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学校代码１０４５９学号或申请号２０１４２２１６２０２４密级专业硕士学位论文？微生物制剂对西瓜枯萎病的防治研究作者姓名：杨洁导师姓名：陈继峰副教授专业学位名称：生物工程培养院系？生命科学学院．完成时间：２０１７年５月 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，独立进行研宄，是本人在导师的指导下所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研宂作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：曰期？冲曰，年／月学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品。，知识产权归属郑州大学根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门，允许论文被查阅和借阅或机构送交论文的复印件和电子版；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文一。或与该学位论文直接相关的学未论文或成果时，第署名单位仍然为郑州大学保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者导师：＜Ｉ曰期：：年４月￣曰曰期年月Ａ曰 AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterStudyontheMicrobialAgentsofWatermelonFusariumWiltByYangJieSupervisor:Prof.ChenJifengMajor:BiologicalEngineeringSchoolofLifeScienceMay,2017 摘要西瓜枯萎病是西瓜的主要病害之一，是一种毁灭性的维管束土传病害。其致病菌尖孢镰刀菌有很强的定殖力，可以在土壤中越冬并存活数年之久，并且防治难度大，众多方法中人们越来越青睐于生物防治。利用生防菌剂是进行生物防治的主要方法，生防菌剂在环境兼容性和安全性上具有传统防治方法如化学防治、农业防治等无法比拟的优点。利用生防菌剂防治西瓜枯萎病的关键是找到对西瓜枯萎病致病菌有强抑制作用的生防菌，本实验室具有长期生防菌研究利用的经验，在此基础上对西瓜枯萎病的生防菌进行了筛选并进行固态发酵制成微生物制剂，并采用盆钵试验和田间实验，分别在根际施用微生物制剂对西瓜枯萎病的防治效果、对西瓜植株生长的促生作用以及对西瓜产量、品质的影响进行了研究，获得了如下主要结果：（1）将实验室已保藏的功能菌与分离得到西瓜枯萎病病原菌在实验室通过平板对峙法进行了拮抗微生物筛选，并筛选出了几株拮抗性较强的菌株。其中菌株Y1、D-10、M-43、M-16对西瓜枯萎病菌的抑制率较好，其抑制率分别为79.1%、75.0%、70.8%、68.8%。（2）通过盆钵试验在苗期施用不同处理、不同浓度的微生物制剂观察对西瓜生长的影响。其中处理T1、T2、T3、T5、T6及T7对西瓜的出苗率及各生长指标影响不同，随着菌剂施加浓度的减小而呈现增大的趋势；而处理T4则是随着施加浓度的增大而呈现明显的促生效果。综合各项指标，得出了7个处理的最适施加浓度分别为0.5%、0.5%、1%、3%、1%、0.5%和0.5%。（3）处理T1、T2、T3、T4、T5、T6及T7对西瓜枯萎病有着不同程度的防治效果，其中处理T3的防效最好，防治率达到68.2%，其次为T6、T7，其防治率分别是61.04%和56.36%。在生长、光合速率及根系活力等方面，不同处理的结果不同。其中T3长势最好，鲜重增加达到63.9%，株高增加66.7%，根长增加81.9%；T3光合速率最大，其值为15.97µmol•m-2•s-1，T6、T4和T7对西瓜光合作用的影响也较为显著。处理T6、T3、T4和T7根系活力较好，其中T6达到最大值，其次是T3。1 （4）从田间实验结果看，T4防治效果最好，无发病植株，其次为T7，防治率达到75%，T6和T3的防治效果也较为显著；T4的西瓜产量最高，比对照提高了14.7%，其次为T3，其产量提高了10.5%；T3、T7、T4和T6各处理西瓜果实可溶性固形物都有不同程度增加，分别比对照提高16.9%、12.5%、9.7%和9.3%。且施加微生物制剂可改变西瓜根际土壤中微生物含量，可一定程度改善植株根际土壤微生物环境。（5）综合其防治效果以及对西瓜植株生长的影响，筛选出了2个较好的处理，分别是T3和T4。关键词：西瓜；枯萎病；生物防治；微生物制剂；防效2 AbstractWatermelonFusariumwiltisoneofthemaindiseasesofwatermelon,anditisakindofdestructivesoilbornedisease.ThepathogenicfungusFusariumoxysporumhasverystrongcolonizationability,andcansurvivethroughthewinterinthesoilforseveralyears,soitisdifficulttocontrol.Ofvariedmethods,peoplepreferthebiologicalcontrol.Theuseofmicrobialagentsisthemainmethodofbiologicalcontrol.Microbialagentshasunmatchedadvantagesinenvironmentalcompatibilityandsafetyovertraditionalcontrolmethodssuchaschemicalcontrol,agriculturalcontrolandsoon.ThekeytothepreventionandcontrolofwatermelonfusariumwiltbyusingmicrobialagentsistofindthebiocontrolagainstthepathogenofFusariumoxysporum.Thelaboratoryhaslong-termexperienceintheresearchandutilizationofbiocontrol,andonthisbasis,watermelonwiltbiocontrolbacteriawerescreenedandpreparedintosolidfermentationmicrobialagents.Throughthemethodofpotexperiment,fieldexperimentandlaboratoryanalysis,theeffectsofthesemicrobialagentsonthecontrolofwatermelonfusariumwilt,thepromotertowatermelongrowth,watermelonproductionandtheimpactofwatermelonqualityarestudied.Themainresultsareasfollows:(1)SeveralstrainsofhighlyantagonisticwerescreenedfromthepreservationoffunctionalbacteriaandtheseparationofWatermelonFusariumWiltPathogenbyplateconfinementmethod.TheinhibitoryratesofY1,D-10,M-43,M-16onWatermelonFusariumWiltPathogenwere79.1%,75%,70.8%and68.8%respectively,andtheinhibitoryeffectwasobvious.(2)Effectsofdifferenttreatmentsanddifferentconcentrationsofmicrobialagentsonthegrowthofwatermelonwerestudied.ThegerminationrateandgrowthindexofwatermelontreatedbyT1、T2、T3、T5、T6andT7increasedwiththedecreaseofconcentrationofmicrobialagentsapplied,whiletheT4showedasignificantgrowthpromotingeffectwiththeincreaseofappliedconcentration.The3 resultsshowedthattheoptimumconcentrationofeachtreatmentwas0.5%,0.5%,1%,3%,1%,0.5%and0.5%,respectively.(3)TheresultsshowedthatT1,T2,T3,T4,T5,T6andT7haddifferentcontroleffectsonWatermelonFusariumwilt,andT3hadthebestcontroleffect,thecontrolratewasupto68.2%,followedbyT6andT7,andthecontrolratewasabout61.04%and56.36%respectively.Differenttreatmentsweredifferentingrowth,photosynthesisandrootactivity.T3hadthebestgrowthwith63.9%increaseinfreshweight,66.7%increaseinplantheight,and81.9%increaseinrootlength;theeffectofT3、T4、T6andT7onphotosynthesisofwatermelonwasobvious,T3whichphotosyntheticratereachedthemaximum,is15.97µmol•m-2•s-1,andT6,T4andT7hassignificantlyinfluenceonwatermelonphotosynthesis;rootactivityofT6,T3,T4andT7wasdifferent,T6tothemaximum,followedbyT3.(4)Inthefurtherfieldconditiontest,T4hadthebestcontroleffectwithnodiseasedplants,followedbyT7,thepreventionratereached75%.Comparedwithcontrolgroup,T4obtainedthehighestyieldofwatermelonwithaincreaseof14.7%,followedbyT3,increaseditsoutputby10.5%.T3、T4、T6andT7havedifferentdegreesofincreaseinwatermelonfruitsolublesolids,higherthanCK16.9%,9.7%,9.3%and12.5%respectively.Applicationofmicrobialagentscanchangethemicrobialcontentinrhizospheresoilofwatermelon,whichcanimprovethesoilmicrobialenvironmenttosomeextent.(5)Theeffectsofcontrolonthegrowthofwatermelonwerestudied,andtwobettertreatmentswereselected,T3andT4respectively.Keywords:Watermelon;fusariumwilt;biologicalcontrol;microbialagents;controleffect4 目录摘要......................................................................................................IAbstract.............................................................................................III目录....................................................................................................V第一章引言.......................................................................................81.1西瓜枯萎病概述.....................................................................................81.1.1病害症状.........................................................................................................81.1.2病菌形态及生理小种.....................................................................................91.1.3侵染方式.......................................................................................................101.2西瓜枯萎病防治研究方法...................................................................101.2.1化学防治.......................................................................................................101.2.2抗性育种.......................................................................................................111.2.3农业防治.......................................................................................................111.2.4生物防治.......................................................................................................121.3本研究的目的、意义和内容...............................................................141.3.1研究目的和意义...........................................................................................141.3.2研究的主要内容...........................................................................................141.3.3技术流程.......................................................................................................15第二章西瓜枯萎病拮抗菌株的筛选............................................172.1材料与方法..........................................................................................172.1.1试验材料.......................................................................................................172.1.2试验方法.......................................................................................................205 2.2结果与分析...........................................................................................222.2.1西瓜枯萎病病原菌的分离..........................................................................222.2.2西瓜枯萎病病原菌的鉴定..........................................................................222.2.3西瓜枯萎病菌拮抗菌株的筛选..................................................................222.3本章小结...............................................................................................23第三章生防菌促生作用研究及施用浓度筛选............................253.1材料与方法...........................................................................................253.1.1试验材料.......................................................................................................253.1.2试验方法.......................................................................................................273.1.3数据处理.......................................................................................................293.2结果与分析...........................................................................................293.2.1不同菌剂用量对西瓜出苗率的影响..........................................................293.2.2不同菌剂用量对西瓜生长的影响..............................................................303.3本章小结...............................................................................................34第四章微生物制剂最佳配方的筛选............................................374.1材料与方法...........................................................................................374.1.1试验材料.......................................................................................................374.1.2试验方法.......................................................................................................404.1.3数据处理.......................................................................................................424.2结果与分析...........................................................................................424.2.1不同处理对西瓜枯萎病发病率及防效的影响..........................................424.2.2不同处理对西瓜生长的影响......................................................................424.2.3不同处理对光合作用的影响......................................................................434.2.4不同处理对西瓜根系活力的影响..............................................................444.3本章小结...............................................................................................45第五章田间实验.............................................................................476 5.1材料与方法...........................................................................................475.1.1实验材料.......................................................................................................475.1.2实验设计.......................................................................................................485.1.3测量指标与方法...........................................................................................485.1.4数据处理.......................................................................................................495.2结果与分析...........................................................................................505.2.1微生物制剂防治西瓜枯萎病的效果..........................................................505.2.2微生物制剂对西瓜生长的影响..................................................................515.2.3微生物制剂对西瓜产量和品质的影响......................................................535.2.4微生物制剂对西瓜植株根系微生物含量的影响......................................545.3本章小结...............................................................................................55第六章结论与讨论.........................................................................586.1结论.......................................................................................................586.2讨论.......................................................................................................59参考文献...........................................................................................63个人简历、在学校期间发表的学术论文与研究成果..................69致谢...................................................................................................717 第一章引言西瓜，葫芦科，西瓜属，蔓性草本植物，世界上十大水果之一。西瓜是一种重要的夏令水果，其味道甜美、口感清爽，有“夏季水果之王”的美称。西瓜果肉中含有大量的水，达90%以上，糖分含量达5%-11%，另外，还含有粗纤维、尼克酸以及少量果胶和配糖体。在炎热的夏季，西瓜因含有大量的水分，所以能帮助人们在酷热的天气中解渴降暑，舒缓焦躁情绪，对发热有很好的缓解作用；此外，西瓜还具有利尿，可消除肾脏炎症等作用。因此西瓜的市场需求大，种植面积广，我国是农业大国，西瓜产量大，其产量约占世界西瓜总产量的45%以上[1]。由于西瓜的栽培面积越来越大，造成轮作困难，出现了连作障碍，造成严重的经济损失，而造成连作障碍的主要原因之一就是西瓜枯萎病[2]。通常情况下由西瓜枯萎病可造成西瓜减产达15%-30%，严重时达到50%-85%，甚至绝产[3]。目前主要的防治手段有化学防治、选取抗病砧木进行嫁接防治、引进抗病品种、农业防治以及生物防治。其中生物防治是利用一种或者多种微生物通过其代谢产物来降低病原菌数量或削弱病菌的致病能力的一种防治措施[4]。生物防治对人体无害，对土壤有益微生物无影响，不污染环境，不会使病原菌产生抗性且对西瓜无副作用，越来越受到人们关注与认可。1.1西瓜枯萎病概述西瓜枯萎病俗称“死秧病”，是一种维管束系统遭到破坏的土传病害，是由尖孢镰刀菌西瓜专化型[Fusariumoxysporumschlechlendahlf.sp.melons(Leachatcurrence)snyderetHansen]所引起的[5]，由Smith于1984年首次报道[6]，严重威胁着西瓜的安全生产[2]，现已成为世界性难题。1.1.1病害症状西瓜枯萎病在西瓜生育的各个阶段均有发生，但以座瓜期和瓜膨大后期发8 病最重。幼苗期发病会导致出苗前烂种，幼苗受害，出苗后发病的最初症状表现为嫩叶上出现轻微褪绿[7]，老叶失水萎蔫呈下垂态，茎基部褐色收缩，瓜苗倒伏，将瓜苗拔出其根部呈黄褐色甚至腐烂，植株在苗期发病会迅速死亡[8]。成株期发病初期叶片失緑、下垂，生长缓慢，午时植株萎焉明显，但早晚可恢复正常，发病3-7天后其植株基部叶片黄化、不定根形成、植株萎焉且不可恢复，大部分叶片边缘坏死，最终死亡[9]。大多情况下全株发病，偶见病株仅部分蔓发病，同株上其他蔓正常。空气潮湿时，将病株的根纵向撕开会发现维管束变成褐色，并可以检测出菌丝体和小型分生孢子[10]。尖孢镰刀菌引起的枯萎病最为明显特征就是维管束组织发生褐变[11]，从盛花期到果实成熟期，较老植株的症状表现更为明显[12，13]。1.1.2病菌形态及生理小种在PSA平板上，25℃左右培养菌株10天后，可观察到气生菌丝体呈白色至淡紫色的棉絮状；菌落底色呈红紫色。小型分生孢子无色透明，呈长椭圆形或纺锤形，一般0~1隔，大小为6.4（2.0~13.0）µm×3.4（2.0~4.5）µm；大型分生孢子镰刀型或纺锤形，有足胞，1~5隔，多为3隔，大小18.3（7.3~33.8）µm×3.4（2.6~5.2）µm；厚垣孢子顶升或串生，圆形或长圆形，10.8（5.2~14.3）µm×9.9（5.2~11.7）µm；产孢细胞短，单瓶梗[14]。根据尖孢镰刀菌西瓜专化型的致病性的差异又可划分出不同生理小种。专化型和生理小种的鉴别可在抗病育种、病害防治及植物检疫等方面提供重要的理论和实际意义[15]。在不同区域，同一专化型的枯萎病原菌存在明显的致病性差异，形成不同的生理小种[16]。尖孢镰刀菌西瓜专化型主要有生理小种0、1、2、3共4个生理小种[17，18]。据Cirulli[19]研究生理小种0只能侵染感病品种，而生理小种1可以感染抗生理小种0的感病品种，毒性要强于生理小种0；Netzer[20]于1973年发现一种除野生型PI296431-FR外几乎可以感染所有的西瓜品种，命名为生理小种2[21]；而在2010年Zhou分离得到的西瓜枯萎病菌可以使野生型PI296431-FR维管束变褐，发生枯萎，故定名为生理小种3。9 1.1.3侵染方式尖孢镰刀菌在土壤中依其腐生能力可以长期生存，也可以在植物残株上生存[22，23]，以菌丝体或小型分生孢子、大型分生孢子、厚垣孢子中的一种形式存活[24]。尖孢镰刀菌从根尖、根部伤口或侧根生长点直接进入植株体进行菌丝体或孢子萌发管的侵染[25]。菌丝体进入植株体后，在根皮层细胞间生长直至进入木质部，通过木质部的纹孔侵入导管进行生长，到达植株的茎和顶部[26]。病原菌菌丝体在生产过程中产生分枝，会生成小型分生孢子，自下而上的沿着导管移动，当其萌发时，菌丝体就会穿透木质部的上层壁，在其临近的导管中产生更多的小型分生孢子[27]。同时，病原菌也会由木质部的纹孔进行横向扩展。植物维管束组织内病原菌的生长，会导致叶片气孔关闭，使植株的营养和水分运输受到很大影响，叶片出现萎焉甚至植株的死亡[26]。当病原菌侵入植株的软组织，到达死亡组织表面最终并产生大量的孢子，这些孢子作为接种体又为下一步病原菌的扩散做准备[28]。1.2西瓜枯萎病防治研究方法1.2.1化学防治化学防治是生产上常用的方法，是用化学杀菌剂来防治病原菌，在西瓜生长的不同阶段施用化学杀菌剂可在一定程度上防治西瓜枯萎病[29]。40%灭菌净是一种新型杀菌剂，以有机硫、咪唑类农药、添加助剂复配而成，对枯萎病具有一定的防效[30]。柳唐镜[31]使用绿亨一号（恶霉灵）既能杀灭土壤中的病原菌，又能促进植物的生长。菌线威是新型高效广谱杀菌杀线剂，具有极高的杀菌杀线活性，对多种植物病原菌及线虫都有显著效果。徐宗刚等[32]用不同剂量的菌线威在西瓜定植期和膨瓜期进行灌根试验，以9g菌线威兑水45kg灌根2次的处理效果最好，应用于连续2年的重茬田后，西瓜枯萎病病情得到控制。化学防治中的华光霉素常用于苹果、茄子、黄瓜等二点叶螨的防治，也可用于防治西瓜枯萎病。朱昌雄等[33]从20中助剂中筛选到4种可以增强华光霉素抑菌作用的助剂，不仅可以用到西瓜枯萎病病原菌，而且对棉花枯萎病病原10 菌和苹果轮纹病病原菌都有防治，且防效较高。陆志平[34]采用二灌四喷法施用1％申嗪霉素悬浮剂100倍稀释液，能有效地控制西瓜枯萎病的发生为害。卢灿坤[35]使用83增抗剂以拌种和灌根相结合的方式来防治西瓜枯萎病，试验结果表明83增抗剂对西瓜枯萎病不仅防治效果显著，还能增加西瓜产量。此外，采用福尔马林或高锰酸钾在播种前浸种或者喷洒如溴甲烷、氯化苦等进行土壤熏蒸[36]可以在一定程度上减轻枯萎病的发生。但化学方法的长期使用会使病原菌产生抗药性，致病力增强，杀菌及防治效果逐渐下降甚至无效，更重要的是有害物质的残留对人体有害，其安全性令人担忧，人们对环境保护也日益关注，化学药品的防治方法现已不提倡大量使用[37]。1.2.2抗性育种利用抗病品种可经济有效的防治西瓜枯萎病，是防治西瓜枯萎病的重要措施之一[38]。由美国育种学家Orton于19世纪末开创西瓜抗病育种的研究[39]。“丰乐5号”是由抗病基因转育并经多代病圃筛选得到的一代高抗枯萎病且优质、高产、早熟的西瓜新品种[40]。辐射诱变是西瓜育种方法之一，黄学森等[41]利用西瓜干种子进行辐射诱变，获得了1个突变体。肖光辉等[42]利用外源DNA导入优良品种，产生抗枯萎病的突变体，从而获得抗性品种。目前我国常用的西瓜抗病品种有秀丽、秀雅、郑杂2号、中育6号、红冠龙、京杭1号、郑抗无籽3号、杭柄京欣等品种[43]。西瓜遗传基础狭窄，选用的抗病品种常有一定的局限性，选育的品种常常不能针对所有的生理小种，会受到其他生理小种的侵染而感染西瓜枯萎病，因此在引入其他不同地区可能会失去其抗性，且抗病品种的选育难度大，周期长，不能达到满意的防治效果[44]，无法从根本上解决问题，不能消除西瓜枯萎病的威胁。1.2.3农业防治国内外不断摸索积累了不少采用农业操作方法以防治西瓜枯萎病的经验和措施，主要有嫁接砧木、合理轮作、合理施肥等。嫁接技术是农业防治瓜果病害常用的方法。20世纪20年代日本就开始研11 究利用嫁接砧木来防治西瓜枯萎病，我国随后也开始了大面积的推广。由中国农业科学院郑州果树研究所的郑高飞等选育出的超丰F1是我国第一个西瓜砧木杂交品种[45]。砧木的选择十分重要，莫云彬等[46]通过比较几种不同的砧木，发现日本强势葫芦抗枯萎病的能力比其他砧木要好。尹东亚[47]用超丰F1为砧木，以京新1号为接穗进行嫁接，比药剂防治西瓜枯萎病效果好且增产多。目前生产上常用的优良砧木有中国南瓜、西砧1号、南砧1号、瓠瓜1号、日本强势葫芦等，其中中国南瓜应用最为广泛[48]。轮作即建立合理的耕作制度，实行西瓜和非瓜类作物轮作，水旱轮作[49]也是常用的方法。和豆科、禾本科作物如大豆玉米等轮作防治效果较好，与十字花科的甘蓝或百合科的大葱、大蒜等轮作或混合种植对防治西瓜枯萎病有良好效果[50]。张悟民等[51]在相同的环境条件下观察了施肥种类、数量、时期和方法对病害发生及产量的影响，发现随着施氮量的增加西瓜枯萎病病情严重，当施氮量与作物耐肥能力吻合时，病害减轻显著，增产率也有明显提高。储国良和吴汉章[52]在西瓜重点产区利用西瓜专用药肥92-4经几年多点试验，在一般轮作栽培条件下，发现每亩穴施40kg作为基肥，明显促进西瓜生长且高产早熟，对西瓜枯萎病的大田防治效果平均达67%。这几种常用的农业防治方法虽可以在一定程度上防治西瓜枯萎病，但也有其缺点。嫁接防治虽然无公害但技术难度大，劳动量需求大，也可能会影响西瓜的口感，培育产量、口感皆优异的抗病品种难度大且周期长；轮作一般需要几年的时间才有较好的防治效果，而我国的平均耕地少，在追求经济效益的大面积种植区域很难实施。1.2.4生物防治1921年Hartely利用真菌防治猝倒病，这是最早应用生物防治[53]，生物防治主要是利用对植物无毒无害的环境友好型微生物，以降低致病菌的数量从而达到防控的作用，因为其安全有效，人们越来越关注生物防治[54，55]。主要包括真菌类、细菌类、链霉菌生防菌和非致病性菌株等。用于枯萎病生物防治的真菌中，研究应用较多的有木霉属（Trichoderma）真菌、AM（Arbuscularmycorrhizae，丛枝菌根）真菌等[56]。木霉分布广泛，在12 许多培养基都能生长，易分离培养，可抑制多种病原菌，是一种理想的生防菌[57]。木霉的生防机制主要有重寄生、抗生和竞争作用[58]。哈茨木霉（Trichodermaharzianum）和绿色木霉（Trichodermaviride）[59]是目前常用的。吴石平等[60]运用木霉与微量三唑酮配合，对防治西瓜枯萎病有增效作用，尖孢镰刀菌厚垣孢子的萌发率较低。AM真菌在自然界中普遍存在，能与植物根系建立互惠共生体从而促进共生植物的生长，增强植株的抗逆性，主要利用AM真菌与尖孢镰刀菌之间的竞争关系来防治枯萎病。黎起秦等[61]将土壤中分离得到的4种拮抗真菌「康氏木霉（Trichodermakoningii）、拟康氏木霉（Trichodermapsudokoningii）、哈茨木霉（Trichodermaharzianum）和粘帚霉（Gliocladiumsp.）」分别进行紫外诱变，得到了抗氧氮化铜、扑海因和多菌灵的变异株并对西瓜枯萎病有抑制作用。蒋细良等[62]研究发现中生菌素（链霉菌的一种）对西瓜枯萎病病原菌有抑制作用，发现中生菌素能显著地引起菌丝细胞内原生质的凝集，可强烈的抑制其病原孢子的萌发。陈文俊[63]从西瓜根部筛选了一种内生细菌JK-3可用于防治西瓜枯萎病。马艳等[64]从西瓜植株体内分离获得的内生细菌——枯草芽孢杆菌BS21对西瓜枯萎病有显著防效。岳菊[65]从连作的西瓜、黄瓜和茄子等作物根际土壤和病健组织中分离筛选的拮抗菌株枯草芽孢杆菌NBT-15和假单胞杆菌PL-82在田间试验中的防治效果分别达到70.05%和50.43%。马利平[66]从330个细菌菌株中筛选出了1株蜡质芽孢杆菌“98Ⅰ”，对西瓜、黄瓜、青椒以及番茄的枯萎病均有显著防治效果。黎起秦等[61]筛选的4种芽孢杆菌菌株B11、B19、B21、B24对西瓜枯萎病有良好防治效果。非致病性尖孢镰刀菌的利用是应用了弱株系交互保护作用的原理，以产生诱导抗性作用。然而由于各种因素非致病性尖孢镰刀菌会恢复致病性，因此在大面积应用上必须考虑所选用非致病性尖孢镰刀菌的适应性和变异性[67]。王守正等[68]从西瓜植株维管束中分离得到了尖孢镰刀菌和茄形镰刀菌的2株非致病性菌株，分别是F0-3和F5-1，并用其诱导处理西瓜幼苗，可使其产生对枯萎病的抗性，其非致病性菌诱导抗病的效果与非致病菌和致病菌接种的间隔天数相关，间隔天数越多，防治效果越好。13 1.3本研究的目的、意义和内容1.3.1研究目的和意义西瓜是经济效益较好的作物，种植面积广泛，然而世界性的土传病害——西瓜枯萎病在全国各个产区和西瓜的各个生长时期均有发生，已成为西瓜生产的大敌。目前，对该病的主要防治方法有：施用化学杀菌剂[30-32]、选育抗性品种[40-42]、嫁接砧木[45-47]及合理施肥[51，52]等防治措施。其中施用化学杀菌剂在一定程度上可减轻枯萎病的发生，但有害物质的残留对人体有害，其安全性令人担忧；嫁接防治虽然无公害但技术难度大，劳动量需求大，也可能会影响西瓜的口感；培育产量、品质皆优异的抗病品种难度大且周期长；轮作虽然是一种安全的防治手段，可有效控制西瓜枯萎病的发生，但轮作需要几年的时间，在追求经济效益的大面积种植区域很难实施，并且西瓜枯萎病是一种土传病害，其病原菌在土壤中存活时间长，轮作并不能有效减少土壤中病原菌的数量，不能从根本上防治西瓜枯萎病的发生。生物防治是利用一种或多种拮抗微生物来抑制或减少病原菌的数量，从而达到防控西瓜枯萎病的目的，有望从根本上解决问题，且对环境友好无污染，因此越来越受到人们的关注。生物防治西瓜枯萎病是通过拮抗微生物制成的微生态制剂来实现的，一般通称为微生物制剂，其生态效应有以下几个方面：（1）在微生态环境中通过拮抗、占领、竞争等作用使病原菌数量减少，削弱其危害能力；（2）采用活菌制备的微生物制剂，可通过活菌或其代谢产物进行抗病害和增产保健作用；（3）可改善植株根际微生态环境中化学及物理环境，调控失调的微生态环境。1.3.2研究的主要内容（1）西瓜枯萎病菌拮抗菌的筛选本研究以西瓜枯萎病病原菌为靶标菌，通过平板对峙法从实验室保存的功能菌中筛选对西瓜枯萎病病原菌拮抗作用强的功能菌。（2）微生物制剂最佳施用浓度的筛选将筛选的拮抗菌制成微生物制剂，复配成不同的配方处理，通过盆钵试验，14 施加不同浓度，通过观察对西瓜生长等生物量的影响确定出最佳施加浓度。（3）微生物制剂最佳防治处理的筛选在最佳施用浓度的基础上，通过盆钵试验，观察防病和促生长作用筛选出最佳防治处理。（4）田间实验的检验田间实验，观察防效、西瓜产量、品质以及种植前后根际微生物数量的影响。1.3.3技术流程本论文采用的实验技术流程见图1-1。15 分离靶标病原菌病原菌鉴定生防菌筛选拮抗功能菌活化皿内拮抗性筛选入选生防菌固态发酵微生物制剂盆栽筛选最佳施用浓度盆栽筛选最佳防治处理田间实验发病率、防治率生长影响光合作用根系活力发病率、防治率产量、品质微生物区系出苗率筛选出有效的微生物制剂处理图1-1技术流程16 第二章西瓜枯萎病拮抗菌株的筛选西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型引起的世界性土传病害[5]，是西瓜主要的病害之一。其致病菌——尖孢镰刀西瓜专化型寄主范围广范且能够在土壤中长期存活，西瓜枯萎病不仅造成西瓜减产甚至绝收，还影响西瓜的品质，因此，西瓜生产的当务之急要进行西瓜枯萎病的防治。目前，西瓜枯萎病的防治手段很多，常用的有化学防治、嫁接栽培、合理轮作、选用抗病品种以及生物防治等。采用嫁接栽培、轮作或抗病品种虽然可以减少西瓜枯萎病的危害，但也很难从根本上解决问题。化学防治可以最大限度地减少西瓜发病的初侵染源，对西瓜枯萎病具有一定的防治效果，但长期使用化学试剂造成药物残留超标、污染环境、使病原菌抗性增强等，不符合绿色农业的发展要求和人们对无公害食品、果蔬的需求。因此，无污染、绿色可持续的生物防治成为防治西瓜枯萎病的重要突破口。西瓜枯萎病的生物防治主要是利用对西瓜枯萎病病原菌有拮抗作用的拮抗微生物来降低致病菌的密度从而达到控制西瓜枯萎病病害的作用。因此，筛选出具有抑菌活性、性状稳定的、理想的拮抗菌株是对西瓜枯萎病进行生物防治的关键。2.1材料与方法2.1.1试验材料2.1.1.1供试菌株生防菌均来源于实验室筛选并保存的性状稳定的功能菌，西瓜枯萎病病原菌自行分离并鉴定，其发病植株由中国农业科学院郑州果树研究所西瓜课题组提供。17 2.1.1.2主要试剂试验所用主要试剂及厂家见表2.1。表2.1试验所用主要试剂试剂纯度厂家NaCl分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司NaOH分析纯郑州派尼化学试剂厂KNO3分析纯郑州派尼化学试剂厂KH2PO4分析纯天津市光复精细化工研究所MgSO4·7H2O分析纯天津市光复精细化工研究所FeSO4分析纯郑州派尼化学试剂厂葡萄糖分析纯天津市风船化学试剂科技有限公司琼脂分析纯郑州派尼化学试剂厂牛肉膏北京奥博星生物技术责任有限公司蛋白胨北京奥博星生物技术责任有限公司OmegaDNA提取试剂盒郑州英迈捷生物科技有限公司2.1.1.3主要仪器试验所用主要仪器见表2.2。表2.2主要仪器仪器型号生产厂家霉菌培养箱MJX-250上海树立仪器仪表有限公司稳压稳流电泳仪EPS-600上海天能科技有限公司气浴恒温振荡器SHZ-82常州冠军仪器制造有限公司分析天平FA1204B上海精科天平仪器厂18 紫外分析仪WD-9403C北京市六一仪器厂高压蒸汽灭菌锅LDZH-200KBS上海申安医疗器械厂PCR扩增仪PTC-200美国伯乐公司制冰机SIM-F140ADLPanasonic,Japan恒温培养箱FX303-1上海树立仪器仪表有限公司多功能水平电泳槽HE120上海天能科技有限公司微波炉D8023YTL-V1海尔集团显微镜CX21OLYMPUS,Japan电热恒温培养箱FX303-4太仓市实验设备厂双人双面垂直净化工作台SW-CJ-2F苏州智净净化有限公司离心机SIGMR博动行仪器有限公司移液枪KE0044114北京大龙兴创实验仪器有限公司恒温培养摇床HZQ-B常州冠军仪器制造有限公司2.1.1.4试剂及培养基0.1%升汞液的配制：升汞1.0g，浓盐酸2.5mL，去离子水1000mL，先将升汞用盐酸溶解，然后加水稀释。1%琼脂糖凝胶：取1g琼脂糖溶于100mL1×TAE溶液中，微波炉加热沸腾3次。10×TAE溶液：EDTA29.22g，Tris1.2114g，去离子水1000mL，用HCL调pH至8.0。孟加拉红培养基：葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，琼脂20.0g，1/3000孟加拉红溶液100mL，蒸馏水1000mL，氯霉素0.1g。先将其他成分在蒸馏水中溶解后，最后再加孟加拉红溶液。氯霉素经少量乙醇溶解后，加到培养基中，分装后，121℃灭菌20min。PDA培养基：马铃薯去皮后切块取200g，葡萄糖20.0g，琼脂18.0g，去19 离子水1000mL,自然pH，121℃灭菌20min。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂18-20g，去离子1000mL，调pH至7.0-7.2，121℃灭菌20min。高氏1号培养基：可溶性淀粉20.0g，KNO31.0g，NaCl0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，K2HPO40.5g，FeSO40.01g，琼脂18-20g，去离子水1000mL，调pH至7.0-7.2，121℃灭菌20min。2.1.2试验方法2.1.2.1西瓜枯萎病病原菌的分离从患有西瓜枯萎病病株上剪取发病部位，用自来水冲洗干净，在超净工作台中用在酒精灯火焰下灼烧过的解剖刀在发病边缘健康处剪取病健组织，放入已消毒的烧杯中，倒入0.1%升汞液适量消毒1min，然后用无菌水冲洗2-3次，用灭菌剪刀剪成3mm左右大小，放入已倾注灭菌PDA培养基的平皿中，于霉菌培养箱中28°C静置培养5天，挑选具有西瓜枯萎病病原菌特征的菌落进行纯化与保存，并进一步鉴定。将纯化后的病原菌制成孢子液回接到西瓜植株上，观察西瓜枯萎病的发生情况。2.1.2.2西瓜枯萎病病原菌的鉴定（1）病原菌DNA的提取利用Omega真菌DNA提取试剂盒。（2）18SrRNA片段的扩增利用真菌18SrRNA的通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）进行PCR扩增。PCR反应体系（50μL体系）：10×PCRBuffer(Mg-)5.0μLdNTP4.0μLPrimerITS11.0μL20 PrimerITS41.0μLTemplateDNA3.0μLTaqDNAPolymerase（2U/μL）0.5μLddH2O35.5μLPCR反应条件：94℃预变性10min、35个扩增循环（94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸2min），72℃补充延伸7min，4℃保存。反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。（3）目的DNA的提取纯化使用Takara纯化试剂盒纯化PCR产物。（4）测序由上海生工生物工程技术服务有限公司进行胶回收后的目的DNA片段的测序。将获得的18SrRNA序列在NCBI上进行Blast同源性搜索，并用MEGA进行同源性分析[69]。2.1.2.3西瓜枯萎病菌拮抗菌株的筛选采用平板对峙法来测定功能菌对西瓜枯萎病菌的抑菌能力。首先将实验室已保藏的15株功能菌在其适宜生长的培养基上进行活化，将分离得到的西瓜枯萎病菌在PDA平板上进行活化，连续活化3次，然后将每个活化过的功能菌和分离的西瓜枯萎病菌的菌体用已灭菌的打孔器打直径约5mm的菌饼备用，在直径为90mm的平板上倾注PDA培养基，将西瓜枯萎病菌的菌饼放入平板的中央，在其左右各25mm的地方对称放入一种功能菌的菌饼[70]，以只放入西瓜枯萎病菌菌饼的平皿作为对照，每个重复3次，放入28℃恒温培养箱中培养观察有无抑菌圈的产生，4-5天后测量并记录对照和放入功能菌平皿中西瓜枯萎病菌的菌落半径，根据公式2.1计算功能菌的抑菌率。抑制率（%）=（对照皿病菌菌落半径–处理皿病菌菌落半径）/对照皿病菌菌落半径×100%（公式2.1）21 2.2结果与分析2.2.1西瓜枯萎病病原菌的分离在西瓜枯萎病病株上分离得到的病原菌制成的孢子液回接到西瓜植株上，发现西瓜植株也患有枯萎病，出土后发病，子叶、真叶失水萎蔫，茎基部呈褐色，倒状，拔出幼苗可看见根部呈黄褐色至腐烂状态[71]，其发病症状与典型西瓜枯萎病相同。2.2.2西瓜枯萎病病原菌的鉴定在西瓜枯萎病病株上分离得到的病原菌其菌落为白色菌丝，带有略微红色，分生孢子为无色，呈镰刀形，厚垣孢子间生或顶生、浅黄色、圆形，在接近培养基的菌落基部为葡萄酒色至紫色。将获得的18SrRNA序列在NCBI上由Blast软件进行同源性搜索，其最大相似序列在NCBI上的检索号为KY786127，并用MEGA进行同源性分析可知分离的西瓜枯萎病病菌为尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusariumoxysporumf.sp.niveum），属子囊菌门（Ascomycota），肉座菌目（Hypocreales），镰刀菌属（Fusarium）。2.2.3西瓜枯萎病菌拮抗菌株的筛选以功能菌对西瓜枯萎病病原菌产生的抑菌圈和抑制率来看，从实验室已保藏的15株功能菌中初步筛选出对病原菌有较好拮抗性的菌株。由表2.3来看，对西瓜枯萎病病原菌有较好拮抗作用的菌株有：Y1、D-10、MQM、MM、M-01、M-43、M-16，共7株。在这7株菌中，菌株Y1的拮抗作用最强，抑菌率最大，达到79.1%，病菌菌落半径为5mm，其次菌株为D-10，病原菌菌落半径为6mm，抑菌率为75%，其他几株拮抗效果从大到小菌株依次是M-43、M-16、MM、MQM和M-01。因此，根据其抑菌率以及综合特性共选出4株即Y1、D-10、M-43、M-16强拮抗菌株进行下一步的盆钵试验。22 表2.3功能菌对西瓜枯萎病菌的拮抗作用拮抗菌株处理皿病原菌菌落半径/mm抑菌率/%Y15.079.1D-106.075.0MQM9.062.5MM8.564.5M-019.062.5M-437.070.8M-167.568.8CK24.0--2.3本章小结分离得到西瓜枯萎病病原菌是筛选拮抗菌的前提，由本章研究结果可以得出，通过分离得到西瓜枯萎病病原菌与实验室已保藏的功能菌通过平板对峙法筛选出了几株拮抗性较强的菌株。其中菌株Y1、D-10、M-43、M-16对西瓜枯萎病菌的抑制率分别达到79.1%、75%、70.8%、68.8%，抑制效果非常明显。生物防治植物土传病害是当今科学家们研究的热点，利用拮抗菌来抑制病原菌有着良好的可行性和发展前景，然而利用生防菌防治植物病害，拮抗菌对病原菌在单一的平板环境中有良好抑制效果还远远不够，在试验中表现优异的功能菌在土壤条件下是否会表现出其优异的生防活性，更重要的是在农田生态环境中可以达到对植物病害的防治以及对植物生长的良好影响，因此还需进一步的试验探究。23 24 第三章生防菌促生作用研究及施用浓度筛选利用拮抗微生物来抑制西瓜尖孢镰刀菌从而对西瓜枯萎病进行防治，降低西瓜枯萎病的发生，逐渐受到广大瓜农的认可[70]。因此随着生物防治研究的深入，逐渐产生了微生物制剂的概念[72]。微生物制剂在这里主要讲的是活菌制剂，即把筛选得到的对西瓜尖孢镰刀菌有拮抗作用的生防菌制成活菌制剂，活菌制剂的直接应用也是生物防治植物病害的有效方法，也是今后的发展趋势。且生防菌剂剂型的加工也逐渐从水基制剂向油基制剂，从液体制剂向固体制剂，从粉末制剂向颗粒制剂方向发展[73]。微生物制剂的固态发酵[74]多指通过无游离水的固态基质来供拮抗微生物进行发酵[75]。菌剂固态发酵原料来源广，成本低[76]，可以采用工业下脚料或一些农副产品如麦秸、稻壳、豆粕等，且对发酵条件要求不高，对温度及含氧量无需严格控制，发酵产物易获取，产量高，发酵产物容易保存且保存时间长[77]。微生物制剂的施加不仅抑制病原菌而且对植株的生长如茎粗、根长、植株干鲜重等生物量有良好的促生作用。然而微生物制剂的施加浓度过低，可能达不到人们预期目的，施加浓度过量可能会抑制植物生长或者使根际微生物的比例失衡，也达不到理想效果。因此，微生物制剂的施加浓度十分重要，本章即通过试验的设计筛选出适宜西瓜生长的微生物制剂的施加浓度。3.1材料与方法3.1.1试验材料3.1.1.1微生物制剂及其他材料以第二章试验筛选出的4株拮抗菌Y1、D-10、M-43、M-16依其互不拮抗的原则按比例复配成7个处理，分别以T1、T2、T3、T4、T5、T6和T7来表示。25 各处理及对照CK所用土壤均来自中国农业科学院郑州果树研究所西瓜研究课题组实验田。供试西瓜品种为216蜜宝，由中国农业科学院郑州果树研究所西瓜研究课题组提供。3.1.1.2主要试剂试验所用主要试剂规格及生产厂家同表2.13.1.1.3主要仪器试验所用主要仪器型号及生产厂家同表2.2，另外，还有：电热鼓风干燥箱（101-3B），上海实验仪器有限公司。3.1.1.4主要培养基及试剂配制PDA培养基和牛肉膏蛋白胨培养基见2.1.1.4。0.9%生理盐水：准确称取氯化钠9.0g置于烧杯中，加入适量去离子水，溶解后，定容至1000mL，121℃灭菌20min。分散液：250mL三角瓶中分装50mL生理盐水，加玻璃珠30颗/瓶，121℃灭菌20min。3.1.1.5盆钵试验用具室外试验用具：营养钵足个、台秤50kg1个、铁锨1把、小铲子2把、塑料盆2个、浇水壶2个、带孔的浇水软管N米、标签纸N张、挂牌N个、插牌N个、记号笔3支、直尺（最大30-50cm量程）1把、卷尺1个、软皮尺一个，记录本2本。26 3.1.2试验方法3.1.2.1微生物制剂的制备将筛选的拮抗菌进行平板活化，在超净工作台中用接种环挑取适量菌体或孢子于配制的相应液体培养基中，放于恒温培养摇床中，振荡2-5天，制成种子液。将豆粕、玉米面、麸皮、锯末按照不同的比例共取1kg，并加适量水在发酵桶内混合搅拌均匀后，121℃灭菌40min，制成固体发酵培养基[78]。将制成的种子液在无菌条件下接种到固体发酵培养基中，搅拌均匀后放于培养箱中培养一周左右并测其活菌数，然后在室外通风处晾晒，待其干燥后粉碎备用。3.1.2.2活菌数的测定活菌数测定方法分为以下几个步骤：（1）制备菌悬液：称取干燥的菌剂样品10.0g，放入90mL装有玻璃珠的无菌水中，静置20min后，充分震荡30min，即得10-1菌悬液。（2）稀释：吸取5mL10-1菌悬液加入到45mL无菌生理盐水三角瓶中，吹打摇匀，即得10-2菌悬液。再吸取1mL10-1菌悬液加入到9mL无菌生理盐水试管中，得10-3菌悬液。根据含菌量多少依次稀释至所需合适浓度。（3）倒平板：取融化后培养基，倒平板（约25mL），冷凝后倒置。（4）涂平板：待平板冷却后，吸取所需稀释倍数菌悬液100μL接种于平板上，用无菌涂布棒涂匀，编号，正置于适当温度培养箱中培养，30~60min后倒置培养适当时间。每一稀释度重复3次，并以无菌生理水涂布平板作为空白对照，（5）镜检记数：根据生长情况，取已培养好的菌株平板，挑取3-5个单菌落，涂片染色观察，根据菌落计数原则[79]，确定为单一相同菌株后进行单菌落计数。（6）数据统计与分析：通过单菌落数据统计与分析得到样品中的活菌数。27 3.1.2.3西瓜催芽选取颗粒饱满的西瓜种子，在30℃的无菌水中浸泡24小时后，用一块棉布包裹，拧干水分，放在适宜温度的培养箱中2-3天即可催芽成功。3.1.2.4试验设计采取营养钵种植的方法进行最佳施用浓度的筛选。将土壤过筛，装入灭菌锅中分批进行灭菌。根据前人在甜瓜、黄瓜中的研究经验以及其微生物制剂测得的活菌数量和预试验的结果按比例复配来制定施加浓度，每个处理共3个梯度，以Tx-1、Tx-2、Tx-3来表示，其中T1、T2、T6及T7各处理的施加浓度（w/w）梯度依次为2%、1%、0.5%，T3、T4以及T5各处理施加菌剂的浓度梯度依次为3%、2%和1%，以不加入微生物制剂的处理作为对照（CK），共22个处理，每个处理20株，共3个重复。称取对应梯度的微生物制剂并与灭菌土充分混匀，每个营养钵装入约300g混匀后的灭菌土与菌剂[80]，将催芽后的西瓜种子放入营养钵中，浇水后再铺满一层灭菌土壤，然后盖上塑料薄膜，用细土或砖压好边缘，待其出苗后将塑料薄膜揭去，试验过程中对照和各处理都采取相同的水肥管理。3.1.2.5试验测定指标及方法统计各处理的出苗情况，根据公式3.1计算施加不同浓度微生物制剂对出苗率的影响。出苗率（%）=出芽种子数/试验种子总数×100%（公式3.1）定植缓苗后（15天），每个处理选取长势一致的5株以子叶为界分别测定其株高，在茎基部第二节测植株的横向茎粗，每7天测量一次。定植30天后，每个处理选取长势一致的5株，测定其主根长度并记录，之后用去离子水冲洗干净并吸干水分，测定其整个植株的鲜重，并以子叶为界测其地下部分和地上部分的鲜质量，然后置于115℃电热鼓风干燥箱中杀青30min，75℃下烘干至28 恒重[81]，以前后2次的读数不超过0.01为准，测定其地上部分和地下部分干质量及整株的干质量。3.1.3数据处理采用软件SPSS19.0分析处理试验数据，并用Excel2013绘图。3.2结果与分析3.2.1不同菌剂用量对西瓜出苗率的影响从表3.3得知，同一处理中的浓度梯度对西瓜出苗有着不同程度的影响，不同处理之间微生物制剂的施加对西瓜的出苗情况也有着不同程度的影响，其中T1、T2、T3、T5、T6以及T7施加微生物制剂的浓度越低，其出苗率越高，而T4虽然施加浓度2%和3%对应的出苗率一致，但也呈现施加微生物制剂浓度越高其出苗率越高的趋势。对照CK的出苗率为66.7%，相比对照来看，T1-2、T2-1、T2-2、T5-1和T5-2的出苗率皆低于对照，而其他处理的出苗率皆高于对照CK。同一处理中不同浓度梯度出苗率有高有低，T1-3、T2-3、T3-3、T4-1、T5-3、T6-3及T7-3在对应处理的浓度梯度中出苗率最高，其中T3-3和T7-3在全部处理中的出苗率最高，都达到了96.7%。表3.3不同菌剂用量对西瓜出苗率的影响处理施加浓度/%（w/w）出苗数/株出苗率/%CK---4066.7T1-12.04168.3T1-21.03965.0T1-30.54778.3T2-12.03660.0T2-21.03863.329 T2-30.54066.7T3-13.05693.3T3-22.05693.3T3-31.05896.7T4-13.05185.0T4-22.05185.0T4-31.04676.7T5-13.03558.3T5-22.03863.3T5-31.04473.3T6-12.05185.0T6-21.04981.7T6-30.55795.0T7-12.04676.7T7-21.05083.3T7-30.55896.73.2.2不同菌剂用量对西瓜生长的影响3.2.2.1不同菌剂用量对西瓜株高的影响不同菌剂的施加用量对西瓜栽后30天的株高影响如图3-1所示，可知不同浓度的微生物制剂对西瓜株高影响不同。其中T1、T2、T3、T5和T6在水平处理3（L3）时，而处理T4、T7在处理水平（L2）时，西瓜株高较高，说明其对应的微生物制剂浓度有利于西瓜生长。即在处理T1中T1-3的株高较高，说明微生物制剂的施加浓度为0.5%，利于西瓜生长；T2中T2-3的株高较高，30 为16cm，其施加浓度为0.5%；T3-3和T5-3施加浓度下的西瓜株高明显高于其处理中其他两个梯度，最适施加浓度皆为1%；T6和T7中利于西瓜株高生长的施用浓度皆为0.5%；而T4中最适施加浓度为2%。由图3-1得知，除T1、T2之外，其他处理通过施加微生物制剂有利于西瓜株高的增加，其中T3、T4和T6的效果最为明显，T3-3的株高最大，为24cm，其次是T4-2和T6-3，其值皆为22cm。3.2.2.2不同菌剂用量对西瓜茎粗的影响由图3-2可知，经过微生物制剂施加作用后，西瓜在栽后30天的茎粗与对照有着明显差异，除T1之外，其他处理都有不同程度的促生效果。其中T4促生效果最为显著，其T4-1茎粗达到最大，为0.52cm，其次为T6-3，其茎粗为0.51cm；再次为T3-3，其茎粗为0.49cm。而T1的3个浓度梯度茎粗皆略低于对照，没有表现出明显促生作用。表明微生物制剂的不同施加浓度对茎粗也有着不同程度的影响。在各个处理中，T1、T2、T3、T5、T6以及T7施加微生物制剂的浓度越低，其茎粗的值呈增加的趋势。以茎粗来看这7个处理的最佳施31 用浓度分别为0.5%、0.5%、1%、3%、1%、0.5%以及0.5%。3.2.2.3不同菌剂用量对西瓜植株生物量的影响由表3.4可以看出，西瓜苗定植30天时，施加微生物制剂对西瓜的地上及地下部分干鲜重皆有影响。西瓜植株的干鲜重比值也随着微生物制剂施加浓度的变化而变化，其中T1、T2、T3、T5、T6、以及T7随着微生物制剂施用浓度的减少，植株的干鲜重比呈现增大的趋势；而T4的干鲜重之比则是随着微生物制剂施用浓度的增大而增大。T3-3和T4-1的菌剂用量能显著提高西瓜植株的干鲜重比值（T3-3为0.140，T4-1为0.153），其施加浓度分别是1%和3%；T5-1和T7-1的菌剂施加浓度分别3%和2%，其西瓜植株干鲜重比值较低（T5-1为0.097，T7-1为0.093）。与对照CK相比，施加微生物制剂对地上部鲜重的影响较为显著，T6-3达到最大，其值为5.08g，其施加浓度为0.5%。32 表3.4不同菌剂用量对西瓜地上与地下部鲜重及干鲜重之比的影响施加浓度地上部地下部干鲜处理/%（w/w）鲜重/g干重/g鲜重/g干重/g重比CK---1.980.20.170.010.098T1-12.0%1.630.190.170.010.111T1-21.0%1.600.180.060.010.114T1-30.5%2.840.320.120.020.115T2-12.0%4.740.490.220.040.107T2-21.0%2.770.330.100.020.122T2-30.5%1.930.240.070.010.125T3-13.0%3.300.410.180.030.126T3-22.0%3.580.470.200.030.132T3-31.0%4.450.620.250.040.140T4-13.0%2.120.320.100.020.153T4-22.0%4.980.690.180.030.140T4-31.0%3.830.480.280.040.127T5-13.0%1.700.160.050.010.097T5-22.0%2.100.210.080.020.106T5-31.0%3.980.550.150.030.113T6-12.0%4.830.550.200.030.115T6-21.0%4.850.620.230.040.130T6-30.5%5.080.720.200.040.136T7-12.0%1.870.170.060.010.093T7-21.0%4.180.490.200.030.119T7-30.5%3.650.460.170.030.1283.2.2.4不同菌剂用量对西瓜根长的影响在西瓜定植30天后，由图3-3得知，施加微生物制剂对的西瓜根部生长有着积极影响，即促进西瓜根部的生长、伸长。其中处理T2、T3、T4、T6、T733 的各处理水平以及T1-3，T5-1和T5-3，其根长值皆高于对照。T3、T4和T6对西瓜根长生长的影响较为明显，T3-3的根长最长，为10.2cm；其次为T6-3，其根长值为9.0cm；再次为T4-1，根长为8.9cm。全部处理中仅T4是施加浓度越高其根长值越大，其他处理根长则是随着微生物制剂施加浓度的降低而呈现增加的趋势。3.3本章小结在盆钵条件下对不同微生物制剂的施加浓度的筛选来看，施加不同浓度的微生物制剂对西瓜的出苗和生长影响不同。（1）同一处理中不同浓度梯度出苗率有高有低，其中T1-3、T2-3、T3-3、T4-1、T5-3、T6-3及T7-3在各自对应的处理中该浓度梯度的出苗率最高，T3各梯度水平的出苗率达到了93%以上，其中T3-3和T7-3的出苗率最高，达到了96.7%。（2）施加微生物制剂有利于西瓜株高的生长，其中T3、T4和T6的效果最为明显。其中T1-3、T2-3、T3-3、T4-2、T5-3、T6-3及T7-2在各自对应的处理中该浓度梯度的株高最高，T3-3的株高最高，其次是T4-2和T6-3。（3）施加不同浓度微生物制剂对西瓜植株茎粗、根长和生物量的影响不同，34 其中T1-3、T2-3、T3-3、T4-1、T5-3、T6-3及T7-3在各自对应的处理中该浓度梯度的生长最好。（4）从西瓜植株的出芽率和生长情况来看，仅T4随着施加浓度的增大呈现明显的促生效果，T1、T2、T3、T5、T6及T7则随着菌剂施加浓度的减小而呈现增大的趋势。综合而看，各处理所筛选的最佳施加浓度分别为0.5%、0.5%、1%、3%、1%、0.5%和0.5%。相较对照，T1各处理水平以及T2部分处理水平的各项生态指标都要低于对照，其对西瓜生长的影响及抗病效果还有待在第4章中进行进一步的验证。35 36 第四章微生物制剂最佳配方的筛选西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型所引起的一种土传病害，其病原菌可以在土壤中长期存活，以及西瓜的连年种植所产生的化感物质[82]能够降低植物叶片的光合速率水平[83-85]以及使幼苗生长被抑制[86，87]。接种一些有益微生物可与特定病原菌竞争生存营养和空间来减少病原菌的数量和植株的感染还可以分解土壤中的有害物质。生防菌剂在发酵过程中产生的一些抗生素类、植物激素类等活性物质在土壤中与有害菌产生拮抗作用并建立优势菌群，进而达到防病、抗病及促进植物生长的作用[81]。但不同的微生物制剂施入根际土壤后，其菌体在土壤中的成功定殖以及通过竞争方式使有害微生物减少，在根际土壤中建立优势拮抗菌群并发挥防病和促生作用的效果也不同。有些微生物制剂在定殖后可充分发挥其作用，但有些生防菌剂施加后由于其拮抗菌的特性和土壤的复杂环境不能有效定殖或定殖后不能达到预期效果，因此本章通过试验设计筛选出较好的微生物制剂配方，以利于进一步的田间应用。4.1材料与方法4.1.1试验材料4.1.1.1微生物制剂采用第三章试验所筛选的7个配方中微生物制剂的最适施加浓度，即T1、T2、T3、T4、T5、T6及T7的微生物菌剂施加浓度依次为0.5%、0.5%、1%、3%、1%、0.5%和0.5%。试验所用土壤来自中国农业科学院郑州果树研究所西瓜研究课题组实验田。供试西瓜品种为216蜜宝，由中国农业科学院郑州果树研究所西瓜研究课题组提供。37 4.1.1.2主要试剂试验所用主要试剂规格及生产厂家见表4.1。表4.1试验所涉及到的主要试剂试剂纯度生产厂家NaCl分析纯苏州市太仓美达试剂有限公司葡萄糖分析纯天津市风船化学试剂科技有限公司琼脂分析纯郑州派尼化学试剂厂二氧化硅分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司牛肉膏北京奥博星生物技术责任有限公司蛋白胨北京奥博星生物技术责任有限公司丙酮洛阳昊华化学试剂有限公司次硫酸钠分析纯天津市鼎盛鑫化工有限公司碳酸钙天津金汇太亚化学试剂有限公司乙酸乙酯分析纯新乡市中原有机化工有限责任公司氯化三苯基四氮唑分析纯上海山浦化工有限公司浓硫酸天津市风船化学试剂科技有限公司琥珀酸天津市风船化学试剂科技有限公司氢氧化钠分析纯苏州市太仓美达试剂有限公司4.1.1.3主要仪器试验所用主要仪器型号及生产厂家同表2.2。38 4.1.1.4主要培养基及试剂配制PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、0.9%生理盐水和分散液的制备见3.1.1.4。小麦培养基：取一定量的小麦，浸泡24h，将浸泡的小麦加入清水蒸煮，待水沸腾后再煮15-20min，滤去沸水，沥干后分装在150mL的三角瓶中，小麦占比约1/3，121℃灭菌1h即可。1％TTC溶液：称取TTC（氯化三苯基四氮唑）1.0g，溶于少量去离子水中，定容到100mL，再根据所需浓度稀释。1mol/L硫酸：用量筒量取浓硫酸(比重1.84)55mL，边搅拌边加入盛有500mL蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000mL。0.4mol/L琥珀酸：准确称取琥珀酸4.72g，溶于适量去离子水中，定容至100mL。磷酸缓冲液（1／15mol/L，pH7）：准确称取磷酸二氢钾9.067g，加入1mol/L氢氧化钠溶液38.8mL，加入适量去离子水，稀释至1000mL。TTC标准曲线的制作[88]：取0.2mL0.4％TTC溶液放入10mL量瓶中，再将少许Na2S2O4粉末加入，摇匀后会立即产生红色的TTF（三苯基甲），再用乙酸乙酯定容并摇匀。分别取此液0.25mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以乙酸乙酯为参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。4.1.1.5盆钵试验用具室外试验用具见3.1.1.5。39 4.1.2试验方法4.1.2.1含西瓜病原菌载体的制备首先用平板活化西瓜枯萎病病原菌，然后用无菌水冲洗长满病原菌的平板获得孢子悬液，将获得的西瓜枯萎病病原菌的孢子悬液加入到小麦培养基中，以刚好润湿小麦培养基为宜，于恒温培养箱中28℃，暗黑培养1周左右。4.1.2.2微生物制剂的制备微生物制剂的制备参照3.1.2.1。4.1.2.3活菌数的测定活菌数测定方法参照3.1.2.2。4.1.2.4西瓜催芽西瓜催芽参照3.1.2.3。4.1.2.5试验设计采取营养钵种植的方法进行最佳配方的筛选。取实验田土壤，将土壤过筛后装入灭菌锅中分批进行灭菌。菌剂的施加浓度依照第三章的试验结果，即T1、T2、T3、T4、T5、T6及T7的施加浓度分别为0.5%、0.5%、1%、3%、1%、0.5%和0.5%，共7个处理。每个营养钵装入约300g的灭菌土，在装入之前称取相应质量的微生物制剂和用小麦培养基培养的西瓜枯萎病菌与土充分混合，并测其含病原菌数量，其土壤中病原菌的含量至少要达到106CFU/g（连作西瓜土壤病菌含量）。仅以不加入微生物制剂的处理作为对照（CK），每个处理2040 株，共3个重复。将催芽后的西瓜种子放入营养钵中，浇水后再铺满一层灭菌土壤，然后盖上塑料薄膜，用细土或砖压好边缘，待其出苗后将塑料薄膜揭去。试验过程中，对照和各处理都采取相同的水肥管理。4.1.2.6试验指标测定方法（1）西瓜发病情况。播种35天后调查西瓜枯萎病发病情况，并按照公式4.1和4.2分别计算发病率和防治率。发病率（%）=发病株数/总株数×100%（公式4.1）防治率（%）=（对照发病率-处理发病率)/对照发病率×100%（公式4.2）（2）生长指标测定。试验结束后，每个处理选取长势一致的5株，测定其茎粗、株高；用去离子水冲洗干净并吸干水分，测定其整个植株的鲜重。依照公式4.3、4.4计算株高增加和鲜重增加百分比。株高增加（%）=（处理株高-对照株高）/对照株高×100%（公式4.3）鲜重增加（%）=（处理鲜重-对照鲜重）/对照鲜重×100%（公式4.4）（3）光合速率测定。各处理选取长势一致的植株在晴天上午9点到11点采用光合测定仪测其光合速率。（4）根系活力测定。各处理选取长势一致的植株取根尖样品采用TTC法测定根系活力[88]，其测定方法如下：称取0.5g根尖样品于烧杯中，再加入10mL0.4％TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液，将样品浸没，在37℃下暗保温1h后加入2mL1mol/L硫酸，以停止反应。（同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上）。反应终止后将根取出并吸干水分，放入研钵中，加入3～4mL乙酸乙酯和少量石英砂，充分研磨，以提取TTF。后将研磨的提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯洗涤残渣2-3次，皆移入试管，后加乙酸乙酯使总量至10mL，在波长485nm下比色，以空白实验为参比，测吸光度，由标准曲线求出TTC还原量，并根据公式4.5计算还原强度。四氮唑还原强度=（四氮唑还原量/μg）/（根重/g×时间/h）（公式4.5）41 4.1.3数据处理采用软件SPSS19.0分析处理试验数据，并用Excel2013绘图。4.2结果与分析4.2.1不同处理对西瓜枯萎病发病率及防效的影响栽苗35天后，不同处理在盆钵试验条件下，都可以在不同程度上抑制西瓜枯萎病。由公式4.1和公式4.2计算得出的发病率和防治率见表4.3。由表4.3可以看出，T3、T6和T7的发病率较低，防治效果最好，尤其是T3的发病率最低，为23.33%，防效最好，防治率达到68.2%，其次为T6，发病率为28.5%，防治率为61.0%；再次是T7，发病率为32.0%，防治率为56.4%。表4.3不同处理对西瓜枯萎病发病率及防效的影响处理发病率（%）防治率（%）CK173.3-T138.447.5T250.031.8T323.368.2T440.045.5T561.516.1T628.561.0T732.056.44.2.2不同处理对西瓜生长的影响施加不同处理微生物制剂对西瓜生长的影响不同，出苗后，T3、T4、T6和T7表现良好，长势好，叶片生长快而绿。在栽后35天时，由表4.4可得出，42 T3、T6长势较好，鲜重、株高以及根长增加较为明显，其中T3长势最好，其鲜重增加63.9%，株高增加66.7%，根长增加81.9%；其次为T6，其鲜重增加为63.4%，株高增加66.7%，根长增加36.1%；但从根长增加看，T4的根长增加大于T6，次于T3，其根长增加为68.8%，其鲜重和株高增加分别为60.8%、41.7%。T1、T2和T5则不太理想，与对照相比无明显优势。表4.4不同处理对西瓜生长的影响处理鲜重/g鲜重增加/%株高/cm株高增加/%根长/cm根长增加/%CK1.90±0.10b—12.00±2.00c-6.10±0.50c-T12.03±0.02b6.3011.00±2.50c-6.80±0.70c11.50T21.93±0.06b0.9010.00±2.00c-6.20±0.40c1.60T33.13±0.13a63.9020.00±1.50ab66.7011.10±0.80a81.90T43.07±0.03a60.8017.00±0.50b41.7010.30±0.70a68.80T52.07±0.07b8.2010.00±1.50c-5.00±0.50d-T63.12±0.16a63.4020.00±1.00a66.708.30±0.20b36.10T73.03±0.04a58.6017.00±1.00ab41.707.80±0.10b27.904.2.3不同处理对光合作用的影响通过光合速率及胞间CO2浓度来反应施加微生物制剂对光合作用的影响。从光合速率的测定结果来看，T3、T6、T4、和T7的光合速率较高（表4.5）。其中T3的光合速率最高，其值为15.97µmol•m-2•s-1，T6次之，其值为14.42µmol•m-2•s-1；而T1、T2和T5的光合速率较低，其中T2最低，低于对照的光合速率。蒸腾速率与光合速率正相关，各处理的结果与光合速率的趋势一致（表4.5）；测定的胞间CO2浓度、本文高的其光合速率也较高，基本上和光合速率的结果一致（表4.5）。43 表4.5不同处理对西瓜叶片光合速率的影响处理光合速率蒸腾速率胞间CO2浓度/µmol•m-2•s-1/mmol•m-2•s-1/µmolCO2mol-1CK8.41±0.28d4.02±0.26e298±2.00cT19.38±0.30d5.45±0.13c301±4.55cT28.24±0.16d4.37±0.25de283±6.58dT315.97±1.00a8.83±0.13a328±6.58aT413.45±1.82bc7.35±0.11b321±4.00aT58.48±0.63d4.82±0.87cd251±4.36eT614.42±0.20b8.72±0.35a325±8.12aT712.13±0.13c7.85±0.10b312±1.00b4.2.4不同处理对西瓜根系活力的影响氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位80mV的氧还原色素，被广泛地用作酶试验的氢受体，常以TTC还原量来表示脱氢酶活性从而作为判定根系44 活力的指标。根系活力的强弱可以反映植物体能量代谢水平。由图4-1可看出各处理的根系活力不同，其中处理T6、T3、T4和T7根系活力高于对照，可提高西瓜植株根系活力，其中T6最大，是CK的1.6倍。4.3本章小结利用盆钵栽植对不同处理微生物制剂的不同浓度进行筛选，即T1、T2、T3、T5、T6及T7各处理所筛选的最佳施加浓度分别为0.5%、0.5%、1%、3%、1%、0.5%和0.5%。在此基础上进行了本章的抗病防治试验，结果发现这7个处理对西瓜枯萎病有不同程度的防治效果，对植株的生长、光合作用及根系活力等方面的影响也不同。（1）在所有处理中T3的防治效果最好，防治率最高，达68.2%，防治效果较好分别为T6、T7、T1、T4，其防治率分别为61.0%、56.4%、47.5%、45.5%。（2）施加不同处理微生物制剂的西瓜生长不同，T3长势最好，鲜重、株高以及根长皆增加最多，其次较好的分别为T6、T4和T7。（3）不同微生物制剂对西瓜光合作用及根系活力影响不同，处理T3、T4、T6、和T7对西瓜光合作用的影响较为显著，T3光合速率达到最大值；各处理的根系活力不同，T6达到最大值，其次较好的分别为T3、T4、T7。（4）本试验证在盆钵条件下，不同处理对同一品种西瓜的防病效果和对生长的影响不同，其中T3、T4、T6以及T7综合表现较好，而T1、T2和T5表现的不太理想，发病率稍高，防治率略低，且与对照相比并不能有效提高叶片的光合速率以及根系活力。45 46 第五章田间实验中国作为一个农业大国，可耕作的土地面积有限。西瓜是一种重要的经济作物，为了取得较高的经济效益，常会在同一块田地里连续种植西瓜，使西瓜枯萎病这种土传病害的病原菌在土壤中的积累越来越多，对西瓜的生产造成的危害也日益严重，使得西瓜植株长势差、产量变低、品质变差。为防治西瓜枯萎病，导致农药和化肥的滥用，使土壤微生态系统逐渐被破坏，从而加重了西瓜枯萎病的危害程度。通过前两章的盆钵试验，发现施加微生物制剂不仅可以防治西瓜枯萎病，而且对于西瓜植株的生长以及光合作用、根系活力都有显著提高。前两章的试验初步确定了微生物制剂的最佳施加浓度还筛选出了防治效果比较好的处理配方，主要采用的是营养钵的方式来探究对西瓜苗期相关形状的影响，因此本章着重通过进一步的田间试验，通过施加微生物制剂在田间西瓜生产中对西瓜枯萎病的防治效果及西瓜的生长、产量、品质及土壤微生物指标进行测定。该实验结果为微生物制剂的推广应用具有重要意义，为西瓜枯萎病的防治提供理论依据，也为可持续的绿色农业发展提供一条可行的途径[89]。5.1材料与方法5.1.1实验材料5.1.1.1供试菌剂生防菌：来自近年来由郑州大学微生物实验室已经筛选出的一些功能菌，通过前三章的试验确定出的4个较好的处理，分别是T3、T4、T6和T7。微生物制剂的制备参照3.1.2.1。47 5.1.1.2供试西瓜品种供试西瓜品种为216蜜宝，由中国农业科学院郑州果树研究所西瓜课题组提供，为该试验区主栽易感病品种。将西瓜种子消毒后浸种24小时，将种子放入育苗盘中于恒温适宜条件下育苗。5.1.1.3供试地块在中国农业科学院郑州果树研究所西瓜课题组试验田，为种植西瓜已连作4年的地块。土质为适合西瓜生长的砂壤土，面积约为256m2，经检测土壤中存在大量西瓜枯萎病病原菌。5.1.2实验设计以种植西瓜4年限的土壤为基础，设1个空白对照CK及4个处理（T3、T4、T6及T7），每个处理设3个重复。每个处理小区面积和种植密度根据西瓜种植区原有的种植习惯，采用随机区组排列，尽量保持每个小区的原始条件一致，每个小区周围设置保护行。栽苗15天之内若死苗可以补，超过15天不再补苗，生长过程中死苗不拔除，仍留在原处。对照处理：根据西瓜种植区原有的种植习惯进行常规种植管理。选择处理：在西瓜定植时采用穴施的方式施加不同配方的微生物制剂约6g，在生长的旺长期再追加微生物制剂约100g，进行常规种植管理。5.1.3测量指标与方法5.1.3.1植株生长量、产量和品质定植后，使用游标卡尺或卷尺每隔7-10天测量植株的茎粗、蔓长、叶长、叶宽等；收获时随机选取各小区各处理各5株，以测定西瓜产量并计算单位亩48 产量；采用手持糖量测定仪测定西瓜的糖度（可溶性固形物）[90]。5.1.3.2枯萎病发生情况观察并记录西瓜枯萎病发病情况，发病部位、株数、病情指数等。病情指数根据发病情况定级，结合田间调查进行。西瓜枯萎病病情分级标准[90]：0级：植株正常生长；1级：植株萎焉，占全株的1/4及以下，瓜果生长正常；2级：植株萎焉，占全株的1/4或1/2，瓜皮表面稍有褪色；3级：植株萎焉，占全株的的1/2以上，茎蔓上有琥珀色胶状物，根部病茎表面产生白色或粉红色霉层，果实萎蔫缩小；4级：整株枯萎并死亡。病情指数按照公式5.1计算，发病率和防治率按照公式4.1和公式4.2计算。病情指数=∑（发病株数x病情级数）/（总调查株数x最高级数）×100%………………….（公式5.1）5.1.3.3西瓜植株根系微生物含量在定植西瓜前用采样铲刮除地表约1cm的表土层，用土钻采集耕层土壤，放在冰箱中备用，在西瓜成熟采摘前在距植株根茎约10cm处取0~20cm耕层土壤，采用传统平板计数法分别测定施加前后不同处理西瓜根际土壤微生物群落种类与数量[79]。5.1.4数据处理采用软件SPSS19.0分析处理试验数据，并用Excel2013绘图。49 5.2结果与分析5.2.1微生物制剂防治西瓜枯萎病的效果通过对从不同处理对西瓜枯萎病的发病率及防治率的调查结果（见第四章表4.3），选用了防治效果较好的4个处理，在连作4年的田间进行实验时也能达到很好的防治效果，并且不同处理对西瓜枯萎病的防治效果不同（表5.1）。空白（图5-1a）对照的发病率达到了44.44%，死株率达到29.6%，施加微生物制剂的T4（图5-1b）无死亡植株，防治效果最明显，达到了100%，其次为T7，发病率较低，为11.11%，防治率较高，为75%；T3和T6的发病率和死株率皆低于空白对照，分别为30.5%、23.0%和23.1%、12.0%；防治率分别是31.25%和47.91%。表5.1施用微生物制剂对西瓜枯萎病的防治效果处理发病率/%死株率/%病情指数防治率/%CK44.429.637.0—T330.523.025.031.3T40—-—100T623.112.014.047.9T711.111.111.175.050 ab图5-1西瓜枯萎病的田间防治效果5.2.2微生物制剂对西瓜生长的影响5.2.2.1微生物制剂对西瓜蔓长生长的影响由图5-2得知，施加微生物制剂可以加快西瓜植株蔓长的生长。在定植缓苗后15天到43天，T3、T4、T6和T7，即施加微生物制剂的处理西瓜蔓长生长比对照要快，其中T3的蔓长生长较为旺盛，在定植24天的时候，蔓长极显著地高于对照和其他处理，在第43天测量时达到最大，其蔓长为192.7cm；其次为T4，其蔓长为181.4cm。51 5.2.2.2微生物制剂对西瓜茎粗生长的影响由图5-3得知，施加微生物制剂可增加西瓜植株的茎粗。在定植缓苗15天时，植株茎粗增加缓慢，定植缓苗24天后，施加微生物制剂的处理茎粗增加迅速；在定植缓苗33天后，T3、T6茎粗已显著大于对照与其他处理。T3在定植缓苗43天后，茎粗最粗，其茎粗值为0.70cm，其次为T6，茎粗值为0.62cm；再次为T7，其茎粗值为0.59cm。52 5.2.3微生物制剂对西瓜产量和品质的影响产量的增加和品质的改善可以有效减少施加微生物制剂的投入成本。由表5.2得知，在同一土壤条件下施加微生物制剂的各处理的西瓜产量和可溶性固形物与对照相比，差异性显著。不同处理对西瓜的产量影响不同，且在座瓜期，施加微生物制剂的要比没施加的对照要早一些，T3最早开始座瓜。其中T4的单果重和亩产最大，分别为983.6g、553.4kg/亩，相比对照提高了14.7%；其次为T3，单果重和亩产分别947.5g、533.2kg/亩，相比对照提高了10.5%。T3西瓜的可溶性固形物最高，为9.88%，比对照提高16.9%，其次为T7，其值为9.51%，比对照提高了12.5%。53 表5.2施用微生物制剂对西瓜产量和品质的影响处理单果重/g产量/kg/亩可溶性固形物/%CK857.50±482.40±8.45±6.70d10.80c0.35cT3947.50±533.20±9.88±12.80b7.90b0.29aT4983.60±553.40±9.27±16.00a12.70a0.19bT6916.10±515.40±9.24±15.60c5.00b0.21bT7922.00±518.80±9.51±11.00c5.30b0.18ab5.2.4微生物制剂对西瓜植株根系微生物含量的影响根际微生物区系是根系环境是否健康的一个衡量标准。利用平板计数法分析了西瓜种植前后施加微生物制剂对西瓜根际土壤中细菌、放线菌、酵母菌和霉菌数量的影响。结果（表5.3）表明，施加微生物制剂后，土壤中细菌、放线菌、酵母菌和霉菌数量与对照相比，差异显著。施加前土壤中细菌和放线菌含量较低，霉菌含量较高，施加后，西瓜根际土壤中细菌和放线菌的数量均高于CK，而霉菌的数量要低于CK。其中细菌数量变化最为显著的是T7，其细菌含量是施加前的2.29倍，其次为T6，其细菌含量是施加前的1.67倍；放线菌含量变化最为显著的是T6，是施加前的2.16倍，其次是T3，其放线菌含量为施加前的1.90倍；酵母菌变化最为显著的是T3，其次为T4，分别为施加前的2.42倍、1.95倍；T3和T7的霉菌含量仅为施加前的26.3%。54 表5.3施用微生物制剂对西瓜根际土壤中微生物数量的影响菌种类别施加前施加后CKT3T4T6T7细菌（108CFU/g）2.4±0.35.5±1.4±0.5d2.5±0.3c4.0±0.6b4.0±0.2b0.5a放线菌（108CFU/g）3.0±0.45.4±2.7±0.3c5.7±0.7a4.3±0.5b6.5±0.5a0.6a酵母菌（108CFU/g）2.1±0.31.9±0.1c5.1±0.3a4.1±0.4b2.2±0.1c2.1±0.02c霉菌（107CFU/g）1.9±0.50.5±3.4±0.4c0.5±0.2a0.8±0.3a1.5±0.5b0.1a5.3本章小结本研究从生物防治的角度，基于生产实践，制备了几种处理并在田间对其防效进行检验，从试验结果来看，在连作4年西瓜且富含西瓜枯萎病病原菌的田间条件下，施加不同处理的微生物制剂皆能在不同程度上防治西瓜枯萎病的发生，促进西瓜生长，提高西瓜产量，改进西瓜品质，对西瓜根际土壤中细菌、放线菌和真菌的数量也有影响。（1）T4在田间实验中没有出现死亡植株，防治效果最好，防治率达到100%，其次为T7，发病率和防治率分别为11.11%和75%；T3和T6的发病率皆低于对照，防治率分别是31.25%和47.91%。（2）施加微生物制剂的植株叶片颜色深绿，其蔓长、茎粗与对照差异性显著。T3的蔓长要明显长于其他处理，达到192.78cm，生长较为旺盛，其次为T4，其蔓长为181.4cm；西瓜植株在定植33天后，茎粗增加较快，其茎粗值为0.70cm，其次为T6，茎粗值为0.62cm。（3）不同处理对西瓜的增产作用不同。其中T4获得了最高的西瓜产量，相比对照提高了14.7%，其次为T3，相比对照提高了10.5%；T3的西瓜果实可溶性固形物含量最高，达到了9.88%，比对照提高了16.9%，其次是T7，其值为9.51%，比对照提高了12.5%。（4）在施加微生物制剂前后，土壤中细菌、放线菌、酵母菌和霉菌数量有55 不同的变化，施加前土壤中细菌和放线菌含量较低，真菌含量较高。施加后，与对照相比，西瓜根际土壤中细菌和放线菌的数量均高于CK，而真菌的数量要低于CK，微生物含量差异显著。56 57 第六章结论与讨论6.1结论尽管国内外许多研究者对西瓜枯萎病做了不少的研究，但目前仍没有能够有解决这一问题的有效措施。近几年，越来越多的研究者着手于病原菌的研究，这是产生西瓜枯萎病的主要原因，并提出要从西瓜植株根系的土壤微环境的角度来防治西瓜枯萎病。只要土壤微生态环境中病原菌数量减少，西瓜枯萎病的发生机率也会大大降低，因此从生物的角度出发的生物防治是最快速有效且无污染的解决方法。本研究虽是利用生防菌防治西瓜枯萎病的初探，但也可以预见这种防治手段在将来所发挥的长远的经济效益和环境效益。本文以防治西瓜枯萎病为目的，筛选出了对西瓜枯萎病病原菌有良好拮抗作用的功能菌，制备微生物制剂，并测定了复配的配方处理对西瓜枯萎病的防病及促生效果，为西瓜枯萎病的生物防治提供了新的思路。通过研究可以得出以下结论：（1）通过分离得到西瓜枯萎病病原菌与实验室已保藏的功能菌通过传统的平板对峙法筛选出了几株拮抗性较强的菌株。其中菌株Y1、D-10、M-43、M-16对西瓜枯萎病菌的抑制率分别达到79.1%、75%、70.8%、68.8%，抑制效果非常明显。（2）在盆钵条件下对不同微生物制剂的施加浓度的筛选来看，施加浓度不同在不同处理中对西瓜的影响不同。只有T4中西瓜植株的出芽率和各生长指标随着施加浓度的增大而呈现明显的促生效果，而T1、T2、T3、T5、T6及T7则随着菌剂施加浓度的减小而呈现增大的趋势。各处理所筛选的最佳施加浓度分别为0.5%、0.5%、1%、3%、1%、0.5%和0.5%。（3）这7个处理对西瓜枯萎病都有不同程度的防治效果。其中T3、T4、T6和T7不仅防治西瓜枯萎病效果好，在生长、光合作用以及根系活力这些方面都要优于对照组。T3的防效最好，防治率达到68.2%，其次为T6、T7，其防治率分别是61.04%和56.36%；T3长势最好，鲜重、株高以及根长皆增加最58 多，其中鲜重增加达到63.9%，株高增加66.7%，根长增加81.9%；T3、T4、T6和T7对西瓜光合作用的影响较为显著，T3光合速率达到最大值；各处理的根系活力不同，T6达到最大值，其次是T3，分别为20μg/g、17μg/g。而T1、T2和T5表现的不太理想，发病率稍高，防治率略低，与对照相比并不能有效提高叶片的光合速率以及根系活力。（4）在进一步的田间条件下，T3、T4、T6和T7皆能在不同程度上防治西瓜枯萎病的发生，促进西瓜生长，提高西瓜产量，改进西瓜品质。T4在田间实验中没有出现死亡植株，防治效果最好，其次为T7，防治率达到75%；T4获得了最高的西瓜产量，相比对照提高了14.7%；T3、T4、T6和T7各处理西瓜果实可溶性固形物都有不同程度增加，分别比对照提高16.9%、9.7%、9.3%和12.5%。且对西瓜根际土壤中微生物数量也有影响，可一定程度改善植株根际土壤微生物环境。（5）综上所述，通过盆钵试验和田间实验，综合其防治效果以及对西瓜植株生长的影响，筛选出了2个较好的处理，分别是T3和T4。6.2讨论虽然对国内外西瓜枯萎病的防治进行了大量的研究，但目前仍无可以根治且经济有效的方法。利用拮抗菌是一种新型途径。微生物制剂是利用农业边角废料通过接种拮抗菌发酵而制成的，是集营养、防病于一体的多功能高效复合微生物制剂[89]，不仅含有农作物生长发育所必须的元素、有机质外，还含有大量活性有益微生物及微生物代谢产物，既能在作物幼苗期提供一定的速效成分，又能在其生长的过程中，通过微生物的生命活动不断发挥速效和长效兼有的作用[91]。在西瓜枯萎病的生物防治中，常常将防病作用与促生作用相结合，会起到更理想的效果。从本研究可看出，施加不同处理的微生物制剂对西瓜植株的生长与对照相比都有一定的促生长作用。促生长作用机理包括生防菌产生的生理活性物质促进植物生长，产生的代谢物质抑制根部病原菌的生长，间接促进植物生长[92]。研究不同菌剂施加浓度对棉花生物量的影响试验[93]以及对连作番茄生理生态的试验都表明微生物制剂在不同浓度下可促进植株幼苗株高、茎粗及59 主根长的生长，还可以增加植株干物质量的累积，这与本试验的结果一致。目前，有一种观点认为，微生物菌剂对植株的促生作用如生物量和根系是由于拮抗微生物的拮抗作用和有益分泌物共同作用的结果[94]，但具体的作用机制及代谢产物还需要考察和验证。西瓜连作土壤中的病原菌数量非常高，因此，西瓜植株在土壤中是否能正常生长，取决于其根系周围微生物的种类与含量，在定植时穴施微生物制剂能够在西瓜植株根系周围形成有益微生物的保护墙，可有效抵御西瓜枯萎病病原菌的侵入，防范西瓜枯萎病的发生。且微生物制剂中功能菌的加入可改变植株根际环境中微生物数量，减少土壤中的霉菌数量，一般土传病害的致病菌大部分是由霉菌引起的，霉菌数量的减少在一定程度上也降低了土传病害发生的可能性。在试验过程中发现抑制率高、拮抗效果强的功能菌并不能都在具体的西瓜枯萎病防治试验中表现良好。T1、T2和T5所使用的拮抗菌在第二章的平板对峙法的试验中，对西瓜枯萎病病原菌的抑制效果非常明显。然而在试验中，T2和T5较早出现西瓜枯萎病的症状，且在盆钵条件下防治率较低。且不同的处理在盆钵条件下防治效果随时间推移呈现不同的变化，T1和T4在后期患西瓜枯萎病的植株增加，防治效果降低。可能与其菌剂使用浓度有关，如果适当改变施加浓度，或许会有较好的防效。利用生防菌进行西瓜枯萎病的防治虽然已是当前生物防治的主流，然而在生产实践中，同一处理在田间和盆钵条件下表现不尽相同。在盆钵条件下防治效果最好的是T3，而在田间条件下，防治效果最好的是T4；田间条件与盆钵条件相比要复杂的多，受植物、病原微生物和复杂的土壤环境等多种因素的影响，尤其是其它微生物的竞争作用[95]使其功能菌不易定殖。微生物间存在复杂的动态变化以及我们未知的防病机理，需要我们进行更加深入的研究。土壤环境复杂多样，各地区间土壤类型、自然气候等因素的影响，不同地区土壤酶活性、结构及土壤微生物种类与数量变化的影响也有差异，因此对于利用生防菌进行生物防治也许需要因地而异。应在不同田间的应用中进行跟踪试验，不仅是观察防病效果还要了解市场的接受程度。在实际的防治过程中要找到不仅具有良好抑菌活性、性状稳定且适应性强，在对西瓜的促生长等各个指标皆优于一身的处理比较困难。在本试验的研究过60 程中也有此类问题的出现。不同处理对西瓜的生长促进和产量以及西瓜糖度的影响也不相同，有的处理能明显促进西瓜植株生长，有的处理可以显著增加西瓜产量、改善西瓜品质。由于本研究田间实验中采用的西瓜品种为小型瓜，在秋茬、重茬情况下会造成减产，甚至绝收，因此实验中整体产量低。要得到更加高效经济的微生物制剂，需要进一步的研究其防病及作用机制。并且自然界微生物含量非常丰富，存在大量尚未发现的优异拮抗菌株，发现并分离新的优异菌种仍是今后工作的重点。61 62 参考文献[1]殷晓敏，金志强.西瓜枯萎病综合防控技术规程[J].安徽农业科学,2016,(1):184-186[2]杨秀云.西瓜枯萎病的发生特点及防治措施[J].现代农业科技,2005,(13):16-16[3]张洪宇.西瓜枯萎病的预防[J].农民致富之友,2014,(15):32-32[4]张炳欣，J·O·Becker.植物病原的生物防治[J].科技通报,1987,(6):56-59[5]周永强.西瓜枯萎病生防放线菌筛选及其防病促生作用研究[D].西北农林科技大学,2008[6]H.A.J.Hoitink，A.G.Stone，M.E.Grebus.SuppressionofPlantDiseasesbyComposts[M].SpringerNetherlands,1997,pp.373-381[7]谢大森，陈家旺.西瓜枯萎病研究进展[J].江西农业大学学报,1997,(4):42-45[8]马存，简桂良，郑传临，等.棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.Vasinfectum(ATK)Sndyder&Hansln的抑菌土初步研究[J].棉花学报,1992,(2)[9]HamedK.Abbas，ChesterJ.Mirocha，W.ThomasShier.Isolation,identificationandbiologicalactivityofchlamydosporolfromFusariumculmorumHM-8[J].Mycopathologia,1992,118(2):115[10]邓小龙，颜继烂，李艳君，等.西瓜枯萎病的发生及防治[J].安徽农学通报,2011,17(8):115-116[11]J.P.Jones，J.W.Scott.EvaluationofFusariumwilt(race3)-toleranttomatolines[J].1987[12]M.KSmith，A.WWhiley，CSearle，等.MicropropagatedbananasaremoresusceptibletoFusariumwiltthanplantsgrownfromconventionalmaterial[J].AustralianJournalofAgriculturalResearch,1998,49(7):1133-1139[13]王全华，李景富，李永镐，等.黑龙江省番茄枯萎病菌生理小种鉴定[J].东北农业大学学报,1996,(4):354-357[14]刘波.尖孢镰刀菌生物学及其生物防治[M].科学出版社,2013,pp.77-77[15]戚佩坤.瓜类枯萎病菌专化型研究简介[J].华南农业大学学报,1995,(4):110-114[16]梁金兰，王守正.黄瓜枯萎病菌专化型鉴定及其防治研究[J].河南农业大学学报,1991,(3)[17]NIoannou，C.APoullis，J.BHeale.FusariumwiltofwatermeloninCyprusanditsmanagementwithsoilsolarizationcombinedwithfumigationorammoniumfertilizers[J].BulletinOepp/eppoBulletin,2000,30(2):223-230[18]X.PZhang，BRhodes.Inheritanceofresistancetoraces0,1,and2ofFusariumoxysporumf.sp.niveuminwatermelon(Citrullussp.PI296341)[J].Report-CucurbitGeneticsCooperative,1993[19]R.D.Martyn.AnAggressiveRaceofFusariumoxysporumf.sp.niveumNewtotheUnitedStates[J].PlantDisease,1985,69(11)[20]X.GZhou.Race3,anewandhighlyvirulentraceofFusariumoxysporumf.sp.niveum63 causingFusariumwiltinwatermelon[J].2010,94(1):92-98[21]DNetzer.PI296341,asourceofresistanceinwatermelontorace2ofFusariumoxysporumf.sp.niveum[J].PlantDisease,1989,73(6):518[22]李培夫.新疆陆地棉抗病育种现状及对策[J].西北农业学报,2000,9(2):128-131[23]C.Alabouvette.Researchontheresistanceofsoilstodiseases.IX.PopulationdynamicsofFusariumspp.andFusariumoxysporumf.sp.melonisinasoilresistanttoandasoilconducivetovascularFusariumdiseases[J].1984[24]王政逸，李德葆.尖孢镰刀菌的遗传多态性[J].植物病理学报,2000,30(3):193-199[25]周华众，李祥，刘慧.棉花枯萎病菌侵染棉籽途径的研究Ⅰ.从维管束系统侵染棉籽的途径[J].华中农业大学学报,1997,16(3):263-267[26]苗琛，尚富德，谷艳芳，等.黄瓜(CucumissativusL.)对枯萎病菌抗性超微结构的研究[J].河南大学学报(自然版),1997,(3):61-67[27]徐建华，苗琛.黄瓜感染枯萎病后病理组织学的研究[J].植物病理学报,1997,(4):349-352[28]王建明，郑经武，贺运春.西瓜枯萎病田间症状类型及侵染来源的研究[J].山西农业大学学报(自然科学版),1992,(4):352-354[29]JKandhari，SMajumder，BSen.ImpactofAspergillusnigerAN27ongrowthpromotionandsheathblightdiseasereductioninrice[J].InternationalRiceResearchNotes,2000[30]诸葛龙，胡金和，王汉荣，等.40%灭菌净增效作用与抗性治理研究[J].江西农业大学学报,2001,23(3):450-452[31]柳唐镜.绿亨一号(恶霉灵)防治西瓜枯萎病试验[J].广西植保,2001,14(1):32-33[32]徐宗刚，付学艳，李芳，等.菌线威对西瓜枯萎病的防治效果试验初报[J].中国瓜菜,2002,(4):16-16[33]朱昌雄，蒋细良，程洪坤，等.华光霉素制剂中有效助剂的筛选及其效果[J].中国生物防治学报,1999,15(3):104-107[34]陆致平.申嗪霉素防治设施西瓜枯萎病的研究与推广[J].第六届中国植物病害化学防治学术研讨会,2010[35]卢灿坤.83增抗剂防治西瓜枯萎病的药效试验[J].安徽农业科学,1999,(3):215-215[36]原国辉，李向英，高一凤，等.氯化苦熏蒸处理西瓜甜瓜重茬地试验初报[J].中国植保导刊,2001,21(3):16-16[37]张志忠，吕柳新，黄碧琦，等.西瓜枯萎病防治技术研究进展[J].中国蔬菜,2005,1(7):38-40[38]王万成.关于西瓜枯萎病及其综合防治的探讨[J].农家之友:理论版,2008,(6):8-10[39]周凤珍.西瓜枯萎病、炭疽病双抗鉴定筛选方法及其应用效果[J].农业新技术,1991,(2):30-32[40]戴祖云，杨坤.早熟,优质,抗枯萎病西瓜新品种——丰乐5号的选育[J].中国瓜菜,1998,(3):5-8[41]黄学森，张学炜.西瓜辐射诱变获无杈,轻抗枯萎病新种质[J].中国瓜菜,1995,(3):10-1164 [42]肖光辉.瓠瓜DNA直接导入西瓜抗枯萎病育种研究进展[J].湖南农业科学,2001,(5):43-45[43]丁建成，张其安，方凌，等.西瓜新品种抗枯萎病鉴定[J].中国瓜菜,2005,(6):27-29[44]于天祥，张明方.西瓜枯萎病研究进展[J].中国瓜菜,2004,(1):17-19[45]郑高飞.优良西瓜砧木──超丰F_1[J].农业科技通讯,1995,(1)[46]莫云彬，冯春梅，陈海平，等.冬春季大棚西瓜嫁接高产栽培技术研究[J].北方园艺,2005,(3):31-32[47]尹东亚.嫁接技术与药剂处理防治大棚西瓜枯萎病效果对比试验[J].现代农业科技,2005,(2):23-23[48]王毓洪，李林章，黄芸萍，等.不同砧木嫁接西瓜大棚栽培试验[J].安徽农学通报,2005,11(7):73-74[49]李必翠.西瓜枯萎病的发生特点及综合防治[J].现代农业科技,2004,(1):18-18[50]郑军.西瓜主要病害的防治[J].吉林农业,2007,(12):25-25[51]张悟民，方伯成，陈一杭，等.施肥与蔬菜、西瓜病虫害抗性关系研究[J].上海农业科技,1995,(5):29-33[52]储国良，吴汉章，于汉寿，等.西瓜专用药肥92-4应用效果及施用技术[J].江苏农业科学,1994,(6):47-49[53]A.K.Parida，A.B.Das，B.Mittra.EffectsofNaClStressontheStructure,PigmentComplexComposition,andPhotosyntheticActivityofMangroveBruguieraparvifloraChloroplasts[J].Photosynthetica,2003,41(2):191-200[54]HÖzaktan，TBora.BiologicalcontrolofFusariumoxysporumf.sp.melonisbytheformulationsoffluorescentpseudomonads[J].JournalofTurkishPhytopathology,2000[55]K.YLum，HKomada，KKiritani，等.BiologicalcontrolofplantdiseasesandvirusvectorsinMalaysia[C].1991[56]陈三凤，李季伦.作物根际和叶围中产几丁质酶微生物的分布及其抑制真菌作用[J].中国生物防治学报,1994,10(2):58-61[57]吴加志，ShlomoPleban.植物土传、根际和内生细菌用于植物病害生物防治潜力的研究[J].中国微生态学杂志,1996,(3):4-13[58]李敏，孟祥霞.AM真菌与西瓜枯萎病关系初探[J].植物病理学报,2000,(4):327-331.[59]严叔平.哈济木霉防治西瓜枯萎病试验初报[J].中国瓜菜,1999,(2):18-18[60]吴石平，燕嗣皇，陆德清，等.木霉菌与三唑酮配合对西瓜生长的影响和对枯萎病的防效[J].西南农业学报,2002,15(2):65-68[61]黎起秦，陈永宁，林纬，等.西瓜枯萎病生防细菌的筛选[J].基因组学与应用生物学,2000,19(2):81-84[62]蒋细良，谢德龄.中生菌素对真菌作用机理的研究[J].中国生物防治学报,1997,13(2):69-71[63]陈文俊.西瓜内生细菌JK-3菌株的种类鉴定及其拮抗机理的初步研究[D].扬州大学,2010[64]马艳，赵江涛，常志州，等.西瓜内生枯草芽孢杆菌BS211的拮抗活性及盆栽防效[J].65 江苏农业学报,2006,22(4):388-393[65]岳菊.西瓜枯萎病生防细菌筛选及其防治作用的研究[D].南京农业大学,2011[66]马利平，乔雄梧，高芬，等.防病促生枯萎病拮抗菌“98-Ⅰ”对4种枯萎病防治效果研究[J].中国生态农业学报,2005,13(1):91-94[67]李敏，刘润进，赵洪海.AM真菌和镰刀菌对西瓜根系几种酶活性的影响[J].菌物学报,2001,20(4):547-551[68]王守正，王海燕，李洪连，等.瓜类植物诱导抗病性研究[J].河南农业科学,2001,(10):28-30[69]张茹萍.烟草黑胫菌拮抗放线菌的筛选、鉴定及其生防效果研究[D].山东农业大学,2011[70]赵红杰.3株放线菌组合菌剂对西瓜枯萎病的防治[D].西北农林科技大学,2010[71]葛桂琴.酒泉地区西瓜枯萎病的发生与防治[J].现代农村科技,2011,(15):25-25[72]冀媛媛.SC11放线菌剂的研制及其复配菌剂对西瓜枯萎病的控制作用[D].西北农林科技大学,2011[73]申继忠.微生物农药剂型加工研究进展[J].中国生物防治学报,1998,14(3):129-133[74]S.T.Silveira，M.S.Oliveira，J.A.Costa，等.OptimizationofglucoamylaseproductionbyAspergillusnigerinsolid-statefermentation[J].AppliedBiochemistryandBiotechnology,2006,128(2):131-139[75]ChundakkaduKrishna.Solid-StateFermentationSystems—AnOverview[J].CriticalReviewsinBiotechnology,2005,25(1-2):1-30[76]徐福建，陈洪章，李佐虎.固态发酵工程研究进展[J].中国生物工程杂志,2002,22(1):44-48[77]吴振强.固态发酵技术与应用[M].化学工业出版社,2006[78]石礼森.禽畜粪便的基质化处理研究[D].郑州大学,2016[79]李亚兰，张建新.微生物肥料中有效活菌数检测方法[J].西北农业学报,1999,8(4):94-96[80]邓开英，凌宁，张鹏，等.专用生物有机肥对营养钵西瓜苗生长和根际微生物区系的影响[J].南京农业大学学报,2013,36(2):103-109[81]王玉.放线菌剂对连作番茄生理生态及土壤微环境的影响[D].西北农林科技大学,2012.[82]ElroyL.Rice.10–ChemicalNatureofAllelopathicAgents[J].Allelopathy,1984:266-291[83]FitzgeraldL.Booker，UdoBlum，EdwinL.Fiscus.Short-termEffectsofFerulicAcidonIonUptakeandWaterRelationsinCucumberSeedlings[J].JournalofExperimentalBotany,1992,43(5):649-655[84]AngelA.M.Hejl，FrankA.Einhellig，JamesA.Rasmussen.Effectsofjugloneongrowth,photosynthesis,andrespiration[J].JournalofChemicalEcology,1993,19(3):559-568[85]LMerlo，RGhisi，NRascio，等.Effectsofhumicsubstancesoncarbohydratemetabolismofmaizeleaves[J].CanadianJournalofPlantScience,1991,71(2):419-425[86]ShibuJose，AndrewR.Gillespie.Allelopathyinblackwalnut(JuglansnigraL.)alley66 cropping.II.Effectsofjugloneonhydroponicallygrowncorn(ZeamaysL.)andsoybean(GlycinemaxL.Merr.)growthandphysiology[J].PlantandSoil,1998,203(2):199-206[87]FrankA.Einhellig，JamesA.Rasmussen.Effectsofthreephenolicacidsonchlorophyllcontentandgrowthofsoybeanandgrainsorghumseedlings[J].JournalofChemicalEcology,1979,5(5):815-824[88]赵世杰，刘华山，董新纯.植物生理学试验指导[J].中国农业科学技术出版社,1998[89]凌宁.根际施用生物有机肥防控西瓜土传枯萎病效果及机理研究[D].南京农业大学,2012[90]李敏.AM真菌对西瓜抗枯萎病的效应及其机制[D].中国农业大学,2005[91]龙明华，于文进，唐小付，等.复合微生物肥料在无公害蔬菜栽培上的效应初报[J].中国蔬菜,2002,1(5):4-6[92]李阜棣，胡正嘉.跨越三个世纪的土壤微生物学[C].2001[93]陈秦.棉花连作障碍放线菌修复技术研究[D].西北农林科技大学,2010[94]BakkerPahm，A.W.Bakker，J.D.Marugg，等.BioassayforstudyingtheroleofsiderophoresinpotatogrowthstimulationbyPseudomonassppinshortpotatorotations[J].SoilBiology&Biochemistry,1987,19(19):443–449[95]王卿.西瓜枯萎病生防细菌的筛选及作用机制初步研究[D].南京师范大学,201367 68 个人简历、在学校期间发表的学术论文与研究成果1个人简历：杨洁，女，汉族，1991年9月10日出生于河南省新蔡县。本人于2014年6月毕业于河南省郑州大学信息工程学院计算机科学与技术生物信息方向，获得工学学士学位；于2017年6月毕业于河南省郑州大学生命科学学院生物工程专业，获得生物工程专业硕士学位。2发表文章：陈继峰,石礼森,刘洪源,杨洁等.鸡粪基质化生产有机肥的发酵剂筛选[J].贵州农业科学,2016,44(8):57-6069 70 致谢光阴似箭，岁月如梭，不知不觉间，我已在郑州大学里度过了七年的时光。七年，从本科到研究生，从青涩到成熟，都是人生中最精彩最重要的时光，尤其是读取硕士生的选择，让我有了不同的人生轨迹。首先我要感谢我的导师陈继峰老师，这三年来为我她倾注了大量汗水和心血，尤其是在论文的修改阶段，老师逐字逐句的修改，我很感动。导师不仅在学习上给予我重要的指导，同时在生活上、为人处事方面和意志品质方面导师也给予了谆谆教诲，老师非常注重细节，要做就要做到最好的态度时刻影响着我，经常鼓励我们做事要坚持、要学会追根究底等等，而这些教导在我今后的人生道路上也必将激励着我奋勇向前。同时还要感谢中国农业科学院郑州果树研究所的马双武和尚建立老师。马老师和尚老师都是非常朴素可亲的老师，在果树所做实验的过程中马老师和尚老师总是倾囊相授，特别是实验的设计以及实施过程中给予的指导和帮助，他们总是亲历亲为，不惧炎热在田间给我讲解，带我观察。还要感谢果树所的杨雪师姐和李楠楠师姐对我的帮助，使我的实验能够顺利完成。还要衷心的感谢实验平台王时征和韩绍印两位老师给予我实验器材上的帮助，他们管理实验平台的各种器材，有时需要使用一些仪器或我们操作中有不很明白的地方总是麻烦他们，对他们表示衷心感谢。感谢我的师姐孙会和师兄石礼森在实验过程给予我的指导帮助；感谢我的同学李远远对我工作和生活的关心和帮助；另外还要感谢研二的李贝贝师妹、郭瑞亮师弟，以及研一的师妹杨运真和张晓雨给予我实验上的帮助。感谢郑州大学给我提供一个这样的机会，三年的学习生活中，不但让我学习到了许许多多最前沿的知识，开阔了我的视野，也培养了我发现问题，解决问题的能力，在这里我和我的小伙伴们获得了成长。师姐弟之间的的相互帮助增进了我们之间的情谊，也留下了许多不可磨灭的美好回忆。三年的时光让我明白了很多，学到了很多，除了知识的丰富还有对于人生的理解，让我明白了困难并非不可战胜，有时候只是我们怕了，不敢去正面抗争。困难和失败的磨练，让我变的坚韧，使我懂得了成功的不易和可贵。在研究生生活中，得到了很多老师，同学的帮助，在这里，我要真诚的向大家道一声感谢。杨洁2017年4月71
