinA-producingnonphytopathogenicStreptomycesturgidiscabiesfrompotato.JournalofAppliedMicrobiology,104(5),1332-1340.Koch,A.,Biedenkopf,D.,Furch,A.,Weber,L.,Rossbach,O.,Abdellatef,E.,Linicus,L.,Johannsmeier,J.,Jelonek,L.,Goesmann,A.,Cardoza,V.,McMillan,J.,Mentzel,T.,Kogel,K.H.2016.AnRNAi-basedcontrolofFusariumgraminearuminfectionsthroughsprayingoflongdsRNAsinvolvesaplantpassageandiscontrolledbythefungalsilencingmachinery.PLoSPathogens,12(10),e1005901.Krieger,E.,Nabuurs,S.B.,Vriend,G.2003.Homologymodeling.MethodsBiochemAnal,44,509-523.Kumari,G.N.K.,Masilamani,S.,Ganesh,M.R.,Aravind,S.,Sridhar,S.R.2003.ZaluzaninD:afungistaticsesquiterpenefromVernoniaarborea.Fitoterapia,74(5),479-482.Kunz,S.,Lutz,B.,Deising,H.,Mendgen,K.1998.Assessmentofsensitivitiestoanilinopyrimidine-andstrobilurin-fungicidesinpopulationsoftheapplescabfungusVenturiainaequalis.JournalofPhytopathology,146(6),231-238.Kussmaul,L.,Hirst,J.2006.ThemechanismofsuperoxideproductionbyNADH:ubiquinoneoxidoreductase(complexI)frombovineheartmitochondria.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,103(20),7607-7612.Kushnareva,Y.,Murphy,A.N.,Andreyev,A.2002.ComplexI-mediatedreactiveoxygenspeciesgeneration:modulationbycytochromecandNAD(P)+oxidation-reductionstate.BiochemicalJournal,368(2),545-553.Laties,G.G.1982.Thecyanide-resistant,alternativepathinhigherplantrespiration.AnnualReviewofPlantPhysiology,33(1),519-555.Lambert,A.J.,Brand,M.D.2004.Inhibitorsofthequinone-bindingsiteallowrapidsuperoxideproductionfrommitochondrialnadh:ubiquinoneoxidoreductase(complexI).JournalofBiologicalChemistry,279(38),39414-39420.130 Lemos,R.S.,Fernandes,A.S.,Pereira,M.M.,Gomes,C.M.,Teixeira,M.2002.Quinol:fumarateoxidoreductasesandsuccinate:quinoneoxidoreductases:phylogeneticrelationships,metalcentresandmembraneattachment.BBA-Bioenergetics,1553(1),158-170.Leben,C.,Keitt,G.W.1950.Abioassayfortetramethylthiuramdisulphide.Phytopathology,38,898.Lin,Q.,Chen,Z.C.,Antoniw,J.F.,White,R.F.1991.Isolationandcharacterizationofacdnacloneencodingtheanti-viralproteinfromPhytolaccaamericana.PlantMolecularBiology,17(4),609-614.Lin,M.T.,Beal,M.F.2006.Mitochondrialdysfunctionandoxidativestressinneurodegenerativediseases.Nature,443(7113),787-795.Litvintseva,A.P.,Henson,J.M.2002.CharacterizationoftwolaccasegenesofGaeumannomycesgraminis,var.graminis,andtheirdifferentialtranscriptioninmelaninmutantsandwildtype.MycologicalResearch,106(7),808-814.Liu,Z.,Liu,S.,Xie,Z.,Pavlovicz,R.E.,Wu,J.,Chen,P.,Aimiuwu,J.,Pang,J.Bhasin,D.,Neviani,P.,Fuchs,J.R.,Plass,C.,Li,P.K.,Li,C.,Huang,T.H.,Wu,L.C.,Rush,L.,Wang,H.,Perrotti,D.,Marcucci,G.,Chan,K.K.2009.ModulationofDNAmethylationbyasesquiterpenelactoneparthenolide.JournalofPharmacologyandExperimentalTherapeutics,329(2),505-514.Lombes,A.,Nakase,H.,Tritschler,H.J.,Kadenbach,B.,Bonilla,E.,Devivo,D.C.,Schon,E.A.,DiMauro,S.1991.Biochemicalandmolecularanalysisofcytochromecoxidasedeficiencyinleigh'ssyndrome.Neurology,41(4),491-498.Magri,S.,Fracasso,V.,Rimoldi,M.,Taroni,F.2010.Preparationofyeastmitochondriaandinvitroassayofrespiratorychaincomplexactivitiestobefoundunderhttp://www.molmeth.org.Maier,F.J.,Malz,S.,Lösch,A.P.,Lacour,T.,Schäfer,W.2005.DevelopmentofahighlyefficientgenetargetingsystemforFusariumgraminearumusingthedisruptionofapolyketidesynthasegeneasavisiblemarker.FemsYeastResearch,5(6-7),653-662.Mizutani,A.,Miki,N.,Yukioka,H.,Tamura,H.,Masuko,M.1996.Apossiblemechanismofcontrolofriceblastdiseasebyanovelalkoxyiminoacetamidefungicide,SSF126.Phytopathology,86(3),295-300.Mansilla,H.,Palenzuela,J.A.1999.MinoreudesmanolidesfromArtemisiacanariensis.Phytochemistry,51(8),995-997.Mateeva,A.1995.Useofunfriendlyplantsagainstrootknotnematodes.IVInternationalSymposiumonSoilandSubstrateInfestationandDisinfestation(Vol.382,pp.178-182).McMillan,V.E.,Hammond-Kosack,K.E.,Gutteridge,R.J.2015.Evidencethatwheatcultivarsdifferintheirabilitytobuildupinoculumofthetake-allfungus,Gaeumannomycesgraminisvar.tritici,underafirstwheatcrop.PlantPathology,60(2),200-206.Meloni,D.A.,Oliva,M.A.,Martinez,C.A.,Cambraia,J.2003.Photosynthesisandactivityofsuperoxidedismutase,peroxidaseandglutathionereductaseincottonundersaltstress.EnvironmentalandExperimentalBotany,49(1),69-76.Mendgen,K.,Hahn,A.M.,Deising,H.1996.Morphogenesisandmechanismsofpenetrationbyplantpathogenicfungi.AnnualReviewofPhytopathology,34(34),367-386.Minato,H.,Nosaka,S.,Horibe,I.1964.Studiesonsesquiterpenoids.PartVIII.Thestructureofcarabrone,anewcomponentofCarpesiumabrotanoides.Linn.JournaloftheChemicalSociety,1057,5503-5510.131 Miresmailli,S.,Isman,M.B.2014.Botanicalinsecticidesinspiredbyplant-herbivorechemicalinteractions.TrendsinPlantScience,19(1),29-35.Miró,O.,López,S.,Pedrol,E.,Rodríguez-Santiago,B.,Martínez,E.,Soler,A.,Milinkovic,A.,Casademont,J.,Nunes,V.,Gatell,J.M.,Cardellach,F.2003.MitochondrialDNAdepletionandrespiratorychainenzymedeficienciesarepresentinperipheralbloodmononuclearcellsofHIV-infectedpatientswithHAART-relatedlipodystrophy.AntiviralTherapy,8(4),333-338.Mishra,N.C.,Tatum,E.L.1973.Non-MendelianinheritanceofDNA-inducedinositolindependenceinNeurospora.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,70(12),3875-3879.Mishra,A.K.2001.Antimicrobialactivitiesofisoalantolactone,amajorsesquiterpenelactoneofInularacemosa.ChineseScienceBulletin,46(6),498-501.Mitchell,P.1961.Couplingofphosphorylationtoelectronandhydrogentransferbyachemi-osmotictypeofmechanism.Nature,191(4784),144-148.Miwa,S.,Brand,M.D.2003.Mitochondrialmatrixreactiveoxygenspeciesproductionisverysensitivetomilduncoupling.BiochemicalSocietyTransactions,31(6),1300-1301.Molina-Navarro,M.M.,Casas,C.,Piedrafita,L.,Bellí,G.,Herrero,E.2006.Prokaryoticandeukaryoticmonothiolglutaredoxinsareabletoperformthefunctionsofgrx5inthebiogenesisofFe/Sclustersinyeastmitochondria.FebsLetters,580(9),2273-2280.Moazed,D.2009.SmallRNAsintranscriptionalgenesilencingandgenomedefence.Nature,457(7228),413-420.Moghaddas,S.,Distler,A.M.,Hoppel,C.L.,Lesnefsky,E.J.2008.Quinoltypecompoundincytochromecpreparationsleadstonon-enzymaticreductionofcytochromecduringthemeasurementofcomplexIIIactivity.Mitochondrion,8(2),155-163.Muller,F.L.,Liu,Y.,VanRemmen,H.2004.ComplexIIIreleasessuperoxidetobothsidesoftheinnermitochondrialmembrane.JournalofBiologicalChemistry,279(47),49064-49073.Muntari,B.,Amid,A.,Mel,M.,Jami,M.S.,Salleh,H.M.2012.RecombinantbromelainproductioninEscherichiacoli:processoptimizationinshakeflaskculturebyresponsesurfacemethodology.AMBexpress,2(1),12.Muñoz,V.,Ibáñez,F.,Tordable,M.,Megías,M.,Fabra,A.2015.RoleofreactiveoxygenspeciesgenerationandNodfactorsduringtheearlysymbioticinteractionbetweenbradyrhizobiaandpeanut,alegumeinfectedbycrackentry.JournalofAppliedMicrobiology,118(1),182-192.Nakayashiki,H.,Hanada,S.,Quoc,N.B.,Kadotani,N.,Tosa,Y.,Mayama,S.2005.RNAsilencingasatoolforexploringgenefunctioninascomycetefungi.FungalGeneticsandBiology,42(4),275-283.Nakamaru-Ogiso,E.,Yano,T.,Yagi,T.,Ohnishi,T.2005.Characterizationoftheiron-sulfurclusterN7(N1c)inthesubunitnuogoftheproton-translocatingnadh-quinoneoxidoreductasefromescherichiacoli.JournalofBiologicalChemistry,280(1),301-307.Nandal,S.N.,Bhatti,D.S.1986.Influenceoffourplantextractsonthehatchingofmeloidogynejavanicaandinvasionofhostroots.NematologiaMediterranea,14(2),291-294.Neerman,M.F.2003.Sesquiterpenelactones:adiverseclassofcompoundsfoundinessentialoilspossessingantibacterialandantifungalproperties.InternationalJournalofAromatherapy,13(3),114-120.132 Nguyen,K.T.,Ho,Q.N.,Do,L.T.B.X.,Mai,L.T.D.,Pham,D.N.,Tran,H.T.T.,Le,D.H.,Nguyen,H.Q.,Tran,V.T.2017.Anewandefficientapproachforconstructionofuridine/uracilauxotrophicmutantsinthefilamentousfungusAspergillusoryzaeusingAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation.WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology,33(6),107.Nicolás,F.E.,Vila,A.,Moxon,S.,Cascales,M.D.,Torres-Martínez,S.,Ruiz-Vázquez,R.M.,Garre,V.2015.TheRNAimachinerycontrolsdistinctresponsestoenvironmentalsignalsinthebasalfungusMucorcircinelloides.BMCGenomics,16(1),237.Olaya,G.,Koller,W.1999.Baselinesensitivitiesofventuriainaequalispopulationstothestrobilurinfungicidekresoxim-methyl.PlantDisease,83(3),274-278.Olaya,G.,Zheng,D.S.,Köller,W.2015.DifferentialresponsesofgerminatingVenturiainaequalisconidiatokresoxim-methyl.PestManagementScience,54(3),230-236.Ohnishi,T.,Nakamaru-Ogiso,E.2008.Werethereany“misassignments”amongiron–sulfurclustersN4,N5andN6binnadh-quinoneoxidoreductase(complexI)?BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-Bioenergetics,1777(7–8),703-710.Papadopoulou,L.C.,Sue,C.M.,Davidson,M.M.,Tanji,K.,Nishino,I.,Sadlock,J.E.,Krishna,S.,Walker,W.,Selby,J.,Glerum,D.M.,Coster,R.V.,Lyon,G.,Scalais,E.,Lebel,R.,Kaplan,P.,Shanske,S.,DeVivo,D.C.,Bonilla,E.,Hirano,M.,DiMauro,S.,Schon,E.A.1999.FatalinfantilecardioencephalomyopathywithCOXdeficiencyandmutationsinSCO2,aCOXassemblygene.NatureGenetics,23(3),333-337.Park,J.,Radwan,O.,Martin,B.,Wilkinson,H.T.,Fouly,H.M.2011.TransformationofGaeumannomycesgraminiswithbeta-glucuronidasereporterandhygromycinresistancegenes.JournalofPhytopathology,159(4),317-320.Pedersen,P.L.,Ko,Y.H.,Hong,S.2000.ATPsynthasesintheyear2000:evolvingviewsaboutthestructuresoftheseremarkableenzymecomplexes.JournalofBioenergeticsandBiomembranes,32(4),325-332.Perry,G.,Raina,A.K.,Nunomura,A.,Wataya,T.,Sayre,L.M.,Smith,M.A.2000.Howimportantisoxidativedamage?LessonsfromAlzheimer’sdisease.FreeRadicalBiologyandMedicine,28(5),831-834.Picman,A.K.1986.Biologicalactivitiesofsesquiterpenelactones.BiochemicalSystematicsandEcology,14(3),255-281.Romano,N.,Macino,G.1992.Quelling:transientinactivationofgeneexpressioninNeurosporacrassabytransformationwithhomologoussequences.MolecularMicrobiology,6(22),3343-3353.Roy,K.W.,Abney,T.S.,Huber,D.M.,Keeler,R.1982.IsolationofGaeumannomycesgraminisvar.graminisfromsoybeansinthemidwest.PlantDisease,66(1),822.Rachdawong,S.,Cramer,C.L.,Grabau,E.A.,Stromberg,V.K.,Lacy,G.H.,Stromberg,E.L.2002.Gaeumannomycesgraminisvars.avenae,graminis,andtriticiidentifiedusingPCRamplificationofavenacinase-likegenes.PlantDisease,86(6),652-660.Rajvanshi,I.,Varma,M.K.,Yadav,B.S.1985.NematostaticpropertiesofTagetespatulaL.aqueousleafextractonXiphinemabasirisiddiqi,1959.IndianJournalofNematology,15(2),195-196.Reddy,P.H.2008.Mitochondrialmedicineforagingandneurodegenerativediseases.NeuromolecularMedicine,10(4),291-315.133 Rehnstrom,A.L.,Free,S.J.1996.Theisolationandcharacterizationofmelanin-deficientmutantsofMoniliniafructicola.PhysiologicalandMolecularPlantPathology,49(5),321-330.Reinhammer,B.1984.Laccase.InCopperProteinsandCopperEnzymes.R.Lontie,editor.CRCPress,Inc.,BocaRaton,FL.4-10.Rhee,S.G.2006.Cellsignaling.H2O2,anecessaryevilforcellsignaling.Science,312(5782),1882-1883.Rieske,J.S.1967.AntimycinA.Antibiotics.SpringerBerlinHeidelberg.Ristow,M.,Schmeisser,S.2011.Extendinglifespanbyincreasingoxidativestress.FreeRadicalBiologyandMedicine,51(2),327-336.Robinson,M.,Sharon,A.1999.TransformationofthebioherbicideColletotrichumgloeosporioidesf.sp.aeschynomenebyelectroporationofgerminatedconidia.CurrentGenetics,36(2),98-104.Rossignol,R.,Malgat,M.,Mazat,J.P.,Letellier,T.1999.Thresholdeffectandtissuespecificity.implicationformitochondrialcytopathies.JournalofBiologicalChemistry,274(47),33426-33432.Rüngeler,P.,Castro,V.,Mora,G.,Gören,N.,Vichnewski,W.,Pahl,H.L.,Merfort,I.,Schmidt,T.J.1999.Inhibitionoftranscriptionfactornf-kappabbysesquiterpenelactones:aproposedmolecularmechanismofaction.BioorganicandMedicinalChemistry,7(11),2343-2352.Sarewicz,M.,Osyczka,A.2015.Electronicconnectionbetweenthequinoneandcytochromecredoxpoolsanditsroleinregulationofmitochondrialelectrontransportandredoxsignaling.PhysiologicalReviews,95(1),219-243.Sierotzki,H.,Parisi,S.,Steinfeld,U.,Tenzer,I.,Poirey,S.,Gisi,U.2015.Modeofresistancetorespirationinhibitorsatthecytochromebc1enzymecomplexofMycosphaerellafijiensisfieldisolates.PestManagementScience,56(10),833-841.Sierotzki,H.,Wullschleger,J.,Gisi,U.2000.PointmutationincytochromebgeneconferringresistancetostrobilurinfungicidesinErysiphegraminisf.sptriticifieldisolates.PesticideBiochemistryandPhysiology,68(2),107-112.Salas,S.D.,Bennett,J.E.,Kwon-Chung,K.J.,Perfect,J.R.,Williamson,P.R.1996.EffectofthelaccasegeneCNLAC1,onvirulenceofCryptococcusneoformans.JournalofExperimentalMedicine,184(2),377-386.Satrústegui,J.,Villalba,M.,Pereira,R.,Bogónez,E.,Martínez-Serrano,A.1996.Cytosolicandmitochondrialcalciuminsynaptosomesduringaging.LifeSciences,59(5-6),429-434.Sayyad,S.A.,Panda,B.P.,Javed,S.,Ali,M.2007.OptimizationofnutrientparametersforlovastatinproductionbyMonascuspurpureusMTCC369undersubmergedfermentationusingresponsesurfacemethodology.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,73(5),1054-1058.Sazanov,L.A.,Hinchliffe,P.2006.StructureofthehydrophilicdomainofrespiratorycomplexIfromthermusthermophilus.Science,311(5766),1430-1436.Schafer,F.Q.,Buettner,G.R.2001.Redoxenvironmentofthecellasviewedthroughtheredoxstateoftheglutathionedisulfide/glutathionecouple.FreeRadicalBiologyandMedicine,30(11),1191-1212.Schaefer,D.G.2001.GenetargetinginPhyscomitrellapatens.CurrentOpinioninPlantBiology,4(2),143-150.Schägger,H.,Pfeiffer,K.2000.Supercomplexesintherespiratorychainsofyeastandmammalianmitochondria.EmboJournal,19(8),1777-1783.Schägger,H.,De,C.R.,Bauer,M.F.,Hofmann,S.,Godinot,C.,Brandt,U.2004.Significanceof134 respirasomesfortheassembly/stabilityofhumanrespiratorychaincomplexI.JournalofBiologicalChemistry,279(35),36349-36353.Schilling,G.,Berti,D.,Kluepfel,D.1970.AntimycinAcomponents.II.IdentificationandanalysisofantimycinAfractionsbypyrolysis-gasliquidchromatography.JournalofAntibiotics,23(2),81.Schmidt,T.J.1999.Toxicactivitiesofsesquiterpenelactones:structuralandbiochemicalaspects.CurrentOrganicChemistry,3(6),577-608.Schmidt,T.,Heilmann,J.2015.Quantitativestructure-cytotoxicityrelationshipsofsesquiterpenelactonesderivedfrompartialcharge(Q)-basedfractionalaccessiblesurfaceareadescriptors(Q_frasas).QsarandCombinatorialScience,21(3),276-287.Schwarze,S.R.,Weindruch,R.,Aiken,J.M.1998.OxidativestressandagingreduceCOXIRNAandcytochromeoxidaseactivityinDrosophila.FreeRadicalBiologyandMedicine,25(6),740-747.Sharma,P.,Jha,A.B.,Dubey,R.S.,Pessarakli,M.2012.Reactiveoxygenspecies,oxidativedamage,andantioxidativedefensemechanisminplantsunderstressfulconditions.JournalofBotany,2012(2012).Shiomi,K.,Hatae,K.,Hatano,H.,Matsumoto,A.,Takahashi,Y.,Jiang,C.L.,etal.2005.Anewantibiotic,antimycinA9,producedbyStreptomycessp.k01-0031.JournalofAntibiotics,36(29),325.Singh,U.P.,Singh,H.B.1983.Comparativeefficacyofsomecommercialfungicides,plantextractsandoilforthecontrolofpowderymildew(ErysiphePolygoniDC.)ofpea(PisumsativumL.).AustralasianPlantPathology,12(2),22-24.Singha,P.K.,Roy,S.,Dey,S.2003.Antimicrobialactivityofandrographispaniculata.Fitoterapia,74(7),692-694.Sorgato,M.C.,Sartorelli,L.1974.Oxygenradicalsandhydrogenperoxideinratbrainmitochondria.FebsLetters,45(1),92-95.Spinazzi,M.,Casarin,A.,Pertegato,V.,Salviati,L.,Angelini,C.2012.Assessmentofmitochondrialrespiratorychainenzymaticactivitiesontissuesandculturedcells.NatureProtocols,7(6),1235-1246.Stanway,C.A.,Buck,K.W.1984.InfectionofProtoplastsoftheWheatTake-allFungus,Gaeumannomycesgraminisvar.tritici,withDouble-strandedRNAViruses.JournalofGeneralVirology,65(11),2061-2065.Sun,Y.P.,Johnson,E.R.1960.Analysisofjointactionofinsecticidesagainsthouseflies.JournalofEconomicEntomology,53(5),887-892.Sun,F.,Huo,X.,Zhai,Y.,Wang,A.,Xu,J.,Su,D.,Bartlam,M.,Rao,Z.2005.CrystalstructureofmitochondrialrespiratorymembraneproteincomplexII.Cell,121(7),1043-1057.Szendroedi,J.,Phielix,E.,Roden,M.2012.Theroleofmitochondriaininsulinresistanceandtype2diabetesmellitus.NatureReviewsEndocrinology,8(2):92-103.Takeshige,K.,Minakami,S.1979.NADH-andNADPH-dependentformationofsuperoxideanionsbybovineheartsubmitochondrialparticlesandNADH-ubiquinonereductasepreparation.BiochemicalJournal,180(1),129-135.Tanabe,K.,Park,P.,Tsuge,T.,Kohmotoh,K.,Nishimura,S.2009.CharacterizationofthemutantsofAlternariaalternatajapanesepearpathotypedeficientinmelaninproductionandtheirpathogenicity.AnnalsofthePhytopathologicalSocietyofJapan,61(1),27-33.Tamura,H.,Mizutani,A.,Yukioka,H.,Miki,N.,Ohba,K.,Masuko,M.1999.Effectofthemethoxyiminoacetamidefungicide,SSF129,onrespiratoryactivityinBotrytiscinerea.Pesticide135 Science,55(7),681-686.Taylor,R.D.,Jewsbury,P.J.,Essex,J.W.2002.Areviewofprotein-smallmoleculedockingmethods.Journalofcomputer-aidedmoleculardesign,16(3),151-66.Tetorya,M.,Rajam,M.V.2017.RNAsilencingofPEX6genecausesdecreaseinpigmentation,sporulationandpathogenicityofFusariumoxysporum.PlantPathology,67(1).Thurston,C.F.1994.Thestructureandfunctionoffungallaccasesmicrobiology.Microbiology,140(1),19-26.Thomashow,L.S.,Weller,D.M.1988.RoleofaphenazineantibioticfrompseudomonasfluorescensinbiologicalcontrolofGaeumannomycesgraminisvar.tritici.JournalofBacteriology,170(8),3499-3508.Tomlinson,J.A.,Walker,V.M.,Flewett,T.H.,Barclay,G.R.1974.TheinhibitionofinfectionbycucumbermosaicvirusandinfluenzavirusbyextractsfromPhytolaccaamericana.JournalofGeneralVirology,22(2),225-232.Trachootham,D.,Alexandre,J.,Huang,P.2009.TargetingcancercellsbyROS-mediatedmechanisms:aradicaltherapeuticapproach?NatureReviewsDrugDiscovery,8(7),579-591.Trumpower,B.L.1990.TheprotonmotiveQcycle.energytransductionbycouplingofprotontranslocationtoelectrontransferbythecytochromebc1complex.JournalofBiologicalChemistry,265(20),11409-11412.Tsukihara,T.,Aoyama,H.,Yamashita,E.,Tomizaki,T.,Yamaguchi,H.,Shinzawa-Itoh,K.,Nakashima,R.,Yaono,R.,Yoshikawa,S.1996.Thewholestructureofthe13-subunitoxidizedcytochromecoxidaseat2.8A.Science,272(5265),1136-1144.Turrens,J.F.,Boveris,A.1980.GenerationofsuperoxideanionbytheNADHdehydrogenaseofbovineheartmitochondria.BiochemicalJournal,191(2),421-427.Turrens,J.F.2003.Mitochondrialformationofreactiveoxygenspecies.JournalofPhysiology,552(2):335-344.Turner,E.M.1940.Ophiobolusgraminis,sacc.var.avenae,var.n.asthecauseoftakeallorwhiteheadsofoatsinwales.TransactionsoftheBritishMycologicalSociety,24(3-4),270-281.Uzarska,M.A.,Dutkiewicz,R.,Freibert,S.A.,Lill,R.,Mühlenhoff,U.2013.ThemitochondrialHsp70chaperoneSsq1facilitatesFe/sclustertransferfromisu1toGrx5bycomplexformation.MolecularBiologyoftheCell,24(12),1830-1841.Vanlerberghe,G.C.,Ordog,S.H.2002.AlternativeOxidase:IntegratingCarbonMetabolismandElectronTransportinPlantRespiration,PhotosyntheticNitrogenAssimilationandAssociatedCarbonandRespiratoryMetabolism.theNetherlands:Springer,173-191.Varfolomeev,S.D.,Lushchekina,S.V.,Nemukhin,A.V.2016.Computersimulationinmolecularmedicineanddrugdesign.HeraldoftheRussianAcademyofSciences,86(3),185-192.Venkateswara,R.P.,Holm,R.H.2004.Syntheticanaloguesoftheactivesitesofiron-sulfurproteins.ChemicalReviews,104(2),527-559.Vila,I.,Sales,E.,Ollero,J.,Muñozbertomeu,J.,Segura,J.,Arrillaga,I.2010.Micropropagationofoleander(NeriumoleanderL.).HortscienceAPublicationoftheAmericanSocietyforHorticulturalScience,45(1),98-102.Votyakova,T.V.,Reynolds,I.J.2001.DΨm-Dependentand-independentproductionofreactiveoxygen136 speciesbyratbrainmitochondria.JournalofNeurochemistry,79(2),266-277.Wang,W.,Donini,O.,Reyes,C.M.,Kollman,P.A.2001.Biomolecularsimulations:recentdevelopmentsinforcefields,simulationsofenzymecatalysis,protein-ligand,protein-protein,andprotein-nucleicacidnoncovalentinteractions.AnnualReviewofBiophysicsandBiomolecularStructure,30(1),211.Wang,G.,Zhou,Z.,Cheng,C.,Yao,J.,Yang,Z.2008.OstholandisopimpinellinfromFructuscnidii,forthecontrolofDactylogyrusintermedius,inCarassiusauratus.VeterinaryParasitology,158(1-2),144-151.Wang,J.,Wen,Y.,Chen,X.,Lin,Y.,Zhou,J.,Xie,Y.,etal.2010.PreparativeseparationofsixantimycinAcomponentsfromantimycinfermentationbrothbyhigh-speedcounter-currentchromatography.JournalofChromatographyA,1217(36),5687-5692.Wang,M.,Wang,L.,Han,L.,Zhang,X.,Feng,J.2017.TheeffectofcarabroneonmitochondrialrespiratorychaincomplexesinGaeumannomycesgraminis.JournalofAppliedMicrobiology,123(5),1100-1110.Wang,L.,Zhang,Y.,Wang,D.,Wang,M.,Wang,Y.,Feng,J.2018.MitochondrialsignsandsubcellularimagingprovideinsightintotheantifungalmechanismofcarabroneagainstGaeumannomycesgraminisvar.tritici.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,66(1),81-90.Wang,H.,Ren,S.X.,He,Z.Y.,Wang,D.L.,Yan,X.N.,Feng,J.T.,Zhang,X.2014a.Synthesis,antifungalactivitiesandqualitativestructureactivityrelationshipofcarabronehydrazonederivativesaspotentialantifungalagents.InternationalJournalofMolecularSciences,15(3),4257-4272.Wang,D.L.,Ren,S.X.,Wang,H.,Yan,H.,Feng,J.T.,Zhang,X.2014b.SemisynthesisandantifungalactivityofnoveloximeesterderivativesofcarabronemodifiedatC(4)againstBotrytiscinerea.ChemistryandBiodiversity,11(6),886-903.Walker,J.1972.TypestudiesonGaeumannomycesgraminisandrelatedfungi.TransactionsoftheBritishMycologicalSociety,58(3):427-457.Walker,J.1980.Gaeumannomyces,Linocarpon,Ophiobolusandseveralothergeneraofscolecosporedascomycetesandphialophoraconidialstates,withanoteonhyphopodia.Mycotaxon,11(1),1-129.Walker,J.E.,Fearnley,I.M.,Gay,N.J.,Gibson,B.W.,Northrop,F.D.,Powell,S.J.,Runswick,M.J.,Saraste,M.,Tybulewicz,V.L.1985.PrimarystructureandsubunitstoichiometryofF1-ATPasefrombovinemitochondria.JournalofMolecularBiology,184(4),677-701.Ward,E.,Bateman,G.L.1999.Comparisonofgaeumannomyces-andPhialophora-likefungalpathogensfrommaizeandotherplantsusingdnamethods.NewPhytologist,141(2),323-331.Wada,H.,Nishio,H.,Nagaki,S.,Yanagawa,H.,Imamura,A.,Yokoyama,S.,Sano,T.,Woo,M.,Matsuo,M.,Itoh,H.,Nakamura,H.1996.Benigninfantilemitochondrialmyopathycausedbyreversiblecytochromecoxidasedeficiency.NotoHattatsuBrainandDevelopment,28(5),443-447.Wedge,D.E.,Galindo,J.C.,Macías,F.A.2000.Fungicidalactivityofnaturalandsyntheticsesquiterpenelactoneanalogs.Phytochemistry,53(7),747-757.Wille,P.,Sierotzki,H.,Stanger,C.,Cleere,S.,Burbidge,J.,Hall,A.,Windass,J.,Gisi,U.2002.QualitativeandquantitativeidentificatonofSNPsinplantpathogens,inModernfungicidesandantifungalcompoundsIII,13thInternationalReinhardsbrunnSymposium,edbyLyr,H.,Russell,P.E.,Dehne,H-W.,Gisi,U.,Kuck,K.H.Willems,P.H.,Valsecchi,F.,Distelmaier,F.,Verkaart,S.,Visch,H.J.,Smeitink,J.A.,Koopman,W.J.137 2008.MitochondrialCa2+homeostasisinhumanNADH:ubiquinoneoxidoreductasedeficiency.CellCalcium,44(1),123-133.Williamson,P.R.,Wakamatsu,K.,Ito,S.1998.Melaninbiosynthesisincryptococcusneoformans.JournalofBacteriology,180(6),1570.Wippich,C.,Wink,M.1985.Biologicalpropertiesofalkaloids.influenceofquinolizidinealkaloidsandgramineonthegerminationanddevelopmentofpowderymildew,erysiphegraminisf.sp.hordei.Experientia,41(11),1477-1479.Winterbourn,C.C.,Hampton,M.B.2008.Thiolchemistryandspecificityinredoxsignaling.FreeRadicalBiologyandMedicine,45(5),549-561.Wood,P.M.,Hollomon,D.W.2010.AcriticalevaluationoftheroleofalternativeoxidaseintheperformanceofstrobilurinandrelatedfungicidesactingattheQositeofcomplexIII.PestManagementScience,59(5),499-511.Xiao,K.,Yu,L.,Yu,C.A.2000.Confirmationoftheinvolvementofproteindomainmovementduringthecatalyticcycleofthecytochromebc1complexbytheformationofanintersubunitdisulfidebondbetweencytochromebandtheiron-sulfurprotein.JournalofBiologicalChemistry,275(49),38597-38604.Xia,D.,Yu,C.A.,Kim,H.,Xia,J.Z.,Kachurin,A.M.,Zhang,L.,Yu,L.,Deisenhofer,J.1997.Crystalstructureofthecytochromebc1complexfrombovineheartmitochondria.Science,277(5322),60-66.Xu,X.M.,Møller,S.G.2011.Iron-sulfurclusters:biogenesis,molecularmechanisms,andtheirfunctionalsignificance.AntioxidRedoxSignal,15(1),271-307.Xu,S.,Zhao,X.,Liu,F.,Cao,Y.,Wang,B.,Wang,X.,Yin,M.,Wang,Q.,Feng,X.2018.CrucialroleofoxidativestressinbactericidaleffectofparthenolideagainstXanthomonasoryzaepv.Oryzae.PestManagementScience,doi:10.1002/ps.5091.Yamakawa,M.,Hishinuma,F.,Gunge,N.1985.Intactcelltransformationofsaccharomycescerevisiaebypolyethyleneglycol.JournaloftheAgriculturalChemicalSocietyofJapan,49(3),869-871.Yakovlev,G.,Reda,T.,Hirst,J.2007.ReevaluatingtherelationshipbetweenEPRspectraandenzymestructurefortheironsulfurclustersinNADH:quinoneoxidoreductase.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,104(31),12720-12725.Yan,L.L.,Han,N.N.,Zhang,Y.Q.,Yu,L.Y.,Chen,J.,Wei,Y.Z.,etal.2010.AntimycinA18producedbyanendophyticstreptomycesalbidoflavusisolatedfromamangroveplant.JournalofAntibiotics,63(5),259-261.Yankovskaya,V.,Horsefield,R.,Törnroth,S.,Luna-Chavez,C.,Miyoshi,H.,Léger,C.,Byrne,B.,Cecchini,G.,Iwata,S.2003.Architectureofsuccinatedehydrogenaseandreactiveoxygenspeciesgeneration.Science,299(5607),700-704.Yao,J.M.1992.Anewvarietyofthepathogenofmaizetake-all.Mycosystema,11(2),99-104.Yin,X.,You,Q.,Jiang,Z.2011.OptimizationofenzymeassistedextractionofpolysaccharidesfromTricholomamatsutakebyresponsesurfacemethodology.CarbohydratePolymers,86(3),1358-1364.Yoon,Y.S.,Yoon,D.S.,Lim,I.K.,Yoon,S.H.,Chung,H.Y.,Rojo,M.,Malka,F.,Jou,M.J.,Martinou,J.C.,Yoon,G.2006.FormationofelongatedgiantmitochondriainDFO-inducedcellularsenescence:involvementofenhancedfusionprocessthroughmodulationoffis1.JournalofCellularPhysiology,209(2),468-480.138 Zhang,J.P.,Wang,G.W.,Tian,X.H.,Yang,Y.X.,Liu,Q.X.,Chen,L.P.,Li,H.L.,Zhang,W.D.2015.ThegenusCarpesium:Areviewofitsethnopharmacology,phytochemistryandpharmacology.JournalofEthnopharmacology,163,173-191.Zhang,Z.,Huang,L.,Shulmeister,V.M.,Chi,Y.I.,Kim,K.K.,Hung,L.W.,Crofts,A.R.,Berry,E.A.,Kim,S.H.1998.Electrontransferbydomainmovementincytochromebc1.Nature,392(6677),677-684.Zhang,Y.J.,Xie,M.,Zhang,X.L.,Peng,D.L.,Yu,W.B.,Li,Q.,Li,Q.,Zhao,J.J.,Zhang,Z.R.2016a.Establishmentofpolyethylene-glycol-mediatedprotoplasttransformationforLecanicilliumlecaniianddevelopmentofvirulence-enhancedstrainsagainstAphisgossypii.PestManagementScience,72(10),1951-1958.Zhang,C.,Zong,H.,Zhuge,B.,Lu,X.,Fang,H.,Zhu,J.,Zhuge,J.2016b.Protoplastpreparationandpolyethyleneglycol(PEG)-mediatedtransformationofCandidaglycerinogenes.BiotechnologyandBioprocessEngineering,21(1),95-102.Ziabreva,I.,Campbell,G.,Rist,J.,Zambonin,J.,Rorbach,J.,Wydro,M.M.,Lassmann,H.,Franklin,R.J.Mahad,D.2010.InjuryanddifferentiationfollowinginhibitionofmitochondrialrespiratorychaincomplexIVinratoligodendrocytes.Glia,58(15),1827-1837.Zhou,A.,Rohou,A.,Schep,D.G.,Bason,J.V.,Montgomery,M.G.,Walker,J.E.,Grigorieff,N.,Rubinstein,J.L.2015.StructureandconformationalstatesofthebovinemitochondrialATPsynthasebycryo-EM.Elife,4,e10180.Zimmerman,W.C.,Blanchette,R.A.,Burnes,T.A.,Farrell,R.L.1995.Melaninandperithecialdevelopmentinophiostomapiliferum.Mycologia,87(6),857-863.139 附录一缓冲液的配置（1）HEPES-Trisbuffer（20mM，pH7.2）：2.383gHEPES溶于450mL纯水，以1.7MTris调节pH至7.2，加纯水补足500mL。4℃保存。（2）线粒体提取缓冲液（250mM蔗糖，10mMKCl，5mMEDTA，20mMHEPES-Tris，pH7.2，1.5mg/mLBSA）：42.79g蔗糖、372.8mgKCl、930.6mgEDTA和2.383gHEPES溶于450mL纯水，以1.7MTris调节pH至7.2，加纯水补足500mL。4℃保存。临用时加入1.5mg/mLBSA。（3）线粒体保存缓冲液（2mMHEPES，0.1mMEGTA，250mM蔗糖，pH7.4）：238.3mgHEPES、19.02mgEGTA和42.79g蔗糖溶于450mL纯水，以1.7MTris调节pH至7.4，加纯水补足500mL。4℃保存。（4）低渗缓冲液（25mM磷酸钾缓冲液，pH7.2，5mMMgCl2）：在25mMK2HPO4中滴加25mMKH2PO4溶液，至溶液pH为7.2。分装并加入5mMMgCl2后4℃保存，最多保存2月。（5）磷酸钾缓冲液（0.5M，pH7.5）：在0.5MK2HPO4中滴加0.5MKH2PO4溶液，至溶液pH为7.5。分装后4℃保存，最多保存2月。（6）BSA（50mg/mL）：250mgBSA溶于5mL纯水，分装后4℃保存，最多保存1月。（7）KCN（10mM）：6.5mgKCN溶于10mL纯水。通风橱中操作，用时现配。（8）NADH（10mM）：7.5mgNADH溶于1mL纯水。用时现配。（9）鱼藤酮（1mM）：3.94mg鱼藤酮溶于10mL无水乙醇。分装后-20℃避光可保存数月。（10）癸基泛醌（10mM）：3.22mg癸基泛醌溶于1mL无水乙醇。分装后-20℃可保存数月。（11）琥珀酸（400mM）：2.36g琥珀酸溶于20mL纯水中，以3MKOH调节pH至7.4。加纯水补足50mL。分装后-20℃保存，可保存数月。（12）DCPIP（0.15mg/mL）：7.5mgDCPIP溶于50mL纯水中。用时现配，避光保存。（13）氧化型Cytc（1mM）：12.5mg氧化型Cytc溶于1mL纯水。用时现配。（14）EDTA（5mM，pH7.5）：46.5mgEDTA溶于20mL纯水，用NaOH调节pH至7.5。加纯水补足25mL。室温下可保存数周。（15）吐温20（2.5%）：200μL吐温20加入7.8mL纯水。用时现配，避光保存。（16）抗霉素A（1mg/mL）：25mg抗霉素A溶于2.5mL无水乙醇，制备10mg/mL储存液-20℃保存。用时吸取10μL储存液加入90μL无水乙醇中进行稀释。140 （17）癸基泛醇（10mM）：取250μL癸基泛醌（10mM）加入离心管中，加入少量硼氢化钾晶体。再加入5μL盐酸（100mM），用移液器轻轻吹吸混匀至溶液澄清透明后，10000×g离心1min。转移澄清溶液至新离心管，避免转入任何硼氢化钾晶体。再加入5μL浓盐酸（1M）调节pH为2~3。癸基泛醇溶液置于冰上避光保存，颜色变回黄色则重制。用时现制。（18）磷酸钾缓冲液（100mM，pH7.0）：在100mMK2HPO4中滴加100mMKH2PO4溶液，至溶液pH为7.0。分装后4℃保存，最多保存1月。（19）还原型细胞色素c（1mM）：用时现制。12.5mg氧化型细胞色素c加入1mL磷酸钾缓冲液（20mM，pH7.0）中溶解。临用前，用吸头挑取几粒连二亚硫酸钠加入氧化型细胞色素c溶液，溶液颜色由棕色变为橙粉色。充分涡旋。（若溶液在20μM终浓度下OD550/OD565＞6，则细胞色素c被有效还原）。（20）H-Mg缓冲液（10mMMgSO4，100mMHepes-KOH，pH8.0）：1.19gHEPES溶于20mL纯水，以8MKOH调节pH至8.0。加入60.2mgMgSO4，并加纯水补足50mL。分装后-20℃保存。（21）磷酸烯醇式丙酮酸（50mM）：10.3mg磷酸烯醇式丙酮酸（单钾盐）溶于1mL纯水。用时现配。（22）丙酮酸激酶（5mg/mL）：5mg丙酮酸激酶溶于1mL纯水，分装后4℃保存。（23）乳酸脱氢酶（5mg/mL）：5mg乳酸脱氢酶溶于1mL纯水，分装后4℃保存。（24）寡霉素（1mg/mL）：5mg寡霉素溶于5mL无水乙醇，分装后-20℃保存。（25）ATP（25mM）：13.78mg溶于1mL纯水，用时现配。（26）含0.2%TritonX-100的Tris缓冲液（200mM，pH8.0）：1.21gTris溶于40mL纯水，以浓盐酸（1M）调节pH至8.0。加入0.1mLTritonX-100，并加纯水补足50mL。4℃保存，最多保存2月。（27）DTNB（1mM）：7.9mgDTNB溶于20mLTris缓冲液（100mM，pH8.0）。用时现配。（28）乙酰CoA（10mM）：100mg乙酰CoA溶于12.35mL纯水。分装后-80℃保存，可保存数月。（29）草酰乙酸（10mM）：6.6mg草酰乙酸溶于5mL纯水。用时现配。141 附录二小麦全蚀病菌总RNA提取1）将100mg鲜菌丝与少许的石英砂于研钵中，液氮充分研磨成粉状；2）将粉末转入2mL塑料离心管中，迅速加入1mL裂解液RZ，用匀浆仪涡旋混匀；3）室温放置5min，4℃12000rpm离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中；4）加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min；5）4℃12000rpm离心10min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中；6）缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，4℃12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液；7）向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液RD（使用前请先检查是否已加入乙醇），4℃12000rpm离心30s，弃废液；8）向吸附柱CR3中加入600μL漂洗液RW（请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，4℃12000rpm离心30s，弃废液；9）再向吸附柱CR3中加入600μL漂洗液RW，重复一次；10）将吸附柱放入2mL收集管中，4℃12000rpm离心2min，去除残余液体；11）将吸附柱CR3转入一个新的离心管中，加30-100µLRNase-FreeddH2O，室温放置2min，4℃12000rpm离心2min。注意：1）所用试剂及吸附柱均购于天根生物技术有限公司；2）玻璃器、瓷器、铁器和石英砂均采用干热（180℃）灭菌4h以上；3）塑料制品用0.1%DEPC水浸泡12h后，120℃湿热灭菌20min；4）用0.1%DEPC处理ddH2O配制试剂；5）为防止基因组污染，转移上清液时避免吸取中间层物质。142 附录三小麦全蚀病菌基因组DNA提取（1）取新鲜小麦全蚀病菌菌丝体约100mg或干重组织约20mg，加入液氮充分研磨。（2）将研磨后的粉末收集到离心管（自备）中，加入700µL65℃预热的BufferGP1（使用前在预热的BufferGP1中加入β-巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管置于65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管混匀样品数次。注意：如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4µL浓度为100mg/mL的RNaseA溶液，震荡混匀，室温放置5-10min。（3）加入700µL氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min。（4）小心将上层水相转入一新的离心管（自备）中，加入700µLBufferGP2，充分混匀。（5）将步骤4中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱（SpinColumnsDM）中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（6）向吸附柱中加入500µLBufferGW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（7）向吸附柱中加入500µLBufferGW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7.（8）12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）。（9）将吸附柱置于一个新的离心管（自备）中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-100µLBufferGE或灭菌水，室温放置2-5min，12000rpm离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。注意事项：样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。143 附录四Southern杂交所用试剂配制及步骤试剂配制（1）变性液：0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl方法：87.75gNaCl，20gNaOH加水至1000mL；（2）中和液：0.5mol/LTris-HCl，1.5mol/LNaCl，pH7.5方法：87.75gNaCl，60.5gTris加水至1000mL；（3）20×SSC：3mol/LNaCl，0.3mol/L柠檬酸钠方法：175.3gNaCl，88.2g柠檬酸钠，加水至1000mL，用HCl调节pH至7.0；（4）10%SDS：10gSDS加水至100mL；（5）BufferⅠ：又称Maleicacidbuffer方法：11.61gMaleicacid（顺丁烯二酸），8.775gNaCl溶于1000mL水中，调PH值至7.5；（6）BufferⅡ：又称Washingbuffer方法：485mL的Maleicacidbuffer（BufferⅠ），15mL的Tween20溶液，调PH值至7.5；（7）BufferⅢ：2×SSC溶液，0.1%SDS方法：100mL20×SSC，10mL的10%SDS溶液，加水定容至1000mL；（8）BufferⅣ：0.1×SSC溶液，0.1%SDS方法：5mL20×SSC，10mL10%的SDS溶液，加水定容至1000mL；（9）BlockingSolution：150mLMaleicacidbuffer（BufferⅠ），15mL6号溶液；（10）AntibodySolution：50mLBlockingSolution，8μL4号溶液；（11）DetectionBuffer：12.1gTris，5.85gNaCl，21.58gMgCl•6H2O，溶于1000mL水中，用HCl调pH值至9.5；（12）ColorSolution：30mLDetectionbuffer，400μL5号溶液。DNA杂交步骤1.DIG-DNA探针的标记（1）将1μg探针模板DNA加入到1.5mL离心管中，加灭菌超纯水至16μL；（2）沸水中温浴10min，使DNA变性，并迅速再冰水中冷却；（3）完全混匀DIG-HighPrime（DIG标记试剂盒-瓶1），取4μLDIG-HighPrime加入到变性的探针模板DNA中，混匀并稍离心，37℃温浴20h；（4）加入2μL0.2mol/LEDTA（pH8.0），加热到65℃温浴10min，停止反应；（5）-20℃保存。144 2.基因组DNA的酶切电泳（1）将基因组DNA并加入限制性内切酶缓冲液，混匀，4℃放置1-2h；（2）加入适量限制性内切酶，混匀，稍离心，37℃，酶切过夜（分3次进行酶切，每次加入一定量的内切酶，酶切4-6h，但是3次所加入的内切酶总量不能超过整个酶切体系中所要求的最大酶量）；（3）酶切结束后，将适量的酶切DNA产物与电泳缓冲液（6×loadingbuffer）混匀，缓慢加入上样孔，静止几分钟；（4）120V电泳10min后，低压（<1V/cm）电泳过夜；（5）电泳完毕，将凝胶放在凝胶成像仪上拍照；3.DNA变性（1）电泳分离DNA后，将凝胶转移到玻璃盘中，切去凝胶边缘无用部分，在凝胶左上方（加样孔端为上方）切去一角作为凝胶方位标记（正面朝上）；（2）用灭菌水漂洗，将凝胶浸泡在变性液中，室温下平板摇床轻摇（40r/min）20-30min，倒掉，重复操作一次；（3）倒去变性液，用灭菌水漂洗；（4）加中和液浸没凝胶，室温下平板摇床轻摇（40r/min）20-30min，倒掉，重复1次；（5）倒去中和液，加入转移缓冲液（20×SSC或10×SSC，如果DNA片段<500bp，使用20×SSC，如果DNA片段>500bp，使用10×SSC）浸没凝胶，室温下平板摇床轻摇（40r/min）5min；4.DNA转膜（1）10×SSC浸湿一双层滤纸并放在支撑平台上，此平台要比凝胶稍大，平台置于盛有10×SSC的大培养皿中，形成一个“桥”；（2）将凝胶反放在浸湿的滤纸上，用玻璃棒赶去凝胶与滤纸之间的气泡，并在凝胶的周围边缘放几条封口膜，防止液流短路；（3）剪一块每边比凝胶大1mm的带正电荷的尼龙膜，减去一角与凝胶吻合作为正反标记，将尼龙膜浸在双蒸水中10min，取出浸在10×SSC中至少5min；（4）将尼龙膜小心反放在凝胶上方，并使两者切角重叠，先使尼龙膜一角与凝胶接触，再缓慢将其放到凝胶上，用玻璃棒赶去尼龙膜与凝胶之间的气泡；（5）尼龙膜上放两层预先用10×SSC湿润的双层滤纸，用玻璃棒赶去滤纸与尼龙膜之间的气泡；（6）在滤纸上方放置一叠5-8cm高的吸水纸巾，纸巾上方平放一玻璃板，其上压一重约500g的物品；（7）静止转移约12-24h，及时更换湿润的纸巾；（8）拆除转膜装置，尼龙膜靠胶面为正面，将膜放在用10×SSC浸湿的滤纸上，正面朝上，在254nm紫外下照射3-5min，使DNA交联到膜上；145 （9）用灭菌水清洗尼龙膜，将尼龙膜用吸水纸吸干，若不立即进行下一步杂交，则将其保存于两张滤纸之间，密封袋中4℃保存。5.杂交（1）预杂交液（DIGEasyHybWorkingSolution）：64mL灭菌双蒸水分两次小心加入DIGEasyHybGranules（DIG标记试剂盒-瓶7），立即37℃搅拌溶解5min；（2）杂交温度的设定：Tm=（49.82+0.41）×（%G＋C）－（600/L）L=杂交DNA的碱基长度Topt＝Tm－20to25℃（3）预杂交A．将含有靶DNA的尼龙膜漂浮在盛有6×SSC的平皿内，直到尼龙膜之下而上完全浸湿，浸泡2min；B．轻轻将湿润的尼龙膜卷成筒状，放入杂交管中，与凝胶贴合的一面朝内，另一面（反面）贴向管壁，并排除气泡；C．将适量体积（10mL/100cm2尼龙膜）的预杂交液（5mL）预热到杂交温度，然后将其倒入杂交管中，拧紧管盖，杂交炉中（37-42℃）预杂交1h；（4）杂交A．取适量的DIG标记的DNA探针（约25ng/mL杂交液）加入到200μL蒸馏水中，在沸水中变性5-10min，并迅速放到冰水浴中冷却；B．将变性的DIG标记的DNA探针加入到预热的预杂交液（3.5mL/100cm2尼龙膜）（5mL）中，并混匀，避免产生气泡；C．倒掉预杂交液，加入杂交液（探针＋预杂交液）于杂交管中，杂交炉中杂交温度下杂交过夜（12-16h）；D．杂交液的贮存：含DIG标记的DNA探针的杂交液贮存在-15-25℃，可以重复使用几次，使用前临时在68℃下变性10min；6.洗膜（1）加入150mLBufferⅢ在48℃的杂交炉中，漂洗2次，每次5min；（2）倒出BufferⅢ，加150mLBufferⅣ在48℃的杂交炉中，漂洗2次，每次15min；（3）倒出BufferⅣ，取出膜于一干净的实验盒中，加100mL的BufferⅡ（Washingbuffer）室温下，摇床上漂洗5min；（4）50mLBlockingSolution室温下，漂洗30min；（5）50mLAntibodySolution室温下，漂洗30min；（6）50mLBufferⅡ（Washingbuffer）室温下，摇床上漂洗2次，每次15min；（7）50mLDetectionbuffer室温下，摇床上漂洗5min。7.显色146 （1）将硝酸纤维素膜放入盛有新配制的30mLColorSolution的容器中，室温下，用报纸包好，黑暗中漂洗30min-2h；（2）当显色条带达到要求后，用50mL灭菌双蒸水洗膜5min，终止显色反应；（3）观察结果，并拍照记录图像。147 附录五普通琼脂糖凝胶DNA回收（1）柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500µL平衡液BL，12000rpm(~13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）。（2）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。（3）向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100µL，则加入100µLPN溶液），50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。（4）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12000rpm(~13400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。注意：吸附柱容积为800µL，若样品体积大于800µL可分批加入。（5）向吸附柱CA2中加入600µL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm(~13400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW加入后静置2-5min再离心。（6）重复操作步骤5。（7）将吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm(~13400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。（8）将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12000rpm(~13400×g)离心2min收集DNA溶液。注意：洗脱体积不应小于30µL，体积过少影响回收效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。DNA也可以用缓冲液(10mMTris-Cl,pH8.0)洗脱。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm(~13400×g)离心2min，将DNA溶液收集到离心管中。148 附录六大肠杆菌感受态的制备（1）将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp储存液，使终浓度为50μg/mL，摇匀后倒板；（2）活化菌株，将保存于-80℃的菌株DH5α在LB固体培养基上进行划线，37℃培养箱中过夜培养；（3）从LB平板上挑取新活化的DH5α单菌落，接种于4mLLB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养12h左右，直至对数生长后期；（4）吸取上述培养12h左右的菌悬液（250μL）以1:100-1:50的比例加入25mLLB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养2-3h至OD600达到0.5左右（OD600范围0.4-0.6）；（5）将25mL菌液移至预冷的50mL聚丙烯离心管中，在冰上放置30min，使培养物冷却到0℃；（6）4℃，4000rpm离心10min，回收细胞；（7）倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸或吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽；（8）每50mL菌液用10mL预冷的0.1mol/L的CaCl2重新悬浮，冰浴放置30min；（9）4℃，4000rpm离心10min，回收细胞；（10）倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸/吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽；（11）每50mL初始培养物用2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2（含15%甘油）重悬每份细胞沉淀；（12）在冰上将细胞分装成小份，每份100μL或200μL，-80℃冻存；（13）如果当天要用，最好将制好的感受态细胞在4℃放置4h后再用，效果较好；制备好的感受态细胞在4℃放置24-48h内使用，不影响效果。149 附录七大肠杆菌质粒提取（1）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500µL的平衡液BL，12000rpm（~13400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）（2）取1-5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm（~13400×g）离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。（3）向留有菌体沉淀的离心管中加入250µL溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。（4）向离心管中加入250µL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。（5）向离心管中加入350µL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm（~13400×g）离心10min。注意：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。（6）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm（~13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。（7）可选步骤：向吸附柱CP3中加入500µL去蛋白液PD，12000rpm（~13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。（8）向吸附柱CP3中加入600µL漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。（9）重复操作步骤8。（10）将吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm（~13400×g）离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。（11）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm（~13400×g）离心2min将质粒溶液收集150 到离心管中。注意：洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为了增加质粒的回收率，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm（~13400×g）离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。151 致谢天波易谢，寸暑难留。转眼间，五年的硕博生活即将结束，回首走过的岁月，心中倍感充实。值此毕业论文完成之际，我谨向所有关心、爱护、帮助我的人们表示最诚挚的感谢与最美好的祝福。本论文是在导师张兴教授的精心指导和严格要求下完成的。从论文选题、试验设计、实施到论文完成，无不倾注着导师的心血和汗水。导师敏锐的科研思路，渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，科学高效的工作方法，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力，尤其是科研中的哲学思想，使学生受益匪浅。在此，谨向恩师表示最崇高的敬意和最衷心的感谢！本论文在具体的实施过程中由冯俊涛教授指导完成。冯俊涛教授在工作中兢兢业业、孜孜不倦、潜移默化的精神无时无刻不在影响着我。在生活中亦是良师益友，事无大小，不厌其烦，悉心教诲，恩同再造，师德如山，实乃学生之幸也。在此，谨向恩师表示最崇高的敬意和最衷心的感谢！在论文开题论证过程中，慕小倩教授、胡兆农教授等提出了许多宝贵的意见和建议；在论文实施过程中，＂中心＂的马志卿、王永宏、祝传书、吴华、韩立荣、王勇、闫合等老师给了我很多指导和帮助；此外西北农林科技大学植物保护学院王晨芳教授在质粒和载体等方面给予了无私帮助。在此谨向各位致以诚挚的谢意！感谢＂中心＂办公室和实验室的何军、王智辉、高保卫、冯梅、梁欲晓、陈娟等老师给予的大力支持和无私帮助。特别感谢同学范小静，韩玲娟，唐改娟，张斌，马树杰，王德龙在试验和生活中给予的大力帮助。感谢师兄何泽瑜，霍彦波，周勇，张超，张云飞，和师姐王兰英，张淑静在试验中的帮助。感谢师弟杨中林，张鸥，候昌亮，李海，马庭，李杨，任兴玉和师妹孙扬，李忝真，王茜，史小玲等在试验中的帮助。最后，我要特别感谢我的父母、爱人和朋友，他们的支持和理解给了我坚持不懈、完成学业的勇气和信心。王梅2018年10月于杨凌152 作者简介王梅，女，1991年生，中共党员，陕西榆林人。2013年毕业于西北农林科技大学植物保护学院，获得农学学士学位。同年被保送至西北农林科技大学无公害农药研究服务中心硕士，师从冯俊涛教授。2015年转博，师从张兴教授，目前从事农药作用机理的研究。攻读博士学位期间参与的科研项目及发表学术论文情况如下：参与科研项目：1公益性行业（农业）科研专项“生物源农药环境安全性评价体系的建立与标准化及植物源抗病毒剂新产品开发（子课题）”（项目编号：200903052）2国家自然科学基金项目“植物源活性物质天名精内酯酮抑菌作用机理研究”（项目编号：31272074）发表论文[1]MeiWang,LanyingWang,LirongHan,XingZhang*,JuntaoFeng*.TheeffectofcarabroneonmitochondrialrespiratorychaincomplexesinGaeumannomycesgraminis.JournalofAppliedMicrobiology,2017,123(5):1100-1110.(SCI,IF=2.160)[2]MeiWang,JieZhang,LanyingWang,LirongHan,XingZhang*,JuntaoFeng*.Optimizationofproductionconditionsforprotoplastsandpolyethyleneglycol-mediatedtransformationofGaeumannomycestritici.Molecules,2018,23(6):1253.(SCI,IF=3.098)153
