条锈菌重要致病因子PstGSRE1和PstCPK1致病机理研究及利用HIGS技术创制小麦持久抗条锈病材料

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分类号：S432.2学校代码：10712UDC：632研究生学号：2014060057密级:公开2018届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文条锈菌重要致病因子PstGSRE1和PstCPK1致病机理研究及利用HIGS技术创制小麦持久抗条锈病材料学科专业：植物病理学研究方向：植物免疫研究生戚拓指导教师：郭军教授完成时间：2018.9中国陕西杨凌 Classificationcode:S432.2Universitycode:10712UDC:632Postgraduatenumber:2014060057Confidentialitylevel:PublicDissertationforDoctorDegreeNorthwestA＆FUniversityin2018FUNCTIONALCHARACTERIZATIONOFIMPORTANTPATHOGENICITYFACTORSPSTGSRE1ANDPSTCPK1ANDCREATIONOFWHEATDURABLERESISTANTMATERIALSUSINGHIGSMajor:PlantPathologyResearchfield:PlantImmunityNameofPostgraduate:QiTuoAdviser:ProfessorGuoJunDateofsubmission:2018.9YanglingShaanxiChina 本论文由国家重点研发计划（2018YFD0200400）、国家基础研究计划（2013CB127700)、国家自然科学基金（31620103913、31371889、31171795）、高等学校创新引智计划“111”计划（B07049）及陕西省自然科学基础研究计划（2017JM3007)等项目资助。 条锈菌重要致病因子PstGSRE1和PstCPK1致病机理研究及利用HIGS技术创制小麦持久抗条锈病材料摘要小麦条锈病是由小麦条锈菌（Pucciniastiiformisf.sp.tritici）引起的小麦重大病害，在世界范围内危害严重。利用抗病品种进行防治仍然是目前最经济最有效的方式。然而，条锈菌毒性变异频繁，新的毒性小种出现使得抗病基因不断被克服，同时新的抗病品种的选育速度远远滞后于毒性小种的更新速度。因此，研究小麦条锈菌的致病机理，寻找新的病害防控策略刻不容缓。小麦条锈菌作为活体寄生真菌，需要从活体细胞中吸收营养，并向寄主中分泌效应蛋白调控寄主的免疫反应，促进侵染。在锈菌与小麦的互作过程中的致病因子有很多，其中一类基因主要负责条锈菌的生长及致病能力，相对保守；另外一类能够分泌进入寄主的体内，通过调节寄主的免疫系统以促进病原菌侵染。效应蛋白是侵染过程中分泌到寄主中促进病原菌侵染的一类小分子蛋白，在长期的进化过程中，产生了可以被寄主特异识别并引起过敏性坏死反应的AVR蛋白和调节寄主免疫的其他效应蛋白。然而条锈菌中重要效应蛋白调控小麦的机理我们知之甚少。本研究选取锈菌富含甘氨酸丝氨酸的效应蛋白PstGSRE1进行研究，分析其序列特点，解析其变异特征；利用瞬时表达、亚细胞定位、寄主诱导的基因沉默（Host-InducedGeneSilencing,HIGS）等方法，解析PstGSRE1的时空表达特征、毒性及无毒性功能；进一步通过蛋白互作技术获得其在小麦中的靶标蛋白并明确其靶标蛋白的功能。此外，本论文还利用寄主诱导的基因沉默技术（Host-InducedGeneSilencing,HIGS）靶向沉默小麦条锈菌致病因子PstCPK1基因，创制了持久抗条锈病的转基因抗病材料。取得的主要结果如下：1.鉴定了1个小麦条锈菌富含甘氨酸和丝氨酸的效应蛋白PstGSRE1。序列分析发现其N端含有具有分泌功能的信号肽，未发现保守结构域。qRT-PCR分析发现PstGERE1在侵染初期表达量显著上调。毒性功能分析表明其可抑制Bax诱导的PCD；可抑制由EtHAn引起的胼胝质累积及非亲和菌株诱导的活性氧累积。亚细胞定位分析表明该效应蛋白在寄主体内活动活跃，并且呈现一种活跃的流动现象;2.瞬时沉默PstGSRE1，条锈菌的生长明显受到抑制，菌丝长度，菌落面积及吸器数量减少，产孢的数量和面积大幅减少。表明该效应蛋白对于锈菌毒性具有重要作用。通过构建PstGSRE1的RNAi转基因沉默载体，基因枪法获得该基因的永久沉默转基因植株，经过多代的抗病选育，在T4代获得3个抗病性提高的转基因株系（L33、L34、L43），以上结果表明PstGSRE1是条锈菌重要的致病因子; 3.为了解析该效应蛋白在调控寄主免疫反应的机理，我们利用酵母双杂交系统筛选到了PstGSRE1的候选靶标蛋白，分别为TaLOL2、TaCAT1、TaCAT3、TaCIPK10等。利用酵母双杂交系统确认该效应蛋白与TaLOL2的C端互作，并进一步利用Pull-down技术和Co-IP技术确认了PstGSRE1与TaLOL2的互作关系;4.序列分析发现，效应蛋白靶标TaLOL2含有三个锌指结构，该结构具有结合DNA的功能，在小麦中高度保守；存在3个拷贝，分别在5A、5B、5D上，且不同拷贝间相似性达96%以上。利用BSMV-VIGS技术瞬时沉默TaLOL2发现沉默植株对小麦条锈菌的抗病性显著降低，活性氧和坏死面积显著减少。利用T3SS系统在小麦中过表达该蛋白能够显著降低孢子堆的数量，表明其为小麦抗条锈病的正向调控因子；通过小麦原生质体定位技术发现TaLOL2具有明显的核定位信号，并能在烟草中引起细胞死亡。5.PstGSRE1可以抑制TaLOL2诱导产生的坏死。荧光标记两个基因发现：在烟草中，TaLOL2在核中具有明显的累积，然而在效应蛋白存在的情况下，TaLOL2主要在细胞质中累积，导致其无法进入细胞核启动寄主免疫反应。表明条锈菌效应蛋白PstGSRE1通过干扰TaLOL2进核，从而抑制寄主免疫反应而利于病菌的侵染。;6.鉴定了小麦条锈菌重要致病因子蛋白激酶A的催化亚基PstCPK1。qRT-PCR分析发现，PstCPK1在条锈菌侵染初期表达量逐渐升高，18h达到峰值，随后逐渐降低。利用PstCPK1互补稻瘟菌CPK1突变体可以部分恢复其致病力。利用BSMV-HIGS瞬时沉默PstCPK1显著降低了条锈菌的毒性，组织学观察也发现病菌菌丝长度和菌落面积均显著下降。我们进一步构建PstCPK1永久沉默载体，通过基因枪转化法对小麦品种西农1376进行遗传转化，所获得的株系利用PCR鉴定并对阳性植株进行加代。经过多代抗病选育，在T4代获得2个抗病性提高的阳性转基因株系（L12和L18），并对插入小麦基因组的载体和所产生的小RNA分子进行分子鉴定，进一步明确了转基因株系的组织细胞学和分子水平的变化，初步探究了转基因株系的抗病分子机制。关键词：小麦；条锈菌；活性氧；转基因；效应蛋白；致病因子；核定位信号；调控机理 FUNCTIONALCHARACTERIZATIONOFIMPORTANTPATHOGENICITYFACTORSPSTGSRE1ANDPSTCPK1ANDCREATIONOFWHEATDURABLERESISTANTMATERIALSUSINGHIGSABSTRACTStriperust,causedbyPucciniastriiformisf.sp.tritici(Pst),isoneofthemostdamagingpathogensinwheat(Triticumaestivum)worldwide.Wheatstriperustisanaerobornedisease.Plantingresistantcultivarstocontrolstriperust.However,race-specificresistancecanbeovercomequicklyduetotherapidvariationofPstpopulation.Inaddition,breedingofnewresistantcultivarislagging.Therefore,studyingthepathogenesisofPstiscriticalforunderstandinghowPstvirulencechangesandhowtocreatewheatcultivarswithdurableresistancetostriperust.Pst,abiotrophicparasitefungus,uptakesnutritionfromlivingcellsandsecretsproteinstohosttissuetomanipulatehostimmunesystemandpromotesdisease.Duringtheprogressofinfection,twotypesofproteinsplayimportantroles.Onetypeispathogenicityanddevelopment-relatedgenewhichisconservedinpathogenicfungi,anotherisgenesencodingsecretesproteins.Toabolishtheinfectionandsubsequentcolonization,plantcoevolvedresistance(R)proteinstorecognizecertainpathogensecretedproteins,namedasavirulence(AVR)effectors,totriggerasecondarywaveofplantimmuneresponses,thisresponsealwaysresultsineffectortriggeredimmunity(ETI)whichoftenassociatedwithlocalizedhypersensitiveresponse(HR).FindingoutRandAvrgenesmaycontributetoresistancevarietybreeding,whilestudyingofthemechanismofhowimportantseffectorsregulatinghostimmunityisstillimportantforcontrollingdisease.Therefore,inthisstudy,weidentifiedandcharacterizedaglycine-andserine-richeffectorPstGSRE1.Additionally,westablysilencedanimportantpathogenicityfactorPstCPK1andcreateddurableresistantwheatmaterialsagaistPstusinghost-inducedgenesilencing(HIGS)technique.Theresultswereobtainedasfollows:1.Aglycine-andserine-richeffectorPstGSRE1wasclonedandidentifiedinPst.SequenceanalysisindicatedthatithasafunctionalN-signalpeptide,containstwocysteines anddoesnothaveanyconserveddomain.qRT-PCRassayshowedthatPstGSRE1isup-regulatedattheearlystageofinfectionanduptopeakat24hpi.PstGSRE1cansuppressBax-inducedPCD,EtHAn-inducedcallosedeposition,andavirulencePst-inducedROSaccumulation.SubcellularlocalizationshowedthatPstGSRE1flowsactivelyinplantcells;2.TransientsilencingPstGSRE1usingBSMV-HIGSresultsinareductionofurediniosppresproduction,indicatingthatPstGSRE1positivelycontributestothevirulenceofPst.APstGSRE1RNAiconstructstablyexpressedinthreeindependenttransgenicwheatlines(L33,L34,L43)confersstrongresistancetoPst.OurresultsindicatiedthatPstGSRE1playsanimportantroleinthevirulenceofPst;3.Tofishforwheatinteractors,wescreenedaY2HlibraryusingPstGSRE1withoutsignalpeptideasthebait.WefoundafewcandidatesincludingTaLOL2、TaCAT1、TaCAT3、TaCIPK10.Y2HanalysisconfirmedtheinteractionofPstGSRE1withTaLOL2.Pull-downandCo-IPassayfurtherconfirmedtheinteractioninvitroandinvivo.Co-expressedPstGSRE1andTaLOL2asavarietyofGFPorRFPfusionproteinsbyagro-infiltrationinNicotianabenthamianashowedPstGSRE1andTaLOL2interactionoccursinthenucleusandcytoplasm;4.TaLOL2containsthreezincfingerdomainswhichhaveDNAbindingactivity.TaLOL2locatedon5A、5B、5Dchromosomeandthesecopiesshownatleast96%identity.KnockdowntheexpressionofTaLOL2byusingBSMV-VIGSreducesresistanceofwheat.ROSaccumulationandHRalsoshowasignificantlyreductioninTaLOL2-kncokdownplantscomparedwiththatinthecontrolplants.OverexpressionofTaLOL2usingtheT3SSassayinwheatcouldinduceoxidativeburstandshowedadetectablechloroticreactionphenotypeonwheatplantswhichEtHAncouldnottrigger.ThesedataindicatedthatTaLOL2isapositiveregulatorofplantimmunity.TaLOL2caninducecelldeathinN.benthamiana.SubcellularlocalizationindicatedTaLOL2hasastrongsignalinthenucleusalthoughthereisnoconventionalnuclearlocalizationsequence.TaLOL2anditsdeletionmutantswithGFPrecombinantproteinexpressedinwheatprotoplastsconfirmedthatthefirstzincfingerdomainofTaLOL2elicitsthenuclearlocalization;5.PstGSRE1cansuppressTaLOL2-inducedcelldeathinN.benthamianacells.modulatedthenucleartranslocationofTaLOL2,andsuppressedROS-mediatedcelldeathinducedbyTaLOL2,thuscompromisinghostimmunity.Thisworkrevealsanovelstrategythatrustfungiexploittomodulatehostdefenseandfacilitatepathogeninfection;6.ProteinkinaseA(PKA)hasbeenprovedtoplayimportantrolesinregulatingthevirulenceofphytopathogenicfungi.PstCPK1,aPKAcatalyticsubunitgenefromPst,ishighlyinducedattheearlyinfectionstageofPst.TheinstantaneoussilencingofPstCPK1by barleystripemosaicvirus(BSMV)-mediatedhost-inducedgenesilencing(HIGS)resultsinasignificantreductioninthelengthofinfectionhyphaeanddiseasephenotype.TheseresultsindicatethatPstCPK1isanimportantpathogenicityfactorbyregulatingPstgrowthanddevelopment.TwotransgeniclinesexpressingtheRNAinterference(RNAi)constructinanormallysusceptiblewheatcultivardisplayedhighlevelsofstableandconsistentresistancetoPstboththeT3andT4generations.ThepresenceoftheinterferingRNAsintransgenicwheatplantswasconfirmedbynorthernblotting,andtheseRNAswerefoundtoefficientlydownregulatePstCPK1expressioninwheat.Thisstudyaddressesimportantaspectsforthedevelopmentoffungal-derivedresistancethroughtheexpressionofsilencingconstructsinhostplantsasapowerfulstrategytocontrolcerealrustdiseases.KEYWORDS:wheat,Pucciniastiiformisf.sp.tritici(Pst),reactiveoxygenspecies(ROS),effector,transgene,pathogenicityfactor,regulationmechanism,nuclearlocalizationsignal(NLS) 目录第一章文献综述....................................................................................................................11.1小麦条锈病..................................................................................................................11.2条锈菌的生活史和侵染循环......................................................................................11.3植物的免疫反应..........................................................................................................31.3.1病原物诱导的免疫反应.......................................................................................31.3.2基因对基因假说...................................................................................................41.3.3活性氧迸发（ROS）与过敏性坏死反应（PCD）...........................................51.3.4转录水平的免疫反应...........................................................................................61.4病原菌的致病因子......................................................................................................71.4.1信号传导类致病因子...........................................................................................81.4.2侵染分化相关基因.............................................................................................101.4.3效应蛋白.............................................................................................................111.5小麦对条锈病的抗性...............................................................................................131.5.1Yr基因的克隆....................................................................................................131.5.2抗性相关基因的功能分析.................................................................................131.5.3转录因子.............................................................................................................151.5.4转基因技术育种................................................................................................161.6本研究的目的和意义................................................................................................19第二章条锈菌重要效应蛋白PstGSRE1功能鉴定...........................................................212.0前言............................................................................................................................212.1材料、试剂及仪器....................................................................................................212.1.1试验材料...........................................................................................................212.1.2试剂及仪器.........................................................................................................222.2试验方法....................................................................................................................222.2.1效应蛋白基因的筛选及序列分析.....................................................................222.2.2PstGSRE1的转录表达分析...............................................................................232.2.3PstGSRE1的信号肽分泌验证...........................................................................232.2.4PstGSRE1的烟草瞬时过表达...........................................................................242.2.5PstGSRE1通过细菌三型分泌系统在小麦中过表达.......................................242.2.6PstGSRE1通过BSMV介导的基因沉默.........................................................252.2.7PstGSRE1的酵母过表达分析...........................................................................252.2.8PstGSRE1的在小麦原生质体和烟草细胞中的定位情况分析.......................25 2.2.9PstGSRE1通过酵母双杂交系统筛选寄主靶标...............................................262.2.10PstGSRE1与寄主靶标间的互作位点分析.....................................................272.2.11PstGSRE1与靶标之间的共定位情况分析.....................................................272.2.12PstGSRE1与靶标之间的体外互作（Pull-Down）.......................................272.2.13PstGSRE1与靶标之间的免疫共沉淀分析（Co-IP）...................................282.2.14PstGSRE1多克隆抗体的制备.........................................................................292.3试验结果....................................................................................................................292.3.1PstGSRE1的序列分析.......................................................................................292.3.2PstGSRE1的转录表达分析...............................................................................302.3.3PstGSRE1的信号肽分泌功能验证...................................................................312.3.4PstGSRE1在烟草中抑制Bax诱导的过敏性坏死..........................................322.3.5PstGSRE1通过细菌三型分泌系统在小麦中过表达.......................................342.3.6PstGSRE1通过BSMV诱导的基因瞬时沉默................................................352.3.7PstGSRE1-RNAi的转基因株系的抗病性鉴定...............................................372.3.8PstGSRE1-RNAi沉默株系的分子鉴定............................................................392.3.9PstGSRE1-RNAi的转基因株系的组织学分析...............................................402.3.10PstGSRE1的酵母过表达分析.........................................................................422.3.11PstGSRE1的在小麦原生质体和烟草细胞中的定位情况分析.....................442.3.12PstGSRE1通过酵母双杂交系统筛选寄主靶标.............................................442.3.13PstGSRE1与寄主靶标间的互作位点分析.....................................................452.3.14PstGSRE1与靶标之间的共定位情况分析.....................................................462.3.15PstGSRE1与靶标之间的体外互作（Pull-Down）.......................................472.3.16PstGSRE1与靶标之间的免疫共沉淀分析（Co-IP）...................................472.4结论与讨论................................................................................................................48第三章小麦条锈菌重要效应子PstGSRE1调控小麦中靶标TaLOL2的免疫机理.......503.0前言............................................................................................................................503.1材料、试剂及仪器....................................................................................................503.1.1试验材料.............................................................................................................503.1.2试剂及仪器.........................................................................................................503.2试验方法....................................................................................................................513.2.1TaLOL2的序列分析............................................................................................513.2.2TaLOL2的转录表达分析...................................................................................513.2.3TaLOL2的亚细胞定位及结构域功能分析......................................................513.2.4TaLOL2的烟草瞬时过表达及结构域功能......................................................513.2.5TaLOL2在裂殖酵母中过表达分析.................................................................51 3.2.6TaLOL2在小麦中过表达分析.........................................................................513.2.7TaLOL2在小麦中瞬时沉默分析......................................................................523.2.8ChIP-Seq分析转录因子TaLOL2下游调控基因............................................523.3试验结果....................................................................................................................523.3.1TaLOL2的序列分析...........................................................................................523.3.2TaLOL2的转录表达分析...................................................................................533.3.3TaLOL2的亚细胞定位及结构域功能分析......................................................543.3.4TaLOL2的烟草瞬时过表达及结构域功能......................................................553.3.5TaLOL2在裂殖酵母中过表达分析.................................................................563.3.6TaLOL2在小麦中过表达分析.........................................................................573.3.7TaLOL2在小麦中瞬时沉默分析......................................................................573.3.8TaLOL2的ChIP-Seq结果分析........................................................................603.3.9效应蛋白PstGSRE1对TaLOL2的影响分析................................................633.3.10效应蛋白PstGSRE1对TaLOL2调控基因的影响分析..............................663.4结论与讨论................................................................................................................68第四章利用HIGS技术创建小麦持久抗锈病材料...........................................................714.0前言............................................................................................................................714.1材料、试剂及仪器....................................................................................................714.1.1试验材料.............................................................................................................714.1.2试剂及仪器.........................................................................................................714.2试验方法....................................................................................................................734.2.1植物材料种植与接种.........................................................................................734.2.2序列分析和进化树构建.....................................................................................734.2.3总RNA的提取和cDNA第一条链的反转......................................................734.2.4实时荧光定量分析............................................................................................744.2.5稻瘟菌突变体互补.............................................................................................744.2.6BSMV-VIGS介导的基因沉默..........................................................................754.2.7基因枪法进行小麦遗传转化.............................................................................774.2.8转基因小麦后代植株的抗锈性鉴定................................................................794.2.9转基因小麦后代植株的分子检测....................................................................794.2.10转基因后代的Sourthern检测........................................................................804.2.11转基因后代的Northern检测..........................................................................814.3结果与分析................................................................................................................834.3.1PstCPK1的序列分析和进化树构建.................................................................834.3.2PstCPK1基因在锈菌侵染过程中的表达分析.................................................85 4.3.3PstCPK1互补稻瘟突变体.................................................................................864.3.4BSMV-VIGS体系诱导条锈菌PstCPK1基因沉默分析.................................864.3.5PstCPK1转基因植株的加代及分子检测.........................................................884.3.6PstCPK1转基因植株的抗锈病鉴定及Northern和Sourthern的分子鉴定.904.3.7筛选出的PstCPK1转基因株系的抗锈病鉴定及分子检测............................934.3.8PstCPK1转基因沉默植株接菌后的组织细胞学分析.....................................954.3.9PstCPK1转基因沉默植株接菌后的分子生物学分析.....................................964.4结论与讨论................................................................................................................99第五章全文结论................................................................................................................103附录................................................................................................................................106参考文献................................................................................................................................121致谢................................................................................................................................131个人简介................................................................................................................................132 第一章文献综述1.1小麦条锈病条锈是禾谷类作物如小麦、大麦、禾谷类杂草的一种古老病害，12000年前就发现了此种病害(Haldorsenetal.2011)。在中国，1470年前就在“齐民要术”中将此病害记载为麦类“黄疸病”(LiandZeng2002)，现在仍在世界范围内严重危害小麦的产量，个别地区危害尤为严重(Chenetal.2002;Wanetal.2004;李振岐1980;李振岐和曾士迈2002)。对条锈菌的研究始于十九世纪，已有130年的历史，然而最重要的进展是在近二三十年发现的(ChenandKang2017)。小麦条锈菌是一种活体寄生的真菌气传病害，在寄主的整个生长时期均可侵染，高感品种甚至可能导致绝收。2011年在美国华盛顿州普尔曼（Pullman）附近的一个实验场小麦产量损失了90%(Chenetal.2014)。2005年以来在世界60多个国家如新西兰，中国，印度，尼泊尔，巴基斯坦，乌兹别克斯坦，也门，埃塞俄比亚，肯尼亚，英国，智利，秘鲁，厄瓜多尔，哥伦比亚，墨西哥和美国均有不同程度的爆发，只澳大利亚小麦产量就损失了5-10%。中国福建和四川在1939-1940年条锈菌大流行年份分别造成小麦产量损失了10%-15%和60%(李振岐和曾士迈2002)。1942年，1946年，1948年和1949年在陕西中部发生了条锈病大流行。20世纪五六十年代（1950年，1956年，1958年，1960年，1962年和1964年）发生全国性流行，影响面积达22.2万~88.8667万公顷。1950年和1964年极为广泛的流行病造成小麦产量损失6.0-3.2百万吨(李振岐和曾士迈2002)。科学家为了控制条锈病的发生做出了巨大的努力。首先，准确预测条锈病的发生是非常重要的。有关条锈病的预测已有很多研究(Line2002;Sharma-Poudyaletal.2014;SharmapoudyalandChen2011;Youngetal.2003;Zadoks1978;Zadoks1981;李振岐和曾士迈2002)。Kuang等人(2013)使用WebGIS技术开发了一种基于网络的小麦条锈病预测系统。由于中国气候地理情况多样导致预测困难，必须辅以其他防治手段。抗病品种的选育和合理种植，适当地使用杀菌剂是目前最为经济有效的条锈病防治方案(Chen2005)。条锈菌具有有性和无性两种不同的生存形式，并且具有有性形态在小檗上寄生，无性形态在小麦上寄生的转主寄生现象，这种生存方式导致锈菌的毒性变异尤其迅速，能够快速分化出一个新的生理小种寄生不同的宿主(Vidhyasekaran2004)，致使大部分抗性品种抗性丧失。因此，对条锈菌的致病机理的研究越来越迫切。1.2条锈菌的生活史和侵染循环条锈菌是一种高等进化的从活体吸收营养的寄生真菌。其生活史有有性阶段和无性阶段，五种孢子参与到这个过程中：夏孢子、冬孢子、锈孢子、性孢子和担孢子(李振1 岐和曾士迈2002)，冬孢子和性孢子一般无侵染能力(Voegele,RTandMendgen,K2011)，其他几种孢子均能寄生于不同的寄主。夏孢子、冬孢子以及担孢子的寄主主要是禾谷类作物如小麦、大麦、燕麦等，有些杂草也可以成为它们的侵染对象，而性孢子和锈孢子则主要侵染转主寄主小檗。锈菌的毒性变异主要源于在转主寄主上的有性生殖,近年来对这方面的研究渐渐成为热点。具有双核、每个核里有一组染色体称为单倍型的夏孢子，在不利的环境条件下转化成由两个细胞组成的每个细胞都是单核二倍体的冬孢子，冬孢子经过一次有丝分裂一次减数分裂分化出两组先菌丝，先菌丝上着生两种单核单倍体的担孢子，具有（+）（-）两种不同的配型，这两种担孢子侵染小檗，并在小檗叶片上形成两种性子器，一种产生受精丝，一种产生单核单倍体的性孢子，性孢子和受精丝结合经过这样的有性生殖过程在小檗叶片背面形成锈子器，锈子器产生很多锈子腔，锈子腔破裂释放很多双核单倍体的锈孢子，在小麦上侵染形成夏孢子，进行下一轮的侵染循环。在自然条件下，有性阶段的周期通常是一年，在最适温度条件下，无性繁殖的周期需要两周，而低温条件则需要几个月。经过这样复杂的有性生殖过程，锈菌的毒性变异频率成倍增加，条锈菌的这种有性生殖过程不仅为锈菌增加变异频率，也更加难以根除在其他寄主上的残留锈菌，这也为锈菌的防治增加了非常大的难度。图1-1：锈菌的生活史，包括有性和无性生殖阶段。Zhengetal.2013Figure1-1:LifecycleofPucciniastriiformisWestendf.sp.tritici.夏孢子是锈病通过气流进行远距离传播及越冬越夏的主要形式(Chen2005;ZengandLuo2006)，目前对锈菌的防治及对锈菌侵染过程中的组织学、分子生物学的变化也主要集中在夏孢子上(HahnandMendgen1997;MendgenandHahn2002;Voegeleetal.2 2006)。锈菌产生具有厚壁、表面呈突起状、有色素沉积的夏孢子经过传播落在寄主小麦的叶片上，在低温（4-20℃）高湿（湿度>90%）的情况下经过6-8小时孢子萌发产生芽管，接受寄主表面信号分子的芽管向叶肉细胞呈垂线方向生长，遇到气孔侵入，接种后12小时后形成附着胞(HahnandMendgen1997;HochandStaples1987)，多数芽管侵入气孔，气孔内部形成膨胀的20-25μｍ椭圆或者葫芦状的气孔下囊，气孔下囊是侵染成功的标志。气孔下囊继续生长分化形成初生菌丝和吸器母细胞进行初步的物质交换，侵染成功48小时后，侵染菌丝不断生长分化形成更多的吸器母细胞并分化出在寄主细胞质膜上膨胀却不刺穿质膜只进行物质交换的活体吸器(VoegeleandMendgen2003)。接种后48h后分化出次生侵染菌丝，在接种后216h（14天）左右形成孢子床，产生孢子堆(Wangetal.2007)，孢子堆散开释放大量夏孢子开始下一轮的侵染循环(李振岐和曾士迈2002)。锈菌作为最高等的真菌与小麦在长期的进化过程中形成了复杂的寄生关系，单一品种小麦的大面积种植也导致了该病原菌的大面积爆发。研究锈菌与小麦互作过程中的分子机理有助于我们找到防治锈菌的新途径。1.3植物的免疫反应病原物通过不同的策略来侵染植物并影响其生长和发育，病原细菌可以通过气孔、水孔或伤口直接进入寄主的细胞间隙（质外体）并大量增殖；线虫和蚜虫利用刺针插入植物细胞进行取食；真菌可以侵入植物表皮细胞或者通过吸器入侵寄主细胞吸收营养；卵菌和病原或者共生真菌可以使寄主细胞质膜上凹陷形成吸器，通过吸器-吸器外间质-寄主细胞这种结构来进行物质交换，如从寄主体内吸收营养和向寄主体内分泌效应蛋白调控寄主免疫系统。1.3.1病原物诱导的免疫反应植物没有哺乳动物一样的移动防御细胞和体细胞适应性免疫系统，在长期的进化过程中，他们依靠先天免疫系统，从感染部位释放信号分子，激发系统抗病性抵抗病原菌的进一步入侵(Chisholmetal.2006;DanglandJones2001)。在这一层免疫反应中，植物的基础防御系统激活，位于植物表面的病原识别受体（PAMPs）识别病原表面表面物质如鞭毛蛋白、多糖、几丁质等，激发具有广谱抗性的病原相关分子激发免疫反应（PTI），这种免疫反应可以防治大多数演变缓慢的病原物的进一步侵染(JonesandDangl2006)。然而有些病原物通过不断的进化可以抑制或者躲避寄主的这种免疫反应来在寄主身上定殖，并分泌特异的效应因子使得寄主变得适宜病原菌侵染，从抗病转变为易于被侵染的感病性（ETS）。植物的第一道免疫系统失效后，随即启用第二阶段的免疫系统，通过产生抗性蛋白识别进入寄主体内的特异的效应因子，诱导第二层有针对性的特异的免疫系统（ETI），这种识别可以是间接识别，也可以是具有特殊结构如NB-LRR的抗病蛋白3 直接识别。这种识别是一种级联扩大的信号反应，扩大第一道免疫反应并启动新的防御反应，最后启动系统性过敏反应（HR），在侵染点形成坏死斑，杀死侵入的病原菌。图1-2植物抗病性的分子基础Figure1-2Amodelillustratesthemolecularmechanismoftheplantimmunesystem(Wangetal.2016).1.3.2基因对基因假说ETI免疫反应经过长期的演化，形成了植物抗病基因对病原菌的效应蛋白类似一对一的识别关系。在亚麻锈菌的小种专化型抗性研究过程中，这种基因对基因的假说被Flor(1971)首次提出。这种基因对基因的假说现如今已经证明存在于几十种不同的植物病原菌互作体系中，可以看作是一种较为普遍的植物体免疫病原菌的特异抗病性。这种理论提出：病原物侵染其寄主的时候会有两种不同的表现型，亲和体系和非亲和体系的病原菌分别含有毒性基因（a）和无毒基因（A），所对应的寄主则有感病基因（r）和抗病基因（R）。无毒基因V可以被寄主的抗病基因R特异识别，迅速引发下游的过敏性坏死反应。其他几种对应关系不能引起寄主的坏死反应，病原菌可以顺利侵染寄主，使寄主患病。在之后的研究中，也发现了不仅仅存在这种一一对应的关系，也存在一个抗病基因识别多个无毒基因或者多个抗病基因识别一个无毒基因的模式存在。对该理论的4 进一步研究，在此基础上的一些新的假说也被提出：Bosetal.(2006)提出从生物化学角度出发，植物抗病蛋白相当于病原菌无毒蛋白的底物，他们之间属于直接作用。Biezen和Jones（1998）又进一步提出抗病蛋白在植物体内作为病菌效应蛋白的底物主动监听病原菌。1.3.3活性氧迸发（ROS）与过敏性坏死反应（PCD）活性氧物质的迸发参与了PTI与ETI等植物的免疫反应。活性氧迸发是寄主成功识别病原菌的标志(LambandDixon1997;Torres2006)，超氧阴离子（O2-）是最初产生的活性氧物质，而过氧化氢（H2O2）则相对稳定，作为一种标志性活性氧物质被应用于很多研究中，其他的活性氧物质还有纯态氧和氢氧自由基等。活性氧迸发反应是双向的、非特异的、在病原菌侵染瞬间即可产生的，第二阶段活性氧的产生发生在侵染后几个小时，这个阶段活性氧的迸发是持久的，与后续免疫反应和过敏性坏死密切相关的(GrantandLoake2000)。细菌的鞭毛蛋白（flg22）(Felixetal.1999)和真菌的聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonases）(Kakuetal.2006)均能诱导寄主产生瞬时，但是强烈的活性氧物质迸发。病原菌的无毒基因与R基因识别也能强烈诱导活性氧的产生(Piedrasetal.1998;Torres2006)。早期的研究认为活性氧迸发是直接作用于病原菌的，如羟基自由基能够直接杀死病原菌(ChenandSchopfer1999)。也可以通过参与在侵染点形成乳突、木质素和软木脂聚合物等物理屏障的过程低于病原菌入侵(Bradleyetal.1992;Hückelhoven2007)。随着研究的深入发现，活性氧物质也参与了激活抗病基因、激活氧化还原反应相关的转录因子以及参与钙信号、水杨酸、（SA）磷酸化级联放大反应交叉激活等信号传导途径(Kovtunetal.2000;Mouetal.2003)。活性氧可以通过非酶促氧化反应产生脂质衍生物造成膜损伤或作为信号分子参与信号转导，如茉莉酸循环中的环氧化脂(Montilletal.2005)。活性氧物质也可以调节植物产生抗毒素和次生带下产物来阻止病原物的进一步入侵(Thomaetal.2003)。然而，活性氧最特殊的是与之密切相关的在侵染点周围限制病原菌进一步侵染的过敏性坏死反应（PCD）。细胞死亡在植物和动物的先天性免疫反应中起着核心作用，植物和动物均可在识别病原菌后诱导细胞程序性死亡，植物在病原菌侵染点周围产生坏死斑，而动物则表现为侵染细胞周围的炎症反应。动物和植物的先天免疫系统除了具有有惊人的保守性，还具有整体进化的相似性。动物通过样受体（NLRs）识别病原菌引起坏死，植物通过类似的NB-LRR结构识别病原菌诱导坏死反应。植物的叶绿体在抵抗病原菌入侵和诱导产生过敏性坏死反应中也起到了关键的作用。首先，叶绿体是重要信号分子如活性氧物质、氮氧化物中间产物以及水杨酸和茉莉酸等抗性相关激素的产生场所；其次，过敏性坏死反应在很多研究中都发现需要光的参与。参与PCD调控的基因除了NB-LRR蛋白外，还有被NB-LRR蛋白调控的非小种专化型抗性蛋白1（NDR1）、促感病蛋白1（EDS1）、植物抗毒素缺陷蛋白4（PAD4）、衰老相关蛋白101（SAG101）等。ROS信号与SA信5 号也参与了协同诱导HR的过程。在研究拟南芥突变体时发现了一类可以模拟坏死反应的抗性蛋白家族（lsd）在没有病原菌参与下与坏死反应密切相关。这是一类含有锌指结构的转录因子，可以诱导或抑制活性氧密切相关的坏死反应，关于这方面的研究报的非常有限，是我们研究过程中的重点，LSD家族转录因子的研究进展在1.5.3中有详细描述。病原菌也在与寄主长时间的演化过程中得出了一套足以颠覆过敏性坏死反应的策略。很多研究还发现病原菌的效应蛋白靶标叶绿体定位信号叶绿体转运肽（rCTP）并抑制寄主免疫反应。特别是某些活体营养型寄生菌必须躲避寄主的侦测和坏死反应，进化出通过向寄主分泌特定的效应子抑制寄主坏死反应的分泌系统。如细菌里的丁香假单孢和黄单孢菌能够分泌多种效应蛋白抑制拟南芥和烟草的坏死反应(Guoetal.2009;Jamiretal.2004)。卵菌和高等的锈菌均能分泌效应子抑制寄主HR反应(Chengetal.2016;Kelleyetal.2010)。然而效应蛋白抑制寄主坏死的机理仍属未知。而死体营养型病原菌正相反，它可以诱导寄主产生坏死反应，并分泌植物毒素和细胞壁降解酶破坏寄主细胞，扩大坏死部位并从中吸收营养。这些诱导寄主产生坏死的因子被称为致病因子(GovrinandLevine2000)。如维多利亚旋孢腔菌（Cochliobolusvictoriae）通过劫持寄主的CC-NB-LRR抗性蛋白LOV1诱导拟南芥产生坏死反应(Lorangetal.2007)。过敏性坏死反应是病原菌与寄主互作过程中非常重要的反应，研究该机理有助于我们利用该抗性行为为病原菌的防治提供新思路。1.3.4转录水平的免疫反应长期以来，DNA作为主要的遗传物质与蛋白质支撑整个细胞正常运转，DNA与蛋白质被认为是生物最重要的组成部分。而RNA最初被认为是一种中间物质连接DNA与蛋白质，主要参与到DNA的剪切（snRNA）和蛋白质的翻译（tRNA和rRNA）过程中。小RNA（siRNA和miRNA）是一类非常重要的小分子RNA，几乎参与到生物的各个调控途径中，如稳定生物基因组；调控植物生长发育；对植物生物和非生物胁迫的适应性；指导在真菌和植物中异染色质的组装过程中大核DNA的消除；靶向内源性和外源mRNA，控制植物和动物中转录和转录后水平的转座元件活性；保护基因组免受由转座子和重复序列的积累引起的不稳定性方面发挥重要的生物学作用(Kettingetal.1999;Tabaraetal.1999)。真核细胞在转录过程中具有调控转录活性的系统，针对特异的RNA，抑制或促进其表达，这个体系非常有效，一旦异常或外来的RNA分子出现被识别，就可抵抗与识别的RNA分子序列同源的RNA种类。此种过程被称作RNA沉默，可以被看成是核酸水平的免疫系统的一种形式。RNA沉默在植物、动物、真菌中均有存在，是一种普遍的转录调控过程。最先发现这种现象是在对秀丽隐杆线虫的研究中，在蠕虫被饲喂双连RNA(dsRNA)甚至喂养转入的dsRNA的细菌均能抑制线虫基因的表达，而且正义链和反义链均能起相同的作用(TimmonsandFire1998),之后的研究发现dsRNA6 能够诱导产生具有干扰功能的小RNA（siRNA）。类似的沉默机制在昆虫（果蝇）、真菌（脉孢菌）、真菌原生生物（衣藻）、高等植物（拟南芥）以及动物（小鼠等）均有发现(Zamoreetal.2000)。植物在应对外界病原菌入侵的时候，有一类特异的病原物比较特殊-病毒，真核生物具有一套RNA调控机制抑制外源遗传元件，在针对病毒进化的过程中产生了一种转录免疫过程称为RNA沉默。通过合成与目标序列相匹配的核苷酸序列siRNA（21~23个碱基）特异识别外源RNA序列并降解外源mRNA。然而病毒也会产生相应的沉默抑制子防御寄主的清除(Zamoreetal.2000)。在高等植物中，超过90％的病毒具有高度复制的RNA基因组，RNA沉默的性质，RNA沉默的高效率和反式作用特性使其成为抗病毒的有效防御机制。在对转基因矮牵牛的研究中发现内源基因的表达被导入的转基因同源序列抑制，随后提供了沉默寄主内源mRNA的遗传工具(Fireetal.1998;Gilroyetal.2007)。随后由寄主介导的病原菌的基因沉默技术也日趋成熟(Nowaraetal.2010)。1.4病原真菌的致病因子真菌病原体采用不同的策略来感染它们的宿主植物。随着分子遗传学的快速发展，如基因敲除技术、分子标记、荧光标记、组织染色技术等，通过比较野生型同突变掉致病基因的突变型比较，确定了大量与病原菌致病性关系密切的基因，从1990年的不足10个已经发展到超过八十个致病因子别确认(IdnurmandHowlett2001)。对致病机制重要的基因类型取决于不同病原菌的侵染过程。一些病原菌形成附着胞穿透寄主表皮；如稻瘟菌、炭疽菌等。稻瘟菌通过构建基因的突变体库研究其致病因子，已经发现NPR1、NPR2、ACR1、ORP1等基因与稻瘟菌的细胞壁和附着胞的形成有关，缺失这些基因的突变体都丧失了侵染能力。一些病原菌分泌毒性因子降解寄主表皮和细胞壁入侵寄主，然而这些酶类物质一般是由多个基因家族或者几个完全不相干的基因一起参与合成的，这种冗余意味着敲除单个基因难以对个体产生明显的影响，其他基因很容易掩盖这种不活跃的基因，因此难以被证实参与毒性，而且这种酶类还有其他更加复杂的作用，如诱导产生一些低聚糖类物质从而参与寄主的免疫反应(Moldenhaueretal.2006)。此外，这种植物细胞壁降解酶本身就能引起寄主的免疫反应，有研究表明将木聚糖酶浓度降低1000倍依然能够诱导烟草和番茄等的免疫作用(Enkerlietal.1999)。能够降解植物角质层的角质酶同样是病原菌必须的致病因子，角质酶合成缺陷的突变体同时也失去了侵染能力(Rogersetal.1994)。同样是细胞壁组成物质的果胶可以被果胶酶，聚半乳糖酶和果胶甲基化酶等酶降解，真菌的这些酶也是非常重要的致病因子。如炭疽菌中编码果胶裂解酶的基因pelB具有致病性而plnA却对炭疽的致病能力没有影响(Bowenetal.1995)。灰霉病中编码多聚半乳糖醛酸内切酶的基因Bcpg1缺失可以大幅降低灰霉菌在苹果和番茄上的发病面积(Tenetal.1998)。不仅仅是降解寄主细胞的酶，一些菌的代谢产物也具有非常强的致病性，如炭疽菌中的次生代谢产物调节基因ccsnf1敲除后病原菌也丧失7 了致病能力(Tonukarietal.2000)，该基因的缺失导致了10个细胞壁降解酶基因表达量的降低；然而在酵母中该基因的同源基因却调控其他的代谢途径如糖原、固醇和脂肪酸的生物合成以及脂肪酸氧化(Hardieetal.1998)。稻瘟菌的葡萄糖阻遏调控元件GRR1也被证实是一个致病因子(Sweigardetal.1998)。对真菌的营养生长重要，突变后真菌无法正常生长，这种基因也被鉴定为致病因子。稻瘟菌的pth3突变体的咪唑磷酸甘油脱水酶，催化组氨酸合成第六步的催化亚基无法正常表达，稻瘟菌营养生长和侵染能力均受到了大幅抑制，玉蜀黍黑粉菌和黑星菌的营养缺陷型突变体ad-1,me-1和leu-1失去了致病力(Puhalla1968)。一些真菌会产生毒素关闭宿主细胞功能或杀死宿主细胞，非特异性毒素不加选择地破坏各种植物细胞，而寄主特异性毒素则是真菌和去所侵染的寄主共同决定的。大多数已知的真菌特异性毒素都不容易检测到。控制这些毒素的生物合成的基因通常是聚集在一起的，尽管基因突变试验表明并不是所有的基因都参与了毒素的生物合成，而且部分改变毒素的真菌仍然可以致病。其中一个例子是炭色孢腔菌的HC-毒素生物合成的基因在一个600kb的范围内含有至少6个基因的重复序列。其中的几个基因参与了hc毒素的生产，包括HTS1，它编码了一种对四种氨基酸的非核糖体组装至关重要的肽合成酶(Panaccioneetal.1992)。TOXC和TOXF对毒素的合成和致病力也很重要(ChengandWalton2000)。偃麦草特异的核腔菌ToxA和Ptr毒素是在叶子表面形成棕褐色坏死斑的小分子分泌蛋白，将该基因转入非致病小种中也能导致菌株获得致病能力(Ciuffettietal.1997)。这些病原菌一旦侵染成功便形成特殊的结构吸收营养(Mendgenetal.1996)。1.4.1信号转导类致病因子信号转导对于病原菌也至关重要，真菌通过改变基因表达，利用信号级联来回应环境的变化。可以直接影响病原菌的致病力、交配、分化、生长率和毒素产量等。如异三聚G蛋白，有丝蛋白激活蛋白(MAP)激酶和环腺苷酸依赖的蛋白质激酶基因（PKA）等非常重要的信号转导途径(XuandMalave2000)。一般这些信号转导原件由某个基因家族编码和调控，如在稻瘟菌中，三个G蛋白的α亚基和三个MAPK家族基因被克隆，然而只有个别关键基因是致病必须的，只有pmk1和mps1基因缺失突变体无法产生附着胞并失去侵染力(XuandHamer1996;Xuetal.1998)；MAPK基因的另一个突变体hog1对渗透压敏感然而附着胞的产生和毒性都没有受到影响。尽管这些信号同路蛋白都是高度保守的，然而在不同的真菌中各个通路和他们之间的相互连接却不尽相同，因此各个不同的突变体可能产生不同的影响。不同病原菌与酵母fus3/kss1的同源的MAPK蛋白激酶突变体也表现出了不同的表现型。这些信号转导途径在高等真菌的有性生殖的过程中有着级联放大的作用，一些担子菌如玉米黑粉菌和大麦黑粉菌在有性生殖后的双核期才能在寄主上致病(Leeetal.2003)。一些特殊的致病基因也渐渐被发掘出来；炭疽菌path-1基因是在紫外线诱变产生的突变体，该突变体失去强致病性却能在西瓜中作为内生菌存8 活抑制其他病害的发生。这个发现表明病原真菌的进化通过一个内生阶段进行，随后通过突变体库筛选，发现了176个非致病表型并对寄主防止其他寄生菌有不同程度的保护作用。炭疽菌的CLTA1基因编码一个有锌指结构的转录因子调控该病原菌在活体寄生与死体寄生之间的转换(Dufresneetal.2000)。在氮源缺陷型筛选培养时筛选出的胶胞炭疽菌的CgDN3基因编码由54个氨基酸组成的分泌蛋白，缺失该基因使菌株失去侵染能力，通过显微观察发现该分泌蛋白能抑制寄主产生的过敏性坏死反应(Stephensonetal.2000)。越来越多的致病因子及致病机理在被一步一步地解开，帮助我门更加深入地了解病原菌的致病机理。cAMP又称环磷酸腺苷，在细胞内扮演含氮类第二信使的角色，可以接受其他激素或信号刺激腺苷酸环化酶催化ATP的环化反应。该信号途径的相关基因在稻瘟菌突变体的研究中被证实与附着胞的形成密切相关，在一些附着胞难以形成并失去侵染能力的突变体中，外源喷施cAMP或代替物一定程度上能够回复其附着胞形成的能力，侵染能力也同时得到恢复(Xuetal.1997)。同时Xu也发现cAMP信号途径还参与了碳代谢、菌丝的极性生长与交配过程中的细胞融合等过程(XuandHamer1996)。AC是cAMP合成的上游关键基因，敲除该基因可以直接导致cAMP的和成缺陷，稻瘟菌的AC缺失突变体营养生长和毒性均受到了极大的抑制，外源回补cAMP则可恢复这些缺陷表型。这类基因是相对保守的。用不同菌的AC基因回补AC突变体也能够恢复其缺陷表型(Tzimaetal.2010)。ATP环化形成的cAMP可以激活蛋白激酶PKA，调节下游细胞磷酸化，PKA是一个异源四聚体蛋白，含有两个调节亚基和两个催化亚基，当调节亚基接受到cAMP信号分子的时候，调节亚基分离，释放催化亚基磷酸化下游基因，级联放大信号(Bockmühletal.2001;Priyatnoetal.2012)。PKA是调节cAMP途径信号，磷酸化下游基因的关键环节，虽然在各个物种中相对保守且大部分是致病性相关，但突变体与沉默该基因发现表型不尽相同，其原因与其催化下游的基因池有关，如在稻瘟菌中主要负责部分营养生长及黑色素影响的附着胞的形成(Hartmannetal.1999)。PKA所磷酸化下游的基因在各个物种中有所不同，且参与多种生命进程；如tRNA转录进程、体内稳态、钙离子通道、铁离子运输、染色质重建、氮代谢以及有丝分裂的S期(Guoetal.2016)。cAMP的浓度也被其他基因调控，与AC相反，磷酸二酯酶（PDE）可以水解cAMP失活为5-单磷酸核苷（AMP），对形成反馈循环cAMP，是之在体内维持一个稳态；此外，cAMP的浓度还与PDE在细胞内的分布有关(Mitsuzawa1993)。研究该保守信号通路有助于我们了解锈菌的侵染、定殖及凋亡(Cupertinoetal.2012)。锈菌已知的致病因子候选基因已经有了初步的研究成果。朱对锈菌中MAPK信号通路相关基因做了分析发现在锈菌中的这些保守通路基因存在冗余状态，只有个别基因沉默后表型发生明显变化如PsFUZ7，该基因在侵染初期上调表达，利用病毒介导的基因沉默技术（BSMV-VIGS）沉默该激酶，菌丝的蔓延受到了明显的抑制，利用小麦转9 基因技术成功获得两个稳定抗病株系，利用锈菌的该基因互补稻瘟菌中对应该基因的突变体mst7可以恢复稻瘟菌的附着胞形成和能力，酵母中过表达PsFUZ7导致酵母细胞发生形变细胞核也无明显轮廓，抗外界的胁迫能力增强(Zhuetal.2017)。该通路的另外一个基因PsKPP4在沉默后锈菌发病表型也产生明显变化，PsKPP4含有一个SAM结构域，且该结构域可以与衔接蛋白（PsUBC2）结合，用该基因互补稻瘟菌对应的突变体mst11能够恢复其致病表型，且在烟草中过表达该基因能够抑制bax诱导的过敏性坏死反应（Zhuetal.2018）。转录因子PsPRF1处于MAPK及PKA信号通路的下游，具有DNA切割的作用，可以引起植物细胞和酵母的坏死，是一个锈菌中潜在的致病因子。转录因子PsSTE12在酵母中的同源基因主要发挥在交配中的作用，锈菌也有有性生殖阶段，用该基因互补酵母中的突变体也说明了该基因参与了有性生殖过程，互补稻瘟菌同源基因突变体mst12恢复了部分致病能力。利用BSMV-VIGS在锈菌侵染过程中抑制该基因的表达后，锈菌的致病力下降，菌丝生长受到抑制(Zhuetal.2018)。锈菌是进化高等的真菌，保守的致病因子在锈菌中得到了部分的验证，然而锈菌的防治现状依然严峻，对于锈菌的致病机理的深入探讨也越来越关键。1.4.2侵染分化相关基因真菌在侵染寄主的时候会分化出一系列就够帮助其侵染并从寄主中吸收营养，比如芽管、侵染垫、侵染丁、附着胞、吸器、气孔下囊等，其中与致病力密切相关的有附着胞和吸器。附着胞的产生和保持都由环境和遗传因素共同调控，附着胞可以在植物表面形成高压足以刺穿植物表皮(BechingerandBastmeyer1999)。稻瘟菌的附着胞的压力是由其内甘油的摩尔浓度决定的(DeJongeetal.2011),附着胞壁上的黑色素可以阻止甘油的外泄，因此，黑色素缺失突变体不能形成正常的附着胞而失去侵染能力(Valentetal.1991)，在炭疽菌中，黑色素起着相似的作用。此外，黑色素还能够增强细胞壁的强度，促进病原菌的侵染(Talbotetal.1993)。调节氮代谢的NPR1和NPR2基因也与附着胞的形成有关(LauandHamer1996)。一种在孢子中特异表达的转录因子ACR1与其他转录因子具有的很低的相似性，缺失这个基因的稻瘟突变体难以形成正常的分生孢子，附着胞受损也导致其致病性丧失(Dezwaanetal.1999)。pth11基因编码了一个细胞膜蛋白，缺失该基因后突变体无法识别宿主表面而无法形成正常的附着胞进而丧失毒性(Dezwaanetal.1999)。而OPR1基因缺失突变体对附着胞形成没有影响，却能够使其丧失侵染能力(Villalbaetal.2001)。在菜豆锈菌中分离到了一类与侵染分化相关的基因并命名为INF类基因(Hochetal.1987)。菜豆锈菌的UaINF24在侵染初期3-4h表达，通过RNAi体外干扰发现该基因与菜豆锈的附着胞形成关系密切。UaINF56编码一个和核包涵体和纺锤体微纤丝相关蛋白，在附着胞的形成过程中也发挥作用(Xuetal.1992)。INF类基因在锈菌中特异存在，张金山（2013）通过blast分析也有此发现，并且克隆到了五条条锈菌中的侵染分化相关基因，沉默这些基因，对条锈菌的致病性有很大的打击，沉默后部分10 后代夏孢子的形态都发生了改变。1.4.3效应蛋白效应蛋白作为一类寄生菌与寄主互作过程中的主要对话物质近些年已被广泛研究(RaffaeleandKamoun2012;Stotzetal.2000)，病原菌以各种各样的方式从寄主植物吸收营养，有活体寄生、死体寄生以及共生等体系，病原菌分泌多种类型的效应蛋白或者次生代谢产物增强、诱导、减弱或欺骗寄主植物对于病原菌入侵的抵抗(Loetal.2015;Zuccaroetal.2014)。一般情况下侠影蛋白通过内质网传输到高尔基体后分泌体外，在这个过程中一种能够起到分泌作用的N端短肽被作为生物信息学上识别效应蛋白的一个标志，新一代的测序技术为我们了解效应蛋白提供了一个迅速直观的途径，稻瘟菌的基因组数据在2005年的公布，极大促进了病原真菌的研究，越来越多的真菌基因组数据也逐渐被揭示，不仅如此，寄生性昆虫、寄生性植物等也将被大规模测序(Rovenichetal.2014)。从进化上说，病原菌和寄主植物协同进化造就了两者如今的基因组，而效应蛋白就是两者之间的纽带，效应蛋白在病原菌与寄主互作后从病原菌中分泌至寄主细胞，在不同的侵染时期和不同的寄主器官中起效(OkmenandDoehlemann2014)。真菌效应蛋白的种类一定程度上决定了真菌的生活方式和寄主范围，一般情况下，效应蛋白是一类小于300个氨基酸的可分泌的非保守的蛋白质，通常含有丰富的半胱氨酸帮助其三级结构上二硫键而在体外稳定存在，然而一些效应蛋白也非常大，而且具有保守的功能结构，半活体寄生真菌中的分泌蛋白数量最多，原因是其存在两个寄生阶段；其次是活体寄生真菌如进化高等的锈菌家族，因为锈菌中除了亚麻锈菌只在亚麻上完成自己的生长周期，其他的锈菌菌被观察到了有性生殖阶段，也就是存在转主寄主，不同的寄主和生长阶段导致其分泌蛋白的数量相对较高。效应蛋白的进化是在躲避寄主的检测和毒性的选择中权衡出来的，长期的相互适应是新的效应蛋白不断产生代替失去毒性的蛋白或者捕获新的寄主靶标，效应蛋白的多样性也是强大的选择压力的结果。很多效应蛋白属于来自同意祖先的多基因家族，这些基因家族有可能是种间特异的，也有可能是在整个真菌中普遍存在的，卵菌中起到类似半胱氨酸抑制剂作用的效应蛋白的多样性与寄主中半胱氨酸蛋白酶的多样性非常相似，这也验证了效应蛋白进化成多基因家族过程中的产生-消失的进化模型(NeiandRooney2005)；另外一种进化方式是基因的水平转移，如禾谷镰刀菌将致病染色体转移到寄主中的过程(Maetal.2011)。由于真菌尤其是破坏性极强的锈菌和丛枝菌的遗传操作比较困难，真菌效应蛋白的研究远远滞后于细菌，不过技术的发展已经可以逐渐克服这些弊端，对于这些真菌效应蛋白的研究方法会越来越多。锈菌是目前真菌中进化最为高等的专性寄生真菌，已经有七千多种锈菌在世界各地被发现，侵染禾本科植物和豆科植物的锈菌对于经济和粮食的威胁最大。锈菌的侵染结构具有和其他物种不同的特点，吸器的形成是锈菌进化高等的标志(VoegeleandMendgen2011)，亚麻锈菌可以通过吸器将合成的效应子分泌进入亚麻的细胞中，部分11 效应子可以被亚麻细胞识别诱导产生抗病反应，其中研究最为透彻的是蛋白质小含有丰富的半胱氨酸的分泌蛋白：AvrM,AvrL567,AvrP123,和AvrP4。杆锈菌中PGTAUSPE10-1基因可以在含有R基因的小麦上引起坏死反应，通过全基因组测序和对锈菌天然突变体的分析发现了抗杆锈病的R基因Sr35和Sr55对应的无毒基因AvrS35和AvrS55。AvrM的蛋白质晶体结构阐述了该无毒基因的毒性特征和在寄主体内的转运机制(Thomasetal.2013)。免疫组化技术和电子显微镜技术的快速发展也为效应子的功能的解析提供了快速的途径。蚕豆锈菌中一个保守的效应子RTP1通过免疫胶体金技术发现其出现在在菌的吸器周围的寄主细胞中，首次直观地证明了效应子通过吸器分泌进入寄主的猜测，后续研究发现该蛋白参与了病原菌的吸器纤丝的形成来维持吸器的形态(Kemenetal.2013;Pretschetal.2013)。条锈菌中的PEC6也是一种小的富含半胱氨酸的效应子，在寄主中能够抑制细菌引起的PTI和活性氧迸发，并且发现其能够靶标寄主小麦的腺苷酶(Liuetal.)。锈菌效应子PSTha5a23也可以抑制寄主的PTI反应，沉默该效应子基因，锈菌的潜育期延长，生长受到抑制(Chengetal.2016)。与其他病原菌比较，锈菌的研究相对滞后，特别是效应蛋白的研究也才刚刚开始，但是，随着新一代测序技术、免疫荧光技术、遗传转化技术的发展，对于这方面的研究会越来越迅速，也将更加加深我们对锈菌致病的机理认知。病原菌通过分泌效应子调节寄主的免疫反应促进其成功地侵染和定殖。目前越来越多的研究表明多种多样的效应蛋白通过参与进寄主的各种免疫途径中来调节寄主的免疫反应。（1）效应子调节寄主基因的转录翻译过程。卵菌中具有RxLR保守motif的效应子PsPSR1影响寄主sRNA的累积，而PsPSR2则能靶标特定的siRNA，卵菌无毒基因PsAvr3c靶标mRNA前提蛋白，通过调节寄主的转录过程调控寄主免疫反应(Huangetal.2017;Qiaoetal.2013)。效应子AvrPm2编码一个具有RNA降解酶功能的蛋白进入寄主体内发挥作用。（2）效应子参与调节寄主的基础抗病反应。稻瘟菌中效应子AvrPi9可以通过靶标抗病基因Pi9参与寄主的基础防卫反应中，另外一个效应子DES1同样可以抑制水稻的基础防卫反应，促进稻瘟菌的定殖(Chietal.2009;Wuetal.2015)。（3）效应子靶标主效抗病基因调控寄主免疫。灰霉菌的CP1效应子可以靶标植物的PR1抗病基因调控寄主免疫(Yangetal.2018)。细菌无毒基因AvrPto靶标寄主的Pto酶基因(OhandMartin2011)。效应蛋白中含有参与氧化还原反应过程Nudix水解酶的也在细菌、卵菌和真菌中广泛存在(DongandWang2016)。细菌效应子通过与NPR1互作调节寄主的免疫反应，锈菌中的PNPi效应子也存在类似的作用(Chenetal.2017;Wangetal.2016)。（4）效应子调控活性氧途径相关基因调控寄主免疫反应。玉米瘤黑粉中的Pep1分泌蛋白靶标过氧化物酶POX；卵菌的植物细胞死亡诱导效应子可以靶标过氧化氢酶CAT(Hemetsbergeretal.2012;Zhangetal.2015)。（5）效应蛋白通过靶标寄主信号通路上游基因调控寄主免疫反应。丁香假单胞细菌HopF2效应子可以通过抑制MAPK信号通路的磷酸化级联放大反应抑制PTI。卵菌的Avr3a可以和泛素连接酶互作避免被蛋白酶12 体降解从而抑制激发自INF1引起的过敏性坏死(Bosetal.2006;Bosetal.2010)。效应子调控寄主免疫的机理正在逐步被解析，了解这些和效应子的毒性功能，对抗病机理和抗病育种都有非常大的助益。1.5小麦对条锈病的抗性小麦对条锈病的抗性可以大致分为全生育期抗性（也称幼苗抗性）和成株抗性（APR）(Chen2013;2005)。幼苗期抗病性是在植物生长的各个阶段都对条锈菌有抗性，然而这种抗性容易被新的毒性小种克服(LineandQayoum1992)；而成株期抗病性则表现为苗期感病，成株期抗病的特点，这种抗性通常具有针对不同生理小种的高水平抗性(LinandChen2009)。非寄主抗性是植物抵抗大部分病原菌的最基础最普遍的抗性，条锈菌针对不同寄主进化出了很多小种转化型，如小麦条锈、大麦条锈、禾草锈等，而这些小种之间一般情况下不能侵染与之不匹配的寄主，这些专化型菌株与不匹配的寄主之间的抗性非常类似于非寄主抗性，在这里用非寄主抗性表示。寻找这些非寄主抗性的基因对于锈病的防治也非常有益(Jafaryetal.2006;Suietal.2010)。1.5.1Yr基因的克隆控制条锈菌的最环保最有效的策略是寻找小麦的抗病基因并利用这些抗病材料合理种植并辅以适当的化学肥料和农药，这些可以作为抗病育种候选的基因就是R基因。由于锈菌的毒性变异太快，R基因被大致分为小种特异的和具有普遍抗性的Yr基因。大部分的小种特异的Yr基因含有核苷酸绑定位点和亮氨酸富集的重复序列（NBS-LRR），含有这种保守结构域的大部分都是小种特异的R基因，如抗叶锈菌基因（Lr1，Lr10，Lr21）、抗杆锈基因（Sr22，Sr33，Sr35，Sr55）。目前已经有近80个抗条锈病基因被定位和命名，只有一个小种特异的Yr10被克隆出来，将该基因含有典型的CC-NBS-LRR结构域，通过基因枪法轰击进入感病品种Fielder中，在接种特定小种中感病的表现型转变为明显的过敏性坏死反应。Yr5也是一个NBS-LRR的抗病基因，然而含有Yr5的品种对锈菌小种的抗病性比Yr10效率更高。在条锈菌和小麦抗病体系中，非小种特异的抗性包括慢锈性和有条件抗性，即病原菌可以定殖和生长，但是生长缓慢甚至不能形成完整的侵染循环。Yr36就是这么一个温敏型抗病基因，在小麦的整个生长周期均能起作用，但是受到温度变化的调节(Chen2013;Uauyetal.2005)。其他非小种特异的基因Lr34/Yr18/Sr57/Pm38，利用这些基因的种植资源通过转基因或者抗病育种可以创制具有持久抗病性的品种。1.5.2抗性相关基因的功能分析植物进化出很多防卫基因来避免和减弱病原菌的定殖和繁殖。其中一部分非常重要的低分子量在防卫机制中被激活的蛋白质被命名为抗病相关蛋白（PRs）。β-1,3-葡聚糖酶也就是PR1基因，在小麦和条锈菌非亲和互作体系中表达量比亲和体系高很多倍。而13 PR5基因能够激活茉莉酸信号通路，在小麦细胞壁上富集。其他抗性相关基因还有很多中类型。1.5.2.1热激蛋白热激蛋白（HSPs）是另外一类普遍的高保守的抗性蛋白。在烟草中，HSP70和HSP90是病原菌激发子INF1诱导HR反应过程中的组成部分，在其上游起作用并激发MAPK途径的信号放大(Kanzakietal.2003)。小麦中TaHSC70在小麦抗锈病中起着重要作用，并参与茉莉酸信号转导途径。很多报道的R蛋白都被证明需要HSP90s的参与才能起作用，如拟南芥中的R蛋白RPM1需要HSP90s才能与丁香假单孢的AVR蛋白互作诱导产生过敏性坏死(Hubertetal.2003)，HSP90s通常有两个伴侣蛋白STG1和RAR1，在很多单子叶和双子叶植物中均参与了与R蛋白互作的过程。1.5.2.2SNAREs蛋白家族SNAREs蛋白家族是真核生物里囊泡转运过程的关键组成原件(Heeseetal.2001)，SNARE复合体通过与特定细胞内的三个靶定囊泡融合形成特异的SNARE螺旋结构。植物中的SNARE基因很多已经被证明与抗病性相关，如大麦中的HvSNAP34在白粉病的非寄主抗性中参与了胼胝质的形成，NPSN11与胞质分裂过程中新的细胞壁形成的细胞壁前体有关，而拟南芥中该基因调控的是胞质分离过程中的膜融合(Eletal.2013)。另一个拟南芥高尔基体相关的AtMEMB12被miR393靶定并引起PR1的表达（Zhangetal.2011c）。过敏性坏死反应是经典的植物防卫反应，是细胞程序性死亡的一种形式，植物细胞坏死可以抑制病原菌的生长，而引起植物过敏性坏死的信号途径有很多，最早起反应的便是活性氧和离子通道内离子的累积。1.5.2.3HR相关蛋白与过敏性坏死相关的基因有PR2和β-葡聚糖酶，过表达辣椒和水稻中的HIR1基因可以引起自发的过敏性坏死类似的症状和抗病相关蛋白的表达，对于细菌、卵菌和寄生疫霉菌的抗病性也有显著提高(Jungetal.2008;JungandHwang2007)。而动物中负调控细胞坏死的如凋亡蛋白酶、bcl-2、DAD1等部分基因在小麦中也被克隆到了。小麦中的单脱水抗坏血酸还原酶TaMDAR6是一个植物PCD的负向调控因子，沉默该基因后，活性氧的累积和过敏性坏死面积显著提高，锈菌在该植株上的致病能力也被显著抑制。凋亡蛋白酶是动物程序性死亡过程中的执行者，目前没有在植物中发现该蛋白的同源基因，然而一类半胱氨酸依赖的的半胱天冬蛋白酶在植物、真菌和原生动物中广发存在，该蛋白一般与其他坏死相关蛋白形成复合体发挥作用，如液泡加工酶和枯草杆菌蛋白酶。根据20-likeandP10-like两个保守结构域的连接结构不同将这种蛋白酶分为I型和II型，小麦中的I型半胱天冬蛋白酶TaMCA1和II型半胱天冬蛋白酶TaMCA4在调控细胞坏死过程中起相反的作用。14 1.5.2.4细胞骨架相关蛋白细胞骨架在过敏性坏死反应中也扮演着重要的角色，细胞骨架相关的基因如actin、profilin、actinrelatedprotins（ARPs）、actin-depolymerizingfactors（ADFs）、actinbindingproteins（ABPs）等，其中ADF主要与生物胁迫过程密切相关，大麦中的ADF3的异常可以破坏大麦细胞骨架的完整性，引起类似感病基因mlo的感白粉病表型；拟南芥中ADF4可以被细菌效应蛋白靶标来调控寄主抗病基因RPS5介导的抗病反应；大麦的ADF3也参与了rpg-4介导的抗杆锈病过程中。小麦中的ADF7可以执行微丝绑定和微丝切割的功能，沉默ADF7可以住降低小麦对非亲和条锈小种的抗病性和侵染过程中的活性氧累积，而小麦中另外一个ADF3基因则是一个负向调节因子，该基因在亲和互作中显著上调表达，沉默ADF3，小麦对条锈菌的抗性显著提高，侵染过程中的活性氧和坏死累积也显著上调(Tangetal.2015)。1.5.3转录因子植物应对外界的反应由很多转录因子调节下游基因完成。转录因子（TFs）特异结合下游基因位点或者与其他蛋白形成复合体调控下游信号网络参与植物的各项生命活动中，目前已经有超过五十个转录因子家族基因在拟南芥和水稻中被克隆出了，其中主要包括NAC、WRYK、C2H2-type锌指结构转录因子、Apetala2/ET反应原件绑定蛋白、MYB转录因子等。1.5.3.1NAC转录因子NAC蛋白是一类植物特异的转录因子，其N端有着高度保守的DNA结合结构域而C端的结构域主要起着转录活性调节功能。在水稻中过表达OsNAC4可以引起过敏性坏死反应，沉默该基因的转基因株系失去了对非亲和的细菌的抗病性；在小麦与条锈菌互作体系中，TaNAC4和TaNAC8在非亲和体系中上调表达，外源喷施茉莉酸甲酯和乙稀以及环境刺激可以诱导这两个基因的表达。1.5.3.2MYB转录因子MYB转录因子含有大约50个氨基酸残基组成的MYB结构域形成螺旋-转角-螺旋结构插入DNA的凹槽中。MYB转录因子主要参与调控次生代谢、细胞形态、和抗病性。植物中第一个被发现的是玉米中的MYB基因C1，该基因主要调控花青素的生物合成；拟南芥中的AtMYB30主要参与信号传导和调控水杨酸的合成，在对病原菌抗病性中正向调节过敏性坏死反应；水稻中OsMYB4转基因株系显著提高率水稻的抗寒、抗冻、紫外辐射、抗旱和抗病性(Lauraetal.2010;Vanninietal.2006)。小麦中的TaMYB4基因在条锈菌侵染初期诱导表达，参与了水杨酸、乙稀和茉莉酸的信号通路；该基因主要定位到核中，其C端有转录调控活性；沉默该基因可以显著降低PR基因和TaPAL的转录水平。15 1.5.3.3bZIP转录因子和EIN3转录因子bZIP转录因子含有典型的核定位信号序列可以结合DNA，其C端含有亮氨酸重复结构域产生两性螺旋结构与其他蛋白质互作。bZIP转录因子优先绑定ACGT核心位点如G-Box（CACGTG）。双子叶植物中的bZIP转录因子大部分和植物的抗性相关。小麦中的bZIP转录因子尚未见报道。ET-insensitive3(EIN3)参与率外界条件刺激和病原菌攻击情况下的植物免疫反应。其中的部分基因含有DNA结合的活性位点，这个位点推测与启动很多病程相关蛋白的表达有关；如烟草中的EIN3-likeTEIL直接结合PR1a基因的启动子序列。EIN3作为乙稀信号通路的重要基因，也可以响应茉莉酸信号通路。小麦中的EIN3同源基因TaEIL1在小麦与锈菌非亲和体系中上调表达，并参与了SA，JA和ET信号途径中。1.5.3.4LSD转录因子某些植物基因的突变体会表现出类似的过敏性坏死反应的表型，反向遗传学发现这个是由一类LSD基因控制的，也就是说LSD家族基因是植物过敏性坏死的负向调节因子。LSD基因家族含有典型的C2C2-锌指结构，根据含有锌指结构的个数分为I型，II型和III型。拟南芥中LSD-one-likeproteinsLOL1（At1g32540），LOL6(At1g79350)和LOL2（At4g21610）以及凋亡蛋白酶AtMC1(At1g02170)，AtMC2(At4g25110)，AtMC3（At5g64240）均含有C2C2-锌指结构并参与到了细胞坏死的进程中，而AtbZIP10能够和AtLSD1结合阻止AtbZIP10进入细胞核中发挥作用。LSD1在拟南芥中与偶联水杨酸通路调控坏死，试验发现LSD1可以激发SOD的表达；拟南芥突变掉LSD1和PAD4、EDS1的突变体细胞坏死的表型完全消失，说明EDS1和PAD4所参与的R基因引起的坏死反应事实上和LSD1所参与的细胞坏死有着重叠的部分。水稻中LOL2基因分别在水稻和烟草中过表达后，两种植株对细菌病害的抗性均有所提高，且抗病相关蛋白如PR2、PR5等也都上调表达(XuandHe2007)。小麦中的LSD1是小麦过敏性坏死的负向调控因子，含有三个典型的锌指结构，在非亲和互作体系中显著上调，通过原生质体定位发现该转录因子定位于细胞核(Guoetal.2013)。1.5.4转基因技术育种传统育种周期长，种质资源的更新赶不上锈菌毒性小种变异的频率，导致针对锈菌的育种一直处于停滞阶段，基因的敲除和沉默是目前普遍的遗传研究手段(HutvágnerandZamore2002)，普通的遗传转化手段在基因组复杂的小麦(Lietal.2012)和营活体寄生真菌锈菌中应用难度大，且周期长不稳定，极大地限制了针对锈菌的抗病性育种，病毒介导的基因沉默技术（BSMV-VIGS）可以在小麦和锈菌系统中引起瞬时沉默，是目前功能基因研究的主要手段。基于此技术发展出来的寄主诱导的基因沉默（HIGS）以及转基因技术育种是目前为止非常有效的抗病育种手段。16 1.5.4.1基因沉默真核细胞通过特定的RNA翻转机制抑制外来遗传因子，在这里称为RNA沉默。沉默分子来自转基因、病毒、类病毒或转座因子，其机制涉及核酸酶和指导RNA。这些沉默分子被称为小干扰（si）RNA，它们是目标RNA的反向互补物。在病毒诱导的RNA（基因）沉默（VIGS）中，siRNA特异性决定簇源自病毒RNA。这种机制是非常有效的，因为一旦被异常或外源RNA分子激活，它就可以对抗任何与触发分子具有序列同源性的细胞质RNA种类。因此可以将RNA沉默想象成在核酸水平上运作的免疫系统的一种形式。RNA沉默过程首先在转基因矮牵牛中发现，其中导入的转基因及其同源内源基因的表达被共同抑制。随后，显示与植物基因组没有序列同源性的转基因可以作为该抑制机制3的触发因子以及靶标。在动物中也观察到RNA沉默，包括预先植入双链（ds）RNA的小鼠胚胎，RNA干扰（RNAi）被激活。RNA沉默的机制逐渐被解开，并且似乎在各个生物中高度保守。最近在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans），果蝇（Drosophila）以及在脉孢菌属，衣藻属和拟南芥属中进行的最近的遗传和生物化学研究证明了这一点。在动物中，RNA沉默的作用是控制转座因子。在高等植物中，超过90％的病毒具有高度复制的RNA基因组，基于RNA的性质，RNA沉默的高效率和反式作用特性使其成为抗病毒的有效防御机制。真菌和卵菌感染植物，RNA沉默似乎不可能在宿主相互作用中具有直接作用，因为两种基因组和它们的RNA通过两套质膜和细胞外基质彼此分开。然而，有新的证据表明植物和丝状病原菌使用RNA沉默来相互影响。宿主诱导基因沉默（HIGS）影响丝状病原菌中的基因表达并且丝状生物体诱导的基因沉默以相反的方向起作用。还有可能将病原菌编码码的RNA沉默抑制子转移到宿主中，从而影响沉默转录过程。RNAi过程通过双链RNA（dsRNA）和病毒小干扰RNA来激活(DingandVoinnet2007)。dsRNA通过DCL4切割成为siRNAs(Llave,C2010)。随后，这个过程可以通过植物RNA依赖性RNA聚合酶1（RDR1），RDR2和RDR6放大，将单链RNA大量合成dsRNA(Donaireetal.2008)。所产生的siRNA结合Agronaute（AGO1）复合体并提供靶向序列(Quetal.2008)，含有siRNA的AGO复合体可导致内切核酸裂解和同源RNA的翻译抑制。而siRNA又可以大规模引发dsRNA的合成，进一步扩大沉默反应(Beneditoetal.2004)。1.5.4.2HIGS目前为止，HIGS是分析真菌或卵菌基因功能的非常有效的工具。然而，鉴于植物和真菌中siRNA的丰富性和多样性，内源性植物RNA沉默靶向丝状病原菌中的基因的内在机制仍不清楚。我们不知道HIGS中的转移是长RNA还是siRNA。如果植物DCL蛋白的突变阻止了HIGS效应，那么转移将是siRNAs，如果不是，那么它将涉及长RNA。这项试验尚未用丝状生物的HIGS进行验证，但在拟南芥与棉铃虫之间的跨境沉默中，寄主植物dcl2,3和4的突变没有影响(Wuetal.2012)。它可以是转移涉及由DCL1产生17 的siRNA（在拟南芥中有四种DCL蛋白质）或长的RNA，然后将其在受体有机体中切成小块。图1-3：RNA沉默用于发展植物病害控制策略的一般机制和潜在应用。Figure1-3GeneralmechanismandpotentialapplicationofRNAsilencingforthedevelopmentofplantdiseasecontrolstrategies.(Cristianoetal.2011).在HIGS中，RNA转移是从宿主到丝状生物体。然而，也存在向相反方向转移的可能性。真菌从复制的转座子中产生沉默RNA，经由真菌Dicer处理，然后转运到植物细胞中（最可能是双链形式的siRNA），在那里它们与植物AGO1结合并沉默植物防御基因表达。如果HIGS是单步机制，那么沉默RNA必须过量。然而，植物和真菌都支持产生具有传递性和扩增潜力的次级siRNA，如病毒RNA沉默。因此，来自宿主植物的低丰度siRNA可能在真菌中引发大的沉默效应，反之亦然：植物与丝状真菌之间的跨界沉默需要涉及大量的RNA的转移。BSMV沉默系统是单子叶植物中基因功能研究的主要工具，Yinetal.(2009)提出来用该系统研究小麦与条锈菌的基因功能。目前已有大量的小麦和锈菌的基因功能利用该系统进行研究。1.5.4.3小麦的遗传转化技术转基因育种是我国分子育种的主要方向，加强农艺性状，提高抗性是转基因育种的主要目的。小麦的大规模基因组和基因冗余是小麦遗传转化发展迟缓的最大原因，随着新的技术的产生，小麦的转基因育种也日趋成熟，主要的几种转化技术有基因枪法、农杆菌转化法、花粉管通道法、花粉转化法、其他转化法。转基因所用受体材料多选取高18 分化能力的品种的幼胚如Bobwhite、西农1376、杨麦158等，采用UBI1启动子和E35S启动子启动基因的表达，所采用的筛选标记有潮霉素抗性、草铵膦抗性、草甘膦抗性、双丙氨膦抗性、GUS染色等，将抗逆、抗虫、抗病、优质增产等基因导入小麦并稳定遗传是小麦转基因的主要方向。基因枪法因其受体广泛，操作简单而成为小麦遗传转化的主要方式，其原理是通过金属颗粒附着载体，通过高速运动进入小麦的受体，小麦受体自身修复分化，将载体携带的基因转入小麦基因组。金属颗粒经过超声混匀，受体细胞经过高渗产生质壁分离提高受体接触面积并启愈伤活性，这些措施能够增加基因枪转化效率，因此该方法要求受体的再生能力强，受体的选择也是提高转化效率的方法之一。农杆菌介导法在其他物种中已经成熟应用，然而农杆菌侵染单子叶植物的体系一直都处于盲目状态，农杆菌是将其质粒上的一段DNA插入到寄主的染色体中，这种方法简单高效稳定而被大规模应用，而近年来农杆菌侵染单子叶植物的研究越来越多，日本建立了能够侵染成熟胚的小麦转基因技术体系(Hamadaetal.2017)，我国中科院遗传所也发现了容易被农杆菌侵染的小麦受体材料并成功构建小麦农杆菌转化体系(Zhaoetal.2017)。花粉管通道法是一种染色体水平转移的遗传转化体系，最开始是在发展小麦远缘杂交育种中开发的方法，其具体过程是在在小麦开花授粉后会形成的花粉管通道，在这个时期直接将外源DNA导入花粉管中，这个阶段的操作使得外源DNA在受体中易于整合，但操作困难周期长也是其缺点。近年来有小麦转基因新的技术产生，即花粉转化法。该方法是基因枪法的升级版本，将载体偶联到金颗粒上通过与大量花粉混合在磁场中高速旋转让金颗粒通过花粉上的孔洞进入花粉中并通过正常授粉完成目的基因进入受体的转化，该方法可用于大规模分子育种，结合了基因枪法和花粉管通道法的优点，是非常有效的转基因育种体系。其他的转基因方法还有电激法、PEG转化法等，这些方法由于其操作的简便性和瞬时特性在瞬时操作中广发应用，然而在育种中由于受体材料再生困难等缺点，育种专家偏向于不采用这种方法。转基因育种极大地拓宽了传统育种的局限，并为传统育种提供大量的材料，然而目前人民群众对于转基因技术的安全性还存在大量的猜测，国家的政策给与了强有力的支持，然而群众的认识和转基因技术的安全性还需要科研人员的进一步实践研究和理论普及。1.6本研究的目的和意义小麦条锈病是世界农业病害难题，严重危害小麦的产量，然而其有性生殖过程和大规模流行使得毒性小种频繁变异，不断攻克抗病材料，对于锈菌毒性变异和致病性的研究目前处于初级阶段。小麦条锈菌是活体计生真菌，需要从活体细胞中吸收营养，并向寄主中分泌效应蛋白调控寄主的免疫系统，促进侵染。在锈菌与小麦的互作过程中，一类基因主要负责条锈菌的生长及致病能力，这类基因相对保守，广泛存在于各种病原真19 菌中。另外一类主要负责分泌进入寄主的体内，通过调节寄主的免疫系统达到促进病原菌侵染的目的。锈菌致病性的研究和转基因育种为迅速建立抗病材料提供理论和材料基础。本研究借助小麦-小麦条锈菌互作体系进行了以下几个方面的研究：（1）鉴定了小麦条锈菌重要效应蛋白PstGSRE1，并初步鉴定了其作为效应蛋白和致病因子的功能。（2）利用HIGS技术构建该基因的RNAi转基因沉默载体，通过基因枪获得该基因的永久沉默植株，经过多代的抗病选育，在T4代获得三个抗病性提高的转基因株系。（3）为了解析该效应蛋白在调控寄主免疫系统中所起的作用，我们利用酵母双杂交系统筛选到了该效应蛋白的候选靶标,利用Pull-down技术和Co-IP技术确认了效应蛋白与其中一个靶标TaLOL2的互作关系。（4）对于效应蛋白在小麦中的靶标（TaLOL2）的功能进行了初步的分析，确认其作为活性氧正向调控因子调控小麦抗病性。（5）在烟草体系中初步明确效应蛋白与靶标的互作模式，通过荧光标签直观地展示了效应蛋白存在情况下寄主靶标调控寄主免疫的模式，利用ChIP-seq初步明确效应蛋白调控寄主靶标转录因子的下游调控模式。（6）鉴定了小麦条锈菌重要致病因子蛋白激酶A的催化亚基PstCPK1，分析了其主要的功能和致病机理。（7）利用HIGS技术构建了沉默PstCPK1的小麦抗病材料，确认转基因株系的抗病分子机制，进一步探究了转基因株系的组织细胞学和分子水平的变化。20 第二章条锈菌重要效应蛋白PstGSRE1功能鉴定2.0前言锈菌作为专性寄生菌，依靠吸器吸收营养并分泌毒性因子进入寄主，调节寄主免疫帮助其建立持久的寄生关系，吸器作为病原菌与寄主间互作交流的界面扮演着尤为重要的角色。早在1988年就有研究人员对蚕豆锈菌的侵染结构进行了蛋白差异表达分析，在之后的几年中，陆续鉴定出了菜豆锈菌中和侵染分化相关的INF24、INF8、INF56等基因，INF24参与了菜豆锈菌附着胞的形成；并且之后有研究证明疏水蛋白又叫棒状蛋白在侵染结构构建中发挥重要作用，这些蛋白是具有分泌功能的，并且参与了致病菌的毒性。RTP1就是其中最典型的一个效应子，不仅参与了毒性，还与侵染分化过程中的微丝骨架建成密切相关。甘氨酸富含的蛋白质是高等植物中细胞壁构成的重要组成蛋白，近年来还发现该种类型的蛋白在真菌中也与形态建成有关，如小孢子虫中一个甘氨酸丝氨酸富含的基因编码的是一个孢子壁蛋白；稻瘟菌中甘氨酸富含的效应子Rbf1与稻瘟菌侵染寄主过程中的焦点形成密切相关；因此我们在锈菌侵染的数据库中检索了一类甘氨酸富集的蛋白质，通过筛选在侵染初期高表达的基因，我们得到一个富含甘氨酸丝氨酸的具有分泌功能的效应子，和菜豆锈菌的INF24直系同源的PstGSRE1，并对其作为效应子的功能进行了系统的分析。在侵染过程中病原菌分泌进入寄主的效应子是病原菌毒性的主要组成部分，效应子进入寄主首先响应的是广谱的寄主免疫反应PTI，经过长时间的进化，大部分效应子能抑制PTI反应而进入效应子诱导的寄主的免疫反应过程（ETI）中，能够和R基因识别的效应子即为具有无毒功能的效应子，可以被寄主识别并迅速引起过敏性坏死反应，然而还有一部分效应子没有能够被寄主识别而顺利进入寄主体细胞，从而调控寄主的各种免疫途径，使得寄主无法抵抗病原菌的入侵，而顺利建立寄生关系。条锈菌的效应子研究现在属于初级阶段，只有部分效应子的功能被初步解析，如PSTha5a23、PEC6、PNPi、PstSCR1等，因此，确认锈菌中重要的效应子锈菌致病机理研究的主要方面。2.1材料、试剂及仪器2.1.1试验材料本试验采用明贤169扩繁条锈菌生理小种CYR23，用水源11扩繁条锈菌生理小种CYR31和CYR32。所用的细菌三型分泌系统菌株为荧光假单包菌株EtHAn，载体为EDV6；验证信号肽分泌所用的酵母菌株为YTK12，载体为pSUC2；大麦条纹病毒诱导的基因沉默所用的载体为BSMV：γ；烟草瞬时过表达载体为pGR106和pGR107，农杆菌菌株为GV3101；酵母过表达系统所用菌株为粟酒裂殖酵母SP_Q01，载体为pREP3X21 烟草定位所用载体为1302-GFP；酵母双杂交系统所用菌株为AH109，所用载体为pGBGT7和pGADT7；烟草瞬时表达所用的载体为2095-GFP、pGDR、SPYNE，SPYCE，1307-Myc，pWGB11-Flag；小麦原生质体定位用pJIT163-GFP、Q6、Q10载体；大肠杆菌所用菌株为DH5α、BL21、Top10；原核表达所用载体为Pcold-TF、pET32a、pET4T-1等；所有载体由旱区作物逆境国家重点实验室保存提供。2.1.2试剂及仪器主要试剂：Biozol（BioFlux），TTC（Amresco），果胶酶、纤维素酶、逆转录试剂盒（Fromentas），体外转录试剂盒RNAProductionSystem（Promega），胶回收试剂盒（天根），质粒小提试剂盒（Omega），质粒大提试剂盒（天根），一步法克隆试剂盒（Vazyme），GatewayBPClonaseEnzymeMixes（Thermo），GatewayLRClonaseEnzymeMixes（Thermo），anti-His抗体（康为世纪），anti-GST抗体（康为世纪），二抗鼠抗（康为世纪），anti-GFP抗体（Vazyme），anti-RFP抗体（Vazyme），anti-Bax抗体（Abcam），二抗兔抗（Vazyme）、anti-TaLOL2多克隆抗体（杭州景杰生物科技有限公司）、anti-PstGSRE1多克隆抗体（杭州景杰生物科技有限公司），ECL化学发光试剂盒（Thermo）、硝酸纤维素膜（Millipore），PVDF膜（Millipore），GSTPull-down试剂盒（Thermo），RIPA裂解液（Solarbio），His蛋白纯化介质填料Nisepharose（Solarbio），蛋白Marker（Solarbio），GFP-Trap（Chromotek）、RFP-Trap（Chromotek）、抗体稀释液（Takara），SYBRGreen定量Mix（康为世纪）及其他实验室常用试剂。主要仪器：垂直电泳仪（Bio-Rad），SopTopUV2200紫外可见光分光光度计（舜宇恒平），ChemidocXRS+化学发光成像系统（Bio-Rad），低温冷冻离心机（ThermoFisher），高速离心机（Thermo），BE-1100型四维旋转混匀器（其林贝尔），Nanodrop2000分光光度计（Thermo），DYCZ-20D型DNA序列分析电泳仪（北京六一），JY-SPCT型水平电泳槽（北京君意），Milli-Q超纯制水仪（Millipore）等。2.2试验方法2.2.1效应蛋白基因的筛选及序列分析利用转录组数据分析小麦条锈菌CYR32的转录表达谱，首先筛选出甘氨酸富集的基因，其次，通过分析这些基因的表达谱筛选出吸器形成即侵染24h后高表达的基因（人为设定高表达倍数为300倍），然后通过生物信息软件筛选出其中的效应子，如预测其信号肽，剔除含有线粒体定位信号、GPI锚定信号、跨膜结构等基因，经过实时荧光定量分析验证其表达谱后，选定其中的与菜豆锈菌UaINF24直系同源的PstGSRE1基因进行深入研究。通过Pfam和Intropro等在线分析软件预测蛋白的保守结构、通过NCBI中的在线blastp比对该蛋白在其它物种中的直系同源基因，进化树构建利用MEGA6.0软件，多22 序列比对用CLCSequenceViewer62.2.2PstGSRE1的转录表达分析在PstGSRE1核苷酸序列中比对特意序列设计两对引物。水源11种子生长至一叶一心期时接种新鲜的生理小种CYR32的夏孢子，并按照时间点取样，所取样品抽提RNA并反转录cDNA第一条链，以不同时间点样品的cDNA为模版，检测PstGSRE1在小麦条锈菌侵染时期的表达谱。2.2.3PstGSRE1的信号肽分泌验证通过酶切连接法将PstGSRE1用SignalP4.1预测的信号肽序列连入pSUC2载体的EcroI和XhoI酶切位点之间，并用YTK12酵母菌株在YPD培养基上划线活化。挑取新鲜的YTK12菌株单克隆，在液体YPD培养基中摇至OD600=0.5左右，常温下5000rpm离心并用1ⅹTE重悬菌体，常温下5000rpm离心并用1ⅹTE/LiAc（V/V=1:1）重悬菌体，即为感受态细胞，可以保存部分至-80˚C备用。准备CMDW和YPRAA培养基：YPRAACMDW酵母抽提物1gYNB0.67gPeptone2gTryptophan0.075gRaffinose2g蔗糖2gAntimycina0.2g葡萄糖0.1gAgar2gAgar2g100mL灭菌100mL灭菌在感受态细胞中依次加入如下试剂：试剂体积10ⅹLiAc140μL50%PEG40001.12mL10ⅹTE140μLssDNA（2ng/mL）200μLpSUC2-SP-PstGSRE14μgYTK12感受态细胞200μL30˚C200rpm转化半小时后加入140μLDMSO上下颠倒混匀，42˚C热激15min，冰上静置5min，室温5000rpm离心5min后用500μLTE重悬菌体，并涂在CMD-W培23 养基上。将在CMD-W培养基上生长的阳性克隆在YPRAA培养基上重新划线，能够在YPRAA上生长的说明该信号肽具有分泌功能。用液体CMD-W培养基将对照和基因的单克隆30˚C200rpm摇培24h，将培养基用双蒸水洗掉，加入含有2%TTC的PBS溶液，30˚C200rpm摇培2h,观察变色情况并照相。2.2.4PstGSRE1的烟草瞬时过表达构建成熟的除去信号肽序列的基因序列进入pGR106载体中，构建好的质粒通过测序验证其正确性。购买商业GV3101农杆菌感受态，将构建好的pGR106-PstGSRE1质粒2μL加入100μL农杆菌感受态中，冰上静置30min，同时在超净工作台中将电击杯倒扣在滤纸上，紫外灭菌30min。将质粒和感受态的混合物缓慢转移至电击杯中，尽量不能有气泡产生，放入电击仪中，2500V电击5ms，用800μL无抗LB将菌体洗出到1.5mL无菌的离心管中，28˚C200rpm活化2h，将200μL菌液涂布于含有卡那利福平的平板上，避光培养2d。PCR检测阳性克隆，用含有卡那利福平的LB液体培养基将菌体摇培至OD600=0.8以上，5000rpm室温离心5min，收集菌体，并用10mMMgCl2溶液洗涤菌体2次，并用MgCl2溶液将OD稀释至0.2，注射生长到4-6周的烟草叶片，同样的方法处理各种对照和Bax菌液，并注射。构建该基因的缺失突变体，每个突变体截短50个氨基酸，分析抑制Bax引起的PCD的作用位点。2.2.5PstGSRE1通过细菌三型分泌系统在小麦中过表达EDV6载体的构建，通过PCR反应得到在引物的两端添加attB位点的基因序列，attB-F“GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTNN”和attB-R“GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTN”利用BP反应体系连接到pDONR221上，扩繁pDONR221-PstGSRE1后通过LR体系将序列转入pEDV6载体，构建好的载体通过测序检测其正确性。挑取荧光假单胞菌落于5mLKB中28˚C200rpm活化1-2天，转接1mL到100mLKB中28˚C200rpm培养至OD600=0.6左右，4˚C5000rpm离心收集菌体，用预冷的无菌水重悬菌体两次，加入2mL无菌的15%的甘油，100μL分装到1.5mL离心管中。多余的保存在-80˚C备用。电击法转化构建好的质粒，并涂在卡那庆大霉素的KB平板上。PCR检测阳性克隆，挑取单克隆摇菌48h后用10mMMgCl2溶液洗涤菌体2次，并用MgCl2溶液将OD稀释至1.0，注射生长到一叶一心期的小麦水源11上并标记，28˚C正常光照培养24h和48h后取样并接种小麦条锈菌非亲和小种CYR23，16˚C黑暗保湿24h后放于16˚C光照培养箱中培养，24h和48h取定量样品和组织样。组织学处理方法如下：24 过氧化氢的染色观察：将3,3′-Diaminobenzidine（DAB）染料溶解于pH=5.4的HCl溶液中（1mg/mL），于取样前6h左右将叶片根部插入DAB染液中，在光照下吸收到取样时间点放入脱色液固定脱色，脱色完毕后用水合氯醛处理样品2h，转入20%甘油中保存，于显微镜下白光通道观察活性氧的染色。胼胝质的染色观察：将组织样固定透明后用50%乙醇浸泡样品15min两次，用蒸馏水洗样品10min，将样品放入0.5MNaOH中漂白10min，蒸馏水洗样品10min，将样品浸入0.067MK2HPO4（pH=9.0）中30min，将0.05g苯胺蓝溶解入100mL0.067MK2HPO4配制成苯胺蓝染液，将样品在苯胺蓝染液中染色后保存在20%甘油中。在荧光显微镜紫外通道检测胼胝质的产生状况。条锈菌菌落的WGA染色观察：参照2.2.6.3中进行染色观察。2.2.6PstGSRE1通过BSMV介导的基因沉默通过T4连接法将设计好的目的基因非特异片段连入BSMV：γ载体的NotI和PacI酶切位点中，并测序验证其正确性。参照2.2.6中体外转录BSMV病毒接种条锈菌并取样，检测基因的沉默效率、沉默后植物基因的表达以及各种组织学观察。2.2.7PstGSRE1的酵母过表达分析通过T4连接法构建pREP3X载体，构建好的载体通过测序检测其正确性。参照4.2.2中酵母感受态的制备方法制备粟裂酵母菌株SP_Q01的感受态并转化构建好的质粒，涂在单缺Leu的酵母培养基上，PCR检测阳性克隆。将阳性克隆摇培至OD600大于1.0，配制2mM的维生素B1水溶液，抽滤灭菌，将菌液重新接种于两个相同体积的一个含有2µMVB1，一个不加VB1的培养基中使最终OD600=0.2，30˚C200rpm震荡培养至20h，用显微镜观察细胞形态，用ImageJ软件统计细胞数量，用DHE探针染色检测ROS含量多少。2.2.8PstGSRE1的在小麦原生质体和烟草细胞中的定位情况分析通过T4连接法构建pJIT163-PstGSRE1-GFP载体，测序验证载体构建的正确性。将正确的质粒重新转化大肠杆菌JM109感受态，并用含有150mL氨苄培养基的三角瓶两瓶用于摇菌扩繁质粒，参照天根的大提质粒盒子说明书大提质粒，保证浓度在1000ng/μL以上即为合格。准备水源11种子培养至一叶一心期按照附表体系配制酶液、W5溶液、MMG溶液、1MCaCl2溶液、PEG/Ca转化液。（1）在干净的50mL离心管中加入酶液20mL、纤维素酶（Cellulase）0.2g、果胶25 酶（Pectinase）0.04g，55˚C水浴10min，冷却至室温后加入1MCaCl2200μL，BSA0.02g，β巯基乙醇7μL，将小麦叶片剪碎放入酶解液中，真空抽气30min，23˚C黑暗酶解4h（可缓慢摇动）。（2）将裂解好的酶解液用200目的筛子除去杂质，常温条件下用水平转子300rpm离心5min除去酶液，加入W5溶液轻轻悬浮原生质体，同样条件离心去除上清后加入10mLW5轻悬起原生质体，冰上静置30min。（3）常温水平转子300rpm离心5min，除去上清后加入2mLMMG溶液，镜检。将原生质体轻悬均匀后每200μL分装于2mL离心管中。（4）向离心管中加入质粒20μg，加入200μL的PEG/Ca转化液，轻柔混匀，23˚C避光转化30min。（5）室温水平转子300rpm离心5min，尽量除去转化液，加入500μLW5溶液洗去转化液，可重复洗两次，加入200μLW5溶液，23˚C避光诱导表达，24h后即可观察荧光状况。2.2.9PstGSRE1通过酵母双杂交系统筛选寄主靶标构建PstGSRE1的诱饵载体pGBKT7-PstGSRE1，测序检测载体正确与否。参照4.2.2中酵母感受态的制备方法制备AH109感受态。挑取单克隆利用PCR检测阳性克隆。（1）接种-Trp培养基扩大培养24h，室温700g离心5min收集菌体，用YPD培养基摇培至OD600=0.5左右，室温700g离心5min，用无菌水洗菌体一次。加入3mLTE/LiAc（1.1：1）洗菌体一次后加入600µL重选菌体即为酵母AH109感受态细胞，室温静置1h内使用。（2）感受态中加入文库质粒10μg，PEG/LiAc2.5mL，ssDNA(10mg/mL)40μL，轻柔混匀30˚C静置，每10min轻柔混匀一次，三次后加入160μLDMSO，42˚C热激20min，涡旋混匀10min，室温700g离心5min，用3mLYPD培养基重新活化一个半h后用12mL0.9%NaCl水溶液重悬菌体，吸取200μL菌液稀释10、100、1000倍分别涂布于二缺和三缺的平板上，剩余菌液涂布于三缺平板上，至少涂30个平板所长出的单克隆才能完全覆盖真个库。（3）稀释后的菌液可以计算此次筛库的覆盖率，将其他三缺平板上单克隆划线转移至四缺平板，能够生长的转移至四缺显色（加入X-α-Gal）平板上，均能生长的单克隆抽提质粒送测序（或者用T7通用引物PCR检测后切胶送测序）。（4）将测序回来的序列利用NCBI的载体工具去除载体序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/）后进行Blast比对，找出潜在的互作靶标，设计引物，克隆全长。（5）将候选靶标全长序列构建到pGADT7上，测序正确后，将质粒转入（1）中的26 诱饵蛋白酵母感受态细胞中，或将pGBKT7-PstGSRE1和pGADT7-候选靶标共转入AH109感受态细胞中，涂布二缺和三缺板子，如果长出单克隆，则在四缺和显色四缺上划线筛选，均能生长的视为有潜在的互作关系，进行下一步验证。（6）将在四缺上生长的菌落重新用四缺培养基摇混，利用血球计数器统计浓度并稀释到107，106，105，104或利用OD法稀释，稀释后的菌液涂布二缺和显色四缺，观察互作强度。2.2.10PstGSRE1与寄主靶标间的互作位点分析通过生物信息学工具Globplot2.0（http://globplot.embl.de/）预测PstGSRE1的三级结构并设计突变体引物构建pGBKT7-PstGSRE1-Mutant载体，同时分析互作靶标的保守结构域（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi），设计缺失保守结构域的突变体载体pGADT7-靶标-Mutant，将突变体载体利用酵母双杂交体系分析其潜在的互作位点。2.2.11PstGSRE1与靶标之间的共定位情况分析利用Gataway技术构建载体2095-GFP和pGD-RFP载体，参照4.2.4中方法通过农杆菌侵染烟草将基因在烟草中表达，观察其互作后的定位情况。2.2.12PstGSRE1与靶标之间的体外互作（Pull-Down）（1）通过T4连接法构建pGEX-4T-1、Pcold-TF载体，将测序验证正确的载体转入诱导表达菌株BL21中，挑取PCR检测正确的单克隆抗体37˚C摇菌，培养至OD600=0.6左右，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.8mM，低温诱导24h，收集菌体，超声破碎后SDS-PAGE检测诱导结果。（2）参照附表中体系配制蛋白胶，将蛋白样品30mA跑胶检测，用考马斯亮蓝染色液染色4-6h，蛋白表达情况需要确认蛋白是否在上清还是包涵体中，在上清中的含量等。（3）将用考染法确认在上清中表达的蛋白重新定量跑胶后去除浓缩胶，将分离胶连同NC膜（或PVDF膜，使用之前需要在甲醇中处理5min）3MM滤纸一同泡入转膜液中，使用电转膜夹子按照泡沫垫、3MM滤纸两层、胶、膜、3MM滤纸两层泡沫垫的顺序依次叠放整齐，胶和膜之间一定要紧密贴合，不能有气泡，使胶-膜为负极到正极放入电泳池中，加电泳液漫过夹子（可以在电泳池中放置冰袋），将电泳槽用冰浸没，42V转膜2h。（4）转膜结束后将膜用TBS洗涤5min，重复一次，用Blotingbuffer（含有5%脱脂奶粉的TBST）室温封闭1h。（5）将一抗按照1：5000比例用Blotingbuffer稀释，将膜放入盛有5mL一抗孵育液的杂交袋中，四位旋转混匀器上4˚C杂交过夜。27 （6）将膜从一抗杂交液中取出，用TBST洗膜5min，重复一次。按照1：2000的比利用Blotingbuffer稀释二抗，将膜放入盛有5mL二抗孵育液的杂交袋中，四位旋转混匀器上室温杂交4h。（7）将膜从二抗杂交液中取出，用TBST洗膜5min，重复一次。用ECL化学发光试剂盒在化学发光成像仪中显色观察。（8）确认蛋白均能正常表达且用WesternBlot检测正常则利用GSTPull-down试剂盒，按照试剂盒说明书进行蛋白的体外互作试验。（9）完成试验后WB检测蛋白互作情况。2.2.13PstGSRE1与靶标之间的免疫共沉淀分析（Co-IP）通过Gataway系统构建烟草瞬时表达载体2095-GFP；pGWB11-Flag;pGWB14-Myc；一步法构建：pGD-RFP；pCambia1307-Myc；pGR107-HA；参照4.2.4中方法通过农杆菌侵染烟草将基因在烟草中表达。配制如下体系的蛋白裂解液：2×GTEN体积/质量甘油200mL1MTris-HClpH7.550mL0.5MEDTA4mL5MNaCl60mLddH2O定容至1000mLProteinExtractionbuffer(EB)50mL2×GTEN25mLDTT150ul(5mM)ProteinaseInhib.Cocktail些许粉末NP4070uLMQ25mL取共注射农杆菌2-3天后的烟草叶片，用液氮研磨至粉末状，加入蛋白抽提液EB（ProteinExtroctionBuffer），1g叶子加入2mLEB，4˚C旋转混匀2h，4˚C10000g离心15min，取上清100uL作为Input，剩余上清约1.5mL加入RFP/GFPTrapbeads15uL轻柔旋转孵育1h，（或加入抗体后孵育1h后加入ProteinA+Gbeeds孵育30min）,4˚C10000g离心1min，去除上清，加入1mLEB洗珠子2次，去除上清，加入60uL洗脱液和蛋白Loadingbuffer，水浴10min，WB检测。28 2.2.14PstGSRE1多克隆抗体的制备参照4.2.9构建pGEX-28a、pGEX-32a载体，并诱导蛋白，考染确认蛋白在上清中表达后大量诱导，配制500mM的咪唑和15mM的咪唑溶液，pH根据蛋白的等电点确定，用10倍柱体积蒸馏水和低浓度咪唑重力流动法洗镍柱数次，加入超声破碎的蛋白溶液，重力流动法抓取His标签蛋白，20倍柱体积15mM咪唑清洗柱子，洗去杂蛋白，用5mL500mM咪唑洗脱镍柱，每1mL承接在一个管中，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，同时用蛋白胶检测蛋白。高盐洗脱下的蛋白低温冷冻后很容易洗出絮状沉淀，降低蛋白浓度，因此需要量大的蛋白和需要长期保存或运输的有必要将蛋白中的盐分透析。使用夹子将蛋白封闭入透析袋，4˚C在2LPBS溶液中搅拌透析过夜，将透析袋中的低盐的蛋白重新检测浓度后寄送杭州景杰生物科技有限公司制作多克隆抗体。2.3试验结果2.3.1PstGSRE1的序列分析PstGSRE1是一个编码290位氨基酸的N端含有信号肽的分泌蛋白，去掉信号肽的成熟蛋白有273个氨基酸。其中甘氨酸含量为14.8%，丝氨酸含量为21.4%，含有两个半胱氨酸，没有已知的保守结构域和motif，N端有一个17个氨基酸的信号肽序列，没有GPI靶定位点，没有跨膜结构、没有典型的核定位信号，NCBI中将BlastE-value设置到10-5除了锈菌，均不能搜索到其他物种里的同源基因，因此该基因应为锈菌特异的效应子，将该基因的氨基酸序列在叶锈、杆锈、条锈菌中的同源基因比对发现该效应子蛋白序列不保守，通过构建同源基因的进化树发现，该基因与菜豆锈菌的UaINF24直系同源(图2-1a)。在中国各个省份收集的条锈菌菌株重测序数据分析该基因的SNP，发现该基因的突变均为同义突变，说明该基因在条锈菌的进化和毒性变异过程中相对保守(图2-1b)。利用MEMESuit在线分析工具分析这些锈菌同源基因的氨基酸序列，发现了一个甘氨酸富集的保守motif和丝氨酸富集的保守motif(图2-1c)。利用Scanprosite在线分析工具分析该基因的蛋白序列，发现去除信号肽序列后91-140位氨基酸是一个Serine-richregionprofile和一个Glycine-richregionprofile；在20-22和86-88位氨基酸有两个PKC磷酸化位点，在38-41和230-233位氨基酸含有两个酪蛋白激酶II磷酸化位点，含有19个豆蔻酰化位点，主要集中在100位氨基酸周围。29 图2-1：锈菌效应子PstGSRE1的序列分析。a通过蛋白序列构建的锈菌效应子PstGSRE1的进化树，叶锈菌(PTTG),杆锈菌(PGTG),菜豆锈菌(Ua),蚕豆锈菌(UF),玉米锈菌(PSO)同源序列来自于NCBI数据库。b锈菌中PstGSRE1的同源基因氨基酸序列比对。cMEMEsuit比对PstGSRE1同源基因后发现的甘氨酸丝氨酸富含的motif。Figure2-1SequenceanalysisofPstGSRE1gene.a:PhylogeneticanalysisofthePstGSRE1withotherfungalclosesthomologs.TheaminoacidsequencesencodedbyPSTG_27397(PstGSRE1)fromP.striiformisf.sp.tritici(PSTG),P.triticina(PTTG),P.graminisf.sp.tritici(PGTG),Uromycesappendiculatus(Ua),Uromycesfabae(UF),Pucciniasorghi(PSO)wereretrievedfromtheNCBI.PhylogeneticanalysiswascarriedoutwiththeMEGA6softwarebytheneighbour-joiningmethod.b:SequencealignmentofPstGSRE1homologproteinsfromdifferentcerealrustpathogens.Multi-sequencealignmentperformedusingCLCSequenceViewershowingconservationamongPstGSRE1homologsfromPucciniastriiformisf.sp.tritici(Pst),Pucciniagraminisf.sp.tritici(Pgt)andPucciniatriticina(Pt).cglycinerichmotifandserinerichmotifanalyzedbyMEMEsuit.2.3.2PstGSRE1的转录表达分析在锈菌侵染时期检测该效应子的转录表达情况，发现该基因在侵染后开始上调表达，6h已经上调了近20倍，18h的表达量超过了一百倍，24h吸器大量形成时期表达量上升至300倍以上，甘氨酸富含蛋白质在报道中有参与病原菌侵染结构的功能，该基因在吸器大量形成时表达说明该基因很有可能参与了吸器等结构的形成，后期该基因表达量逐渐下降，120h后基本无表达。30 图2-2PstGSRE1在锈菌侵染时期的的转录表达情况分析。接种锈菌生理小种CYR32后0,6,12,18,24,36,48,72,120,144,216,和264h后取样，分析所以方法为比较临界值法2–ΔΔCT，数据采用T测验分析显著性差异。Figure2-2TranscriptionprofilesofPstGSRE1atdifferentPstinfectionstages.WheatleavesinoculatedwithvirulentPstisolateCYR32sampledat0,6,12,18,24,36,48,72,120,144,216,and264hourspostinoculation(hpi).RelativeexpressionofPstGSRE1wascalculatedbythecomparativethreshold(2–ΔΔCT)method.Meanandstandarddeviationwerecalculatedwithdatafromthreeindependentbiologicalreplicates.“*”indicateasignificantdifference(P<0.05)and“**”indicatesP<0.01relativetotheurediniosporessampledeterminedusingStudent’st-test.2.3.3PstGSRE1的信号肽分泌功能验证将PstGSRE1的信号肽序列利用酵母转化酶分泌系统验证其是否能够行使信号肽分泌的功能，YTK12是一个只能利用单糖的酵母菌株，在pSUC载体上含有可以分解多糖的酵素酶，将预测的信号肽序列连接到酵素酶的N端，如果该信号肽序列具有分泌功能且可被酵母系统识别，则酵素可以分泌出酵母细胞分解培养基中的多糖，该酵母可正常生长，如没有功能或未能识别，则酵母在多糖培养基上不能正常生长，基于此原理，将PstGSRE1的信号肽在该体系中验证确实具有分泌功能，用空菌株、空载体以及稻瘟菌的Mg87效应子的信号肽序列作为阴性对照，该信号肽被验证不具备分泌功能，卵菌的Avr1b信号肽作为阳性对照，同时信号肽引导分泌出的酵素利用TTC试剂检测酵素活性，从另一方面验证PstGSRE1的信号肽具有分泌功能。31 图2-3PstGSRE1信号肽分泌功能验证。采用CMD-W（含有葡萄糖）或不含葡萄糖只含有多糖棉籽糖的YPRAA培养基进行筛选，携带pSUC2-SP（AVR1b）和pSUC2-SP（PstGSRE1）的酵母YTK12菌株，其可以表达成熟融合的两个不同信号肽片段的转化酶SUC2并且分泌出去分解多糖，能够在棉子糖作为唯一碳源的YPRAA培养基中生长。携带空载体pSUC2T7M13ORI的YTK12和YTK12菌株不分泌转化酶，因此不能在YPRAA培养基上生长。用2,3,5-三苯基四唑氯化物（TTC）检测分泌的转化酶活性；红色表示转化酶活性。Figure2-3FunctionalvalidationofthesignalpeptidesofPstGSREproteinusingtheyeastinvertasesecretionassay.YeastgrowthassayonmediawithCMD-Worwithout(yeast-peptone-raffinose-AntimycinAagar[YPRAA])glucose.YeastYTK12strainscarryingpSUC2-SP(AVR1b)andpSUC2-SP(PstGSRE1),whichexpresstwodifferentsignalpeptidefragmentsfusedinframetothematureinvertasegeneSUC2,areabletogrowinYPRAAmediawithraffinoseasasolecarbonsource.YTK12andtheYTK12straincarryingemptyvectorpSUC2T7M13ORIdonotsecreteinvertaseand,thus,arenotabletogrowonYPRAAmedia.Thesecretedinvertaseactivityaredetectedwith2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride(TTC).Theredcolorindicatesinvertaseactivity.2.3.4PstGSRE1在烟草中抑制Bax诱导的过敏性坏死将PstGSRE1构建到过表达载体pGR106中，通过农杆菌在烟草中瞬时过表达，以缓冲液和pGR106-GFP为阴性对照，以pGR106-Avr1b为阳性对照，发现PstGSRE1可以抑制Bax诱导的过敏性坏死反应，WB检测各个蛋白均能正常表达。32 图2-4在烟草中过表达PstGSRE1抑制Bax诱导细胞产生的过敏性坏死反应。烟草叶片注射含有PVX-PstGSRE1等载体的农杆菌菌液，后注射含有PVX：Bax的菌液，结果在注射5天后观察。Figure2-4TransientexpressionofPstGSRE1supresscelldeathinducedbyBax.N.benthamianaleaveswereinfiltratedwithAgrobacteriumtumefacienscellscontainingPVXcarryingPstGSRE1oracontrolgene(eGFPandAVR1b),eitheraloneorfollowedafter24hbyA.tumefacienscellscarryingPVX:Bax.Proteinexpressionwasdetectedbyimmuno-detectionwithanti-Bax,anti-GFPoranti-PstGSRE1antibodies.ProteinswereextractedfromtheleavesofN.benthamianaafter5days.为了进一步了解PstGSRE1的某一个区域可以抑制Bax诱导的PCD反应，我们构建了一系列缺失突变体，通过与Bax共同注射烟草发现一个90-140位氨基酸发挥主要作用，同时观察到该区域存在一个甘氨酸富含motif和丝氨酸富含motif。33 图2-5PstGSRE1的抑制PCD的毒性motif分析。通过构建C端缺失50个氨基酸和N端缺失10个氨基酸的方式构建缺失突变体，发现一个甘氨酸和一个丝氨酸富集的motif和抑制PCD有关。Figure2-5StructuralanalysisofthePstGSRE1regionrequiredforthesuppressionofPCD.AgrobacteriummediatedtransientexpressionofPstGSRE1(m1-m9)withadeletionofevery50aainC-terminalandevery10aainN-terminal.AglycinerichmotifandserinerichmotifresponsibleforthesuppressionofPCD.2.3.5PstGSRE1通过细菌三型分泌系统在小麦中过表达为了研究该效应蛋白对小麦PTI的影响，我们利用三型分泌系统将该效应子分泌进入小麦叶肉细胞，细菌的侵染可以引起小麦胼胝质的累积，以dsRed、空菌株、缓冲液为对照，统计胼胝质的累积状况，分析效应子对胼胝质累积的影响，确认该效应子是否可以抑制寄主小麦的PTI（图2-6）。注射细菌后，小麦叶片表型并未发生明显变化，24h和48h取样，通过苯胺蓝染色后在荧光显微镜紫外通道下观察胼胝质的积累并统计个数，发现效应子存在的情况下小麦胼胝质的累积明显减少，说明该效应子参与了PTI抗病反应，并且可以抑制寄主小麦的胼胝质的累积。注射含有不同载体的荧光假单胞后接种小麦条锈菌非亲和生理小种CYR23，并检测活性氧的迸发情况，发现该效应子能够抑制非亲和条锈菌引起的活性氧的迸发。图2-6通过三型分泌系统将PstGSRE1在小麦中过表达发现PstGSRE1可以抑制细菌诱导的PTI反应，也能够抑制条锈菌非亲和小种引起的活性氧迸发。a注射不同对照之后的小麦叶片表型，b取样24和48h后检测胼胝质的累积，c统计胼胝质的累积，d接种CYR23后24h和48h的活性氧迸发状况，e活性氧面积统计。Figure2-6OverexpressionofPstGSRE1suppressedPTI-associatedcallosedepositionandROSaccumulationinwheat.a:ThephenotypeofwheatleavesinoculatedwithMgCl2buffer,EtHAn,34 pEDV6:dsRed,andpEDV6:PstGSRE1at48hpi.b:ThewheatleavesinoculatedwithMgCl2buffer,EtHAn,pEDV6:dsRed,orpEDV6:PstGSRE1wereexaminedforcallosedepositionbyepifluorescencemicroscopyafteranilinebluestaining.Bars,20µm.c:Averagenumberofcallosedeposits/mm2inwheatleavesinoculatedwithMgCl2buffer,EtHAn,pEDV6:dsRedorpEDV6:PstGSRE1.d:HistologicalobservationofROSaccumulationinpEDV6:eGFP-andpEDV6:PstGSRE1-inoculatedwheatplants14dpiwithPst.e:QuantificationofROSaccumulationinpEDV6:eGFP-andpEDV6:PstGSRE1-inoculatedwheatplants14dpiwithPst.Valuesrepresentthemeans±standarderrorofthreeindependentsamples.Asterisksindicateasignificantdifference(P<0.05)relativetothepEDV6:dsRedsampleaccordingtoStudent’st-test.2.3.6PstGSRE1通过BSMV诱导的基因瞬时沉默通过将PstGSRE1的片段连入BSMV：γ载体中，通过寄主诱导的基因沉默技术将该基因沉默后通过表型、组织学、分子生物学分析该基因的功能。空载体病毒位阴性对照，接种病毒后会出现条纹状的病毒症状，BSMV:TaPDS-as为阳性对照，产生漂白的现象说明病毒接种成功，根据发病症状判基因沉默与否，将没有表型的苗子拔掉，只在有表型的小麦叶片上接种小麦条锈菌CYR32。通过检测接菌48h、120h、168h后的PstGSRE1的沉默效率，该基因两个片段的表达量下降了40-90%，说明此次试验成功沉默了该基因，对照苗子接菌后表现出正常的产孢表型，沉默该基因的两个片段后均呈现产孢量显著减少的表型，统计相同面积上孢子堆的数量，沉默植株叶片上的产孢量比对照显著减少，1cm2面积上产孢量从对照的23降低到8和14，同时测定生物量发现7d时，沉默植株条锈菌的生物量比对照的显著减少，从对照的0.89降低到0.22和0.31。35 图2-7BSMV介导的基因沉默技术分析PstGSRE1的致病性。avigs片段选择b为病毒症状和沉默后和对照小麦接菌后的表型，c为PstGSRE1的沉默效率分析，d为确定叶片面积下小麦条锈菌的孢子堆个数统计分析，e为7d的样品的生物量分析。Figure2-7FunctionalassessmentofPstGSRE1inPstpathogenicitydeterminedbyBSMV-mediatedHIGS.a:VIGSsiteselectb:PhenotypesofthefourthleavesofBSMV:γ(control),BSMV:PstGSRE1-F,andBSMV:PstGSRE1-Binoculatedwheatplants14dpiwithPst.c:RelativetranscriptlevelsofPstGSRE1intheBSMV:γ,BSMV:PstGSRE1-F,andBSMV:PstGSRE1-Binoculatedwheatplants48,120and168hpiwithPst.ValuesareexpressedrelativetotheendogenousPstreferencegeneEF1,withtheemptyvector(BSMV:γ)setat1.d:QuantificationoftheuredinialdensityintheBSMV:γ,BSMV:PstGSRE1-F,andBSMV:PstGSRE1-Binoculatedwheatplants14dpiwithPst.e:GenomicDNAextractedfromthesecondleaffromthreedifferentplantsat7dpi.Valuesrepresentthemeans±standarderrorofthreeindependent36 samples.DifferenceswereassessedusingStudent’st-tests,andasterisksindicateP<0.05.将取样时间点的样品通过染色后观察菌落形态并统计，发现沉默该基因后，菌落面积显著减少，菌丝长度在前期24h和48h并未有明显差别，在120h开始出现差异，沉默植株的菌落面积比对照小很多，整个侵染过程并未发现明显的吸器和其他侵染结构的畸形。图2-8PstGSRE1沉默后条锈菌的组织细胞学分析。a显微观察下菌落形态的，b-c组织细胞学统计分析菌落的分枝长度和菌落面积，d组织细胞学统计分析菌落的菌落面积Figure2-8HistologicalchangesofPstgrowthinPstGSRE1-silencedplants.a:Amicroscopicexaminationrevealednoobviousdifferencesinthenumberofhyphalbranchesbetweenthecontrolplantsandthesilencedplants.b-c:Thehyphallengthsinthesilencedplantswereshorterthanthoseobservedinthecontrolplantsat120hpi.d:thecolonysizesinthetwosilencedplantswerereducedcomparedwiththesizesobservedinthecontrolplantsat120hpi.2.3.7PstGSRE1-RNAi的转基因株系的抗病性鉴定将转基因株系在温室中接种条锈菌后取样，观察表型后处理组织和定量样品进行分子鉴定。接种小麦条锈菌后，大部分株系的产孢变化不明显，部分产孢减少的为了进一步排除外界条件影响和锈菌接种不均匀的影响，将有抗性效果的转基因株系在温室中重复接菌两次，观察表型，发病等级均有降低的再进行下一步的分子鉴定。如此初步筛选出了五个株系L28、L30、L34、L43和L44。将这些株系取30个单株进行加代并抽提37 DNA和RNA的样品进行Sourthern和Northern检测。图2-9转基因小麦植株对条锈菌抗性的表型观察。第三代和第四代接种的小麦植株的第二片叶子接种小麦锈菌14天的表型。a接种CYR32的Swon11中的PstGSRE1的相对转录水平。b小麦转化载体pAHC25-PstGSRE1-RNAi的结构示意图。c转基因品系L28，L30，L34，L43和L44对条锈菌抗性的表型观察。d通过RNA凝胶印迹分析T4代小麦叶片中小RNA的表达，rRNA为对照。RNA印迹与相应的靶基因特异性探针杂交。使用不同转基因株系（L28，L30，L34，L43和L44）的总RNA杂交，使用pAHC25-PstGSRE1-RNAi载体中PstGSRE片段为模板制作探针，检测siRNA水平。在空白对照（WT）中未检测到信号。溴化乙锭染色的rRNA作为凝胶加样对照。箭头表示21个核苷酸的大小标记。e接种锈菌7天后的转基因植株二叶中的PstGSRE1的相对转录水平。数值相对于锈菌内源参考基因PsEF1表达，野生型设定为1.数值表示三个独立样品的平均值±标准误差。f真菌生物量的qPCR测量。与对照相比，分别使用锈菌PsEF1和小麦TaEF1基因的真菌与小麦核基因组的比例。在7dpi时从不同株系的小麦二叶中提取基因组DNA。使用Student'st检验评估差异，星号表示P<0.05。Figure2-9PhenotypeobservationofthetransgenicwheatplantsforPstresistance.aPhenotypesofthesecondleavesofthethirdandthefourthgenerationofinoculatedwheatplantsat14dpiwithPst.aRelativetranscriptlevelsofPstGSRE1intheSwon11inoculatewithCYR32.bDiagramshowingtheRNAicassetteinthewheattransformationconstructpAHC25-PstGSRE1-RNAi.cPhenotypeobservationofthetransgeniclinesL28、L30、L34、L43andL44forPstresistance.dTheexpressionofthesmallRNAinT4generationlineswasanalyzedbyRNAgelblotting.rRNA,loading/blottingcontrol.RNAblotswerehybridizedwiththecorrespondingtargetgene-specificprobes.siRNAlevelsinplantssilencedusingthepAHC25-PstGSRE1-RNAiDNAvectorexpressingtargetfungalfragmentswithamixtureofsenseplus38 antisenceforms(L28、L30、L34、L43andL44).Nosignalwasdetectedinemptycontrols(WT).TotalRNAwasextractedfromthirdsystemicleavespooledfromthreedifferentplants.Lowerpanels,ethidiumbromide-stainedrRNAasgelloadingcontrols.Thearrowheadindicatesanoligonucleotidesizemarkerof21nucleotides.eRelativetranscriptlevelsofPstGSRE1inthesecondleavesofthefourthgenerationinoculatedwheatplants7dayswithPst.ValuesareexpressedrelativetotheendogenousPstreferencegenePsEF1,withthewildtypesetat1.Valuesrepresentthemeans±standarderrorofthreeindependentsamples.(f)qPCRmeasurementoffungalbiomass.RatiooffungaltowheatnucleargenomesusingfungalPsEF1andwheatTaEF1genes,respectively,inplantstreatedwithvariantstargetingfungalgenescomparedwithcontrols.GenomicDNAextractedfromthesecondleaffromthreedifferentplantsat7dpi.DifferenceswereassessedusingStudent’st-tests,andasterisksindicateP<0.05.2.3.8PstGSRE1-RNAi沉默株系的分子鉴定通过抽提每代转基因株系的DNA，通过PCR初步筛选阳性植株，如图2-10所示，将三对检测引物结果均为阳性的样品筛选出来进行加代，经过抗病性筛选后将沉默株系在温室中接种取样抽提DNA和RNA，进行Sourthern和Northern检测（图2-11）。图2-10转基因株系的PCR鉴定。通过基因组PCR分析转基因植物中RNAi的选择标记基因Bar，UBI启动子和片段（内含子+PstGSRE1）的存在。Figure2-10PCRidentificationofdifferenttransgeniclines.TransgenicplantswereanalyzedbygenomicPCRforthepresenceoftheselectablemarkergeneBar,UBIpromoterandfragment(Intron+PstGSRE1)oftheRNAicassette.转基因株系均有载体导入，Northern发现siRNA的产生量和抗病性强弱有直接的关系，L30、L34、L43均有siRNA的产生且抗病性有显著提升，而未检测到siRNA的L28和L44抗病性无显著变化。39 图2-11a转基因株系的Northern和Sourthern鉴定。T4代转基因植物（L28，L30，L34，L43，L44）的基因组DNA和质粒pAHC25-PstGSRE1-RNAi用BamHI和XhoI消化，并用发夹片段制作探针杂交。b从不同转基因株系的第三叶中提取总RNA,并用PstGSRE1沉默序列制作探针，箭头表示21个核苷酸的寡核苷酸标记，加号表示siRNA的量。Figure2-11aNorthernandSourthernanalysisofdifferenttransgeniclines,GenomicDNAfromT4transgenicplants(L28,L30,L34,L43,L44)andplasmidpAHC25-PstGSRE1-RNAi.DNAsweredigestedwithBamHIandXhoIandhybridizedtothehairpinfragmentprobe.TotalRNAwasextractedfromthirdleavespooledfromthreedifferentplants.Thearrowheadindicatesanoligonucleotidemarkerof21nucleotides.PlussignindicatequalityofsiRNA2.3.9PstGSRE1-RNAi的转基因株系的组织学分析通过观察组织学，统计寄主活性氧累积和过敏性坏死的变化，了解转基因后小麦植株的抗性变化，发现早期活性氧累积比对照多，且L34株系上升最多，然而后期至5d的时候，活性氧的累积与对照相差不大，活性氧是过敏性坏死的早期激发物质，过敏性坏死细胞的面积在前期相差不大，L34和L43比对照高出1.5倍左右，而后期只有L34坏死面积显著升高。因此，沉默PstGSRE1后接种条锈菌，植株的活性氧的累积增加，过敏性坏死面积升高，抗性增强。40 图2-12用锈菌接种后48h和120h转基因小麦植物的菌落生长的组织学观察及过敏性坏死和活性氧的面积统计。接种CYR32后48和120hPstGSRE1沉默植株中寄主反应的细胞学观察，转基因植株叶片接菌后测量了H2O2的积累和坏死细胞死亡面积。使用Student'st检验评估差异，星号表示P<0.05。Figure2-12HistologicalobservationofnecrosisandH2O2areaoftransgenicwheatplantsat48and120hoursafterinoculationwithrustfungi.CytologicalobservationofhostresponseinPstGSRE1-silencedleavesinoculatedwithCYR32.AmicroscopicexaminationofROSaccumulationandnecroticcelldeathareawerealsomeasuredinthetransgenicplantsat48and120hpi.DifferenceswereassessedusingStudent’st-tests,andasterisksindicateP<0.05.同时将菌落用WGA染色后观察，并统计菌丝长度菌落面积等数据，发现菌丝的分枝数和分枝长度L30和L34均有所降低，L43变化不大，而菌落面积三个株系均显著减少；并未发现显著的菌落形态畸形。41 图2-13接种小麦条锈菌后真菌的生长状况的组织学观察及菌落面积、菌丝长度的统计。SV，气孔下囊;HMC，吸器母细胞;IH，感染菌丝;HB，菌丝分支;H，吸器。Figure2-13Histologicalobservationonthegrowthoffungiafterinoculationwithwheatstriperustandthestatisticsofcolonyareaandhyphallength.SV,substomatalvesicle;HMC,haustorialmothercell;IH,infectionhypha;HB,hyphalbranch;H,haustoria.2.3.10PstGSRE1的酵母过表达分析42 利用酵母体系将该效应子在酵母真菌中过表达，通过染色和统计可以帮助我们分析该蛋白的功能，VB1可以抑制载体pREP3x的表达，统计对照抑制和不抑制以及转入基因后抑制和不抑制的细胞长度以及活性氧产生染色发现该基因对菌体形态并无明显作用，统计学分析细胞长度同样说明菌体变化并不明显（图2-14）。用活性氧探针DHE染色，产生活性氧的细胞可以发出红色荧光，没有活性氧产生的则为蓝色背景色，统计分析发现PstGSRE1可以在抑制活性氧的产生（图2-15）。图2-14PstGSRE1过表达的酵母菌株形态观察Figure2-14MorphologicobservationoffussionyeastbeteweencontrolandcellsoverexpressedPstGSRE1.图2-15DHE活性氧探针染色检测过表达酵母细胞活性氧累积状况Figure2-15DHEreactivespeciesassaykitanalyzetheROSaccumulationoffissonyeast.43 2.3.11PstGSRE1的在小麦原生质体和烟草细胞中的定位情况分析将该基因融合GFP荧光标签通过农杆菌介导在烟草中瞬时表达，PstGSRE1蛋白呈现一种活跃的流动态（结果未显示），在细胞中活动异常活跃，同样的结果也在小麦原生质体瞬时表达融合蛋白时被观测到。图2-16PstGSRE1荧光标签融合蛋白在小麦原生质体细胞中瞬时表达。绿色荧光表示蛋白的定位情况，红色为叶绿体自发荧光。Figure2-16PstGSRE1fluorescenttagfusionproteinexpressedinwheatprotoplast.Greenfluorescenceindicatesthelocalizationoftheprotein,andredisthechloroplastautofluorescence.2.3.12PstGSRE1通过酵母双杂交系统筛选寄主靶标将PstGSRE1构建到诱饵载体pGBKT7上，通过筛选锈菌亲和小种侵染小麦24h的AD亲和文库，得到以下结果，筛库的覆盖率较为理想，通过筛库，并构建全长载体，利用酵母体系初步筛选出以下候选靶标基因（图2-17）:小麦中的过氧化物酶CAT家族中的TaCAT1和TaCAT3，小麦LSD家族转录因子TaLOL2等。稀释浓度后点斑可以初步确认互作强度，图2-17为PstGSRE1与候选靶标的互作强度。初步确认该效应子可能通过靶标活性氧相关基因参与活性氧信号通路。44 图2-17通过酵母双杂交系统初步验证效应子于靶标的互作。梯度稀释在四缺培养基上筛选，LacZ表示报告基因，在互作的情况下显示蓝色。Figurr2-17Initialvalidationofeffector-targetinteractionsviatheyeasttwo-hybridsystem,LacZindicatedthemarkergeneandturnblueaftertheinteraction.2.3.13PstGSRE1与寄主靶标间的互作位点分析通过效应子与靶标基因的保守结构域和三维结构等的分析，设计突变体载体（图2-18），通过酵母双杂交系统找出其潜在互作结构域。效应子的三个突变体均能和寄主靶标TaLOL2互作，而靶标突变体只有M5不能和效应子互作，说明效应蛋白和其靶标TaLOL2的C端互作。45 图2-18酵母双杂交突变体结构和互作结果。PstGSRE1通过GlobPlot2.3预测其结构中折叠到外部的和不规则的区域，pGADT7-PstGSRE1突变体分别与酵母中的pGBKT7-TaLOL2相互作用。pGBKT7-TaLOL2突变体设计为示意图。蓝色条带代表TaLOL2，而黄色条带代表三个不同的锌指。pGADT7-PstGSRE1分别与酵母中的pGBKT7-TaLOL2突变体相互作用。酵母转化体在SD/-Trp/-Leu（SD-2）上生长，并在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade（SD-4）上选择。在接种后5天拍摄平板。Figure2-18SchematicdiagramshowingtheproteinstructuresofPstGSRE1andTaLOL2deletionmutants.ThePstGSRE1sequencewasanalyzedbyGlobPlot2.3,whichpredictsregionsofglobularityanddisorder.pGADT7-PstGSRE1mutantinteractswithpGBKT7-TaLOL2inyeast,respectively.pGBKT7-TaLOL2mutantwasdesignasschematicdiagramshowing.thebluestripsrepresentTaLOL2,whiletheyellowonessymbolizethreedifferentzincfingers.pGADT7-PstGSRE1interactswithpGBKT7-TaLOL2mutantinyeast,respectively.YeasttransformantsweregrownonSD/-Trp/-Leu(SD-2)andselectedonSD/-Trp/-Leu/-His/-Ade(SD-4).Theplateswerephotographed5daysafterinoculation.2.3.14PstGSRE1与靶标之间的共定位情况分析将PstGSRE1与靶标分别融合不同的荧光标签，通过烟草瞬时表达系统将效应子和靶标基因TaLOL2在烟草体系中共表达，发现，PstGSRE1单独存在时其在细胞质中快速流动，而TaLOL2在细胞质和核中均有，细胞内点状结构也有荧光，然而共注射之后TaLOL2的定位情况发生变化，在细胞质中不规律富集，在核周围富集，核中荧光减弱（图2-19）。46 图2-19烟草细胞中PstGSRE1-RFP和TaLOL2-GFP的共定位。RFP-PstGSRE1和GFP-TaLOL2的共定位，分别在本氏烟中表达RFP-PstGSRE1和GFP-TaLOL2融合蛋白进行RFP-PstGSRE1/RFP和GFP-TaLOL2的共定位。Figure2-19Co-expressofPstGSRE1-RFPandTaLOL2-GFPinepidermalleafcellsofN.nthamiana.Co-localizationofRFP-PstGSRE1andGFP-TaLOL2.LocalizationofRFP-PstGSRE1andGFP-TaLOL2fusionsinN.benthamiana,respectively.Co-localizationofRFP-PstGSRE1/RFPandGFP-TaLOL2wereperformedinN.benthamianaleaves.2.3.15PstGSRE1与靶标之间的体外互作（Pull-Down）利用细菌表达系统得到PstGSRE1与TaLOL2的体外可溶性蛋白，利用体外Pull-down互作试剂盒验证其是否互作（图2-20）,结果显示这两个基因在体外也可以互相结合。图2-20PstGSRE1与TaLOL2的Pull-down结果分析，将GST-TaLOL2或GST蛋白与含有His-PstGSRE1的大肠杆菌上清液一起孵育，GST-TaLOL2的蛋白质条带用星号标记，使用抗His标签抗体通过蛋白质印迹检测His标记的蛋白质的存在。Figure2-20Pull-downassayanalyzetheinteractionofPstGSRE1andTaLOL2.GST-TaLOL2orGSTboundresinswereincubatedwithE.colisupernatantcontainingHis-PstGSRE1.ProteinbandsofGST-TaLOL2aremarkedbyasterisks.ThepresenceofHis-taggedproteinswasdetectedbywesternblotusinganti-Histagantibody.2.3.16PstGSRE1与靶标之间的免疫共沉淀分析（Co-IP）在烟草叶片瞬时表达该蛋白，通抽提蛋白后用抗体孵育和用磁珠结合，洗脱后确认另一个蛋白的存在与否，从而确认蛋白在体内的互作情况，如图2-21所示：PstGSRE147 与TaLOL2在植物体内可以直接互作。图2-21PstGSRE1与TaLOL2的Co-IP结果分析,在表达RFP-PstGSRE1和GFP-TaLOL2的本氏烟草叶提取物中进行免疫共沉淀（IP）。使用抗RFP抗体通过蛋白质印迹检测RFP蛋白的存在，使用抗TaLOL2抗体通过蛋白质印迹检测GFP-TaLOL2蛋白。Figure2-21Co-IPassayanalyzetheinteractionofPstGSRE1andTaLOL2.Co-immunoprecipitations(IP)wereperformedinextractsofN.benthamianaleavesexpressingbothRFP-PstGSRE1andGFP-TaLOL2.ThepresenceofRFPproteinswasdetectedbywesternblotusinganti-RFPantibody.TheGFP-TaLOL2proteinwasdetectedbywesternblotusinganti-TaLOL2antibody.2.4结论与讨论病原菌分泌效应蛋白进入寄主调控寄主免疫反应，抑制活性氧的产生，防止形成局部过敏性坏死，活体营养寄生菌尤其如此，因此了解病原菌如何抑制寄主免疫反应是了解其致病机理非常重要的一个方面。效应蛋白PstGSRE1在锈菌侵染初期诱导表达，通过细菌三型分泌系统将该效应子在小麦叶片中过表达，该效应子能够抑制细菌引起的胼胝质累积以及非亲和锈菌引起的活性氧迸发，通过烟草瞬时过表达体系发现该效应子可以抑制Bax诱导的过敏性坏死反应，同时发现一个对该功能负责的甘氨酸和丝氨酸富含的motif，富含甘氨酸的蛋白在植物体内主要作用有三个方面，一个是参与细胞壁的建成，其次是参与RNA绑定蛋白和角蛋白的构成，在稻瘟菌中的一个甘氨酸富含的蛋白质参与侵染丁的形成，另外一个色氨酸富含的蛋白质参可以中和活性氧并调控寄主的基础防卫反应，因此该效应子可能参与了锈菌的形态建成，以及和活性氧相关的信号通路，这和我们筛选到的靶标功能不48 谋而合；参与锈菌形态建成的基因有菜豆锈菌的UaINF8、UaINF24、UaINF56，PstGSRE1和UaINF24属于同源基因，很有可能也有着相似的功能，然而UaINF24并没与信号肽；另一个和形态构成相关的基因是菜豆锈菌的UfRTP1，该基因被证明参与了吸器形成过程中的丝状结构的形成，并且可以在体外促进微丝蛋白的聚合，而且该蛋白是一个分泌蛋白，可以进入寄主细胞发挥作用，因此PstGSRE1可能在锈菌中扮演着形态建成和调控寄主免疫等多方面的角色。瞬时沉默该基因，锈菌的致病力显著下降，菌落面积显著减小。为了进一步了解该效应子在调控寄主免疫方面的功能，我们筛选到了该基因在小麦中的靶标：转录因子TaLOL2，通过体内和体外互作试验证明该效应子可以和TaLOL2互作；TaLOL2是一个正向调控小麦锈菌抗病性的基因，可以激发活性氧的产生。另一个锈菌效应子PEC6也可以抑制胼胝质的产生和活性氧的累积，因此，从侧面也验证了PstGSRE1等锈菌的效应子均存在类似功能。为了进一步了解效应子调控寄主免疫反应的机理，首先需要了解寄主靶标如何参与条锈菌抗病性的免疫反应中，因此，我们对TaLOL2的功能进行了深入的研究。49 第三章小麦条锈菌重要效应子PstGSRE1调控小麦中靶标TaLOL2的免疫机理3.0前言病原菌通过多种途径调控寄主抗性，基因的表达起始于转录因子的调控，寄主很多生理过程也都有转录因子的参与，如生物合成、气孔的调节、活性氧的降解和质膜的结构调整等，病原菌通过调节转录因子参与寄主的免疫反应已经有很多报道，如层锈菌的PpEC23可以靶标转录因子GmSPL21参与寄主免疫反应，细菌效应子AvrRps4靶标WRYK转录因子的保守结构域；然而还有一类蛋白可以直接在寄主体内起转录因子的作用，如细菌的AvrBs3在寄主体内直接扮演转录因子的角色，代替寄主行使转录激活或抑制功能。LSD家族基因是在拟南芥突变体库中一类突变之后表型如同过敏性坏死类似症状发现的基因，这类基因含有锌指结构，通过所含锌指结构的数量分为三个家族，且功能有负向调控活性氧和正向调控活性氧等，部分基因证实含有DNA结合功能和转录激活功能，小麦中的该类基因目前报道的有TaLSD1，是一个LSD1基因的同源基因，负向调节小麦抗条锈病抗性，而TaLOL2虽然属于同一个家族，但是功能完全相反，因此对于该基因的功能的深入研究可以为小麦条锈菌抗病性提供重要的理论依据。3.1材料、试剂及仪器3.1.1试验材料本试验采用本实验室构建的小麦与条锈菌亲和非亲和互作体系：水源11与CYR23（非亲和）和CYR31（亲和）；菌种的扩繁用铭贤169；接种方法参考KangandLi1984；所用的细菌三型分泌系统菌株为荧光假单包菌株EtHAn，载体为EDV6；大麦条纹病毒诱导的基因沉默所用的载体为BSMV：γ；烟草瞬时过表达载体为pGR106和pGR107，农杆菌菌株为GV3101；酵母过表达系统所用菌株为粟酒裂殖酵母SP_Q01，载体为pREP3X烟草定位所用载体为1302-GFP；小麦原生质体定位用pJIT163-GFP，其他载体为本实验室保存的常规载体。3.1.2试剂及仪器主要试剂：Biozol（BioFlux），TTC（Amresco），果胶酶、纤维素酶、逆转录试剂盒（Fromentas），体外转录试剂盒RNAProductionSystem（Promega），胶回收试剂盒（天根），质粒小提试剂盒（Omega），质粒大提试剂盒（天根），一步法克隆试剂盒（Vazyme），GatewayBPClonaseEnzymeMixes（Thermo），GatewayLRClonaseEnzymeMixes（Thermo），SYBRGreen定量Mix（康为世纪）及其他实验室常用试剂。50 主要仪器：垂直电泳仪（Bio-Rad），SopTopUV2200紫外可见光分光光度计（舜宇恒平），ChemidocXRS+化学发光成像系统（Bio-Rad），低温冷冻离心机（ThermoFisher），高速离心机（Thermo），BE-1100型四维旋转混匀器（其林贝尔），Nanodrop2000分光光度计（Thermo），DYCZ-20D型DNA序列分析电泳仪（北京六一），JY-SPCT型水平电泳槽（北京君意），Milli-Q超纯制水仪（Millipore）等。3.2试验方法3.2.1TaLOL2的序列分析在NCBI中的BlastP工具分析TaLOL2的同源基因，之后利用CLCsequenceviewer进行氨基酸序列比对，在URGI（https://urgi.versailles.inra.fr/blast/?dbgroup=wheat_survey&program=blastn）分析该基因在六倍体小麦基因组中的分布状况，利用CSS-Palm2.0在线分析工具分析蛋白的修饰位点，利用Swissmodel（https://swissmodel.expasy.org/）工具分析蛋白的三维结构，ChIP-Seq分析参考Martinetal.2016中的分析方法。3.2.2TaLOL2的转录表达分析生长至一叶一心期的水源11叶片接种条锈菌CYR23和CYR31后取样，参照2.2.3的方法抽提RNA并反转录成cDNA，通过实施荧光定量分析基因的转录表达状况；生长至一叶一心期的水源11叶片外源喷施激素（ETH、SA、ABA、MeJA）处理后0h、2h、6h、12h、24h取样，参照2.2.3的方法抽提RNA并反转录成cDNA，通过实施荧光定量分析基因的转录表达状况。3.2.3TaLOL2的亚细胞定位及结构域功能分析通过NLS（http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）在线预测转录因子的核定位序列，根据基因的保守结构构建融合荧光标签的缺失突变体，参照2.2.8中原生质体转化的方法，观察荧光的表达状况。3.2.4TaLOL2的烟草瞬时过表达及结构域功能根据基因的保守结构构建缺失突变体，转入农杆菌注射烟草和其他双子叶植物叶片，观察表型。3.2.5TaLOL2在裂殖酵母中过表达分析参照2.2.7中方法构建pREP3X，并转入酵母菌株中，进行过表达试验。3.2.6TaLOL2在小麦中过表达分析参照2.2.5中方法构建pEDV6-TaLOL2载体，通过细菌三型分泌系统将该基因在小麦叶肉细胞中过表达后接种条锈菌观察表型。51 3.2.7TaLOL2在小麦中瞬时沉默分析参照2.2.6构建BSMV：γ-TaLOL2-F和BSMV：γ-TaLOL2-B，接种小麦发病后接种条锈菌，取样观察表型和组织学的变化。3.2.8ChIP-Seq分析转录因子TaLOL2下游调控基因通过细菌三型分泌系统将过表达的TaLOL2-GFP小麦转基因叶片取样，以终浓度为1%的甲醛交联处理样品，利用甘氨酸终止交联反应；对交联形成的DNA-蛋白质复合物进行超声打断处理；加入目的蛋白抗体，形成抗体-靶蛋白-DNA复合体；利用ProteinAbeads沉淀此复合物，特异性的富集与目的蛋白结合的DNA片段；多次洗涤，除去非特异结合的染色质，并纯化复合体；解交联，纯化DNA片段；送到武汉康测公司进行ChIP-Seq分析。3.3试验结果3.3.1TaLOL2的序列分析通过序列分析发现TaLOL2是一个典型的LSD家族转录因子，N端含有三个锌指结构，未发现有典型的核定位序列，分析发现该基因含有三个PKC磷酸化位点、两个酪蛋白激酶II磷酸化位点、四个N豆蔻酰化位点、一个酰胺化作用位点和两个N糖基化位点。蛋白质三维结构分析发现这三个锌指结构，呈指状结构，推测和结合DNA有关（图3-1）。图3-1TaLOL2的修饰位点和三维结构预测（1-110个氨基酸）Figure3-1Modificationsitesandthree-dimensionalstructurepredictionofTaLOL2（1-110aa）.在URGI数据库中搜索发现TaLOL2在基因组中有三个拷贝，分别位于5A、5B和5D上，且各个拷贝之间相似性达95%以上（图3-2），因此设计沉默片段在其UTR结合基因区域设计。52 图3-2TaLOL2的序列分析。a：TaLOL2与其他植物同源基因的氨基酸序列比对，Aegilopstauschii（At），Brachypodiumdistachyon（Bd），Oryzasativa（Os），Sorghumbicolor（Sb），保守域从NCBI比对发现，序列比对后的符号分别显示了不同的蛋白质修饰，相似性用红框显示。b：VIGS片段的选择。c：TaLOL2的再小麦染色体上三个拷贝的编码序列的多重比对，TaLOL2cDNA序列为从小麦品种水源11上扩增的全长cDNA序列，从小麦中国春数据库（UGRI）获得来自染色体5AL，5BL和5DL的三个TaLOL2拷贝的cDNA序列。d：TaLOL2与TaLSD1的相似性蛋白的多重比对。Figure3-2SequenceanalyzeofTaLOL2.a:AminoacidsequencealignmentsofTaLOL2withhomologousgeneofotherplant.Aegilopstauschii(At),Brachypodiumdistachyon(Bd),Oryzasativa(Os),Sorghumbicolor(Sb).conserveddomain(bracket)wasdownloadfromNCBI,respectively.Proteinmodification,identity(redboxes)areshown,respectively.b:VIGSsiteselectinthecompletecdsofTaLOL2.c:Multi-alignmentoftheencodingsequenceofthethreecopiesofTaLOL2.TaLOL2cDNA,thefull-lengthcDNAsequenceamplifiedfromcDNAofwheatcv.Suwon11.ThecDNAsequencesofthreeTaLOL2copiesfromchromosomes5AL,5BL,and5DLwereobtainedfromthewheatUGRIgenomedatabaseofwheatcvChineseSpring.d:Multi-alignmentofthesimilarityTaLOL2proteinsfromwheatcv.Suwon11ahomologgenewithdifferentfunction.3.3.2TaLOL2的转录表达分析TaLOL2在条锈菌侵染侵染时期有诱导表达，且在非亲和组合（CYR23）中表达量比亲和组合（CYR31）上调明显，在24h，非亲和比亲和组合高四倍左右，亲和组合中上调的迅速，下降的也迅速，24h后迅速下降到0.3倍左右；然而亲和组合18h上调3倍左右，之后缓慢下降，至120h降低至和非亲和组合类似倍数（图3-3）。53 图3-3TaLOL2在小麦与条锈菌亲和非亲和互作体系中的转录分析Figure3-3TranscriptionlevelofTaLOL2incompatibleandincompatibleinteraction.微伤处理后该基因有一个先下调后上调的趋势，总的变化不明显；低温处理后该基因在6h前有微弱上调，之后缓慢下调至正常水平的一半左右；活性氧诱导剂MV处理后2h内上调，之后趋于正常水平无变化；激素ABA处理12h后该基因显著上调；乙稀、茉莉酸和水杨酸处理对该基因无明显影响（图3-4）。图3-4TaLOL2在小麦经过胁迫和外源激素处理后的转录表达情况。TaLOL2在小麦外源喷施ET，ABA，MeJA和SA处理后的表达量分析，误差条表示三个独立重复之间的变化，利用小麦TaEF基因进行均一化。Figure3-4TranscriptionlevelofTaLOL2afterstressandhormonetreatment.ThetranscriptionofTaLOL2inwheatresponsetowounding,lowtemperatureandMVtreatment.ThetranscriptionofTaLOL2inwheatresponsetoET,ABA,MeJAandSAtreatment.Errorbarsrepresentthevariationsamongthreeindependentreplicates.ThedatawerenormalizedtowheattheTaEFgene.3.3.3TaLOL2的亚细胞定位及结构域功能分析通过分析该基因的保守结构域，构建其缺失突变体融合GFP荧光标签后在小麦原生质体中瞬时表达，观察其定位情况：该基因完整的蛋白定位于细胞的膜质核中，核定54 位信号很强，质和膜中也存在，缺失第一个锌指结构的突变体主要定位情况发生改变，核定位消失，其他突变体并未发现显著的核定位改变，因此，该转录因子的第一个锌指结构发挥着核定位的功能，推测也有可能是结合DNA的位点。图3-5TaLOL2通过小麦原生质体试验分析其保守结构域功能。aTaLOL2突变体蛋白结构示意图，b通过原生质体定位分析锌指结构与核定位之间的关系。Figure3-5ZincfingerdependednuclearlocalizationsignalweredeterminedusinganPEG-mediatedtransientlyexpressedinwheatprotoplasts.b:SchematicdiagramshowingtheproteinstructuresofTaLOL2anditsdeletionmutants.3.3.4TaLOL2的烟草瞬时过表达及结构域功能在烟草中瞬时过表达该基因能够引起烟草叶片的过敏性坏死反应，同源在双子叶植物中也可以激发活性氧诱导过敏性坏死反应，通过构建不同的突变体在烟草叶片中过表55 达发现第一个锌指结构和诱导过敏性坏死的产生密切相关。图3-6TaLOL2在烟草等双子叶植物中过表达能够引起过敏性坏死，其他双子叶植物有拟南芥、番茄、三生烟、辣椒等；将TaLOL2设计保守结构域缺失突变体构建载体，注射烟草，观察哪个保守结构域与诱导过敏性坏死有关。Figure3-6OverexpressionofTaLOL2inN.benthamianainducedprogrammedcelldeath.N.benthamianaleaveswereinfiltratedwithAgrobacteriumtumefacienscellscontainingPVXcarryingTaLOL2;TaLOL2canalsoinduceprogrammedcelldeathonArabidopsisthaliana,Solanumlycopersicum,NicotianatabacumandCapsicumannuumleaves;StructuralanalysisoftheTaLOL2regionrequiredforPCD.AgrobacteriummediatedtransientexpressionofTaLOL2(M1-M5)withadeletionofzincfingerdomains.3.3.5TaLOL2在裂殖酵母中过表达分析在裂殖酵母中过表达该转录因子对酵母的形态无明显影响，外界施加活性氧胁迫对细胞的生长影响不大；DHE活性氧探针染色检测细胞内活性氧的累积状况发现该转录因子能够显著激发活性氧的产生，活性氧累积的细胞数量显著上升，引发的细胞坏死数量也显著上升，染色的活细胞数量减少（图3-7）。图3-7在裂殖酵母中过表达TaLOL2后细胞的活性氧累积状况和活细胞数量统计56 Figure3-7AccumulationofcellsstainingbyDHEandthenumberoflivingcellsincellsafteroverexpressionofTaLOL2infissionyeast.3.3.6TaLOL2在小麦中过表达分析利用三型分泌系统将TaLOL2在小麦叶片中过表达，叶片呈现出黄色，推测为转录因子激发活性氧引起的，在注射过细菌的小麦叶片上接种条锈菌CYR23和CYR31后，叶片的抗性显著提升，锈菌的产孢从正常变为零星产孢，部分注射区域甚至出现不产孢的表型，组织学观察发现活性氧的累积在前期显著提升，说明该基因能够激发活性氧继而提高小麦的抗病性。图3-8在小麦中过表达TaLOL2可以诱导活性氧的产生，a注射三型细菌后接种小麦条锈菌12天后小麦叶片产孢的表型b接种小麦条锈菌后的组织学观察及活性氧染色面积统。Figure3-8OverexpressionofpEDV6:TaLOL2inducedROSaccumulationinwheat.a:ThephenotypeofpEDV6:dsRedandpEDV6:PstGSRE1inoculatedwheatplantswithCYR31andCYR23(compatibleandincompatibleinteration)at12dpi.b:HistologicalobservationofROSaccumulationinpEDV6:eGFP-andpEDV6:TaLOL2-inoculatedwheatplants14dpiwithCYR31.3.3.7TaLOL2在小麦中瞬时沉默分析利用BSMV介导的基因沉默技术将TaLOL2沉默，沉默效率的两个片段沉默效率均达到50%以上，接种小麦条锈菌非亲和小种CYR23，对照仍然是正常的局部坏死的表型，然而沉默植株上有部分叶片产生部分孢子堆，说明沉默后小麦的抗性减弱，锈菌从57 不能正常生存进展为能够产孢并形成完整的侵染循环；接种CYR31的表型均为正常产孢，但沉默植株的产孢明显比非沉默植株产孢密集，通过统计固定叶片面积孢子堆的数量和面积可以得出相同的结论（图3-9）。图3-9利用BSMV介导的基因沉默技术分析TaLOL2的功能。a为接种病毒后的表型b接种小麦条锈菌亲和小种CYR31和小麦条锈菌非亲和小种CYR23的产孢表型。c沉默植株接种小麦条锈菌后TaLOL2的表达量分析。d小麦条锈菌在沉默植株上的产孢面积和包子度数量的统计分析。Figure3-9FunctionalassessmentofTaLOL2inwheatdeterminedbyBSMV-mediatedVIGS.a:Nophenotypicchangeswereevidentonthewheatleavestreatedwith1×Fesbuer(MOCK).MildchloroticmosaicsymptomswereobservedinthewheatleavesinoculatedwithBSMV:γ(control),BSMV:TaLOL2-F,andBSMV:TaLOL2-B.PhotobleachingwasobservedontheleavestreatedwithBSMV:PDS.b:PhenotypesofthefourthleaveschallengedwithurediniosporesofthevirulentraceCYR31andCYR23.c:RelativetranscriptlevelsofTaLOL2inknockdownplantsassayedbyquantitativereverse-transcriptionpolymerasechainreaction(qRT-PCR).d:QuantificationofpustulesnumberandareaonthePstinfectionleavesofacertainarea.为了进一步了解沉默TaLOL2后锈菌引起的小麦抗条锈病的抗性变化，我们统计分析了活性氧染色面积，形成气孔下囊的侵染点算是成功侵染的标志，以此为标准统计分析活性氧的染色状况，发现沉默后活性氧的产生面积显著降低，活性氧是响应病原菌侵染的最早的信号物质，在非亲和组合中更是早期阻止病原菌侵染，甚至消灭病原菌的物质，因此该基因对活性氧起正向调控作用，从而激活小麦抗性。58 图3-10BSMV诱导TaLOL2基因沉默后活性氧的累积状况a小麦条锈菌侵染成功后活性氧累积状况的显微观察bDAB染料染后的活性氧累积状况的统计分析。Figure3-10H2O2accumulationobservationsofwheatleavestreatedwithBSMVandinfectedwithincompatibilityraceCYR23.a:H2O2accumulationatinfectionsiteswereobservedbymicroscopy.HMC,haustorialmothercell;IH,infectionhypha;HR,hypersensitiveresponse;SV,sub-stomatalvesicle.Bar,20μm.b:TheareaofH2O2stainingby3,3’-diaminobenzidine(DAB)wasmeasuredbyDP-BSWsoftwareinTaLOL2knockdownplantsat24hpiand48hpiafterinoculation.Asterisksindicatesignificantdifference(P<0.05)fromBSMV:γusingStudent’st-tests.过敏性坏死是活性氧激发的寄主局部防卫反应，活性氧的改变势必引起下游激发细胞坏死的变化，因此，我们在统计活性氧后用坏死的自发荧光观察了过敏性坏死的产生面积的变化，48h后过敏性坏死面积出现差别，沉默植株的过敏性坏死面积减少，到120h坏死面积变化差别更大，说明该基因沉默影响了细胞坏死的生成。59 图3-11用BSMV处理并用非亲和小种CYR23侵染小麦叶片后观察细胞坏死a：在24,48和120hpi通过自发荧光观察到细胞过敏性坏死。HMC，吸器母细胞;IH，侵染菌丝;HR，超敏反应;SV，气孔下囊。b：将坏死细胞死亡定量为自发荧光的面积。星号表示有显着差异（P<0.05）。Figure3-11NecroticcelldeathobservationsofwheatleavestreatedwithBSMVandinfectedwithincompatibilityraceCYR23.a:Necroticcelldeathwasobservedbyepifluorescenceat24,48and120hpi.HMC,haustorialmothercell;IH,infectionhypha;HR,hypersensitiveresponse;SV,sub-stomatalvesicle.Bar,20μm.b:Necroticcelldeathwasquantifiedastheareaofauto-fluorescence.Asterisksindicateasignificantdifferences(P<0.05)fromBSMV:γusingtheStudent’st-tests.3.3.8TaLOL2的ChIP-Seq结果分析通过ChIP级别的GFP抗体将结合在TaLOL2上的DNA完全分离，如图3-12所示：Lane1和Lane2即为片段化前后，DNA片段化单一，主要集中在100-500bp，效果较好。60 图3-12染色质超声波片段化电泳胶图Figure3-12Ultrasoundfragmentelectrophoresisgelofchromatin将所收集的片段DNA进行建库测序，得到20.21Mreads数，将数据分析后发现，如图3-13所示，2763条peak落在基因间，210条落到启动子区域，66条存在于外显子和启动子之间，25条跨越内含子、启动子和外显子，22条在内含子上，18条跨越内含子和启动子，2条在外显子上。图3-13Peaks在基因组中的交叉分布情况Figure3-13Distributionofpeaksinwheatgenome.61 通过MEMEsuit的motif和ChIPmotif工具分析在启动子区域的peaks得到三个特异结合的motif：TTCTTYTTCTTCTTCTTYTTCTTCTTCT(E-valueof3.3e-079)，GAAAATGTTGAAASTTGGC(E-valueof7.0e-017)和CBVCMRARTGGTGAG(E-valueof3.9e-011)，功相似性分析均为锌指结构结合DNA的位点。通过将peaks和基因组数据比较，分析其GO注释，发现其主要参与了基础代谢和对外界刺激的反应过程中，其中很大一部分是活性氧信号通路的相关基因（图3-14）。图3-14GO注释分析转录因子调控的网络Figure3-14GOannotationanalysisofregulatenetworkofTFTaLOL2.将我们所感兴趣的活性氧信号通路的相关基因通过在NCBI中去重，得到表中的相关候选基因为转录因子调控的候选基因，进行下一步研究。62 表1转录因子TaLOL2调控的ROS信号通路相关候选基因Table1TaLOL2regulateROSrelatedcandidategenes.3.3.9效应蛋白PstGSRE1对TaLOL2的影响分析通过综合分析效应子与靶标的生物学功能，TaLOL2能够激发活性氧继而引起过敏性坏死反应，而效应子PstGSRE1在小麦叶片和酵母细胞内均可以抑制活性氧的产生，将蛋白共注射进烟草叶片中，TaLOL2所激发的细胞坏死可以被效应子完全抑制（图3-15a），通过融合荧光标签蛋白发现TaLOL2在细胞内的定位情况发生改变（图3-15b），从规则分布于细胞质和核中转变为在细胞内不规则富集撞他，通过进一步比对其核定位情况发现该效应子可以阻止寄主TaLOL2进入细胞核发挥功能。为了进一步证实这个设想我们进行了一下试验。63 图3-15PstGSRE1抑制TaLOL2诱导的细胞死亡。a：用含有携带TaLOL2和PstGSRE1的PVX或对照基因的农杆菌细胞注射入本氏烟草叶。b：用DAPI染色观察GFP与PstGSRE1分别和TaLOL2-GFP共表达的TaLOL2-eGFP的核中荧光的变化情况。Figure3-15PstGSRE1suppressTaLOL2-inducedcelldeath.a:N.benthamianaleaveswereinfiltratedwithAgrobacteriumtumefacienscellscontainingPVXcarryingTaLOL2andPstGSRE1oracontrolgene.b:FluorescenceofTaLOL2-eGFPchangedco-expresswithPstGSRE1witha35Spromoter,GFPandTaLOL2-GFPusedasnegativeandpositivecontrol.利用DAPI染料将烟草叶片的核染色后与荧光共同观察，之后统计核定位改变情况，发现有约一半的核定位发生改变，从核定位非常明显转变为在核外富集，而核内部荧光非常微弱（图3-16）。64 图3-16PstGSRE1通过改变TaLOL2的核定位来抑制TaLOL2触发的细胞死亡。a：TaLOL2诱导的细胞死亡需要TaLOL2的核定位。将具有nes或NES标记的TaLOL2PVX载体的菌株注射进入烟草叶中，最终OD为0.2。照片于5天后拍摄。b:共聚焦显微镜图像显示用核输出信号NES和突变体标记的TaLOL2的亚细胞定位。c:RFP-PstGSRE1和TaLOL2-GFP在烟草中的共定位。d:PstGSRE1对在烟草叶中表达的TaLOL2-GFP的核定位的影响，N代表核。e:当单独表达TaLOL2-GFP或与PstGSRE1一起表达时，筛选总共177至204个烟草的表皮细胞的核中荧光统计。f:Western印迹分析显示了本烟草叶中TaLOL2-GFP的总蛋白和核蛋白。TaLOL2-GFP与RFP-PstGSRE1的瞬时表达或RFP的表达在3天后通过农杆菌渗入用作阴性对照。用TaLOL2抗体通过免疫印迹分析总蛋白和细胞核蛋白中TaLOL2的含量。肌动蛋白和组蛋白H3分别被检测为总蛋白和细胞核的标记。65 Figure3-16PstGSRE1suppressesTaLOL2-triggeredcelldeathbyalteringthenuclearlocalizationofTaLOL2.a:ThenuclearlocalizationofTaLOL2wasrequiredforTaLOL2-inducedcelldeath.Strainswithnes-orNES-taggedTaLOL2PVX-constructswereinfiltratedintobaccoleavesatafinalODof0.2.Picturesweretakenat5dpi.b:ConfocalmicroscopyimagesshowingthesubcellularlocalizationofTaLOL2modifiedwiththenuclearexportsignalsNESandthemutantformnes.c:Co-localizationofRFP-PstGSRE1andTaLOL2-GFPinN.benthamiana.Bars,20μm.d:EffectsofPstGSRE1onthenuclearlocalizationofTaLOL2-GFPexpressedinleavesofN.benthamiana.Nrepresentnuclear.e:Atotalof177to204epidermalcellsofN.benthamianawerescreenedforthedistributionoffluorescencewheneitherexpressingTaLOL2-GFPaloneortogetherwithPstGSRE1.f:WesternblottinganalysisshowsthetotalandnuclearproteinofTaLOL2-GFPinN.benthamianaleaves.TransientexpressionofTaLOL2-GFPwithRFP-PstGSRE1orexpressionofRFPwasusedasthenegativecontrolviaagro-infiltrationafter3days.ThetotalproteinandthenucleusfractionwereanalyzedbywesternblottingwithTaLOL2antibody.ActinandhistoneH3weredetectedasfractionationmarkerforthetotalproteinandthenucleus,respectively.3.3.10效应蛋白PstGSRE1对TaLOL2调控基因的影响分析为了进一步了解效应子对转录因子TaLOL2所调控的下游基因的影响，利用细菌三型分泌系统将PstGSRE1和TaLOL2在小麦中过表达后，通过检测活性氧相关的下游基因的表达趋势，推测效应蛋白PstGSRE1对小麦免疫的调控作用。结果如3-17所示：66 图3-17TaLOL2调控的候选活性氧相关基因的转录表达谱。在TaLOL2-OE，RFP-OE，PstGSRE1-OE植物和PstGSRE1-RNAi转基因植物中，在0,6,12,24和48hpi用实时荧光定量检测基因表达量，OE代表过表达。使用2-ΔΔCT方法相对于内源对照TaEF1表达选择的基因，logFC[log2（CT）]对数据处理后作图。Figure3-17TranscriptionlevelsofROSrelatedgensregulatedbyTaLOL2.ExpressionpatternsofselectedgeneswereperformedwithlogFC[log2(foldchange)]at0,6,12,24and48hpiinTaLOL2-OE,RFP-OE,PstGSRE1-OEplantsandPstGSRE1-RNAitransgenicplants.OEindicateoverexpression.SelectgenesareexpressedrelativetoendogenouscontrolTaEF1usingthe2-ΔΔCTmethod.转录因子过表达的植株，活性氧相关基因显著下调，而对照RFP和效应蛋白过表达的植株这些基因上调，同时我们检测看效应蛋白转基因株系接锈菌后的这些基因的表达谱，发现这些基因也是显著下调，通过查阅文献，我们发现其中大部分的基因都参与活性氧的正向调控，通过抑制活性氧正向调控基因降低活性氧从而降低植物抗性，这个现象与转基因的抗病表型一致。从另一个方面证明，效应子通过调控转录因子的转录活性影响下游活性氧相关基因的表达，进而影响小麦的免疫反应。67 3.4结论与讨论由于PstGSRE1对小麦条锈菌的侵染和定殖非常重要，为了深入了解PstGSRE1如何在调控小麦免疫中发挥作用，我们在条锈菌和小麦的互作中找到了它的一个靶标。PstGSRE1与锌指型LSD-Onelike转录因子互作。在拟南芥类似病变的突变体中发现LSD基因，这些突变体都参与ROS诱导的细胞死亡。Kliebenstein等证实了拟南芥LSDl参与了水杨酸信号通路诱导的细胞死亡，通过调控CuZn-SOD的活性来清除激发细胞死亡的活性氧作用。TaLOL2含有三个内部保守的植物特异性锌指结构域，尽管核定位信号在小麦原生质体和本氏烟草细胞中明显存在，但其不具有常规的核定位序列。BohLOL1编码的LSD1锌指蛋白可直接结合DNA也是锌指蛋白在细胞核中起作用的证据。TaLOL2的第一个锌指结构负责核定位和细胞死亡；然而PsLSD1的三个锌指结构中的任何一个对于其在豌豆豌豆中的核定位而言是必要的且足够的。TaLOL2片段的VIGS导致对锈菌的易感性增加以及ROS积聚和随后坏死的显著减少。TaLOL2利用T3SS在小麦中的过表达导致更高的ROS产生水平和增强的锈菌抗性。因此，TaLOL2已被认为是小麦ROS突发相关防御机制的关键正调控因子之一。效应子通过调控蛋白的转录后修饰从而操纵宿主免疫是破坏植物防御的原始策略。基因表达起始于TFs转录的调控，TFs调节许多生理过程，包括表皮蜡质生物合成，气孔关闭，ROS解毒和质膜结构改变。病原体利用TFs通过在其宿主中分泌效应物来增强宿主的易感性。来自豆薯层锈菌（Phakopsorapachyrhizi）的称为PpEC23的效应子编码富含半胱氨酸的小蛋白质靶向TFGmSPL121以抑制宿主防御反应(Qietal.2016)。另一种针对WRKYTFs53的细菌效应子AvrRps4(Schönetal.2013)。有趣的是细菌效应因子可以作为植物转录因子参与了宿主的免疫系统。另一种细菌效应物AvrBs3是NUDX家族的成员，可作为TF并诱导植物细胞发育和编码(Exp2016)。为了研究效应器PstGSRE1如何与TaLOL2相互作用，我们研究了TaLOL2与PstGSRE1在烟草和小麦叶片中共表达后，TaLOL2的重新定位情况。PstGSRE1表达导致TaLOL2蛋白质定位情况改变并诱导TaLOL2重新定位出核。两种蛋白之间的相互作用导致TaLOL2转录活性的抑制和寄主防御性降低。核定位对核蛋白（如TFs）在细胞核中执行其功能至关重要。经典的核输入途径涉及经典核定位信号（NLS）和异二聚体输入受体如反应调节物5（PRR5）TOC1/PPR156之间的相互作用(Imaietal.2014)。然而，PstGSRE1不是与第一个锌指结构相互作用引发的核定位改变。MfNACsa的N-肉豆蔻酰化不受脱水胁迫处理的影响，而de-S-棕榈酰化对调节MfNACsa在脱水胁迫下核输入的调节起着至关重要的作用(Duanetal.2017)。通过GPS脂质预测TaLOL2含有一个N-豆蔻酰化和四个S-脂酰化位点。TaLOL2的核易位也可能与PstGSRE1相关的翻译后修饰有关。今后的工作将决定TaLOL2的易位是否依赖于翻译后修饰。PstGSRE1阻止TaLOL2在宿主细胞核中积累，揭示了增强宿主易感性的新方法。68 先天免疫系统的许多重要进展，包括基础防御，SAR，PTI和ETI，都发生在细胞核中。活体营养型病原体以活细胞为食，因此通过不同的特异性效应子靶向宿主成分（或功能），感知或干扰宿主检测和入侵植物细胞的死亡是必不可少的。在这里，我们确定了锈菌中一个重要的致病效应子PstGSRE1。PstGSRE1直接与TaLOL2相互作用并影响核的重新定位（图3-18）。据报道，许多植物病原体效应物靶向转录调节因子以逃避植物免疫系统，而很少显示这种核易位。一个例子是来自致病疫霉菌的RxLR效应物Pi03192干扰外源试剂CF触发的NAC转录因子从内质网到核的转运(Mclellanetal.2013)。我们研究了TaLOL2不是PstGSRE1的独特目标，调查其他宿主靶标来调节植物防御反应将是下一步的工作。图3-18图解说明PstGSRE1通过影响TaLOL2核定位抑制诱导的植物抗性的示意图。小麦产生吸器，通过它可以分泌效应子并转移到宿主细胞中。在被感染的'吸入'细胞中，宿主质膜保持完整，但被侵入的菌丝侵入并成为外吸收膜（EHM）。在最初的营养阶段，PstGSRE1是增强锈菌的侵染和定殖的毒性因子。PstGSRE1（以及许多其他效应子）也可抑制PTI相关胼胝质的沉积和ROS累积。当PstGSRE1被锈菌分泌并从吸器转移到宿主细胞中时，其靶向TaLOL2并改变TaLOL2的核定位状况，调控宿主免疫。H，吸器;HMC：吸器母细胞。Figure3-18AschematicsummaryillustratingPstGSRE1suppressionofTaLOL2-inducedcelldeathbyaffectitsnuclearlocalization.Duringinfection,P.striiformisf.sp.triticiproduceshaustoria,throughwhicheffectorsaresecretedandtranslocatedintohostcells.Ininfected‘haustoriated’cells,thehostplasmamembraneremainsintactbutisinvaginatedbytheinvadinghyphaeandbecomestheextrahaustorialmembrane(EHM).Intheinitialbiotrophicphase,PstGSRE1actsasanessentialvirulencefactortoenhancePstcolonizationandinfection.PstGSRE1(alongwithmanyothereffectors)canalsosuppress69 PTI-associatedcallosedepositionandROSaccumulation.Inresponsetopathogeninvasion,thehostcellsecretesantimicrobialcompoundsanddepositscalloseatthesiteofpenetrationtohamperinfection.However,whenPstGSRE1issecretedbyPstandistranslocatedfromthehaustoriumintothehostcell,ittargetsTaLOL2andchangestheNLSofTaLOL2whichactivethecelldeath.H,haustoria;HMC:haustorialmothercell.70 第四章利用HIGS技术构建小麦持久抗条锈病材料4.0前言禾谷类锈菌是最具破坏性的真菌病害之一，严重的锈病可导致田间产量损失90％以上（http://striperust.wsu.edu。）。在许多国家，单季作物产量损失达数百万吨（Li＆Zeng，2002;Kolmer等，2009;Wellings，2011）。小麦（Triticumaestivum）条锈病（小麦条锈菌（Pucciniastriiformisf.sp.tritici）是全世界最具破坏力的禾谷类锈病。使用抗性小麦品种是控制病原体的最经济，有效且环境友好的方法。然而，新的毒性锈菌菌株的快速进化导致大多数小种特异性的抗性基因正在快速失效(Fisheretal.2012)。RNA干扰（RNAi）是所有真核生物均存在的生理过程，并具有成为在基因操作难以处理的生物体中瞬时研究靶基因功能的有力工具(Hellensetal.2005)。HIGS作为一种新的工具来研究专性活体营养型锈菌中的基因功能，该真菌也具有通过使用表达抗真菌RNAi构建体的转基因植物来控制锈病的可能性。HIGS可用于控制特定作物的特定病害，因为构建体可以被设计为非常特异而有效的RNAi靶序列。4.1材料、试剂及仪器4.1.1试验材料本试验的供试小麦品种为水源11；大麦品种为GoldenPromise；小麦条锈菌为CYR32；大肠杆菌菌株为DH5α;所用载体为pMD18-TSimplevector（TaKaRa）；BSMV-VIGS所用载体为α、β、γ、γ-PDS-as；稻瘟菌突变体互补所用菌株为野生型Guy11和突变型DF51。转基因所采用的受体材料是西农1376，一种愈伤组织分化能力强的高产早熟的冬小麦品种，这个品种整个生长周期均能被流行小种CYR32侵染，CYR32来自于甘肃陇南，在感病品种杨麦158上扩繁。试验采用本实验室构建的小麦与条锈菌亲和非亲和互作体系：水源11与CYR23（非亲和）和CYR31（亲和）；菌种的扩繁用铭贤169；接种方法参考KangandLi1984；所用的细菌三型分泌系统菌株为荧光假单包菌株EtHAn，载体为pEDV6；大麦条纹病毒诱导的基因沉默所用的载体为BSMV：γ；烟草瞬时过表达载体为pGR106和pGR107，农杆菌菌株为GV3101；酵母过表达系统所用菌株为粟酒裂殖酵母SP_Q01，载体为pREP3X烟草定位所用载体为1302-GFP；小麦原生质体定位用pJIT163-GFP，其他载体为本实验室保存的常规载体。4.1.2试剂及仪器主要试剂：非限制性内切酶、显影液、定影液、胶片、TaqMix（康为世纪）、定量TaqMix（Vazyme）、Biozol、DNA胶回收试剂盒（TianGen）、质粒小提试剂盒（Omega）、71 质粒大提试剂盒（康为世纪）、RNALoadingBuffer(+EB)（Takara）、siRNALadderMarker（Takara）、KlenowFragment（Takara）、金粉、无水乙醇、CaCl2亚精胺、VB1、谷氨酰胺、酸水解酪蛋白、尿素、P32-ATP、琼脂糖、山梨醇、玉米素、NAA、IAA、草甘膦，Biozol（BioFlux），TTC（Amresco），果胶酶、纤维素酶、逆转录试剂盒（Fromentas），体外转录试剂盒RNAProductionSystem（Promega），胶回收试剂盒（天根），质粒小提试剂盒（Omega），质粒大提试剂盒（天根），一步法克隆试剂盒（Vazyme），GatewayBPClonaseEnzymeMixes（Thermo），GatewayLRClonaseEnzymeMixes（Thermo），SYBRGreen定量Mix（康为世纪）及其他实验室常用试剂。主要仪器：高速冷冻离心机（Thermo），高通量组织研磨仪TissueLyserⅡ（Qiagen）、冷冻干燥机、水浴锅、BioRadCFX定量仪（Bio-Rad）、生物安全柜、恒温光照培养温室、四位旋转混匀器、杂交炉、垂直电泳槽（Bio-Rad）、金属浴、铅盒、制冰机、制水机、同位素操作间、暗室，恒温光照培养箱SPX-0B（上海南荣），智能植物培养箱ZPS-250（黑龙江东拓）CentrifugeST16R台式低温高速离心机（Thermofisher），Bio-RadCFX（Bio-Rad），PCR仪（Biosystems），OlympusBX-53荧光显微镜（OlympusCorporation），生物安全柜1300SERIESA2（Thermo），高速离心机MICRO17（Thermo），化学发光成像系统CHEMIDOCXRS+（Bio-Rad），电穿孔仪4308（Eppendorf），超低温冰箱995（Thermo），低温冷冻冰箱DW-YL270（中科美菱），电热恒温鼓风干燥箱SFG-0.500（Hengfeng），医用低温药品展示柜（Thermo），振荡仪（Thermo），Nanodrop2000分光光度计（Thermo），HIRAYAMAHV-50高压灭菌锅，垂直电泳仪（Bio-Rad），SopTopUV2200紫外可见光分光光度计（舜宇恒平），ChemidocXRS+化学发光成像系统（Bio-Rad），低温冷冻离心机（ThermoFisher），高速离心机（Thermo），BE-1100型四维旋转混匀器（其林贝尔），Nanodrop2000分光光度计（Thermo），DYCZ-20D型DNA序列分析电泳仪（北京六一），JY-SPCT型水平电泳槽（北京君意），Milli-Q超纯制水仪（Millipore）等。72 4.2试验方法4.2.1植物材料种植与接种将小麦或大麦种子均匀摆放于盛满营养土的10cm的培养钵中，在植物光照培养箱中按照16/8h的光周期和16/10˚C的温周期培养约14天后接种小麦条锈菌或稻瘟菌。条锈菌的接种是将新鲜的夏孢子均匀涂抹于叶表面后16˚C黑暗保湿24h（康振生等1984），稻瘟菌的是将菌饼接种于大麦叶片表面，后25˚C黑暗保湿24h。4.2.2序列分析和进化树构建将测序序列用DNAMAN和原始比对，匹配后可进行后续工作。将序列置入NCBI的保守结构域分析CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)中分析其保守结构域（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），利用NCBI中的Blastp中搜索其同源基因，将不同物种的同源基因筛选出来通过MEGA6.0构建进化树。孢子堆数统计使用ImageJ软件按照统计细胞数目的操作说明，通过色彩变化统计孢子堆数量和面积。4.2.3总RNA的提取和cDNA第一条链的反转（1）将在超低温冰箱中冻存的样品去除，逐个添加液氮研磨至粉末状，分别加入事先加好0.8mL的Biozol裂解液的2mLRNAse-Free离心管中，混匀后冰上静置15min。（2）在上述离心管中加入RNAse-Free的0.8mLpH=4.5的酚：氯仿：异戊醇，混匀后4˚C静置5min，12000rpm离心10min，取上清液约0.6mL转移至1.5mLRNAse-Free离心管中。（3）加入等体积的RNAse-Free的0.8mLpH=8.0的酚：氯仿：异戊醇，混匀后4˚C静置5min，12000rpm离心10min，取上清液转移至另一个1.5mLRNAse-Free离心管中。（4）加入等体积氯仿，混匀后4˚C静置5min，12000rpm离心10min，取上清液转移至另一个1.5mLRNAse-Free离心管中。（5）加入等体积的RNAse-Free的异丙醇和100μL的pH=5.4的醋酸钠，混匀后-20˚C过夜沉淀。（6）超净工作台内加入50μLRNAse-Free的ddH2O2溶解沉淀，跑胶并检测浓度。将粗体的RNA样品在微量离心管中配制下列反应液，总体积100μL：待处理RNA20～50μgDNaseI(5U/µL)2.0μL10×DNasebufferⅠ5.0μLRNaseinhibitor（40U/μL）1μL73 DEPC处理水补足至100μL37℃孵育20-30min；加入EDTA2μL终止反应。反转录用如下体系操作：样品用量RNA2.5μgOligo(dT)181.0μLRNAse-Freewater补足至12μL65˚C反应7min后，冰浴5min；试剂总体积20μL5×ReactionBuffer4.0μLdNTP(10mmol/L)2.0μLRNaseInhibitor(20U/μL)1.0μLM-MLVReverseTranscriptase200U/μL1.0μL混匀离心后在PCR仪中42℃孵育1.5h，75˚C灭活2-3min；将反转录的产物储存于-20˚C备用。4.2.4实时荧光定量分析使用软件设计根据序列的要求设计18-25bp大小的引物，尽量不要有错配和发卡结构，片段大小为100-250bp左右，退火温度为55±10˚C，GC含量为40-60%。设计好的引物应在定量分析检测合格后使用。以各处理取样点的cDNA为模板进行定量分析，定量PCR体系如下：试剂用量cDNA2.0μL2×SYBRGreenMix10μLA/ASprimers（10μmol/L）各0.5μLddH2O补足至25μL采用3次生物学重复和3次技术重复，2–ΔΔCt方法计算CT值(Livaketal.2001)。4.2.5稻瘟菌突变体互补4.2.5.1载体构建和稻瘟菌原生质体转化（1）采用T4链接法构建pFL2-PstCPK1载体。74 （2）许金荣实验室惠赠的稻瘟菌CPK1突变体DF51在CM培养基（1gCaNO3.4H2O，0.2gKH2PO4，0.25gMgSO4.7H2O，0.15gNaCl，1.0gYeastextract，0.5gEnzymaticcaseinhydrolysate，0.5gAcidiccaseinhydrolysate，10gglucose；至1L）上活化约6天，取新鲜菌落25℃，150rpm重新震荡培养，用滤布过滤菌丝并干燥，加入含有0.1g裂解酶和0.3g破壁酶的酶液10mL，31℃温和振荡（80-120rpm）2h左右，用滤布过滤菌体后3,500rpm离心10min，并分别用1.2MKCl和1×STC（Sorbitol1.2M；Tris-pH7.510mM；CaCl250mM）清洗菌体。（3）用STC重悬菌体，并将浓度调整至107-108个每毫升，按照200μL的量分装至1.5mL离心管中。（4）每个转化中加入20μg的质粒，室温静置20min，缓慢加入1mL转化液PTC（60%PEG4000，10mMTris-HCIpH7.5，20mMCaCl2溶解于PTC中），并轻轻转移至50mL离心管中，水平静置20min。（5）加入含有氨苄的5mLTBS（20mMTris-HCl，500mMNaClpH=7.5），28℃，100rpm过夜。（4）室温3,500rpm离心5min，弃去上清，加入含有氨苄和G418的BottomAgar15mL，混匀后倒到培养皿中28℃培养12h。（5）融化含Amp（50ng/mL）和G418（400μg/mL）的TopAgar10mL覆盖于平板上，28℃静止培养一周；试剂盒提取DNA快速PCR鉴定阳性转化子并转移至无抗燕麦培养基上进一步筛选。4.2.5.2稻瘟菌突变体及互补后营养生长和毒性鉴定将野生型Guy11和突变体DF51及转化子CM-41接种到燕麦平板上培养2d，在菌落边缘用打孔器均匀取样，重新接种到燕麦平板上，25℃，记录生长状况，照相并统计。毒性验证需要收集其孢子，将平板置于25℃和14/10h光周期的条件下培养7天诱导产孢，加入10mL无菌水悬浮孢子，将杂质过滤，手机孢子悬浮液在50mL离心管中计数并将终浓度调整至105个/mL，吸取20μL孢子悬浮液滴在疏水玻片上25℃黑暗保湿24h观察孢子萌发情况，并统计。取生长状况良好的大麦，将加入0.25%Gelation的孢子悬浮液均匀喷施于大麦叶片，25℃保湿促进孢子萌发，培养5d后观察并统计发病状况，每个菌侵染三十片叶子，三次生物学重复。4.2.6BSMV-VIGS介导的基因沉默4.2.6.1载体的构建及病毒的体外转录（1）设计基因的特异片段并在引物两端加入相应的酶切位点（NotI和PacI），并利用T4连接法构建到BSMV:γ载体上，测序验证序列准确性。（2）将构建好的载体及BSMV:α，BSMV:β，BSMV:γ，BSMV:γ-CPK1-F，75 BSMV:γ-CPK1-H，BSMV:γ-PDS进行线性化，体系如下：（3）将α、β、γ、γ-PDS-as、γ-gene的质粒分别进行单酶切线性化，体系如下：α、γ质粒酶切体系：组分用量10×RBuffer2.0μLMluI(10U/μL)1μLα/γ质粒1.5μgddH2O补足至20μLβ质粒酶切体系：组分用量10×TangoBuffer2.0μLSpeI(10U/μL)1.0μLβ质粒1.5μgddH2O补足至20μLγ-PDS-as、γ-gene质粒酶切体系：组分用量10×RBuffer1.0μLBssHII(10U/μL)1.0μLγ-PDS-as/γ-gene质粒1.5μgddH2O补足至20μL琼脂糖凝胶电泳检测线性化的完整性，并高温失活。（4）将线性化质粒按照如下进行体外转录：组分用量5×T7TranscriptionBuffer2.0μLrATP0.5μLrUTP0.5μLrCTP0.5μLrGTP0.5μL线性化质粒4.0μLRNaseinhibitor0.5μLRibom7GcapAnalog（40mM）0.5μL76 Enzyme（200U/μL）1.0μLTotal10μL在RNAse-free离心管中按顺序加入样品，离心后37℃孵育2h。取1μL通过电泳检测转录效果后将9μL转录产物用RNAse-free的无菌水稀释为27μL，后-80℃保存备用。4.2.6.2病毒及锈菌的接种（1）取生长至一叶一心的水源11苗子接种病毒BSMV，大麦条纹病毒是RNA三联体病毒，需要三个部分α、β、γ共同侵染才能发病，将体外转录的产物1:1:1混合按照1.5μL加入45μLFes缓冲液的比利混匀，对小麦叶片摩擦接种(Scofieldetal.2005)。BSMV-PDS为阳性对照，BSMV-γ和水对照为阴性对照，每个处理至少接种30棵苗子。（2）接种病毒后的小麦幼苗，黑暗条件下高温高湿（23±2℃；90%）24h促进侵染，后转入正常光周期，约10d后观察病毒表型并照相。（3）有发毒症状的苗子即可视为接种成功，将新鲜的条锈菌夏孢子用无菌水混匀按照康振生等（1984）的方法接种条锈菌，16˚C黑暗保湿24h后16/8h的光周期正常生长。（4）接种后1d、2d、5d、7d同一时间点取定量样和组织样，用来观察基因的沉默效率、接种锈菌后植株的反应以及锈菌的菌落特征。定量方法参照3.2.4。接种锈菌后12d观察表型。4.2.6.3组织样的处理、观察及统计（1）将接种部分叶片剪下后分两份，一份按照3.2.3中提取RNA并转录为cDNA后按照2.2.4中方法做定量分析沉默效率；另一份在乙醇：冰醋酸（V/V=1：1）的液体中脱色至透明。（2）用50%乙醇洗两次样品，后用蒸馏水洗两次样品，将样品装入冻存管中并用铅笔做好标记，加入1MKOH液体浸没样品。（3）高压灭菌（121˚C，2min）破坏叶肉组织使菌体充分裸露。蒸馏水轻轻冲洗样品10min，可重复1-2次。（4）将样品浸泡于50mMThris-HCl（pH=7.4）中30min，倒掉液体，加入20μg/mL的WGA-Alexa488（Ayliffeetal.2011），一种能够在488nm处激发荧光的偶联细胞壁的小麦胚芽凝集素，染色10-30min，回收染色液，蒸馏水清洗样品2-3次，转入50%甘油中常温保存。（5）样品用荧光显微镜观察其菌落形态并统计个数和面积，每个样品至少统计50个侵染点。4.2.7基因枪法进行小麦遗传转化通过设计不同的酶切位点，将PstCPK1的序列正向和反向连接到pMCG161载体77 adh1内含子两边，通过测序验证序列准确性。将构建好的pMCG161-PstCPK1-RNAi载体经过大肠杆菌扩繁后，进行质粒大提，方法按照天根质粒大提试剂盒说明书进行，抽提好的质粒要求浓度大于1000ng/μL。参照徐惠君(徐惠君等2001)，所有的操作都在超净工作台中进行。(1)收去刚刚授粉不久的西农1376，将种子脱粒并保存于4˚C，取出两百到三百粒左右用70%乙醇振荡消毒1min，后用无菌水在超净工作台里冲洗干净，之后用10%的次氯酸钠消毒10min，共三次。(2)在生物安全柜中将小麦幼胚用镊子将胚挑出放于SD2培养基（配方见附表）中，整齐排列，每个胚之间距离0.5cm，将挑满幼胚的平板置于黑暗的26℃恒温培养箱中，促进其愈伤组织的生长，经过9d左右的生长，将愈伤组织放在渗透培养基中处理4-6h，脱水处理可以增大基因枪轰击面积和之后愈伤组织恢复生长的能力。（3）基因枪轰击：称规格为1.0的60mg的金颗粒（Bio-Rad），加入0.5mL的无菌水，连同2.5MCaCl2一同高压灭菌。将金颗粒在1.5mL离心管中用无水乙醇洗3次，加入30μg质粒、250μL2.5MCaCl2和50μL0.1M的亚精胺，涡旋混匀10min，使质粒充分被金颗粒吸附,用无水乙醇洗涤一次，加入250μL无水乙醇重悬后备用，同样的方法准备空载对照的金粉。（4）基因枪工作台提前紫外灭菌，并用医用酒精将各个仪器角落均仔细消毒，阻挡网和装膜器及其中的载体膜、爆裂膜也用医用酒精消毒，将10μL吸附DNA的金颗粒悬浮液放在载体膜上晾干后将膜加入基因枪中，开启基因枪轰击愈伤组织，重复次操作25次，并更换愈伤组织和金颗粒。（5）被轰击过的愈伤组织在黑暗条件下在渗透压培养基中生长过夜，转入SD2培养基黑暗中恢复生长14d。将愈伤组织转移至分化培养基中光周期10/14h和24˚C恒温培养箱培养4周后转移至生长培养基中，同样条件下生长4周后接着转移至壮苗培养基中，待苗子长高至8cm左右放入春化间处理一周，转移至温室生长，条件为16˚C和16/8h光周期。（6）按照如下转基因小麦的加代管理措施培养直至小麦收获并加代至三代以上，期间将每一代代转基因苗子编号并取样抽提DNA进行分子检测。a、营养生长阶段（约一个月）（空载体对照和转基因植株区分编号并取样）条件：温度：16˚C，光照：10-12h/天；浇水、施肥：1次/周，以氮肥（尿素）为主。b、生殖生长阶段（约一个月）开花前温度：18-20˚C，光照：12h/天；浇水、施肥：3天浇水一次，每周施肥1次，以磷肥为主。开花至灌浆期（15天）温度：22-24˚C，光照：14小时/天；浇水：3天浇水一次，500mL/盆。成熟期（8-10）天温度：28-30˚C，光照：14小时/天；浇水：3天浇水一次，500mL/78 盆4.2.8转基因小麦后代植株的抗锈性鉴定将一叶期的转基因植株放入温度为16˚C光周期为16/8h的温室中,将新鲜的条锈菌夏孢子和灭过菌的滑石粉以1：20的比例混合均匀，在转基因植株上均匀喷上水珠，将混合有条锈菌夏孢子的滑石粉均匀抖落至转基因植株叶片上，放置于16˚C的黑暗恒温保湿培养箱中24h后取出放入之前的温室，每隔4d喷水直至滑石粉全被冲洗干净，12-16天观察表型，统计结果并照相。统计标准参照(LineandQayoum,1992)的方法重新划分为抗病（I）、中抗（II）、感病（III）三级。具体下图所示：0NoVisableInfection1Necrotic/ChloroticfleckswithoutsporulationI2Necrotic/Chloroticstripeswithoutsporulation3Necrotic/Chloroticstripeswithtracesporulation4Necrotic/ChloroticstripeswithlightsporulationII5Necrotic/Chloroticstripeswithintermediatesporulation6Chloroticstripeswithmoderatesporulation7ChloroticstripeswithabundantsporulationIII8Stripeswithoutchlorotic,moderatesporulation9Stripeswithoutchlorotic,abundantsporulation表4-1小麦条锈菌在苗期侵染的病情分级。4.2.9转基因小麦后代植株的分子检测（1）将3.2.2所取的2mL离心管中样品放入冷冻干燥机除去水分后经过组织破碎仪破碎成粉末状。（2）在管中加入预热的CTAB抽提液800μL，放入65˚C水浴锅中裂解1h，每隔10min混匀一次。加入800μL酚氯仿异戊醇（pH=7.8）混匀后4˚C静置5min。79 （3）放入低温冷冻离心机中10000g离心10min，将上清液转移至新的1.5mL离心管中，加入600μL酚氯仿异戊醇（pH=7.8），混匀后4˚C静置5min。（4）低温离心机10000g离心10min后将上清转于一新的1.5mL离心管中，加入100μLpH=5.4的醋酸钠，和上清液等体积的异丙醇，-20˚C沉淀过夜；（5）预冷离心机，将样品10000g离心30min后，轻柔地去除上清，并分别用70%无水乙醇和100%无水乙醇清洗沉淀，并室温风干沉淀。（6）加入50μL无菌水4˚C溶解沉淀至少2h。（7）检测所抽提的DNA浓度并吸出10μL稀释至100-300ng/μL，用设计PCR检测引物（Bar、Promoter、Intron、CPK1等引物见附表1）和0.5μL稀释后的DNA溶液为模板PCR检测载体是否存在于植株基因组中。4.2.10转基因后代的Sourthern检测（同位素试验在上海植生所朱健康实验室进行）（1）用基因中没有的内切酶过夜酶切在3.2.4中的抽提的DNA约20μg后用0.8%的琼脂糖凝胶电20V电泳20h。（2）电泳结束后切胶至14ⅹ9cm大小，切角标记后放入超纯水中40rpm旋转振荡洗涤10min。（3）用400mL0.25MHCl中40rpm旋转振荡洗涤20min，同时准备和胶相同大小的尼龙膜、3MM滤纸、吸水纸和长33cm宽18cm的盐桥纸。（4）将凝胶用蒸馏水洗两次后放入变性液中40rpm旋转振荡洗涤30min，用蒸馏水清洗凝胶10min。在此过程中，将玻璃板横着放在白瓷盘上，在玻璃板上放置盐桥纸使盐桥纸两端浸入白瓷盘中的转膜液中。（5）将在转膜液中沁润的3MM滤纸放在盐桥纸中央并除尽气泡，将凝胶翻转过来放于滤纸上，将尼龙膜和凝胶的切角对应放好并去除气泡，在尼龙膜上逐次放置3MM滤纸，每铺一层都要除掉中间的气泡，最上层防止吸水纸并用玻璃板和500g物体重力压平。（6）勤更换吸水纸，开始时间间隔短，可一小时换一次，之后5-6次即可逐渐间隔时间长，这样经过2-3天的毛细管转膜过程，即可去除尼龙膜，紫外观察转膜情况。（7）用5ⅹSSC溶液洗干净尼龙膜，加到3MM滤纸中间，在80˚C烘箱中烘干2h保存于4˚C备用。（8）设计探针引物启动子、Bar基因和目的基因均可，大小为300-500bp最佳，胶回收PCR片段。（9）将膜正面向内放入杂交管中，56˚C预杂交2小时，在此期间准备杂交探针。（10）如下体系制作杂交探针：80 组分用量胶回收样品2μLRandomprimer2μL10ⅹbuffer2.5μLdNTP-dCTP2.5μLKlenow1μL[α-32P]dCTP（最后加）2μLddH2O补足至25μL注意：除了同位素，其余样品在实验室中加好后与95˚C金属浴中反应3min置于冰上，使引物和模版更好地结合，然后进入同位素实验室添加同位素。（11）将上述混合物在铅化玻璃中加入同位素后放入金属浴中37˚C反应1h，95˚C灭活5min，同时检测使用过同位素的位置有无同位素泄漏。（12）反应结束后将同位素探针缓慢加入杂交管中，并盖好盖子，检测有无泄漏情况。将杂交管放入杂交炉中56˚C杂交过夜。（13）将废弃的杂交液放入专门回收同位素的废液桶中，倒干净，盖好盖子后检测有无泄漏；然后用5ⅹSSC58˚C洗膜20min；洗膜后的废液倒入回收同位素的桶中。（14）用2ⅹSSC+0.1%SDS58˚C洗膜20min；洗膜后的废液倒入回收同位素的桶中。（15）用1ⅹSSC+0.1%SDS38˚C洗膜20min；洗膜后的废液倒入回收同位素的桶中。（16）用0.5ⅹSSC+0.1%SDS38˚C洗膜20min；洗膜后的废液倒入回收同位素的桶中。（17）用蒸馏水将膜冲洗干净后在暗室中放上胶片后放入铅盒中，放入-80˚C保存2d，使同位素信号清晰、边缘锐利。（18）将膜和胶片在暗室中取出用显影液、定影液洗出胶片，即为结果。4.2.11转基因后代的Northern检测同3.2.3中方法抽提转基因植株的总RNA，RNA固体在无水乙醇中保存，使用时再行稀释，浓度要高于1000ng/μL为最佳。（1）配置10%TBE-Urea胶10ml：尿素4.8g、水6.1mL、30%Acrylamide3.3mL、10×TBE（10.8gTris,0.744gEDTA,5.5g硼酸，定容到100ml）1ml、10%APS（0.5gAPS，溶于5ml去离子水中，4℃可储存数个月）0.11ml、TEMED0.01ml。等待尿素充分溶解（溶解过程会吸收热量，可81 以密封后加热加速溶解），立即灌入凝胶夹子中间的玻璃板之间并插好梳子，等待胶凝固30min。（2）拔掉梳子，放入电泳槽中，倒入1ⅹTBE电泳液，并用针头吸电泳液洗涤点样孔内的尿素数次。将20μgRNA混合等体积的RNALoadingBuffer(+EB)，点入点样孔，300V跑2h或400V跑1h，指指loading跑出胶外。（3）取出胶并在紫外成像系统看RNA跑胶状况，并照相；将胶切角标记，按照3MM滤纸、胶、尼龙膜、3MM滤纸的顺序叠放入夹子，按照RNA从负极向正极电泳的方向放入电转膜仪，150V转膜1h，取出尼龙膜和胶并照像。（4）将膜正面向内放入杂交管中，38˚C预杂交2小时，在此期间准备杂交探针。（5）利用目的基因沉默片段设计探针，如下体系制作杂交探针：组分用量胶回收样品2μLRandomprimer2μL10ⅹbuffer2.5μLdNTP-dCTP2.5μLKlenow1μL[α-32P]dCTP（最后加）2μLddH2O补足至25μL注意：除了同位素，其余样品在实验室中加好后与95˚C金属浴中反应3min置于冰上，使引物和模版更好地结合，然后进入同位素实验室添加同位素。（6）将上述混合物在铅化玻璃中加入同位素后放入金属浴中37˚C反应1h，95˚C灭活5min，同时检测使用过同位素的位置有无同位素泄漏。（7）反应结束后将同位素探针缓慢加入杂交管中，并盖好盖子，检测有无泄漏情况。将杂交管放入杂交炉中38˚C杂交过夜。（8）将废弃的杂交液放入专门回收同位素的废液桶中，倒干净，盖好盖子后检测有无泄漏；然后用5ⅹSSC38˚C洗膜20min；洗膜后的废液倒入回收同位素的桶中。（9）用2ⅹSSC+0.1%SDS38˚C洗膜20min；洗膜后的废液倒入回收同位素的桶中。（10）用1ⅹSSC+0.1%SDS38˚C洗膜20min；洗膜后的废液倒入回收同位素的桶中。（11）用0.5ⅹSSC+0.1%SDS38˚C洗膜20min；洗膜后的废液倒入回收同位素的桶中。（12）用蒸馏水将膜冲洗干净后在暗室中放上胶片后放入铅盒中，放入-80˚C保存2d，使同位素信号清晰、边缘锐利。（13）将膜和胶片在暗室中取出用显影液、定影液洗出胶片，即为结果。82 4.3结果与分析4.3.1PstCPK1的序列分析和进化树构建PKA是一个含有四个亚基的蛋白酶复合体，其中两个调节亚基，两个催化亚基，每个调节亚基结合一个催化亚基，调节亚基脱落释放催化亚基磷酸化下游基因是PKA的主要作用机制。条锈菌基因组里的两个PKA的催化亚基分别是PSTG06781和PSTG11839分别命名为PstCPK1和PstCPK2，研究表明，这两个催化亚基的功能不尽相同，一个是重要的致病因子，而另外一个则是其他功能相关，与毒性关系不大，通过同源性分析，锈菌中的PstCPK1就是这个重要的致病因子，而PstCPK1与PstCPK2的氨基酸的相似性为30.57%，一致性为40.54%。PstCPK1含有1440个碱基，编码480个氨基酸，组成等电点为6.72分子量为55.69kDa的蛋白质。通过在NCBI中搜索PstCPK1的同源基因，通过MEGA6.0软件构建进化树（图4-1），进化树分为两个枝，分别为两个催化亚基。分析显示PstCPK1和PstCPK2分别和玉米瘤黑粉菌的adr1和uka1基因同源，分别为玉米瘤黑粉菌PKA的两个催化亚基;PstCPK1和PstCPK2分别和稻瘟菌中的cpkA和cpk2直系同源。PstCPK1也是酵母中TPK2的直系同源基因，将CPK1在不同物种里的氨基酸序列通过DNAMAN8.0进行序列比对，如图4-2。条锈菌的PstCPK1在杆锈菌的同源基因相似性为80%，叶锈菌的相似性为57.3%。通过NCBI的保守结构域分析PstCPK1是色氨酸丝氨酸蛋白激酶超家族的成员，含有STKc_PKA保守结构域，和两个A-Loop，箭头表示的是磷酸化位点；星号表示的是催化亚基和调节亚基之间的结合位点；倒三角表示的是ATP结合位点。图4-1锈菌PKA序列的进化树分析。条锈菌：PSTG（PST78）,叶锈菌：PTTG杆锈菌：PGTG玉米瘤黑粉：UM,隐球酵母CNAG,禾谷镰刀菌：FGSG,稻瘟菌：MGG,酿酒酵母：SCRG,粗糙83 脉孢菌：NC,and构巢曲霉：ANID等序列来自数据库NCBI。Figure4-1PhylogeneticanalysisofthecatalyticsubunitsoffungalcAMP-dependentproteinkinases.TheaminoacidsequencesencodedbythecatalyticsubunitsofthecAMP-dependentproteinkinasesfromP.striiformisf.sp.tritici(PSTG),P.triticina(PTTG),P.graminisf.sp.tritici(PGTG),Ustilagomaydis(UM),Cryptococcusneoformans(CNAG),Fusariumgraminearum(FGSG),Magnaportheoryzae(MGG),Saccharomycescerevisiae(SCRG),Neurosporacrassa(NC)andAspergillusnidulans(ANID)wereretrievedfromtheNCBI.图4-2锈菌PstCPK1催化亚基同源基因的序列保守性分析及沉默位点的选择箭头表示的是磷酸化位点；星号表示的是催化亚基和调节亚基之间的结合位点；倒三角表示的是ATP结合位点箭头表示的是磷酸化位点；星号表示的是催化亚基和调节亚基之间的结合位点；倒三角表示的是ATP结合位点；PSTG06781;PGTG_17146,PTTG_25458,SCRG_03512,UM_04456,MGG_06368,和FGSG_07251序列来自NCBI数据库。84 Figure4-2AminoacidsequencealignmentsofPstCPK1withotherfungalcatalyticsubunitsofPKA.Aminoacididentity(blackboxes)andsimilarity(grayboxes)areshownwithintheproteinkinasedomain.Theactivesitesarehighlightedwitharrows.AsterisksindicatetheresiduesshowntoberequiredfortheassociationbetweencatalyticandregulatorysubunitsofPKA.TheATPbindingsiteisindicatedwithafilledtriangle.PSTG06781,PGTG_17146,PTTG_25458,SCRG_03512,UM_04456,MGG_06368andFGSG_07251wasdownloadfromNCBI,respectively.4.3.2PstCPK1基因在锈菌侵染过程中的表达分析锈菌侵染后不同的时间点取样分析PstCPK1在锈菌中的表达发现PstCPK1在侵染初期表达量上升，6-18h开始上调表达，18h表达量最高为12倍，随后24h到48h表达量开始恢复正常，72h的寄生阶段表达量开始下降，至产孢阶段该基因基本不表达。因此该基因是在侵染初期高表达的，很有可能和毒性相关或者和侵染过程中菌体的生长发育相关。图4-3PstCPK1在锈菌侵染过程中的转录分析。小麦叶片接种条锈小种CYR32后0,6,12,18,24,36,48,和72取样。PstCPK1采用2–ΔΔCT法计算，误差分析来自三次生物学重复。各个表达量之间经过T测验后*表示样品间具有显著差异，**表示样品间具有极显著差异。Figure4-3TranscriptionprofilesofPstCPK1atdifferentPstinfectionstages.WheatleavesinoculatedwithvirulentPstisolateCYR32sampledat0,6,12,18,24,36,48,and72hourspostinoculation(hpi).RelativeexpressionofPstCPK1wascalculatedbythecomparativethreshold(2–ΔΔCT)method.Meanandstandarddeviationwerecalculatedwithdatafromthreeindependentbiologicalreplicates.“*”indicateasignificantdifference(P<0.05)and“**”indicatesP<0.01relativetotheurediniosporessampledeterminedusingStudent’st-test.85 4.3.3PstCPK1互补稻瘟突变体PstCPK1和稻瘟菌中的同源基因cpkA蛋白序列相似性为80%，一致性为66%，由于该基因功能相对保守，因此我们用PstCPK1互补进入稻瘟菌突变体中，观察稻瘟菌的表型恢复情况，借以推测锈菌中该基因的功能。将含有该基因的转化自CM-41和突变体以及野生型在燕麦平板上重新培养发现突变体的营养生长缓慢，互补PstCPK1的转化子能够恢复营养生长能力，与野生型的生长状况基本一致（图4-4a），在培养基中诱导各个菌落产孢24h后统计孢子萌发状况发现突变体的附着胞形成能力形成很大程度上的缺陷，互补后的转化子附着胞形成能力得到部分恢复，大约50%的孢子恢复形成附着胞（图4-4b），用孢子悬浮液侵染侵染一叶期的大麦叶片，其毒性也得到了部分恢复（图4-4c）。图4-4PstCPK1互补稻瘟突变体。a是稻瘟菌野生型（Guy11）、突变体（DF51）个互补后的转化子（CM-41）在燕麦培养基上生长5天后的菌落特征；b是培养基上的菌落经过诱导产孢后收集的孢子悬浮液经过疏水玻片上萌发后统计附着胞的产生情况并统计。c大麦叶片分贝喷施蒸馏水、野生型孢子悬浮液、突变体孢子悬浮液、互补后转化子的孢子悬浮液，接种6天后观察表型。Figure4-4：ComplementationoftheM.oryzaecpkAmutantwithPstCPK1.aColonymorphologyofMagnaportheoryzaestrains.Coloniesofthewild-type(Guy11),cpkAdeletionmutant(DF51),andcomplementedstrain(CM-41)grownonPDAplatesfor5dpi.bAppressoriumformationassay.Germtubesfromthewild-typestrain(Guy11)developedappressoriaby24hpi,butnoappressoriumformationwasobservedinthecpkAmutantDF51.Underthesameconditions,atransformantofexpressingthePstCPK1fusionconstruct(CM-41)formedappressoria.Bar,25mm.cBarleyinfectionassay.Lefttoright,barleyleavesweresprayedwithsterilewaterandconidiaofGuy11,DF51,orCM-41.Typicalleaveswerephotographedat6dpipostinoculation.4.3.4BSMV-VIGS体系诱导条锈菌PstCPK1基因沉默分析由于小麦条锈菌缺乏稳定的遗传转化体系，病毒诱导的基因沉默技术成为一个分析锈菌基因功能的有效工具。我们选择PstCPK1两个特异片段进行基因沉默试验（图3-2），86 以光漂白基因PDS为接种病毒的阳性对照，BSMV空载体为锈菌基因沉默的阴性对照。接种病毒后产生条纹状褪绿的病毒表型即为接种成功（图4-5a）。接种锈菌后1d，2d，5d后取定量样品分析PstCPK1两个特异片段的沉默效率（图4-5b），沉默片段PstCPK1-1as的1d，2d，5d表达量分别下降了74%,85%和58%，PstCPK1-2as的1d，2d，5d表达量分别下降了75%,81%和62%，沉默PstCPK1两个片段呈现产孢量大幅下降表型，软件分析统计平均叶片面积的产孢数量比空载体对照下降了51%和46%（图4-5c）。组织样品也经过显微镜观察和统计分析（图4-6），发现该基因沉默后菌落面积和菌丝长度在48h和120h显著下降，菌落面积在120h显著下降，对照约为每个侵染点3000μm2而沉默后只有20000-25000μm2每个侵染点。并未发现吸器母细胞和吸器个数的明显变化，也未发现菌丝或者侵染结构的畸形。由于锈菌侵染过程中附着胞的形成难以被观察，因此该基因对附着胞的影响也无法确定。图4-5通过BSMV-VIGS沉默系统对锈菌的PstCPK1的功能分析。a-b接种BSMV病毒后的空载体和沉默PstCPK1两个片段的表型和接种锈菌CYR32小种后各个处理的表型c沉默PstCPK1两个片段后接种条锈菌没确定面积内的孢子堆数统计分析。dPstCPK1在沉默24h，48h，120h后的沉默效率分析，锈菌的延伸因子PsEF1为内参基因。Figure4-5FunctionalassessmentofPstCPK1inPstpathogenicitydeterminedbyBSMV-mediatedHIGS.a-b:PhenotypesofthefourthleavesofBSMV:γ(control),BSMV:PstCPK1-1as,andBSMV:PstCPK1-2asinoculatedwheatplants14dpiwithPst.c:QuantificationoftheuredinialdensityintheBSMV:γ,87 BSMV:PstCPK1-1as,andBSMV:PstCPK1-2asinoculatedwheatplants14dpiwithPst.Valuesrepresentthemeans±standarderrorofthreeindependentassays.d:RelativetranscriptlevelsofPstCPK1intheBSMV:γ,BSMV:PstCPK1-1as,andBSMV:PstCPK1-2asinoculatedwheatplants24,48and120hpiwithPst.ValuesareexpressedrelativetotheendogenousPstreferencegeneEF1,withtheemptyvector(BSMV:γ)setat1.Valuesrepresentthemeans±standarderrorofthreeindependentsamples.DifferenceswereassessedusingStudent’st-tests,andasterisksindicateP<0.05.图4-6BSMV-VIGS沉默PstCPK1后组织学观察菌丝生长状况，a-f分别为不同时间点各个处理和对照的菌落生长状况，SV,气孔下囊;HMC,吸器母细胞;IH,侵染菌丝;HB,菌丝分枝;H,吸器.Figure4-6HistologicalobservationoffungalgrowthintransgenicwheatplantsafterinoculationwithPst.a-f:Fungalgrowthofdependentsamples.SV,substomatalvesicle;HMC,haustorialmothercell;IH,infectionhypha;HB,hyphalbranch;H,haustoria.4.3.5PstCPK1转基因植株的加代及分子检测基因名称轰击幼胚T0阳性植株阳性率（%）pMCG161-PstCPK1-RNAi221270231.04%88 pMCG161107728151.39%设计RNAi载体，并轰击基因枪，通过将T0代转基因株系编号并检测阳性植株后统计如下表：每一代转基因植株经过这样的PCR阳性检测,至第四代载体T0T1T4CPK1-10-121、41、L1CPK1-1111、21、L1CPK1-12-151、71、L2CPK1-12-291、121、L3CPK1-1371、91、101、121、131、L4CPK1-16-1121、L5CPK1-16-2CPK1-16-3101、11、21、31、41、61、71、81、CPK1-21111、L6CPK1-2611、21、41、L7CPK1-32pMCG161-RNAiCPK1-4821、L8CPK1-50CPK1-5-111、41、61、81、101、121L9CPK1-5-221、51、101、111、121、131、L10CPK1-5-311、41、51、61、71、81、L11CPK1-5-411、21、41、61L12CPK1-5911、L1311、21、31、41、51、71、101、CPK1-6121、131、141、151、L14CPK1-63-11-121、L15CPK1-63-21-51、7-121、L16CPK1-661-41、L17CPK1-3111、51、81、101、L1889 空载体检测如下：至第四代转基因载体T0T1161-11-1021、31、41、51、61、71、81、111、121、131、141、161-11-2031、161-11-3041、51、61、91、101、161-11-4011、31、41、51、61、71、91、161-120161-17011、21、31、pMCG161161-19021、161-21011、21、161-3-1011、31、51、71、81、91、101、111、121、161-3-2011、31、41、71161-3-4011、21、161-3-5011、21、51、61、91、121、131、161-5-3031、41、61表2PstCPK1转基因株系的加代及命名4.3.6PstCPK1转基因植株的抗锈病鉴定及Northern和Sourthern的分子鉴定按照4.2.8中的9型分级标准将转基因植株的抗病等级进行统计，得出如下表格，其中L9、L12、L18等株系有抗病反应。90 图4-7转基因株系抗条锈病等级的生物学鉴定。Figure4-7BioassayoftransgenicwheatplantsforPstresistance.筛选出的几个株系进行sourthern检测，结果如下：图4-8各个转基因株系的Sourthern检测结果Figure4-8Sourthernblotanalyzeoftransgenicplants.91 92 同样抽提转基因株系的RNA样品进行检测，结果如下：图4-9转基因株系的Northern检测。Figure4-9Northernblotanalysisofdifferenttransgeniclines.4.3.7筛选出的PstCPK1转基因株系的抗锈病鉴定及分子检测通过抗病性鉴定及分子鉴定，筛选出具有抗病性的两个转基因株系（L12，L18）后续研究的主要材料。将这两个株系在温室中接种取样并统计表型数据，得出结果：转基因株系L12的病情等级比野生型下降到了59%，而L18的发病等级比野生型下降到了46%；将发病等级分为三级的话，L12和L18株系的抗病植株所占的比例分别为69%和77%。实时荧光定量分析转基因株系接种条锈菌后PstCPK1的转录表达情况93 发现在接种后48,72,120,168h的表达量均显著下调；L12中PstCPK1的表达量下降至42-64%，L18中下降至36-50%。同时通过检测接菌5d后的生物量发现锈菌的生物量在L12中下降至76%，在L18中下降至72%。研究结果表明，锈菌的生长被siRNA明显干扰导致其致病力显著降低。图4-10两个转基因株系抗锈病的分子生物学鉴定。a:T4代转基因株系接种CYR32后14d的抗条锈病表型分析b:两个转基因株系的发病等级统计，按照9型病情分级标准统计后重新分为3级I:1-3;II:4-6;III:7-9。c：接种条锈菌后48,72,120和144h的沉默效率分析。d：接菌16d后发病叶片孢子堆数量统计分析。e：发病后5d所取叶片抽提DNA，以小麦和条锈菌的延伸因子为内参基因，绝对定量分析转基因株系的生物量。Figure4-10ExpressionofPstCPK1smallRNAinwheatconfersdurableresistancetoPst.a:Phenotypesofthesecondleavesofthethirdandthefourthgenerationofwheatplantsat14dpiwithPstisolateCYR32.b:Theratioofplantsindiseasegrades.Phenotypeswerescoredtoindicatethefrequencyofsymptoms,asfollows:I:1-3;II:4-6;III:7-9.c:RelativetranscriptlevelsofPstCPK1inthesecondleavesofthefourthgenerationwheatplantsat48,72,120and168hpiwithPstisolateCYR32.d:QuantificationoftheuredialdensityintheCK,L12,andL18inoculatedwheatplantsat16dpi.e:Q-PCRmeasurementoffungalbiomass.RatiooffungaltowheatnucleargenomesusingfungalPsEF1andwheatTaEF1genes,respectively,inplantstreatedwithvariantstargetingfungalgenescomparedwithcontrols.GenomicDNAextractedfromthesecondleaffromthreedifferentplantsat5dpi.Valuesrepresentthemeans±standarderrorofthreeindependentsamples.94 4.3.8PstCPK1转基因沉默植株接菌后的组织细胞学分析为了进一步了解沉默所产生的siRNA对小麦和条锈菌的影响，我们首先观察了接菌后的组织学（图4-11），发现沉默后菌丝的分枝长度和菌落面积显著降低，在L12中，分枝长度为300μm左右，比野生型中的600μm显著降低，L18中的菌丝平均长度约为200μm；菌落面积则是野生型为50000μm2，而转基因株系L12约为30000μm2，接种L18的菌落面积约为20000μm2。图4-11：转基因株系接种条锈菌后的组织学分析。a-f转基因株系和野生型接种后条锈菌的菌落结构观察；g-h转基因株系和野生型之间的菌落面积分析。接菌后2d和7d。Figure4-11HistologicalchangesofPstgrowthintransgenicplants.a-f:Amicroscopicexaminationrevealednoobviousdifferencesinthenumberofhyphalbranchesbetweenthecontrolplantsandthetransgenicplants.g-h:Thehyphallengthsinthetransgenelineswereshorterthanthoseobservedinthecontrolplants,andthecolonysizesinthetwotransgenicplantswerereducedcomparedwiththesizesobservedinthecontrolplantsat7dpi.95 4.3.9PstCPK1转基因沉默植株接菌后的分子生物学分析为了进一步了解沉默PstCPK1基因对于转基因株系的影响及对锈菌的影响，我们选择cAMP-PKA途径的相关基因和小麦的抗病及ROS信号通路相关基因进行了实时荧光定量分析。首先，我们通过观察表型发现，在该转基因材料中，锈菌的侵染时间久，发病时间长，因此我们推测锈菌的侵染过程在该材料中有所延迟，为此，我们做了实施荧光定量分析锈菌在侵染该材料后PstCPK1的基因表达情况，如图4-12所示：图4-12小麦条锈菌侵染西农1376后PstCPK1的基因表达情况。Figure4-12TranscriptionlevelanalysisofPstCPK1afterinoculatedofPstinXinong1376.我们对cAMP信号通路的相关基因进行了分析如图4-13所示：Ras基因是cAMP途径的上游基因，负责启动PKA信号通路和MAPK信号通路，Ras1可以激发烟草和酵母的坏死反应，然而，沉默锈菌的Ras1和Ras2对锈菌的生长和致病影响不大，我们检测了转基因株系中这两个基因的表达情况发现Ras1在前期48h有下调表达，而后期则无明显变化，然而Ras2在整个侵染后期均有所下调，说明PstCPK1的沉默通过某种方式反馈到该信号通路的上游，使得这两个基因也有所抑制。我们同时检测了PKA这个四聚体的调节亚基和另一个催化亚基，这两个基因的表达量均在后期大幅下调，说明PstCPK1的沉默效果在后期逐渐体现并抑制了整个复合体其他基因的表达情况。Prf1是cAMP下游的一个重要的转录因子，需要PKA进行磷酸化才能发挥作用，这个基因在PstCPK1沉默后受到了显著的抑制。综上所述：沉默PstCPK1基因能够使整个cAMP信号通路紊乱，通过各种反馈，上下游相关基因均被抑制表达，达到更好的抑制病原菌致病力的作用。96 图4-13锈菌侵染转基因株系后cAMP-PKA信号途径相关基因的表达分析Figure4-13TranscriptionlevelofsomeselectgenesincAMP-PKApathwayafterPstinfection.我们对沉默后植物的抗性相关基因和ROS信号通路相关基因的表达情况进行了分析，如图4-13所示，TaSOD、TaCAT1、TaCAT3、TaNOX、TaAPX高表达，活性氧信号通路被激活，因此，沉默PstCPK1基因某种程度上诱导了植物活性氧信号通路相关基因的表达，然而TaPOD、TaPAL、TaCAT2等基因并未出现明显的表达量的变化特征。抗病相关基因TaPR5显著上调表达，因此沉默PstCPK1基因可能激活了TaPR5的表达，而TaPR1和TaPR2的表达反而受到了抑制，有可能是因为转基因将载体导入导致的。综上所述，沉默PstCPK1基因不仅引起了菌中基因的沉默，通过寄生菌与寄主互作等复杂过程也导致了寄主抗病反应的提升。97 图4-14锈菌侵染转基因株系抗病相关基因和ROS信号途径相关基因的表达分析Figure4-14TranscriptionlevelofsomeselectgenesinresistancerelatedgeneandROSpathwayofwheatafterPstinfection.98 4.4结论与讨论由于锈菌毒性的疯狂变异，很多抗性品种逐渐丧失抗性，而锈菌和小麦的遗传转化困难导致锈菌致病性的研究滞后，因此对于锈菌致病基因的确定和功能分析非常重要，PKA蛋白激酶是研究历史久远的病原菌中的致病因子，由于其在毒性中发挥重要作用而被研究人员重视，在酵母中PKA与菌体的生长息息相关(Thomasetal.2009)，人源致病菌白色念珠菌在侵染寄主的时候该基因也参与了侵染过程(Cassolaetal.2004)，调节亚基的缺失突变体中催化亚基无法正确定位，也无法正常发挥功能，在毛霉菌中PKA参与了孢子的产生和萌发。玉米瘤黑粉菌的两个催化亚基参与了毒性和有性生殖过程，磷酸化下游诸多基因，影响非常大(Dürrenbergeretal.1998)。小麦壳针孢病菌中PKA与黑色素沉积和渗透压侵染丁的形成有关，也和无性繁殖过程中菌丝的生长有关(MehrabiandKema2006)。稻瘟菌的该基因是许金荣在1996年进行的研究，在稻瘟菌中cpkA是附着胞形成和致病性的必要基因，缺失后附着胞形成和侵染能力均丧失，另外，该基因还和有性生殖和产孢相关。RNAi通过表达与靶序列同源的双链RNA来沉默该序列的表达来完成。RNAi技术已被商业用于通过将病毒序列转基因来在植物中构建病毒抗性(Frizzi,AandHuang,S2010)。该技术也被用于昆虫和线虫的功能基因组学实验(Hannon,GJ2002)，并且通过简单地饲喂目标基因的双链RNA（dsRNA）(Huvenne,HandSmagghe,G2010)，已经证明了几种昆虫和线虫的沉默效应。真菌几丁质合成酶基因的HIGS可以产生对死体营养型真菌病原体具有抗性的转基因植物(Chenetal.2016)。目前正在探索HIGS策略以获得siRNA转基因的稳定和瞬时表达以实现对活体营养型真菌的抗性。通过在转基因植物细胞中产生双链RNA（dsRNA）来产生小RNA以产生持久抗性(Yinetal.2011)。在大麦中表达白粉病原菌中的几个基因的siRNA分子，影响病原真菌的生长发育(Nowaraetal.2010)。VinayPanwar和Macovei沉默MAP激酶（PtMAPK1），亲环素（PtCYC1）和钙调磷酸酶B（PtCNB）的相关基因，在体内分析它们在病原菌侵染小麦过程中的作用，发现通过植物表达序列内源性沉默小麦叶锈病致病基因导致小麦锈病的生长收到抑制。表达反义重复片段的纤维素合成酶（CES1）基因的转基因植物特异性抑制这些基因的表达，大大减缓菌落生长和抑制孢子形成(Govindarajuluetal.2015)。组织蛋白酶L半胱氨酸蛋白酶（Mi-cpl-1）基因的RNAi构建体的转基因表达导致番茄中南方根结线虫的感染和增殖减少了60-80％(Duttaetal.2015)。此外，基于小RNA的技术也可用于修改农作物农艺性状，以增强胁迫耐受性并提高产量(AuerandFrederick2009)。锈菌中对PstCPK1表达量在侵染初期非常高，后期降低到检测不到表达，在锈菌中沉默该基因后发现产孢量显著降低，因此，该基因与锈菌的致病力相关，组织学分析发现菌落面积和菌丝长度菌显著降低。利用异源互补技术分析该基因功能的保守性，如我们所期望的，互补后转化子的生长速率和野生型类似，气生菌丝比野生型更密集，稻瘟99 菌cpkA突变体的附着胞产生和侵染能力得到了部分恢复。因此锈菌的PstCPK1基因极有可能是一个锈菌中的致病因子，和侵染过程密切相关。通过以上的试验验证了PstCPK1是锈菌中一个潜在的致病因子，功能保守，在侵染初期诱导表达，可以互补稻瘟菌中附着胞的形成功能，并能恢复该基因在稻瘟菌中突变体的部分毒性功能，BSMV-HIGS瞬时沉默该基因，条锈菌的致病力大幅下降。因此，该基因是一个可用于遗传育种的重要的基因资源，我们利用HIGS技术构建该基因的永久沉默载体，通过基因枪法得到了该基因的抓基因沉默材料。这一章着重分析稳定后的转基因材料抗病等方面的各种指标，准确分析了该转基因材料沉默小麦锈菌基因后的各种表型、组织学和分子证据，为未来的转基因育种打下坚实的基础。HIGS技术是近10年新兴起的一个基因沉默技术，在锈菌中的应用是2010年开始的，随后发展出了BSMV介导的、农杆菌介导的和基因枪法利用寄主体系介导的基因沉默技术，此后该技术迅速普及，稳定的体系成为分析锈菌基因功能的反向遗传学的有力工具。然而小麦条锈菌中始终没有一个可以使用的HIGS抗病材料，这也是我们进行该项工作的初衷。小麦转基因难以进行一方面由于小麦基因组庞大，转基因体系不容易实现，另一方面，成功的转基因在小麦的不断加代中，外源转入的载体也会被小麦基因组逐步剔除，一般情况下，我们认为三代以后的小麦转基因材料才可以算是稳定遗传。我们在得到转基因材料后经过不断的加代和抗病性鉴定，筛掉假阳性的株系，最终得到了另个能够稳定遗传的抓基因株系，可以稳定抵抗小麦条锈流行小种CYR32和V26。脱靶效应是每个基因编辑所必需面对的难题，我们利用SiFi4.0预测了该基因在小麦中并无明显的脱靶效应，通过观察表型，如图4-21所示，我们发现转基因的空载对照和转基因株系在生长上并无明显差别，因此我们判断脱靶效应在该转基因株系中影响不大。同时我们检测了寄主抗病相关基因和锈菌的cAMP-PKA途径相关基因的表达情况，并参考文献绘制了该转基因株系中的沉默机理及影响，如图3-21所示，载体经过基因枪法进入寄主小麦的基因组中，在寄主体内借助其体系将单链DNA转录成为双链RNA，后经过寄主的Dicer酶体的切割成为siRNA大量存在寄主体内，在小麦条锈菌侵染寄主后经由吸器的吸收进入病原菌体内，抑制PstCPK1的表达，导致PKA激酶无法正常发挥作用，继而导致下游的大量基因未能接受磷酸化激活反应，锈菌的正常生长受到抑制，致病力也因此下降。转基因材料作为抗病育种的资源越来越重要，因此广发的发现致病因子并创制转基材料是防治锈病的有效途径。100 图4-21转空载体和转基因株系的营养生长状况。Figure4-21Thegrowthbetweentransgenicandcontrolwheatlines101 图4-22PKA途径中可能的HIGS机制的示意图。在宿主细胞内产生的真菌dsRNA被植物沉默机器使用内切核酸酶型DICER酶切割成siRNA；siRNA通过吸器外间质从小麦细胞转移到真菌细胞，该空间充当宿主或病原体细胞与其各自外部环境之间的通信和运输的纽带；发生通过HCW的主动或被动通道，并且一旦进入真菌吸器内，沉默分子触发其mRNA靶标的RNAi，并且可以在真菌沉默途径中充当引物，导致产生全身沉默信号。HMC，haustorium母细胞;H，haustorium;SSV，亚气管囊泡。Figure4-22SchematicpresentationofpossibleHIGSmechanismsinvolvedinPKApathway.SchematicpresentationofpossibleHIGSmechanismsinvolvedinPKApathway.FungaldsRNA,producedinsidehostcells,iscleavedbytheplantsilencingmachineryusingendonuclease-typeDICERenzymesintosiRNAs.siRNAstransferfromwheatcellsintofungicellsthroughextrahaustorialmatrix.Thisspaceactsasanexusofcommunicationandtransportbetweenhostorpathogencellsandtheirrespectiveexteriorenvironments.PassagethroughtheHCW,eitheractiveorpassive,occursand,onceinsidethefungalhaustorium,thesilencingmoleculestriggerRNAioftheirmRNAtargets,andmayactasprimersinthefungalsilencingpathway,leadingtothegenerationofsystemicsilencingsignals.HMC,haustoriummothercell;H,haustorium;SSV,substomatalvesicle.我们将HIGS视为研究专性营养性锈菌的基因功能的新工具，其也具有通过使用表达抗真菌RNAi构建体的转基因植物来控制疾病的可能性(Nowaraetal.2010)。转入RNAi构建体的转基因植株在第四代中表现出对锈菌遗传稳定的抗性。我们的研究结果表明，PstCPK1是一个很好的靶点，可以产生耐锈菌的持久遗传抗性，并且是生产持续抗真菌病原体的转基因粮食作物的新型抗性资源的潜在材料。但这种材料在农业生产中的应用需要更多的田间试验。随着各种测序技术的迅速发展，蛋白质组学和RNA-Seq分析的定量可用于此材料以了解效应子的致病机制。有助于环境友好和可持续农业的遗传育种发展。102 第五章全文结论自然界中，植物会受到外界各种生物或非生物胁迫环境的危害，其中包括各种病原微生物的侵袭。在植物与病原菌互作的过程中，二者相互斗争，协同进化。病原菌在与寄主长期进化过程中形成了大量的毒性因子，通过作用于寄主植物细胞使病原菌在寄主植物中成功侵染和定殖(Spethetal.2007)。效应蛋白（effector）作为一类非常重要的毒性因子，主要通过病原菌的菌体分泌到寄主体内，抑制寄主的防卫反应，从而引发寄主植物感病；另外，当病原菌效应蛋白被植物抗病蛋白直接或间接识别时，可以激活植物免疫系统，引起寄主细胞过敏性坏死反应，植物表现为抗病，此时被称为无毒基因(Avirulencegene)，诱导的防卫反应被称为效应蛋白激发的免疫反应(EffectorTriggeredImmunity,ETI)(Kamoun2006)。因此，病原菌的效应蛋白具有毒性和无毒性的双重功能，既是植物病原菌致病的重要武器，同时也是植物免疫系统的重要靶标。小麦条锈病是危害范围达整个世界的小麦病害，毒性变异的迅速和生长状态的复杂使其难以被攻克，对于锈菌的研究也由于其难以体外培养和遗传转化困难而进展缓慢。目前小麦条锈病仍未发现一个重要的致病因子和无毒基因，其研究进展远远落后于亚麻锈菌、叶锈菌、杆锈菌等，因此，对于其致病机理的研究和抗病材料的选育至关重要。亚麻锈菌已克隆和进行功能分析的效应蛋白基因均编码分泌蛋白，富集于吸器，如AvrL567、AvrM、AvrP123和AvrP4分别与亚麻抗病基因L5/L6/L7、M、P1/P2/P3和P4特异互作激活抗病反应(Catanzaritietal.2006)。研究表明亚麻锈菌可以将效应蛋白通过吸器注入到寄主细胞内，而且在没有病原菌存在的条件下，这些效应蛋白也能激活寄主的防卫反应，表明这些效应蛋白在病原菌通过吸器侵染寄主过程中发挥重要功能。另外，Ve等(2013)通过解析AvrM的晶体结构阐明了AvrM转运及毒性结构的功能。应用免疫荧光标记和电子显微镜技术，证实蚕豆锈菌分泌蛋白RTP1不仅分布在蚕豆锈菌体内和吸器外间质，而且在侵染植物细胞内也能检测到。RTP1蛋白具有蛋白酶抑制剂的功能，并且形成病菌纤丝以维持病菌吸器的结构(Kemenetal.2013;Pretschetal.2013)。Nirmala等(2011)鉴定了小麦秆锈菌夏孢子中的两个效应蛋白能够激活RPG1介导的抗性，表明RPG1作为受体可识别秆锈菌并且转导跨膜信号。近期的研究表明，小麦锈菌效应蛋白PEC6可抑制寄主的PTI反应并且能够与寄主中的腺苷酸激酶互作(Liuetal.)。Wang等(Wangetal.2016)通过酵母双杂等技术筛选出能够与小麦NPR1互作的锈菌效应蛋白。此外，本实验室在锈菌中鉴定出了一个重要的效应蛋白PSTha5a23并证实了其在干扰寄主防卫反应过程中的重要作用(Chengetal.2016)。通过研究致病因子PstCPK1和候选重要效应蛋白PstGSRE1调控寄主免疫机理，将加深我们对条锈菌致病及调控寄主免疫机理的深入认识，为条锈菌可持续控制提供理论103 依据。小麦条锈菌重要致病因子蛋白激酶A的催化亚基PstCPK1在其他物种中报道与毒性密切相关，在条锈菌侵染初期上调表达，可以互补稻瘟菌中的同源基因突变体，瞬时沉默该基因后，锈菌的产孢显著减少，说明该基因是一个潜在的重要致病因子，通过构建该基因的RNAi沉默载体转入小麦受体中，通过加代和抗病性鉴定及分子鉴定确认抗病性的提升是由于小RNA的产生，通过进一步分析分子水平的变化发现锈菌的cAMP信号通路基因表达量均有所下调，寄主的几个重要的抗性相关基因也诱导表达，说明通过某种未知途径，该基因也对寄主的某些基因有所影响。另一方面，我们筛选出了一个富含甘氨酸丝氨酸的分泌蛋白，该基因在侵染初期急速上调表达，可以抑制Bax诱导的过敏性坏死反应，并且探索出了是其中的甘氨酸丝氨酸富含的motif发挥作用，通过三型分泌系统将效应子在小麦叶片中过表达后发现该效应子可以抑制由细菌引发的胼胝质的累积和非亲和锈菌引起的活性氧累积，在裂殖酵母细胞中过表达该基因也得到类似的结论。同样的，锈菌中的PEC6和PSTHa5a23也有类似的功能。瞬时沉默该效应子可以导致锈菌致病性显著降低，然而并未发现明显的锈菌结构畸形等变化。因此我们构建了RNAi沉默载体转入小麦中得到持久抗病材料，并分析了转基因株系间的组织学和分子水平的变化。为了进一步了解该效应子在锈菌侵染过程中对寄主免疫的影响，我们通过酵母双杂交系统筛选出了一系列靶标，最终通过BiFC、Co-IP、Pull-down技术验证了该效应子的靶标TaLOL2。TaLOL2是LSD家族转录因子，在小麦抗锈病过程中起正向调控作用，在烟草中过表达该转录因子可以激发活性氧进而引起过敏性坏死，通过构建缺失突变体发现第一个锌指结构与激发活性氧的迸发密切相关，第二个和第三个也有类似功能，但是不是起主要作用，利用原生质体转化技术将该基因在小麦原生质体中瞬时表达，发现该转录因子有着明显的核定位，然而序列分析并未发现其有经典的核定位信号序列。通过构建缺失突变体，第一个锌指结构起主要的核定位功能。在小麦中过表达TaLOL2，小麦的抗条锈菌能力显著提升，组织学观察发现活性氧的累积也显著提升。在酵母细胞中过表达该基因，活性氧累积的细胞着色数量也有显著提升。为了进一步分析效应子和其靶标的作用方式，我们将其在烟草中共表达，发现该效应子可以抑制寄主TaLOL2所激发的活性氧和接下来的过敏性坏死反应，荧光显示寄主靶标的定位情况发生改变，从在核和胞质中的点状结构变化为在胞质中不规则富集状态，而核定位情况的变化最为明显，TaLOL2的核定位从明显到几乎观测不到在核内累积而在核外某个结构显著富集。我们利用CHIP-Seq技术分析了TaLOL2下游调控的基因，从而初步确认了小麦条锈菌效应子调控寄主免疫的通路。为锈菌的致病机理的研究提供了一个可以探索的途径。目前，生产上主要通过抗病品种的应用并辅以三唑类药剂使用来防治小麦条锈病。然而，由于小麦条锈菌毒性的频繁变异不断产生新毒性小种，往往导致小麦品种的抗病性失效；同时化学农药的大量使用造成人类生存环境的严重污染。因此，寻找新的抗病策略及创制新的持久抗病材料对小麦条锈病的持久控制具有重要的理论和实践意义。目104 前，寄主诱导的基因沉默（Host-InducedGeneSilencing，HIGS）技术已成为创制抗病新种质，持久控制病害的一种新的技术策略，并被推广应用。因此，通过HIGS技术改良小麦抗锈性、选育抗锈新品种已成为小麦抗病育种的重要任务之一。105 附录附表1部分溶液配方：MS培养基母液的配制：将各种元素母液进行混合，配制MS培养基（加入NaOH溶液调节pH值至5.8，高压灭菌20min）。其中1L体积中含有如下成分：组分用量大量元素母液100mL微量元素母液10mL铁盐母液5mL肌醇母液5mL甘氨酸母液2mL烟酸母液1mL盐酸吡哚素母液1mL琼脂7g盐酸硫胺素母液1mL蔗糖30gSD2培养基的配制：1L体积SD2培养基中含有如下试剂（加入NaOH溶液调节pH值至5.8，高压灭菌20min）：组分用量大量元素母液100mL微量元素母液10mL铁盐母液5mL天冬酰胺150mg2,4-D2mg琼脂4.8g盐酸硫胺素母液1mL蔗糖30gA.10×大量元素母液配方：大量元素组分质量（g）NH4NO316.5KNO319.0CaCl2·2H2O4.4106 MgSO4·7H2O3.7KH2PO41.7用蒸馏水体溶解定容至1,000mL（注：CaCl2·2H2O需要先进行单独溶解，稀释之后在与其它大量元素溶液混合）。B.100×微量元素母液配方微量元素组分质量（mg）KI83H3BO3620MnSO4·4H2O2230ZnSO4·7H2O860Na2MoO4·2H2O25CuSO4·5H2O2.5CoCl2·H2O2.5用蒸馏水溶解，定容至1,000mL（注：MnSO4·4H2O需要先用少1MHCl溶解，然后再与其它微量元素溶液混合）。C.200×铁盐母液配方组分用量Na2EDTA3.37gFeSO4·7H2O2.78gddH2O500mLD.10-3M的萘乙酸（NAA）溶液配方：称取18.6mg萘乙酸粉剂，用少量95%乙醇溶解后，用蒸馏水稀释并定容到1,000mL。E.20mg/mL肌醇母液：称量2g肌醇，用蒸馏水定容到100mL。F.0.5mg/mL烟酸母液：称量50mg烟酸，用蒸馏水溶解后定容至100mL。G.1.0mg/mL甘氨酸母液：称取100mg的甘氨酸用蒸馏水溶解后定容至100mL。H.0.5mg/mL盐酸吡哚素溶液：称取50mg盐酸吡哚素，蒸馏水定容到100mL。I.0.1mg/mL盐酸硫胺素溶液：称量10mg盐酸硫胺素，用蒸馏水定容至100mL。J.0.2mg/mL吲哚乙酸（IAA）溶液：称量20mg吲哚乙酸粉剂，用蒸馏水定100mL。K.1.0mg/mL激动素（KT）溶液：称量100mg的激动素，先用少量1MHCl溶解，然后用蒸馏水定容至100mL。L.3.0mg/mL草丁瞵(PPT)：量取30mgBialaphos溶于10mL蒸馏水，过滤除菌，-20℃冻存。107 2%CTAB缓冲液组分加入量（mg或mL）CTAB20gNaCl81.8g1MTris-HCl(pH=8.0)20ml0.5MEDTA20mlPVP-3608ml0.2%β-巯基乙醇2g总体积1L调整pH=8.0后再灭菌SouthernBlot所需试剂配方：溶液成分/制备用途注意事项2.5M86.2mL浓HCl，ddH2O定容至400mL脱嘌呤不需灭菌HCl121℃灭菌变性液NaCl87.6g，NaOH20g,ddH2O定容至1000mL变性DNA20min中和液Tris60.57g，NaCl87.6g，加入约800mL的ddH2O，用浓盐调整凝胶的PH121℃灭菌酸调节pH至7.6，ddH2O定容至1000mL值近中性20min20×SSC二水合柠檬酸钠88.2g,NaCl175.3g，加入约800mL的转膜液母液，洗121℃灭菌ddH2O，用稀HCl调pH值至7.0，用超纯水定容至1000mL，膜用液母液20min溶液成分/制备用途注意事项泡沫较多，应使用体积较大10%SDS1LSDS100g母液的容器进行配制0.3MNa3Citrate•2H2O88.2g20×SSC1L3MNaCl175.3g母液pH至7.02×SSC0.5%SDS20×SSC100ml洗膜1L10%SDS50ml量取20×SSC后先加入适量0.5×SSC20×SSC40ml水再加10%SDS洗膜0.5%SDS1L10%SDS50ml0.1M马来酸11.607g马来酸缓冲液封阻液0.15MNaCl8.766g1L的稀释用NaOH(固体)调节pH值到7.5(20℃)洗涤缓冲液1L0.1M马来酸11.607g去除未称取马来酸和NaCl后加入108 0.15MNaCl8.766g结合的适量水，调完PH值后，灭菌pH7.5(20℃)抗体后加入Tween20。实际为马0.3%(v/v)Tween20来酸缓冲液灭菌后加吐温200.1MTris12.114g调整pH检测缓冲液1L0.1MNaCl5.844g值到9.5pH9.5(20℃)0.2MDNA印0.2MNaOH8gNaOH+0.1%SDS记的洗10%SDS10ml1L脱小麦原生质体定位所需试剂配方：酶液加入量甘露醇7.285gKCl0.15gMES0.425gNaOH调节pH=5.7，定容至100mL，高压灭菌。W5溶液加入量（mg或mL）NaCl9gCaCl2•2H2O18.4gKCl3.75gMES0.42g总体积1LNaOH调节pH=5.7，高压灭菌。MMG溶液加入量（mg或mL）甘露醇7.285gMgCl20.305gMES0.085g总体积100mLNaOH调节pH=5.7，高压灭菌。1MCaCl2溶液：称取CaCl2•2H2O溶于20mL蒸馏水中，高压灭菌。109 PEG/Ca转化液加入量（mg或mL）甘露醇0.182gPEG40002g1MCaCl20.5mL总体积5mL现配现用。WesternBlot所需试剂配方：10%SDS：试剂用量ddH2O900mLSDS100.0g68℃助溶浓HClpH=7.2去离子水Upto1000mL10%APS（现配现用）:试剂用量APS0.05gddH2O500μL30%Arc+Bis（存储于棕色瓶中，4℃避光保存）:试剂用量Arc17.4gBis0.6g去离子水20.0mL37℃水浴助溶ddH2OUpto60mL滤纸过滤pH≤7.0110 分离胶：试剂用量ddH2O1.6mL30%Arc+Bis2.0mL1.5MTris-Cl1.3mL10%SDS50μL过硫酸铵（APS）70μL加速剂（TEMED）4.0μL搅拌，入缝。用ddH20水封30min;浓缩胶：试剂用量ddH2O1.4mL40%Arc+Bis330μL1.0MTris-Cl250μL10%SDS20μL过硫酸铵（APS）30μL加速剂（TEMED）3.0μL快速搅拌均匀，入缝插好梳子，静置15-20min。蛋白胶染色液（按照比例加入）：试剂用量（体积）甲醇4.5冰醋酸4.5水1考马斯亮蓝R-2500.25%脱色液：甲醇：水：冰醋酸=4.5：4.5:1（体积比）混合；330％丙烯酰胺溶液：30％丙烯酰胺溶液：4℃保存（100mL）Bis-Acrylamide0.8gAcrylamide29.2gddH2O定容至100mL111 1.5mol.L-1Tris-HCl(pH8.8)(500mL):Tris碱90.1g，盐酸5~10mL，ddH2O至400mL，浓盐酸调pH=8.8，定容至500mL；10％SDS（100mL）SDS10g，dH2O定容至100mL；10％过硫酸铵AP（100mL）过硫酸铵10g，dH2O定容至100mL；1.0mol.L-1Tris-HCl(pH6.8)(500mL)Tris碱60.55g，浓盐酸35mL；ddH2O至380mL，浓盐酸调pH=6.8，定容至500mL；2xproteinsamplebuffer:2xproteinsamplebuffer体积/质量1.0mol.L-1Tris-HCl(pH6.8)1.0mLβ-巯基乙醇1.0mLSDS粉末0.4g0.1％溴酚蓝1.0mL甘油3.0mLddH2O定容至10mLBlottingbuffer：5％脱脂牛奶于1xTBSTansferbuffer：transferbuffer体积/质量Tris3.03g甘氨酸14.3g甲醇200mLSDS0.5gddH2O定容至1L电泳缓冲液（5X）：Tris碱15.1g，甘氨酸94g，SDS5g。1XTBS:1.0mol/LTris-HCl(pH=7.4)50mL，NaCl8.8g，定容至1L。112 附表2.PstCPK1引物列表Table1PrimersdesignedforPstCPK1research.LenghtofAmplifiedPrimersSequences(5′→3′)FragmentsCPK1-FATGTCAGCCTTTGATCCATT1443bpCPK1-RTTAAAAACCAGGGAAAAGATGqRT-CPK1-FACGCACCCTTGGAACTGG160bpqRT-CPK1-RTCGAACGGCAGCCAACATHigs-CPK1-1ATATTAATTAAGCCACTGACTTGCCTACas-F296bpHigs-CPK1-1TATGCGGCCGCGAGGGGAAGTGAGGGTas-RTHigs-CPK1-2ATATTAATTAATGCTGGTTATCCTCCCas-F224bpHigs-CPK1-2TATGCGGCCGCATCGTTCCCAATCTACTas-RTCCAGATCTTGGCTTTCGTAGGAACCCAATCPK1-CM-FCTTCAATGTCAGCCTTTGATCCATT1443bpCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCCPK1-CM-RTTGCTCACAAAACCAGGGAAAAGATGRNAiGAGGGCGCGCCATGTCAGCCTTTGATCC-CPK1-1-FATTGRNAi-CPK1-CCTTCCTAGGTTAAAAACCAGGGAAAA1-RGATGA1443bpRNAi-CPK1-AGAGCGATCGCTTAAAAACCAGGGAAA2-FAGATGRNAi-CPK1-CCCACTAGTATGTCAGCCTTTGATCCAT2-FTGACBar-FACTCGGCCGTCCAGTCGTA175bpBar-RACAAGCACGGTCAACTTCCUBI1-FATCTAACAGAACTCGCCGTGAA453bpUBI1-RGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCPK1-Intron-GGCTGAACACATCATACGATAF1803bpCPK1-Intron-TCTGAATAAGAGGGGAAACAARTG-CPK1-FTTCTCCAATACCCGTCTC559bpTG-CPK1-RAACAAGTTTAGCGAACCCNB-CPK1-FAATACCCGTCTCAACACCCCTAGAA291bpNB-CPK1-RACGAGGAAAGGATGTCGAACGGCAGSB-CPK1-FAAAATTACCGATTTTGGGTTCGCTA302bpSB-CPK1-RTTGGATAGATCGGCCGTTAAGAGTG113 γ-FAAAGTGAGGTTAACGCAATACGgeneralprimerγ-RTCAGGCATCGTTTTCAAGTTTaEF1-FTGGTGTCATCAAGCCTGGTATGGTgeneralprimerTaEF1-RACTCATGGTGCATCTCAACGGACTqRT-PstRas1-ATGGCTTCAAAGGCTCAGTFgeneralprimerqRT-PstRas1-AATCACGCATTGTTTACGGRqRT-PstRas2-GTCTTACTGGGAGATGGAGGTGFgeneralprimerqRT-PstRas2-CCTCCTGTCCTGCTGTATCGRqRT-prf1-FACGCCTACGTGGGCTATTGAgeneralprimerqRT-prf1-RGGTGAGCTGTTGGGAGATGGqRT-PKAr-FGTATCAGTATCCGCTGAATCTCgeneralprimerqRT-PKAr-RCATCATCGTGTTGCTCTTGqRT-CPK2-FAAAAGCGGCAGATTGGTGgeneralprimerqRT-CPK2-RGAGTAGTCTTGAGATGAGGTCG附表3PstGSRE1中所用的引物PrimersSequences(5′→3′)Experiment1302-PstGSRE1-CATGGTAGATCTGACTAGTTCTCCAGTFACATCACGAAGCTsubcellularlocalization1302-PstGSRE1-GCCCTTGCTCACCATCCTAGGGAAGCCRCAATAGGCTAAGAGGACpSUC2-PstGSRECCGGAATTCATGTTCACCGCCATCTAC1-FGFunctionalvalidationofpSUC2-PstGSRECCGCTCGAGAGCAAAGGCAACGGCAGsignalpeptides1-RCCCCCCGGGACTGAGTACTCCGACGAAAPVX-AVR1b-FCCAATAGCGCGTCGACGTCTCAGCTCTGATACCPVX-AVR1b-RGGTGAAAGGPVX-PstGSRE1-CCCCCGGGTCTCCAGTACATCACGAAGoverexpressioninN.FCTtabacumXhoCCGCTCGAGTCTCCAGTACATCACGAAI-PstGSRE1-FGCTEcoRCCGGAATTCCTAGAAGCCCAATAGGCTI-PstGSRE1-RAAGAGGACPstGSRE1Δ1-10-TCCCCCGGGTCTAGTTACTCGCAGGACdeletionmutantFAGCGCGC114 PstGSRE1Δ1-20-TCCCCCGGGTCCGCAATCATGACTCTCFAAGPstGSRE1Δ1-30-FTCCCCCGGGGGCCCATTTGGTGGACACCGCGTCGACGTCCTAGAAGCCCAATAGPstGSRE1N-RGCTAAGAGGACTCCCCCGGGTCTCCAGTACATCACGAAPstGSRE1C-FGCTPstGSRE1Δ240-2CGCGTCGACTTGTTCAAAGAATGACTG90-RGAAAGTCPstGSRE1Δ190-290-RCGCGTCGACGCTGGAAGCAACGCTGGCPstGSRE1Δ140-2CGCGTCGACAGTCTGAGACATTGAACC90-RAGCCPstGSRE1Δ90-29CGCGTCGACACCGGCACCGCCAATCAT0-RAPstGSRE1Δ60-29CGCGTCGACGGCGTTGCCGAATCCGAG0-RA4T-1-PstGSRE1-CCGGAATTCTCTCCAGTACATCACGAAFGCT4T-1-PstGSRE1-CCGCTCGAGCTAGAAGCCCAATAGGCTRAAGAGGACPull-downassayCCGGAATTCATGCAGAGCCAGATCGTG4t-1-lol2-FT4t-1--lol2-RCCGCTCGAGCTACTTTTTCCCGCCGGACGGAATTCATGTTCACCACCATCTACGTBD-PstGSRE1-RCGCTTCY2HGCGTCGACCTAGAAGCCCAATAGGCTABD-PstGSRE1-FAGAGGACBIFC-PstGSRE1-FACTAGTTCTCCAGTACATCACGAAGCTBIFC-PstGSRE1-CCGCTCGAGGAAGCCCAATAGGCTAAGRAGCAACATCGAGGGATCCATGCAGAGCCANYFP-lol-FGATCGTGTGCTGTACAAGGGATCCATGCAGAGCCACYFP-lol-FGATCGTGTBIFCTTCGAGCTCTATCCCGGGCTTTTTCCCGN/CYFP-lol-RCCGGANYFP-CAACATCGAGGGATCCTCTCCAGTACAPstGSRE1-FTCACGAAGCTCYFP-GCTGTACAAGGGATCCTCTCCAGTACAPstGSRE1-FTCACGAAGCTN/CYFP-TTCGAGCTCTATCCCGGGGAAGCCCAA115 PstGSRE1-RTAGGCTAAGAGTGCTCTAGATCTCCAGTACATCACGAAcoip-PstGSRE1-FGCTcoip-PstGSRE1-CO-IPRACTAGTGAAGCCCAATAGGCTAAGAGco-ip-lol2-FcaccATGCAGAGCCAGATCGTGTco-ip-lol2-RCTTTTTCCCGCCGGAATATTAATTAACGGTGGGATGAGTGCTr-PstGSRE1F-FTCTATGCGGCCGCCTGATGGCGGACGAGGr-PstGSRE1F-RTACTGAAGCBSMV-HIGSATATTAATTAAACTTCCTCTTCTTCGTCr-PstGSRE1B-FTTTCTATGCGGCCGCACCGACACCAGGGATGr-PstGSRE1B-RATorf-lol2-FATGCAGAGCCAGATCGTGTGCorf-lol2-RCTACTTTTTCCCGCCGGATGTTCCCCCGGGATGCAGAGCCAGATCGTGPVX-lol-FTGCCGCGTCGACCCTACTTTTTCCCGCCGGAPVX-lol-RTGTCCGGAATTCATGCAGAGCCAGATCGTGAD-lol-FTGCAD-lol-RCCGCTCGAGCTTTTTCCCGCCGGATGTCCGGAATTCTCTAGTTACTCGCAGGAC1BD-Δ1-10-FAGCGCGCCCGGAATTCTCCGCAATCATGACTCTC2BD-Δ1-20-FAAG3BD-Δ1-30-FCCGGAATTCGGCCCATTTGGTGGACACGCGTCGACTTGTTCAAAGAATGACTGGY2H4BD-Δ234-274-RAAAGTC5BD-Δ194-274-RGCGTCGACGCTGGAAGCAACGCTGGCGCGTCGACAGTCTGAGACATTGAACCA6BD-Δ154-274-RGCC7BD-Δ114-274-RGCGTCGACACCGGCACCGCCAATCATA8BD-Δ74-274-RGCGTCGACGGCGTTGCCGAATCCGAGACCGCTCGAGAATAAAATTGCAGATAGCAD-NTD-LOL-RACATTTGPVX-NTD-LOL-CGCGTCGACCAATAAAATTGCAGATAGRCACATTTGNB-PstGSRE1-FCTACCGGCTGCATGACTTGTTTCTCNB-PstGSRE1-RGATGCTTTGCATGACCGGGGCNortherblotandPstGSRE1-intronSourthernblotGCCCCTAAGACAGATAAGCCGC-F116 PstGSRE1-intronCCAAGGTATCTAATCAGCCATC-RPCR-PstGSRE1-ACCAATTCGCTTCGTTCATGAGCF+RUBI-FTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCUBI-RTGAGACCCTTTACGCCACCGCAGCACCG/RFP-XhoI-lol-CCGCTCGAGATGCAGAGCCAGATCGTGFTGCG/RFP-BamHI-loCGCGGATCCCTTTTTCCCGCCGGATGTl-RCo-localzationG/RFP-XhoI-PstCCGCTCGAGATGGGATCCTCTCCAGTAGSRE1-FCATCACGAAGCTG/RFP-BamHI-PCGCGGATCCCCCGGGGAAGCCCAATAGstGSRE1-RGCTAAGAG117 附表4PstCPK1脱靶的SiFI分析PredictionofPstCPK1geneoff-targettranscriptsa.OrganismbIDAllHitsEffHitsAJIL01000005.1560AJIL01000004.1340AJIL01000017.1290AJIL01000164.1210PucciniaAJIL01000014.1190striiformisf.sp.AJIL01000009.1130triticiAJIL01000084.1120AJIL01000251.1120AJIL01000006.1110AJIL01000122.1100TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_515228_AA1668380.11000TRIAE_CS42_1BL_TGACv1_030715_AA0098920.1650TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_516419_AA1675140.1450TRIAE_CS42_3DL_TGACv1_250762_AA0872750.1420TRIAE_CS42_6AS_TGACv1_487288_AA1569730.1420TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_513282_AA1637120.1370TRIAE_CS42_1BS_TGACv1_050316_AA0170590.1360TRIAE_CS42_5AL_TGACv1_375443_AA1221730.2220TRIAE_CS42_5AL_TGACv1_375443_AA1221730.6220TRIAE_CS42_5AL_TGACv1_375443_AA1221730.4220TRIAE_CS42_5AL_TGACv1_375443_AA1221730.5220TRIAE_CS42_5AL_TGACv1_375443_AA1221730.3220TriticumTRIAE_CS42_5AL_TGACv1_375443_AA1221730.1220aestivumTRIAE_CS42_U_TGACv1_646843_AA2147070.1200TRIAE_CS42_U_TGACv1_665230_AA2153870.1180TRIAE_CS42_1AS_TGACv1_019078_AA0059980.1180TRIAE_CS42_4BS_TGACv1_328596_AA1090800.1170TRIAE_CS42_2BL_TGACv1_131565_AA0429230.1170TRIAE_CS42_6AS_TGACv1_485671_AA1549900.1120TRIAE_CS42_4DS_TGACv1_362062_AA1176280.1120TRIAE_CS42_6AS_TGACv1_492231_AA1577600.1100TRIAE_CS42_5DL_TGACv1_435789_AA1454930.2100TRIAE_CS42_4AL_TGACv1_289933_AA0978980.1100TRIAE_CS42_5DL_TGACv1_435789_AA1454930.1100TRIAE_CS42_5DL_TGACv1_435789_AA1454930.3100Pucciniatriticina00Pucciniagraminisf.sp.triticiNW_003526549.1126Blumeriabgh_dh14_v3.0_supercontig_0054832110118 graminisbgh_dh14_v3.0_supercontig_00545183bgh_dh14_v3.0_supercontig_00548652bgh_dh14_v3.0_supercontig_00010041bgh_dh14_v3.0_supercontig_00548511bgh_dh14_v3.0_supercontig_00546810附表5PstGSRE1和TaLOL2脱靶的SiFI分析.PredictionofPstGSRE1gene(fulllength)off-targettranscriptsa.OrganismbIDAllHitsEffHitsPucciniastriiformisf.sp.triticiAJIL01000051.1;644321AJIL01000071.1;6333AJIL01000022.1;5732AJIL01000171.1;4522AJIL01000289.1;2517AJIL01005185.1;97AJIL01004245.1;51AJIL01000119.1;55AJIL01007068.1;32Triticumaestivumnohitsfound00Pucciniatriticinanohitsfound00Pucciniagraminisf.sp.triticinohitsfound00Blumeriagraminisnohitsfound00PredictionofTaLOL2geneoff-targettranscriptsa.OrganismbIDAllHitsEffHitsPucciniastriiformisf.sp.triticinohitsfound00Triticumaestivumnohitsfound00Pucciniatriticinanohitsfound00Pucciniagraminisf.sp.triticinohitsfound00Blumeriagraminisnohitsfound00119 附表6生物量分析的标准曲线120 参考文献李振岐.1980.我国小麦品种抗条锈性丧失原因及其解决途径.中国农业科学,13(3):72-77.李振岐,曾士迈.2002.中国小麦锈病中国农业出版社.AuerC,FrederickR.2009.CropimprovementusingsmallRNAs:applicationsandpredictiveecologicalriskassessments.Trendsinbiotechnology,27(11):644-651.BechingerC,BastmeyerM.1999.Opticalmeasurementofinvasiveforcesexertedbyappressoriaofaplantpathogenicfungus.Science,285(5435):1896.BeneditoVA,VisserPB,AngenentGC,KrensFA.2004.Thepotentialofvirus-inducedgenesilencingforspeedingupfunctionalcharacterizationofplantgenes.Genetics&MolecularResearchGmr,3(3):323.BockmühlDP,KrishnamurthyS,GeradsM,SonnebornA,ErnstJF.2001.DistinctandredundantrolesofthetwoproteinkinaseAisoformsTpk1pandTpk2pinmorphogenesisandgrowthofCandidaalbicans.Molecularmicrobiology,42(5):1243-1257.BosJIB,ArmstrongMR,GilroyEM,BoevinkPC,HeinI,TaylorRM,TianZD,EngelhardtS,VetukuriRR,HarrowerB.2010.PhytophthorainfestanseffectorAVR3aisessentialforvirulenceandmanipulatesplantimmunitybystabilizinghostE3ligaseCMPG1.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,107(21):9909-9914.BosJIB,KannegantiT,YoungC,CakirC,HuitemaE,WinJ,ArmstrongMR,BirchPRJ,KamounS.2006.TheC-terminalhalfofPhytophthorainfestansRXLReffectorAVR3aissufficienttotriggerR3a-mediatedhypersensitivityandsuppressINF1-inducedcelldeathinNicotianabenthamiana.ThePlantJournal,48(2):165-176.BowenJK,TempletonMD,SharrockKR,CrowhurstRN,RikkerinkEH.1995.GeneinactivationintheplantpathogenGlomerellacingulata:threestrategiesforthedisruptionofthepectinlyasegenepnlA.Molecular&GeneralGeneticsMgg,246(2):196.BradleyDJ,KjellbomP,LambCJ.1992.Elicitor-andwound-inducedoxidativecross-linkingofaproline-richplantcellwallprotein:anovel,rapiddefenseresponse.Cell,70(1):21-30.CassolaA,ParrotM,SilbersteinS,MageeBB,PasseronS,GiassonL,CantoreML.2004.Candidaalbicanslackingthegeneencodingtheregulatorysubunitofproteinkinaseadisplaysadefectinhyphalformationandanalteredlocalizationofthecatalyticsubunit.EukaryoticCell,3(1):190.CatanzaritiAM.2006.Haustoriallyexpressedsecretedproteinsfromflaxrustarehighlyenrichedforavirulenceelicitors.THEPLANTCELLONLINE,18(1):243-256.ChenJ,NolanT,YeH,ZhangM,TongH,XinP,ChuJ,ChuC,LiZ,YinY.2017.ArabidopsisWRKY46,WRKY54andWRKY70tanscriptionfctorsaeinvolvedinbrassinosteroid-regulatedplantgrowthanddroughtresponse.ThePlantCell:364-2017.ChenSX,SchopferP.1999.Hydroxyl‐radicalproductioninphysiologicalreactions.FebsJournal,260(3):726-735.ChenW,KastnerC,NowaraD,Oliveira-GarciaE,RuttenT,ZhaoY,DeisingHB,KumlehnJ,SchweizerP.2016.Host-inducedsilencingofFusariumculmorumgenesprotectswheatfrominfection.JournalofEperimentalBotany,67(17):4979-4991.ChenW,WellingsC,ChenX,KangZ,LiuT.2014.Wheatstripe(yellow)rustcausedbyPuccinia121 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致谢时光飞逝，岁月如梭，转眼间我的博士生涯已经接近尾声，作为一个陕西人，从本科到博士，我的青春岁月永远地留在了杨凌这个美丽的地方，一点一滴，我亲眼见证了杨凌的飞速发展，也参与到了西农的日渐强大，在这里，有我失败的悔恨，也有我成功的喜悦。在小麦条锈病课题组学习近5年，对我的人生影响很大，让我深深地认识到了平台和眼界对一个人的影响有多大。首先要感谢我的导师郭军教授，我是郭老师的第一个博士研究生，也是接受郭老师栽培和心血最多的博士，郭老师将成熟的课题和最新的研究方向都交给了我，让我在科研上能够做出现在的成绩与郭老师的心血分不开，郭老师不仅是我学习上的导师，更加教会了我为人处事的好多道理，他的谆谆教诲与严格要求是我进步的动力，也是我今后的方向。康振生院士更是我生活和工作中的榜样，康老师的勤奋和眼界是我们望尘莫及的，作为一个他门下的弟子，我深感荣幸，正是在这种工作和生活中的点点滴滴无形的影响着我们，让我们心无旁骛，专心研究。真诚感谢顾彪老师和杜羽老师在试验思路和试验设计上的无私知道和全力帮助，衷心感谢詹刚明老师、魏国荣老师和陈银潮老师在东南窑的辛苦付出，感谢韩德俊老师、王晓杰老师、赵杰老师、黄雪玲老师、毛虎德老师、张新梅老师、刘杰老师、汤春蕾老师、王晓静老师、裴国亮老师、王建锋老师以及庄华老师在试验开展过程中给予的诸多帮助和便利。感谢实验室博士硕士：王琪琳、曾庆东、郝影宾、白鹏飞、张金山、姚娟妮、冯浩、成玉林、杨宇衡、常青、朱晓果、王龙、吴建辉、赵梦鑫、刘芃、黄传明、秦娟、何付新、张阳、郭嘉、杨倩、王康、王宁、宋平、马微、兰定云、谭成龙、刘聪、王韵倩、张冕等对我的无私帮助。同时，感谢中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所主任朱建康老师提供的同位素平台和在试验过程中的无私帮助。还要感谢我的家人，感谢父母在生活中给予我细心周到的照顾，你们的默默陪伴、鼓励与支持是我专心学业的坚强后盾。最后，感谢西北农林科技大学，感谢小麦锈病课题组为我提供优越的学习和生活环境，这不仅让我度过了人生中最美好的大学时光，更让我学到了许多非常有用的宝贵知识。131 个人简介戚拓，男，汉族，1988年1月出生，陕西西安人。2010年毕业于西北农林科技大学葡萄酒学院葡萄与葡萄酒酿造专业，获工学学士学位；2014年毕业于西北农林科技大学植物保护学院植物免疫学专业，获农学硕士学位；同年，就读于西北农林科技大学植物病理学专业攻读博士学位，主要从事小麦与小麦条锈菌互作过程中的致病机理和RNAi转基因抗病材料的创制研究。攻读博士期间发表的相关学术论文：[1]TuoQi,XiaoguoZhu,ChenlongTan,PengLiu,JiaGuo,ZhenshengKang,JunGuo*2017.9，Host-inducedgenesilencingofanimportantpathogenicityfactorPstCPK1inPucciniastriiformisf.sp.triticienhancesresistanceofwheattostriperust，PlantBiotechnologyJournal,SCI,2017,IF=7.4431,doi:10.1111/pbi.12829[2]TuoQi1†,JuanWang1†,QixiongSun1,BradDay2,3,JunGuo1*andQingMa,2017.8，TaARPC3,ContributestoWheatResistanceagainsttheStripeRustFungus，Frontiersinplantscience8:1245,SCI,2017,IF=4.298,doi:10.3389/fpls.2017.01245[3]XiaoguoZhu,TuoQi,QianYang,FuxinHe,ZhenshengKang*,andJunGuo*Host-inducedgenesilencingoftheMAPKKgenePsFUZ7confersstableresistancetowheatstriperust,PlantPhysiology,SCI，2017，IF=6.456，doi:10.1104/pp.17.01223[4]TuoQi,ThePucciniastriiformisf.sp.triticiin-plantainducedeffectorgenePSTG_27397(PstGSRE1)suppresseswheatimmunitybytargetingTaLOL2involvedinROSsignaling.NatureCommunication,manuscript[5]TuoQi,TaARPC5,PlayingMultipleRolesinWheatagainsttheStripeRustFungus,Frontiersinplantscience,underreview132