西藏不同海拔高度世居藏族和移居人群高原适应不全的流行病学调查与分子机制研究

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学校代码：10694附学号：1405122002密级：硕士学位论文西藏不同海拔高度世居藏族和移居人群高原适应不全的流行病学调查与分子机制研究姓名：次仁潘多指导教师：巴桑卓玛教授院（部、中心）：医学院专业：生物化学与分子生物学研究方向:高原医学完成日期：2017年4月20日 II 英文缩写注释表英文缩写英文全名中文译名全基因组等位基因分化GWADSGenome-WideAllelicDifferentiationScan扫描SNPSinglenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性PCRPolymearsechainreaclion聚合酶链式反应HIFHypoxiaInducibleFactor低氧诱导因子SLC8A1SoluteCarrierFamily8，member1钠钙交换因子Hardy-weinberg哈迪-温伯格定律OROddsRation优势化Maladaptationtohighaltitude高原适应不全ADRA1AAdrenoceptoralpha1α基因编码肾上腺素受体PRKCEProteinKinaseC，Epsilon是蛋白激酶CKIF1BKinesinsuperfamilyproteins驱动蛋白超家族III 摘要目的青藏高原是人类生存具有挑战性的环境之一，在青藏高原上生活的藏族人群适应了高原低压低氧环境而成为高原世居人群。本文将从世居藏族各个系统的高原适应情况进行流行病学调查，以及选择与藏族低氧适应相关的候选基因来探讨世居藏族高原低氧适应相关性，找出与世居藏族低氧适应相关候选基因多态位点，为高原医学研究提供理论依据。方法1.流行病学调查：在西藏不同海拔高度拉萨市（3650）、山南市（3600）、林芝市（2900）、日喀则市（4100）四个市采用偶遇调查方法，对当地世居者和移居者共2884人（总共发放4000个问卷表，其去掉无效问卷，最后获得有效问卷有2884个）进行调查，其中有1691个世居藏族和1193个移居者（汉族为主）通过自行设计的问卷调查表，以自填的方式进行流行病学调查。问卷内容包括各系统（呼吸、神经、消化系统和循环系统等）的变化情况。收集的数据进行统一录入，并采用SPSS17.0统计软件进行分析，其中计数资料采用卡方检验（卡方值进行哈迪温伯格检验）。2.候选基因分型，本课题前期通过全基因组等位基因分型（genomewideassociationstudy，GWADS）方法筛选出的与藏族低氧适应相关的候选基因钠钙交换因子（SLC8A1）、蛋白激酶C（PRKCE）、细胞色素C氧化酶合成的核编码基因（CMC2）、促血管新生蛋白因子（ANGPT4）、腺苷酸脱氨酶家族成员之一（AMPD3）、驱动蛋白超家族（KIF1B）和基因编码肾上腺素受体（ADRA1A），本课题选择了IV 241例世居藏族和HapMapⅢ期中北方和南方平原汉族（208例）利用SequenomMassArry平台对（ADRA1A基因的rs1177946、rs6557946、rs7842829、rs1048101、rs1442341；位于SLC8A1基因上的rs4952404、rs13031392、rs2192771；PRKCE基因上的rs11898209、rs6544852、rs6756452、rs3768753、rs10205024、rs2278775、rs3820729、rs2594489、rs2594494、rs7571879；KIF1B基因上的rs10492970、rs17034615、rs17034716、rs2297881）共4个候选基因22个SNP位点利用SquenomMassARRAY检测平台进行扩大样本验证。所获得数据采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料采用T检验，计数资料采用卡方检验，进行哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinbergequilibrium）检验，群体表型的比较采用单因素方差分析，用T检验计算基因型对临床表型的影响，用plink软件进行与表型的关联分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。结果1.流行病学调查：本次调查获得2884个不同海拔高度的世居者和移居者，其中拉萨市世居者579人，移居者536人；女性526人，男性589人；山南市世居者250人，移居者281人；女性164人，男性367人；林芝市世居者153人，移居者206人；女性152人，男性207人；日喀则市世居者708人，移居者171人；女性472人，男性407人；调查发现世居者总的高原不适应率为34.9%，而移居者总的高原不适应率为52.9%，其世居者和移居者神经系统不适应率为37.1%和50.7%；循环系统的不适应率为23.6%和48.9%；消化系系统不适应率为36.4%和44.3%。在不同海拔高度的四个地区的世居者和移居者总的高原不适V 应情况调查显示，拉萨世居者和移居者总的不适应率为34.5%和48.0%；山南世居者和移居者总的不适应率为38.3%和52.3%；日喀则世居者和移居者总的不适应率为29.6%和52.2%；林芝世居者和移居者总的不适应率为55.9%和67.2%，在4个不同海拔高度的世居者和移居者各组间有统计学差异。2.表型数据分析：对241例世居藏族的临床生化表型进行统计，发现世居藏族的临床生化指标基本在正常参考值范围内，其反应心室收缩功能的心功能指标EF（射血分数%）较高与正常参考值。在世居藏族中男性是73.77±4.86%；女性是73.63±4.36%。3.候选基因的分型：4个候选基因的22个SNP位点在世居藏族和平原汉族之间进行两两比较，并进行与表型的关联分析，发现4个候选基因均在不同人群中基因型频率差异显著且最小等位基因频率具有显著相关性（P﹤0.05）。首先对4个候选基因的22个SNP位点进行基因型频率比较，发现KIF1B基因上的4个（rs10492970、rs17034615、rs17034716、rs2297881）SNP位点的基因型频率均在世居藏族和平原汉族中各组间比较均有显著差异（P﹤0.05）。SLC8A1基因上的2个（rs4952404、rs13031392）SNP位点的基因型频率在世居藏族和平原汉族中各组间比较均均有显著差异（P﹤0.05）。ADRA1A基因上的5个（rs1177946、rs6557946、rs7842829、rs1048101、rs1442341）SNP位点的基因型频率在世居藏族和平原汉族中各组间比较均有显著差异（P﹤0.05），PRKCE基因上的10个（rs11898209、rs6544852、rs6756452、rs3768753、rs10205024、rs2278775、rs3820729、VI rs2594489、rs2594494、rs7571879）SNP位点的基因型频率在世居藏族和平原汉族中各组间比较均有显著差异（P﹤0.05）。我们还对4个候选基因的22个SNP位点在世居藏族和平原汉族中进行频率差异性进行比较，发现KIF1B基因上的4个SNP位点；ADRA1A基因的5个SNP位点；SLC8A1基因上的2个（rs4952404、rs13031392）SNP位点；PRKCE基因上的10个SNP位点均具有显著差异性（P﹤0.05）。此外，我们发现了SLC8A1基因上rs4952404和rs13031392位点，PRKCE基因上的rs7571879、rs6756452、rs3820729和rs2278775位点，ADRA1A基因上的rs7842829位点的最小等位基因频率随着海拔升高而增大，其在安多人群中显示最小等位基因频率最大。4.数量性状关联分析我们对具有表型数据的世居藏族（241例）通过数量性状关联分析发现PRKCE基因上的rs3768753位点与每搏输出量（SV）及射血分数（EF）相关；rs2594489位点与红细胞压积（HCT）、最大肺活量（FVC）、最大呼气流量（PEF）、时间肺活量（FEV1）、血氧饱和度（SaO2）相关；rs2594494位点与FEV1、FVC、PEF、HCT相关；rs6544852位点与SaO2、主动脉内径（Ao）、FEV1、FVC、PEF相关；rs6756452位点与SaO2相关。ADRA1A基因上的rs1442341位点与SaO2相关；rs6557946、rs7842829、rs1048101位点均与A0相关；rs11779546位点与SaO2、SV相关。KIF1B基因上的rs17034716位点与SaO2相关；rs10492970位点与AO相关；rs17034615位点与AO相关；rs2297881位点与AO相关（P<0.05）。SLC8A1基因VII 上的rs4952404位点与SaO2相关（P<0.05）。结论1.在高原低压低氧环境下长期生活，对机体呼吸系统、神经系统、循环系统和消化系统均受到了一定程度的影响。2.世居藏族的高原适应性较移居者好，世居藏族总的高原不适应率为34.9%，而移居者总的高原不适应率为52.9%。不同海拔高度的4个地区高原不适应率没有随着海拔的升高而增加。3.进一步证明了PRKCE、SLC8A1、ADRA1A和KIF1B基因可能是藏族低氧适应相关的候选基因。4.PRKCE基因6个SNP位点（rs3768753、rs2594489、rs2594494rs6544852、rs6756452、rs11898209）在不同海拔高度世居藏族中与表型（SV、EF、HCT、FVC、PEF、FEV1、SaO2、Ao）有显著相关性（P<0.05），因此推测PRKCE基因可能在藏族低氧适应机制中发挥着不容忽视的作用。5.SLC8A1基因rs4952404和rs13031392位点可能是藏族低氧适应相关的重要候选位点。6.ADRA1A基因rs1442341、rs7842829和rs11779546位点可能是藏族低氧适应相关的重要候选位点。7.KIF1B基因rs17034716位点可能是藏族低氧适应的重要候选位点。关键词藏族，高原世居者，高原移居者，高原适应不全，分子机制VIII ABSTRACTPurposeQinghai-Tibetanplateauisoneofthemostchallengingenvironmentofhumansurvival，afterlongtimeadaptiontothelowoxygenenvironment，TibetanlivedinQinghai-Tibetanplateauforgenerations.ThisstudyperformedtheepidemiologicalinvestigationonphysiologicalhypoxiaadaptationofTibetanandselectedthecandidategenesandSNPsitesofhypoxiaadaptationofTibetan，inordertoexploretheTibetanspecialhypoxiaadaptationmechanismandbenefitfortheplateaumedicalresearch.MethodEpidemiologicalinvestigationofrespiratory，nervous，digestiveandcirculatorysystems，bothofaboriginalTibetanandimmigrationHangroupswereperformedinfourcitiesatQinghai-Tibetanplateau，includingLhasa(Altitude=3650m)，Shannan(Altitude=3600m)，Linzhi(Altitude=2900m)，Shigates(Altitude=4100m).Inallofthe4000questionnaires，2884werevalid，including1691answeredbyaboriginalTibetanand1193answeredbyimmigrationHan，beforethestatisticanalyseswithChisquaretest(chisquarevalueforHardyWeinbergtest)bySPSS17.0software.OurpreviousGenomewideassociation(GWADS)studieshadrevealedthatSolutecarrierfamily8memberA1(SLC8A1)，ProteinkinaseCepsilon(PRKCE)，C-X9-Cmotifcontaining2(CMC2)，Angiopoietin4IX (ANGPT4)，Adenosinemonophosphatedeaminase3(AMPD3)，Kinesinfamilymember1B(KIF1B)andAdrenoceptoralpha1A(ADRA1A)wereselectedasthecandidategenesofhypoxiaadaptationofTibetan.Totally22SNPsite，includingrs1177946、rs6557946、rs7842829、rs1048101、rs1442341atADRA1A，rs4952404、rs13031392、rs2192771atSLC8A1，rs11898209、rs6544852、rs6756452、rs3768753、rs10205024、rs2278775、rs3820729、rs2594489、rs2594494、rs7571879atPRKCE，rs10492970、rs17034615、rs17034716、rs2297881atKIF1B，werevalidatedingenomesequenceof241aboriginalTibetanand208NorthandSouthHanwithinHapMapIIIbySquenomMassARRAY.TheresultswerestatisticallyanalyzedbyT-test，ChisquaretestandHardy-Weinbergequilibriumtest.PopulationgeneticphenotypedatawereanalyzedbyOnewayANOVA，andtheinfluenceofgenotypeonphenotypewasstudiedwithlinearregressionmodel.Exceptplinksoftwarewasusedfortheassociationanalysesbetweengenotypeandphenotypedata，allofthedatawerestatisticallyanalyzedbySPSS17.0softwareandwithpvaluelessthan0.05consideredasstatisticdifference.ResultEpidemiologicalinvestigationresultsshowedthatallofthe2884validquestionnaireswereansweredby579aboriginalTibetanand536immigrationHaninLhasa(Male=589，Female=526)，250aboriginalTibetanand281immigrationHaninShannan(Male=367，Female=164)，153aboriginalTibetanand206immigrationHaninLinzhi(Male=207，X Female=152)and708aboriginalTibetanand171immigrationHaninShigates(Male=407，Female=472).TheratesofplateauinadaptationinaboriginalTibetanwere34.9%and52.9%inimmigrationHan，inwhichnervoussystemplateauinadaptationrateswere37.1%and50.7%，circulatorysystemplateauinadaptationrateswere23.6%and48.9%，anddigestivesystemplateauinadaptationrateswere36.4%and44.3%，inaboriginalTibetanandimmigrationHangroupsrespectively.Amongthefourcitieswithdifferentaltitude，theratesofplateauinadaptationwere34.5%and48.0%inLhasa，38.3%and52.3%inShannan，29.6%and52.2%inShigates，55.9%and67.2%inLinzhi，inaboriginalTibetanandimmigrationHangroupsrespectively，whichshowedstatisticallysignificantdifferenceamongthesefourcitiessub-groups.Thestatisticallyanalysesoftheclinicalphenotypedataof241aboriginalTibetanshowedthatonlytheejectionfractionvalue(EF，Ventricularsystolicfunction)werehigherthanthereferencerangevalue，whileEFvaluewas73.77±4.86%inmaleand73.63±4.36%infemalesub-groups.Baseonthecomparisonanalysesofthegenotypefrequencyof22SNPsitesin4candidategenebetweenaboriginalTibetanandimmigrationHangroupsandassociationanalyseswithphenotypedata，wefoundthestatisticallysignificantdifferenceofthese4genesbetweentwogroupsandtheminimumallelefrequencywassignificantlycorrelated(p<0.05)，XI suchastheSNPsiteofrs10492970、rs17034615、rs17034716、rs2297881atKIF1B，rs1177946、rs6557946、rs7842829、rs1048101、rs1442341atSLC8A1，rs1177946、rs6557946、rs7842829、rs1048101、rs1442341atADRA1A，rs11898209、rs6544852、rs6756452、rs3768753、rs10205024、rs2278775、rs3820729、rs2594489、rs2594494、rs7571879atPRKCE，theallelefrequencieswerestatisticallysignificantlydifferentbetweenaboriginalTibetanandimmigrationHangroups(p<0.05).Theassociationanalysesofthese22SNPsiteat4genesbetweenaboriginalTibetanandimmigrationHangroupsrevealedthat4SNPsitesatKIF1B，5SNPsitesatADRA1A，rs4952404、rs13031392atSLC8A1and10SNPsitesatPRKCEwerestatisticallysignificantcorrelated(p<0.05)Inaddition，theminimumallelefrequenciesofrs4952404&rs13031392atSLC8A1，rs7571879、rs6756452、rs3820729、rs2278775atPRKCE，rs7842829atADRA1AwereincreasedwithaltitudeandshowedmaximumvalueinAnduosub-groupinaboriginalTibetan.Thequantitativetraitassociationanalysesofgenotypeandphenotypedataof241aboriginalTibetanrevealedthesignificantcorrelations(p<0.05)，suchasatPRKCEgene，rs3768753wasassociatedwithstrokevolume(SV)andejectionfraction(EF);rs2594489wasassociatedwithhematokrit(HCT)，maximalvitalvolume(L-2)，maximumexpiratoryflowvolume(dl)，timevitalcapacity(L-1)andSaO2;rs2594494wasXII associatedwithL-1，L-2，dlandHCT;rs6544852wasassociatedwithaorticdimension(Ao)，L-1，L-2，dlandSaO2;rs6756452wasassociatedwithSaO2.AtADRA1Agene，rs1442341wasassociatedwithSaO2;rs6557946、rs7842829、rs1048101wereassociatedwithAo;rs11779546wasassociatedwithSaO2andSV.AtKIF1Bgene，rs17034716wasassociatedwithSaO2;rs10492970、rs17034716andrs2297881wereassociatedwithAo.rs4952404atSLC8A1genewasassociatedwithSaO2.Conclusion1.ThehypoxiaenvironmentatQinghai-Tibetanplateaumighthadtheinjuriouseffectonhumanrespiratory，nervous，digestiveandcirculatorysystems.2.TheaboriginalTibetanhadbetterhypoxiaadaptationinQinghai-TibetanplateauthanimmigrationHangroup.Theratesofplateauinadaptationwere34.9%and52.9%inaboriginalTibetanandimmigrationHangrouprespectively，whilerateofplateauinadaptationwasnotincreasedwiththealtitudeinfourcities，inwhichtheepidemiologicalinvestigationwerecarriedoutinthisstudy.3.ThisstudyvalidatedthePRKCE、SLC8A1、ADRA1AandKIF1BastheTibetanhypoxiacandidategenes.4.AtPRKCEgene，6SNPsitesincludingrs3768753、rs2594489、rs2594494、rs6544852、rs6756452andrs11898209werefoundXIII significantlycorrelated(p<0.05)withSV、EF、HCT、L-2、dl、L-1、SaO2andAo，whichmightsuggestedtheimportantroleofPRKCEinTibetanhypoxiaadaptation.5.TheSNPsitesincludingrs4952404andrs13031392atSLC8A1，s1442341、rs7842829andrs11779546atADRA1Aandrs17034716atKIF1BmightplayimportantrolesinTibetanhypoxiaadaptation.KEYWORDSAboriginalTibetan，ImmigrationHan，Plateauinadaptation，MolecularmechanismXIV 目录作者声明....................................................................................................II英文缩写注释表.....................................................................................III摘要..........................................................................................................IVABSTRACT....................................................................................................IX目录........................................................................................................XIV第一章概论..............................................................................................11.1高原适应与高原习服....................................................................11.1.1高原适应..............................................................................11.2青藏高原低氧适应机制..................................................................31.3全基因组关联研究进展................................................................71.3.1原理及应用..........................................................................81.3.2SNP检测方法......................................................................91.4本课题研究背景及意义................................................................10第二章材料与方法.................................................................................122.1研究资料与方法.........................................................................122.1.1研究对象............................................................................122.1.2研究方法............................................................................142.1.3质量控制............................................................................142.1.4资料分析............................................................................14XV 2.2实验材料与方法..........................................................................152.2.1实验仪器............................................................................152.2.3实验方法............................................................................15第三章研究结果...................................................................................203.1调查结果......................................................................................203.2实验结果......................................................................................253.2.1世居藏族的生理生化表型................................................253.2.2世居藏族低氧适应相关候选基因选择............................26第四章讨论、结论与后续研究计划.....................................................364.1.讨论..............................................................................................364.2结论...............................................................................................394.3后续研究计划..............................................................................40参考文献....................................................................................................41附录............................................................................................................47在攻读硕士学位期间发表的论文...........................................................68致谢..........................................................................................................69XVI 第一章概论1.1高原适应与高原习服1.1.1高原适应适应(adaptation)是生物界普遍存在的现象，也是一种生命所特有的，是在进化过程中所形成的。高原适应是指世居的人群与动物发生的一种可遗传的，而且具有遗传基础结构、习惯和功能特征，因而很好的能在高原环境中生存及繁衍的过程[1]。在国外，适应性是人类学和高原医学的重要研究内容，特别是比较极端条件的适应性是高原医学和人类学重要研究课题，青藏高原地区、安第斯山地区以及北极等地区都是研究的重点。适应性分为文化适应和体质适应，高原医学研究以体质适应为主，人类不仅要与物质环境相处，还要与其他生态种群相互作用。对于体质适应性研究，主要集中在不同的居住环境对人体的身体形态、生理机能和运动能力等方面的变化和调整。（例如，随海拔的上升，人的身高会随之降低，体成分中的脂肪含量会增加）[2]。对世界各地人的体质调查发现，欧洲大陆和东亚大陆的人均存在从南到北随纬度上升、温度下降而身高体重均值上长的趋势[3]。对少数民族青少年中学生的生长发育与自然环境差异的研究结果表明，较高纬度地区的少数民族群体的发育水平较高于低纬度地区群体，其中身高长、体重重、胸围大等身体形态状况[4]。体质适应环境的最终结果是身体形态的变化，体重增加、人的身高、体形增大，相比之下，身体的体积增加大于身体表面积的增加，体型越大产热量越多，而热量散失相对来说较少，居住在越寒冷地方，人群的体型越大[5]。寒冷的北极地区的因纽特人，具有独特的体质特征，均为体质对生存环境的适应结果[6-7]。对青藏高原上生活的世居者和移居者的高原适应性进行比较研究中，发现藏族和平原汉族具有比回族、撒拉族等更好的适应高原自然环境的能力[8]。因此，高原适应是指人们在高原居住，并将长期或至少3代后所发生改变，是一种对低压低氧环境下的遗传选择性反应。适应可以遗传，它具有解剖、生化学和生理等特征，并且能在高原环境中达到最佳状态。在高海拔居住的高原人群中青藏高原是居住高原上时间最长的人群，也只1 有青藏高原的世居藏族生活在高原低氧低氧环境中经过数千之万年的适应和选择，从而获得最佳的高原适应性，是高原适应最成功的人群[9]。1.1.1.1高原低氧反应世界上高原人群分布较广，包括北美洲、南美洲、亚洲和非洲的高原地区，在大洋洲（巴布亚、新几内亚）和欧洲（阿尔卑斯山区）也有少数的高原居民，在全世界居住高原历史最长的两个民族，即南美洲的印第安人和喜马拉雅山脉的世居藏族人。早在1987年Moore就报道，印第安人在南美洲安第斯高原上生活了大约9千年，而喜马拉雅山脉的藏族人在青藏高原生活了大约2万5千年的历史。即世居藏族成为高原上居住历史最悠久的人群，也是高原医学研究的最佳研究对象之一。高原世居者长期在高原环境生存过程中，在自然选择的作用下，发生了很多遗传变异，从而使高原世居者的生理学变化和适应机制一般不同于其他移居高原的平原人群，从各个系统组织解剖到生理、生化功能都发生了一系列适应高原低压低氧环境的改变。其中对神经、呼吸、循环系统等各个系统影响较大。低压低氧给全身器官、组织带来一系列的影响，尤其中枢神经系统对缺氧耐受性最差，即使是日常很轻微的低氧刺激，都有可能引起不同程度的脑细胞及神经元的损伤。长期低氧对于人的睡眠、记忆、嗅觉、味觉、视力和听神经均有不同程度的影响，而且低氧对神经系统的影响以及内在的机理非常复杂。1.1.1.2高原适应不全高原适应不全（Maladaptationtohighaltitude），有人称之为“高原衰退症”或“慢性高原反应”、“持续性高原反应”、“高原世居者脱适应”等，此术语到目前为止仍然概念比较模糊且很容易混淆，没有一个统一的称谓。总而言之，是世居者或者长期移居者在高原低压低氧环境中，机体通过长时期不间断的选择和调节过程，仍然不能很好地适应高原环境，而出现一系列功能失调或病理形态上的改变称之为“高原适应不全”[10]。根据国内外对藏族和其他世居高原人群的研究结果显示，高原世居者在高原上经过世世代代选择，证明了高原世居者适应性较移居者好，但在不同的高原世居或长期移居者当中仍有一定比例的人出现了对高原环境的适应不全，这种适应不全在不同人群中表现形式各异，部分人会出现神经系统、呼吸系统、循环系统等各系统和代谢的失衡，如睡眠紊乱、记忆力减退、性功能减退、月经失调等，而一些人会出现血压异常、肺循环异常、红细胞容量2 和血红蛋白容量异常等相关的临床表现，从而使发生高原性红细胞增多症、高原性心脏病和高原性肺动脉高压等高原慢性疾病，而且还呈现出生活的海拔越高其发病率越高的倾向。这些功能失调严重影响高原人群正常生活及作业。近年来，对于高原医学研究中的适应慢性低压性缺氧及适应不全方面的研究虽然已取得了前所未有的成就，但目前还处于一个较为基础的阶段，有很多概念及理论性的问题尚未阐明，还需进行流行病的基线调查为存在的一些现实问题提供数据支撑。因此，在不同的海拔高度深入开展相关调查，对于人们进一步理解和研究复杂的高原低压、低氧等特殊气候对于人体的多方位影响提供理论依据。1.1.2高原习服高原习服是指平原人在高原上生活数周、数月、数年甚至3代以内，产生的一种非遗传性的生理和形态改变以适应高原低压低氧的环境。对于习服良好的平原人群进入高原后，能够在高原低压低氧环境中正常生活或工作，无任何不适应症状。但是对于习服不良的平原人群进入高原后出现一系列的代偿反应或功能失调（如，呼吸、神经、循环系统等）各系统的紊乱。由于高原上居住时间的延长会出现各种急性、慢性高原疾病，这些因素严重影响高原工作及生活的人群。因此良好高原习服对于在高原上工作、学习、旅游的人群身体健康具有重要的意义。1.2青藏高原低氧适应机制我国青藏高原位列为全球三大高原之首，面积250万平方公里，具有“世界屋脊”之称，平均海拔4500m以上。青藏高原居住着以藏族为主的高原世居民族，据考古学和遗传学的研究推测，现代世居藏族的祖先大约在2万5千多年前就开始涉足青藏高原地区，大约1万多年就开始成功定居在青藏高原地区。由于青藏高原特殊的地理环境，低温、低湿、低压、低氧、强紫外线等恶劣环境对机体有极大损害，其中缺氧是关键因素，平均海拔4500m时氧含量是海平面的56%[11]。即便是这样，世居藏族仍然能在如此恶劣的环境中生活数千年至上万年。随着高原居住时间的延长，对高原适应也大大增加。然而人类居住高原历史最长青藏高原人群获得了最佳的高原适应性[12]。青藏高原这一独特的人力和环境资源3 便成为高原医学研究者们的最佳研究场所。1.2.1世居藏族高海拔低氧适应机制研究藏族是适应高原的世居人群，也是人类居住高原历史最长的民族[13]。尽管已经认识到高原适应过程中存在着时间依赖性，但其确切适应机制仍不清楚。就氧在体内的代谢过程来说比较复杂，氧通过肺部气体的交换、血液氧和血流运输，到达组织毛细血管，经过弥散到组织间液中，再到细胞，最后经过线粒体来摄取和利用氧气。人体初进高原的早期，主要是通过呼吸系统、循环系统、神经系统等代偿性改变来达到供氧目的。对于人类居住在高海拔的主要地区青藏高原人群来讲。这一独特人群的低氧适应模式与其他高海拔地区有所相同，其青藏高原藏族人群的模式为低血红蛋白伴动脉低氧血症、而其他高海拔地区如安第斯山脉人群的模式为红细胞增多伴动脉低氧血症和埃塞尔比亚人群的模式为血红蛋白浓度和动脉血氧饱和度均处于海平面正常水平，此外在呼吸、代谢功能等生理学方面也存在差异，与其他两个高原相比，青藏高原世居藏族具有良好的高原适应表现，具有完善的氧传送系统及强大的心肺储备和摄氧能力；与移居平原汉族相比，藏族能够较低的耗氧完成同一做功，即对氧的利用更充分、更经济、更有效。青藏高原在历史上地理环境的比较封闭性和藏族传统婚俗的对外隔离性，使青藏高原上居住的这一人群形成了比较显著的遗传隔离，随着在高原上居住时间的延长，对高原适应性也越来越好，这一独特的资源为高原医学研究提供了很好的条件。以往研究证明了世居藏族在高原人群中获得了最佳的高原适应性[2]，藏族在高原上经过长期的进化和演变，发生了基因流动，基因漂移和自然选择的作用下，在遗传基因上发生了很大的变化来适应低氧环境[10]。现有大量的研究表明，世居藏族较其他高原世居者和移居人群能更好的适应高原低氧环境。综上所述，世居藏族即是适应高原的佼佼者，也是高原医学研究的最佳研究对象。2010年是高原医学丰收之年，国内外科学家们在高原医学研究领域获得了前所未有成就。随着全基因组关联研究（GWADS）与外显子测序等研究方法和技术的进步，利用藏族人群的全基因组芯片分型数据或外显子组测序数据应在全基因组数据范围内对藏族人群中的低氧适应自然选择信号进行筛选。很多研究使用的方法尽管不尽相同，大部分都采用藏族和平原汉族作为对照组来研究两个人群的等位基因频率以及局部区域连锁不平衡的类型和单体型多态性等方法，因为4 高海拔藏族人群与低海拔平原汉族人群具有共同的祖先[14]，两个人群的基因组上差异可以认为是由于各自生活的环境不同进而受到自然选择的结果。将于藏族人群拥有共同祖先的低海拔平原汉族作为对照来筛选藏族人群高原低氧适应的阳性信号，可以在有效减小由于人群遗传背景差异造成的干扰及高原低氧环境作用于藏族人群造成的基因组选择信号进行筛选。近年来由于全基因组测序与外显子测序等研究方法和技术的不断进步以及全新的与之相匹配的统计策略的应用，在高原医学研究取得了突破性的进展，进行了一些藏族高原低氧适应相关的候选基因的研究，例如，谷胱甘肽硫转移酶(GST)基因，内皮型一氧化氮合酶(eNOS或NOS3)基因，肺泡表面活性物质相关蛋白(SP-A)基因，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)相关基因，内皮素1(ET-1)基因等高原低氧适应的相关基因的研究。发现脯氨酸羟化酶2(prolinehydroxylase2，PHD2又名EGLN1)和过氧化物酶体增生物激活受体A(peroxisomeproliferator-activatedreceptorA，PPARA)可能参与了藏族的高原适应过程。内皮PAS蛋白1(endothelialPer-Arnt-Simdomainprotein1)，EPAS1，ANGPT1，FOXO1，RUNX1等也参与了高原低氧适应[15]。EPAS1，EGLN1和PPARA基因调节或由低氧诱导因子调节，主要控制红细胞生成和其他适应机能[16]。PRKAA1，NOS2A对人的呼吸生理过程起着重要作用。EPAS1在藏族高原适应中起主要作用，EGLN1作用虽不及EPAS1，但也占有重要位置。此外，ANGPT1、FOXO1和RUNX1也参与高原低氧适应[17]，但也有HIF信号通路的作用。以往的研究结果显示：藏族生物人类学研究回顾对EGLN1基因多个SNPs位点分析中发现，rs480902和rs479200位点的多态性与适应低氧环境有关。藏族和(Sherpa地区)eNOS的两个位点频率比低海拔地区高，在与缺氧有关的2个基因GLN1和EPAS1选择性性扫描中发现了较强信号，这两个基因与非藏族的低海拔地区(平原汉族与日本人)明显的不同[18-19]。通过高海拔与低海拔人群基因组扫描筛查，发现在几个染色体区有正向直接选择的证据，HIF(hypoxiainduciblefactor)通路基因与高原低氧适应相关，HIF的调节基因EGLN1和EPAS1及2个HIF靶基因PRKAA1和NOS2A被认为是西藏(EPAS1)和安第斯山(PRKAA1，NOS2A)自然选择的候选基因。只有一个HIF通路基因EGLN1是西藏和安第斯山两个地区公共候选的基因，这种遗传适应类型对西藏和安第斯山人群是独特的[20]。Laura，etal(2010)在安第斯山和西藏人群中分别分辨出38和145 个候选区域，而且两地区候选基因区域不重叠，最支持的候选者是PRKAA1和NOS2A(安第斯山)以及EPAS1(西藏)，HIF-1a，EPAS-1代表了西藏高原人群适应高原生活的最关键的基因[21-22]。由于西藏与安第斯山人群基因的不同，导致两地区高原低氧适应差异。最近研究揭示，HIF氧信号通路是西藏高原人群强烈的正向选择目标，而安第斯山人群却无类似的机制，可能与居民的高原居住历史长短有关[23]。青藏高原人类活动的时间早于安第斯山，有更长的进化时间，因而表现出比安第斯山居民具有更好的适应机制。Yi等人通过分析50例西藏无关藏族个体（>=4300米）的全外显子组测序数据，40例低海拔平原汉族的全基因组测序数据以及200例丹麦人的全外显子测序数据后，发现引起氨基酸改变的无义突变在藏族和平原汉族人群中的频率差异都不超过6%；EPAS1基因第4内含子内的一个C至G的突变是最强的选择信号，该突变在藏族人群中的频率为87%，而在平原汉族人群中仅为9%；数量性状关联分析发现该突变与藏族人群的Hb和红细胞数显著相关[24]。基于以上研究结果，本课题筛出4个候选基因22个SNP位点进行扩大样本验证，位于ADRA1A基因的rs1177946、rs6557946、rs7842829、rs1048101、rs1442341；位于SLC8A1基因上的rs4952404、rs13031392、rs2192771；位于PRKCE基因上的rs11898209、rs6544852、rs6756452、rs3768753、rs10205024、rs2278775、rs3820729、rs2594489、rs2594494；位于KIF1B基因上的rs10492970、rs17034615、rs17034716、rs2297881、rs7571879，进一步证明与高原低氧适应相关性。2010年及以后的虽然很多藏族低氧适应遗传机制研究都解释了与藏族低氧适应相关的很多候选基因在藏族低氧适应中发挥重要作用。复杂的藏族低氧适应机制，随着高原医学研究的深入，藏族低氧适应候选基因还不断被发现，但藏族低氧适应机制的揭露还需进一步去研究发现。1.2.2世居藏族低氧适应的生理特征经过长期的自然选择，高原世居藏族具有一些特有的性状来适应低氧环境[25-26]。与低海拔人群相比，他们表现出静息通气量(restingventilation，RV)增加、缺氧性肺血管收缩(hypoxicpulmonaryvasoconstrictor，HPV)反应减弱、动脉血氧含量减少、以及血红蛋白(hemoglobin，Hb)水平降低[27]。这些生理和病理上的差异很大一部分是由遗传因素决定的[28-33]。有研究表明，血氧亲和力较高基因型的藏族妇女其婴儿出生的存活率较高，与血氧亲和力较低的基因型妇女相比，其6 出生婴儿的死亡率明显降低[34]，这提示我们，对氧供应的调节是高原适应的最重要最首要的问题。这些结果都表明，世居藏族人群可能具有与其他人群不同的遗传机制，使得他们对青藏高原有特殊的适应能力[35]。在高原低压缺氧的条件下，世居藏族人群的胸廓及肺发育良好，有明显的胸深（男）和明显的胸宽（女），这可能是对低氧的适应的结果[32]。有较大的肺活量和较大的肺总容量，这提示我们可能具有较大的肺泡弥散面积及较高的通气储备。与安第斯高原相比世居藏族血红蛋白浓度较低，而具有较高的血氧饱和度、较小的肺容量和肺动脉压，有较高的一氧化氮呼气量和脑血流量，而低氧通气反应不钝化等特征[36-38]。喜马拉雅山脉高海拔世居藏族和夏尔巴人是最适应高原低氧环境的人群之一，这两个人群在低压低氧环境中的适应几乎免受慢性和急性高山病的困扰[39-40]；夏尔巴人与藏族人低氧适应表型相似，与高加索习服人群相比红细胞数目和血红蛋白浓度都未增加，而氧气与血液的亲和力则较高[41]。与低海拔习服人群相比，高海拔世居藏族人群与夏尔巴人过度换气减弱。研究认为减弱过度换气是高海拔世居人群对低氧的一种呼吸适应，过度换气减弱能允许世居人群减少用于过度换气的能量消耗，同时能为更高海拔的活动做呼吸储备[42]。有研究表明，对拉萨世居藏族青年和移居平原汉族氧使用情况进行比较的研究结果显示，藏族的最大摄取量、潮气量、肺通气量、最大运动负荷量以及氧脉搏等均大于移居平原汉族，说明与移居平原汉族相比，高原世居藏族具有更佳的氧摄取和氧转运功能，对高原低压缺氧环境已获得了良好的生理适应[43]。在高原时世居藏族比平原汉族有更好的肺弥散能力和更高的工作效率，世居藏族人有利的肺弥散能力可能与他们较大的肺容量有相关。较大的肺容量通过增加肺小泡表面积和肺毛细血管来提高肺弥散能力，所以提高了在运动中的血氧饱和度[44]。不论在高原或在低压氧舱中模拟低氧条件中的运动状态下，其最大通气量、最大耗氧量、最大射血量、最大做功及无氧代谢阈值均明显高于移居平原汉族。在海拔5000m作力竭运动时，世居藏族在以上生理指标上的优势更为显著。1.3全基因组关联研究进展所有人类疾病的发生过程都可归因于遗传因素，或遗传因素与环境因素之间的相互作用，寻找疾病的发生、发展相关的遗传易感基因有助于阐明某些复杂性7 疾病的发病机制。虽然在某些疾病的家族谱系研究已经发现了和疾病发病关系密切的某些高外显率基因，但是单一基因的改变难以解释多数散发疾病的发病机制，由此可推断疾病的发生是多基因低频率、改变的逐步累积的结果。但是如果要寻找与疾病发生相关的易感基因位点，需要在大规模样本中进行全基因组范围的筛选，而全基因组关联研究（GWADS）为研究者提供了实现这一目标的有效手段。1.3.1原理及应用GWADS以为分子遗传标记，通过对大样本群体的进行全基因组范围的比对和筛选，从而寻找出与复杂疾病相关的易感基因和位点。目前已经筛选出上千万个与各种疾病发病相关的低频基因变异位点。GWADS的原理是假设群体基因组中某些SNP位点与疾病关联，通过分析这些的等位基因或基因型频率在研究目标人群中是否高于或低于对照，从而筛选出与疾病风险关系最为密切的易感基因位点。研究设计类型有单阶段、两阶段或多阶段几种。单阶段研究即一次性设立足够的病例和对照样本，对所选进行基因分型后再分析每个与疾病的关联性。早期的多为该类方法。目前的则较少釆用单阶段方法，而通常是在第一阶段小样本中对覆盖整个基因组的所有进行基因分型，然后在第二阶段中对第一阶段筛选出的结果进行更大样本量的验证，最后综合两阶段或多阶段的数据得出与疾病关联最显著的。GWADS一出现就成为各国研究者关注的焦点，并且在分子遗传学及疾病病因学研究方面显示出强大的功效。研究人员采用策略对人类复杂性疾病如视网膜黄斑变性、冠心病、Ⅱ型糖尿病、肥胖、精神分裂症等进行了大量的研究，并且先后发现了与上述疾病相关的一系列疾病易感基因、多态性位点及染色体区域[45]。人类基因组计划初步完成后，GWADS为人类复杂性疾病的研究展开了新的篇章。短短数年间，许多前所未知的与人类各种疾病和肿瘤相关的SNP位点和染色体区域不断被发现，GWADS为了解人类复杂性疾病的分子病因学机制提供了有力的证据和线索[46]。然而，基因是在不断的动态变化中，基因变异的方式并非仅仅是单核苷酸的改变，而有可能是多种多样的形式，基因的复杂性是不言而喻。在疾病的发生发展过程中可能有数以千计的基因参与在其中，并且在不同个体、不同疾病、疾病的不同阶段涉所及的基因变化亦可能有所不同。此外，疾病的发生还关系到不同基因之间，以及基因与环境之间的相互作用。因此，研究者应该把8 握的优势及局限性，有计划地进行复杂性疾病的研究，对研究结果进行综合分析，同时还需要考虑到环境因素与基因之间的复杂关联[47]。1.3.2SNP检测方法单核苷酸多态性（Singlenucleotidepolymorphism，SNP）是人类可遗传的基因变异中最为常见的一种，是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性[48]。SNP的检测需要高效、特异、准确的方法。随着高通量技术平台的不断开发和应用，SNP的检测手段也得以快速发展和完善。按原理分类，目前SNP的检测方法主要包括[49]：（1）基于等位基因特异性杂交的动态等位基因特异性杂交、TaqMan探针技术和分子信标技术等；（2）基于内切酶酶切技术的限制性酶切片段长度多态性，随机扩增多态性和引物入侵分析技术等；（3）基于引物延伸法的单碱基延伸技术和焦磷酸测序技术等；（4）与寡核昔酸连接反应法结合的滚环扩增技术。近年来，多种方法相结合的SNP检测技术和相关仪器不断涌现，按照各种检测平台通量的高低，又可以分为低通量的单链构象多态性（SSCP）、限制性酶切片段长度多态性（RFLP）、变性高效液相色谱、测序法等；中低通量的ABITaqMan探针技术、高分辨溶解曲线基因突变检测系统、高温连接酶检测反应技术等；中高通量的贝克曼库尔特SNPstream、Affymetrix基因芯片技术、ABISNPlexTMAssay、Squenom的MassARRAY-IPLEX等。本课题采用的方法为SquenomMassARRAY-IPLEXSNP检测系统。其基本原理为基于多重PCR、单碱基延伸和芯片技术相结合的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱广（MALDI-TOFMS）。该系统的测定方式是基于单碱基引物延伸反应法（又称法PinPoint），主要特点是序列特异引物在SNP位点上延伸个碱基，然后将样品与芯片基质共结晶，瞬时纳秒（10-9s）强激光激发，基质将吸收的激光脉冲能量转移给待分析样品，按质荷比加以分离。离子捕获仪收集并储存脉冲信号，并对其进行质谱分析，通过比较A、G、T、C的信号强度及信号间质量的差异可得出模板序列的一维信息。MassARRAY系统反应体系为非杂交依赖性系统，不存在潜在的杂交错配干扰，不需要各种标记物，并结合高密度SpectroCHIPTM点阵芯片可以快速完成多重性鉴定。该系统具有较高的灵敏性和特异性，并且节约时间和成本，便于操作，适合在临床及科研工作中应用。9 本课题研究利用世居藏族和平原汉族人群，与分子生物学技术相结合进行研究低氧适应相关的候选基因，通过利用SquenomMassARRAY平台完成全部基因分型与验证的，发现一些与低氧适应相关的候选基因及与低氧适应相关重要候选位点，为高原医学研究提供一些数据支撑。1.4本课题研究背景及意义在高海拔（>2500m）特别是极高海拔（>4500m）环境下生存对人类最具有挑战性的。在人类祖先漫长的迁移及演化的过程中，最终有少数部落适应了高原的低氧环境，逐渐形成世居人群。有研究表明高原人群在低压低氧状态下，其多种代谢功能与平原人群在低海拔时的状态近似或一致[50]，这充分说明了高原人群的低氧适应。我国青藏高原位列全球三大高原之首，是研究人群低氧适应的最佳场所。我国是世界上高原面积最大的国家，以内蒙古、黄土、云贵、青藏四大高原著称于世。特别是号称“世界屋脊”的青藏高原是世界上海拔最高、面积最大的高原。随着高原地区的经济不断开发，进入高原工作和旅游人群日益增多，但是个体出现的急性、慢性高原病是目前高原开发资源的主要障碍之一。高原低压低氧环境对人类生存形成极大挑战，虽然已有很多研究证实世居藏族获得最佳适应。但据报道，青藏高原是慢性高原病患者分布最多的地方，全国慢性高原病患者人数已达25万。目前，关于高原世居者和长期移居群体由于适应不全而引发的各种功能失调和高原病的发病机理及高原环境中各种致病因素尚未完全阐明，严重影响着高原地区生活人群的身心健康。对于移居者和世居高原人群中有多少比例的人蒙受高原低压低氧或适应不全而引起的各种代谢紊乱还没有相关报道和研究，人们对此问题也没有引起足够重视，因此，高原低氧或适应不全引起的各种代谢紊乱和常见高原病发病机制的研究不论对高原世居者还是平原移居者均有极其重要意义，因此找出候选基因中有利于藏族人群适应高原的多态性，从而有利于高原医学研究者提供数据支撑具有重要意义。随着新一代技术的发展，全基因组外显子测序、SNP芯片技术使得研究者能深层次的从遗传基础挖掘低氧适应机制，揭露了EPAS1，EGLN1等若干参与低氧反应通路中的藏族低氧适应候选基因；然而复杂的环境，复杂的群体，10 复杂的遗传基因、分子通路及网络如何相互作用，最终适应高原低氧环境的机制还并不是十分清楚，所得到的数据还不能完全准确的解释高原低氧适应的根本机制。同时低氧代谢与多种疾病如心脑血管疾病等发生发展密切相关，阐明低氧相关的分子通路是研究疾病进程转归和研发防治措施的重要和基础，对高原人群突出的低氧适应性的生理和遗传机制研究具有非常重要的意义。研究对象来自藏族不同海拔高度的四个地区（林芝、拉萨、山南、日喀则、海拔2900-4100m）世居者和移居者进行流行病学基线调查，进一步去了解人群的高原适应情况，为今后研究提供基本理论意义。另外本课题前期研究GWADS测序筛出高原适应相关4个候选基因22个SNP位点在进一步不同海拔高度的（安多、昌都、波密、海拔2400-4700m）世居藏族和HapMapⅢ期平原汉族进行SNP分型，本课题拟利用这一独特的人力和环境资源优势，运用临床、生理、生化的调查结合4个候选基因SNP位点利用SquenomMassARRAY检测平台进行基因分型等分子机制研究，一方面研究分析平原汉族和世居藏族人群之间的差异，另一方面研究这些候选基因SNP位点与临床生化指标进行关联分析。探讨这些候选基因多态位点与藏族人群低氧适应是否相关具有重要的现实意义和理论意义。11 第二章材料与方法2.1研究资料与方法2.1.1研究对象本课题首先对西藏不同海拔高度的4个地区（拉萨、山南、林芝、日喀则、海拔2900-4100m）世居者与移居者高原适应情况用自行设计的问卷表进行流行病学基线偶遇调查。共2884名世居者和移居者（汉族为主）进行调查，分别是拉萨1115名其中世居者（579）和移居者（536）；山南531名其中世居者（250）和移居者（281）、林芝359名其中世居者（153）和移居者（206）、日喀则879名其中世居者（708）和移居者（171）。其总的世居者1691名和移居者1193名，民族结构：藏族1764人，平原汉族1086，其他民族34人；性别结构：男性1570人，女性1314人；年龄结构：男性：14≤80，女性：14≤72；学历结构：博士学历31人，研究生学历328人，本科1425人，大专学历706人，中专及以下394人。其次，本课题获得241例西藏不同海拔高度（安多、昌都、波密、海拔2400-4700m）世居藏族的样本和对照组HapMapⅢ期中北方和南方平原汉族（208例），其中藏族样本分别取自昌都155例、波密39例、安多47例。并结合临床生化检查，在采集不同海拔高度是藏族血液样本时并获取了详细的生理生化表型数据(详见表1)。表1.不同海拔高度藏族生理生化表型表型内容量化单位或注释测量仪器性别1，21=男，2=女出生年月年.月.日高原居住年限数值年12 血压舒张压和收缩压数值mmHg①HR心率数值次/分钟肺功能指标②时间肺活量数值L最大呼气流量数值dL最大肺活量数值L血常规③WBC白细胞计数数值/LRBC红细胞计数数值/LHGB血红蛋白浓度数值g/LHCT红细胞压积数值%MCV平均红细胞体积数值fLSaO2血氧饱和度数值%④心脏超声诊断（D/S）⑤EF射血分数数值%SV每搏输出量数值MlCO每分心输出量数值mL/minFS%左心室小轴缩短率数值%（①表示采用台式血压仪检测血压，②表示肺功能仪（型号SPIDA5，MicroMedicalLimited，UK)检测肺功能指标；③表示采用血液分析仪（型号SYSMEXpocH-100i，Japan）检测红细胞数、血红蛋白和红13 细胞压积；④表示采用便携式血氧仪（型号NellcorNPB-40，USA）检测血氧饱和度；⑤表示超声诊断仪（型号ACUSONCA94043，USA）检测各项心功能指标。D和S代表分别在Diastole（舒张）和Systole（收缩）两个时期测量指标。）2.1.2研究方法首先依据查阅文献和专家指导自行设计调查问卷表，其中内容包括姓名、性别、出生年月、民族、是否三代以上生活在高原、既往史以及呼吸、神经、消化、循环系统的改变情况等，并签订知情同意书；同时对调查人员进行统一的培训，保证所采集数据的质量。采用偶遇调查，进行自填式调查。其次，本课题前期研究获得的与高原低氧适应相关的4个（SLC8A1、ADRA1A、KIF1B、PRKCE）候选基因22个SNP位点利用SquenomMassARRAY检测平台进行扩大样本验证。2.1.3质量控制首先为了确保调查问卷资料的收集及填写的质量，调查采用统一的调查程序进行。由于调查涉及个人隐私和敏感问题，为尽可能保证保密，调查表采用独立填写，当场收回的方式。其次，为了确保实验样本的分型数据质量，对不同海拔高度世居藏族22个SNP位点分型原始数据进行预处理，利用illumina公司自主研发软件GenomeStudio软件导出，并同时对数据进行质量控制（QualityControl）。2.1.4资料分析首先，对调查数据采用SPSS17.0统计软件进行分析，计数资料采用卡方检验，2X值进行哈迪温伯格值检验。其次，对本实验采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料采用T检验，计数资料采用卡方检验，计算基因频率，基因关联分析，以及被选择的SNP基因型分布是否符合哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinbergequilibrium），重点分析SNP位点在不同人群中的频率分布情况及藏族和平原汉族之间频率差异情况。单因素方差分析法应用于群体表型的比较，采用T检验计算基因型对临床表型的影响，用plink软件最后所生成的ped、map文件数据进行关联分析，获得的藏汉各遗传位点间的进行比较，以P＜0.05为差异有14 统计学意义。2.2实验材料与方法2.2.1实验仪器（1）微量移液器芬兰Biohit公司（0.1~0.25μl，1~10μl，1~20μl，10~100μl，100~1000μl）（2）台式微离心机德国Eppendorf公司（3）涡旋振荡器江苏海门麒麟医用仪器厂（4）9700PCR仪美国ABI公司（5）微量分光光度计NanoDropND2000美国Thermo公司（6）超低温箱(-80℃)美国Thermo公司（7）超纯水仪美国Millipore公司（8）电热恒温水浴锅天津泰斯特仪器有限公司（9）凝胶成像分析系统美国Bio-Rad公司（10）电泳仪北京六一仪器厂2.2.2主要实验试剂及溶液配制和分析软件（1）DNA提取试剂盒北京Tiangen公司产品（2）PCR反应试剂美国Sequenome公司产品（3）TE缓冲液北京索莱宝科技有限公司（4）琼脂糖北京索莱宝科技有限公司（5）引物设计软件美国Sequenome公司（6）基因分型分析软件美国Sequenome公司2.2.3实验方法2.2.3.1基因组DNA提取本实验基因组DNA提取使用TIANamp血液基因组DNA提取试剂盒，按照操作说明书提取收集的血样DNA，主要步骤如下：a.取200μl全血标本至1.5mlEP管中，做好相应样本标记，加入20μl蛋白15 酶K，混匀；b.加入200μlBufferBL，涡旋振荡15s以充分混匀；c.简短离心20s，65℃水浴10min，水浴过程中简单震动一次；d.加260μl无水乙醇，涡旋混匀20s，简短离心20s；e.将上述混合液转入带收集管的离心柱，8000×g离心1min，倒掉废液，更换新的收集管；f.加500μlBufferHB8000×g离心1min，倒掉收集管中的废液，将离心柱放回收集管；g.加700μlDNAWashBuffer(含乙醇)，8000×g离心1min，离心倒掉废液，将离心柱放回收集管；h.再加700μlDNAWashBuffer，8000×g离心1min，倒掉废液，将离心柱放回收集管；i.15000×g空管离心2min离心柱开盖室温放置瞭干；j.将离心柱转入另一新1.5mlEP管经高压灭菌中，加入100μlElutionBuffer(65℃预热)，静置5min，8000×g离心1min，将溶液收集到离心管中；k.重复步骤(j)以提高提取效率，将收集有DNA溶液的离心管做好标记(编号、批次、提取日期等)，-70℃保存备用。（2）检测所提DNA浓度与纯度a.采用紫外分光光度仪NanoDropND2000测量DNA浓度与纯度：通过测量DNA在260nm和280nm紫外线吸光值比(A260/A280)来衡量DNA纯度。每个样本测量2次，取平均值。如果两次测量误差>10%则测量第3次，取相近DNA浓度的平均值。b.分别加入适量的TE缓冲液将每个样本稀释至终浓度5±0.5ng/µL。（3）引物设计与合成在NCBI中dbSNP数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)所挑选SNPs位点所在的基因序列，使用(https://www.mysequenom.com/Home.aspx)引物设计软件进行引物设计。针对每个位点设计相应的三条引物，即用于PCR扩增的上游、下游引物（1st-PCRprimer，2nd-PCRprimer）以及一条单碱基延伸反引物（UEP-SEQ），所设计的引物序列由北京博奥晶典生物技术有限公司合成。16 2.2.3.2SNP位点检测分型与验证a.PCR扩增反应根据实验样本数目，计算所需反应体系的量，每个样本所需的PCR反应体系如下:NanopureH2O1.75μlPCRBufferwithMgCL20.675μlMgCL2（mM）0.375μldNTPmix（25mM）0.100μlPrimermix（500Nmeach）1.000μlGenomicDNA（5-10ng/μl）1.000μlHostarTaq（5U/μl）0.100μlTotal5.000μl先将实验样本DNA加至384微孔板，再各加4μlPCR反应体系（冰上操作），封膜，在振荡器上轻轻混匀，2000rmp瞬时离心，放置9700PCR仪中，反应条件设置为：94℃15minutes94℃15seconds56℃30seconds45cycles72℃60seconds72℃3minutes4℃hold反应结束后，2000rmp瞬时离心。b.SAP反应根据检测样本数目，配SAP反应体系如下：NanopureH2O1.530μl10×SAPbuffer0.170μlSAPenzyme（1U/μl）0.300μl17 Total2.000μl向含有PCR反应产物的孔中加入2μlSAP反应体系混合物（冰上操作），封膜，在振荡器上轻轻混匀，2000rmp瞬时离心后将384微孔板置于9700PCR仪中反应，条件设置为：37℃40分钟，85℃5分钟，4℃静止。反应结束后，2000rmp瞬时离心。c.iPLEX反应（单碱基延伸反应）根据实验样本数目，计算所需反应体系的量，每个样本所需的反应体系如下：NanopureH2O0.755μliPLEXBufferPlus（10×）0.200μliPLEXterminationmix0.200μlIplexextendPrimermix0.803μliPLEXenzyme0.042μlTotal2.000μl向SAP反应结束的384微孔板每孔加入2μl反应体系（冰上操作），封膜，在振荡器上轻轻混匀，2000rmp瞬时离心后置于9700PCR仪中，反应条件设置如下：94℃5seconds94℃5seconds52℃5seconds5cycles40cyceles82℃5seconds72℃3minutes4℃holdd.脱盐、点样反应结束后，2000rmp瞬时离心，向板上每个加有反应体系的孔中加16μl去离子高压水稀释反应产物，再加入树脂6mg（用树脂板操作），封膜后在振荡器上轻轻混匀，于垂直混合器上混匀15min，2000rmp离心5min。去掉封膜，将384微孔板按正确的方位置于MassARRAY仪中，釆用24点样针将反应产物转移至含有基质的SpectroCHIP芯片上。e.质谱检测18 将带有样品的SpectroCHIP芯片放入MALDI-TOF质谱仪中进行检测，整个工作平台为MassARRAY操作系统。利用样品分子在电场中的飞行时间与分子的质荷比成正比的原理，通过检测样品分子的飞行时间测得分子量，从而推出SNP基因型。用相应的结果分析软件查看并输出基因分型结果。f.候选位点的验证采用SequenomMassArray平台对候选SNPs位点进行分型验证。该技术是由Sequenom公司推出的通过引物延伸或切割反应与MALDI-TOF质谱技术相结合，实现基因分型、DNA甲基化监测的世界领先基因分析工具。实验设计灵活，分型结果准确性高，对于数十到数百个SNP位点进行数百至数千份样本检测时，MassARRAY具有最佳性价比。特别适合于已经确定有限数量研究位点的情况或全基因组研究发现的结果进行验证的应用。19 第三章研究结果本次研究首先对2884名世居者和移居者高原适应情况进行两两比较，结果发现世居者和移居者高原适应情况差异有统计学意义（P﹤0.05），不同海拔高度四个地区高原适应情况差异显著（P﹤0.05）。进一步证明世居者的高原适应性较移居者好，结果详见表2~9。其次，我们对与高原适应相关的4个（SLC8A1、ADRA1A、KIF1B、PRKCE）候选基因22个SNP位点在241例藏族样本和对照组208例HapMapⅢ期中北方和南方平原汉族中进行分型与验证。发现世居藏族和平原汉族间最小等位基因频率差异显著（P﹤0.05），还发现与藏族低氧适应相关的重要候选位点。进一步证明了SLC8A1、ADRA1A、KIF1B、PRKCE基因可能是藏族低氧适应相关的候选基因。3.1调查结果3.1.1流行病学调查结果3.1.1.1研究对象的基本情况统计描述本课题对西藏不同海拔高度的4个地区（拉萨、山南、林芝、日喀则、海拔3100-4100m）共2884名世居者与移居者高原适应情况用自行设计的问卷表进行流行病学基线偶遇调查，其中世居者1691人（58.6%），移居者1193人（41.4%）；民族结构;藏族1764人（61.2%），平原汉族1086(37.6%)，其他民族34人（1.2%）；性别结构：男性1570人（54.4%），女性1314人（45.6%）；年龄结构：男性:14≤80，女性:14≤72；学历结构：博士学历31人（1.1%），研究生学历328人（11.4%），本科1425人（49.4%），大专学历706人（24.5%），中专及以下394人（13.6%）；婚姻状况：未婚1390人（48.2%），已婚1361人（47.2%），离婚75人（2.6%），分居39人（1.4%），再婚16人（0.6%），丧偶3人（0.1%）;具体资料见表220 表2世居者与移居者基本资料项目世居藏族移居者P总数16911193年龄14≤8014≤690.001性别0.001男（%）799（50.9%）771（49.1%）女（%）892（67.9%）442（32.1%）吸烟状况吸烟者357(21.1%)268(22.5%)非吸烟者1185(70.1%)803(67.3%)曾经吸，现已戒烟149(8.8%)122(10.2%)饮酒状况饮酒者869(51.4%)526(44.1%)非饮酒者822(48.6%)667(55.9%)3.1.1.2世居者和移居者高原不适应的整体情况世居者和移居者高原适应情况进行分析，发现世居者总的不适应率为34.9%，而移居者总的不适应率为52.9%。再进行世居者和移居者间不适应率比较（X2=2024.2；P<0.05）差异有统计学意义。详见表3表3世居者和移居者高原不适应情况组别总数*不适应数*不适应率（%）世居者355111239134.9移居者250531326952.9合计605642566042.4（备注：1.总数=每组人数×22（项目数），不适应数=每组22个项目中不适应人数总和。）2.X2=2024.2P<0.013.1.1.3高原环境对世居者与移居者呼吸系统的影响此次调查结果显示：世居者与移居者呼吸系统的不适应情况差异显著，高原21 世居者与移居者相比，世居者的适应性较好。尤其世居者和移居者在呼吸困难、胸闷等情况差异很显著（P<0.05）差异有统计学意义。详见表4表4高原环境对世居者与移居者呼吸系统不适应情况2项目呼吸系统不适应数XP世居者移居者自感呼吸困难521781（65.5）204.6﹤0.05自感胸闷，气短517636（53.3）93.7﹤0.05不明原因经常感冒667529（44.4）4.4﹤0.05自感经常喉咙不适723711（59.7）41.7﹤0.05经常性鼻出血484652（54.7）75.7﹤0.05合计2912(33.43309(55.5)471.9﹤0.05（备注：1.总数=每组人数×5（项目数），不适应数=每组5个项目中不适应人数总和。）3.1.1.4高原环境下世居者与移居者神经系统的影响调查显示：世居者与移居者神经系统的不适应情况差异显著，在高原地区，以低压低氧为主要特点的恶劣的气候环境对机体造成多方便的影响，并可对移居高原个体多系统、多脏器的损伤[51-52]。而在各系统中，神经系统对高原低压缺氧最为敏感，受不同程度的影响，更容易导致移居高原个体出现一系列的神经功能失调症状。有研究发现，高原低压缺氧环境对神经功能的失调等症状（如，睡眠紊乱、记忆力减退等症状）。本次调查发现高原低压缺氧环境对世居藏族和移居者的神经系统有不同程度影响，但世居者的影响程度低于移居平原汉族。世居者和移居者的高原不适应情况差异显著（P<0.05）差异有统计学意义。详见表5表5高原环境下世居者与移居者神经系统的不适应情况项目神经系统不适X2P世居者移居者经常性失眠723704（59.0）39.5﹤0.05自感记忆力减退789708（59.3）23.0﹤0.05经常性夜间多梦861767（64.3）23.65﹤0.05经常烦躁不安796757（63.5）37.1﹤0.05自感注意难于集中676670（56.2）43.4﹤0.05自感听力下降248(14.7)293(24.6)37.3﹤0.05自感耳鸣或中听613(36.3)595(49.9)32.5﹤0.05海拔变化出现耳塞851(50.3)811(67.9)40.49﹤0.05自感味觉下降85(5.1)137(11.5)38.2﹤0.05合计56425442(50.68)476.8﹤0.05（备注：1.总数=每组人数×9（项目数），不适应数=每组9个项目中不适应人数总和。）22 3.1.1.5高原环境对世居者与移居者循环系统的影响调查显示：在被调查的世居者和移居者在高原低压低氧环境中对循环系统有不同程度的影响，但移居者的影响程度大于世居者。结果发现在高原低压缺氧环境下移居者经常性心跳加快、经常性有头晕头疼现象较多，在世居者和移居者之间差异很显著（P<0.05）差异有统计学意义。只有血压异常情况在世居者和移居者之间没有差异。详见表6表6高原环境下世居者与移居者循环系统的不是情况项目循环系统不适应数X2P世居者移居者经常性心跳加517（30.6）636（53.3）98.3﹤0.05血压异常388（22.9）288（24.1）0.45﹥0.05经常性头晕头288（17.0）737（61.8）424.2﹤0.05眼结膜充血403（23.8）480（40.2）65.5﹤0.05嘴唇及脸颊发396（23.4）481（40.3）69.9﹤0.05合计1992（23.6）2922（48.9）1094.1﹤0.05（备注：1.总数=每组人数×5（项目数），不适应数=每组5个项目中不适应人数总和。）3.1.1.6高原环境对世居者与移居者消化系统的影响世居者和移居者在高原低压缺氧环境中生活会对消化系统带来不同程度的影响，高原低压缺氧环境对消化系统的影响主要表现为食欲下降、恶心、呕吐、腹胀、腹泻等症状，可引起胃肠道功能失调。本次调查发现世居者和移居者较多人群出现食欲下降，经常性腹泻等症状，两组间的差异显著（P<0.05），差异有统计学意义。详见表7表7高原环境对世居者与移居者消化系统的影响比较项目消化系统不适应数X2P世居者移居者自感食欲下降696(41.2)666(55.8)36.41﹤0.05经常性腹泻696(41.2)642(53.8)27.37﹤0.05有胃炎、胃溃疡453(26.8)288(24.1)2.31﹥0.05合计1845（36.4）1596（44.3）150.8﹤0.05（备注：1.总数=每组人数×3（项目数），不适应数=每组3个项目中不适应人数总和。）23 3.1.1.7不同海拔高度世居者与移居者在高原环境下对机体总体不适应情况本次调查对4个不同海拔高度的共2884名世居者和移居者进行高原不适应情况比较，其中拉萨1115名世居者（579）和移居者（536）；山南531名世居者（250）和移居者（281）、林芝359名世居者（153）和移居者（206）、日喀则879名世居者（708）和移居者（171）被调查的世居藏族和移居者在不同海拔高度的4个地区的总体不适应情况差异显著（P﹤0.05）差异有统计学意义。详见表8，以及各个地区的世居者和移居者的不适应情况比较。详见表9表8不同海拔高度的世居者和移居者高原不适应情况比较项目世居者不适应移居者不适应率X2P不适数率（%）不适数（%）拉萨419534.5540448.0山南200938.3308552.3157日喀则439529.6186252.2﹤0.050.3林芝179255.9291867.2合计1239134.91326952.6————（备注：1.总数=每组人数×22（项目数），不适应数=每组22个项目中不适应人数总和。）表9各个地区的世居者和移居者高原适应情况比较拉萨山南日喀则林芝项目世居者移居者世居者移居者世居者移居者世居者移居者适应796458523241281610473170814211408不适应41955404200930854395186217922918合计12159112565250590114868357032134326X2440.9219.8655.7107.3P﹤0.05﹤0.05﹤0.05﹤0.05（备注：1.总数=每组人数×22（项目数），不适应数=每组22个项目中不适应人数总和。）24 在各地区世居者和移居者的总的不适应情况比较，发现各地区世居者和移居者高原总体不适应情况差异显著（P<0.05）差异有统计学意义。世居者的适应性高于移居者，相对而言移居者在高原缺氧环境下对各系统及器官更容易遭受损伤，也可以说是以损伤为代价生活。相比之下世居者适用性较好，这可能是长期的自然习服结果。但也有很多世居者仍然存在不适应的现象，从各个系统、组织细胞水平上出现不同程度的不适应症状，以往的很多国内外研究表明世居藏族较移居者更好的适应高原低压低氧环境。因为世居藏族在高原上经过长期漫长的进化和演变，发生了基因流动、基因漂移等自然选择的作用下，在遗传因素上发生很大改变来适应高原环境[10]。我们将进一步从基因水平与分子生物学技术相结合进行研究与低氧适应相关的候选基因。3.2实验结果3.2.1世居藏族的生理生化表型对世居藏族生化表型统计结果显示，世居藏族临床生化表型基本在正常参数范围内，反应心室收缩功能的心功能指标EF（射血分数%）在世居藏族人群中男性是73.77±4.86%女性是73.63±4.36%，明显高于正常范围值67±8%，在一定程度上反应该人群是适应高原优势群体。具体详见表10表10世居藏族生化表型数据统计世居藏族表型M（112）F（129）Age25.48±2.6724.55±2.34SaO2（%）89.50±5.4589.83±5.49Hb（g和dＬ）16.12±3.4313.91±3.60HR（times和min）75.82±11.4178.40±11.91最大呼气流量（dＬ）788.36±131.98518.45±75.48最大肺活（Ｌ）4.49±0.373.52±0.25时间肺活量（Ｌ）4.09±0.373.27±0.19HCT（％）0.22±0.150.19±0.1225 EF（％）73.77±4.8673.63±4.36每搏输出量（mL和min）69.89±16.4460.78±12.44每分心输出量（L）5.22±1.344.76±1.19AO（cm）2.71±0.352.57±0.38（M代表男性，F代表女性；Hb代表血工蛋白，SaO2代表血氧饱和度，HR代表心率，HCT代表红细胞压积，EF代表射血分数，AO主动脉内径。）3.2.2世居藏族低氧适应相关候选基因选择3.2.2.1世居藏族低氧适应相关的候选基因本课题前期研究通过GAWAS方法筛出的低氧适应相关的4个候选基因是SLC8A1、ADRA1A、PRKCE、KIF1B基因。本课题采用SequenomMassArray平台对候选基因的SNPs位点进行分型验证。一方面是为了进一步证明这些候选基因可能藏族低氧适应相关的候选基因，另一方面筛选出于低氧适应相关的重要候选位点。3.2.2.2候选基因位点样本分型与验证对前期研究所获得的候选基因位点进行扩大人群验证，具体方法是利用SequnomMassArray平台对候选SNP位点进行分型验证。初步我们筛选出SLC8A1（3个SNP），ADRA1A（5个SNPs），PRKCE（10个SNP），KIF1B（4个SNP），共22个SNP进行验证。我们在155例昌都人群、39例波密人群、47例安多人群与HapMapⅢ中北方和南方平原汉族（208例）人群中进行基因分型和验证。进行关联分析和不同人群的频率分布情况比较，发现不同海拔高度的人群与平原汉族之间SLC8A1的3个SNP，ADRA1A的5个，PRKCE的10个，KIF1B的4个SNP均具有显著性的差异，详见表11表11候选SNP位点在不同人群中的最小等位基因频率分布情况最小等位基因位点ANDCDGBOMIHan基因rs10492970G0.26090.1550.2050.053KIF1Brs17034615A0.2610.1680.2050.05326 rs2297881G0.2610.1680.2050.053rs17034716C0.48920.4970.5130.053rs7571879T0.3400.1820.1790.024rs11898209G0.4570.3130.3460.168rs6544852T0.4430.3040.3330.147rs6756452A0.2500.1470.1280.048PRKCErs3768753G0.4670.4820.4620.716rs10205024A0.4890.3390.3460.123rs2278775G0.5160.3460.3460.125rs3820729T0.4670.3130.2820.113rs2594489C0.0870.2140.2050.526rs2594494C0.1190.2460.2310.555rs1442341G0.4890.4850.5000.673rs1048101A0.3150.3120.3080.108ADRA1Ars7842829T0.3150.3120.3080.111rs6557946A0.3190.3280.3330.108rs11779546G0.2330.1920.2500.067rs2192771C0.3260.3260.3110.332SLC8A1rs13031392T0.2610.1950.2210.060rs4952404T0.4970.4820.4620.296（AND代表安多，CDG代表昌都，BOMI代表波密，Han代表平原汉族）此外本课题获得的世居藏族表型数据与藏族基因型数据进行数量性状关联分析发现PRKCE基因上的rs3768753位点与SV及EF相关；rs2594489位点与HCT、FVC、PEF、FEV1、SaO2相关；rs2594494位点与FEV1、FVC、PEF、HCT相关；rs6544852位点与SaO2、Ao、FEV1、FVC、PEF相关；rs6756452位点与SaO2相关。ADRA1A基因上的rs1442341位点与SaO2及相关；rs6557946、rs7842829和rs1048101位点与A0相关；rs11779546位点与SaO2、SV相关。KIF1B基因上的rs17034716位点与SaO2相关；rs10492970位点与A0相关；rs17034615位点与AO相关；rs2297881位点与AO相关（P<0.05）。SLC8A127 基因上的rs4952404位点与SaO2相关（P<0.05）。另外，在不同人群的表型数据数量性状关联分析发现，在安多人群中的（4700m）rs3768753位点与反应心室功能的射血分数有相关性，并且表在表型数据统计分析结果显示射血分数值明显高于正常范围，在高海拔的人群中rs376875位点具有特殊的贡献，这可能提示我们这个位点可能是藏族低氧适应相关的重要候选位点，而且这个位点可能在该人群中起到低氧适应选择性作用。还发现世居藏族8个（rs11898209、rs6544852、rs6756452、rs2594489、rs17034716、rs4952404、rs1442341、rs11779546）候选位点均与血氧饱和度显著相关（P<0.05），有文献报道血氧饱和度在藏族人群中可能有一个显性遗传模式的主效基因控制，而且藏族长期在高海拔上生活血氧饱和度较高于平原人群，因此考虑与血氧饱和度相关的基因可能是低氧适应相关的重要候选位点。详见表12表12基因与表型数量性状关联分析基因染色体位点最小等位BetaP表型人群基因PRKCE2rs3768753G-6.4230.011SVAnduoPRKCE2rs2594489C0.0540.038HCTAnduoPRKCE2rs3768753G-2.5270.002EFAnduoPRKCE2rs11898209G-1.8660.045SaO2BomiPRKCE2rs6544852T-2.1250.027SaO2BomiPRKCE2rs2594489C-0.2590.027FEV1BomiPRKCE2rs2594494C-0.2760.019FEV1BomiPRKCE2rs2594489C-98.790.005PEFBomiPRKCE2rs2594494C-98.810.005PEFBomiPRKCE2rs2594489C-0.2890.021FVCBomiPRKCE2rs2594494C-0.3060.015FVCBomiPRKCE2rs2594489C-0.03060.028HCTBomiPRKCE2rs2594494C-0.02980.035HCTBomiPRKCE2rs11898209G0.1050.042AoChangduPRKCE2rs6544852T0.1250.024AoChangdu28 PRKCE2rs6544852T0.1920.009FEV1ChangduPRKCE2rs6544852T55.920.025FVCChangduPRKCE2rs6544852T0.1920.020PEFChangduPRKCE2rs6756452A-1.7360.048SaO2ChangduPRKCE2rs2594489C1.1210.032SaO2ChangduKIF1B1rs17034716C-2.7000.015SaO2AnduoKIF1B1rs10492970G0.2350.029A0AnduoKIF1B1rs17034615A0.250.029A0AnduoKIF1B1rs2297881G0.2350.029AOAnduoSLC8A12rs4952404T-2.3870.032SaO2AnduoADRA1A8rs1442341G2.1880.049SaO2AnduoADRA1A8rs1048101A-0.0910.034AoChangduADRA1A8rs7842829T-0.0910.034AoChangduADRA1A8rs6557946A-0.0860.044AoChangduADRA1A8rs11779546G-1.4940.008SaO2ChangduADRA1A8rs11779546G-6.020.015SVChangdu（注：SV表示每搏输出量；EF表示射血分数；SaO2表示血氧饱和度；HCT表示红细胞压积；Ao表示主动脉内经；PEF最大呼气流量；FEV1表示时间肺活量；FVC最大肺活量；）3.2.2.3世居藏族和平原汉族SNP位点的基因型分布及等位基因频率的比较对世居藏族241例和208例HapMapⅢ期中北方和南方平原汉族的22个SNP位点基因型频率进行比较分析，发现KIF1B基因上的rs10492970位点的GG、GA和AA的基因型频率在世居藏族和平原汉族中别是2.1%和0%；30.9%和10.6%；67.0%和89.4%，rs17034615位点AA、GA和GG基因型频率在分别是2.5%和0%；32.2%和10.6%；65.3%和89.4%，rs17034716位点CC、CT和TT基因型频率分别是24.7%和0%；50.6%和10.6%；24.7%和89.4%，rs2297881位点上的GG、GA和AA基因型频率分别是2.5%和0%；32.2%和10.6%；65.5%和89.4%。世居藏族和平原汉族之间各组间基因型频率比较均差异较显著（P﹤0.05），这提示我们KIF1B基因上的4个候选位点均可能是低氧适应相关的候选位点，而且在rs10492970位点的GA基因型、rs17034615位点的GA基因型、29 rs17034716位点的CT基因型和rs2297881位点的GA基因型可能更有利于适应高原低压低氧环境。详见表13表13KIF1B基因在世居藏族与平原汉族的基因型分布统计分析普通世居平原汉族基因位点基因型X2P藏族（%）（%）GG5(2.1)0（0）4.4﹤0.05rs10492970GA74(30.9)22（10.6）26.9﹤0.05AA160(67.0)186（89.4）33.5﹤0.05AA6(2.5)0（0）5.2﹤0.05KIF1Brs17034615GA77(32.2)22（10.6）29.7﹤0.05GG156(65.3)186（89.4）37.5﹤0.05CC60(24.7)0（0）59.8﹤0.05rs17034716CT121(50.6)22（10.6）80.8﹤0.05TT60(24.7)186（89.4）187.7﹤0.05GG6(2.5)0（0）5.2﹤0.05rs2297881GA77(32.2)22（10.6）29.7﹤0.05AA156(65.3)186（89.4）37.5﹤0.05SLC8A1基因上的rs2192771位点CC、CT和TT基因型频率在世居藏族和平原汉族中分别是11.7%和12.0%，41.8%和42.3%；r46.5%和45.7%，rs4952404位点TT、TC和CC基因型频率分别是23.1%、10.1%；49.4%、38.9%；27.5%、51.0%，rs13031392位点TT、TC和CC基因型频率分别是5.4%和0.5%；30.8%和11.1%；63.8%和88.4%。SLC8A1基因上的rs2192771位点的三个基因型各组间无统计学差异，rs4952404位点和rs13031392位点的三个基因型均在世居藏族和平原汉族中有显著差异（P<0.05）。这提示我们有差异的这两个SNP位点可能是藏族低氧适应相关的重要候选基因。而且在rs4952404位点上的TT基因型和rs13031392上的TC基因型可能更有利于世居藏族适应高原低压缺氧的环境。详见表1430 表14SLC8A1基因在世居藏族和平原汉族的基因型分布统计分析世居藏族平原汉族基因位点基因型X2P（%）（%）CC28(11.7)25（12.0）0.02﹥0.05rs2192771CT100(41.8)88（42.3）0.03﹥0.05TT111(46.5)95（45.7）0.007﹥0.05TT13(5.4)1（0.5）8.9﹤0.05SLC8A1rs13031392TC74(30.8)23（11.1）25.4﹤0.05CC153(63.8)184（88.4）37.2﹤0.05TT55(23.1)21（10.1）12.9﹤0.05rs4952404TC118(49.4)81（38.9）4.5﹤0.05CC66(27.5)106（51.0）26.3﹤0.05ADRA1A基因上的rs1442341位点的GG、GA和AA基因型在世居藏族和平原汉族中基因型频率分别是23.2%和10.6%；50.6%和41.3%；26.2%和46.7%，rs1048101位点的AA、AG和GG基因型频率分别是11.7%和1.4%；39.2%和18.8%；49.1%和79.8%，rs7842829位点TT、TC和CC基因型频率分别是11.7%和1.4%；39.2%和19.2%；49.1%和79.4%，rs6557946位点的AA、AG和GG基因型频率分别是12.0%和1.4%；41.5%和18.8%；46.5%和79.8%，rs11779546位点的AA、AG和GG基因型频率分别是12.0%和0.5%；41.5%和12.5%；46.5%和87.0%。ADRA1A基因上的5个位点基因型频率均在世居藏族和平原汉族之间各组间比较差异显著（P<0.05）。这提示我们ADRA1A基因上的5个候选位点可能在藏族低氧适应中起到不容忽视的作用，其rs1442341位点的GG基因型、rs1048101位点的AG基因型、rs7842829位点的TC基因型、rs6557946位点的AG基因型和rs11779546位点的AG基因型可能更有利于世居藏族适应低压低氧环境。因此推测ADRA1A基因是高原低氧适应相关的候选基因。详见表15表15ADRA1A基因在世居藏族和平原汉族的基因型分布统计分析世居藏族平原汉族基因位点基因型X2P（%）（%）GG56（23.2）25（12.0）53.8﹤0.0531 rs1442341GA122（50.6）86（41.3）49.7﹤0.05AA63（26.2）97（46.7）61.1﹤0.05AA28（11.7）3（1.4）59.9﹤0.05ADRA1Ars1048101AG94（39.2）39（18.8）63﹤0.05GG118（49.1）166（79.8）78.9﹤0.05TT28（11.7）3（1.4）59.8﹤0.05rs7842829TC94（39.2）40（19.2）62.2﹤0.05CC118（49.1）165（79.4）77.8﹤0.05AA29（12.0）3（1.4）60.6﹤0.05rs6557946AG100（41.5）39（18.8）66.8﹤0.05GG112（46.5）166（79.8）83.9﹤0.05AA29（12.0）1（0.5）64.2﹤0.05rs11779546AG100（41.5）26（12.5）80.9﹤0.05GG112（46.5）181（87.0）104.3﹤0.05PRKCE基因上的rs7571879位点TT、TC和CC基因型频率在世居藏族和平原汉族中分别是2.5%和0%；37.3%和4.8%；60.2%和95.2%，rs11898209位点GG、GA和AA基因型频率分别是11.2%和2.9%；45.6%和27.9%；43.2%和69.2%，rs6544852位点TT、TC和CC基因型频率中分别是10.9%和1.9%；44.3%和25.5%；44.8%和72.6%，rs6756452位点AA、GA和GG基因型频率分别是2.5%和0.9%；28.3%和7.7%；69.2%和91.4%，rs3768753位点AA、AG和GG基因型频率分别是22.2%和8.2%；53.9%和40.4%；23.9%和51.5%，rs10205024位点的AA、AG和GG基因型频率分别是14.6%和1.4%；44.4%和21.6%；41.0%和76.9%，rs2278775位点GG、AA和AG基因型频率分别是15.8%和1.4%；43.9%和22.1%；40.3%和79.5%，rs3820729位点TT、TC和CC基因型频率分别是12.9%和0.9%；42.7%和20.7%；44.7%和78.4%，rs2594489位点CC、CT和TT基因型频率分别是5.4%和22.6%；27.1%和49.5%；65.5%和27.9%，rs2594494位点CC和CT、TT基因型频率分别是23.6%和19.2%；30.1%和50.5%；62.4%和30.3%，PRKCE上的10个SNP候选位点在世居藏族和平原汉族中基因型频率差异显著（P﹤0.05）差异有统计学意义。这提示我们PRKCE基因上有差异位点均可能是32 低氧适应相关的候选位点。而且rs7571879位点的TC基因型、rs11898209位点GA基因型、rs6544852位点TC基因型、rs6756452位点GA基因型、rs3768753位点AA基因型、rs10205024位点AG基因型、rs2278775位点AA基因型、rs3820729位点TC基因型、rs2594489位点TT基因型和rs2594494位点TT基因型可能更有利于世居藏族适应高原低压低氧环境。详见表16表16PRKCE基因在世居藏族和平原汉族的基因型分布统计分析世居藏族平原汉族基因位点基因型X2P（%）（%）TT6（2.5）0（0）5.2﹤0.05rs7571879TC90（37.3）10（4.8）68.3﹤0.05CC145（60.2）198（95.2）75.9﹤0.05GG27(11.2)6（2.9）55.1﹤0.05rs11898209GA110(45.6)58（27.9）58.1﹤0.05AA104(43.2)144（69.2）68.3﹤0.05TT25(10.9)4（1.9）56.4﹤0.05rs6544852TC101(44.3)53（25.5）56.7﹤0.05CC102(44.8)151（72.6）76.1﹤0.05AA6(2.5)2（0.9）47.9﹤0.05rs6756452AG68(28.3)16（7.7）69.5﹤0.05GG166(69.2)190（91.4）70.5﹤0.05AA53(22.2)17（8.2）58.7﹤0.05PRKCErs3768753AG129(53.9)84（40.4）52.7﹤0.05GG57(23.9)107（51.5）73.1﹤0.05AA35（14.6）3（1.4）64.8﹤0.05rs10205024AG106（44.4）45（21.6）24.9﹤0.05GG98（41.0）160（76.9）60.1﹤0.05GG38（15.8）3（1.4）27.6﹤0.05rs2278775AA106（43.9）46（22.1）64.5﹤0.05AG97（40.3）159（76.5）89.1﹤0.0533 TT31（12.9）2（0.9）63.7﹤0.05rs3820729TC103（42.7）43（20.7）65.1﹤0.05CC107（44.4）163（78.4）84.7﹤0.05CC13（5.4）47（22.6）67.1﹤0.05rs2594489CT65（27.1）103（49.5）63.8﹤0.05TT162（65.5）58（27.9）98.1﹤0.05CC17（23.6）40（19.2）57.3﹤0.05rs2594494CT72（30.1）105（50.5）60.7﹤0.05TT150（62.4）63（30.3）80.8﹤0.05对世居藏族241例与和照组208例平原汉族的SNP位点最小等位基因进行频率比较，世居藏族和平原汉族最小等位基因频率比较结果显示；KIF1B上的4（rs10492970、rs17034615、rs17034716、rs2297881）个SNP位点均有差异，SLC8A1上的2（rs4952404、rs13031392）个SNP位点有显著差异，PRKCE上的10（rs11898209、rs6544852、rs6756452、rs3768753、rs10205024、rs2278775、rs3820729、rs2594489、rs2594494、rs7571879）个SNP位点有差异，ADRA1A上的5（rs1177946、rs6557946、rs7842829、rs1048101、rs1442341）个SNP位点有差异（P﹤0.05），因此我们推断KIF1B、SLC8A1、PRKCE和ADRA1A基因可能是藏族低氧适应相关的候选基因。详见表17。表17世居藏族与平原汉族的最小等位基因频率的比较最小/主要世居藏族（最小平原汉族（最小基因染色体位点POR等位基因等位基因频率）等位基因频率）1rs10492970G/A0.1760.0533.38E-090.31rs17034615A/G0.1860.0534.87E-100.2KIF1B1rs2297881G/A0.1850.0535.56E-100.21rs17034716T/C0.5000.0538.60E-510.12rs2192771C/T0.3260.3320.88531SLC8A12rs13031392T/C0.2080.0614.04E-110.22rs4952404C/T0.5230.2961.65E-080.52rs7571879T/C0.2130.0242.46E-170.134 2rs11898209G/A0.3400.1681.62E-090.42rs6544852T/C0.3310.1476.92E-110.42rs6756452A/G0.1670.0483.35E-080.32rs3768753G/A0.5080.2841.60E-110.4PRKCE2rs10205024A/G0.3680.1231.67E-170.22rs2278775G/A0.3780.1253.91E-180.22rs3820729T/C0.3420.1131.29E-150.32rs2594489C/T0.1890.5266.70E-284.72rs2594494C/T0.2220.5551.84E-264.48rs1442341G/A0.4860.3277.22E-094.78rs1048101A/G0.3130.1085.04E-144.4ADRA1A8rs7842829T/C0.3130.1111.09E-130.38rs6557946A/G0.3260.1081.20E-150.38rs11779546G/A0.2010.0671.40E-090.33.2.2.4最小等位基因频率随着海拔的升高而增大我们统计低海拔平原汉族（50米），波密（2400米），昌都（3700米），安多（4700米）人群中最小等位基因频率，发现SLC8A1基因上rs4952404和rs13031392位点，PRKCE基因上的rs7571879、rs6756452、rs3820729和rs2278775位点，ADRA1A基因上的rs7842829位点的最小等位基因频率随着海拔升高而升高，其在安多人群中显示最小等位基因频率最大，这提示我们随着海拔的升高，高原低压低氧环境虽然对人类有具有极大的挑战性，而具有SLC8A1基因上rs4952404和rs13031392位点、PRKCE基因上的rs7571879、rs6756452、rs3820729和rs2278775位点和ADRA1A基因上的rs7842829位点的藏族人群可能适应高原低氧环境的优势人群。因此，我们推测SLC8A1基因上rs4952404和rs13031392位点、PRKCE基因上的rs7571879、rs6756452、rs3820729和rs2278775位点和ADRA1A基因上的rs7842829位点可能是藏族低氧适应相关的重要候选位点。35 第四章讨论、结论与后续研究计划4.1.讨论2010以来高原低氧适应机制的研究有了前所未有的成就，以往的研究表明世居藏族获得高原最佳适应[12]。本次研究首先通过各系统和代谢功能适应情况调查为下一步低氧适应机制准备理论数据。调查发现世居者总的高原不适应率为34.9%，而移居者总的高原不适应率为52.9%，其世居者和移居者神经系统不适应率为37.1%和50.7%；循环系统的不适应率为23.6%和48.9%；消化系系统不适应率为36.4%和44.3%。在不同海拔高度的四个地区的世居者和移居者总的高原不适应情况调查显示，拉萨世居者和移居者总的不适应率为34.5%和48.0%；山南世居者和移居者总的不适应率为38.3%和52.3%；日喀则世居者和移居者总的不适应率为29.6%和52.2%；林芝世居者和移居者总的不适应率为55.9%和67.2%。综上所述，不同海拔高度4个地区的世居者和移居者各组间高原适应情况差异显著（P﹤0.05）差异有统计学意义。尤其，在经常性呼吸困难，心跳加快，有经常性头晕头疼等症状在世居者和移居者之间差异很显著。世居者与移居者总的高原适应情况相比，移居者的适应性低于世居者，与以往的研究相一致[53]。不同海拔高度的四个地区高原适应情况进行比较，发现林芝人群的不适应率最高，虽然4个不同海拔高度的人群之间比较有差异（P﹤0.05），但与以往的研究不一致，以往研究表明随着海拔的上升而增加[54]，而此次调查发现世居者不适应率最高的是林芝，其次是山南、拉萨和日喀则，移居者不适应率最高的是林芝，其次是山南、日喀则和拉萨，而没有呈现随着海拔的升高而增加，这有可能是本次调查选择样本量不一致或文化水平有一定程度的影响。虽然世居藏族的适应性较移居者好，但世居者中有部分人群仍然存在着不适应的现象。本课题实验研究对象为世居藏族和对照组平原汉族。世居藏族和平原汉族具有相同的祖先，遗传背景相似，两个人群之间存在的等位基因频率差异的SNP位点可能是遗传变异的结果，因为世居藏族和平原汉族两个人群分开后生活环境发生了改变，世居藏族生活在高原低压低氧环境下，而平原汉族生活在低海拔常36 氧环境，两个人群间的差异是环境因素所造成的。两个人群间存在差异的位点可能是低氧适应相关的候选位点。本次研究对4个候选基因的22个候选位点分别在世居藏族和HapMapⅢ期中北方和南方平原汉族（208例）样本作为对照组进行等位基因频率比较。采用低海拔平原汉族作为对照人群来探究藏族低氧适应相关候选位点。结果显示，SLC8A1基因上的rs13031392和rs4952404在世居藏族和平原汉族间频率差异显著（P﹤0.05）。这提示我们SLC8A1基因上的两个SNP位点在藏族人群中可能受到选择作用。还发现SLC8A1上的2个SNP位点在不同海拔高度人群中出现最小等位基因频率随着海拔的升高而升高，其rs4952404和rs13031392位点在安多人群中的频率最高。这提示我们随着海拔的升高，高原低氧等各种环境压力也随着增大，对机体具有强大的选择性，而具有rs4952404和rs13031392位点上的最小等位基因的世居藏族个体可能是适应高原低压低氧环境的优势群体。因此rs4952404和rs13031392位点可能是高原低氧适应的重要候选位点。另外，进行表型的数量性状关联分析，发现SLC8A1基因上的rs4952404位点与SaO2相关；rs13031392位点与AO相关（P<0.05）。SLC8A1（SoluteCarrierFamily8，member1）是钠钙交换因子，参与心肌、骨骼肌等细胞收缩过程，调节在心肌细胞收缩过程中产生的细胞内高水平的钙离子浓度，使心肌细胞恢复正常静息状态[55]，有研究表明SLC8A1是HIF-1a的一个靶基因，在大脑缺血时HIF-1a通过上调SLC8A1表达对大脑进行缺血保护机制[56]。以往的研究发现SLC8A1基因是miR-1的靶基因，而miR-1是调节心肌肥厚的一个关键因子，miR-1失能跟心脏肥大密切相关[57]。有报道到发现心机异常的大鼠中miR-1高表达能够显著抑制SLC8A1基因的mRNA和蛋白水平的表达，因而对心肌异常状况有所缓解。以上的种种表现使我们更加怀疑SLC8A1基因可能是藏族低氧适应相关的重要候选基因。ADRA1A基因上的5个SNP位点在世居藏族和平原汉族之间最小等位基因频率比较，发现在世居藏族和平原汉族间ADRA1A上的5个SNP位点均有显著性差异（P﹤0.05），这提示我们ADRA1A上的5个位点可能是低氧适应相关的候选位点。进行表型数量性状关联分析发现ADRA1A基因上的rs1442341与SaO2及EF相关；rs6557946、rs7842829、rs1048101与A0相关；rs11779546与SaO2、SV相关（P<0.05）。37 ADRA1A（Adrenoceptoralpha1α）基因编码肾上腺素受体，是G蛋白耦联受体超家族的成员之一，能够激活促有丝分裂的反应和调节许多细胞的生长和增殖。它具有三个亚型，均在人类的心脏中表达，能够调节心肌细胞的生长和收缩特性。并且有研究表明，ADRA1A多态性与原发性高血压患者血清中alA自身抗体产生有一定的关联性[58]。由此可见ADRA1A基因可能在藏族低压低氧适应中起到微效基因的作用。PRKCE上的10个SNP位点在世居藏族和平原汉族之间的最小等位基因频率比较显示：PRKCE上rs7571879、rs11898209、rs6544852、rs6756452、rs3768753、rs2278775、rs2594494、rs2594489位点在世居藏族和平原汉族之间10个位点均有显著差异（P<0.05）。另外与表型数据进行数量性状关联分析发现PRKCE基因上的rs3768753与SV及EF相关；rs2594489与HCT、FVC、PEF、FEV1、SaO2相关；rs2594494与FVC、PEF、FEV1、HCT相关；rs6544852与SaO2、Ao、FVC、PEF、FEV1相关；rs6756452与SaO2相关（P<0.05）。PRKCE（ProteinKinaseC，Epsilon）是蛋白激酶C(ProteinkinaseC)家族的一个成员，在心肌缺血时对心肌细胞起保护中作用的一个重要蛋白[59]，且有研究表明该基因在心肌缺血时被激活与涉及线粒体氧化磷酸化、电子传递、离子运输及线粒体通透性改变等相关蛋白作用，进而增加ATP合成产生缺血保护机制的[60]，且在低氧条件下被ROS的激活，同时又正向调节ROS生成形成反馈环[61]。KIF1B基因的4个候选位点最小等位基因频率比较。结果显示，KIF1B基因上的rs10492970、rs17034615、rs17034716、rs2297881候选位点的最小等位基因频率在世居藏族和平原汉族人群之间的最小的等位基因频率差异显著。另外KIF1B基因的4个SNP位点与藏族表型数据进行数量性状关联分析，发现KIF1B基因的3个SNP位点rs10492970、rs17034615、rs17034716在世居藏族人群中血氧饱和度和心功能检测指标主动脉内径有显著相关性。KIF1B(Kinesinsuperfamilyproteins，驱动蛋白超家族）是驱动蛋白的家族成员之一[62-63]，属于N-驱动蛋白，包括两个可变剪切体KIF1Bα和KIF1Bβ，KIF1B是细胞内小泡运输和细胞器转运的重要分子[64]。有研究[65]表明：KIF1BmRNA在乳腺原发性癌组织中下调与患者的预后差有相关，并且可以作为独立预后预测分子标志物。近年来有研究发现，在多种肿瘤中KIF1Bβ的突变导致其38 功能的缺失[66-68]，KIF1Bβ可诱导细胞凋亡而成为肿瘤抑制基因[69-70]。Shi等[71]同样发现KIF1BmRNA表达下调可能会增加卵巢癌的患病风险度。Schlisio等[72]研究发现KIFIB基因突变，mRNA表达下调，导致神经母细胞瘤的发生。此外，KIF1B和KIF5B是驱动蛋白家族两个负责神经元中线粒体运输的蛋白[73]，有报道称KIF5B是耐力训练诱导心脏每搏量增加的候选基因，在体外过表达KIF5B影响心肌细胞对耐力训练的适应[74]。在我们生活中机体很多疾病的病理过程都会有缺氧的问题（如心脑血管疾病，肿瘤和呼吸系统疾病等），尤其肿瘤是血管微环境异常造成的血液供应不足而导致的缺氧，归根结底与缺氧息息相关。因此，推测KIF1B基因可能在高原低压缺氧环境中起到不容忽视的作用。对世居藏族人群表型数据进行统计显示，发现反应心室收缩功能的心功能指标EF（射血分数%）在世居藏族人群中男性是73.77±4.86%；女性是73.63±4.36%，明显高于正常范围值67±8%。另外表型数量性状关联分析发现KIF1B基因的个rs17034716位点及ADRA1A基因上的rs1442341位点与世居藏族的射血分数有显著相关性（P﹤0.05），从一定的程度反应该人群是适应高原的优势群体。但目前没有发现此类相关的报道，需进一步深入研究。4.2结论本课题研究首先对不同海拔高度的4个地区共2884名世居藏族和移居者高原适应情况进行流行病学调查，采用卡方检验在世居藏族和移居者中进行比较分析。其次选择与高原低氧适应相关的4个候选基因22个SNP位点在241例世居藏族和208例平原汉族中利用SequenomMassArray平台对候选SNPs位点进行分型验证，世居藏族和平原汉族间频率的比较和相关性分析采用pink软件进行分析，发现与低氧适应相关的重要候选位点。1.在高原低压低氧环境下长期生活，对机体呼吸系统、神经系统、循环系统和消化系统均受到了一定程度的影响。2.世居藏族的高原适应性较移居者好，世居藏族总的高原不适应率为34.9%，而移居者总的高原不适应率为52.9%。不同海拔高度的4个地区高原不适应率没有随着海拔的升高而增加。39 3.进一步证明了PRKCE、SLC8A1、ADRA1A和KIF1B基因可能是藏族低氧适应相关的候选基因。4.PRKCE基因6个SNP位点（rs3768753、rs2594489、rs2594494rs6544852、rs6756452、rs11898209）在不同海拔高度世居藏族中与表型（SV、EF、HCT、FVC、PEF、FEV1、SaO2、AO）有显著相关性（P<0.05），因此推测PRKCE基因可能在藏族低氧适应机制中发挥着不容忽视的作用。5.SLC8A1基因rs4952404和rs13031392位点可能是藏族低氧适应相关的重要候选基因。6.ADRA1A基因rs1442341、rs7842829和rs11779546位点可能是藏族低氧适应相关的重要多态为位点。7.KIF1B基因rs17034716位点可能是藏族低氧适应的重要候选基因。4.3后续研究计划（1）本次调查是进行世居藏族和移居者高原适应不全情况研究的一次预调查，下一步我们将扩大样本覆盖全区不同海拔高度世居者和移居者进行大样本调查。（2）目前本课题的研究局限在全基因组SNP水平上进行世居藏族和平原汉族之间频率比较来选择信号。需要进一步从基因功能上进行研究。（3）进一步优化样本量，收集平原汉族的生理生化表型，以便于藏族表型比较，探究表型对基因的贡献。40 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附件编号：调查时间：2017年月日西藏不同海拔高度高原适应情况调查问卷表您好:我是西藏大学医学院的调查员,我们邀请您参加“高原世居和移居人群高原适应的相关研究”项目。此项目是西藏大学医学院开展的一个以青藏高原世居和移居居民为对象的研究项目，目的是对长期生活在高海拔地区的世居和移居的人进行高原适应性方面的研究。高原环境的低压、低氧、寒冷、强紫外线、干燥等给全身脏器带来一系列影响，而且机体对高原环境所出现的适应性或不适应反应是逐步发生的，表现为神经系统、呼吸系统和循环系统等各个器官及组织、细胞水平的反应。我们希望通过我们的工作，让生活在高原的人群能够知道自己的身体在高原上大概在发生什么样的变化，我们应该如何预防各种急慢性高原性疾病等。因此，我们需要向您了解：您的一般情况、居住高原时间、您身体各个系统的健康状况等。本问卷调查表采用自填式、不匿名方式填写（为方便我们后续为您提供健康咨询服务），您的回答对我们很重要，也对长期生活、工作在高原上的人群健康有很大的指导意义。希望您能根据实际情况进行回答，同时我们保证对调查中所有可能涉及到您个人及家人隐私的问题，给予严格保密。我们的研究结果将在公开科学期刊上公布，但不会擅自公布任何个人的信息。希望得到您的支持,谢谢！知情同意书本人已了解这次调查研究的描述，并对调查员的介绍感到满意，我自愿参加这项调查研究及提供相关资料。调查对象签名：签名日期:2017年月日47 填表说明1．请用签字笔或圆珠笔在相应的答案或方框里打钩√，或在横线上填写所要求的内容。2．有单选题和多选题，请根据自己实际情况选择，可多选。3.如果所需填报内容与您实际情况不符，可不填。(一)一般情况姓名：性别：男□女□出生日期：年月日所在单位：联系电话：民族：藏族□汉族□其他职称：正高□副高□中级□初级□职位：厅级及以上□县级□科级□干事/办事员□职业：学历：博士□硕士□本科□大专□中专/高中及以下□父亲籍贯省/自治区市/地区县母亲籍贯省/自治区市/地区县长期居住地省/自治区市/地区县居住时间：年移居地省/自治区市/地区县居住时间：年家族里三代以内有无与其他民族婚配的经历：1=无□2=有□三代以上是否生活在西藏地区：1=否□2=是□是否曾在内地或国外上学：1=否□2=是□在内地上学年限：1=少于1年2=1-3年□3=4-6年□4=7-10年5=10年以上婚姻状况：1=未婚□2=已婚□3=离异□4=分居□5=再婚□6=丧偶□子女情况：有无子女？1=没有□2=1个□3=2个□4=3个□其他：小孩性别？：1=1个男孩□2=1个女孩□3=2个男孩□4=2个女孩□5=1男1女□其他：小孩出生情况：1=在内地出生□2=在西藏出生□(二)生活方式一、吸烟48 1．吸烟（吸烟的标准：每天一支以上，连续半年以上）1=是，一直吸□2=曾经吸，现已戒□3=否，从不吸□2．开始有规律吸烟的年龄岁，共吸了年3.您每天吸烟量支4.曾戒烟（戒烟的标准：不吸烟三个月以上）1=是□戒烟年限年2=否□二、饮酒1.您是否饮酒？1=是□2=否□2.开始饮酒的年龄岁。3.饮酒次数：1=只在特殊的场合下（如节假日或做客时）□2=偶尔喝□3=只在忙碌或夏季几个月里喝酒□4=每周1-2次□5=每周3-4次□6=每周5-6次□7=每天□4.最常饮的酒的种类及量（一般白酒为500ml每瓶，啤酒350ml每听）1=白酒□饮酒量两/次饮酒次数次/周2=啤酒□饮酒量瓶/次饮酒次数次/周3=黄酒、红酒□饮酒量ml/次饮酒次数次/周4=青稞酒□饮酒量ml/次饮酒次数次/周三、过去疾病史1、您有无住院史：1=有□，因何种疾病住院2=无□四、疾病家族史（如选择有，请在相应的称谓后打勾√）：⑴心脏病无□有□爷爷奶奶外公外婆父母兄弟姐妹⑵高血压无□有□爷爷奶奶外公外婆父母兄弟姐妹⑶糖尿病无□有□爷爷奶奶外公外婆父母兄弟姐妹⑷肿瘤无□有□爷爷奶奶外公外婆父母兄弟姐妹(三)在高原生活情况1．您是否出生在西藏？1=是□2=否□2．您在西藏生活或工作有多少年？3．您每年是否有回内地居住或出差的机会？1=有□2=没有□4．一年内您去内地的次数是多少？1=10次以上□2=6-9次□3=3-5次□4=1-2次□5=从不□5.一年内您去内地居住的总时长？1=少于1个月□2=13个月□3=3-6个月□4=半年以上□49 6.您是否觉得在高原对身体有不同程度的影响？1=是□2=否□7．您每周参加体育锻炼的频率为？1=1—2次□2=3—4次□3=每天参加□4=偶尔参加□8．您一天大概运动的时间?1=30分钟以下□2=30分钟—1个小时□3=1个小时—2个小时□4=2个小时以上□9．您选择的运动方式：1=跑步□2=快走□3=散步□4=球类□5=跳绳□6=呼啦圈□7=攀岩□8=跳舞9=其他10．您生活规律，保证充足睡眠(7—8小时)，劳逸结合吗？1=是□2=否□3=有时不是□4=经常熬夜□11．您是否有每天喝酥油茶的习惯？1=是□2=否□或一周内喝1=1到2次2=3到4次12．您是否有每天喝甜茶的习惯？1=是□2=否□或一周内喝1=1到2次2=3到4次13．您每天喜欢吃的食物？1=肉食□2=素食□3=半荤半素□4=水果类□5=粥类□6=粗粮（糌粑、谷类等）其他：14．您喜欢的吃的口味是：1=甜食2=酸类食物3=辛辣4=清淡5=低盐6=其他（四）高原适应情况问卷一1．您会感觉呼吸困难吗？1=从不□2=很少□3=偶尔□4=□经常2．您会感觉胸闷、心跳加快、胸口疼吗？1=从不□2=很少□3=偶尔□4=经常□3．您是否经常有恶心、呕吐等胃肠道症状？1=没有□2=有□（或您从内地回来一周内会有恶心、呕吐等胃肠道症状？1=没有□2=有□）4.您是否经常有以下情况：1=食欲不振或恶心□2=中度恶心或呕吐□3=剧烈50 恶心或呕吐，不能忍受□（或您从内地回来一周内会有1=食欲不振或恶心□2=中度恶心或呕吐□3=剧烈恶心或呕吐，不能忍受□）5.您经常有眩晕或头晕的现象吗？1=没有□2=很少□3=偶尔□4=经常□（或您从内地回来一周内会有1=无眩晕□2=轻度眩晕□3=中度眩晕□4=剧烈眩晕,不能忍受□）6.您经常有头痛的现象吗？1=没有□2=很少□3=偶尔□4=经常□（或您从内地回来一周内会有1=无头痛□2=轻微头痛□3=中度头痛□4=剧烈头痛,不能忍受□）7.您有没有不明原因的感冒？1=没有□2=很少□3=偶尔□4=经常□8.您是否有喉咙不适现象？1=没有□2=很少□3=偶尔□4=经常□9.您有没有鼻出血现象？1=没有□2=很少□3=偶尔□4=经常□10.您有没有失眠？1=从不□2=很少□3=偶尔□4=经常□11.您从内地回来一周内有没有入睡困难的现象？1=睡眠如常□2=睡眠比平时差□3=睡眠不佳,多次醒来□4=睡不着□12.您有没有烦躁不安的情况？1=从不□2=很少□3=偶尔□4=经常□13.您是否有明显的记忆力减退，经常忘事现象？1=没有□2=很少□3=偶尔□4=经常□14.您感觉注意力明显减退，注意力难于集中？1=没有□2=很少□3=偶尔□4=经常□15.您的月经周期是否正常规律(女性问答)？1=非常有规律□2=比较有规律□3=有时不规律□4=非常不规律□16.您的月经量是否正常(女性问答)？1=很多□2=很少□3=时多时少□4=正常□17.您的皮肤有没有紫外线过敏现象？1=没有□2=很少□3=偶尔□4=经常□18.到了一年的某些特定时间，有没有发生过敏的情况？1=每年□2=经常□3=偶尔□4=很少□5=没有□19.您的皮肤有没有长斑现象？1=有□2=没有□3=不知道□51 20.每年到了冬季您的脸颊、手足、脚足有没有冻疮现象？1=有□2=没有□21.您有没有检查过眼睛白内障？1=有□（检查结果1=有□2=没有□）2=没有□22.您是否有眼睛翼状胬肉（即内眼角余肉向眼球周边扩散）？1=有□2=没有□3=不清楚□23.您目前的血压情况？1=正常□2=高血压□3=低血压□4=起伏比较大（偶尔很高偶尔很低）□5=从不关注□24.您有没有嘴唇发紫或脸上有红血丝？1=有□2=没有□25.您的眼睛有没有结膜充血（眼睛出现血丝）现象？1=经常□2=偶尔□3=很少□4=从不□5=不知道□26.您有无感觉听觉下降？1=有□2=没有□3=不知道□27.您是否会出现耳鸣和重听？1=经常□2=偶尔□3=很少□4=从不□5=不知道□28.您有没有由于海拔的变化（如从低海拔到高海拔或乘坐飞机等）而出现耳鸣或耳塞的情况？1=从不□2=很少□3=偶尔□4=经常□29.您有没有味觉下降，对咸味、酸味和苦味的敏感度下降？1=有□2=没有□3=不知道□30.您有无感觉食欲下降的现象？1=没有□2=很少□3=偶尔□4=经常□31.您经常有腹泻现象吗？1=没有□2=很少□3=偶尔□4经常=□32.您是否有胃炎、胃溃疡？1=没有□2=有□3=不知道□33.您有没有早晨起来脸部和四肢凹陷性水肿现象？1=经常□2=偶尔□3=很少□4=没有□5=不知道(如有水肿,请选择1=水肿局限在一个部位□2=水肿发生在两个或多个部位□)34.您是否有均匀性的头发脱落或指甲凹陷现象？1=没有□2=很少/很轻□3=一般□4=很严重□35.您是否有疲劳或虚弱的现象?1=无疲劳或虚弱□2=轻度疲劳或虚弱□3=中度疲劳或虚弱□4=重度疲劳或虚弱,不能忍受□52 问卷二填表提示：以下的问题仅与您过去一个月的睡眠习惯有关。你应该对过去一个月中多数白天和晚上的睡眠情况作精确的回答，要回答所有的问题。1.过去一个月你通常上床睡觉的时间是？上床睡觉的时间是______________2.过去一个月你每晚通常要多长时间（分钟）才能入睡？多少分钟____________3.过去一个月每天早上通常什么时候起床？起床时间____________4.过去一个月你每晚实际睡眠的时间有多少？每晚实际睡眠的时间____________◆从以下每一个问题中选一个最符合你的情况作答，打“√”5.过去一个月你是否因为以下问题而经常睡眠不好：（a）不能在30分钟内入睡：过去一个月没有（）每周平均不足一个晚上（）每周平均一或两个晚上（）每周平均三个或更多晚上（）（b）在晚上睡眠中醒来或早醒：过去一个月没有（）每周平均不足一个晚上（）每周平均一或两个晚上（）每周平均三个或更多晚上（）（c）晚上有无起床上洗手间：过去一个月没有（）每周平均不足一个晚上（）每周平均一或两个晚上（）每周平均三个或更多晚上（）（d）不舒服的呼吸：过去一个月没有（）每周平均不足一个晚上（）每周平均一或两个晚上（）每周平均三个或更多晚上（）（e）大声咳嗽或打鼾声：过去一个月没有（）每周平均不足一个晚上（）每周平均一或两个晚上（）每周平均三个或更多晚上（）（f）感到寒冷：过去一个月没有（）每周平均不足一个晚上（）每周平均一或两个晚上（）每周平均三个或更多晚上（）（g）感到太热：53 过去一个月没有（）每周平均不足一个晚上（）每周平均一或两个晚上（）每周平均三个或更多晚上（）（h）做不好的梦：过去一个月没有（）每周平均不足一个晚上（）每周平均一或两个晚上（）每周平均三个或更多晚上（）（i）出现疼痛：过去一个月没有（）每周平均不足一个晚上（）每周平均一或两个晚上（）每周平均三个或更多晚上（）（j）其他原因，请描述：_______________________________________过去一个月没有（）每周平均不足一个晚上（）每周平均一或两个晚上（）每周平均三个或更多晚上（）6.你对过去一个月总睡眠质量评分：非常好（）尚好（）不好（）非常差()7.过去一个月，你是否经常要服药（包括从以医生处方或者在外面药店购买）才能入睡？过去一个月没有（）每周平均不足一个晚上（）每周平均一或两个晚上（）每周平均三个或更多晚上（）8.过去一个月你在开车、吃饭或参加社会活动时难以保持清醒状态？过去一个月没有（）每周平均不足一个晚上（）每周平均一或两个晚上（）每周平均三个或更多晚上（）9.过去一个月，你在积极完成时事情上是否有困难？没有困难（）有一点困难（）比较困难（）非常困难（）10.你是与人同睡一床（睡觉同伴，包括配偶）或有室友？没有与人同睡一床或有室友（）同伴或室友在另外房间（）同伴在同一房间但不睡同床（）同伴在同一床上（）◆如果你是与人同睡一床或有室友，请询问他（她）你过去一个月是否出现以下情况:(A)你在睡觉时，有无打鼾声：过去一个月没有（）每周平均不足一个晚上（）每周平均一或两个晚上（）每周平均三个或更多晚上（）54 (B)在你睡觉时，呼吸之间有没有长时间停顿：过去一个月没有（）每周平均不足一个晚上（）每周平均一或两个晚上（）每周平均三个或更多晚上（）(C)在你睡觉时，你的腿是否有抽动或者有痉挛：过去一个月没有（）每周平均不足一个晚上（）每周平均一或两个晚上（）每周平均三个或更多晚上（）(D)在你睡觉时是否出现不能辨认方向或混乱状态：过去一个月没有（）每周平均不足一个晚上（）每周平均一或两个晚上（）每周平均三个或更多晚上（）(E)在你睡觉时是否有其他睡不安宁的情况，请描述_________________过去一个月没有（）每周平均不足一个晚上（）每周平均一或两个晚上（）每周平均三个或更多晚上（）问卷三填表提示：以下每个题目都有一定的主题，但是每张大的主题图中都缺少一部分，主题图以下有6—8张小图片，若填补在题图的缺失部分，可以使整个图案合理与完整，请从每题下面所给出的小图片中找出适合大图案的一张，把它的号码填写在卷卡上与图案号码相对应的一格内。A1A255 A3A4A5A6A7A856 A9A10A11A12B1B257 B3B4B5B6B7B858 B9B10B11B1259 C1C2C3C4C5C660 C7C8C9C1061 C11C12D1D262 D3D4D5D6D7D863 D9D10D11D12E1E264 E3E4E5E665 E7E8E9E10E11E1266 您还有其他对高原不适应情况？或者对此问题有什么好的建议，请您写下来告诉我们：问卷结束，非常感谢您的配合，也感谢您对生活在高原上的人群和高原医学所做出的贡献！如对本次问卷有任何疑问请联系西藏大学医学院：巴桑卓玛电话：1388901900067 在攻读硕士学位期间发表的论文目录1.次仁潘多,拉巴桑珠,达娃普赤,次松,巴桑卓玛.西藏在校女大学生生育健康知识知晓情况调查研究[J].西藏医药2016,37（2）：56-59.2.次仁潘多,巴桑卓玛.世居藏族与移居人群睡眠状况及记忆功能影响情况调查[J].西藏医药2016,37（11）：55-59.3.次仁潘多,巴桑卓玛.KIF1B基因多态位点与藏族藏族登山运动员高原低氧适应表型的相关性研究[J].中国高原医学与生物学杂志,2017,（6）4.次仁潘多,曲吉,普布多吉,达娃普赤，巴桑卓玛.世居藏族与移居者高原适应不全现况研究[J].西藏大学学报，2017,55.曲吉，次仁潘多，杜宝中，等.Sp110基因rs1135791多态性位点与藏族肺结核病易感性研究[J]，西藏科技，2017,3（288）：43-4668 致谢三年的硕士研究生学习生活即将结束,在这期间我得到了很多老师、同学和亲朋好友的帮助。我希望借此机会向一直以来关心和帮助过我的人致以最诚挚的谢意！首先,衷心感谢我的导师巴桑卓玛教授在学习中对我的悉心指导、精心培养,在生活中对我无微不至的关怀。巴桑卓玛老师精湛的科学思维,独特的科学见解,严谨的学术态度,广博的学识累积、高尚的人格魅力让我深深折服,巴桑卓玛老师是我人生路上的楷模。在三年的学习生活中,巴桑卓玛老师不仅教了我如何做科学研究,更教了我如何做人,这让我受益终身。师恩永难忘,藉此,谨向恩师巴桑卓玛老师敬上我最诚挚的谢意。其次，感谢本课题的合作者中国科学院北京基因组研究所曾长青研究员,在她的全力协助、鼎力支持下本课题得以顺利展开进行,她的科学思维、专业意见为课题的顺利完成给予了极大帮助。同时感谢课题组其他成员。感谢中国科学院北京基因组研究所实验室的全体成员对我做课题期间科研和生活上的帮助,很幸运能在曾老师课题组这个大家庭中学习。感谢刘天资师姐,邵建明师兄,从我做课题实验以来在课题上对我不厌其烦的指导以及积极帮助和专业建议。感谢同级曲吉同学,在生活和课题上给予的诸多帮助。感谢普布多吉,江玲同学的帮助和支持。感谢预防医学系达娃普赤老师、德吉老师、杜宝忠老师、央拉老师及次松老师等在专业知识及课题研究中给予的帮助与指导。感谢2014级的同窗好友,感谢你们的鼓励与支持。感谢研究生管理员聂丽娟、范东艳和赵朝阳老师对我们的学习和生活上的关心和帮助。感谢医学院所有老师对我的帮助与支持工作人员对我的帮助。最后,感谢我的家人对我无微不至的关怀和鼓励,他们的理解、支持和鼓舞是我的精神力量,是我前行的动力。69