同种异体富血小板血浆对糖尿病大鼠深Ⅱ°烫伤创面愈合的影响

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分类号Ｒ７３密级公开－ＵＤＣ６１０学校代码１０５５５？名考々莩硕士学位论文（专业学位）同种异体富血小板血浆对糖尿病大°鼠深ＩＩ烫伤创面愈合的影响研究生姓名：舒海宁指导教师、职称：郑军主任医师专业学位类别（领域）：外科学研究方向：烧伤整形所在学院一临床学院：第二〇一八年五月 论文题目：同种异体富血小板血浆对糖屎病大鼠深°Ｍ烫伤创面愈合的影响论文作者签名：指导教师签名论文评阅人１：张不红主仟医师博导中南大学湘雅民院评阅人２：贺全勇主仟医师硕导中南大学湘雅三民院答辩委员会主席：昔晓元主仟医师博导中南大学湘雅医院委员１一：李利平丰仟医师硕导南华大学附属第医院一委员２：贺大璞主仟医师硕导南华大学附属第医院委员３：贺楚宇主仟疾师南华大学附属南华医院委员４周昌宁副主仟医师南华太学附属第一医院：答辩日期：年Ｊ月曰ｆ 南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或ｉ正书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研宄所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：月，‘曰南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读／（博硕＃学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得以其它、单位的名义发表。本人同意南华大学有关保留使用学位论文的规ｇ：定，卩学校，可全有权保留学位论文允许位论文查阅借阅：学被和学校以公布学位论文的部或部，可以、分内容采用复印缩印或其它手段保留学位论文；可根学校据国家或。入湖南省有关部门规送交位论文意学校《士定学同将论文加中国优秀博硕学位论文全库》，《士》文数据并按中国优秀博硕学位论全数据库规文文出版章程定受益。享相关权同意授权中国科究位论《学信息技术研所将本学文收录到中国学位论全文数通过。库》，网络向社会公服于文据并众提供信息务对涉密的学位论，。文解密后适用该授权■：作者名签年５月日签名：导曰师年月＞Ｊ＃各Ｉｙｆ 同种异体富血小板血浆对糖尿病大鼠深II°烫伤创面愈合的影响摘要：目的：探讨同种异体富血小板血浆（PRP）对糖尿病大鼠深二度烫伤创面愈合的影响，及初步研究其促进糖尿病烫伤创面愈合的机制。方法：SPF级雄性SD大鼠,随机分成三组，其中两组以STZ诱导成I型糖尿病组（即A、B两组）；C组为正常大鼠组，每组12只。糖尿病组大鼠予以一次性腹腔注射STZ(60mg/kg)，同时对正常组大鼠腹腔注射相同体积的柠檬酸缓冲液。STZ诱导后72小时经尾静脉采血，测随机血糖。分别在建模后第0、1、2、3、4周监测大鼠的血糖并观察其一般情况。诱导后8周，随机摘取糖尿病组及正常组大鼠胰腺组织行HE染色。糖尿病大鼠造模成功8周后，采用恒温水浴2箱80℃，使用烫伤装置在三组大鼠背部建立面积为4×4cm大小的深II°烫伤模型。A、C组使用富血小板血浆凝胶涂抹创面，B组使用等量生理盐水涂抹创面，凡士林纱布封闭，胶布固定（或缝线固定），隔日换药并观察创面愈合情况，于治疗后7、14、21d时相点各组随机处死4只取创面皮肤组织标本,组织学检查创面愈合情况，测定血管内皮生长因子（VEGF）表达水平，微血管密度，炎性细胞，成纤维细胞及微血管形成。结果：大鼠注射STZ后第7天血糖值达到成模标准，与正常组I 相比，糖尿病组大鼠胰岛细胞被破坏，体积萎缩变小，胰岛内分泌细胞数量明显减少。烫伤后第14、21天A组大鼠创面愈合率明显高于B组（P＜0.05），HE染色显示B组大鼠创面在烫伤后第21天仍存在炎性细胞浸润。经PRP治疗7天后的糖尿病大鼠与糖尿病对照组相比，其烧伤创面中MVD阳性表达明显增高，P＜0.05。烫伤后各时相点糖尿病大鼠VEGF的表达阳性率均低于正常组(P<0.05)。结论：1.一次性腹腔注射STZ（60mg/kg）可制备稳定的I型糖尿病大鼠模型。2.同种异体富血小板血浆通过提高创面肉芽组织VEGF表达水平，增加创面微血管数量，促进肉芽组织增殖，加快创面愈合，是其促进糖尿病大鼠烫伤创面愈合的机制之一。关键词：烫伤;糖尿病;富血小板血浆(PRP);创面;大鼠II THEEFFECTOFALLOGENEICPLATELET-RICHPLASMAINDEEPⅡDEGREEBURNWOUNDHEALINGOFDIABETICRATSHainingShu(Burn&plasticSurgery)DirectedbyJunZhengAbstract：Objective:Preparationofallogeneicplatelet-richplasmaandtoobservethediabeticratswithdeepIIdegreeburnswoundhealing.Method:TheSPFmaleSDrats(aged8weeks,weighing200-250g)wererandomlydividedinto3groups,RatsofgroupAandBwereinjectedwithstreptozocintoinducediabeticmodels.GroupCasnormalcontrolgroup,eachgrouphad12rats.Diabetic[60mg/kgofSTZ,singlei.p.]groupandnormal[citratebuffersolutioni.p.]group.72hafterinjectionwithSTZ,thebloodglucoselevelsweremonitoredandcomparedformratvenathstndrdthcaudalis.Levelsofbloodglucosewereevaluatedatthe0,1,2,3,4weekrespectively.ThetissuesectionsofpancreaswerestainedbyHEatththe8week.After8weeksthentype1diabetesratsaftermodelingsuccessfully,usingheatedwaterbath80℃，threegroupratswere2produceddeepIIdegreeburnwoundwithaareais4×4cmwasestablishedontheback.Eachgrorpwereuseddifferentinterventions:Thewoundweretreatedwithallogeneicplatelet-richplasmaorN.S.dressingIII Dailydressingandmeasurementofwoundarea.Tissuesamplesfromwoundsitewerecollectedonin7,14and21dpointwererandomlykilledfourratsineachgrouptakescaldedskinfull-thicknessspecimensforhistologicalandimmunohistochemicalstainingtodetecttheVEGFexpressionlevel,themicrovesseldensity,inflammatorycells,fibroblastsandangiogenesis.Result:Thebloodglucoselevelreachedthemold-guidestandardanddiabeticappearanceoccurredat7daysafterSTZadministration.Comparedwithnormalgroup,thepancreaticisletsofdiabeticratsweredestroyedandshrunk,andtheendocrinecellsofpancreaticisletsweremarkedlydecreasedinexperimentrats.Atthe14thand21stdaysafterscald,thewoundhealingrateofgroupAwassignificantlyhigherthanthatofgroupB(P<0.05).HEstainingshowedthatthewoundsofgroupBstillhadinflammatorycellinfiltrationonthe21stdayafterscald.Comparedwiththediabeticcontrolgroup,theMVDexpressioninthediabeticratsafterPRPtreatmentfor7dayswassignificantlyhigherthanthatinthediabeticcontrolgroup(P<0.05).TheexpressionofVEGFwaslowerinburnedwoundsofdiabeticratsthaninthenormalatvarioustimepoints(P＜0.05).Conclusion:1.IntraperitonealthroughinjectionofSTZ（60mg/kg）isanexcellentmethodtoinducetypeIdiabetesinrats.IV 2.Allogeneicplatelet-richplasmacanacceleratetheprocessofwoundhealingbyimprovetheexpressionofVEGF,increasesthemicrovesselsdensity,andpromotesproliferationofgranulationtissue.Keywords:burndiabetesplatelet-richplasma(PRP)woundratsV 主要英文缩写中英文对照表英文缩写英文全称中文全称STZStreptozotocin链脲佐菌素DMDiabetesMellitus糖尿病PRPPlatelet-RichPlasma富血小板血浆ACDAcidCitrateDextrosesolution柠檬酸葡萄糖溶液VEGFVascularEndothelialGrowthFactor血管内皮生长因子MVDMicrovesseldensity微血管密度PPPplatelet-poorplasma贫血小板血浆HIF-1αHypoxiainduciblefactor-1α缺氧诱导因子-1αAGEsAdvancedglycationendproducts晚期糖基化终末产物APGautologousplatelet-richgel自体富血小板血浆凝胶FDAFoodandDrugAdministration食品药品监督局VII 目录中文摘要............................................................IAbstract........................................................................................................................III第一章前言.........................................................1第二章材料与方法...................................................51.试剂与仪器...................................................51.1主要试剂.................................................51.2主要仪器.................................................51.3实验动物.................................................52.主要试剂配置方法..............................................62.1链脲佐菌素（STZ）的配置..................................62.2柠檬酸葡萄糖溶液（ACD抗凝剂）的配置...................62.3血小板激活剂的制备.......................................62.410%中性福尔马林固定液的配置..............................63.烫伤装置.....................................................6二、实验方法...................................................71.动物模型建立..............................................72.富血小板血浆制备..........................................83.分组、取材和检测指标......................................84.统计学处理.................................................9第三章实验结果....................................................111.1糖尿病大鼠模型的建立........................................111.2糖尿病大鼠合并烫伤模型制作及愈合大体观察....................111.3烫伤创面病理组织学观察......................................121.4微血管密度（MVD）检测.......................................141.5VEGF水平的动态变化.........................................15第四章讨论........................................................171.糖尿病合并烧伤创面愈合.......................................172.PRP在烧伤创面修复中的应用。.................................18 第五章结论........................................................21参考文献...........................................................23综述...............................................................27 第一章前言皮肤是人体最大的器官，覆盖于人体表面，占总体重的14%~17%。由于它具有自我修复和更新的能力，使之成为外界环境和机体的重要屏障，在防御和生存中起着至关重要的作用。创伤就是正常皮肤的解剖结构和功能完整性遭到破坏[1]。皮肤损伤的类型、大小和深度对创面修复在细胞和分子水平有重要意义，小而表浅的皮肤损伤主要通过表皮迁移来修复，不需要依赖于角质细胞增殖延期愈合。深度仅达表皮层的损伤，依靠残存在毛囊中的角质细胞和皮肤附件，就可以促伤口由基底部向上和由边缘向中心愈合。相比之下，全层皮肤损伤，只能由边[2,3]缘愈合，且收缩作用起至关重要的作用。烧伤是日常生活及工作中常见的创伤之一，主要包括热烧伤、化学烧伤、电烧伤和放射性烧伤。不同程度的烧伤对机体的影响存在很大差异，目前普遍采用三度四分法，将烧伤深度分为I度、II度（浅II度与深II度）、III度。一般，成人烧伤面积超过30%，小儿超过10%，均有可能发生烧伤休克，而在临床上治疗此类患者时应及时积极大量补液，预防休克。烧伤创面修复主要取决于创面的深度、感染的程度，在无感染情况下，深II度和III度烧伤创面愈合后遗留的瘢痕及畸形需要长期的锻炼或整形才能恢复其功能，若发生感染甚至脓毒血症，将形成慢性难愈性创面或威胁生命。而创面愈合是一个协调的动态组织修复过程，涉及多种细胞类型、生长因子、[4,5]细胞因子和趋化因子的一系列生化和分子生物学反应。受全身因素（年龄、糖尿病、激素水平等）或局部因素（感染、含氧量、局部血运和部位等）的影响。[6][7]一般包括炎症反应、细胞增殖、创面成熟和重建三个阶段，这些阶段互相联系且存在交集，以炎症反应和细胞增殖两个阶段为主，其中任何一个阶段的延缓或停止都将影响整个愈合进程。急性创面的愈合是这三个阶段的线性发展的结果，当因某种内在或外在因素作用使创面不能正常愈合，则进入一种病理性炎症[8]状态，从而出现慢性、不愈合的创面或过度肉芽组织形成。慢性难愈性创面修复缓慢甚至停止的机制有以下几种主要原因：1）创面存在一定感染或坏死组织存在；2）创面组织缺血缺氧；3）局部生长因子浓度低或缺乏，活性降低或多种生长因子网络调节失控；4）修复细胞结构改变和过度凋亡，细胞膜上受体结构[9,10]异常，导致生长因子与受体之间失耦联。常规的换药和清创手术仅能清除局1 部感染和坏死组织，无法解决如重建创面血液供应、提高生长因子活性和数量、防止细胞凋亡等问题。而对于糖尿病创面、褥疮及血管源性等慢性创面，即使行皮瓣移植手术其治[11]疗效果都不佳。根据报道，近年糖尿病的患病率呈现逐年上升趋势,其是以遗传因素、不良生活方式、经济状况改变和人口老龄化等多种因素相互作用的结果。根据2010年我国进行的糖尿病标准化患病几率调查，糖尿病标准化患病几率达到了11.6%（较2007年增长了1.9%），而糖尿病前期患病率则到了50.1%的比率，说明我国近一半成人成为准糖尿病患者。糖尿病创面难愈机制也存在多种学[12]说：1）AGEs可减少创面组织内血管数量和降低皮肤弹性使表皮基底层胶原发生交联反应，使创面愈合长期处于炎症反应阶段，对细胞外基质胶原的裂解作用[13][14]，抑制中性粒细胞的功能及作用于成纤维细胞减少胶原和纤维结缔组织的生[15]成而延迟创面愈合；2）长期处于慢性炎症反应阶段：体内高糖环境和ROS，使炎性细胞持续大量产生炎性前体因子而维持炎症反应发生，抑制新生血管生成，导致神经纤维结构和功能损伤抑制细胞增殖而延缓创面愈合。3）外周神经功能障碍：高血糖可引发机体周围神经和血管病变，使患者对外界刺激不敏感而[16]极易发生烧伤。烧伤患者因皮肤功能遭到破坏及创面坏死组织的存在，容易引[17]发感染甚至脓毒血症威胁生命。当糖尿病合并烧伤，创面因其局部炎症反应低下、炎性细胞浸润减少以及表皮增殖、细胞外基质沉积及新生血管形成受抑,致使其愈合缓慢，更易发生感染。因此，如何快速促进糖尿病合并烧伤患者创面愈合，是临床医生面临的亟需解决的难题。自体富血小板血浆（APRP）是来源自身的、浓缩的血小板及血浆，是全血经过二次离心而得到的浓缩物，亦称之为血小板凝胶、富生长因子血小板或自体浓缩血小板，其血小板含量为普通全血的3-5倍。它被广泛用于骨修复、整形手[18-20]术和创面愈合。PRP包含多种高浓度的生长因子和细胞因子，比如：血小板源性生长因子、血管内皮生长因子、转化生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞[21]生长因子、胰岛素样生长因子等，均可加速创面愈合和止血。尽管PRP在临床实践中得到了广泛应用，但它在烧伤治疗领域的应用仍然有限。如前所述，烧伤的临床生理过程一般分为三期：体液渗出期，急性感染期及修复期。大面积烧伤后因受伤局部毛细血管扩张、通透性增加导致大量血浆液渗出和经创面蒸发失2 水，造成有效循环血量减少，而出现低血容量休克。而此时机体微循环中血液处于瘀滞状态，血液成分、血细胞生理形态及细胞因子均发生了一定变化，此时采用患者自体血液，无异于“拆东墙补西墙”，无疑会加大患者失血量，这显然不现实在临床上也不被允许，且所获取的PRP质量难以保证。又或患者还患有其他基础疾病，不适宜或禁止采用自体血液。鉴于此，本实验以SD大鼠为实验对象，建立I型糖尿病模型及深II°烫伤模型，通过外用同种异体富血小板血浆，探究其对于糖尿病合并烧伤创面愈合的影响,为临床糖尿病患者合并烧伤治疗提供实验依据和治疗方法。3 4 第二章材料与方法1.试剂与仪器1.1主要试剂链脲佐菌素STZ（干粉）Sigma公司柠檬酸三钠（干粉）上海麦克林生化科技有限公司柠檬酸（干粉）上海麦克林生化科技有限公司牛凝血酶（干粉）Sigma公司10%水合氯醛南华大学第一附属医院药剂科氯化钙（干粉）上海麦克林生化科技有限公司葡萄糖（干粉）上海麦克林生化科技有限公司甲酵溶液北京索莱宝科技有限公司磷酸二氢钠（干粉）上海麦克林生化科技有限公司磷酸氢二钠（干粉）上海麦克林生化科技有限公司肝素注射液深圳赛保尔生物药业有限公生理盐水湖南科伦制药有限公司1.2主要仪器高速低温离心机德国Heraeus公司电热恒温水箱北京博医康实验仪器有限公司冰箱Haier常规手术器械和玻璃用品上海医疗器械有限公司电子天平北京赛多利斯天平有限公司产品罗氏血糖仪Roche,德国自动纯水蒸馏器上海贤德实验仪器有限公司数码相机Canon1.3实验动物健康SD大鼠70只，雄性，1～2月龄，体重150～250g，由湖南斯莱克景达5 实验动物有限公司提供。将大鼠按实验设计要求随机分组后，分笼饲养，所有大鼠均自由进食与饮水。设定饲养环境温度为24℃～26℃，相对湿度为40%～50%，饲养室内定期消毒，按照清洁级实验动物标准饲养。SD大鼠饲养员严格执行清洁级实验动物操作的规程。鼠饲料和垫料由南华大学实验动物学部提供。整个实验过程符合实验动物伦理学标准条例。2.主要试剂配置方法2.1链脲佐菌素（STZ）的配置于100ml双蒸水中加入2.94g柠檬酸钠完全溶解配成柠檬酸钠溶液，即为A液；于100ml双蒸水中加入2.10g柠檬酸溶完全溶解配成柠檬酸溶液，即为B液；将上述两种液体按1：1.32比例混合（即取A液约43ml，B液57ml），配成100ml、0.1mol/L柠檬酸缓冲液（pH4.0-5.0）。临用前在避光条件下和冰台上操作，将称取的STZ粉末溶于预冷的柠檬酸缓冲液中，配制成10mg/ml浓度的STZ溶液。2.2柠檬酸葡萄糖溶液（ACD抗凝剂）的配置于50ml双蒸水中溶入0.48g柠檬酸，配成柠檬酸溶液，即为A液；于50ml双蒸水中溶入1.32g柠檬酸三钠，配成柠檬酸三钠溶液，即为B液；将A液与B液各50ml混合摇匀，再加入1.47g葡萄糖干粉摇匀，即得ACD抗凝剂。2.3血小板激活剂的制备取无水氯化钙10g使之完全溶于100ml蒸馏水中，配成10%Cacl2溶液，再取出1ml与1000U牛凝血酶混合，即得血小板激活剂，制备PRP凝胶时，按10：1比例加入此激活剂。2.410%中性福尔马林固定液的配置先将无水磷酸氢二钠6.5g，磷酸二氢钠一水化合物4.0g，融入盛有900ml蒸馏水的广口瓶中，搅拌直至完全溶解，再取40%的甲醛溶液100ml倒入广口瓶内，混合摇匀，避光密封保存。6 3.烫伤装置以250ml广口烧瓶装满水，置于恒温水浴箱内，水浴箱内水平面以恰好没过烧瓶口为准，将恒温箱内水温加热至80℃。另制作一泡沫模具，模具中心开口大小等同于烧瓶口大小，套于烧瓶口处，致伤时，使麻醉状态下的大鼠裸露的背部皮肤紧贴烧瓶口而其他部位不被烫伤。实验方法1.动物模型建立[22-23]（1）糖尿病模型制作：SD大鼠随机分为糖尿病组（n=30）和正常组（n=15）。造模前适应性喂养1周，于制模前禁食12小时，注射前用血糖仪检测大鼠血糖，测平均值（mmol/L）。实验时按60mg/kg体重单次腹腔快速注射STZ溶液（现配现用，避光低温环境下），正常组腹腔注射等体积柠檬酸盐缓冲液，正常饮水与普食喂养，密切观察。STZ诱导72h后尾静脉采血，利用血糖仪检测随机血糖水平，血糖值≧16.7mmol/L且诱导前基础血糖水平＜8.9mmol/L则判定为建模成功。对第一次未成功建模大鼠，饲养一周后，再次腹腔注射STZ（60mg/kg），监测血糖。建模后第0、1、2、3、4周测量大鼠的血糖并观察其一般情况。STZ诱导8周后，随机摘取糖尿病组及正常组各2只大鼠胰腺组织行组织病理学检查。（2）烫伤模型制作：烫伤前1天，用理发器备皮，去除大鼠背部毛发，裸露背部。糖尿病组大鼠和正常组大鼠称重，按3ml/kg计量腹腔注射10%水合氯醛实施麻醉，待大鼠对疼痛刺激无反应时，使用上述烫伤装置，持续接触12秒，在2[24]其背部造成面积为4×4cm大小的烫伤创面，48h后取创面组织行HE染色证实烫伤深度（见附图），同时予以腹腔注射5ml林格氏液预防休克。（见图1）图1烫伤模型的制作：备皮(左);80℃恒温水浴烫伤(右)7 2.富血小板血浆制备另取25只400-450g大鼠，每次2-3只，称重后，按3ml/kg计量腹腔注射10%水合氯醛实施麻醉成功后，固定，络合碘消毒大鼠腹部后乙醇脱碘，经腹主动脉用预先肝素化的5ml注射器及一次性静脉采血针取得全血约10ml，各取1ml9全血经血细胞分析仪法行血小板计数，约0.52×10/ml，然后剩余9ml全血注入预先加有ACD抗凝剂的15ml离心管中，摇匀后第一次以200×g和4℃条件下离心15分钟，此时可见离心管中全血分为三层，取上清液及交界面层移入另一离心管，摇匀，第二次以500×g和4℃条件下离心10min，弃上层贫血小板血浆[25](PPP)，下层为少量红细胞、血浆和血小板混合物，即获得PRP1ml,血小板计12数约为1.97×10/ml。（见图2）ABC图2PRP的制备：A.第一次离心；B.第二次离心；C.弃PPP后混合物3.分组、取材和检测指标（1）分组：将SD大鼠随机分为3组，A、B两组为糖尿病模型组，C组为正常组，每组12只。3组均建立烫伤模型。A、C两组创面使用PRP涂抹，B组用生理盐水涂抹，均用无菌纱布缝线固定。隔日络合碘消毒、换药（见图3）。（2）标本采集时间：分别伤后7、14、21d时相点随机处死4只大鼠,取全8 层皮肤组织标本，行组织形态学观察、病理组织学观察、微血管密度(MVD)检测、血管内皮生长因子（VEGF）水平测定。（3）创面愈合面积与愈合率：烫伤后7、14、21天用相机拍摄创面，确保每次拍摄角度、与创面垂直距离及相机焦距恒定，同时以标尺为参照。运用ImageJ图像分析软件计算各时相点创面面积，取平均值。创面愈合率=（初始创面面积-治疗后创面面积）/初始创面面积×100%。（4）创面微血管密度计数：以抗CD31单克隆抗体对皮肤组织标本中血管内皮细胞进行标记，图像输入计算机，应用图像分析软件计算阳性染色区域占视野面积的百分比,取平均值。（5）创面组织中VEGF含量免疫组化检测和图像分析：取各时相点创面组织，采用ELISA技术测定组织中VEGF含量，并应用计算机图像分析软件得出各时相点VEGF表达阳性率。AB图3A.换药；B.包扎4.统计学处理各组检测数据用SPSS23.0统计学分析软件，数据结果以均数±标准差（⎯x±S）表示，组间数据对比采用单因素方差分析（one-wayANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。9 10 第三章实验结果1.1糖尿病大鼠模型的建立大鼠在使用STZ前，单笼（5只）垫料可3天一换，所有大鼠的基础血糖水平为（3.90±0.63）mol/L；糖尿病组腹腔注射STZ3d后，单笼垫料完全湿透，需每日一换，且大鼠饮水量及食量较前增加。诱导后1、2、3和4周，血糖水平分别为（24.20.3±2.28）mol/L、（24.72±1.87）mol/L、（24.89±1.78）mol/L和（25.02±1.30）mol/L，糖尿病组与正常组大鼠随机血糖值比较有统计学差异（P＜0.05）。8周后30只大鼠共造模成功27只，总成模率90.00%，并对糖尿病组大鼠造模前后取胰腺组织做HE染色，证实胰岛细胞被破坏（见图4，图5），I型糖尿病大鼠建模诱导成功。（见表1）图4诱导前正常胰腺组织（HE染色）400×图5诱导后胰腺组织（HE染色）400×表1各时相点三组大鼠随机血糖值（mmol/L,⎯x±S）0d7d14d21d28dA3.85±0.4923.60±2.29*24.44±2.07*24.44±1.94*24.60±1.14*B4.10±0.8724.80±2.17*25.00±1.67*25.35±1.53*25.45±1.35*C3.76±0.453.79±0.613.70±0.583.90±0.313.88±0.40注：0d表示STZ诱导前；7d表示STZ诱导后第7天；14d表示STZ诱导后第14天；21d表示STZ诱导后第21天；28d表示STZ诱导后第28天。*P＜0.05，与C组比较。11 1.2创面愈合大体观察大鼠烫伤后24小时，各组大鼠无死亡，创面未见感染征象。烫伤面积与模板面积基本一致，创缘与正常皮肤分界清楚，创面红肿，有韧性。烫伤后7d，C组大鼠创面面积较前明显缩小，A、B组大鼠创面未见明显缩小，B组痂皮完整，呈浅黄色，伴大量渗出，A组创缘红肿消退，渗出减轻，C组大鼠创面出现肉芽生长，创缘部分上皮化。烫伤后14d，愈合面积C＞A＞B，A、C组大鼠创面无明显肿胀及渗出，C组痂皮脱落，新生皮肤组织角化形成，创缘可见细小毛发生长，除中央区创面外大部分基本愈合，A组大鼠创面周围及毛囊边缘创面部分愈合，B组大鼠创面仍有少量渗出，基底部肉芽组织初步形成。烫伤21d后，C组大鼠烫伤创面基本愈合，新生上皮质软，色红润，创周毛发生长正常，A组创面也大部分愈合，但中央存留少量未愈创面，皮肤角化形成好，见细小少量毛发生长，B组创面愈合最差。（见图6、表2）7d14d21dA组B组C组图6不同时相点创面愈合情况大体观察12 1.3各组创面愈合率烫伤后第7天A、B两组大鼠创面愈合率比较无明显差异性，即P＞0.05；但C组大鼠创面愈合明显优于糖尿病大鼠组（A组和B组），与其相比较差异有统计学意义，即P＜0.05；烫伤后第14、21天时，B组相比于其余两组创面愈合率最低，均存在差异性，即P＜0.05；表2烫伤后不同识相点创面愈合率的比较（%，⎯x±S）伤后时间（d）分组n71421●＃＃●A416.7±1.850.8±3.661.3±4.1B●△●△●414.2±2.621.1±2.435.7±7.6△＃＃△＃C439.8±9.862.4±10.184.6±9.4注：△表示与A组比较P＜0.05；＃表示与B组比较P＜0.05；●表示与C组比较P＜0.05.1.4各时相点各组大鼠烫伤创面病理组织学观察高倍镜下可见皮肤组织角质层、乳状层部分缺失，网状层受累，部分皮肤附件坏死，各层细胞排列紊乱，病理组织结果符合皮肤深Ⅱ度烧伤特征。烫伤后7d，各组大鼠烫伤皮肤组织中大量炎症细胞浸润，且炎症细胞散在分布，而C组皮肤烫伤组织中新生毛细血管数量、成纤维细胞含量较其余两组明显增高。A组可见成纤维细胞聚集，但分布紊乱，新生毛细血管散在分布。B组大鼠创面组织中细胞肿胀，成纤维细胞分布较少，炎性细胞多见，新生毛细血管数目稀少。伤后14d，C组创面炎细胞数目减少，可见成纤维细胞聚集，胶原纤维排列有序，毛细血管明显增多。A组炎性细胞减少明显，以成纤维细胞、新生毛细血管、胶原蛋白与第7d相比较增加显著，但胶原纤维排列紊乱。B组创面可见聚集的巨噬细胞、淋巴细胞及中性粒细胞等炎性细胞，成纤维细胞分布散乱，及少量微血管。烫伤后21d，C组大鼠创面基本完成上皮化，炎性细胞消失，胶原纤维排列整齐有序。A组创面仍可见炎性细胞浸润相较之前数量明显减少，新生毛细血管管径基本一致，胶原纤维大量形成且排列方向大致相同，但较C组差。B组仍可见散在炎性细胞浸润，胶原纤维排列紊乱，及少量新生毛细血管。（见图7-15）13 图77天A组创面（HE染色）400×图87天B组创面（HE染色）400×图97天C组创面（HE染色）400×图1014天A组创面（HE染色）400×图1114天B组创面（HE染色）400×图1214天C组创面（HE染色）400×14 图1321天A组创面（HE染色）400×图1421天B组创面（HE染色）400×图1521天C组创面（HE染色）400×注：红色箭头表示新生血管，蓝色箭头表示成纤维细胞，黑色箭头表示炎性细胞，绿色箭头表示鳞状上皮。15 1.5微血管密度（MVD）检测正常大鼠和糖尿病大鼠在烫伤后各时相点CD31均有阳性表达，并随时间推移逐渐升高，均在14天达到顶峰值，且C组大鼠创面阳性细胞最多，A组次之，B组阳性表达最少；C组大鼠创面组织CD31阳性细胞表达率从第7天开始明显高于另外两组，存在明显差异性，即P＜0.05；烫伤7天时，A、B组大鼠CD31阳性表达率差异比较无统计学意义，即P＞0.05，但在14天、21天时两组比较差异具有统计学意义，即P＜0.05。（见图8、表3）图8.烫伤后不同时相点创面MVD结果（×400倍）2表3烫伤后各时相点创面MVD值动态变化（条/mm,⎯x±S）组别n1d7d14d21d●＃●＃●A411.7±2.540.2±7.964.0±5.548.2±5.3●△●△●B410.0±2.531.0±6.640.5±9.632.2±5.0△＃△＃△＃C412.7±2.761.7±4.285.5±4.461.5±8.1注：△表示与A组比较P＜0.05；＃表示与B组比较P＜0.05；●表示与C组比较P＜0.05.16 1.6VEGF水平的动态变化各组大鼠创面组织VEGF表达量在烫伤后呈上升趋势,以第7d至第14d上升趋势最明显。B组大鼠烫伤后创面组织VEGF表达水平一直处于最低水平。与A组比较，C组在烫伤后第7天、14天、21天VEGF表达量明显高于A组（P＜0.05）；A组与B组比较，在烫伤后第14天、第21天VEGF表达量明显高于B组（P＜0.05）；B组在烫伤后第7天、第14天、第21天VEGF表达量与C组比较有明显统计学差异（P＜0.05）。（见图9、表4）图9.烫伤后不同时相点创面VEGF表达结果（×400倍）表4烧伤后各时相点创面VEGF水平动态变化（pg/ml,⎯x±S）组别n1d7d14d21d＃●＃●A414.7±3.822.7±4.542.7±3.858.7±8.0●△●△●B413.2±3.317.0±3.627.7±8.033.2±5.5＃△＃△＃C414.2±4.731.5±7.557.5±6.275.2±5.3注：△表示与A组比较P＜0.05；＃表示与B组比较P＜0.05；●表示与C组比较P＜0.05.17 附图烫伤前大鼠皮肤组织（HE染色）100×烫伤后大鼠皮肤组织（HE染色）100×18 第四章讨论1.VEGF对糖尿病合并烧伤创面愈合的作用机制创面的良好修复得益于正确的创面处理，其直接影响机体内环境的稳定和病情的发展、预后、转归。创面愈合过程涉及一系列生化和分子生物学反应。肉芽组织形成和上皮化过程是创面愈合的基础，而肉芽组织形成依赖于血管化和成纤维细胞增殖。糖尿病患者因周围神经功能的损伤，机体感觉神经末梢敏感度降低，使其被烧伤几率上升，且糖尿病合并烧伤创面因其创面自身特殊性，如渗出增多、感染几率增大及高血糖环境局部细胞因子的抑制，致修复速度减慢，愈合质量亦明显低于普通烧伤创面，甚至出现创面不愈或难愈的特征。本实验通过采用糖尿病合并深二度烫伤的动物模型,初步探究其创面愈合机制。研究证实，在创面愈合过程中毛细血管的生成，需要多种生长因子的协同作用，其中VEGF是主要调控因子。动物实验证明，缺氧诱导因子-1（HIF-1）是转录活化编码VEGF基因的活化因子，可诱导创面血管形成，改善创面缺血。而HIF-1的活性由HIF-1α调控，糖尿病合并烧伤创面因组织缺血缺氧，可使HIF-1α分泌增加，抑制了HIF-1的活性，致使VEGF分泌不足，从而出现创面愈合延迟或[26]不愈。吴起等的研究显示，在烧伤创面愈合过程中VEGF起着重要作用，可促进创面血管再生。但也有研究报道，抑制糖尿病患者VEGF的表达有利于创面愈[27]合。可见，糖尿病烫伤后出现创面愈合延迟或不愈,其机制众说纷纭，而比较统一的意见即创面不能生成新的血管和（或）微血管生成速度减慢可能是其重要原因之一。本实验采用CD31对创面愈合过程中的新生血管进行荧光标记，而这与CD31的特性有着密切关系。CD31是血管内皮特异性标记物，可标记出单个血[28]管内皮细胞及新生不成熟的微小血管。本实验通过建立糖尿病合并深II度烫伤模型，采用CD31对愈合过程中的新生血管进行标记及HE染色病理学结果，可以证实PRP可以促进创面成纤维细胞和血管内皮细胞的增值，加速肉芽组织血管化，增加创面微血管密度，且可能存在浓度依赖作用。在本实验中，至烫伤后14天，创面组织中MVD值呈现下降趋势，而VEGF表达水平仍处于上升状态，说明创面组织中微血管生成受到抑制。那么这种高分泌19 [29]低效应局面产生的原因是什么呢?乔亮等研究证实，组织中其他细胞如淋巴细胞和成纤维细胞也有合成分泌VEGF的能力，即使在内皮细胞功能受损的情况下，通过这些细胞的代偿作用也能保持局部组织VEGF的水平不低于正常或高于正常。Anne，Saaristo等人研究证实在糖尿病创面愈合过程中，当VEGF通路被特[30][31]异性抑制剂阻断，创面愈合明显延迟。而根据DinhT等的研究表明，对糖[32]尿病足患者外用VEGF可提高疗效。及燕辛的研究说明VEGF促血管化的作用存在剂量依赖性,只有创面局部VEGF聚集到一定浓度才能发挥其效应，这也与本实验结论一致。糖尿病患者持续高血糖引起葡萄糖分子与体内多种蛋白质非酶糖基化而形成的晚期糖基化终末产物(Advancedglycationendproducts，AGEs)，有研究表明,某些参与创面修复的功能蛋白质分子,如VEGF被糖基化后会丧失其活性,从而使其不能发挥促血管化功能。综上所述，可能与生长因子本身活性、浓度及其作用通路等有关，有待进一步研究证实。值得注意的是，创面血管生成过程及机制十分复杂，VEGF是关键因子之一，而其他生长因子的协同作用是否发挥一定作用仍需进一步研究。另外近年相关研究表明，VEGF的过度表达可能与肿瘤生长有关，所以应用于临床相关疾病时，如何避免其过度表达等问题仍需进一步深入研究探讨。2.PRP在烧伤创面修复中的应用。富血小板血浆（PRP）是浓缩的血小板血浆，是全血经过二次低速离心分离而得到的血小板和血浆浓缩物，其血小板含量为普通全血的3-5倍。众所周知，血小板含有大量的GFs，如：血小板源性生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、成纤维细胞生长因子等。在血小板激活后，这些生长因[33]子相互协同作用使得富血小板血浆的功能得以发挥。而有研究表明，这些生长因子与其受体结合作用于细胞膜外表面，受体再激活细胞内第二信号，从而诱导细胞内基因表达。因生长因子未进入细胞，从而保证了PRP在临床应用的安全性。目前其已被广泛用于骨外科、口腔颌面科、整形美容和创面愈合等多个领域。但在治疗烧伤创面修复领域的研究较少。烧伤是日常生活及工作中常见的创伤之一，主要包括热烧伤、化学烧伤、电烧伤和放射性烧伤。烧伤创面愈合需要多种生长因子参与，这些生长因子在组织修复与再生过程中主要有3种作用，即趋化作用、合成分泌作用和增殖分化作用。20 PRP不仅含有高浓度的血小板，而且各生长因子比例与机体正常比例相符，能更好的发挥协同作用，PRP在添加激活剂后可形成凝胶，方便应用于烧伤创面且可使生长因子达到缓慢释放的目的，延长作用时间，更主要的是对于大面积烧伤患者，应用PRP尽快促进其创面愈合，不仅可改善患者生存质量，缩短病程而降低治疗费用，还因其制作简单、来源广泛，可降低医疗成本，明显缓解患者的经济负担。研究报道证明，在修复烧伤创面应用PRP治疗过程中未发现局部及全身不良反应。在近年临床研究中，证实自体富血小板血浆凝胶(autologousplatelet-richgel，[33-36]APG)治疗严重烧伤患者，能够明显促进组织修复和再生、加速创面愈合。APG还应用于特殊部位烧伤、特殊烧伤及不同年龄层人群烧伤的创面修复。陈富[37]禄等研究表明，APG可加速儿童面部Ⅱ度烧伤创面愈合，同时能明显改善瘢痕[38]形成。吴宏志等研究得出结论，APG可改善电烧伤患者创面的微循环，缩小创[39]面瘢痕、加快创面的愈合速度。彭小维等研究APG对角膜碱烧伤组织修复的影响，证实其对角膜碱烧伤组织具有明显的修复作用。然而，对于本身患有贫血、凝血功能异常、血液病、感染等基础疾病时，采用自体血液被禁止。针对糖尿病合并烧伤患者，其血液处于高凝及浓缩状态，且感染风险高于普通患者，及可能合并各脏器损伤或功能不全，不适宜采用自体血制备PRP。所以，对同种异体富[40]血小板血浆的研究很有临床意义。根据吕敏对兔桡骨缺损修复的研究，比较自体与同种异体富血小板血浆在体外对骨髓间充质干细胞的增殖与分化的影响和[41]其在体内对骨缺损修复两者差异，得出同种异体PRP可取代自体PRP。刘宸等人也证实同种异体富血小板血浆可以有效促进糖尿病大鼠创面胶原的合成。与本实验通过建立糖尿病合并深II度烫伤大鼠模型，外用PRP观察其创面愈合时间明显缩短，检测VEGF表达水平及创面微血管密度均显著升高，所得结论基本一致。证实外用同种异体富血小板血浆主要是通过加速创面肉芽组织形成，及创面血管化，改善微环境等作用促进糖尿病合并深II度烧伤创面愈合。21 22 第五章结论(1)一次性腹腔快速注射STZ可成功制备I型糖尿病大鼠模型。(2)与正常大鼠相比，糖尿病大鼠烧伤创面存在血管化障碍。(3)同种异体富血小板血浆可促进糖尿病大鼠烧伤创面愈合，其机制可能是通过提高创面肉芽组织中VEGF水平，增加创面微血管数量，促进肉芽组织增殖，最终加快创面愈合。23 24 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综述富血小板血浆和生长因子治疗糖尿病足溃疡的发展现状和前景关键词：PRP；生长因子；糖尿病足糖尿病是世界上一种常见和分布广泛的疾病。根据国际糖尿病联合会的数据，4.15亿成年人（每11人中就有1人）患有糖尿病。大约15%的患者会伴有足部溃疡或创面难愈合，其中约5%的糖尿病足溃疡（DiabeticFootUlcers,DFU）最终发展为糖尿病足坏疽，导致患者不得已截肢，甚至死亡。超过88%的下肢截[1]肢是由糖尿病足溃疡引起的，因为溃疡极易受感染，所以常并发坏死、坏疽和骨髓炎。这些创面大多是慢性难愈性创面，由不同的因素引起，这些因素又加速糖尿病足溃疡形成。比如因周围神经病变阻碍痛觉传导、影响肌肉运动而有可能形成胼胝体。如果没有提供适当的治疗，又或患者对治疗失去信心，听之任之，就会形成溃疡并很容易恶化。糖尿病血管病变会引起周围小血管疾病，也会引起大血管病变。对于血管性溃疡通常需要血管再造手术、血栓溶解和血管旁路重建[2]术。相比之下，神经性溃疡可以保守治疗。微循环的结构和功能的变化导致局部缺血和细胞代谢变化，破坏正常的创面愈合机制。溃疡其他常见的原因如：足部畸形、高足底压力、外周水肿、外伤，后者是引起DFU主要因素。因此，在早期诊断这种疾病是很重要的，并应采取有效的措施以避免产生更严重的后果。目前DFU的治疗标准首先是对血管疾病，皮肤、软组织或骨骼感染[3]以及神经疾病的评估。DFU治疗的常规方法包括清创和截肢。清创术的目的是在去除所有失活的组织，包括老茧，坏死，和感染的组织，只留下健康的、有用的组织，将慢性创面转化为急性创面。在一实验中，急性创面组织被置于DFU的[4]渗出液中，明显观察到急性创面愈合被抑制的效果。因此，去除坏死组织对防止新生组织被破坏是至关重要的，适当的创面处理、合适的敷料覆盖以及闭合方法在加速愈合中有重要作用。然而，一系列证据也表明，这种方法对溃疡愈合的有效作用微乎其微，截肢通常仍是必要的。现有的技术水平还未被完全利用，因此现代技术应该被广泛地应用到医疗行业，以克服在创面修复方面的局限性。比如使用现代的伤口敷料和生物工程的皮29 肤替代品、负压疗法、局部疗法、高压氧疗法、生长因子、电物理疗法和另类疗法。同时也缺乏明确的证据来证明这些治疗方法是否有效。[5]据报道，慢性模式的一个强有力的起源是金属蛋白酶活动的增加，导致细胞外基质的变化。也有证据表明，新陈代谢的变化会影响糖尿病患者的生长因子[6-9]的产生，而这种不平衡在创面延迟愈合中扮演着重要的角色。生长因子（Growthfactors,GFs）是具有生物活性的多肽分子，它们以外用或自体分泌的方式发挥作用，调节趋化性、细胞迁移、分裂、细胞增殖、细胞外基质形成和细胞间的相互作用。研究表明，GFs在伤口愈合过程中起着重要的作用[10]。GFs的消耗被认为是慢性模式（如DFU）的主要原因。因此，GFs被认为是DF的治疗前景。通过对动物模型和临床试验的研究，阐明了GFs在创面修复的[11]有效性。众所周知，血小板含有大量的GFs，在血小板激活后释放，并通过GFs的局[12]部作用启动创面愈合。因此，富血小板血浆（Platelet-RichPlasma,PRP）在临床应用中作为辅助治疗应运而生。自体富血小板血浆（autologousplatelet-richplasma,APRP）是取自自身的浓缩血小板血浆，是全血经过二次低速离心和激活剂活化而得到的血小板和血浆浓缩物，其血小板含量为普通全血的3-5倍。它被[13-15]广泛用于骨修复、整形手术和创面愈合。PRP包含多种高浓度的生长因子和细胞因子，比如：血小板源性生长因子、血管内皮生长因子、白介素-8等，均可加速创面愈合和止血。最主要的是，PRP中存在的多种GFs被认为比使用单一[11]GF更能提高创面愈合的治疗效果。然而，以上提及的治疗方案其效果仍备受争议，需要进行更详细的研究。本文主要介绍了在DFU治疗中，PRP、单一GF以及生长因子组合物疗法。我们建议使用生长因子组合物作为可能的解决方案，以提高PRP和单一GF的优势。1.生长因子与创面愈合创面愈合是一个协调的动态组织修复过程，涉及多种细胞类型、生长因子、细胞因子和趋化因子的一系列生化和分子生物学反应。受全身因素（年龄、糖尿病、激素水平等）或局部因素（感染、含氧量、局部血运和部位等）的影响。创面愈合过程大致可以分为三个阶段:炎症反应、细胞增殖、创面成熟和重建三个阶段。首先，创面形成了血凝块和纤维基质;血小板由细胞基质的胶原蛋白和血30 [16]小板中的神秘介质和细胞因子激活。其次，中性粒细胞和单核细胞在创面部位聚集。炎症细胞会产生GFs和其他能刺激细胞分裂和迁移的信号分子。巨噬细胞，[17]分泌GFs于创面上通过控制纤维母细胞使胶原蛋白沉积。纤维母细胞和组织中的其他细胞产生新的GFs，上皮细胞开始迁移，新的血管从原血管中生长(血管生成)。之后纤维母细胞、角化细胞和新血管会转移到创面部位产生肉芽组织。最后，创面表面进行再上皮化和基质重建，形成了早期疤痕组织。上皮细胞从创[17]缘开始，通过有丝分裂和细胞迁移形成新生上皮细胞覆盖创面。然而，对于糖尿病患者来说，存在一些创面愈合的缺陷。它们包括：GFs生成途径的减少或机制受损，血管生成反应的损伤，巨噬细胞功能的改变，胶原蛋[18]白的积累，以及通过金属蛋白酶加速细胞外基质的重建。这些因素最终导致纤维母细胞和角化细胞的迁移减少，从而导致愈合不良。伤口愈合过程中的所有阶段都有GFs的参与，这些GFs是由血小板和促炎细胞在愈合的第一个阶段分泌的。这些GFs改变了纤维细胞、角化细胞和上皮细胞的活性及形态，导致细胞外基质的改变和进一步促进组织细胞中生长因子的生[19]成。这两种因素都导致了创面中一直存在GFs。同时需要注意的是，GFs影响的机制是非常复杂的，涉及到各种各样的信号路径。在糖尿病患者中，GFs的不同类型和浓度平衡被破坏，导致治疗的异常。1.1血小板源性生长因子(PDGF)血小板源生长因子(PDGF)由血小板、巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞和角质细胞生成。在机体中，PDGF被发现存在于是外科手术产生的急性创面，但是在慢性难愈性的创面上，它基本不表达。由于蛋白酶活性的增加，它的浓度急剧下降。血小板是PDGF最早和最大的来源，它能吸引单核细胞聚集到创面并转化为巨噬细胞同时分泌PDGF。它还能促进纤维蛋白和透明质酸的产生，而它们是细胞外基质的主要成分。在促进纤维母细胞增殖的同时也会增加胶原蛋白的[20]生成。PDGF是成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的一种化学诱导剂和有丝分裂原，并与转化生长因子-β(TGF-β)和表皮生长因子(EGF)存在协同作用。在创面愈合的上皮化阶段，PDGF调节类胰岛素生长因子I(IGF-I)和血小板反应蛋[20]白-1的产生。PDGF能吸引炎性细胞，如中性粒细胞、单核细胞和成纤维细胞，促进肉芽组织的生长。虽然PDGF不直接影响角化细胞，但会加快创面上皮化的31 [17]速率。它可以被解释为:从巨噬细胞和成纤维细胞分泌的GFs被吸引到创面部位。同时也有报道说糖尿病患者血浆中原本PDGF和EGF的浓度就很高。1.2转化生长因子(TGF)TGF是可以影响不同类型的细胞并能可逆地刺激或抑制它们的生长和转换的一类GFs。[17]转化生长因子-ɑ（TGF-ɑ）是由创面处的巨噬细胞和角化细胞产生的。TGF-ɑ和EGF是角化细胞和成纤维细胞的促细胞分裂剂，但TGF-ɑ也刺激血管生成。TGF-β是一组蛋白质，可以可逆地抑制来自外胚层原始细胞的生长。该组蛋白由血小板、巨噬细胞、成纤维细胞、角质细胞和淋巴细胞构成。这些GFs在创面愈合的早期阶段被释放，它们的不足会增加创面愈合的时间。TGF-β1作为中性粒细胞、巨噬细胞和成纤维细胞的一种化学诱导剂，广泛的参与创面愈合过程。它能刺激胶原蛋白合成，加速肉芽组织形成和促进表皮组织再生。TGF-β1可以影响多种细胞的生长或分化。TGF-β1可刺激炎症细胞产生趋化因子，并触发细胞产生细胞外基质。TGF-β1是一种多效性的GF，它是剂量依赖性。例如，它能[19]在低浓度的情况下加强纤维细胞增殖，但在高浓度下使其诱导分化。1.3表皮生长因子（EGF）EGF被发现存在于包括肾脏、唾液腺和皮肤等不同的组织中。EGF与TGF-ɑ共享一个受体，通过刺激成纤维细胞、角化细胞、血管内皮、平滑肌和上皮细胞而加速创面愈合。EGF增加了创面中产生胶原蛋白的成纤维细胞的数量，并提升了创面的强度。此外，经动物实验证明，该GF可增加角化细胞的活性，促进表皮和角膜上皮再生。EGF刺激创面中上皮细胞生长，在早期的机体创面修复中增[21]。强上皮细胞的上皮化。据报道，可增强慢性创面愈合（如糖尿病足）1.4成纤维细胞生长因子(FGF)FGF包括几个GFs。在创面愈合过程中，FGF2，FGF7(也被称为角化细胞生长因子-KGF)和FGF10(或称为KGF2)相互作用。FGFs是由角质细胞、成纤维细胞、[20]内皮细胞、平滑肌细胞和软骨细胞合成的。FGF是一种作用于中胚层和外胚层细胞的生长因子。FGFs作用于成纤维细胞、血管内皮细胞及血管平滑肌细胞，能加速新生毛细血管形成，增加肉芽组织内毛细血管数量和创面血流量，从而改32 [17]善创面微循环，为组织修复提供氧和丰富的营养物质。FGF2或碱性成纤维生长因子（bFGF）在急性创面中增加，在肉芽组织形成、表皮上皮化和组织重建中起着重要作用。它促进了角化细胞和成纤维细胞的增殖、分化和迁移。FGF2也通过成纤维细胞增加胶原蛋白的生成。FGF2参与了肉芽组织的形成，通过刺激肉芽组织中毛细血管内皮细胞的渗透和增殖作用，从而缩短了血管内皮细胞形成[19][22]周期并增加了创面的强度。FGF2的水平在慢性创面中降低，因此愈合延迟。角化细胞生长因子(KGF)是FGF家族的成员，仅由成纤维细胞分泌，并影响角化[19][20]细胞的增殖和迁移，促进创面再上皮化。KGF还可促进VEGF的合成。1.5胰岛素样生长因子（IGF）IGFs家族由两种低分子多肽(IGF1、IGF2)、两类特异性受体及六种结合蛋白组成，它们与胰岛素结构的同源性。在受损的皮肤中，IGF1是由上皮细胞产生的。IGF1诱导内皮细胞的趋化性，刺激角化细胞的增殖和伤口的再上皮化。[17]IGF1也激活了作为细胞外基质主要化合物的葡糖氨基葡聚糖的合成。IFG1和IGF2都能增强成纤维细胞的胶原蛋白合成。IGF2在胚胎发育期尤为重要。在成熟的皮肤中，IGF2在表皮中表达。然而，在糖尿病患者的皮肤上，IGF1表达受损，这种损耗可能导致创面延迟愈合。1.6血管内皮生长因子（VEGF）VEGF与PDGF相似，是一种强有力的血管生成因子。虽然VEGF的合成是由PDGF、FGF2和TGF-β所调控的，但它却是在缺氧条件下由角化细胞和上皮细胞[23]释放。VEGF与FGF2、胎盘生长因子（PLGF）存在协同作用，因此这些因子的[23]组合是血管生成的有力刺激剂。VEGF会增加血管的通透性和血管的形成。它仅激活单核细胞，而不影响成纤维细胞或血管平滑肌细胞。实验证明，将VEGF应用于兔子局部缺血性创面，可促进肉芽组织形成，但对上皮细胞的形成没有影响。在糖尿病患者中，因为微循环的破坏导致组织缺氧，从而增加VEGF的生成，致使糖尿病患者血浆中VEGF的浓度升高。据报道，在糖尿病患者中，创面中VEGF[24]的减少是溃疡形成的主要原因。2.富血小板血浆（PRP）血小板在激活和脱粒后分泌大量的GFs。这些GFs可以启动伤口愈合过程，33 因此在慢性创面中，外用血小板提取物中的GFs有效弥补了慢性创面中GFs分泌不足的空缺。在近25年里，血小板衍化的伤口愈合配方(platelet-derivedwoundhealingformula,PDWHF)和PRP已被广泛使用。这些自体制剂，是由患者自身的全血经离心分离后而得到的富含生长因子的颗粒，这些颗粒要么被裂解，要么被激活。PRP制备过程需经特殊仪器处理使其浓缩。而这个过程的价格也有很大不[25,26][21]同。PRP的定义是每微升该制剂中血小板浓度不少于100万。美国食品及药物管理局已经对PRP制备的几种方案进行了评价，市面上也有各种各样的商业设备。然而，目前为止没有统一的研究证明不同的PRP制备方法对其各类型生长因子浓度有何影响。但有研究表明，不同的制备方法，所得制剂中PDGF和TGF的浓度存在差异[27]。相关研究也证明，有些制备方法无效，并不是所有设备能被人们认可并用于[12]保存活化的血小板。因为得到的PRP在早期血小板活化得不到有效控制，导致[16]贫血小板血浆(PPP)，或低血小板浓度。在这种情况下，我们应该注意到PPP和PRP的联合使用可能会有积极的效果，因为PPP包含了创面在缺血条件下愈合[27]所需要的营养物质。此外，法律制约了PRP在医疗系统的广泛使用。因此，在循证医学的基础上更深入的临床试验应该被科学管理。PRP是一个输送系统，它将GFs(PDGF、TGF、VEGF、EGF、IGF1)、纤链蛋白和其他分子运送到创面部位。PRP可释放多种高浓度活性物质，并通过刺激修复[28]细胞的迁移和增殖，而促进急性和慢性创面的愈合。而PRP对细胞的刺激作用[21][29]究竟是由血小板的化合物还是其中高浓度的GFs引起，仍然存在争议。PRP中血小板激活后释放出多种高浓度的生长因子协同作用，对不同的细胞类型（如[12]纤维母细胞，角化细胞和上皮细胞）有促有丝分裂和趋化性的特性，促进了局部修复细胞的增殖分化及细胞外基质的合成，从而增强了组织再生和修复能力，促进创面闭合，改善了血管再生和再上皮化。据报道，PRP能抑制细胞因子释放[30]和炎症反应，可能是与巨噬细胞相互作用从而促进组织愈合和再生。[26]截至2017年，没有大规模的统计学资料和相关研究证明,现有的证实PRP有积极影响的试验组与对照组或用标准技术治疗的患者组相比，可以被认为使用[31,32]方法存在问题以致其用于DFU时愈合效果欠佳。然而，与其他治疗方法结合[31]使时PRP治疗DFU效果显著。34 3.生长因子的应用3.1单一生长因子的应用正如之前提到的，根据DFU愈合过程和GFs在其中所起的激活和调节作用证[31]实，局部外用GFs被认为是治疗DFU的可靠方法以补充创面缺乏的GFs。一些研究人员强调，GFs的效力可因创面中蛋白酶活性的增加或创面愈合过程中信号[4]传导通路的阻断而降低。为了延长GFs在创面中的效力，最新文章介绍了几个[17,33,34]用于保护GFs的基质，如生物工程的皮肤替代品和脂质体。Bennett等人研究了糖尿病小白鼠全层皮肤损伤愈合机制，并将伤口愈合率低归咎于生长因子的单一。而联合使用EGF、TGF、FGF以及PDGF和IGF-1则使创面上皮化率增加了20-30%。另外，通过基质长时间暴露于GFs显着增加了治疗的有效性。然而，现有的数据显示这种DFU治疗方法(即单一生长因子疗法)的疗效具有争议性。目前已被美国食品药品监督管理局（FoodandDrugAdministration，FDA）批准用于神经病变DFU的一种GF产品是REGRANEX凝胶（Smith＆Nephew公司）中的重组PDGF。只有当它被用作辅助治疗时，才能减少创面愈合时间并[17,33,34]提升创面愈合率。而从3个月的治疗效果来看，其影响微乎其微。Meta分析也表明在短时间内PDFA有积极的疗效，但目前没有数据支持其存在较好的[26]长期疗效，因此值得进一步研究。[35]在糖尿病溃疡中测试使用TGF-β，并与胶原蛋白海绵相比显示出更好的疗效，然而，用标准治疗方案的患者溃疡愈合好于单用TGF-β治疗的患者。EGF[19]的疗效通过以猪和大鼠为实验模型的研究得以验证。并且EGF也已经在各种活[17]体和临床研究中进行了测试。结果显示，观察到了积极疗效但缺乏大数据。对[31]有效临床试验的回顾揭示了几项使用重组人EGF的试验，其与安慰剂相比具有显著疗效。GameF.等人在一系列临床试验中报道了EGF坚持使用12到16周时[26]DFU愈合得以改善。[26,31]在几项研究中，FGF2在使用12周内对创面愈合没有发挥任何作用。然而，有实验证实因FGF2的使用使溃疡面积显著减少(达75%)，但却因实验方法[36]上的缺陷致使其结果可信度不足。重组人FGF10（repifermin）已被用于临床试验并推理出有争议的结果：一组报告显示其与应用安慰剂相比创面闭合时间缩短35 [37]约75%，但在另一份报告中显示局部外用repifermin20周后创面闭合时间两者[38]没有显着差异。已经用重组人VEGF（商品名：Telbermin，Genentech公司）在神经性DFU患者中进行了两个阶段的临床试验（阶段I和阶段II），它显示其对缩短愈合时间有积极效果。另一组研究人员联合胶原结合基和VEGF，该结合体被命名为CBD-VEGF，作用于胶原蛋白基质，在创面愈合，细胞化和血管生成方面效果明显[39]。3.2生长因子组合物的应用所有的数据表明，无论是PRP还是单一的GF都不能被认为是DFU可靠和充分的治疗方法。PRP需要实验室设备和医务人员制备，它是有创的，而且PRP治疗的效果缺乏科学依据，需要进一步研究。单一类型的GFs只影响特定类型的细胞，并且不能改变因愈合过程中组织的病理生理学不同而在DFU中出现的不平衡。目前临床使用单一的GFs治疗DFU的证据还不足。因此，应不断在临床实践中对新技术和方法进行研讨。根据创面愈合的生理机制和DFU的情况，对各类型GFs浓度和混合相对比例的标准化应该有突破性的结果。然而，这一目标无法用单一一种GF应用到一处创面而得以实现。我们建议使用生长因子组合物来创造和保持“治疗平衡”，从而为DFU的细胞提供足够的GFs，并避免炎症细胞因子和蛋白酶的抑制作用。该组合物中不同GFs的最佳配比仍有待研究，可能与正常生理条件下的组织中发现的不同。这种方法有以下几个优点：1）优化和平衡愈合过程。因为创面愈合是一个复杂的过程,包括几个阶段,每一个阶段都由不同的GFs发挥促进或抑制作用，所以在创面闭合的每个阶段需要不同的GFs,而生长因子组合物可精确优化愈合过程并作用于相关细胞(例如:成纤维细胞,角质细胞、巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞等)。在创面愈合过程中，由于创面环境和金属蛋白酶的活性随着时间的变化而发生变化，不同浓度的各类GFs应该被输送到创面部位发挥作用。为了提高该混合物的稳定性，及其释放的稳定性和可控性，GFs可以与“储存和输送载体”以物理/化学方式缀合形成聚合物基质/凝胶或脂质体。36 2）旁分泌正常化的监管。混合物中的GFs可以影响各种信号通路诱导细胞增殖和GFs合成3）重组蛋白生物合成的现代技术可以不利用动物和人体成分而得到GFs，以高效安全的方法，避免了受到病原体污染(尤其是病毒)的可能。此外，人工混合物可以根据患者缺乏某些特定细胞因子而进行相对应的制备。4.结论现有的DFU治疗方法和技术作用有限。目前正在实施的新方法包括使用单一GF和PRP---其中一些已经显示出了显著的治疗效果，而且也有一些相应的产品上市。生长因子组合物使用结合了PRP和单一GF的优点，可以作为治疗DFU的另一种方法。未来研究的主要问题是缺乏合适的动物模型，以研究DFU发病机制和该组合物有无物种特异性。在如今的情况下，有关利用重组蛋白技术制备生长因子组合物进一步详细的临床试验是有前景也是必要的。37 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42 致谢感谢我敬爱的导师：郑军副教授，三年前是您给了我一个机会，让我有机会能与优秀的人为伍，与勤奋的人为伍，与阳光的人为伍。您温文尔雅的气质，风趣轻松的谈吐，亲切近人的性格，严谨的治学态度，敬业的奉献精神是我所学习和效仿的，“做人做事”的训导我将铭记在心，感谢您的悉心教导，向您致以最衷心的感谢！感谢尊敬的李利平教授，您渊博的知识，儒雅的风度，以及对我们年轻一辈的关爱，让学生知道学无止境，时刻需要学习。您是学生永远学习的榜样，向您致以崇高的敬意！感谢烧伤科尊敬的周昌宁老师、王晖老师、张建军老师、徐文圣老师、万江老师、严磊老师和温瑞玲护士长及全体医护人员对我临床学习给予指导、帮助和支持！感谢南华大学病理生理教研室韦星主任在实验技术和论文写作方面提供的指导和帮助！感谢阳柏成、于翠云、邓燎原、王菲菲、毛琳琳和黄胜等同学在实验过程中给予的大力支持！感谢家人在我求学路上给予的理解、支持和付出！43