资源描述：
《胃浆膜下层与门静脉胰岛移植治疗糖尿病大鼠的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
单位代码：１０１６０分类号Ｓ３５９．２０１９８学号：２０１５２＠叫蜃科太ｆ碎硕士学位论文题目：胃浆膜下层与门静脉胰岛移植治疗糖尿病大鼠的实验研究ＥｘｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｏｎＴｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｐｙＤｉａｂｅｔｅｓｉｎＲａｔｓｗｉｔｈＧａｓｔｒｉｃＳｕｂｓｅｒｏｕｓａｎｄＰｏｒｔａｌＶｅｉｎＩｓｌｅｔＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ研究生：刘国涛导师：周丁华学科专业：外科学２０—论文课题起止时间１７年２２０１７年１０月：月论文完成时间：２０１８年３月 锦州医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果．据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料一同，与我工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处一，本人承担切相关责任。论文作者签名：日期：锦州医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解锦州医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属锦州医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为锦州医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为锦州医科大学５学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外、。），以采用影印缩印或其他手段保存论文论文作者签名：指导教师签名：（ 目录一、摘要中文论著摘要……………………………………………………………………1英文论著摘要……………………………………………………………………3二、英文缩略语………………………………………………………………………5三、论文前言………………………………………………………………………………6实验材料与方法…………………………………………………………………8实验结果…………………………………………………………………………14讨论………………………………………………………………………………18结论………………………………………………………………………………21四、本研究创新性的自我评价………………………………………………………23五、参考文献…………………………………………………………………………24六、附录综述………………………………………………………………………………27在学期间科研成绩………………………………………………………………39致谢………………………………………………………………………………40个人简历…………………………………………………………………………41 ·中文论著摘要·胃浆膜下层与门静脉胰岛移植治疗糖尿病大鼠的实验研究目的1.探讨胃浆膜下层作为胰岛移植部位的安全性及有效性；2.比较胃浆膜下层胰岛移植与门静脉胰岛移植治疗糖尿病大鼠的移植功效；3.寻找胰岛移植的最适宜部位。方法采用STZ诱导胰岛移植受体组大鼠1型糖尿病，随机将糖尿病大鼠分为胃浆膜下层胰岛移植组、门静脉胰岛移植组、对照组；经胆总管灌注胶原酶XI消化胰腺组织，分离、纯化胰岛；DTZ特性染色并计数胰岛当量及纯度，台盼蓝染色判断胰岛活性；同期分别将500IEQ大鼠胰岛移植入胃浆膜下层和门静脉，对照组输注等量RPMI1640液体，移植后分别检测大鼠的血糖浓度、腹腔葡萄糖耐量实验，评判胰岛功能。结果每只大鼠可获取胰岛数量为(310±42)个，DTZ染色示胰岛纯度(89±4.52)%；台盼蓝染色示胰岛活性良好(89.08±3.76)%；胰岛移植后胃浆膜下层组、门静脉组大鼠血糖较之前下降(P<0.05;P<0.05),与对照组平均血糖浓度相比有差异(P<0.05;P<0.05)；胃浆膜下层组与门静脉组胰岛移植后平均血糖浓度相比有差异(P<0.05)；胃浆膜下层组大鼠与门静脉组大鼠有效控制血糖有效天数分别为(18±1.87、11.6±2.5)天(P<0.05)。胃浆膜下层组与门静脉组腹腔葡萄糖耐量实验示糖耐受功能良好(P<0.05)。1 结论胃浆膜下层作为胰岛移植的部位是安全、有效的；短期时间内胃浆膜下层胰岛移植后比门静脉胰岛移植后控制血糖时间更长、效果更好；与门静脉胰岛移植相比胃浆膜下层胰岛移植安全性更高、操作也更简单，胃浆膜下层是胰岛移植最适宜的移植部位之一。关键词糖尿病大鼠；胰岛移植；胃浆膜下层；门静脉2 ·英文论著摘要·ExperimentalStudyonTreatmentofDiabetesinRatswithGastricSubserousandPortalVeinIsletTransplantationObjective1.Toinvestigatethesafetyandefficacyofthegastricsubserousasatransplantedisletssite2.Tocomparethetransplantedefficacyofgastricsubserousisletstransplantationandportalveinisletstransplantationinthetreatmentofdiabeticrats;3.Findthemostsuitablesiteforislettransplantation.MethodsSTZwasusedtoinducetype1diabetesmellitusinratswithislettransplantation.Thediabeticratswererandomlydividedintothreegroups:thegastricsubserousgroup,theportalveingroup,thecontrolgroup.TypeXIcollagenasewasinjectedthroughcholedochtodigestthepancreas,andtheisletswereisolatedandpurifiedbyislets.ThespecificityoftheisletwasjudgedbyDTZandcountedIEQandisletspurity.Theactivityofisletswasdeterminedbytrypanbluetest.500IEQfreshisletsweretransplantedintothegastricsubserousandintotheportalvein,respectively.ThecontrolgroupwasinfusedwiththesameamountofRPMI1640.Afterisletgraftinthediabeticrats,thechangesinbloodglucose,intraperitonealglucosetoleranceandassessmentthefunctionofislets.3 ResultThenumberofisletswas(310±42),andthepurityofislets(89±4.52)%wasobtainedbyDTZstainingandtheactivityofisletswas(89.08±3.76)%wasobtainedbyTrypanbluestaining.Theglucoselevelofinthegastricsubserousandportalveindiabeticratswassignificantlydecreasedcomparedwiththatbeforetransplantation(P<0.05;P<0.05).Thebloodglucosewasasignificantdifferencebythecontrolgroup(P<0.05;P<0.05).Therewasnosignificantdifferenceintheglucosebetweenthegastricsubserousandportalveinafterbloodglucosetransplantation(P<0.05).Theeffectivecontrolofbloodglucoseingastricsubserousandportalveinwas(18±1.87、11.6±2.5)days(P<0.05).Thegastricsubserousandportalveinratshadgoodintraperitonealglucosetolerance(P<0.05).ConclusionGastricsubserousasaislettransplantationsiteissafeandeffective;Short-term,thegastricsubserousislettransplantationtreatmentofdiabeticratseffectwashigherthanthatofportalvein.Comparedwithportalveinislettransplantation,theoperationofpancreaticislettransplantationismoresimpleandsafe,anditcanbeconsideredasoneofthemostsuitabletransplantsitesforislettransplantation.KeywordsDiabeticrats;Islettransplantation;Gastricsubserous;Portalvein4 ·英文缩略语表·英文缩写英文全称中文译名DMDiabetesMellitus糖尿病T1DMType1DiabetesMellitus1型糖尿病STZStreptozocin链脲佐菌素DTZDiphenylthiocarbazone双硫腙InstantBlood-mediatedInflammatoryIBMIR急性血液介导的炎症反应RespomeHydroxyethylPiperazineeth—AnesulfonicHEPES4-羟乙基哌嗪乙磺酸AcidHBSSHank'sBalancedSaltSolutionHank's平衡盐溶液IPGTTIntraperitonealGlucoseTolerance腹腔葡萄糖耐量实验AMAnteMeridiem上午MinMinute分钟IEQIsletEquivalent胰岛当量SCStemCells干细胞MSCMesenchymalStemCells间充质干细胞ESCEmbryonicStemCell胚胎干细胞5 ·论文·胃浆膜下层与门静脉胰岛移植治疗糖尿病大鼠的实验研究前言1型糖尿病(Type1DiabetesMellitus,T1DM)也称为自身免疫性糖尿病，是一种以胰腺β细胞损失为特征的胰岛素缺乏症，最终导致血糖升高的慢性疾病。这种类型的糖尿病(DiabetesMellitus,DM)最常见于儿童和青少年患者。据调查研究发现，在全球1.9亿名15岁以下的儿童当中，患有T1DM的儿童人数约有49万[4]人；在我国儿童当中，儿童患有T1DM的患病率为0.59/10万/年。随着经济的快速发展，长期的不健康饮食、肥胖和不良的生活习惯等，糖尿病的患病率及患病人数预计未来将会继续大幅增长。据估计，2015年在全球成年人当中患有糖尿[1、2]病的比例高达8.8％，全球几乎近4.147亿人口受糖尿病影响。随着DM发病率的逐年增加，如何治疗及防止DM的并发症的出现，已成为我们迫切需要解决的问题。外源性胰岛素的应用、定期的进行血糖监测和控制糖尿病患者的饮食是治疗所有T1DM的基本方法。虽然，皮下外源性胰岛素的注射疗法，能够有效的控制患者的血糖水平。但是，其仍然不能够达到正常的生理状态下的胰岛素分泌模式。皮下注射胰岛素也能够有效的缓解糖尿病并发症的发生发展，不幸的是应用胰岛素后突发低血糖事件的频率逐渐增多。胰岛素泵虽然能加强对患者血糖的控制，降低了低血糖事件的发生可能性，并且改善了继发性糖尿病并发症的进展。但是，[6]胰岛素泵仍然不能有效地治愈糖尿病。血糖水平如果长期无法得到有效控制，将引起一系列血管、神经系统损伤及视网膜病变等并发症，严重影响了患者的生活水平及生活质量。因此，治愈T1DM患者的关键方法是恢复DM患者体内的β6 细胞数量及功能，使其能够正常发挥作用。全胰腺移植和胰岛移植是能够恢复DM患者体内β细胞功能唯一的两种方法。虽然，从胰岛素分泌多少的量上全胰腺移植要比胰岛移植更多。但是，胰岛移植具有比全胰腺移植侵袭性更小的优点，并[7]可以纠正糖代谢并降低胰岛素抵抗。1972年Ballinger和Lacy通过化学物质诱导大鼠糖尿病中报道了的第一次胰岛分离和胰岛移植，成功的恢复了糖尿病大鼠[8]的正常血糖。Najarian和Sutherland首次在一名慢性胰腺炎患者体内成功的进行了胰岛移植，这名患者是因为顽固性疼痛及高血糖无法承受，对其进行了全胰腺的切除术，切除胰腺后对其进行分离、纯化得到一些正常的、高质量的胰岛，进行自体回输、移植，来阻止糖尿病的进一步发展。通过这次手术，证明了胰岛移植可以成为人们治疗由β细胞缺乏引起糖尿病方法之一。来自明尼苏达大学的Sutherland及其同事的对一名T1DM患者进行了第一次胰岛移植，由于当时技术、条件有限受移植患者没有获得胰岛素独立。1989年，胰岛移植取得了临床上的成功，但是恢复正常血糖的最长时间仅有1个月；直到2000年之前，胰岛移植后[9]胰岛素独立成功率仍低于10％。2000年，由Shapiro和同事发表研究称其治疗的7名T1DM患者通过胰岛移植后获得胰岛素独立时间持续1年。当时，由于这一案例的成功报道，世界各地在临床胰岛移植数量大大增加。移植的所在部位也会对移植后的降糖效果产生十分重要影响。1973年，[10]Kemp等人建立肝脏作为的胰岛移植的最适合位点。肝脏目前仍然是胰岛移植最常用的部位之一，因其能够使移植后的胰岛快速血管化和模拟胰岛素生理的传递[12]过程。然而，在最近的研究中发现，门静脉内胰岛移植后对其静脉血液中的葡[13]萄糖变化没有任何反应。在肝脏内，移植后的胰岛受到门静脉内的氧分压低、移植受体内的固有免疫反应比较强、患者自身的免疫系统对移植后的胰岛也会产生严重的排斥反应以及胰岛移植到门静脉在接触到血液后会很容易引起急性血液介导的炎症反应(InstantBlood-MediatedInflammatoryRespome，IBMIR)等多种因素的影响，这些影响因素都不利于胰岛移植后胰岛的存活。移植后的胰岛在移植早期会出现大量的损失，出现这种情况的最主要原因就是IBMIR。并且，使用门静脉内胰岛移植的移植方法，移植后的门静脉发生大出血和血栓形成等风险也很大。因此，随着对胰岛移植研究的逐渐深入，寻找胰岛移植最合适的移植位点，7 已经成为了胰岛移植是否成功的关键因素之一。最理想的移植位点不仅要尽量减少胰岛移植物与血液接触以防止IBMIR的发生，而且胰岛移植位点也要能够提供足够的氧合和营养物质。目前，对于利用胃浆膜下层的部位来作为胰岛移植的位点的报道相对较少。因此，在本次实验中，我们通过胃浆膜下层胰岛移植来判断胃浆膜下层作为胰岛移植部位的可行性、安全性及有效性；借此来比较胃浆膜下层和门静脉两部位的胰岛移植，观察其治疗大鼠糖尿病的效果；进一步来寻找胰岛移植更为适合的移植部位，为其在临床中应用提供实验和理论基础。8 实验材料与方法一、实验材料(一)实验动物8周龄SD雌性大鼠(体重150-200g)40只购于中国人民解放军军事医学科学院动物实验中心。实验室光照为12h昼夜交替，动物的饲养环境温度控制在25-28℃，相对湿度为45-60%，自由进水及摄食。(二)实验试剂试剂名称公司产地链脲佐菌素Sigma公司美国胶原酶XISigma公司美国Hanks液Sigma公司美国Ficoll400液GEHealthcare公司美国RPMI1640Sigma公司美国培养基双硫腙北京市国药集团化学试剂有限公司中国台盼蓝Sigma公司美国青霉素钠广东省殷健药业有限公司中国水合氯醛济南市嘉格生物科技有限公司中国无水氯化钙广东省西陇化工股份有限公司中国HEPES北京市经科宏达生物技术有限公司中国柠檬酸天津科密欧化学试剂有限公司中国柠檬酸钠北京惠宝联化科技有限公司中国(三)实验仪器仪器名称公司产地血糖仪强生公司中国超净台Hitachi公司日本9 低温离心机Sigma公司德国显微镜Olympus公司日本普通冰箱青岛市海尔股份有限公司中国电子天平上海市速展计量仪器有限公司中国电热恒温水上海市医疗器械厂中国浴箱可调式微量上海市麦尚科学仪器有限公司中国移液枪手术相关器械(手术刀、手术剪、精细上海市医疗器械厂中国组织剪、无损伤镊子、动脉夹等)非吸收丝线(6、4)、外山东省昂扬医疗科技有限公司中国科纱布敷料、棉签注射器(1ml、广东省龙心医疗器械有限公司中国2.5ml、5ml)EP管(0.2ml、深圳市良谊实验室仪器有限公司中国0.5ml)EP管(15ml、南京市贝登医疗股份有限公司中国50ml)不锈钢目(60上海市手术器械厂中国目孔)静脉输液针浙江省康德莱医疗器械股份有限公中国(头皮针)司10 (四)液体及试剂的配制1、STZ配制链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)粉末有毒，配制过程中需要带口罩和手套。(1)将2.1014g柠檬酸放入100ml无离子水中。(2)将2.9412g柠檬酸钠放入100ml无离子水中。在无菌条件下，根据实验要求配制比例为1:1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，调整缓冲的PH值在4.2-4.6之间。然后，根据本次实验制定的STZ55mg/kg标准,按照随机选取的大鼠体重，将200mgSTZ粉末溶于10ml柠檬酸钠缓冲液中，轻微振荡，使STZ粉末完全溶解。注意：STZ的配制需要现用现配，配制过程中及配制完成后都要将STZ溶液避光冷藏，所有配制完的STZ溶液必需在10min之内用完。2、DTZ的配制称取10mg的双硫腙(Diphenylthiocarbazone,DTZ)，将10mgDTZ溶于3ml的无菌的无水乙醇中，然后，向其中加入12ml的Hanks液，作为储存液，使用时按照1:100(PH7.8)的比例，使用Hanks液进行稀释，再使用0.22u孔径滤过膜进行过滤。然后，将其与胰岛混合后镜检。3、Ficoll配制称取Ficoll100g，向其加入250mlHanks液体中(不含Cacl2、NaHCO)，轻微搅拌，等待Ficoll全部溶解后，再向其中倒入Hanks液体，将Ficoll液体总量定容到400ml，此为25%Ficoll溶液。(1)25%Ficoll92ml+Hanks液8ml即为23%Ficoll；(2)25%Ficoll80ml+Hanks液20ml即为20%Ficoll；(3)25%Ficoll44ml+Hanks液56ml即为11%Ficoll。4、胶原酶的配制称取胶原酶XI100mg，无水氯化钙0.93g/L、HEPES2.39g/L、HBSS9.5g/L，向其中加入Hanks液体将总量定容到100ml，即胶原酶XI液体为1mg/ml，调试液11 体PH=7.8，使用0.22um过滤网将胶原酶XI过滤后备用(在常温4℃下进行保存)。二、实验方法(一)动物模型的建立随机选取8周龄的SD雌性大鼠18只，将挑选的SD大鼠禁食24h(不禁水)。在黑暗环境中，通过腹腔给药方法将STZ注射入胰岛移植受体大鼠的体内，将受体大鼠成功诱导为1型糖尿病大鼠。并于STZ注射后72小时，通过受体大鼠尾静脉采血来检测受体大鼠的非空腹血糖浓度，且连续5天在固定时间(9:00am-10:00am)内检测其血糖浓度。当胰岛移植受体大鼠的随机血糖或非空腹血糖浓度﹥16.7mmol/L，并出现多尿、多饮、多食、体重下降等糖尿病症状时，表明糖尿病大鼠造模成功。然后，按照随机数字表法，将糖尿病大鼠随机分为胃浆膜下层组(胃组)、门静脉组、对照组，每组各有6只糖尿病大鼠。(二)胰岛分离通过腹腔注射的方法将10%水合氯醛注射入胰岛供体大鼠腹腔，将麻醉后的供体大鼠仰卧位固定在手术板上。使用手术剪刀和手术刀片剔除供体大鼠腹部毛发，使用碘伏消毒供体大鼠的腹部皮肤。切开腹部，暴露胆总管。用动脉夹夹住胆总管上部及胆总管与十二指肠交汇处。5ml注射器接连头皮针针头逆行穿刺胆总管，胆总管穿刺成功后，用6号丝线固定住注射器针头。打开大鼠胸部，穿刺大鼠心脏，放血、处死大鼠。通过胆总管缓慢灌注1mg/ml胶原酶XI溶液4-5ml(如果灌注过程中有很大的阻力，小心不要破坏血管；如果酶开始流出管道，重定向管道/针头和/或重新调节夹具)。见胰腺充盈良好后(如图1A)，将胰腺组织完整切除，尽可能的去除胰腺周围的脂肪和淋巴组织。将切除后的胰腺组织放置在无菌的、冰冷的Hanks液中，将胰腺组织剪碎约1mm大小后移入到离心管中，放置于38℃水浴缸中消化20min，轻微振荡1min，见胰腺组织呈泥沙状，加入冷RPMI1640液体20ml终止消化。将离心管中的细胞悬液放入离心机中在4℃、1000r/min情况下离心5min(注意：离心机的标准加速度=9；减速度=9)，弃上清液；使用10ml移液管将沉淀组织移至15mlRPMI10％培养基中。使用10ml移液管将稀释后的沉淀组织溶液通过60目不锈钢丝网过滤到20ml烧杯中(将消化后12 未分解的胰腺组织使用14G注射器针头进行分解)，均匀的分配到15ml离心管中，放入离心机中，在4℃、1500r/min情况下离心2min，倒掉上清液，再次洗涤2次后，重复前一轮的操作。(三)胰岛纯化离心完成后，将离心管除沉淀组织以外的所有上清液倒掉，使用不连续密度梯度离心法的方法来纯化胰岛。首先，向离心管中加入25%Ficoll4ml与沉淀物混匀后(所有Ficoll溶液必需是室温)，依次添加23%Ficoll、20%Ficoll、11%Ficoll各2ml(所有的Ficoll溶液都必需非常缓慢地加入，并且不滴入溶液中，以避免层之间的混合)，在4℃、2000r/min情况下离心15min(标准加速度=5；减速度=2)。离心后，纯胰岛将会在20%Ficoll与23%Ficoll分界面上和23%Ficoll与25%Ficoll分界面上。小心吸出并倾倒11%Ficoll和20%Ficoll层的溶液。吸出20%Ficoll与23%Ficoll两层界面和23%Ficoll与25%Ficoll两层界面的胰岛环。纯化后的胰岛细胞通过冷RPMI1640液洗涤2次后，放入离心机中，在4℃、转速为1700rpm情况下进行离心(注意：离心机的加速度=5；减速度=2)，离心后吸出并弃去离心管中的上清液，将其移入到含有RPMI1640培养基中，备用。(四)胰岛细胞计数胰岛的特异性染色使用的是DTZ对其进行染色：吸取DTZ液体50ul与随机吸取的刚分离出来的胰岛100ul进行混合，混合5分钟后，在显微镜下观察并计数胰岛。在显微镜下，除胰岛细胞外其他组织或细胞均不着色，而胰岛被DTZ染成猩红色。胰岛细胞直径大于150μm为1个胰岛当量(IsletEquivalent，IEQ)。胰岛纯度(%)=(DTZ阳性细胞数/细胞总数)×100%。(五)胰岛活性测定判断分离、纯化后胰岛的活性本次实验是使用的是台盼蓝染色的方法。染色后，在显微镜下观察可见，正常的活的胰岛是不着色的，而死细胞或细胞膜不完整的胰岛被台盼蓝染成了蓝色。胰岛细胞成活率%﹦(细胞总数-死细胞数)/细胞总数×100%。13 (六)胰岛移植1、胰岛移植术前准备胰岛移植前2天给予糖尿病大鼠流质饮食，移植前1天对糖尿病大鼠禁食，但不禁止饮水。10%水合氯醛(300mg/kg)利用腹腔注射的方法将胰岛移植受体大鼠麻醉，大鼠取仰卧位固定大鼠四肢，术前常规剃除大鼠腹部毛发、消毒腹部皮肤。2、胃浆膜下层胰岛移植大鼠麻醉成功后，从RPMI1640培养基中，挑取500个直径大于150μm的胰岛，将其放入到含有RPMI1640液的0.2mlEP管中，等待胰岛自然下沉到EP管底部，备用。取大鼠上腹部中正切口，暴露大鼠胃远端，用无损伤组织镊固定胃远端，待胃节律性收缩后，选择胃浆膜下层胰岛移植适合的穿刺部位。用连有头皮针的1ml注射器从0.2mlEP管中抽取出胰岛，将乘有胰岛的1ml注射器针头，缓慢的穿刺进入胃浆膜下层，将注射器内乘有的胰岛全部注入到胃浆膜下层。穿刺、注射完毕后，拔出注射器针头，用干净无菌棉签按压穿刺部位2min，直到穿刺部位无液体渗出后，停止按压，逐层关闭大鼠腹腔。移植术后连续1周通过肌肉注射20万U青霉素钠，用来预防及控制感染。3、门静脉胰岛移植移植前挑选好500个直径大于150um的胰岛，备用。取糖尿病大鼠上腹部正中切口，打开胃结肠韧带，暴露门静脉及分支（肠系膜上静脉），将乘有胰岛细胞的1ml注射器针头，在靠近门静脉分支处，将注射器针头穿刺进入肠系膜上静脉，穿刺成功后，缓慢推注，注射完成后，缓慢拔出穿刺针头，拔出后用无菌棉签按压穿刺部位3min，直到穿刺部位无出血后，逐层关闭大鼠腹腔。移植术后连续1周通过肌肉注射20万U青霉素钠，用来预防及控制感染。4、对照组移植取大鼠上腹部正中切口，用无损伤镊子寻找胃远端并固定(或打开胃结肠韧带，暴露门静脉及其分支)，将相同体积的RPMI1640溶液注射到胃浆膜下层和门14 静脉，检查无液体渗出和出血后，逐层关闭大鼠腹腔。术后连续1周通过肌肉注射20万U青霉素钠，用来预防及控制感染。(七)胰岛移植术前及术后血糖监测移植前血糖监测：STZ造模后连续5天非空腹状态下监测糖尿病大鼠血糖浓度，求其平均值。移植后1周内在固定时间(8:00am-9:00am)每天监测大鼠血糖，以后每周3次监测血糖观察其血糖变化情况。胰岛移植成功的标准是移植后监测的大鼠的随机血糖或非空腹血糖的血糖水平≤11.1mmol/L；胰岛移植失败的标准是连续两次监测随机血糖或非空腹血糖其血糖水平＞11.1mmol/L。(八)腹腔葡萄糖耐量实验(IPGTT)于移植后的第10天行大鼠腹腔葡萄糖耐量实验(IntraperitonealGlucoseTolerance,IPGTT)：禁食12-18小时后测量大鼠血糖浓度。按照每只大鼠2g/kg的标准，给移植后的大鼠的腹腔内注射葡萄糖，并在注射后的第0、5、10、15、30、60、90和120分钟通过血糖仪监测其血糖浓度的变化情况。(九)统计学方法数据处理采用SPSS20.0统计软件，计量数据以均数±标准差(±s)表示，比较采用t检验或重复测量设计的方差分析，两两比较用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。15 结果一、实验动物分析门静脉组在胰岛移植穿刺的过程中，全部糖尿病大鼠均出现少量出血，经过压迫止血后，均出血停止。而胃浆膜组在移植穿刺过程中均未出现出血现象。移植后三组大鼠均存活，均未出现移植后的并发症。胃浆膜组大鼠移植过程平均需要(34.83±3.71)min，门静脉组大鼠移植的过程平均需要(46±6.197)min，采用t检验，差异有统计学意义(t=﹣3.787,P=0.004)，胃浆膜层组的移植时间要短与门静脉组。二、胰岛分离、纯化及活性判断分离、纯化后的胰岛呈圆形或椭圆形细胞团(如图1B)；DTZ染色后显微镜下观察胰岛呈猩红色，内含大量的粗糙颗粒(如图1C)；选取直径≥150μm胰岛，每只大鼠可以获取(310±42)个胰岛当量，纯度达(89±4.52)%。胰岛经台盼蓝染色后，可见胰岛周边被染成蓝色(如图1D)，胰岛存活率(89.08±3.76)%。16 图1.胰腺的灌注、分离、纯化、染色注：a图为经胆总管胶原酶XI灌注胰腺；b图分离纯化后胰岛×10；c图双硫腙染色后胰岛×10；d图台盼蓝染色后胰岛×10。三、胰岛移植后血糖变化情况胰岛移植后胃浆膜下层组和门静脉组糖尿病大鼠均在48h内血糖降至正常，采用t检验，差异具有统计学意义(胃组t=6.081,P=0.002；门组t=11.837,P=0.000)。胃浆膜下层组与门静脉组两组血糖分别在胰岛移植前及移植后相比，采用t检验方法，差异有统计学意义(胃组移植前、后t=6.406,P=0.000；门静脉组移植前、后t=7.086,P=0.000)，两组移植后血糖浓度均低于移植前。胃组与门静脉组糖尿病大鼠胰岛移植前1天、2天、3天、4天、5天平均血糖浓度相比，采用重复测量数据的方差分析，胃组与门静脉组平均血糖浓度无差异17 (F=0.047,P=0.83)(如表1)。对照组、胃组、门静脉组分别在胰岛移植术后1天、3天、5天、7天、11天、14天、18天、21天、25天、28天的非空腹监测血糖浓度进行比较，采用重复测量数据的方差分析，结果：①不同时间点胰岛移植后的平均血糖浓度有差异(F=162.8,P=0.000)；②对照组与胃组和门静脉组胰岛移植术后平均血糖浓度有差异(F=2546.79,P=0.000)，胃组和门静脉组胰岛移植后与对照组相比监测的平均血糖浓度低，相对的胃组和门静脉组胰岛移植后控制大鼠糖尿病血糖的功能较好；③对照组、胃组与门静脉组移植后平均血糖浓度变化趋势有差异(F=1591.21,P=0.000)(如表1，如图2)。对照组、胃组与门静脉组平均血糖浓度在胰岛移植后18、21、25、28时间点相比，采用两两比较LSD-t检验，18天时间点与21时间点、25时间点、28天时间点差异有统计学意义(均P=0.000)，21时间点、25时间点与28时间点平均血糖水平差异有统计学意义(均P=0.000)，门静脉组胰岛移植后的平均血糖浓度低于对照组；胃组胰岛移植后的平均血糖浓度低于门静脉组。胰岛移植后胃组与门静脉有效控制血糖时间分别为(18±1.87)天、(11.6±2.5)天，采用t检验，差异有统计学意义(t=4.571,P=0.002)，胃组比门静脉组控制血糖时间更长(如图3)。表1.对照组、胃组、门静脉组大鼠移植前、后平均血糖浓度比较(±s)。血糖单位（mmol/L）移植前移植后部位对照组24.7±0.6726.74±0.98胃浆膜组25.8±1.4611.35±4.89ac门静脉组25.74±1.1513.5±6.59abcF值13.532546.79P值0.0010.000注：a与移植前相比P<0.05;b与胃组相比P<0.05;c与对照组相比P<0.05。18 40胃浆膜组门静脉组）30对照组20mmol/L血10糖（01357111418212528天数（day）图2.对照组、胃组、门静脉组移植后平均血糖水平不同时间点变化趋势(±s)。图3：胃浆膜下层与门静脉移植后有效天数比较（±s）。四、糖尿病大鼠IPGTT胰岛移植后10天，三组糖尿病大鼠的IPGTT结果(如图4)。对照组、胃组与门静脉组在胰岛移植后10天进行在空腹状态下进行IPGTT分别于腹腔推注2g/kg葡萄糖后0分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟监测血糖变化进行比较，采用重复测量数据的方差分析，结果：①不同时间点胰岛移植后IPGTT的平均血糖浓度有差异(F=285.78,P=0.000)；②对照组与胃组和门静脉组胰岛移植后IPGTT的平均血糖浓度有差异19 (F=2131.67,P=0.000)，门静脉组和胃组IPGTT与对照组相比监测的平均血糖水平低，相对的门静脉组与胃组糖耐受功能较好；③对照组、胃组与门静脉组的IPGTT变化趋势有差异(F=835.73,P=0.000)(如图4)。对照组、门静脉组与胃组大鼠糖耐受功能在30时间点相比，两两比较采用LSD-t检验，差异有统计学意义均(P=0.000)，胃组糖耐受功能比对照组好；门静脉组糖耐受功能比胃组好。30胃浆膜组门静脉组）对照组20mmo10l/L血糖（0051015306090120时间（min）图4.对照组、胃浆膜组、门静脉组移植后腹腔葡萄糖耐量实验不同时间点变化趋势(±s)。20 讨论T1DM作为一种慢性疾病，其病变的主要原因是胰腺的β细胞功能丧失引起的结果。胰岛素治疗虽然能提高患者的生活质量，延缓DM并发症的发展。但是，注射胰岛素后发生的无意识的低血糖事件，依然对T1DM患者的生命健康构成致命威胁。尽管，目前加强了对T1DM患者的血糖监控与强化胰岛素治疗。但是，对糖尿病的并发症仍然无法完全预防。自1972年第一次胰岛移植成功以来，胰岛移植也给T1DM患者恢复正常血糖带来了希望。在2000年之前，临床胰岛移植一直进行，但受困于各种条件的影响，胰岛移植后的降糖效果并不是太理想。在有记录237例T1DM接受胰岛移植的患者中，仅有11%的患者实现胰岛素独[28]立>1年。2000年，Shapiro等研究称在其治疗的7名T1DM患者中，通过对他们施行胰岛移植术后，全部患者都实现了胰岛素的独立，时间大约有1年。而实现这一创举的有两个重要方面是：1.T1DM的患者至少要接受两次及以上的胰岛移植，通过增加移植的次数来提高移植后胰岛数量；2.患者必需使用无类固醇[29]免疫抑制剂联合达替珠单抗的治疗方案，接受移植后的进一步治疗。这就是胰岛移植历史上著名的“埃德蒙顿方案”。随着“埃德蒙顿方案”的提出，通过施行胰岛移植术来治疗T1DM在世界各地医学研究中心逐渐增加。胰岛移植后，患者可以在较短的时间内实现胰岛素的独立，这一时期内也不用胰岛素来维持血糖。但是，在移植后的第5年接受者中能继续保持胰岛素完全独立的人数依然很少。不过，胰岛移植后大多数T1DM的患者都可以免于“脆性”低血糖事件的影响，从而也提高了T1DM患者的生活质量。总的来说，在过去十五年间，胰岛移植领域在实现胰岛素独立以及降低低血糖事件的发生和糖尿病二次并发症方面取得了[16]重大进展。而这些临床上改善是隔离、植入和保存胰岛细胞团的结果。胰岛移植是否成功受多种因素的影响，不仅与胰岛高活性及高纯度有关，合适移植部位也成为其能否移植成功的重要因素之一。因此，合适移植部位要在手术移植过程中简单方便、便于活检的时候取材，更重要的是移植后出现的并发症要少，而且该部位移植后的存活率及成功率都要要求很高。目前，胰岛移植的常[11、17、18]用的部位有门静脉、肾包膜、腹膜、网膜、骨骼肌、皮下组织、和脾等。通过门静脉移植到肝脏直到现在一直是胰岛移植最常用的移植部位。但是，研究21 [19、20、21]发现其并不是胰岛移植最理想的移植部位。肝脏对于包含可变氧的胰岛呈现不稳定的环境和血管生成活性，肝脏餐后高血糖可能影响胰腺β细胞。移植后的胰岛进入到肝脏后分泌的胰岛素和胰高血糖素是通过进入全身的静脉系统发挥作用，而不是仅仅在门静脉内发挥着作用。因为，门静脉血管内的氧气含量低、血液中的血糖水平较高，并且移植后胰岛接触血液后易引发IBMIR且移植后的胰岛也容易引起门静脉或肝血管栓塞，当栓塞阻滞门静脉血流时，易引起发生缺氧和周围肝组织破坏，这些都是影响胰岛存活的重要因素，是移植前期胰岛丧失的[22、23]主要原因。根据研究发现，在胰岛移植的早期阶段胰岛细胞的损失数量达[30]70%。这种情况的出现，可以通过门静脉移植后的IBMIR来解释，这种反应也[31、32]被归因于激活的血小板、补体和细胞因子而导致的。目前，肾包膜下也是移植实验过程中较为常用的部位。虽然较为常用，也有一些缺点：无法提供充足的血液、氧合及营养物质的供应。但是，肾包膜下移植在动物身上操作的过程较为简单、移植后发生免疫排斥反应的情况也较少、移植后的成活率也很高，并且胰岛移植后其发挥作用的速度较快等优点。但是，其在人的临床应用过程操作困难，[27]且移植效果差。脾脏虽然提供了类似于胰腺的环境天然的移植小岛。但是，脾脏部位的移植操作过程复杂、困难，稍有不慎就会引起大出血。并且，在移植后容易引起脾梗塞和门静脉血栓形成等并发症也限制了其应用。所以，脾脏也不能作为胰岛移植部位的最理想的位点。腹膜和网膜部位适用于移植未纯化的自体胰岛。此外，网膜上具有丰富的血液循环，有多条大的血管的存在，这对移植后胰岛能很快的发挥作用也起到营养支持的作用。然而，实际上却需要大量胰岛来逆转转高血糖症状。肌肉也被用于胰岛移植的部位，肌肉组织血液丰富、养分供应充足适合应用于胰岛移植。但是，胰岛移植后移植物的纤维化和坏死，导致移植后血糖控制效果较差。移植后，胰岛能否快速恢复到未移植时的血运对其成活及发挥降糖作用将产生很大的影响。胰岛细胞死亡和移植物早期衰竭可能是由于血液中的氧气和营养物质被剥夺而导致的，因为，此时的胰岛无法快速恢复血运重建不足或恢复延迟。密集的血管网络、血液经门静脉回流入肝、与胰腺具有相同的胚胎源性，且便于[24、25、26]移植，这些条件都证明胃这一器官将会成为胰岛移植的理想替代部位，且22 移植进入胃浆膜层后也可以有效的避免门静脉胰岛移植出现的风险。胃浆膜下层具有丰富的氧分及营养物质，能够促进胰岛细胞在胃浆膜下层定植与生长。猪内[34]镜下胃粘膜下层胰岛移植，目前正在临床试验中，已经显示出很好的结果。此[33]外，Caiazzo等也证明胃粘膜下层移植自体胰岛的功能比在肾囊中更好。通过本次实验探讨胃浆膜下层胰岛移植的安全性及有效性，并且与通过门静脉移植到肝脏的胰岛的治疗糖尿病大鼠的效果进行比较。在本实验中，门静脉组大鼠在移植穿刺过程中均出现出血的情况，这可能与糖尿病大鼠的门静脉血管压力增高有密切关系。虽然，胃浆膜下层在移植时或移植后给移植受体带来的并发症要小于门静脉胰岛移植。但是，胃浆膜下层移植后也存在胃穿孔、感染等潜在风险。胃浆膜组的移植时间要短于门静脉组胰岛移植时间，在移植的过程中，胃浆膜组的移植视野要比门静脉组移植视野更广，胃浆膜组也要比门静脉组胰岛移植过程更为简单、方便。通过研究发现胰岛移植后两组大鼠血糖均在48h内降至正常，胰岛移植后胃浆膜下层与门静脉的平均血糖浓度明显低于对照组。胰岛移植后，两组的平均血糖浓度，均较移植前下降。胰岛移植后前12天两组糖尿病大鼠的血糖一直维持在正常值范围之内；胃浆膜下层组和门静脉组两组糖尿病大鼠在胰岛移植后21、14天时间点平均血糖浓度开始升高，表明移植后的胰岛功能正在开始逐渐减退；门静脉胰岛移植部位在移植后14天平均血糖说开始升高，较胃浆膜下层胰岛移植部位血糖升高时间更早，从中可以得出胃浆膜下层胰岛移植的效果要优于门静脉移植；胃浆膜下层的胰岛移植后维持糖尿病大鼠的正常血糖值范围的天数为(18±1.87)天，而门静脉胰岛移植组的维持大鼠糖尿病的正常血糖值范围的天数为(11.6±2.5)天，此时胃浆膜下层胰岛移植血糖的有效控制时间要远比门静脉移植有效控制时间更长。两组均选用的普通SD大鼠，胰岛移植术后未应用任何的免疫药物，这可能是导致胰岛移植后移植治疗效果低下、两组糖尿病大鼠移植效果不同的重要原因之一。IPGTT表明：胰岛移植后两组大鼠早期的糖耐受功能良好，与对照组相比有明显差异。虽然，胰岛移植能有效的降低T1DM患者的血糖水平，也有望从根本上能够彻底治愈糖尿病。但是，胰岛移植也面临许多挑战：(1)在分离的胰岛的情况下移[15]植后的移植物丢失，(2)供体缺乏和(3)移植后的免疫抑制。2000年，埃德蒙顿23 方案提出的免疫抑制方案包括西罗莫司、低剂量他克莫司和达替珠单抗(抗CD25)[14]诱导。不幸的是，使用埃德蒙顿方案的移植患者随着内分泌功能逐渐下降，在[5]移植后5年接受胰岛移植的患者中实现胰岛素独立率下降到10％。2012年，[3]Bellin等通过另一种免疫抑制方案T细胞消耗性抗体(阿仑单抗和ATG)结合肿瘤坏死因子(TNF)-β抑制或单独的CD3抗体的抗簇用于胰岛移植后免疫排斥治疗，发现移植后5年50％的患者仍然保持胰岛素独立，2例患者在10年内仍然独立。目前使用较新的方案的是使用依法珠单抗和贝伐他汀，目的是为了改善胰岛移植物存活。因此，使用高效的免疫抑制剂不仅能够延长胰岛移植物的生存期间，而且也能有效的避免移植后相应并发症的出现。但是，在这次实验中我们没用采用任何一种的免疫抑制药，来预防免疫排斥。24 结论本次实验研究证实移植后的胰岛能够在糖尿病大鼠的胃浆膜下层存活，能够有效的降低大鼠糖尿病的血糖，且胃浆膜下层胰岛移植比门静脉胰岛移植操作更简单、安全性更高。既能防止像门静脉胰岛移植过程中出现的大量出血、血栓形成的风险，又能避免移植后立即出现的IBMIR。同时，胃大部分在腹腔内无其他组织的遮盖，也可以通过微创技术进行胃浆膜下层的胰岛移植。在本次实验中，从维持糖尿病大鼠正常血糖范围的天数来看，胃浆膜下层移植效果更好，也有望替代肝脏成为胰岛移植更合适的部位。两组糖尿病大鼠都是采用的同种异体的移植方法，移植后均未采用任何的免疫抑制药物。如果使用了免疫抑制药物的情况下，两组部位的糖尿病大鼠的降糖作用及大鼠维持正常血糖的天数如何？还需要进一步的研究加一证实。本次实验只涉及两个部位且样本数量太少，存在很多不足之处。还需要进一步的研究来证实。25 ·本研究创新型的自我评价·外源性胰岛素的应用虽然能够减缓其慢性并发症的进展，但不能够彻底治愈糖尿病。虽然，胰腺移植能让T1DM患者恢复到正常的血糖，但是，它将给接受者带来更大的创伤性。因此，选择一种侵袭力小且能快速恢复患者的糖代谢功能的方法很重要。胰岛移植不仅能够快速的恢复到正常血糖，且侵袭性小，成为了能够治愈T1DM的重要方法。通过门静脉将胰岛移植入肝脏依然是目前在临床和实验中应用最多的移植方法，移植后发生的出血、血栓形成及IBMIR等证明门静脉移植并不是最佳的移植部位。胃浆膜下层具有氧分充足、营养物质丰富和毛细血管多等优点。在本次实验中发现，移植后胃浆膜下层能够快速的降低大鼠血糖，且比门静脉移植维持的正常的血糖时间更长。同时也证明胃浆膜下层比门静脉更能够适合作为胰岛移植的部位。胃浆膜下层作为移植的位点有望成为的最理想部位之一。26 ·参考文献·1ShukKeiCheng,ElisseYPark,AndjelaPehar,etal.Currentprogressofhumantrialsusingstemcelltherapyasatreatmentfordiabetesmellitus.AmJStemCells,2016,5(3):74-86.2FernandaZamboni,MauriceN.Collins.Cellbasedtherapeuticsintype1diabetesmellitus.InternationalJournalofPharmaceutics,2017,521:346–356.3BellinMD,BartonFB,HeitmanA,etal.Potentinductionimmunotherapypromoteslong-terminsulinindependenceafterislettransplantationintype1diabetes.AmJTransplant,2012,12(6):1576–1583.4陶桂香,徐洋.1型糖尿病发病机制及治疗研究.中国免疫学杂志,2015,10:1297-1303.5RyanEA,PatyBW,SeniorPA,etal.Five-yearfollow-upafterclinicalislettransplantation.Diabetes,2005,54:2060–2069.6MichaelMcCall,A.M.JamesShapiro.Isletcelltransplantation.SeminarsinPediatricSurgery,2014,23:83–90.7BallingerWF,LacyPE.Transplantationofintactpancreaticisletsinrats.Surgery,1972,72:175–1868NajarianJS,SutherlandDE,BaumgartnerD,etal.Totalorneartotalpancreatectomyandisletautotransplantationfortreatmentofchronicpancreatitis.AnnSurg,1980,192:526–542.9BetulHatipoglu.IsletCellTransplantationandAlternativeTherapies.EndocrinolMetabClinNAm,2016,45:923–93110KempCB,KnightMJ,ScharpDW,etal.Effectoftransplantationsiteontheresultsofpancreaticisletisograftsindiabeticrats.Diabetologia,1973,9:486–491.11Hyoung-IlKim,JaeEunYu,Chung-GyuPark,etal.ComparisonofFourPancreaticIsletImplantationSites.JKoreanMedSci,2010,25:203-210.12PiemontiL,GuidottiLG,BattagliaM.Modulationofearlyinflammatoryreactionstopromoteengraftmentandfunctionoftransplantedpancreaticisletsinautoimmune27 diabetes.AdvExpMedBiol,2010,654:725-747.13PerezVL,CaicedoA,BermanDM,etal.Theanteriorchamberoftheeyeasaclinicaltransplantationsiteforthetreatmentofdiabetes:astudyinababoonmodelofdiabetes.Diabetologia,2011,54(5):1121-1126.14ShapiroAM,LakeyJR,RyanEA,etal.Islettransplantationinsevenpatientswithtype1diabetesmellitususingaglucocorticoid-freeimmunosuppressiveregimen.NEnglJMed,2000,343:230–238.15YasamanAghazadeh,MariaCristinaNostro.CellTherapyforType1Diabetes:CurrentandFutureStrategies.CurrDiabRep,2017:17:37.16AaronJAhearn,JustinRParekh,AndrewMPosselt.IslettransplantationforType1diabetes:wherearewenow?ExpertRev.ClinImmunol,2014:1–10.17PerezVL,CaicedoA,BermanDM,etal.Theanteriorchamberoftheeyeasaclinicaltransplantationsiteforthetreatmentofdiabetes:astudyinababoonmodelofdiabetes.Diabetologia,2011,54(5):1121-1126.18RajabA.Islettransplantation:alternativesites.CurrDiabRep,2010,10(5):332-337.19NaziruddinB,IwahashiS,KanakMA,etal.Evidenceforinstantblood-mediatedinflammatoryreactioninclinicalautologousislettransplantation.AmJTransplant,2014,14(2):428-43720ContrerasJL.Extrahepatictransplantsitesforisletxenotransplantation.Xenotransplantation,2008,15(2):99-101.21NaziruddinB,IwahashiS,KanakMA,etal.Evidenceforinstantblood-mediatedinflammatoryreactioninclinicalautologousislettransplantation.AmJTransplant,2014,149(2):428-437.22HwangJW,JungHS,LeeDY.InhibitionofplateletadhesionontointrahepaticallytransplantedisletsusingPE-Gylationforattenuatinginstantblood-mediatedinflammatoryreaction(IBMIR).JControlRelease,2011,152(1):213-214.23AndreObenaus,JohnMace,RicardoLPeverini,etal.Efficacycomparisonbetweenintraportalandsubcapsularislettransplantsinamurinediabeticmodel.28 TransplantationProceeding,2009,41(1):346-349.24Zhu-zengYIN,Shu-senWANG,QiangLI,etal.Gastricsubmucosaisinferiortotheliverastransplantsiteforautologousislettransplantationinpancreatectomizeddiabeticbeagles.JHuazhongUnivSciTechnol,2016,36(4):529-533.25XinnongLiu,JinhangZhang,YangLi,etal.Gastricsubserousspaceislettransplantation:techniquesandinitialresultsindiabeticinbredlewisrats.AnnTransplant,2014,19:331-336.26LacknerC,OffnerF,NizzeH.Smallintestine,pancreasandisletcelltransplantation.Patholge,2011,32(2):135-143.27尹注增,刘荣.胰岛移植部位的选择及优缺点.实用器官移植电子杂志,2016,6(4):355-358.28ChristianSchuetz,JamesF.Markmann.Isletcelltransplant:Updateoncurrentclinicaltrials.CurrTransplantRep,2016,3(3):254–263.29AvinashAgarwal,KennethL.Brayman.UpdateonIsletCellTransplantationforType1Diabetes.SeminInterventRadiol,2012,29:90–98.30EichT.Visualizationofearlyengraftmentinclinicalislettransplantationbypositron-emissiontomography.TheNewEnglandjournalofmedicine,2007,356:2754–2755.31BennetW.Isolatedhumanisletstriggeraninstantbloodmediatedinflammatoryreaction:implicationsforintraportalislettransplantationasatreatmentforpatientswithtype1diabetes.UpsJMedSci,2000,105:125–33.32MobergL.Productionoftissuefactorbypancreaticisletcellsasatriggerofdetrimentalthromboticreactionsinclinicalislettransplantation.Lancet,2002,360:2039–45.33CaiazzoR,GmyrV,HubertT,etal.Evaluationofalternativesitesforislettransplantationintheminipig:interestandlimitsofthegastricsubmucosa.TransplantProc,2007,39(8):2620-2623.34TanakaT,FujitaM,BottinoR,etal.Endoscopicbiopsyofislettransplantsinthegastricsubmucosalspaceprovidesevidenceofisletgraftrejectionindiabetic29 pigs.Islets,2016,8(1):1-12.30 ·附录·一、文献综述T1DM治疗的回顾与展望1型糖尿病(T1DM)主要是由于胰腺β细胞自身免疫破坏，引起患者体内胰岛素的严重的分泌不足，而导致的患者体内胰岛素完全缺乏一种慢性疾病。根据调查发现，全球大约有4.15亿的人口患有DM，预计到2040年DM的患病人数将[1][2]达到6.42亿。2014年，Hilal-Dandan等研究发现所有糖尿病患者中有5％为T1DM。迄今为止，对于T1DM治疗尚没有一种药物能够彻底将其治愈。虽然，外源性胰岛素的应用减缓了T1DM的疾病发展，也提高了T1DM患者的生活质量。但是，其仍然不能够有效控制住DM患者微血管、大血管等并发症的发生进展(如心脏病、视网膜病变、神经病变和肾病等)。有时，T1DM患者还会受到严重或致命低血糖事件的影响。如何治愈T1DM及防止其并发症的产生与发展，已经成为当下急需解决的一个难题。胰岛细胞移植可以通过替代已破坏的β细胞来恢复患者体内的β细胞的功能，维持DM的正常血糖水平。胰岛移植也逐渐的成为各国研究人员进行研究和治疗DM的重点。目前，应用干细胞移植来纠正T1DM患者体内的糖代谢功能紊乱治疗DM，也成为各国研究的热点之一。本文将对胰岛移植、异种移植以及干细胞衍生的β细胞及免疫抑制治疗T1DM的最新及既往的治疗方式展开论述分析。(一)胰岛细胞移植治疗T1DM1、胰岛细胞自体移植[5]胰岛细胞自体移植的主要适应症包括慢性胰腺炎伴有顽固性腹痛者、胰腺良性肿瘤或者胰腺的良性肿瘤术后引流失败行全胰腺切除术后所导致的外科源性的DM。胰腺大部分切除术后可能导致术后DM，这就为用胰岛自体移植治疗方法来恢复DM患者正常血糖提供了可能。1977年，世界上成功的进行了首例全胰腺31 切除术联合自体胰岛细胞移植术。自1995年以来，多个医疗中心相继报道了全[9]胰切除术后进行自体胰岛移植，且治疗效果显著。如何缓解顽固性腹痛及维持胰岛移植术后正常血糖，对于全胰腺切除联合胰岛细胞自体移植患者是非常重要的。通过研究发现，胰岛细胞自体移植后5年时仅有46％患者是仍然保持着胰岛素独立，移植后10年仅有28％。导致这种情况发生原因可能是由于慢性胰腺炎导致胰腺组织广泛的纤维化、胰腺组织在消化的过程中消化不完全，导致胰岛的质量在纯化后大大降低，这也会对移植的效果产生影响。自体胰岛移植的基本原理是保持β细胞群体和胰岛素分泌能力，以防止接受总TP或接近TP的患者避免出现术后糖尿病及彻底缓解慢性胰腺炎带来的疼痛。2、同种异体胰岛移植治疗T1DM1977年，世界上第一例临床异体胰岛移植手术在美国完成。在1990年至2000[10]年的10年间，Warnock等人对267个T1DM的患者进行了胰岛移植手术，而在这267例移植的接受者中，仅有8.2％在1年后仍然保持胰岛素独立性。在2000年，Scharp等人制定了“埃德蒙顿”移植方案，其7例接受胰岛移植患者中全部都在术后1年保持胰岛素独立。“埃德蒙顿”方案通过实施减少同种异体免疫反应性并改善胰岛存活和功能的方法，彻底改变了胰岛移植领域。通过这种新颖的方[8]案，也证明在大量胰岛移植后大多数患者是可以实现胰岛素的独立性，长期维持胰岛素的产生。同时也证实，这种方案不仅可以提供稳定的血糖水平还能使糖化血红蛋白(HbA1c)水平正常化，不需要通过外源性胰岛素治疗来实现。尽管胰岛移植后1年，大多数接受者的胰岛素的独立性不能持续，但残留胰岛功能使患者DM症状明显好于治疗前，并且不受严重的低血糖事件困扰。“埃德蒙顿”方案与之前的胰岛移植方案相比，在胰岛制备和移植之间的时间更短、使用的胰岛数量更多(每个受体平均2-3个供体胰岛)、使用不含有类固醇的免疫抑制剂方案。但是，[11]同种异体的胰岛移植方式也面临的着许多问题：在分离的胰岛的情况下移植后的移植物丢失；供体缺乏和移植后的免疫抑制。同时，同种异体移植后所面临的同种异体免疫抑制和自身免疫抑制等问题是影响胰岛移植能否成功的关键。如何解决好上述问题一直是我们面临的难题。随着胰腺组织消化、纯化过程的改进和免疫治疗方案的改逐步提高。在1999〜2010年677例胰岛移植后分析发现，胰32 [17]岛移植的治疗效果和安全性正稳步提升。在胰岛移植后3年，胰岛素独立率也[18]从1999-2003年的27％上升到2007-2010年的44％。最近，英国首次进行了胰岛移植，在胰岛移植输注后2年内80％的移植患者中实现了胰岛素独立，大幅度减少了严重的低血糖事件，70%的接受胰岛移植患者HbA1C<7.0％；Lille[3]研究团队和瑞士-法国GRAGIL研究团队在胰岛移植后5年，患者体内的胰岛素独立率分别达到了50％和75％。由于胰岛供体严重缺乏，影响了其在临床应用。目前许多研究中心旨在寻找β细胞来源的方法，特别是异源胰岛，永生化β细胞系和能够分化成产生胰岛素的β细胞的干细胞。3、异种胰岛移植治疗T1DM由于人胰岛移植供体的不足，使用源自其他物种的胰岛用于T1DM治疗的研究受到广泛关注。其他物种可以提供胰岛移植治疗所需的大量胰岛。猪胰岛细胞[14][12]被认为是最适合人类的。通过研究发现猪作为供体的来源具有下列优点：两者的功能十分的相似，二者仅有一个氨基酸不同；猪胰岛可以调节相同生理的人类葡萄糖水平；可以通过人为的因素纯化出高质量、高产量的胰岛；猪胰岛素可以被遗传修饰，使其更适合人类。通过研究证实猪胰岛异种移植，不仅可以降低糖尿病低哺乳动物如啮齿类动物高血糖，还可以降低灵长类动物高血糖。胎儿或新生儿或成年猪都被考虑用于胰岛移植的组织供体，新生儿猪更可靠，更容易从[22][13]全胰腺中提取最后在胶囊内长时间保持活力。Groth等人在1994年首次进行了异种胰岛移植临床试验，尽管移植后患者的临床益处几乎没有被检测到。但是，[1]也证明了T1DM患者在移植胎儿猪胰岛样细胞簇后猪胰腺内分泌组织可以在人类中存活的证据。但是，有两个主要问题可限制猪胰岛的使用：(1)超急性免疫排[15]斥的风险，因为人类具有与半乳糖-1,3,3-半乳糖(Gal)，在细胞上表达的糖类具有天然预先形成的抗体较低的哺乳动物，而不是人或猴的细胞；(2)人畜共患病的[16]风险，猪内源性逆转录病毒(PERV)序列具有潜在的导致人类细胞被感染病毒的风险，并可能在异种移植后被激活。为了防止异种移植物的排斥，已经使用封装[8]装置来防止猪细胞表面抗原产生的免疫应答。封装也可以提供保护免受外源性侵害。藻酸盐微胶囊是最常用的封装技术，其可以有效防止疾病传播和免疫抑制。首次封装技术应用发现受试者没有发现炎症或纤维化的迹象，没有猪内源性逆转33 录病毒感染，且移植患者的日常胰岛素剂量和HbA1c水平降低。而移植后9年证实微胶囊内胰岛在进行葡糖糖刺激实验时仍然可产生胰岛素。表明微胶囊内可以保持胰岛数十年的活性，而且还能防止病毒与微生物的传播。也证实了封装系统在这方面应用的安全。除了封装之外，研究人员也尝试通过遗传修饰供体胰岛来防止它们引起免疫[8]应答。通过在猪中敲除半乳糖基转移酶异种野毒素基因GalT，来保护猪胰岛免受IBMIR影响。敲除基因猪与野生型猪相比两者葡萄糖代谢功能并无太大差异。最近，通过使用由胰岛素启动子驱动的特异性靶向胰岛β细胞(例如GTKO/hCD46/pCTLA4-IgIns/TFPIIns/hCD39Ins)的转基因表达来对猪进行多种遗传[20][21]修饰。通过研究发现STZ诱导的糖尿病猪接受成年GTKO/hCD46/hTFPIIns/pCTLA4-IgIns或GTKO/hCD46/hCD39Ins/hTFPIIns/pCTLA4-Ig，猪出现IBMIR和早期胰岛损失减少，胰岛移植物功能长期存在，其维持正常血糖达1年。(二)干细胞移植治疗T1DM干细胞(StemCells,SCs)具有分化成为身体内其他细胞能力，对一些因细胞的病变引起的疾病的治疗提供了可能。这些基于细胞疗法主要目标是降低免疫系统并且废除或至少停止这些细胞的自身免疫破坏的过程。另一目标是产生SC并将其分化为功能性胰岛素分泌的β细胞/β样细胞以治疗T1DM。SC是指具有分化成多种特殊细胞类型的未分化细胞，以及其在保持自我更新的同时要经历许多次[1]细胞分裂循环的能力。应用SC治疗T1DM的目的是希望SC能够分化出能无限分泌胰岛素的β细胞。SC治疗T1DM的主要目的是实现稳定的、正常的血糖控制和不存在严重的低血糖发作，从而改善生活质量，预防长期的糖尿病并发症和减少免疫抑制相关的副作用。SC的再生功能和免疫调节功能都展示出了它在治愈T1DM方面的潜力。它不仅可以通过免疫调节特性来阻止β细胞的破坏，保留残留的β细胞团，促进内源性β细胞再生；也可以降低移植后的排斥反应，预防DM的再次发作；还可以利用再生能力来提供用于移植的葡萄糖反应性ISCs的自[24][24]我补充。通过研究证实了SCs在β细胞的再生潜能和恢复免疫稳定及促进胰岛移植存活能力。首次尝试集中于成体干细胞，因为许多组织提供了能够分泌分34 化成胰腺β样细胞的祖细胞的可能性。1、胚胎干细胞胚胎干细胞(EmbryonicStemCell,ESC)自身具有的自我更新能力和可以分化为体内任何细胞的潜力，被认为是在细胞替代治疗的领域中最为理想的细胞来[25]源。2000年索里亚等人通过遗传修饰成功地从小鼠ESC产生胰岛细胞，并且还证明了持续数月的高血糖症状的改善。Odorico等报道发现，ESC可以区分和表达胰岛素基因。在未来，人胚胎干细胞(hESCs)衍生的新的β细胞的产生可能提供这些细胞的无限来源，用于移植到T1DM患者中。Novocell是一家专注于DM的临床前期干细胞工程公司，于2010年将其名称改为ViaCyte，开发了人体ESC分化为β[22]细胞的分化方案，沿体内胰脏器官发生的方式设计。该方案使ESC能够逐步分化成定型内胚层(DE)、胰腺祖细胞(PP)和产生胰岛素的β样细胞(BLC)。在ESC中，一些胰腺转录因子(TFs)如Pdx1、MafA、Neurod1、Neurog3和Pax4的强制表达是一种有效的方法。虽然这种方法尚未产生有效的差异化协议，它却为“细[22]胞命运工程”的概念向β细胞状态提供了原则证明。这些分子，例如CHIR(Wnt信号传导的激活剂，DE阶段)或SANT1(Sonichedgehog信号传导抑制剂，PP阶段)，试图在体外生产高效的hESC衍生的功能性BLC(hESC-BLC)，增加与扩[27、28]展了原发性人β细胞相似性的hESC-BLCs的生成。与以前的报告相比，这些细胞移植后能够更快的改善糖尿病模型小鼠的糖尿病症状。尽管对hESC-BLCs生产的研究仍在继续。但是，其面临的免疫原性挑战仍然是一个重要问题。Rong等人研制出通过产生组成型表达免疫抑制分子例如细胞毒性T淋巴细胞抗原4-免疫球蛋白融合蛋白(CTLA4-Ig)和程序性死亡配体-1的将其敲入hESC中，将这种hESC移植到人源化小鼠中发现它们对同种异体的细胞具有免疫保护作用。最近，[28]Szot等研究发现共刺激阻断可以诱导小鼠模型中移植异种hESC的胰腺内胚层的耐受性。联合刺激阻断可以防止人源化小鼠模型中同种异体外周血单核细胞对[22]这些细胞的排斥。尽管hESC具有分化成β细胞潜能。但是，其仍然受到移植受体免疫抑制功能的影响及使用人类胚胎产生的hESCs在伦理学上仍有很大争议。35 2、诱导多能干细胞通过人体的体细胞如皮肤的成纤维细胞重编程获得的人类的iPSC可能是人类获取ESC的一种好的方法。但是，由于T1DM患者的自身免疫作用，它们也[30][31]具有形成畸胎瘤或肿瘤的风险。2008年，张等人开发的ESC进行了四步分化方案的研制并从重编程的人成纤维细胞中首次体外获得了β样细胞。由于分化[32]过程非常的缓慢复杂，得出β细胞的数量显著低于成人β细胞。通过不断改善细胞的培养条件，大大的提高了iPSC分化成胰岛β样细胞效率。在2010年，Yupo[33]Ma等人也成功将小鼠ESC诱导分化成了小鼠成纤维细胞的iPSC。通过使用这种分化的方案，他们能够获得高达50％的胰岛素的分泌细胞总量。如果，将这些[34]细胞全部移植到糖尿病小鼠体内，能够使糖尿病小鼠恢复到正常血糖。iPSC保留了ESC的相同的基本性质，包括分化为β细胞的能力、产生可能对细胞治疗有用的自体细胞的优势。然而，目前仍然不能排除在人类中使用的过程中iPSC所面临的一些问题如诱导肿瘤的形成。仍然需要做许多努力，使iPSC分化的过程更加安全和高效。3、间充质干细胞间充质干细胞(MesenchymalStemCells,MSC)移植被认为是一种新颖的治疗T1DM的方法。MSC可以衍生出体内许多不同种类的组织和器官，如骨髓、脐带血、胎盘、软骨和脂肪组织等。2015年，Hu等研究发现间充质干细胞可以延缓T1DM的发病并减轻糖尿病小鼠的高血糖。MSCs所具有的强大的免疫调节的[35][36]功能，这使得它比其他干细胞更适合应用于胰岛移植。研究也证实MSC(同基因、同种异体、异种和人)具有能增强移植后体内胰岛的存活和功能的能力。体[37]外证据表明MSC与胰岛直接一起培养增强胰岛活力和胰岛素分泌功能要远优于两者间接培养。尽管，在胰岛分离过程胰岛活力降低和胰岛功能下降，并且在同种异体移植的条件下暴露于促炎环境中更增加了胰岛丢失。但是，MSC对体外中的促炎细胞因子对胰岛的损伤具有保护作用，MSC还可以通过增强血糖浓度对[38]胰岛的刺激来加速胰岛素分泌。并且，MSC还可以防止细胞因子诱导的凋亡。MSC可以通过分泌可溶性的细胞因子抑制细胞的凋亡，并能够通过促进细胞存活36 和组织细胞周围血管的生成对细胞起到保护作用。然而，在移植部位用同源MSC移植胰岛时观察到丰富的血管植入。相比之[29]下，Park等证实了人脐带血源MSC与来自相同培养条件下一起培养的胰岛，具有能够更好的控制血糖和葡萄糖耐量。因此，MSC和胰岛一起移植可以预防移植后早期由IBMIR、缺氧介导的胰岛的损失。此外，MSC移植后通过IPGTT证明移植后胰岛的降低血糖作用显著增强。MSC不仅可以预防炎症的发生，还可以减少移植后的细胞凋亡，并促进移植所在部位胰岛的血管化，改善胰岛功能、促进胰岛功能恢复的作用，增强胰岛移植后的移植效果。MSC和胰岛一起移植后还可以保护移植后的胰岛不受异体和胰岛自身免疫排斥反应的影响。hESC衍生出来的MSC，与胚胎干细胞中未转导的MSC相比，逆转DM所需要的胰岛数量要[38]减少50％。(三)免疫治疗2000年，Shapiro等人在临床上对7例T1DM的患者施行胰岛移植后，这些患者均实现了胰岛素的独立，并维持了1年。这些T1DM患者都使用了无类固醇免疫抑制方案来预防和治疗移植后的免疫排斥反应。这一方案也被称为“埃德蒙顿方案”。自从“埃德蒙顿”协议建立了免疫抑制方案以来，经常使用西罗莫司、低剂量他克莫司和达曲珠单抗，来防止移植自身受体的免疫系统对于异体胰岛发生的排斥反应。通过使用诱导剂如阿仑单抗联合他克莫司/霉酚酸酯，促进了T细胞消耗的过程，有效的改善了移植后胰岛的长期受排斥抑制的现象。在没有使用钙调神经磷酸酶抑制剂的情况下，使用贝伐他汀(抑制CD80-CD86相互作用)与T[3]细胞消耗诱导结合的共刺激阻断导致胰岛素独立，延长了移植胰岛的存活。2012[19]年，Bellin等公布了免疫治疗的新方案：通过使用阿仑单抗或抗胸腺细胞球蛋白与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抑制剂相结合，组成的新的诱导免疫治疗方案。他们报告说，74％的患者在移植后的1年不用依赖于胰岛素治疗，移植5年时这一比例为50％，这种诱导免疫治疗方案胰岛素的独立的5年维持率高于接受白介素(IL)-2RAb的患者的两倍(分别为50％和20％)。在最近几年，该领域向着新的方向寻找具有较低胰岛细胞和器官毒性的特征的生物制剂：靶向免疫细胞和/或粘附[23]分子如LFA-1、CTLA4-Ig、PD-1/PD-L1和CD40共同刺激途径的药物或趋化37 因子受体(CXCR1/2)都已在临床试验中进行了测试。毫无疑问，胰岛移植的面临的主要挑战是除胰岛素产生β细胞的自身免疫性抑制之外预防同种异体反应。选择高效免疫抑制剂不仅可以减少移植后发生排斥反应的频率，还能够延长移植后的胰岛的存活，减少移植后相应并发症的发生。胰岛移植后能否长期发挥调节血[6]糖的作用在一定程度上也取决于免疫抑制剂的应用。(四)结论胰岛移植刚刚开始时，胰岛移植的供体严重不足，分离、纯化技术粗糙到胰岛质量大大降低，没有找到合适的免疫抑制来抑制排斥。而且，移植后DM患者出现移植后的并发症、自身的免疫排斥以及移植后胰岛接触血液后引发的IBMIR等都严重制约了临床胰岛移植的发展。在过去的十几年里，随着“埃德蒙顿协议”的提出，胰岛无论是分离、纯化，还是移植时患者需要的多少数量的胰岛，还是如何选取高效的免疫抑制剂等各方面都取得了巨大的进步。但是，无论如何改进胰岛移植方法都不可避免的会遇到移植胰岛的丢失。目前的研究主要集中在寻找适合的跟踪胰岛移植物存活的生物标志，减少免疫抑制，并增加可用的胰岛细胞和内分泌细胞来源。最近几年，干细胞已经成为胰岛移植研究的热门领域，ESC和iPSC能够诱导产生的体外祖细胞和/或功能性β细胞以及ESC的衍生细胞可以用于治疗糖尿病小鼠。对于其是否能够应用于T1DM患者目前在临床上正在试验阶段。MSC也被证实具有调节免疫细胞和延缓T1DM发病的能力并且在胰岛移[4]植或无胰岛移植发生后减少高血糖发生。已经通过研究证实MSC与胰岛细胞联合移植时，能够提高移植物存活，大大增强了胰岛移植的效果。iPSC能够通过患者本身诱导产生β细胞，这样可以有效的避免体排斥反应的发生。胰岛移植后如何促进胰岛生存、恢复胰岛功能、血管植入和控制自身免疫和同种异体反应来增强胰岛移植功效是胰岛移植成功的关键。随着胰岛移植的限制因素逐渐克服，胰岛移植将会成为T1DM患者一个更好的选择。38 参考文献1SilviaPellegrini,ElisaCantarelli,ValeriaSordi,etal.Thestateoftheartofislettransplantationandcelltherapyintype1diabetes.ActaDiabetol,2016,32:377-386.2F.Zamboni,M.N.Collins.Cellbasedtherapeuticsintype1diabetesmellitus.InternationalJournalofPharmaceutics.2017,521:346-356.3LablancheS,BorotS,WojtusciszynA,etal.Five-yearmetabolic,functional,andsaftyresultsofpatientswithtype1diabetestransplantedwithallogenicisletswithintheSwiss-FrenchGRAGILnetwork.DiabetesCare,2015,38:1714-1722.4魏玲玲,黄孝伦.同种异体胰岛与间充质干细胞联合移植提高胰岛移植疗效的研究进展.实用器官移植电子杂志,2016,4（6）:363-366.5MichihiroMaruyama,TakashiKenmochi,NaotakeAkutsu,etal.Areviewofautologousislettransplantation.CellMedicine,2013,5:59-62.6AnthonyB,BorisGL,AndrewRP,etal.Isletcelltransplantationforthetreatmentoftype1diabetes:recentadvancesandfuturechallenges.DiabetesMetabSyndrObes,2014,23:211-223.7PosseltAM,SzotGL,FrassettoLA,etal.Islettransplantationintype1diabeticpatientsusingcalcineurininhibitor-freeimmunosuppressiveprotocolsbasedonT-cellashesionorcostimulationblockade.Transplantation,2010,90:1595-1601.8KathrynCogger,MariaCN.Recentadvancesincellreplacementtherapiesforthetreatmentoftype1diabetes.Endocrinology,2015,156(1):8-15.9SutherlandDE,RadosevichDM,BellinMD,etal.Totalpancreatectomyandisletautotransplantationforchronicpancreatitis.JAmCollSurg,2012,214:409-24.10WarnocckGL,EllisD,RajotteRV,etal.StudiesoftheisolationandviabilityofhumanisletsofLangerhans.Transplantation,1988,45(5):957-63.11YasamanA,MariaCN.Celltherpyfortype1diabetes:currentandfuturestrategies.CurrDiabRep,2017,37:1-9.12KlymiukN,AignerB,BremG,etal.Geneticmodificationofpigsasorgandonorsforxenotransplantation.MolReprodDev,2010,77:209-221.39 13GrothCG,KorsgrenO,TibellA,etal.Transplantationofporcineferalpancreastodiabeticpatients.Lancet,1994,344:1402-1404.14HammermanMR.Xenotransplantationofembryonicpigpancreasfortreatmentofdiabetesmellitusinnon-humanprimates.JBiomedSciEng,2013,6(5A).15GaliliU,ShohetSB.Kobrin,etal.Man,apes,andoldworldmokeysdifferfromotherammalsintheexpressionofalpha-galsctosylepitopesonmucleatedcells.JBiolChem,1988,263:17755-17762.16PatienceC,TakeuchiY,WeissRA.Infectionofhumancellsbyanendogenousretrovirusofpigs.NatMed,1997,3:282-286.17BartonFB,RickelsMR,AlejandroR,etal.Improvementinoutcomesofclinicalislettransplantation:1999-2010.DiabetesCare,2012,35:1436-1445.18AdarZ,GilL.Islettransplantationintype1diabetes:hype,hope,andreality-aclinician’sperspective.DiabetesMetabResRev,2014,30:83-87.19BellinMD,BartonFB,HeitmanA,etal.Potentinductionimmunotherapypromoteslong-terminsulinindependenceafterislettransplantationintype1diabetes.AmJTransplant,2012,12:1576-1583.20CGPark,RBottino,WJHawthorne.Currentstatusofisletxenotransplantation.InternationalJournalofSurgery,2015,21:1-6.21AyaresD,PhelpsC,VaughtT,etal.Multi-transgenicpigsforxenoislettransplantation.Xenotransolantation,2013,20:46.22G.Basta,P.Montanucci,R.Calafiore.Islettransplantationversusstemcellsforthecelltherapyof1diabetesmellitus.MinervaEndocrinol,2015,40:267-82.23EIKhatibMM,SakumaT,TomeJM,etal.β-cell-targetedblockageofPD1andCTLA4pathwayspreventsdevelopmentofautoimmunediabetesandacuteallogeneicisletsrejection.GeneTher,2015,22:430-438.24Arunav.Vanikar,HL.Trivedi,UG,Thankkar.Stemcelltherapyemergingasthekeyplayerintreatingtype1diabetesmellitus.Cytotherapy,2016,18:1077-1086.25SoriaB,RocheE,BernaG,etal.Insulin-secretingcellsderivedfromembryonicstem40 cellsnormalizeglycemiainstreptozotocininduceddiabeticmice.Diabetes,2000,49:157-162.26PagliucaFW,MillmanJR,GurtlerM,etal.Generationoffunctionalhumanpancreaticbetacellsinvitro.Cell,2014,159:428-439.27RezaniaA,BruinJE,AroraP,etal.Reversalofdiabeteswithinsulin-producingcellsderivedinvitrofromhumanpluripotentstemcells.NatBiotechnol,2014,32:1121-1133.28SzotGL,YadavM,LangJ,etal.Toleranceinductionandreversalofdiabetesinmicetransplantedwithhumanembryonicstemcell-derivedpancreaticendoderm.CellStemCell,2015,16:148-157.29ParkKS,KimYS,KimJH,etal.Trophicmoleculesderivedfromhumanmesenchymalstemcellsenhancesurvival,function,andangiogenesisofisolatedisletsaftertransplantation.Transplantation,2010,89:509-517.30OkitaK,YamakawaT,MatsumuraY,etal.Anefficientnonviralmethodtogenerateintegration-free-human-inducedpluripotentstemcellsfromcordbloodandperipheralbloodcells.StemCells,2013,31:458-466.31JiangJ,AuM,LuK,etal.Generationofinsulin-producingislet-likeclustersfromhumanemmbryonicstemcells.StemCells,2007,25:1940-1953.32TateishiK,HeJ,TaranovaO,etal.Generationofinsulin-secretingislet-likeclustersfromhumanskinfibroblasts.JBiolChem,2008,283:31601-31607.33SchroederIS,RolletschekA,BlyszczukP,etal.Differentiationof,ouseembryonicstemcellstoinsulin-producingcells.NatProtoc,2006,1:495-507.34AlipioZ,LiaoW,RoemerEJ,etal.Reversalofhyperglycemiaindiabeticmousemodelsusinginduced-pluripotentstem(iPS)-derivedpancreaticbeta-likecells.ProcNatlAcadSciUSA,2010,107:13426-13431.35JunbiX,QianwenM,XiaotongW,etal.Mesenchymalstemcellsmoderateimmuneresponseoftype1diabetes.CellTissueRes,2017,368:239-248.36WuH,WenD,MahatoRi.Third-partymesenchymalstemcellsimprovedhumanislettransplantationinahumanizeddiabeticmousemodel.MolTher,2013,21:1778-1786.41 37ScuteriA,DonzelliE,Rodriguez-MenendezV,etal.Adoublemechanismforthemesenchymalstemcellspositiveeffectonpancreaticislet.PLoSOne,2014,9:e84309.38Karen.Mesencchymalstemcellstopromoteislettransplantsurvival.CurrOpinOrganTransplant,2016,21:568-573.42 二、在学期间科研成绩1.刘国涛，周丁华，张涛等。《酒精性肝病的研究进展》《世界华人消化杂志》第一作者已见刊；2.刘国涛，周丁华，郭栋等。《胃浆膜下层与门静脉胰岛移植治疗大鼠糖尿病的实验研究》《中国现代医学杂志》第一作者已见刊；3.郭栋，刘国涛，刘全达等《自体胰岛细胞移植治疗大鼠全胰十二指肠切除术后糖尿病》《中国现代医学杂志》第二作者待见刊。43 三、致谢时光荏苒，白驹过隙，三年的研究生生涯行将结束。三年中，有汗水也有欢笑，有壮志豪情也有失落彷徨。但是，所有的快乐、悲痛、挫折和经历都是独一无二的财富，我将铭记终生。借此，我要向过往三年中给予我关心、帮助和支持的人们表示最诚挚的谢意。首先衷心地感谢我的导师周丁华教授三年来对我学习、工作上的谆谆教诲、细心指导和无私帮助，您渊博的学识、严谨的治学态度，精湛的医术和高尚的医德是我一生学习的楷模，能够以您为师是我今生莫大的荣幸。周丁华教授从各方面对我严格要求，不仅培养了我严谨的科研态度，做学问的方法，还传授了做人的准则，这些使我受益匪浅，他是我职业生涯中永远的楷模。在此再次向我的导师表示衷心的感谢！衷心感谢中国人民解放军火箭军总医院刘全达教授和中国人民解放军军事医学科学院叶华虎教授、王启伟博士。从我课题的最初的开题论证到课题设计实施细节以及后期的论文撰写，事无巨细，刘全达教授、叶华虎教授、王启伟博士都给予了无私的帮助和指导，并给予我极大的鼓励，使我有信心踏上科研的艰辛之路。他们敏锐的科研思维、严谨的治学态度给和渊博的学识都给我留下了深刻的印象。衷心感谢肝胆外科吕伟、李朝阳主任，闫涛、赵玮、王国经、王进副主任，吉王明、张涛、牛强师兄，在我临床学习期间给予我的严格要求和悉心指导和无微不至的帮助，你们精湛的医术、严谨的工作作风和丰富的临床经验深深的影响。感谢中国人民解放军火箭军总医院三生大队梁珺老师和鲁丽萍老师，谢谢你们在日常学习、生活和工作中对我的不吝教诲和无私帮助。衷心感谢郭栋硕士、程宇师弟，不会忘记我们一起并肩作战的日子，祝你们前程似锦！最后，感谢我的父母及其他家人，在我研究生3年期间无私的帮助，深深感谢他们对我工作的理解、关心和大力支持，没有他们的忍耐和付出，我是无法安心完成学业的，谢谢你们对我无怨无悔的付出！祝愿每一位老师、朋友、同学和亲人身体健康，万事如意！44 四、个人简介姓名：刘国涛民族：汉族性别：男籍贯：山东省临沂市出生年月：1990年07月学习经历：2007年-2010年临沂高新实验中学2010年-2015年齐鲁医药学院、泰山医学院2015年-2018年锦州医科大学45 厚德修身斗青＾＾ｉ齐ｉＨｒ？？？；？■
