五倍子基于中医箍围对转基因K14-VEGF银屑病小鼠的治疗作用与抗血管增生机制研究

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中图分类号：Ｒ２５＾＾ＥＤＸＩＣＳＯＵＴＨＷＥＳＴＭＥＤＩＣＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ＾＾；ｙ硕士学位论文五倍子基于中医箍围对转基因Ｋ１４－ＶＥＧＦ银屑病小鼠的治疗作用与抗血管增生机制研究院（系）、所中西医结合学院研究生姓名王瑶学科、专业中医外科学导师姓名杨文信教授学位类型专业学位二〇一八年五月 西南医科大学硕士学位论文西南医科大学毕业硕士研究生学位论文独创性声明及发表承诺书本人声明所呈交的学位论文（已整理成发表形式）是我个人在西南医科大学一导师指导下，由导师及西南医科大学提供切科研条件的情况下进行的研究工作及取得的研宄成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构己经发表或撰写过的研宄成果。其他同志对本研宂的启发和所做的贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。在即将毕业离校之际，本人郑重承诺：该论文将以西南医科大学的名义发表（论文作者为研究生及导师，作者所在）（单位为西南医科大学，并在发表后立即将发表论文原件期＾：学位论文作者签名：导师签名曰期：＞４年６月２曰曰期：Ｗ４月３曰西南医科大学硕士学位论文版权使用授权书本人完全了解西南医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：西南医科大学有权保留并向有关部门或机构送交本人学位论文的复印件和电子版，允，许论文被查阅和借阅，允许有关部门或机构以电子出版物形式出版发行并对外进行全文内容服务。本人授权西南医科大学可以将本人学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，进行数字化处理汇编、通过网络或其它途径进行、，可以用影印缩印、扫描或交流传播，可以公布学位论文的全部或部分内容，大论其和汇论文即西南医科学具有本人学位文的数字他复制手段保存编学位。论录到《、网权和编权时授将本学位文收中国化制品复制权息络传播汇同权倚息务。》《万库》，并通过网络向社会公众提供信服学位论文全文数据和方数据库□，。在年解密后适用本授权书保密本人提交的学位论文属Ｍ保密不Ｐ“”Ｖ）（请在以上方框内打ｖｙ；学：导师签名位论文作者签名－；‘曰导师签章曰期＾年月４这６（＾￥＾＞：＾日年日编：期月地址及邮政码联系电话：：联系电话：电子信箱 西南医科大学硕士学位论文目录1五倍子基于中医箍围对转基因K14-VEGF银屑病小鼠的治疗作用与抗血管增生机制研究................................................................11.1中文摘要............................................................................................11.2英文摘要............................................................................................51.3前言...........................................................................................111.4材料与方法......................................................................................161.5结果..........................................................................................281.6讨论..........................................................................................451.7结论..........................................................................................581.8参考文献..........................................................................................591.9英汉缩略词对照表..........................................................................632致谢...................................................................................................643中医外治银屑病的现代研究进展（综述）..................................65 西南医科大学硕士学位论文五倍子基于中医箍围对转基因K14-VEGF银屑病小鼠的治疗作用与抗血管增生机制研究摘要目的：1、通过观察五倍子乳膏对转基因K14-VEGF银屑病小鼠PASI评分、Baker评分及炎细胞数的影响，初步评价五倍子乳膏治疗转基因K14-VEGF银屑病小鼠的疗效。2、通过研究五倍子乳膏对转基因K14-VEGF银屑病小鼠血清VEGF、NO和皮损MVD、Ang-2的影响，初步探讨其治疗该小鼠的机制。方法：选取转基因K14-VEGF银屑病鼠60只、FVB鼠10只。将60只转基因K14-VEGF银屑病鼠随机分为6组，每组10只，分别为五倍子乳膏高(50%，A组)、中(25%，B组)、低(15%，C组)浓度组，阳性对照组(0.1%他扎罗汀乳膏，D组)，基质对照组（凡士林，E组），模型组(空白组，F组)。FVB鼠（G组）为1组。分组后对各组小鼠耳后皮损予以标记，以盖顶围涂方式分别对A、B、C、D、E组鼠耳后皮损部位涂以相应乳膏，E组涂搽乳膏基质。药量为0.1g/cm2，2次/日，持续30天。F、G组不做任何处理。用药4周后进行PASI评分，采集小鼠血清及皮损标本，对皮损标本予以HE染色后进行Baker评分及炎细胞计数，分别采用ELISA法和硝酸根还原酶法测定血清VEGF和NO含量，使用免疫组化法对皮损中MVD、Ang-2水平进行检测。应用统计软件SPSS20.0处理所有数据：满足正态分布的定量资料用x±s表示，组间对比用单因素方差分析，组内两两对比用LSD法。非正态分布的定量资料组间对比用秩和检验。检验水准α=0.05，以P＜0.05作为有显著性差异1 西南医科大学硕士学位论文的标准。结果：1、转基因K14-VEGF银屑病小鼠分别经高、中、低浓度的五倍子乳膏、他扎罗汀乳膏、凡士林治疗4周后，高、中、低浓度的五倍子乳膏组、他扎罗汀乳膏组小鼠皮损严重程度（PASI评分）明显低于凡士林、空白组小鼠，结果有显著性差异(P＜0.05)。以他扎罗汀乳膏组小鼠的疗效最为明显，高、中、低浓度组次之，不同浓度间的疗效差异不显著(P＞0.05)。凡士林组小鼠皮损严重程度和空白组相比，两者差异不显著(P＞0.05)。以上5种药物均不能使转基因K14-VEGF银屑病小鼠皮损（PASI评分）恢复至FVB鼠水平。2、各组小鼠耳部皮损的Baker积分比较：高、中、低浓度的五倍子乳膏组、他扎罗汀乳膏组小鼠的Baker积分明显低于凡士林、空白组，结果有显著性差异(P＜0.05)。以他扎罗汀乳膏组小鼠疗效最为明显，高、中、低浓度组次之，不同浓度间差异有显著性(P＜0.05)。凡士林组小鼠皮损Baker评分和空白组无著性差异(P＞0.05)。以上5种药物均不能使转基因K14-VEGF银屑病小鼠皮损组织病理学积分恢复至FVB鼠水平。3、各组小鼠耳部皮损的炎细胞计数比较：高、中、低浓度的五倍子乳膏组、他扎罗汀乳膏组的炎细胞计数低于凡士林、空白组低，结果存在显著性差异(P＜0.05)。以他扎罗汀乳膏组小鼠的疗效最为明显，高、中、低浓度组次之，高浓度组与中浓度组、低浓度组疗效差异有统计学意义（P＜0.05），中浓度组与低浓度组疗效差异不显著（P＞0.05）。凡士林组小鼠皮损的炎细胞计数与空白组差异不具有统计学意义(P＞0.05)。以上5种药物均不能使转基因K14-VEGF银屑病小鼠皮损炎细胞浸润恢复至FVB鼠水平。4、每组动物血清中2 西南医科大学硕士学位论文VEGF水平比较：高、中、低浓度的五倍子乳膏组、他扎罗汀乳膏组小鼠血清VEGF水平低于凡士林、空白组，结果存在显著性差异(P＜0.05)。以他扎罗汀乳膏组小鼠疗效最为明显，高、中、低浓度组次之，不同浓度间差异有显著性(P＜0.05)。凡士林组和空白组间，差异不显著(P＞0.05)。以上5种药物均不能使转基因K14-VEGF银屑病小鼠血清中VEGF水平降至FVB鼠水平。5、每组动物血清中NO水平比较：高、中、低浓度的五倍子乳膏组、他扎罗汀乳膏组小鼠血清NO水平比凡士林组、空白组小鼠低，结果存在显著性差异(P＜0.05)。以他扎罗汀乳膏组小鼠的疗效最为明显，高、中、低浓度组次之，高、低浓度间、中、低浓度间疗效有显著性差异(P＜0.05)。高、中浓度间、凡士林组与空白组，差异不不显著(P＞0.05)。以上5种药物均不能使转基因K14-VEGF银屑病小鼠血清NO水平降至FVB鼠水平。6、每组动物皮损组织中MVD比较：高、中、低浓度的五倍子乳膏组、他扎罗汀乳膏组小鼠皮损组织中MVD水平比凡士林组、空白组小鼠低，结果存在显著性差异(P＜0.05)。以他扎罗汀乳膏组小鼠的疗效最为明显，高、中、低浓度组次之，高、低浓度组间、中、低浓度组间疗效具有显著差异（P＜0.05)。高、中浓度组间、凡士林与空白组，无显著差异(P＞0.05)。以上5种药物均不能使转基因K14-VEGF银屑病小鼠皮损组织中MVD水平降至FVB鼠水平。7、每组动物皮损组织中Ang-2比较：他扎罗汀乳膏组小鼠皮损组织中Ang-2水平比高、中、低浓度的五倍子乳膏组、凡士林组、空白组小鼠低，结果存在显著性差异(P＜0.05)。他扎罗汀乳膏尚不能使皮损组织中Ang-2水平降至3 西南医科大学硕士学位论文FVB鼠水平。高、中、低浓度五倍子乳膏、凡士林、空白组之间,结果不具有统计学意义(P＞0.05)。结论：1、五倍子乳膏对转基因K14-VEGF银屑病小鼠的皮损严重程度、组织病理表现、炎细胞浸润有明显改善作用。以高浓度组效果最明显，其作用弱于他扎罗汀乳膏。2、五倍子乳膏可明显降低转基因K14-VEGF银屑病小鼠血清NO、VEGF水平，改善耳部皮损MVD，对耳部皮损的Ang-2作用不明显，其中高浓度组改善作用最明显。3、五倍子乳膏治疗转基因K14-VEGF银屑病小鼠的疗效与浓度相关，其疗效随浓度递减。4、五倍子乳膏对转基因K14-VEGF银屑病小鼠的作用可能是通过抗微血管增生实现。关键词：银屑病；转基因K14-VEGF；小鼠；五倍子乳膏4 西南医科大学硕士学位论文StudyonthetherapeuticeffectandantivascularproliferationmechanismofChinesegallontransgenicK14-VEGFpsoriasismicebasedonthehoopcircumferenceAbstract:Objective:1.ByobservingtheeffectsofgallnutcreamonPASIscore,histopathologicalscoreandinflammatorycellinfiltrationintransgenicK14-VEGFpsoriasismice,thecurativeeffectofgallnutcreamonpsoriasisvulgariswaspreliminarilyevaluated.2.BystudyingtheeffectsofgallnutcreamonserumVEGF,NOandMVD,Ang-2inpsoriaticmicemodeloftransgenicK14-VEGF,theanti-angiogenesismechanismofgallnutcreaminthetreatmentofpsoriasisvulgariswaspreliminarilyinvestigated.Methods:60transgenicmiceand10FVBmicewereselected.The60transgenicmicewererandomlydividedintothreedosegroups:50%,25%and15%concentrationsofgallnutcream,positivecontrolgroup(0.1%TazaroteneCream),matrixcontrolgroup,modelset.Each10miceweremadeupagroup.Aftergrouping,theskinlesionsofmiceinthegallnutcreamgroup,thepositivecontrolgroup,thematrixcontrolgroupandthemodelgroupwerelabeled.Thetraditionalmethodofmiddleretainingtopcircumferencewasusedtoapplythecorrespondingcreamtotheskinlesionoftransgenicmiceineachdruggroup,2timesperdayfor4consecutiveweeks.ModelgroupandFVBmicedonotdoanyprocessing.After4weeksofmedication,PASIassessmentconducted.Collectionofserumandskinlesions.Baker5 西南医科大学硕士学位论文scoreandinflammatorycellcountafterHEstainingwereperformedonthelesions.DeterminationofserumVEGFandNObyELISAandnitratereductasemethod.DetectionofMVDandAng-2levelinskinlesionsbyimmunohistochemicalmethod.ThestatisticalsoftwareSPSS20.0wasusedtoanalyzeallthedata.Thequantitativedatainaccordancewithnormaldistributionareexpressedasx±s.Singlefactoranalysisofvariancebetweengroups.TheintragroupcomparisonwasperformedbyLSDmethod.Theranksumtestwasusedforthecomparisonofquantitativedatanotinaccordancewiththenormaldistribution.Thetestlevelwas0.05,withP<0.05asthestandardofsignificantdifference.Results:1.ThePASIscoresinthehigh,mediumandlowconcentrationsofgallnutcreamandTazaroteneCreamgroupweresignificantlylowerthanthatinthemodelgroupaftertreating4weeks,withsignificantdifferenceintheresults(P<0.05).ThechangeofTazaroteneCreamwasthemostobviousinmice,betterthanthehigh,mediumandlowconcentrationsofgallnutcream.Futhermore,therewasnosignificantdifferenceincurativeeffectamongthethreeconcentrations(P>0.05).ThePASIscoresintheMatrixgroupandmodelgrouphavenosignificantdifference.NoneoftheabovefivedrugscouldrestorethePASIscoreoftransgenicK14-VEGFpsoriaticmicetothelevelofFVBmice.2.ThehistopathologicalscoresofearlesionsineachgroupwerecomparedbyBakermethod.Thehistopathologicalscoresofhigh,mediumandlow6 西南医科大学硕士学位论文concentrationgallnutcreamwerelowerthanmatrixcreamgroupandblankgroupwithsignificantdifferenceintheresults(P<0.05).ThechangeofTazaroteneCreamwasthemostobviousinmice，betterthanthehigh,mediumandlowconcentrationsofgallnutcream.Futhermore,therewassignificantdifferenceincurativeeffectamongthethreeconcentrations(P>0.05).TheBakerscoresintheMatrixgroupandmodelgrouphavenosignificantdifference.NoneoftheabovefivedrugscouldrestoretheBakerscoresoftransgenicK14-VEGFpsoriaticmicetothelevelofFVBmice.3.Comparisonofinflammatorycellcountofearlesionsineachgroup:theinflammatorycellcountofhigh,mediumandlowconcentrationsofgallnutcreamwerelowerthanmatrixcreamgroupandblankgroup,withsignificantdifferenceintheresults(P<0.05).Theinflammatorycellcountsofhighconcentrationsofgallnutcreamwerelowerthanthemediumandlowconcentrationgroup,withsignificantdifferenceintheresults(P<0.05).Therewasnosignificantdifferenceininflammatorycellcountbetweenthemiddleconcentrationgroupandthelowconcentrationgroup.TheinflammatorycellcountintheMatrixgroupandmodelgrouphavenosignificantdifference.NoneoftheabovefivedrugscouldrestoretheinflammatorycellcountoftransgenicK14-VEGFpsoriaticmicetothelevelofFVBmice.4.ThelevelsofVEGFinserumoftransgenicK14-VEGFpsoriaticmicewereasfollows:TheserumlevelsofVEGFinthehigh,mediumandlow7 西南医科大学硕士学位论文concentrationsofgallnutcreamgroupwerelowerthanthoseinthebasecreamgroup,andthoseintheblankgroupwerelowerthanthoseintheblankgroup,withsignificantdifferenceintheresults(P<0.05).ThelevelsofVEGFintheserumofthethreegroupswithhigh,middleandlowconcentrationsofgallnutcreamdecreased,andtherewassignificantdifferencebetweeneverytwogroups(P<0.05).TherewasnosignificantdifferenceinserumVEGFbetweenmatrixcreammiceandblankmice(P>0.05).NoneoftheabovefivedrugscouldrestoretheVEGFinserumoftransgenicK14-VEGFpsoriaticmicetothelevelsofVEGFinserum.5.NOlevelsinserumoftransgenicK14-VEGFpsoriaticmicewereasfollows:TheserumNOlevelinthehigh,mediumandlowconcentrationsofgallnutcreamgroupwaslowerthanthatinthebasecreamgroup,andintheblankgroup,itwaslowerinthecontrolgroup,withsignificantdifferenceintheresults(P<0.05).ThelevelofNOintheserumofthehighconcentrationgroupofgallnutcreamwashigherthanthatofthelowconcentrationgroup,andthelevelofNOinthemiddleconcentrationgroupwashigherthanthatinthelowconcentrationgroup,withsignificantdifferenceintheresults(P<0.05).ThelevelofNOintheserumofmicewithhighconcentrationofgallnutcreamisequaltothatofmiceofmediumconcentration,withoutsignificantdifferenceintheresults(P>0.05).TherewasnosignificantdifferenceinserumNObetweenmatrixcreammiceandblankmice(P>0.05).Noneoftheabovefivedrugs8 西南医科大学硕士学位论文couldrestoretheBakerscoresoftransgenicK14-VEGFpsoriaticmicetothelevelsofNOinserum.6.MVDinskinlesionsoftransgenicK14-VEGFpsoriaticmicewereasfollows:TheMVDintheskinlesionsofthehigh,mediumandlowconcentrationgallnutcreamgroupwaslowerthanthatofthebasecreamgroup,andtheblankgroupwaslowerthanthatoftheblankgroup,withsignificantdifferenceintheresults(P<0.05).TheMVDintheskinlesionsinthehighconcentrationgroupofgallnutcreamwashigherthanthatinthelowconcentrationgroup,andtheMVDinthemiddleconcentrationgroupwashigherthanthatinthelowconcentrationgroup,withsignificantdifferenceintheresults(P<0.05).TheMVDinthelesionsofmiceinthehighconcentrationgroupofgallnutcreamwasequivalenttothatinthemiddleconcentrationgroup,withoutsignificantdifferenceintheresults(P>0.05).NoneoftheabovefivedrugscouldrestoretheMVDoftransgenicK14-VEGFpsoriaticmicetothelevelsofMVDinserum.7.Ang-2inskinlesionsoftransgenicK14-VEGFpsoriasismicewereasfollows:Ang-2levelsinskinlesionsofmicetreatedwithtazarotenecreamwaslowerthanothers.AmongHigh,mediumandlowconcentrationsofgallnutcream,matrixcream,blankgroup,theAng-2inskinlesionsofmicehasnotanysignificantdifference(P>0.05).Conclusion:1.Gallnutcreamcansignificantlyimprovetheseverityofskinlesions,histopathologicalfeaturesandinflammatorycellinfiltrationintransgenicK14-VEGF9 西南医科大学硕士学位论文psoriasismice.Theeffectofhighconcentrationgroupwasthemostobvious,anditseffectwasweakerthanthatoftazarotenecream.2.GallnutcreamcansignificantlyreducethelevelofNOandVEGFintheserumoftransgenicK14-VEGFpsoriasismice,canimproveMVDofearlesions,buttheeffectofAng-2onearlesionswasnotobvious.Theimprovementofhighconcentrationgroupwasthemostobvious.3.TheefficacyofgallnutcreaminthetreatmentoftransgenicK14-VEGFpsoriasismicewascorrelatedwiththeconcentrationanditscurativeeffectdecreaseswithconcentration.4.TheeffectofgallnutcreamontransgenicK14-VEGFpsoriasismicemaybeachievedbyanti-microvascularhyperplasia.KeyWords:Psoriasis/K14-VEGF/Gallnutcream10 西南医科大学硕士学位论文前言银屑病(psoriasis)，即中医的“白疕”，俗称“牛皮癣”，是一种常见且反复发作的慢性炎症性皮肤病，主要表现为表皮异常增殖、真皮炎性反应，肉眼可见明显红斑脱屑。本病在各地的患病率特点各异。据统计，银屑病世界总体患病率是1%～3%[1]。在我国，银屑病患病率1984年为0.123%，2008年为0.47%，呈升高趋势，从地域上看表现为南低北高的特点[2]。银屑病患病率无明显性别及年龄差异，但据数据显示，15-30岁为发病高峰[3]。银屑病很难根治的特点对病患心身健康造成影响，进而在生活及工作造成极大的不便。因此，对银屑病的研究仍是现阶段的主要方向。国内外对于银屑病发病机制的研究虽然已取得很大进展，但依然没有得出全面结论。从银屑病病理表达来看，主要为角朊细胞（Kerationcyte，KC）异常增殖、微血管异常增多及炎症细胞浸润，而血管异常增多和分布是首先发生的病理变化[4]。因而，越来越多的研究涉及血管生成的相关因素。研究较多的是血管内皮生长因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)、一氧化氮(NO)、微血管密度(MVD)和Ang-2。其中，以VEGF最主要。VEGF能加速内皮细胞分裂和增殖，诱导血管发生，在内皮和炎症细胞具有较强化学趋向意义。杨海龙研究发现[5]，VEGF存在于所有人，但在皮损里的程度明显增加，说明VEGF可以反映患者病情，作为评估本病病况的指标之一。一氧化氮(NO)是NOS形成的免疫调节分子和炎性介质。NO可在多种细胞中产生，其中包括KC。NO具有调节皮肤血液循环、11 西南医科大学硕士学位论文调节组织修复、免疫调节等作用，因而参与银屑病炎症反应的形成。NiedbalaW等认为，NO会选择性加强Th1细胞增殖，进而促使微血管形成[6]。杨晓红，杨发枝等研究表明，NO会促进银屑病皮损发生炎症，且参与皮损里微血管形成[7]。可见，在银屑病起病过程中，NO起了重要的作用，可用作评估本病病况的观察指标。微血管密度(MVD)能相对客观地反映组织血管状况。张锡宝等[8]实验研究使用免疫组化对银屑病患者皮损进行微血管标记，发现MVD值与患者的PASI评分呈正相关，表明MVD可体现病情的进展情况，并对后续发展具有相应的预估意义。血管生成素-2(Ang-2)作为一种血管生成调节因子，主要通过破坏内皮细胞和周围细胞间连接而影响血管壁稳定性，进而产生调控血管生成的功能[9]。孙波等实验研究证明了Ang-2仅在皮损乳头层有阳性意义，正常皮肤组织则无，表明其在银屑病的发病中，参与了皮损中血管的异常增生及扩张等改变[10]。综上，VEGF、NO、MVD、Ang-2均参与银屑病微血管生成的过程，因而通过研究其变化与相互关系可评估银屑病的病情变化。在该病的相关探究中，建立适合的研究模型是极为重要的。现阶段常见的银屑病模型产生方法有药物诱发、鼠尾、移植、自发产生等。但经过大量的实验研究证明，即使上述方法可使动物肉眼表现出较为明显银屑病样皮损，但在皮肤病理学方面这些模型与人类银屑病发病特征差距仍较大。目前研究已证实VEGF是促内皮细胞分裂剂，存在于多种组织且呈过度表达状态，具有促进血管新生功能，尤其是在本病可测得较高的水平。近年研究也发现，K14基因在银屑病的发病机12 西南医科大学硕士学位论文制及KC增殖和活化的调控中发挥着关键作用[11]。李红等[11]利用GatewayCloningTechnique将人K14和鼠VEGF-A164置入FVB鼠，转基因K14-VEGF银屑病鼠在国内成功构建。该模型的特点在于小鼠5月龄时能自发产生血管异常增生、增厚、角化过度、角化不全，出现表皮基底层异常等现象。相关资料也表明该鼠3-6个月龄时，可发生巨噬、肥大、CD8+T、CD4+T等细胞浸润，并且CD4+淋巴细胞的数量明显高于CD8+细胞[12]。该动物模型克服了既往各类模型的缺点，综合体现银屑病发病的生理病理变化，为本研究提供了良好的实验依据。银屑病起病原因众多，但仍不完全明确，当前亦尚无较好的防治方式。据现阶段的研究表明，虽然治疗银屑病的方法有很多，但只能在短时间内缓解临床症状，病情极易复发。银屑病发病主要部位是皮肤表皮及真皮浅层，因而治疗以外用药物为主。而目前市面上现有的外用药物的治疗机制多集中于抑制KC增殖、剥脱角质层方面，对于抑制微血管增生这一关键环节的药物极少。外用的西药往往存在显著的副作用，不适合长期大范围使用，且价格较为昂贵，而中药制剂可以弥补西药的不足，于疗效方面有独特的优势。因而，研发出一种针对血管增生安全、有效、经济的中药制剂是很有必要的。根据病因，中医大多“从血论治”，认为本病证型主要包括血热、血瘀、血虚证，治疗分别以“清热凉血”、“活血化瘀”、“养血润燥”为主。现证实，寻常型银屑病在进行期皮损属于血热范畴[13]。中医外治则沿用了内治之法，主要选取清热、凉血、养血、润燥类药物。13 西南医科大学硕士学位论文本病的传统外治原则为清热凉血消斑。传统对于本病外治方药，多沿用涂搽《医宗金鉴》之黄连膏。黄连膏的剂型属于油膏，其作用主要落在消肿定痛上。大量的动物实验[14，15]已经证实，这些消肿定痛的清热解毒、清热凉血药的作用机理多在于抑制细胞的有丝分裂，促使颗粒层发展，进而使表皮角化得到改善，使不完全角化变为完全角化。但针对寻常型银屑病皮疹面积不停扩大，数目不停增多，毒邪扩散这一特点，没有更佳的处理方法。于外治法中收敛箍围是唯一明确提出能够有效束毒、截毒、拔毒的方法。箍围疗法，是中医外科的独特疗法，又名敷贴、围药等，具有箍集围聚、收束疮毒的作用，传统常用于治疗疖、疔、痈、疮、虫兽咬伤等疾患。箍围分为盖顶涂围和留顶涂围，不同用药方法适应病症不同。根据中医基础理论的推导，治疗寻常型银屑病时采用箍围疗法，能更有效的延缓疾病进展。《疡医大全•论阴阳法》提出“施治，必需先审阴阳”，从阴阳辨证角度来看，寻常型银屑病皮损表现，属于阳。阳病者应该使用阴药。那么，箍围药物中的寒凉、收敛类药可以入选。本病的外治原则如前所述为清热解毒、凉血消斑。“热者寒之”，故可使用寒凉箍围药，而且目前我们临床所使用的外用药物主要也集中在寒凉药上。经络是人体气血流通的通路，浮络是循于人体浅表部位而常浮现的络脉，它分布在皮肤表面，起到输布气血濡养全身的作用。寒凉箍围药，即清热凉血药，从经络理论来说，即作用于皮部上，治疗寻常型银屑病时，其作用多在于抗表皮的增殖。如前所述，银屑病己经被14 西南医科大学硕士学位论文明确为是一种慢性炎症性血管新生性疾病，银屑病中最先发生的病理改变是血管的分布和形成的改变。后微血管应属于中医浮络构成部分之一，故银屑病从经络辨证来看，也属于浮络的病变。所以要消除皮部的病变，必须调控好浮络的病变。所以治疗银屑病，更应从调整浮络入手，以箍围收束新生浮络，调整减少其气血流注，使过度增殖的皮部失去足够的气血濡养，从而达到束毒截毒拔毒的目的。西南医科大学附属中医医院皮肤科根据中医“经络理论”和“箍围理论”进行组方，用五倍子、黄芩、黄柏、白芨等药物研制出复方五倍子箍围膏，通过动物实验与临床观察，发现复方五倍子箍围膏局部外用于豚鼠耳部银屑病有效，可改善毛细血管过度扩张及局部炎症，临床运用复方五倍子箍围膏的疗效可达到84.6%[16]，具有“简效便廉”的特点。复方五倍子箍围膏中五倍子为君药，味酸、涩、寒，属收敛药，因此常做为收敛箍围药的代表药。五倍子内含鞣酸，有着沉淀凝聚蛋白的功能，能收敛、解毒、抗菌，临床用于治疗溃疡等疾病[17]。如前所述，收敛箍围药可用于寻常型银屑病的治疗，而且是通过抗血管增生起治疗作用的。而且临床上，五倍子也常与其他凉血药物组方治疗本病。为探讨五倍子单味药在银屑病的治疗作用，故本实验选用转基因银屑病小鼠作为模型，观察治疗后动物血清中VEGF、NO水平及皮损中MVD、Ang-2的表达，进而探讨五倍子是否对银屑病转基因小鼠有抗血管增生作用机制，为中药外用制剂的研究提供参考。15 西南医科大学硕士学位论文材料与方法1实验材料与仪器1.1实验动物所有小鼠均从四川大学华西医院购买(使用许可证号为：SCXK（川）2013-119)，其中60只已成功构建的转基因K14-VEGF银屑病小鼠，10只未经任何处理的FVB鼠，以上小鼠每只体重约25g，雌雄比例1:1，分笼标准饲料喂养（饲料均为：实验动物配合饲料）及自由饮水。定期更换垫料（每周2次，垫料由西南医科大学动物实验中心提供）。1.2实验材料（1）五倍子，由北京同仁堂股份有限公司提供。（2）五倍子乳膏，由西南医科大学附属中医医院药剂科制作（已完成五倍子乳膏相关安全性实验，证实其局部皮肤用药的安全性[18]）。（3）0.1%他扎罗汀乳膏（乐为），购买自重庆华邦制药股份有限公司（批号：2016003）。（4）溶媒基质——白凡士林（由本院药剂科提供，批号：160901）。1.3主要实验试剂Anti-Angiopoietin2Antibody美国abcam公司（货号：ab180820）MVDPolyclonalAntibody美国thermo公司(货号：PA5-22164）NO测定试剂盒（硝酸根还原法）南京建成生物工程研究所（货号：A012）VEGFELISA测定试剂盒上海桥社生物科技有限公司（货号：A012）16 西南医科大学硕士学位论文1.4主要实验仪器DM1000免疫荧光镜德国Leica组织切片机德国LeicaMIAS系列图像自动分析仪四川大学计算机系图像图形研究所OLYMPUS光学显微镜上海普赫光电科技有限公司生产CX31-12L02型离心机北京医用离心机厂生产2实验方法2.1五倍子乳膏的制备2.1.1五倍子提取物的制备：五倍子100g，以8倍水超声提炼3次，30min/次，3次液体混合在一起，减压浓缩，回收溶剂，得五倍子浸膏，以60℃恒温干燥，即得五倍子提取物。2.1.2五倍子乳膏的制备：将五倍子提取物碾成细粉，按一定比例均匀分散于乳膏基质中，做成高（50%）、中（25%）、低（15%）三个浓度的五倍子乳膏，常温保存，备用。2.2分组及给药选取转基因K14-VEGF银屑病鼠60只、FVB鼠10只。将60只转基因K14-VEGF银屑病鼠随机分为6组，每组10只，分别为五倍子乳膏高(50%，A组)、中(25%，B组)、低(15%，C组)浓度组，阳性对照组(0.1%他扎罗汀乳膏，D组)，基质对照组（凡士林，E组），模型组(空白组，F组)。FVB鼠（G组）为1组。分组后对各组小鼠耳后皮损予以标记，以盖顶涂方式分别对A、B、C、D、E组鼠耳后17 西南医科大学硕士学位论文皮损部位涂以相应乳膏，E组涂搽乳膏基质。药量为0.1g/cm2，2次/日，持续30天。F、G组不做任何处理。2.3观察指标及具体实验方法2.3.1肉眼观察小鼠的一般情况及皮损改变2.3.1.1一般情况小鼠的一般情况主要包括运动状况、饮食、死亡情况等。2.3.1.2皮损变化采用PASI评分对皮损进行评估，由于本实验用药部位仅限于小鼠耳部，因此只对各组小鼠进行耳部皮损严重程度评分。评分标准为：皮损严重度评分（分）=红斑(E)＋鳞屑(S)＋斑块肥厚度（T）。具体评分方法见表1。表1PASI评分的方法Table1ThemethodofPASIscore皮损严重程度0分=无1分=轻度2分=中等度3分=重度4分=极重度红斑（E）无红斑呈淡红色红色深红色红色极深鳞屑（S）表面未见明显部分皮损表面上大多数皮损表几乎全部皮全部皮损表鳞屑覆有鳞屑，以细面完全或不完损表面覆有面均覆有鳞微的鳞屑为主全覆有鳞屑，鳞屑，鳞屑较屑，鳞屑很鳞屑呈片状厚成层厚成层斑块肥厚程度皮损与正常皮皮损轻微高出于中等度隆起，皮损肥厚，隆皮损高度增（T）肤平齐正常皮肤表面斑块的边缘为起明显厚，隆起极为圆或斜坡形明显18 西南医科大学硕士学位论文2.3.2采集标本首先，使用2.5%戊巴比妥稀释液（50mg/kg）逐个给70只小鼠予以腹腔注射麻醉。麻醉成功后，分别用打孔器从每只小鼠双侧耳部皮损明显的位置取下直径为0.8cm的组织，左耳组织用作病理组织学观察，右耳组织用作免疫组化检测MVD及Ang-2。将取好的组织固定在10%甲醛溶液里，并分别对容器进行标记。接着，进行眼眶采血，每只小鼠采血2份(每份1-1.5ml)并进行标记，分别用作VEGF和NO测定，采血完毕后使其置入离心机（3000r/min），约15-20min，分别取出血清并进行标记，封存-20℃冰箱里。2.3.3制作病理切片2.3.3.1固定、脱水、透明（1）75%乙醇3Omin（2）85%乙醇3Omin（3）95%乙醇(I)30min（4）95%乙醇(II)30min（5）100%乙醇(I)30min（6）100%乙醇(II)30min（7）1/2二甲苯(乙醇同二甲苯等体积)20min（8）二甲苯(I)20min（9）二甲苯(II)10min(时间可据透明效果而定)19 西南医科大学硕士学位论文组织固定至10%甲醛液内12h后，放入以下试剂按顺序予以脱水：以上每一个步骤过程中要时常晃动组织块，促使组织块的各个位置能充分接触到以上试剂，且每更换一次试剂，都要将残留的液体吸干，保持其干燥，避免使下一种试剂受到干扰。2.3.3.2浸蜡、包埋选用56-58℃的石蜡并熔化，使组织在60℃的温度下前后浸蜡两次，每次2小时。随后在包埋框里灌入适量已熔化的石蜡，立即将浸蜡完毕的组织以适当的位置置于包埋框底部，并对每一个包埋框进行标记。当组织块表面看到有薄膜形成时，放进冷水里促使迅速冷却形成蜡块，避免蜡块内气泡产生。2.3.3.3制作防脱玻片用无菌注射器分别抽取20ml多聚赖氨酸和180ml蒸馏水,放入量杯内充分混匀，配置出多聚赖氨酸溶液。放入洁净玻片泡5min后拿出，用40℃烤箱将其干燥备用。2.3.3.4制片切片机固定蜡块，连续切出均匀的薄片数张，每张蜡片为4um厚。选取三张整块分别贴在防脱玻片上，在60℃恒温箱里放置30min，存放在4℃冰箱。2.3.3.5对左耳组织切片进行HE染色（1）按如下方式对切片予以脱蜡水化20 西南医科大学硕士学位论文①二甲苯I10min②二甲苯II5min③100%乙醇I5min④100%乙醇II3min⑤95%乙醇I2min⑥95%乙醇II2min⑦95%乙醇I2min⑧85%乙醇2min⑨自来水2min（2）按以下顺序对切片进行染色①苏木素染液5min②自来水冲洗lmin③1%盐酸酒精分化2s④自来水冲洗15min以上至反蓝⑤伊红染液水溶lmin⑥自来水冲洗15min（3）对切片进行脱水、透明、封固①75%乙醇2min21 西南医科大学硕士学位论文②85%乙醇2min③95%乙醇I5min④95%乙醇II5min⑤无水乙醇I5min⑥无水乙醇II5min⑦二甲苯I2min⑧二甲苯II2min⑨中性树胶封片2.3.3.6组织学评估、炎症细胞计数光镜下观察切片，随机选择5个区域进行图像分析并使用Baker法分别评估每一张图像的组织学积分。计数并取5个区域炎细胞数的均数。Baker法评分方式见表2。表2Baker法评分表Table2ThetableofBaker项目组织学评分角质层Munro脓肿2.0分角化不全1.0分角化过度0.5分表皮层表皮突伸展呈棒状0.5、1.0、1.5分（轻-中-重）棘层肥厚1.0分颗粒层消失1.0分真皮层炎细胞浸润0.5、1.0、2.0分（轻-中-重）乳突上伸杵状变1.0分毛细血管扩张0.5分22 西南医科大学硕士学位论文2.3.3.7VEGF检测分离血清后，其VEGF值采用ELISA法测得。（1）准备：从冰箱拿出试剂盒，室温条件下放置30min。（2）配液：蒸馏水稀释。20倍浓缩洗涤液。配置成原倍洗涤液。（3）加入标准品、待测样本：首先，将标准样品孔、样品孔和空白对照孔分别标记在酶标包被板上，并将包被板固定在框架上。在标准品孔将50uL标准品加入，在样本孔内先后分别将10uL待测样本、40uL样本稀释液加进去。空白对照孔无处理。封板膜进行封板。（4）温育：把包被板放入水浴器内予以温育30min，温度设定成37℃。（5）洗板：将封板膜取掉，把孔内液体用力倒掉、拍干，加入洗涤液并放置1min之后用力倒掉、拍干，重复上述步骤5次。（6）加酶：分别将50uL酶标液滴入各孔。空白对照孔无处理。（7）温育：再次封板，置于37℃水浴器内孵化30min。（8）洗板：将封板膜取掉，将孔内液体用力倒掉、拍干，加入洗涤液并放置1min之后用力倒掉、拍干，重复上述步骤5次。（9）显色：先后于每个孔内滴入显色剂A、B液每种50uL。用手前后左右来回摇30s使其混匀，37℃并遮光放15min等待显色。（10）终止：拿出酶标板，将封板膜取掉，把终止液50uL滴入各孔。反应此时停止(颜色立即由蓝转黄)。（11）测定：于反应结束后15min内，用空白孔调节零点，依次测出23 西南医科大学硕士学位论文和记录每个孔OD值。测量波长为450nm。（12）计算：参照所记录的标准品浓度和相应OD值。得到标准曲线的直线回归方程。利用样品OD值，根据前面公式得出样品浓度。最终浓度=实际测定浓度×总稀释倍数。2.3.3.8NO测定血清中NO用硝酸根还原法测定。具体操作步骤如下：（1）依次对标准、测定、空白管做记号。（2）将试剂一、试剂二分别加入三个管子里，摇晃30s使其混匀，放进37℃水中进行温育。（3）将试剂三、试剂四分别加入三个管子里，摇晃30s使其混匀，静置于室温下40min。（4）将三个管子置于离心机内，盖好盖子予以离心10min（速率为3500~4000转/分）。借助移液器将上层血清小心移取至显色剂里，摇晃使其混匀，室温放10min。（5）在蒸馏水为零的条件下，对各管OD值进行测量。光径大小为0.5cm，测量波长为550nm。（6）计算方法：NO含量(umol/L)=（测定管OD值-空白管OD值）/（标准管OD值-空白管OD值）×标准品浓度×稀释倍数。2.3.3.9MVD检测皮损MVD用CD34抗体免疫组化法测得。操作步骤如下:24 西南医科大学硕士学位论文（1）对已制好的石蜡切片进行脱蜡水化、热修复处理，滴加一抗，37℃条件下静置1h。（2）滴入二抗（由生物素标记）。在37℃条件下静放30min。（3）滴加Streptavidin（由Oxidase标记）。在37℃条件下静放30min。（4）DBA染色。（5）苏木素复染封片。以上每个步骤后均予以PBS洗5min，重复3次。（6）结果判读：首先，肉眼于低倍镜(×100)选出阳性表达程度较高的位置，调整为高倍镜（×400）分别计数微血管。选5个高倍镜下区域计数微血管，5个数均值即为MVD。CD34抗体表达部位为真皮浅层微血管，染色成功的阳性结果表现为浅层真皮见棕黄色内皮细胞或内皮细胞簇。一个管腔为一根血管，管腔面积＞8个RBC直径者、厚肌层者除外。2.3.3.10Ang-2检测皮损组织血管生成素-2（Ang-2）用SABC法检测。操作步骤如下：（1）脱蜡、水化，蒸馏水洗10min。（2）灭活：30%H2O2与纯甲醇以1：50的比例进行配伍，常温条件下泡30min。使内源性过氧化物酶处于失活状态，蒸馏水清洗10min。（3）PBS冲洗2min，共3次。25 西南医科大学硕士学位论文（4）10%正常山羊血清封闭液封闭10min。用力倒掉额外的液体，此次不清洗。（5）滴加一抗（以1：125稀释），37℃条件下静置2h。（6）PBS冲洗2min×3次。（7）滴加二抗（由生物素标记），37℃条件下静置30min。（8）PBS冲洗2min×3次。（9）滴加SABC工作液，37℃条件下静置30min。（10）PBS冲洗2min×3次。（11）显色：将DAB显色剂（蒸馏水1ml+A、B、C剂分别一滴均匀混合）滴到切片。常温条件下显色5min。（12）蒸馏水洗涤，终止显色。（13）苏木素轻度复染。常规脱水、透明、封片。阴性对照以PBS代替一抗。步骤同前。（14）结果判读（显微镜下观察）：该抗体在细胞质和(或)细胞膜层面呈现褐黄颗粒，即阳性，未染色则为阴性。每一张切片均随机选择5个区域，保存图像并逐一予以定量分析。分别记录阳性表达区的光密度值（IOD值），计算平均数，以该值反应本块组织Ang-2表达强度。分析软件运用BI-2000型全自动图像处理系统完成。26 西南医科大学硕士学位论文2.4统计学分析统计软件SPSS20.0进行统计描述和推断：满足正态分布的定量资料使用x±s表示，用单因素方差分析进行组间比较分析，用最小差异显著法（leastsignificantdifference，LSD）进行组间两两比较分析，用秩和检验对不满足正态分布的定量资料的组间比较进行分析。检验水准α=0.05，当P<0.05时，差异具有统计学意义。27 西南医科大学硕士学位论文结果1小鼠肉眼观察情况1.1一般情况五倍子乳膏（高、中、低浓度）、他扎罗汀乳膏干预4周后的小鼠精神状态、反应灵敏度均较空白组、凡士林组有所改善，较FVB鼠组略差。FVB鼠组、空白组4周前后变化不明显。1.2耳部皮损表现用药后4周观察，转基因K14-VEGF银屑病小鼠空白组耳部红斑、肿胀明显，皮损明显增厚凸起，大部分皮肤表面覆有厚层鳞屑；他扎罗汀组小鼠用药后耳廓红斑、鳞屑、肿胀明显消退，皮损肥厚情况消退，毛细血管扩张明显改善；五倍子乳膏高浓度组小鼠耳廓红斑、肿胀程度明显减轻，未见明显鳞屑，皮损肥厚程度明显改善，毛细血管扩张明显改善且程度略低于他扎罗汀组；五倍子乳膏中浓度组小鼠耳廓红斑、肿胀程度有较大程度的减轻，皮损肥厚较空白组改善，红斑轻微高出正常皮面，可见少许鳞屑附着，毛细血管扩张改善；五倍子乳膏低浓度组小鼠用药后，耳廓红斑、肿胀程度有一定程度的减轻，鳞屑有所减少，皮损肥厚较空白组有所改善，斑块中等度高出正常皮肤，毛细血管扩张部分改善；凡士林组小鼠耳部皮损较空白组皮损红斑、肿胀稍微减轻，鳞屑略有减少，但皮损肥厚程度仍较严重。肉眼观察以上六组小鼠耳部皮损，在空白组小鼠皮损基础上比较，他扎罗汀组小鼠皮损改善最为明显，五倍子乳膏高、中、低浓度组小鼠皮损28 西南医科大学硕士学位论文改善情况依次递减，凡士林组改善甚微，FVB鼠变化不明显。以上药物均不能使皮损恢复至FVB小鼠水平。见图1。FVB鼠空白组小鼠凡士林组小鼠他扎罗汀乳膏组小鼠50%五倍子乳膏组小鼠25%五倍子乳膏组小鼠15%五倍子乳膏组小鼠图1各组小鼠耳部皮损表现Fig.1Theappearanceofearlesionsineachgroupofmice29 西南医科大学硕士学位论文1.3PASI评分各组间PASI评分差异使用秩和检验进行分析，发现：空白组＞凡士林组＞低浓度组＞中浓度组＞高浓度组＞他扎罗汀组＞FVB鼠2组，=49.330，P＜0.001，差别具有统计学意义，即各组PASI评分不全相同。其中他扎罗汀与高、中、低浓度、凡士林、空白组、FVB鼠之间，高浓度与空白组、凡士林之间，中浓度与空白组、凡士林之间，低浓度与空白组、凡士林之间，差别具有统计学意义（P＜0.05）。高、中浓度间，中、低浓度间，凡士林与空白组间，差别不显著（P＞0.05）。见表3，图2。表3各组小鼠耳部皮损PASI评分的比较(M[P25，P75])Table1ComparisonofPASIscoresinearlesionsofmiceineachroup(M[P25,P75])2分组NPASI评分P值他扎罗汀组101[1,2]高浓度组103[2,4]a中浓度组103.5[2,5]a低浓度组105[4,6]a49.330<0.001凡士林组106[6,7]abc空白组107[7,8]abcdFVB鼠组100[0,0]abcdef注：a：与他扎罗汀组比较，P<0.05；b：与高浓度组比较，P<0.05；c：与中浓度组比较,P<0.05；d：与低浓度组比较，P<0.05；e：与凡士林组比较，P<0.05；f：与空白组比较，P<0.05.Note:a：Comparisonwithtazarotenegroup(P<0.05).b：Comparisonwithhighconcentrationgroup(P<0.05).c：Comparisonwithmediumconcentrationgroup(P<0.05).d：Comparisonwithlowconcentrationgroup(P<0.05).e：Comparisonwithmatrixgroup(P<0.05).f：Comparisonwithblankgroup(P<0.05).30 西南医科大学硕士学位论文图2各组小鼠耳部皮损PASI评分的比较Fig.2ComparisonofPASIscoresinearlesionsofmiceineachgroup2HE染色2.1HE染色光镜下表现用药4周后，光镜下观察HE染色后的病理切片。空白组可见角质增厚、不全角化，表皮突下伸明显，有明显的真皮乳头上伸和柞样表现，以及明显毛细血管扩张、炎细胞等病理特征。他扎罗汀组小鼠可见薄层角质，少许过度角化，未见明显不全角化，棘层、表皮突、真皮乳头层明显改善，毛细血管扩张、炎症现象明显好转。五倍子乳膏高、中、低浓度三组小鼠可见增厚角质层，过度、不全角化、棘层肥厚现象明显好转，表皮突下延明显改善，毛细血管扩张与炎细胞浸润也有不同程度减少，其中以高浓度组小鼠的上述表现改善最为明显，中、低浓度组小鼠次之，且高浓度组小鼠毛细血管扩张改善情况较他扎罗汀略佳；凡士林小鼠角化过度、不全现象都有少许改善，棘层厚、表皮突下延、真皮乳突上延、毛细血管扩张、炎症等现象改善不显著。31 西南医科大学硕士学位论文在空白组小鼠基础上比较，以上六组小鼠组织病理切片表现以他扎罗汀组改善最为明显，五倍子乳膏高、中、低浓度依次递减，凡士林鼠改善甚微。FVB鼠未见显著过度、不全的角化、棘层厚、表皮突下伸、毛细血管扩张、炎症等现象。以上药物均不能使皮损恢复至FVB小鼠水平。见图3。FVB鼠空白组小鼠凡士林组小鼠他扎罗汀组小鼠50%五倍子乳膏组小鼠25%五倍子乳膏组小鼠15%五倍子乳膏组小鼠图3各组小鼠耳部皮损HE染色光镜下表现（×100）Fig.3UnderlightmicroscopewithHEstaininginearlesionsofmiceineachgroup32 西南医科大学硕士学位论文2.2Baker评分单因素方差分析用于对比组间Baker评分的差异，两两对比用LSD法，发现：空白组＞凡士林组＞低浓度组＞中浓度组＞高浓度组＞他扎罗汀组＞FVB鼠组，F=130.394，P<0.001，差别具有统计学意义，即各组Baker分不全相同。其中他扎罗汀与高、中、低浓度、凡士林、空白组、FVB鼠间，高浓度与空白组、凡士林间，中浓度与空白组、凡士林间，低浓度与空白组、凡士林间，高、中浓度间，高、低浓度间，中、低浓度间，有显著差异（P＜0.05）。凡士林和空白组，无显著差异（P＞0.05）。见表4，图4。表4各组小鼠耳部皮损Baker评分的比较（x±s）Table4ComparisonofBakerscoreinearlesionsofmiceineachgroup(x±s)分组NBaker评分FP值他扎罗汀组101.32±0.23高浓度组102.53±0.39a中浓度组103.01±0.28ab低浓度组103.31±0.26abc130.394<0.001凡士林组103.81±0.48abcd空白组104.03±0.42abcdFVB鼠组100.86±0.18abcdef注：a：与他扎罗汀组比较，P<0.05；b：与高浓度组比较，P<0.05；c：与中浓度组比较,P<0.05；d：与低浓度组比较，P<0.05；e：与凡士林组比较，P<0.05；f：与空白组比较，P<0.05.Note:a：Comparisonwithtazarotenegroup(P<0.05).b：Comparisonwithhighconcentrationgroup(P<0.05).c：Comparisonwithmediumconcentrationgroup(P<0.05).d：Comparisonwithlowconcentrationgroup(P<0.05).e：Comparisonwithmatrixgroup(P<0.05).f：Comparisonwithblankgroup(P<0.05).33 西南医科大学硕士学位论文图4各组小鼠耳部皮损Baker评分的比较Fig.4ComparisonofBakerscoresinearlesionsofmiceineachgroup2.3炎细胞计数单因素方差分析用于比对组间炎细胞计数的差异，两两对比用LSD法，发现：空白组＞凡士林组＞低浓度组＞中浓度组＞高浓度组＞他扎罗汀组＞FVB鼠组，F=64.145，P＜0.001，差别具有统计学意义，即各组炎细胞计数的数量不完全一样。其中他扎罗汀与高、中、低浓度、凡士林、空白组、FVB鼠间，高浓度与空白组、凡士林间，中浓度与空白组、凡士林间，低浓度与空白组、凡士林间，高、中浓度间，高、低浓度间，差别具有统计学意义（P＜0.05）。中、低浓度间，凡士林与空白组间，差别无统计学意义（P＞0.05）。见表5，图5。34 西南医科大学硕士学位论文表5各组小鼠耳部皮损炎细胞计数的比较（x±s）Table5Comparisonofthecellcountsofeardermatitisineachgroup(x±s)分组N炎细胞计数FP值他扎罗汀1043.16±5.87高浓度组1056.91±5.98a中浓度组1065.11±8.37ab低浓度组1070.11±6.30ab64.145<0.001凡士林组1081.04±10.59abcd空白组1086.06±9.12abcdFVB鼠组1034.50±4.04abcdef注：a：与他扎罗汀组比较，P<0.05；b：与高浓度组比较，P<0.05；c：与中浓度组比较,P<0.05；d：与低浓度组比较，P<0.05；e：与凡士林组比较，P<0.05；f：与空白组比较，P<0.05；Note:a：Comparisonwithtazarotenegroup(P<0.05).b：Comparisonwithhighconcentrationgroup(P<0.05).c：Comparisonwithmediumconcentrationgroup(P<0.05).d：Comparisonwithlowconcentrationgroup(P<0.05).e：Comparisonwithmatrixgroup(P<0.05).f：Comparisonwithblankgroup(P<0.05).图5各组小鼠耳部皮损炎细胞计数的比较Fig.5Comparisonofcellcountsineardermatitisofmiceineachgroup35 西南医科大学硕士学位论文3VEGF单因素方差分析用于对比组间VEGF的差异，两两对比用LSD法，发现：空白组＞凡士林组＞低浓度组＞中浓度组＞高浓度组＞他扎罗汀组＞FVB鼠组，F=64.145，P<0.001，差别具有统计学意义，即各组VEGF的含量不完全一样。其中他扎罗汀与高、中、低、凡士林、空白组、FVB鼠间，高浓度与空白组、凡士林间，中浓度与空白组、凡士林间，低浓度与空白组、凡士林间，高、中浓度间，中、低浓度间，高、低浓度间，存在显著差异（P＜0.05）。凡士林、空白组间，差别不显著（P＞0.05）。见表6，图6。表6各组小鼠血清VEGF的比较（x±s）Table6ComparisonofserumVEGFinmiceofeachgroup(x±s)分组NVEGFFP值他扎罗汀组1078.94±12.04高浓度组1095.19±15.41a中浓度组10111.31±21.28ab低浓度组10125.49±10.13abc64.682<0.001凡士林组10153.5±18.36abcd空白组10164.8±13.43abcdFVB鼠组1056.±14.08abcdef注：a：与他扎罗汀组比较，P<0.05；b：与高浓度组比较，P<0.05；c：与中浓度组比较,P<0.05；d：与低浓度组比较，P<0.05；e：与凡士林组比较，P<0.05；f：与空白组比较，P<0.05.Note:a：Comparisonwithtazarotenegroup(P<0.05).b：Comparisonwithhighconcentrationgroup(P<0.05).c：Comparisonwithmediumconcentrationgroup(P<0.05).d：Comparisonwithlowconcentrationgroup(P<0.05).e：Comparisonwithmatrixgroup(P<0.05).f：Comparisonwithblankgroup(P<0.05).36 西南医科大学硕士学位论文图6各组小鼠血清VEGF的比较Fig.6ComparisonofserumVEGFineachgroup4NO单因素方差分析用于对比组间NO含量的差别，两两对比用LSD法，发现：空白组＞凡士林组＞低浓度组＞中浓度组＞高浓度组＞他扎罗汀组＞FVB鼠组，F=77.984，P<0.001，差别具有统计学意义，即各组NO不完全一样。其中他扎罗汀与高、中、低、凡士林、空白组、FVB鼠间，高浓度与空白组、凡士林间，中浓度与空白组、凡士林间，低浓度与空白组、凡士林间，高、低浓度间，中、低浓度间，存在显著差异（P＜0.05）。凡士林与空白组间，高、中浓度间，差别无显著性差异（P＞0.05）。见表7，图7。37 西南医科大学硕士学位论文表7各组小鼠血清NO含量的比较（x±s）Table7ComparisonofNOcontentinserumofmiceineachgroup(x±s)分组NNO含量FP值他扎罗汀组1032.34±7.38高浓度组1060.52±11.36a中浓度组1064.93±8.55a低浓度组1074.49±6.29abc77.984<0.001凡士林组1083.87±10.26abcd空白组1088.89±10.07abcdFVB鼠组1024.00±7.00abcdef注：a：与他扎罗汀组比较，P<0.05；b：与高浓度组比较，P<0.05；c：与中浓度组比较,P<0.05；d：与低浓度组比较，P<0.05；e：与凡士林组比较，P<0.05；f：与空白组比较，P<0.05.Note:a：Comparisonwithtazarotenegroup(P<0.05).b：Comparisonwithhighconcentrationgroup(P<0.05).c：Comparisonwithmediumconcentrationgroup(P<0.05).d：Comparisonwithlowconcentrationgroup(P<0.05).e：Comparisonwithmatrixgroup(P<0.05).f：Comparisonwithblankgroup(P<0.05).图7各组小鼠血清NO含量的比较Fig.7ComparisonofNOcontentinserumofmiceineachgroup38 西南医科大学硕士学位论文5MVD5.1统计分析单因素方差分析用于对比组间MVD含量的差异，两两对比用LSD法，发现：空白组＞凡士林组＞低浓度组＞中浓度组＞高浓度组＞他扎罗汀组＞FVB鼠组，F=38.119，P<0.001，差别具有统计学意义，即各组MVD的表达不完全一样。其中他扎罗汀与高、中、低、凡士林、空白组、FVB鼠间，高浓度与空白组、凡士林间，中浓度与空白组、凡士林间，低浓度与空白组、凡士林间，高、低浓度间，中、低浓度间，存在显著差异（P＜0.05）。凡士林与空白组，高、中浓度间，差别无显著性差异（P＞0.05）。见表8，图8。表8各组小鼠耳部皮损MVD的比较（x±s）Table8ComparisonofMVDinearlesionsofmiceineachgroup(x±s)分组NMVDFP值他扎罗汀组104.95±0.90高浓度组107.02±1.13a中浓度组107.36±1.36a低浓度组108.63±1.02abc38.119<0.001凡士林组109.75±1.95abcd空白组1010.25±1.26abcdFVB鼠组103.74±0.52abcdef注：a：与他扎罗汀组比较，P<0.05；b：与高浓度组比较，P<0.05；c：与中浓度组比较,P<0.05；d：与低浓度组比较，P<0.05；e：与凡士林组比较，P<0.05；f：与空白组比较，P<0.05.Note:a：Comparisonwithtazarotenegroup(P<0.05).b：Comparisonwithhighconcentrationgroup(P<0.05).c：Comparisonwithmediumconcentrationgroup(P<0.05).d：Comparisonwithlowconcentrationgroup(P<0.05).e：Comparisonwithmatrixgroup(P<0.05).f：Comparisonwithblankgroup(P<0.05).39 西南医科大学硕士学位论文图8各组小鼠耳部皮损MVD含量的比较Fig.8ComparisonofMVDcontentinearlesionsofmiceineachgroup5.2免疫组化用药4周后光镜观察各组鼠耳部皮损中微血管MVD免疫组化结果（DAB显色×100）：在真皮浅层，CD34于FVB鼠组为阴性；CD34于空白组为强阳性；CD34于凡士林组为强阳性；CD34于他扎罗汀组为弱阳性；CD34于五倍子乳膏组为阳性，其中，阳性区域高浓度＜中浓度＜低浓度。见图9。40 西南医科大学硕士学位论文FVB鼠空白组小鼠凡士林组小鼠他扎罗汀组小鼠50%五倍子乳膏组小鼠25%五倍子乳膏组小鼠15%五倍子乳膏组小鼠图9各组小鼠耳部皮损CD34免疫组化图片（×100）Fig.9TheimmunohistochemicalpictureswithCD34ofearlesionsofmiceineachgroup（×100）41 西南医科大学硕士学位论文6Ang-26.1统计分析单因素方差分析用于对比组间Ang-2（IOD值）的差别，两两对比用LSD法，发现：空白组＞凡士林组＞低浓度组＞中浓度组＞高浓度组＞他扎罗汀组＞FVB鼠组，F=21.931，P<0.001，差异具有统计学意义，即各组Ang-2的表达不完全一样。其中他扎罗汀与高、中、低、凡士林、空白组、FVB鼠间，存在显著差异（P＜0.05）。高浓度与空白组、凡士林间，中浓度与空白组、凡士林间，低浓度与空白组、凡士林间，高、低浓度间，中、低浓度间，高、中浓度间，凡士林与空白间，差别无显著性差异（P＞0.05）。见表9，图10。表9各组小鼠耳部皮损Ang-2的比较（x±s）Table9ComparisonofAng-2inearlesionsofmiceineachgroup(x±s)分组NAng-2FP值他扎罗汀组109.38±0.93高浓度组1011.44±1.78a中浓度组1011.65±1.29a低浓度组1011.66±0.92a21.931<0.001凡士林组1012.15±1.33a空白组1012.34±1.05aFVB鼠组107.41±0.99abcdef注：a：与他扎罗汀组比较，P<0.05，b：与高浓度组比较，P<0.05；c：与中浓度组比较,P<0.05；d：与低浓度组比较，P<0.05；e：与凡士林组比较，P<0.05；f：与空白组比较，P<0.05；Note:a：Comparisonwithtazarotenegroup(P<0.05).b：Comparisonwithhighconcentrationgroup(P<0.05).c：Comparisonwithmediumconcentrationgroup(P<0.05).d：Comparisonwithlowconcentrationgroup(P<0.05).42 西南医科大学硕士学位论文e：Comparisonwithmatrixgroup(P<0.05).f：Comparisonwithblankgroup(P<0.05).图10各组小鼠耳部皮损Ang-2的比较Fig.10ComparisonofAng-2inearlesionsofmiceineachgroup6.2免疫组化用药4周后光镜下观察各组小鼠耳部皮损中真皮乳头层的血管内皮细胞的细胞浆和（或）细胞膜，结果（DAB显色×100）如下：在真皮乳头层，Ang-2于FVB鼠组为阴性；Ang-2于空白组为强阳性；Ang-2于凡士林组为强阳性；Ang-2于他扎罗汀组为弱阳性；Ang-2于五倍子乳膏低、中、高浓度组为阳性，且三组间无明显差异（P＞0.05）。见图11。43 西南医科大学硕士学位论文FVB鼠空白组小鼠凡士林组小鼠他扎罗汀组小鼠50%五倍子乳膏组小鼠25%五倍子乳膏组小鼠15%五倍子乳膏组小鼠图11各组小鼠耳部皮损免疫组化(Ang-2)图片（×100）Fig.11TheimmunohistochemicalpictureswithAng-2ofearlesionsofmiceineachgroup（×100）44 西南医科大学硕士学位论文讨论1中医对银屑病的认识1.1病因病机及治疗中医对于皮肤病的命名，多以疾病外在形态或症候为依据，因此同一疾病不同文献记载的病名可有差别。根据银屑病的症状表现，在古籍中发现“白疕”、“干癣”、“松皮癣”、“白壳疮”这几种病描述与本病更为接近。在“久癣”、“风癣”、“顽癣”这几种中也有包含。根据古籍记载，本病病因病机分为内外因。最早于《诸病源候论》提出本病是由于风、寒、湿邪侵袭人体，肌肤失于濡养而致[19]。《医学入门》提到：本病内因血分有热燥，再加上风毒侵袭皮肤之为外因，内外邪气相搏结而致病。《证治准绳》认为本病与肺、脾相关，内因脾经湿热、肺气不固，外感风毒，内外相合而为病。近年来，由于人们身处的生活、社会等环境的改变，现代医家对病因病机进行了新的拓展。我国著名皮肤科老中医朱仁康认为本病病因以“血分有热”为主。初发者多为“血热风燥”，久病者多为“血虚风燥”。赵炳南老专家的观点是血热为主，情志内耗、饮食不节、外邪入侵，内外相合致病[20]。综上言之，中医认为银屑病为内外合邪，化热入血，生风生燥，肌肤失养，而发为本病。银屑病治疗中外治疗法尤为重要。且外治法操作简单方便快捷、针对性强，能够更大程度的为广大银屑病患者所接受。本病以寻常型占多数，辨证属血热。因而医治原则不管是内还是外治皆重点遵循清热、凉血、润燥进行。既往治疗中常见的主要有乳、酊、膏、霜、针45 西南医科大学硕士学位论文灸疗法、放血疗法等。其中，最常用的是乳膏制剂，其稳定性好、保湿效果强等特点正好符合银屑病润燥的治疗原则。1.2箍围疗法与寻常型银屑病箍围，中医外治法之一，具有箍集围聚、收束疮毒的作用，传统用于疮疡、赘瘤、虫兽咬伤、目赤肿痛、目翳。《太平圣惠方》又名贴，敷贴，箍围药，围药。今人朱仁康认为，围药是将药物围敷于患处，依靠药物的箍聚疮毒作用，收束疮形，制止毒邪扩散，使疮疡易消易溃易敛的一种外治方法。此法应用有着悠久的历史，早在《五十二病方》“颐痈节”记有围药处方。明朝许多著作中，均有“围药”的专门论述。殆至清代，围药为广大医家所推崇。徐大椿在《医学源流论•围药论》曰“外科之法，最重外治；而外科之中，尤重围药......”。《外科正宗》明确提出箍围的目的在于“收束根本，庶不开大”。吴师机《理瀹骈文》称围药功用：“一是拔，一是截。凡病症聚结之处，拔之则病自出，无深入内陷之患，病所经由之处，以截之则邪自出，无妄行传变之虞。”在近代经典论著《中医辞海》明确提出其作用为截毒，束毒，拔毒，温化，行瘀，清热，定痛，排毒。从方法上看，箍围分为盖顶涂围和留顶涂围，用于外疡初起时，箍围药宜敷满整个病变部位；若毒已结聚，或溃后余肿未消，宜敷于患处四周，中央留孔。该法中医外治里扮演了重要的角色。《疡医大全》提出“施治，必需先审阴阳”。据阴阳辨证分析，寻常型银屑病进行期皮损为阳。阳病者应该使用阴药。根据病因病机，箍围药物中的寒凉箍围药、收敛箍围药可以应用于寻常型银屑病的治疗。46 西南医科大学硕士学位论文1.3经络理论与寻常型银屑病经络理论是传统医学的重要分支。经络包括经脉与络脉，前者为主干，后者为分支，交织成网，共同构建出人体气血通畅运行的通路。络脉又包含十五络脉、浮络、孙络。其中，浮络分布在人体身上最大的器官——皮肤。浮络具有可以将人体全身的各类精气与血液传送到各个部位，进而发挥相应物质的功能以营养人体。现代医家吴以岭[21]总结出了一个新的观点，他说到细小的络脉可将血液由点到面进行输布，进而发挥全身濡养等作用，络脉的分布及功能与中、小、微血管，甚至微循环基本相同，微血管归属于浮络系统。银屑病的病理组织学表现出明显的微血管异常增生的特点，且血管的异常分布与形成是其首先表现的病理变化，因而经络角度分析银屑病，亦是浮络范畴。且本病是浮络病变在前，皮部病变在后。所以治疗银屑病，更应从调整浮络入手，以箍围收束新生浮络，调整减少其气血流注，使过度增殖的皮部失去足够的气血濡养，从而达到束毒截毒拔毒的目的。外用寒凉箍围药，即清热凉血药，直接作用于皮肤病变部位，从经络理论来看，可调整收敛浮络，减少病变浮络中的气血输布。所以收敛箍围药治疗寻常型银屑病时，可有效的束毒截毒拔毒，对于解决本病皮损短时间内扩散的问题上有明显优势。从作用的最终结果来看，收敛箍围多选用药性味酸甘或苦涩，具有收敛固涩的作用，其类同于现代医学中的抗血管增生剂的效果。47 西南医科大学硕士学位论文2现代医学对寻常型银屑病的认识银屑病是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病。以红斑、鳞屑为主要症状，可伴随瘙痒感，程度因人而异。临床上将本病分为：寻常型、关节型、脓疱型、红皮病型，寻常型尤为多发，比例达95%以上。银屑病在世界各地不同人群中的患病率有明显差异，欧美报告的患病率[1]约1%～3%。在我国，目前最为全面的关于银屑病患病率的调查是在[2]1984年，统计结果显示：总患病率达0.123%；2008年丁晓岚等人对太原市、西昌市、焦作市等为代表的覆盖全国东南中西北区域的全[22]国六省市进行的调查显示：总患病率是0.47%。对比两年较为全面的统计结果，可见银屑病患病人数比例正逐年增加。同时据以上两次[2，22]具有代表性的全国范围内大样本流行病学调查，我们还可以看出，在性别上本病发病率差异并不明显，但从地域分布特点来看，北方患病率低于南方，农村低于城市，并且可知影响银屑病产生的流行病学还与家族易感性、季节变化、外在创伤、情志等有关。银屑病的发病机理尚不完全明确，既往众多研究均表明，免疫学紊乱是重要环节，与T细胞关系尤为密切。银屑病患者常有遗传易感的基础，在内外因作用下，机体的免疫系统受刺激，引发以T细胞为主的免疫学功能失调，炎症相关因子聚集于皮肤，局部产生炎症病变、KC增生异常，进而出现银屑病一系列典型的临床表现。其病理组织学上，主要表现出KC异常增殖、微血管异常增多及炎症细胞浸润的特征，而血管异常增多和分布是首先发生的病理变化[4]。在正常人体皮肤，因人体本身会产生抑制血管过度生成的物质来维持平衡，因而48 西南医科大学硕士学位论文一般不存在微血管增殖过度的现象。但银屑病患者体内，大量促炎因子存在并诱发血管过度增生而导致原有的平衡状态无法继续维持下去，且血管过度增生、异常迂曲及血管的高通透性等现象同时会反过来恶化炎症反应，相互影响进一步引发银屑病的产生与恶化。因而，血管增生是银屑病发生、发展的重要原因。治疗上，系统性治疗的药物主要有免疫抑制剂、维A酸类、抗菌药、免疫调节剂、生物制剂等[23]，但内服药物存在着大量副作用及不良反应，因而，治疗多围绕局部外用药物进行。现阶段，市面上常用的银屑病外用西药有：①激素类制剂：具有有效地抑制KC增生、较强的抗炎疗效[24]，但长期外用可出现用药部位皮肤萎缩、色素沉着等不良反应，停药易复发。②维A酸类制剂：作用于KC并能有效控制其异常增生。长期使用常可引发局部炎症反应、皮肤水分过度缺失、出现裂口等不良反应。③钙调磷酸酶抑制剂：可有效去除Th活化时的神经磷酸酶。其副作用比激素的副作用小，但少数患者可出现皮肤烧灼感、瘙痒、流感样症状、视力异常等。价格也相对昂贵。④维生素D3类似物制剂：具有有效发挥对抗机体炎性反应、控制KC过度增生、免疫抑制效用。但常出现局部皮肤烧灼、瘙痒、干燥等情况。⑤地蒽酚、水杨酸类、焦油制剂等，临床上虽具有一定疗效，但副作用过大现今已极少应用。综上，外用西药制剂虽能在短时间内对银屑病病情发展有不同程度的控制作用，但因大多药物副作用大、价格昂贵而存在较多的局限。本实验采用了临床明确具有调节表皮细胞分化和增殖以及减少49 西南医科大学硕士学位论文炎症等作用的0.1%他扎罗汀乳膏对比不同浓度的五倍子乳膏，结果发现，与模型组相对比，五倍子乳膏和0.1%他扎罗汀乳膏在治疗转基因K14-VEGF银屑病小鼠4周后，PASI评分、Baker评分、炎细胞计数均有不同程度的改善，以0.1%他扎罗汀乳膏变化最为明显，五倍子乳膏高、中、低浓度治疗后所带来的变化递减，表明五倍子乳膏外用于银屑病皮损可起到明显地抗炎、调节角质细胞异常增殖等功效，说明五倍子乳膏对转基因K14-VEGF银屑病鼠具有抗血管增生作用。3银屑病动物模型研究构建合适的模型，对深入探究银屑病起病机理和治疗方法至关重要。现阶段，根据银屑病样皮损产生的方式，常见的模型有药物诱发、鼠尾、移植、自发产生和转基因方式。诱发型是由操作如照射紫外线、外用药物、喂养特殊饲料等办法促使实验动物的皮层出现人类银屑病同样或类似的皮损。该方法简单、快速且成功率高，因而被较多研究者采用。本模型虽然与人类银屑病皮损的肉眼及病理表现有一定的相似性，但仍有较大差异，因而近年对此类动物模型的研究及报道渐少。生物医学鼠尾模型[25]，因小鼠正常发育过程中，其尾巴表皮层的KC仍然有核存在，颗粒层消失，基本符合银屑病组织学表现，因此不需要再复制即可直接使用。但该模型的部位很局限，药物研究时存在诸多不足，因而研究者采用较少。近年来研究中，移植模型是为了能在小鼠皮层产生银屑病皮损，通过小手术在小鼠皮层定植人类银屑病的皮肤来实现，这个50 西南医科大学硕士学位论文方法可很大程度低将物种之间的差异降低。自发型现阶段暂未发现。前述所涉及的方法皆能较大意义地推动探究本病的发展，但是这些方式只是将一些外在表现和组织表现展现出来，耗时相对短，但其过于局限，并且不存在特异性，尚不能广泛用来研究人类银屑病发病机制及过程。近些年，模型探究更多的趋向转基因。其中，由李红等人[11]研究构建的转基因K14-VEGF银屑病动物模型是近年来较为新颖而实用的动物模型，也是本研究选取的实验动物模型。转基因K14-VEGF银屑病动物模型，是以FVB小鼠为基础，利用原核显微技术，将人K14启动子及小鼠编码基因VEGF-A164插入FVB鼠，进而实现由K14启动子在小鼠基因组对VEGF进行调控的异常表达[11]。因VEGF在小鼠皮肤长期慢性的表达可引起银屑病样的慢性炎症性及血管增生等改变，并维持时间较长，因此该模型可应用于银屑病长期的发病机制及病理过程研究，具有较强的稳定性及实用性。4VEGF与银屑病近年来大量研究表明银屑病组织病理为角质细胞异常增生伴不全角化、新生微血管异常增多、炎性细胞浸润。其中新生微血管是其早期发生的病理变化。国外学者CreamerD[26]发现，银屑病患者病灶处可见异常增多的小血管，真皮乳头层存在很明显增粗伴迂曲的微血管，病灶处皮肤的通透性与正常者相比也有显著增加，这些异常的新生血管是银屑病早期出现的病理变化。血管内皮生长因子（Vascular51 西南医科大学硕士学位论文EndotheliaGrowthFactor，VEGF）是促血管生成最重要的刺激因子。VEGF分泌来自于角质细胞，特异地表达在内皮细胞。其发挥作用的方式是通过有指向性的结合于内皮细胞胞膜与之相对应的抗体来进行。学者XiaYP等人[12]通过成功的将编码VEGF的基因插入小鼠，使得小鼠皮肤呈现出角化过度、不全、炎细胞浸润等银屑病样表现，说明VEGF在银屑病起始、进展里均占据了非同一般的地位。张锡宝等[8]通过测定并比较VEGF在42个银屑病病患和15个普通人皮肤组织的水平高低，结果发现前者VEGFmRNA及其蛋白水平明显高于后者，这表明VEGF和它的相应受体在本病血管新生过程中具有不可替代的意义。杨海龙等[5]通过比较寻常性银屑病病人皮损处和正常人皮肤VEGF，发现前者VEGF明显高于后者，说明VEGF可显著促进银屑病病人皮损处出现更多的不正常增生的血管。本实验结果提示，转基因K14-VEGF小鼠的血清VEGF水平明显高于FVB鼠，更深一层明确了VEGF在银屑病发病中扮演了重要角色，与国内外学者研究结果一致。在分别予以他扎罗汀乳膏、高、中、低浓度五倍子乳膏、凡士林五种药物的治疗后，VEGF水平在空白组基础上都呈现下降的趋势，以他扎罗汀乳膏组小鼠的疗效最为明显，高、中、低浓度组次之，但以上五个用药组血清VEGF水平仍高于FVB鼠。由此可见，高、中、低浓度五倍子乳膏、他扎罗汀乳膏对转基因K14-VEGF小鼠血清的VEGF均有降低的作用，五倍子乳膏功效稍弱于他扎罗汀乳膏，但均不能将其血清VEGF恢复到完全正常的状态。进而推测VEGF在银屑病患者血清中处于高表达状态，通过用药可使血清中VEGF52 西南医科大学硕士学位论文的水平有所下降，皮损好转，但在反复受到各种内外因素影响后，皮损极容易复发加重，且正常皮肤也可见到银屑病皮损反应，即同形现象，此时VEGF重新呈现高表达状态。通过本实验我们可得知，VEGF水平与银屑病病情密切相关，VEGF参与了银屑病的发病、发展过程，可作为判断银屑病病情变化及评价药物疗效的重要指标。5NO与银屑病一氧化氮（NO）属于炎症介质和免疫调节因子，可通过皮肤多类细胞产生的。它由一氧化氮合酶（NOS）促化形成，参与生化反应的物质是L-精氨酸。NOS包含结构型和诱生型两类同工酶：结构型包括bNOS和eNOS，具有血管扩张、神经传递的作用；诱生型即iNOS，主要在炎症及免疫刺激下才会大量产生，并且产生的NO比bNOS和eNOS更多，更能持久的起作用，因而在皮肤炎症状态下iNOS起了更为重要的作用。进而说明，NOS的活化是促使NO增多的主要原因，与NO相关的疾病也会加重。NO具有调节皮肤血液循环、诱导促炎细胞因子产生、调节组织修复、免疫调节、参与细胞凋亡、细胞毒等生物学作用。结合银屑病的炎性特点，可知NO与银屑病也有相当紧密的关系。杨政等[27]通过对比寻常型银屑病病人皮损、非皮损、正常人皮肤组织里iNOSmRNA与iNOS蛋白的含量，发现前者iNOSmRNA与iNOS蛋白水平显著高于后两者，并且寻常型银屑病病人iNOS表达程度和PASI评分存在正相关关系，可见NO可反映寻常型银屑病病人疾病进展情况，且呈正相关关系。本实验结果显示，转基因K14-VEGF银屑病小鼠他扎罗汀组、高、中、低五倍子乳膏组血53 西南医科大学硕士学位论文清NO水平较凡士林、空白组小鼠血清NO水平低，均较FVB小鼠组水平高。其中，以他扎罗汀组小鼠血清NO水平最低，五倍子乳膏三个浓度组次之。说明五倍子乳膏能有效减少转基因K14-VEGF银屑病小鼠血清NO的分泌，但效果较他扎罗汀乳膏略差，且以上所有药物均不能使转基因K14-VEGF银屑病小鼠血清NO降低至FVB小鼠组水平。由此也可推测出NO可能在银屑病患者中处于高表达状态。6MVD与银屑病微血管密度（MVD）是反映血管分布状况重要、可靠的客观指标。如前所述，银屑病典型的病理学表现之一是大量新生血管形成，已有大量的文献证明在银屑病的皮损区与非皮损区皆有新生血管形成。因而该指标可作为预估银屑病病情的一个可信赖的依据。张锡宝等[8]通过对42个寻常性银屑病病人和15个正常人皮肤组织MVD值的测定，发现寻常型银屑病病人皮损MVD阳性区域比正常人高，皮损MVD比非皮损更明显，进行期明显高于静止期，进而说明MVD是一个可以反映银屑病病情严重程度并能对其预后提供指导价值的指标。CD34是一种单链膜蛋白抗体，可特异性地对血管内皮细胞进行标记，通过对该抗体标记后的血管内皮细胞进行计量可评估组织血管新生程度，其敏感性较高，已普遍使用于血管相关因子的检测中。朱凡等[28]通过对比银屑病病人皮损与正常人皮肤的MVD表达情况发现，CD34在病人皮损处真皮浅层内皮细胞的阳性区域较正常人皮肤显著增多。因此通过使用CD34对血管内皮细胞进行标记进而可计算出相应的MVD值，以更精确的表达血管增生情况。本实验结果表明，54 西南医科大学硕士学位论文转基因K14-VEGF银屑病鼠高、中、低浓度五倍子乳膏组、他扎罗汀乳膏组小鼠皮损CD34阳性表达较凡士林、空白组小鼠低。其中，以他扎罗汀乳膏组小鼠阳性程度最低，五倍子乳膏高、中、低浓度组次之，但均较FVB鼠阳高，说明五倍子乳膏、他扎罗汀乳膏能显著降低转基因K14-VEGF银屑病小鼠MVD，虽有一定疗效尚不足以将其修复到正常状态。可推测出，五倍子乳膏具有改善转基因K14-VEGF银屑病小鼠局部皮损微循环、调节血管异常增生的作用。空白组小鼠皮损处CD34阳性区明显高于FVB小鼠，据此可推测出银屑病患者皮损中MVD比正常人的显著升高，通过用药后皮损的MVD可有下降。7Ang-2与银屑病Ang-2是一种糖蛋白，来源于内皮周围细胞，通过对内皮与周围细胞之间的连接进行调节而起到改变血管壁稳定性的作用，是调节血管生成的重要因子[10]。Ang-2具有分解血管内皮细胞与胞外基质以及周围支持细胞间的联系的功能，并可增强内皮极其周围支持细胞的活性，这些功能均能助VEGF诱导生成新血管，也表明Ang-2可增进血管增生[29]，同时Ang-2会加强与诱导VEGF水平升高，分泌增多，两者共同作用于银屑病皮损处进而促成新血管长成。国外学者ChuaRA等[30]认为，在银屑病复杂的血管生成过程中，Ang-2会先发出信号开启早期血管生成程序，进而增加了对VEGF的敏感性，皮肤炎症下的VEGF大量分泌反过来也促进Ang-2的表达，相互协同，促使更多的新生血管生成，共同加重银屑病的皮损。孙波等通过检测对比55 西南医科大学硕士学位论文Ang-2在30例银屑病病人皮损和30例正常人皮肤的表达程度，结果显示前者的Ang-2水平明显高于后者，表明在银屑病新生血管形成过程中，Ang-2起了重要作用[10]。本研究显示，他扎罗汀乳膏组Ang-2阳性程度明显好转，但阳性程度较FVB小鼠稍高，说明他扎罗汀乳膏降低转基因K14-VEGF小鼠皮损Ang-2水平有效，但尚不足以使其恢复至正常皮肤状态。五倍子乳膏高、中、低浓度组小鼠皮损Ang-2的阳性区域与凡士林、空白组差异不大，说明五倍子乳膏上降低Ang-2水平的疗效欠佳。空白组小鼠皮损Ang-2在真皮乳头层微血管内皮细胞胞浆的阳性区域明显高于FVB小鼠，可推测出在银屑病病损中Ang-2水平较高，与既往国内外研究结论相符。8五倍子乳膏组方分析及作用机理五倍子乳膏是在箍围疗法引导下，于复方五倍子箍围膏[16]组方之上，将复合药物拆分后以单味药研制出的一种针对寻常型银屑病的中药外用药物。8.1药物组成五倍子乳膏由五倍子浸膏提取物碾成细粉与凡士林混合而成。8.2药物机理五倍子，性属寒，味酸、涩，归肺、肾、大肠经，具有收湿敛疮、收敛止血、敛肺降火、固精止遗、涩肠止泻等功效[31]。《本草纲目》曰：“其味酸咸，能敛肺止血、化痰止渴收汗，其性寒，能散热毒疮肿；其性收，能除泻痢湿烂”。《本草经疏》云：“五倍子……酸平敛浮热，性燥主风湿、疮痒脓水”。因而常作为收敛箍围药的代表药。56 西南医科大学硕士学位论文现代药理发现，五倍子内含鞣酸，拥有收敛、止痒的疗效。并且，它具有压迫、收缩局部组织小血管，进而凝固血管内血液以发挥止血的效果[17]。张建军等[32]抗炎实验研究表明，五倍子具有降低小鼠耳廓肿胀的作用，即具有抗炎的功效。陈平等[33]进行文献汇总归纳出用五倍子煎洗或制膏外擦，具有收敛、抗炎、软化角质、改善局部浸润变厚、抗过敏、调理免疫以及抑制变态反应的功效。综上，五倍子的药物作用机理和银屑病相符合。9问题及展望本实验动物样本量较小，研究结果有待于进一步通过临床及多方面的实验去证实。因时间和科研资金有限，本研究尚未进行更深、更广层次的探索。有关五倍子乳膏治疗寻常型银屑病抗血管增生更多的影响因子及免疫相关因子的研究等待下一步完善与深化。另外，研究中尚未设立复方五倍子箍围膏组，下一步临床研究将完善五倍子膏和复方五倍子箍围膏的对比。57 西南医科大学硕士学位论文结论1、高、中、低浓度五倍子乳膏对转基因K14-VEGF银屑病小鼠的皮损严重程度、组织病理表现、炎细胞浸润有明显改善作用，高浓度效果最明显，其作用弱于他扎罗汀乳膏。2、高、中、低浓度五倍子乳膏可明显降低转基因K14-VEGF银屑病小鼠血清NO、VEGF水平，改善耳部皮损中的MVD,对耳部皮损的Ang-2作用不明显，其中以高浓度组改善最明显。3、五倍子乳膏治疗转基因K14-VEGF银屑病小鼠的疗效与浓度相关，其疗效随浓度递减。4、五倍子乳膏治疗转基因K14-VEGF银屑病小鼠的作用机制可能是通过抗血管增生实现。58 西南医科大学硕士学位论文参考文献1.张建中.银屑病的流行病学与危险因素[J].实用医院临床杂志,2013,10(01):4-6.2.全国银屑病流行调查组,邵长庚等.全国1984年银屑病流行调查报告[J].皮肤病与性病,1989(01):60-72.3.张广中,王萍,李若瑜,王莒生.银屑病流行病学研究进展[J].实用皮肤病学杂志,2008,1(04):247-249.4.GoodfieldM,HullSM,HollandD,etal.Investigationsofthe"active"edgeofPlaquePsoriasis:vascularProliferationPrecedeschangesinepidermalkeratin[J].BrJDermatol,2000,131(6):808-813.5.杨海龙,栗玉珍,党林.银屑病皮损中VEGF、bFGF的表达及与微血管密度的相关性研究[J].实用皮肤病学杂志,2010,3(02):65-68.6.NiedbalaW,CaiB,LiewFY.RoleofnitricoxideintheregulationofTcellfunctions[J].AnnRheumDis,2006,65(Suppl3):37-40.7.杨晓红,蔡丽敏,于淞.寻常性银屑病患者血清一氧化氮合酶的检测[J].中华皮肤科杂志,2003(12):45.8.张锡宝,罗权,吴志华,陈绍谦.血管内皮生长因子及其受体在银屑病发病中的作用及意义[J].中华皮肤科杂志,2005(03):140-142.9.PoncetS,GaseJM,JanzerRC,etal.ExpressionofTie-2inhumanperipheralandautonomicnervoussystem[J].NeuropatholApplNeurobiol.2003;29(4):361-369.10.孙波,徐雨.银屑病皮损中Survivin、VEGF和Ang-2的表达[J].中59 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西南医科大学硕士学位论文ExpDermatol,2015,40(5):556-563.30.ChuaRA,ArbiserJL.Theroleofangiogenesisinthepathogenesisofpsoriasis[J].Autoimmunity,2009,42(7):574-579.31.高学敏.中药学[M].第二版.北京：中国中医药出版社，2007:486-487.32.张建军,林清,李伟等.黄柏黄芩与五倍子配伍外用治疗急性湿疹的药效研究[J].北京中医药大学学报,2011,34(10):690-693.33.陈平,杨志波,杨光艳等.外用中药治疗慢性湿疹研究进展[J].中华中医药学刊,2012,30(03):523-526.62 西南医科大学硕士学位论文英汉缩略词对照表英文缩写英文全称中文全称VEGFVascularEndothelialGrowthFactor血管内皮生长因子LSDLeastSignificantDifference最小差异显著法KCKeratinocyte角质形成细胞NONitricOxide一氧化氮MVDMicrovascularDensity微血管密度Ang-2Angiopoietin-2血管生成素-263 西南医科大学硕士学位论文致谢岁月如歌，光阴似箭，大学生活即将结束。经历了找工作的喧嚣与坎坷，我深深体会到了写作论文时的那份宁静与思考。回首四年的求学历程，对那些引导我、帮忙我、激励我的人，我心中充满了感激。首先要感谢我的导师杨文信教授，论文定题到写作定稿，倾注了老师许多心血。在研究生期间，深深受益于杨老师的关心、爱护和谆谆教导。他作为老师，点拨迷津，让人如沐春风；作为长辈，关怀备至，让人感念至深。能师从杨文信教授，我为自己感到庆幸。在此谨向杨文信教授表示我最诚挚的敬意和感谢!感谢各位师姐、师兄，在我论文撰写以及生活工作中给予我的无私帮助。实验过程中，也得到了各位师妹的鼎力相助，在此一并感谢。感谢皮肤科全体老师及转科期间的所有老师，对我工作和学习中的帮助和理解。感谢我的家人一直以来的关心与支持。在此还要感谢我的母校——西南医科大学，母校给了我一个宽阔的学习平台，让我不断吸取新知，充实自己。64 西南医科大学硕士学位论文中医外治银屑病的现代研究进展综述摘要：银屑病是一类寻常且会反复发作的慢性炎症性皮肤病，中医外治与西药相比，副作用小，相对安全。从古代到现在，关于从中医入手医治本病所报道出来的文献有很多。现在，笔者将从中医角度出发，把相关的现代文献进展进行综述。关键词：中医；银屑病银屑病(psoriasis)，即古代之“白疕”，也就是现今家喻户晓的“牛皮癣”，是一类很寻常且会反复发作的慢性炎症性皮肤病。主要表现为表皮异常增殖、真皮炎性反应，肉眼可见明显红斑脱屑。中医认为银屑病病因病机总因内有血分存热、瘀、虚，再加上风、湿、寒邪侵袭皮肤之为外因，内外邪气相搏结而致病。根据病因，治疗主要从“清”、“凉”、“活”、“润”入手。中医外治则沿用了内治之法，也主要选取了清热、凉血、养血、润燥类药物。中药外治法是通过各种途径直接向人体病损处施加药物，利用经络促使药物渗透入里，进而发挥其功效。局部外用中药医治银屑病能够让病损区域涂搽药后更直接地受到干预，从而更迅速的加快修复病损。它具有直达病位和见效快的特点。与西药相比，副作用小，相对安全。常用药物有药膏、酊剂、油、洗剂、药物熏蒸、药浴等，以乳膏研究最多。同时，今人也将古代一些特殊疗法发展至今，融会贯通，形成“简效便廉”的特色疗法。从古代到现在，关于中医医治本病的文献有很多。现笔者将从中医角度出发，65 西南医科大学硕士学位论文把相关的现代文献进展概述如下：1乳膏黄玉华等[1]使用普连膏与凡士林加神曲调制成的膏药做对比，以50名银屑病病患作为用药对象来予以观察。结果表明，前者效果显著优于后者，有效比例依次是82.58％、63.19％。表明普连膏治疗本病疗效较好。向丽萍等[2]利用克银膏（由紫草、地榆、白芷组成）治疗30名银屑病患者，选择恩肤膏相比较。结果证实，前者临床病愈比例达26.7％，起效并达临床好转比例为63.3％。后者临床病愈比例达33.3％，起效并达临床好转比例为66.7％。但是，从后续复发人数比例来看，前者比例较后者显著更低，各为15.8％、55.0％。说明在医治银屑病时，克银膏与恩肤霜都表现出显著的疗愈功能，但从长远来看，前者相较于后者更佳。贺海英等[3]采用复方消银膏（由姜黄、黄连、黄芩、生地、当归等组成）治疗31名寻常型银屑病病患，和恩肤霜、消银膏作对照。7、14、28、56天各予以评估一次。结果见，复方消银膏起效并达临床好转比例为90％，恩肤霜起效并达临床好转比例为96.7％，消银膏起效并达临床好转比例为73.3％。综合看来，复方消银膏医治银屑病的效果佳，略次于恩肤霜，较单独的消银膏效果更好一些。朱传美等[4]使用润肤保湿膏对30名银屑病病患予以医治。同尿素乳膏相比较。各外涂56天，3次/d。结果显示：有效比例依次是93.3％、70％。可见从润肤保湿膏的疗愈功效来看较尿素更佳。王金铭等[5]利用四黄膏（由黄芩、黄连等组成）治疗300名寻常型银屑病病患，涂搽膏药后用塑料薄膜外包于用药部位以加强吸收。同紫66 西南医科大学硕士学位论文草油作比较。10天后予以评价。发现：临床疗愈比例依次是90％、60％；有效比例依次是80％、50％。可见四黄膏疗效确切并显著优于紫草油。2酊剂卢益萍[6]等临床对31名银屑病病患进行医治，予以祛银酊干预，并和皮炎宁酊作比较。使用18d后予以疗效评价。结果发现：前者效果显著优于后者，有效比例依次是90.3％、63.6％。表明祛银酊疗效更佳。3油剂油剂是用植物中提取的油来对特定的药物进行浸泡或煎炸而得。刘利红[7]用自己研发制作出的消银油医治疗68名银屑病病患。评估、总结发现：临床病愈比例是19.12％；有一定效果的比例是22.06％，总体显现出效果的比例是88.24％。由此可知，该药对于银屑病具有较为显著的功效。4洗剂、药物熏洗杨顶权等[8]针对头皮银屑病皮损研发出新型药物——消银洗剂。对34名银屑病病患进行临床疗效评估，发现消银洗剂对银屑病头皮皮损疗效好，疗愈显效比例显著比对照药物更佳。徐嵩淼[9]运用院内制剂熏洗一号方熏洗配合其院内自己研发的消银汤，同时对90名银屑病病患予以干预。对比单纯予以消银汤口服。14天后予以疗效评估。发现：前者有效程度显著比后者高，依次为83.3％、66.7％，差异显著（P＜0.05）。可见中医多种方法联合医治比单纯选用一种方67 西南医科大学硕士学位论文法效果更好，临床应用价值更高。5中医特色疗法5.1针刺及灸法WuJiaPing等[10]医治银屑病病损时，运用针加灸联合的方式。选取30名银屑病病患，以毫针刺入背俞穴，同时对银屑病病损处行艾灸。对比单纯服用阿维A胶囊者。12周后予以评价。结果发现：前者方法的治愈显效比例显著高于后者，分别是70.00％、53.33％。说明了针灸医治银屑病功效更好。介思等[11]治银屑病时，也运用了针加灸联合的方式。选取40名银屑病病患，以毫针刺入背俞穴，同时对银屑病病损处行贴棉灸。另选取39名银屑病病患，以服用复方青黛胶囊，同时在病损处规律涂搽激素软膏。8周后进行评价。结果发现：前者方法的有效比例显著高于后者，分别是82.05％、77.50％。并且，继续随诊3月，前者的疗效指数亦显著佳于后者。说明针灸医治银屑病，不管是近期还是远期效果都更好。5.2放血疗法季艳芳等[12]运用刺络放血法结合口服消银颗粒、外用糠酸莫米松软膏、维A酸软膏治疗81名银屑病患者。以单纯口服及外用药物、不行刺络放血作对比。结果发现：前者临床效果显著优于后者，有效比例依次是92.6％、84.0％。张秋婷等[13]使用刺络放血后拔罐方法结合NB-UVB医治38名银屑病患。对比仅外用激素软膏结合NB-UVB。28天后予以评估。结果发现：前者临床效果显著优于后者，有效比例依次是84.21％、62.16％，表明刺络放血后拔罐结合NB-UVB疗效68 西南医科大学硕士学位论文确切。5.3耳背割治法李科峰[14]通过对40名银屑病病患运用耳部割治进行处理，并结合口服中药。另与单纯口服中药作对比。结果发现，前者在病损范围等客观症状方面皆优于后者。表明割耳放血结合口服中药效果佳且值得推广。崔炳南等[15]通过对25名银屑病病患运用耳部割治进行处理，结合口服中药。结果表明，前者PASI评分较后者优明显降低，且其愈显率水平明显更低。说明在医治银屑病上，联合耳部割治的效果会更理想。5.4走罐疗法丰靓等[16]采用走罐配合口服中药对200名银屑病病患进行干预。另设一组仅仿效走罐为安慰。分别以走罐10、30、50次分成治疗1、2、3组。疗程为3周。对每个组进行PASI评分。发现，1、2、3组整体的PASI分值显著低于安慰者。并且，经比较发现，治疗1、2、3组中病人最能耐受、效果最明显的是走30次罐的时候。因此合理选择治疗剂量也是影响预后的关键。张成会等[17]对98名银屑病患者进行干预。随机分为3组：治疗1、2、3组。全部统一予以药浴、NB-UVB、涂搽卡泊三醇、走罐四种方法处理。区别在于每组走罐次数不同：1、2、3组分别走罐20、40、60次。疗程为6周。结果发现，3个组有效比例是68.75％、91.17％和84.37％，疗效差别显著（P＜0.05）。其中，效果最显著的是40次走罐时。69 西南医科大学硕士学位论文5.5穴位埋线法吴波等[18]临床随机选取70名银屑病病患进行干预。分为两组，均予以银屑灵口服、涂搽卤美他松处理。其中一组加用穴位埋线。疗程为8周。结果表示，结合穴位埋线的效果显著优于另一组，有效比例分别为82.9％、57.6％。提示穴位埋线在医治本病中具有重要意义。5.6火针疗法火针，又名“燔针”、“焠刺”。操作方法是首先依据病症选取合适的穴位，严格消毒，使针于火上烧红后立即以合适深度快速刺入穴位，并快速取出。黄蜀等[19]通过运用火针医治60名银屑病病患。对比单用他扎罗汀乳膏。疗程30天。统计疗效发现，两者痊愈、显效病例比例分别是76.8％、71.9％，有效比例是94.6％，96.5％，差别不显著（P＞0.05）。但对痊愈、显效病例继续密切随访后发现，两者复发比例分别为23.3％、51.2％，具有显著差别（P＜0.05）。证明火针与他扎罗汀乳膏均有确切效果，虽在近期疗效上差异不大，但从远期来看，火针干预者延缓或预防复发方面具有独特优势。王娟等[20]运用火针医治25名银屑病病人。对比单服活血解毒汤。统计疗效发现，前者疗效均显著佳于后者(P＜0.05)，包括皮疹颜色、瘙痒程度等。两者有效比例分别是92.0％、88.0％。证明结合火针对银屑病医治可将疗效显著提高。5.7穴位注射法穴位注射是将药物注入预先选好的穴位，进而对局部皮损起到相应的疗愈目的。同时，该方法能够对穴位产生时间较长的局部刺激，这样不仅发挥了药物的作用，也能同时强化穴位的功效，一举两得。70 西南医科大学硕士学位论文高俊明等[21]运用穴位注射结合自拟消风散医治银屑病。对比仅口服自拟消风散。结果发现，前者疗效显著高于后者，临床治愈比例分别是62％、40％，有效比例是96％、78％，两者有显著差别（P＜0.05）。该研究表明应用穴位注射结合自拟消风散可进一步改善银屑病炎症，皮损面积、表现程度能得到改善，提高临床治愈和临床有效比例。5.8自血疗法吴波等[22]对90名银屑病病患统一予以服用复方甘草酸苷片、涂搽卤米松膏。随机分为两组，一组口服、外搽药的基础上，还加以穴位注射自血和埋线处理；另一组仅口服、搽药。结果发现，前者效果显著优于后者，有效比例分别占80.0％、62.4％。进而说明穴位自血注射联合埋线医治银屑病效果明显。周琼艳等[23]治疗49名银屑病病患，随机分为两组，均予以外搽卡泊三醇、哈西萘德。前者结合穴位自血注射，后者不再作过多的干预。疗程为8周。结果发现有效比例分别是81.3％、59.1％，差异显著（P＜0.05）。可见治本时联合自血是行之有效的方法。6总结总之，银屑病的外治法多种多样，具有选择范围广、药物选择灵活、疗效显著、副作用小、优势大等优点。证型上，主要是血热、血瘀、血燥，局部用药选用上，一定要首先进行准确的辨证，并根据具体情况对局部用药进行对症治疗。虽然中医医治银屑病从既往经验看来疗效肯定，但研究尚不充分，例如病机方面研究仍缺乏相应标准，用药缺乏定性和定量等指标，此外，还需要对循证医学方面进行大量71 西南医科大学硕士学位论文研究。长期实践证明，我们不仅要充分汲取传统医学的精髓，最大程度的发挥主观能动性发扬中医药的优势，同时要增强相关研究。加深对银屑病中医医理的探究，使中医能更好的与当代医学融会贯通，以促进更好的发展。参考文献1.黄玉华,董亦秋.普连膏治疗银屑病血热型疗效观察[J].实用中医药杂志,2015,31(02):141-142.2.向丽萍,席瑞阑,唐雪勇等.克银膏治疗寻常型银屑病(血瘀证)的临床研究[J].中医药导报,2014,20(01):23-26.3.贺海英,曲生明,李福秋等.复方消银膏治疗轻中度寻常型银屑病临床观察[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2017,16(01):31-35.4.朱传美,汪海珍,杨志波等.润肤保湿乳膏治疗血虚风燥型银屑病[J].吉林中医药,2015,35(03):268-271.5.王金铭,林开金,汪振达等.四黄膏封包治疗寻常型银屑病的临床研究[J].黑龙江中医药,2015,44(05):30.6.卢益萍,苗秀润.祛银酊外用治疗银屑病临床观察[J].辽宁中医杂志,2004(05):394.7.刘利红.自制消银油治疗银屑病68例[J].中医外治杂志,2003(01):48.8.杨顶权,白彦萍.消银洗剂合并消银片治疗头部银屑病的临床研究[J].中华中医药杂志,2009,24(06):831-832.9.徐嵩淼.中医熏洗疗法治疗寻常型银屑病临床疗效观察[J].内蒙古中医药,2016,35(15):106.72 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