先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别

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分类号：Ｓ８５２授予学位单位代码：１０４３４学号：２０１５１１０４８４山东农业大学硕士学位论文先天感染ＡＬＶ－Ｊ对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别Ｐ＇ｒｏｔｅｃｔｉｖｅＥｆｆｉｃａｃｏｆＶａｃｃｉｎａｌＩｍｍｕｎｉｔｙｔｏＭａｒｅｋｓＤｉｓｅａｓｅｂｙｙＣｏｎｅｎｉｔａｌＩｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈＳｕｂｒｏｕＪＡｖｉａｎＬｅｕｋｏｓｉｓＶｉｒｕｓａｎｄｇｇｐＭ’ｏｌｅｃｕｌａｒＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＤｉｆｆｅｒｅｎｔＭａｒｅｋｓＤｉｓｅａｓｅＶａｃｃｉｎｅＳｔｒａｉｎｓ研究生：韩妮学科专业：预防兽医学研究方向：分子病毒学学院：动物科技学院指导教师：崔治中教授一２０１８年６月２日 关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研宄所取得的成果。对在论文研宄期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研宄所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：导师签名：曰期％＾〇Ｌ〇：ｙ〇ｉＪ 论文提交日期：2018.04.15论文答辩日期：2018.06.02学位授予日期：2018.06学科门类：农学答辩委员会主席：沈志强 本研究由国家自然科学基金河南省联合基金项目（U1604232）、国家重点研发计划项目（2017YFD0500704）和国家自然科学基金项目（31402235）资助ThestudywassupportedbygrantsoftheKeyProgramofNSFC-HenanJointFound(U1604232),theNationalKeyResearchandDevelopmentProgramofChina(2017YFD0500704)，andtheNationalNaturalScienceFoundationofChina(31402235)本研究由国家自然科学基金河南省联合基金项目（U1604232）、国家重点研发计划项目（2017YFD0500704）和国家自然科学基金项目（31402235）资助ThestudywassupportedbygrantsoftheKeyProgramofNSFC-HenanJointFound(U1604232),theNationalKeyResearchandDevelopmentProgramofChina(2017YFD0500704)，andtheNationalNaturalScienceFoundationofChina(31402235) 符号说明英文简称英文全称中文全称ALVavianleukosisvirus禽白血病病毒ALV-JavianleukosisvirussubgroupJJ亚群禽白血病病毒BACbacterialartificialchromosome细菌人工染色体bpbasepair碱基对CEFchickenembryofibroblasts鸡胚成纤维细胞DMEMdulbeco'smodifiedeaglemedia极限必需培养基ELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验HIhemagglutinationinhibtion血凝抑制试验HVTherpesvirusofturkeys火鸡疱疹病毒IFAindirectimmunofluorescenceassay间接免疫荧光试验IRLinternalrepeatlong长内部重复区IRSinternalrepeatshort短内部重复区LTRlongterminalrepeat长末端重复序列MDmarek’sdisease马立克病MDVmarek’sdiseasevirus马立克病病毒minminute分钟mTMRmultipletelomericrepeats多重端粒重复序列ORFopenreadingframe开放阅读框PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应PFUplagueformationunite蚀斑形成单位PIprotectionindex保护指数REVreticuloendosiliosisvirus网状内皮细胞增生病病毒SPFspecificpathogenfree无特定病原微生物sTMRshorttelomericrepeats短端粒重复序列TCID5050%tissuecultureinfectivedose半数组织感染剂量TRLterminalrepeatlong长末端重复区TRSterminalrepeatshort短末端重复区ULuniquelongregionofMDVgenome长独特序列USuniqueshortregionofMDVgenome短独特序列µLmicroliter微升 目录中文摘要.....................................................................................................................................IAbstract....................................................................................................................................III1前言......................................................................................................................................11.1鸡马立克病（MD）的研究进展.......................................................................................11.1.1MDV分类及病原学特点.................................................................................................11.1.2MDV的基因组结构.........................................................................................................21.1.3MDV特有基因.................................................................................................................31.1.4MDV的发病机理.............................................................................................................51.1.4.1早期溶细胞感染............................................................................................................51.1.4.2潜伏感染........................................................................................................................51.1.4.3第二次溶细胞感染........................................................................................................51.1.4.4肿瘤细胞增生期............................................................................................................61.1.5MDV的免疫抑制.............................................................................................................61.1.6流行病学...........................................................................................................................71.1.7临床症状及病理变化.......................................................................................................71.1.8诊断技术...........................................................................................................................81.1.8.1常规诊断........................................................................................................................81.1.8.2病毒分离与鉴定............................................................................................................81.1.8.3聚合酶链反应技术（PCR）........................................................................................81.1.8.4实时荧光定量PCR技术..............................................................................................91.1.9MD疫苗的研究进展........................................................................................................91.1.9.1疫苗的免疫机理............................................................................................................91.1.9.2疫苗的种类....................................................................................................................91.2禽白血病（AL）的研究进展..........................................................................................101.2.1病原学特点.....................................................................................................................111.2.2流行病学特征.................................................................................................................111.2.3免疫抑制机制与致病性.................................................................................................111.3MDV与ALV混合感染....................................................................................................12 1.4本研究的目的和意义........................................................................................................131.4.1先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响............................................131.4.2不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立.....................................................................132材料和方法..........................................................................................................................142.1试验材料............................................................................................................................142.1.1病毒.................................................................................................................................142.1.2疫苗与质粒.....................................................................................................................142.1.3主要试剂与仪器.............................................................................................................142.1.4其他试剂的配制.............................................................................................................152.1.5试验动物与SPF饲养设施............................................................................................152.2方法....................................................................................................................................152.2.1鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备.......................................................................................152.2.2MDV的增殖与定量.......................................................................................................162.2.3ALV的增殖与定量.........................................................................................................162.2.4先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响............................................172.2.4.1试验设计......................................................................................................................172.2.4.2鸡的死亡率及肿瘤发生率..........................................................................................182.2.4.3体重和免疫器官指数的测定......................................................................................182.2.4.4AIV-H9和NDV灭活疫苗的免疫和抗体水平的测定..............................................182.2.4.5外周血淋巴细胞DNA的提取...................................................................................192.2.4.6GX0101的增殖动态....................................................................................................202.2.4.7病理学检测..................................................................................................................212.2.4.8统计学分析..................................................................................................................212.2.5不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立.....................................................................212.2.5.1PCR引物的设计与合成..............................................................................................212.2.5.2疫苗DNA的提取.......................................................................................................212.2.5.3PCR扩增体系及条件优化..........................................................................................212.2.5.4地高辛标记DNA探针的制备...................................................................................242.2.5.5核酸斑点杂交检测......................................................................................................243试验结果..............................................................................................................................26 3.1先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响...............................................263.1.1MDV毒株GX0101以及ALV-J毒株NX0101含量测定结果..................................263.1.2SPF鸡的死亡率及肿瘤发生率......................................................................................263.1.3SPF鸡各组体重..............................................................................................................283.1.4SPF鸡AIV-H9疫苗免疫后抗体水平测定..................................................................293.1.5SPF鸡NDV疫苗免疫后抗体水平测定.......................................................................303.1.6SPF鸡中枢免疫器官指数..............................................................................................313.1.7SPF鸡GX0101病毒增殖动态......................................................................................323.2不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立........................................................................323.2.1PCR方法对MDVmeq基因缺失疫苗SC9-1与商品化疫苗的鉴别结果..................323.2.2核酸斑点杂交方法对MDVmeq基因缺失疫苗SC9-1与商品化疫苗的鉴别结果.333.2.2.1探针标记结果..............................................................................................................333.2.2.2核酸斑点杂交结果......................................................................................................344讨论......................................................................................................................................364.1先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响...............................................364.2不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立........................................................................375结论......................................................................................................................................396参考文献..............................................................................................................................407致谢......................................................................................................................................498攻读学位期间发表论文情况..............................................................................................50 山东农业大学硕士学位论文中文摘要鸡马立克病(Marek’sdisease,MD)是由鸡马立克病病毒(Marek’sdiseasevirus,MDV)引起的一种鸡上最常见的T淋巴细胞增生性疾病。疫苗免疫是防控MD的主要措施。目前，我国使用最广泛的是CVI988/Rispens疫苗。然而近年来，有的鸡群免疫CVI988/Rispens疫苗后仍有马立克病的发生，影响了我国养禽业的健康发展，造成经济损失。禽白血病病毒(Avianleukosisvirus,ALV)是一种可以引起多种肿瘤性疾病的免疫抑制性病原，它主要通过垂直感染的方式进行传播。流行病学调查显示，MDV感染鸡群常伴发ALV等免疫抑制性病原的共感染，ALV的先天感染有可能是造成免疫CVI988/Rispens疫苗鸡群仍发生MD的原因之一。为证实这一推论，本文通过动物试验人工模拟先天感染J亚群禽白血病病毒(ALV-J)探究对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响。此外，针对本实验室研发的新型MD疫苗SC9-1株与市场其他疫苗株尚无特异性鉴别方法的问题，建立了区别SC9-1株与其他株MD疫苗的分子鉴别方法。1.先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响为研究先天感染ALV-J对CVI988/Rispens疫苗免疫保护效果的影响，将200枚SPF鸡胚分为5组，每组40枚。第1、2组为先天感染ALV-J组，在6胚龄时通过卵黄囊途径接种500TCID50ALV-JNX0101株。出壳后，第1、2、3、5组鸡颈部皮下免疫CVI988/Rispens疫苗，6日龄对第2、3、4组鸡均以2000PFU/只的剂量腹腔注射MDV超强毒GX0101。试验期间，观察并记录各组鸡的病变及死亡情况，统计死亡率和肿瘤发生率，对疑似马立克病特有的病变脏器做病理切片；MDVGX0101攻毒后第1、2、3、4、5、6周称量各组鸡的体重；所有鸡10日龄免疫禽流感、新城疫灭活苗，免疫后第3、4、5周检测相应抗体水平；在GX0101攻毒后第1周每组随机选取5只鸡进行剖检，选取胸腺和法氏囊测定免疫器官指数；第2、3、4组在GX0101攻毒后5、10、14、21、28天，每组各随机选取6只鸡采集抗凝血分离淋巴细胞提取DNA，利用荧光定量PCR方法检测GX0101的拷贝数。研究结果表明，先天感染ALV-J增加了CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒鸡的死亡率和肿瘤率，2组死亡鸡中一只鸡肝脏出现肿瘤，1、2、3、4、5各组鸡的死亡率分别为：5.7%、20%、2.9%、37.1%、0%；先天感染ALV-J、CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组鸡的体重与CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组鸡相比，体重显著降低(P<0.05)，引起胸腺和法氏囊的萎缩，显著抑制AIV-H9、NDV抗体的产生，GX0101的拷贝数在第14、21、28天显著高于CVI988/Rispens免疫GX0101I 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别攻毒组。因此，先天感染ALV-J降低了CVI988/Rispens疫苗的免疫保护效果，引起感染鸡的免疫抑制，增强了GX0101在鸡体内的复制水平以及致病性，这或许表明先天感染ALV是造成免疫CVI988/Rispens疫苗后鸡群仍发生MD的原因之一。2.不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立为了对马立克病病毒meq基因缺失疫苗株SC9-1与商品化MD疫苗CVI988/Rispens株、814株和HVTFc-126株进行分子鉴别，根据疫苗株SC9-1与其它MD疫苗株的基因组差异，分别针对I型MDVmeq基因以及SC9-1基因组中的禽网状内皮组织增殖症病毒-长末端重复序列(REV-LTR)插入片段，设计三对PCR扩增引物，同时合成针对meq基因和REV-LTR片段的地高辛标记探针，通过PCR扩增和核酸斑点杂交方法区分SC9-1株与其他疫苗株。结果表明，使用针对meq基因的引物F1/R1进行PCR扩增，SC9-1株、CVI988/Rispens株、814株分别扩增出184bp、1297bp、1297bp目的片段，HVTFc-126株没有条带；使用针对meq基因的引物F2/R2进行PCR扩增，CVI988/Rispens株、814株均扩增出746bp目的片段，SC9-1株、HVTFc-126株均没有条带；使用针对REV-LTR片段设计的引物F3/R3进行PCR扩增，SC9-1株扩增出512bp目的片段，CVI988/Rispens株、814株、HVTFc-126株均没有条带。同时，使用针对meq基因的探针进行核酸斑点杂交，CVI988/Rispens株、814株均显示阳性结果，SC9-1株、HVTFc-126株均为阴性；使用针对REV-LTR的探针进行核酸斑点杂交，SC9-1株显示阳性结果，CVI988/Rispens株、814株、HVTFc-126株均为阴性。因此，利用本研究设计的特异性PCR引物以及探针，通过PCR扩增和核酸斑点杂交方法可以有效区分SC9-1与市场其他MD疫苗株。关键词：马立克病疫苗；禽白血病病毒；感染；免疫保护；分子鉴别II 山东农业大学硕士学位论文ProtectiveEfficacyofVaccinalImmunitytoMarek'sDiseasebyCongenitalInfectionwithSubgroupJAvianLeukosisVirusandMolecularIdentificationofDifferentMarek’sDiseaseVaccineStrainsAbstractMarek’sdisease(MD)isamalignantlymphoproliferativediseaseofchickens,whichiscausedbyMarek’sdiseasevirus(MDV).VaccinationisthemosteffectivemeasuretopreventMD。However,CVI988/Rispensisthemostwidelyvaccinehasbeenusedintherecentyears.Marek’sdiseaseoccursfrequentlyinchickensafterimmunizationwithCVI988/Rispensvaccine,whichhascausedsignificanteconomiclossesinthepoultryindustry.Avianleukosisvirus(ALV)isanimmunosuppressivepathogenofchickensthatassociatedwithavarietyofneoplasticdiseases,itismainlytransmittedthroughverticalinfection.EpidemiologicalinvestigationrevealedthatMDV-infectedflocksareoftenco-infectedwithALVandotherimmunosuppressivepathogens,ThecongenitalinfectionwithALVplaysanimportantrolefortheincidenceofMDafterCVI988/Rispensevaccination.Toconfirmthisdeduction,weinvestigatedcongenitalinfectionofJsubgroupALVontheprotectioneffectofCVI988/Rispensvaccinethroughaseriesofanimalexperiments.Inaddition,accordingtolackingspecificidentificationmethodsforthemeq-deletedmarek’sdiseasevaccinestrainSC9-1whichwasdevelopedinourlaboratoryandMDVwildstrainsandothervaccinestrains,themolecularidentificationassayswereestablishedtodistinguishtheSC9-1strainfromothervaccinestrainsofMD.1.Protectiveefficacyofvaccinalimmunitytomarek'sdiseasebycongenitalinfectionwithsubgroupJavianleukosisvirusTostudythecongenitalinfectionofJsubgroupALVontheprotectiveefficacyofCVI988/Rispensvaccine,200SPFeggsweredividedinto5groupswith40eggspergroup.Group1and2werecongenitalinfectionsofALV.Attheageof6embryos,JsubgroupALVNX0101strainwasinoculatedwithdosageof500TCID50viatheyolksacroute.Afterhatching,thechickensfromgroups1,2,3and5weresubcutaneouslyvaccinatedwithCVI988/Rispens.Thechickensfromgroups2,3,and4wereinfectedwithvirulentMDVGX0101atadoseof2000PFUat6daysofagebyintra-abdominalinjection.Allchickensofeachgroupwereobserveddailythroughouttheentireexperimentalperiod.Necropsywasperformedonallchickensthatdiedorwereeuthanatized.SuspiciouslesionswerecollectedIII 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别forhistopathologicconfirmation.Thebodyweightofeachgroupwasweighedonthe1st,2nd,3rd,4th,5th,and6thweeksaftertheMDVGX0101infection.AfterimmunizationagainstAvianInfluenzavirus(AIV–H9)andNewcastlediseasevirus(NDV)inactivatedvaccines,allgroupsweredetectedantibodytitersatweeks3,4and5.After7dpi,5chickenswererandomlyselectedfromeachgrouptoevaluatetheimmuneorganindicesofthymusandbursa.At5,10,14,21,and28daysofpostinfection(dpi)withGX0101,6chickensingroups2,3and4wererandomlyselectedtocollectanticoagulantbloodlymphocytesforDNAextraction,theindexofcopynumberofGX0101weredetectedusingfluorescencequantitativePCR.TheresultsshowedthatcongenitalinfectionwithALV-JincreasedthemortalityrateofCVI988/Rispens-immuneGX0101-challengedchickens,themortalityratesofchickensingroups1,2,3,4,and5were5.7%,20%,2.9%,37.1%and0%,respectively.CongenitalinfectionwithALV-JandCVI988/Rispens-immuneGX0101-challengedgroupsignificantlyreducedthebodyweight,andcausedatrophyofthethymusandbursaofFabricius,andalsosignificantlyreducedantibodylevelsininactivatedvaccinesofAIV-H9andNDV,increasedthereplicationofGX0101，comparingwithCVI988/Rispens-immuneGX0101-challengedgroup.Therefore,congenitalinfectionwithALV-JreducedtheprotectiveefficacyoftheMDvaccineandincreasedthereplicationofGX0101andpathogenicity,theresultsmayindictedthatcongenitalinfectionwithALVisoneofthereasonsfortheincreasingincidenceofMDinvaccinatedchickens.2.Molecularidentificationofdifferentmarek’sdiseasevaccinestrainsInordertorapidlydistinguishmeq-deletedMarek’sdiseasevaccinestrainSC9-1andothercommercialvaccinestrains(CVI988/Rispens,814,HVTFc-126),accordingtotheviralgenomicsequencesofSC9-1andothercommercializedMDVvaccinestrains,themethodsofPCRandDNAblothybridizationwereestablish,threepairsofprimersnamedF1/R1,F2/R2,andF3/R3weredesignedandtheprobeslabeledwithdigoxinspecificfortheserotype-IMDVmeqgeneandSC9-1uniqueREV-LTRfragmentweresynthesized.Theresultsshowedthat184-,1297-and1297-bpproductswereamplifiedusingSC9-1,CVI988/Rispens,and814viralDNAastemplatesemployingprimerF1/R1,butnospecificbandwasobtainedusingHVTFc-126viralDNA.Also,a746-bpproductcouldbeamplifiedwhenusingCVI988/Rispensand814viralDNAastemplatesemployingprimerF2/R2,butnospecificbandswereobtainedusingSC9-1andHVTFc-126viralDNA.Inaddition,a512-bpproductcouldbeamplifiedwhenusingSC9-1viralDNAasatemplateemployingprimerF3/R3,butnospecificbandswereobtainedusingtheCVI988/Rispensstrain,814andHVTFc-126viralIV 山东农业大学硕士学位论文DNA.Adot-blothybridizationassaywasalsoestablished.TheCVI988/Rispensand814viralDNAshowedapositivebyusingaprobespecificforthemeqgene,atthesametime,SC9-1andHVTFc-126viralDNAshowedanegative.WhenusingaprobespecificfortheREV-LTRfragment,SC9-1viralDNAdemonstratedapositiveresultwhereasCVI988/Rispens,814andHVTFc-126viralDNAshowedanegative.Inconclusion,weestablishedmethodsofPCRamplificationandnucleicdot-blothybridizationthatcouldbeusedforrapiddistinctionofSC9-1andothercommercialvaccines.KeyWords:Marek’sDiseaseVaccine;AvianLeukosisVirus;Infection;ImmuneProtection;MolecularIdentificationV 山东农业大学硕士学位论文1前言1.1鸡马立克病（MD）的研究进展鸡马立克病(Marek’sdisease,MD)是由鸡马立克病病毒(Marek’sdiseasevirus,MDV)引起的一种严重危害养禽业的复杂性免疫抑制性疾病，能够导致外周神经、肌肉和皮肤在内的各种器官和组织的单核细胞浸润和肿瘤形成(Marek,1907)，引起一条或多条末梢神经肿大，导致病鸡运动功能障碍，半瘫痪或完全瘫痪。1907年，马立克病首次由匈牙利兽医病理学家JosephMarek报道(Marek,1907)。因早期病原学发展的限制，研究者采用过多种名称来命名本病的淋巴细胞增生和肿瘤症状，如多发性神经炎、神经淋巴瘤病等，这些名称既混淆了炎症和肿瘤的区别，也混淆了本病与禽白血病等其他病原引起的淋巴细胞增生性疾病的区别。直至1961年，Biggs建议将其命名为马立克病，得到广泛认同。马立克病病毒严格的细胞结合特性使其分离鉴定遇到困难。1967年英国和美国2个实验室各自报道从接种病鸡细胞的细胞培养物中分离到了疱疹病毒，并最终用从羽囊获得的细胞游离性病毒进行感染性试验，证实了该病的病原体是病毒。病原学研究所取得的突破，推动了马立克病弱毒疫苗和火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗的问世，并迅速将免疫接种作为有效的MD防控手段。随后研究者们根据抗原特性将MDV区分为3个血清型，确定了肿瘤细胞的T细胞特性、疾病的溶细胞期和免疫抑制期，同时，明确了马立克病的发病机理，即由呼吸道感染、B细胞溶细胞感染，再到T细胞的活化潜伏感染和最终发生T细胞转化过程。马立克病在全世界所有养鸡的国家都有发生，从历史上看可以分为古典型和急性型。古典型发生于20世纪50年代以前，以多发性神经炎为特征。急性型马立克病是20世纪50年代后随着养鸡业的集约化而出现的，多发于肉鸡，蛋鸡也有发生，肿瘤发病率高，多发于卵巢、肝脏、脾脏、肾脏等。近年来对马立克病的病原特点、基因组成、发病机制、肿瘤发生机制、诊断技术、疫苗研发等各方面都有了很大的突破。1.1.1MDV分类及病原学特点MDV属于疱疹病毒科成员，具有细胞结合特性，有与γ疱疹病毒相似的嗜淋巴细胞特性，以及与α疱疹病毒相似的分子结构、基因组成(Buckmasteretal.,1988;Leeetal.,2000)。目前将MDV划分为疱疹病毒目、疱疹病毒科中甲型疱疹病毒亚科的马立克病病毒属(Mardiviris)(Davison,2002)。马立克病病毒3个血清型都是马立克病病毒属的成员：即鸡疱疹病毒2型（血清1型），鸡疱疹病毒3型（血清2型）和火鸡疱疹病毒11 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别型（血清3型）。血清1型马立克病病毒是该属的原型病毒，除非另外说明，马立克病病毒一般是指血清1型病毒。血清2型和3型病毒均不致瘤，但用作疫苗可以预防血清1型马立克病病毒的致瘤作用。按照其毒力的不同，血清1型病毒株可进一步分成以下4种致病型：温和型马立克病病毒(mMDV)（如CU-2株）、强毒型马立克病病毒(vMDV)（如GA株）、超强毒型马立克病病毒(vvMDV)（如MD5株）和特超强毒型马立克病病毒(vv+MDV)（如548A株）(Kawamuraetal.,1969;Witteretal.,1970;Witteretal.,1997)。MDV由核芯、核衣壳、被膜和囊膜组成，包括裸体病毒和完全病毒两种形式。其中，裸露的病毒子是非成熟的细胞结合性病毒，核衣壳是直径为85~100nm的六角形，可在患病鸡的血液白细胞、肿瘤病变组织细胞内观察到裸露病毒子，也能在培养细胞的细胞核中观察到，偶尔也可以在细胞浆和细胞外液中看到，对外界抵抗力很弱，与细胞共存亡。完全病毒是直径约为150~160nm的非细胞结合性的成熟型病毒，有囊膜和2-3层核衣壳，主要存在于核膜和核泡，但有时也能在细胞浆中观察到。病鸡的羽毛囊上皮细胞是该种形式病毒的主要存在之处，可从其中脱离至外界环境，因其抵抗力强，能够在外界生存，促使本病传播。在溶解羽毛囊上皮的负染标本中，病毒粒子表现为不规则的无定形结构，直径为273~400mm，有囊膜。1.1.2MDV的基因组结构MDV的核酸为线性双股DNA，分子量大小因毒株而异，约为108×106-120×106kDa，相当于166-184kb。MDV基因组以游离型或环状结构的形式独立于宿主基因组。截至目前，Md5(GenBank登录号为AF243438)、GA(GenBank登录号为AF147806)、Md11(GenBank登录号为AY510475)以及CVI988的BCA克隆(GenBank登录号为DQ530348)，这4株血清1型的MDV全基因测序已经完成；此外，血清2型HPRS24(GenBank登录号为NC-002577)和血清3型HVTFc-126株(GenBank登录号为AF282130)的全基因测序也已经公布。这些毒株的基因组在组成和线性排列上大体一致，但基因组大小有一定差别，血清1型最大，其次是血清2型，HVT最小，此外，在G+C（鸟嘌呤+胞嘧啶）含量方面也存在差异。马立克病病毒G+C含量为44.1%，禽疱疹病毒3G+C含量为53.6%，火鸡疱疹病毒G+C含量为47.2%，介于马立克病病毒和禽疱疹病毒3之间。MDV基因组DNA上分别有长、短各一的独特序列，即长独特区(uniquelongregion，UL)和短独特区(uniqueshortregion，US)。长独特区含有57个开放阅读框(openreading2 山东农业大学硕士学位论文frame，ORF)，序列侧翼为长末端重复序列(terminalrepeatlongregion，TRL)和长内部重复序列(internalrepeatlongregion，IRL)；短独特区含有7个ORFS，序列侧翼为短内部重复序列(internalrepeatshortregion，IRS)和短末端重复序列(terminalrepeatshortregion，TRS)(图1)。IRL和TRL序列相同但以反向形式排列，IRS和TRS序列也具有同样规律，病毒的六个结构单元共可编码100多个基因。马立克病病毒、禽疱疹病毒3、火鸡疱疹病毒主要差异在IRL和TRL区。图1MDV基因组示意图（McPhersonetal.,2016）Fig.1SchematicofMarek’sdiseasevirus1.1.3MDV特有基因（1）meq基因meq基因为MDV主要的致肿瘤基因(Reddyetal.,2002;Karstenetal.,2005)。1992年，meq基因首次被鉴定其位于基因组IRL区的BamHII2(Bam12)片段中(Jonesetal.,1992)。Meq(RLORF7)蛋白的N末端含有一个与jun/fos致癌基因家族相似的碱性亮氨酸拉链(bZIP)结构域。C末端有与WT-1肿瘤抑制基因相似的富含脯氨酸的重复区域(Jonesetal.,1992)。由339个氨基酸残基构成的meq蛋白能够在MDV引起的淋巴瘤细胞和肿瘤细胞系细胞核中恒有表达，在S期细胞浆中也有表达(Qianetal.,1995;Liuetal.,1999)。研究者将MDVMd5株的meq进行缺失突变，突变病毒不能诱发肿瘤，这是meq与致肿瘤相关的直接证据，但是这也可能是由于病毒复制的显著减少造成的(Lupianietal.,2014)。Meq和转录共抑制因子CtBP蛋白引起的特异相互作用丧失的突变可导致病毒致瘤性完全丧失，对马立克病的致肿瘤特性起到重要作用。（2）vIL-8vIL-8基因(R-LORF2)位于长重复区域，是由三个外显子组成的早期表达基因，在溶细胞性感染晚期表达。据推测vIL-8可能对从B细胞感染到T细胞感染的转变起重要作用(Cuietal.,2004;Jarosinskietal.,2007)。3 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别（3）pp38/pp24马立克病病毒UL区域相反方向两端的两个基因编码pp38/pp24，其又被称为马立克病病毒磷酸化蛋白复合物(Zhuetal.,1994)。其中，pp24基因(R-LOREI4)部分位于TRL和UL区域，pp38基因(R-LORFl4a)位于IRL和UL区域。火鸡疱疹病毒的TRL和IRL包含与pp38同源的基因，但它与血清1型毒株中pp38功能是否有关系还不清楚。血清2型毒株中存在pp24和pp38的同源物。火鸡疱疹病毒和血清2型病毒SB-1能诱导对pp38的细胞介导免疫应答(Schatetal.,2013)。（4）潜伏感染相关转录子(LAT)LAT是一组转录子，目前已有报道一个10kb的大转录子和几个剪接的转录子，如MSR(MDV小RNA)或SAR(小反义RNA)(Burnsideetal.,2007)。目前关于LAT对潜伏感染或转化的意义还不清楚。LAT均能在溶细胞性的感染细胞和转化细胞中表达。一个小LAT，称之为SAR，在原发性淋巴瘤的CD4、AV37细胞恒有表达(Stiketal.,2014)。LAT也存在于马立克病病毒阳性的QT35细胞系中。MSR的5’端插入LacZ基因产生了超强毒株RB1B的缺失突变株。用这个突变的病毒接种鸡能诱发强烈的溶细胞作用，但是不能诱发瘤，说明SAR与诱发肿瘤有关(Morganetal.,2008)。（5）病毒端粒酶RNA(vTR)编码病毒端粒酶亚基的RNA的独特区域位于马立克病病毒基因组的IRL/TRL区。马立克病病毒vTR近88%的序列与鸡的端粒酶RNA(ChTR)相同，这表明它由宿主基因组转导而来(Fragnetetal.,2003)。相比与ChTR的相互作用，vTR通过与鸡端粒酶反转录酶(CHTERT)相互作用更能有效地产生端粒酶活性(Fragnetetal.,2003，2005)。最近的研究表明，马立克病病毒基因组的末端存在两组端粒重复序列：一组是多重端粒重复序列(multipletelomericrepeats，mTMR)，重复数是可变的，高的达到100个重复；另一组是短端粒重复序列(shorttelomericrepeats，sTMR)，重复数是固定的，为6。mTMR在马立克病病毒的整合和肿瘤形成中起重要作用，而sTMR则在马立克病病毒基因组复制、致病机制和诱导肿瘤形成起中心作用(Kheimaretal.,2017)。（6）马立克病病毒编码的微RNA微RNA(miRNAs)是一类独特的小调节分子，大约22nt，在各种细胞类型中都能影响基因表达。它们存在于很多有机体中，包括几种疱疹病毒。最近发现，在马立克病病毒感染的鸡胚成纤维细胞中发现了几种新的马立克病病毒微RNA，它们由位于基因组meq基因和LAT区侧翼序列编码(Hicksetal.,2013)。这些新发现的mRNA在马立克病4 山东农业大学硕士学位论文病毒生物学上的准确功能还不清楚。但是因为这些分子在马立克病淋巴瘤和马立克病病毒感染的细胞系中高水平表达，推测他们可能在致瘤性上起作用。1.1.4MDV的发病机理1.1.4.1早期溶细胞感染这一时期主要引起变性变化，病毒由呼吸道进入机体，被吞噬细胞转运至胸腺、脾脏和法氏囊等部位，继而引发这些淋巴器官暂时性萎缩。B细胞和某些激活的T细胞是这一时期的主要靶细胞，感染3-6天后会达到峰值(Sheketal.,1983;Calneketal.,2001)。根据攻毒毒株的毒力不同，受感染的鸡可能在接种后8-14天康复，也可能造成免疫器官发生永久性萎缩。尽管胸腺中马立克病病毒主要感染B细胞，但胸腺细胞大量凋亡可能是病毒感染或是病毒诱发细胞因子变化的结果。在溶细胞期，脾细胞中促炎细胞因子的表达发生变化。表达的上调及所涉及的细胞因子随病毒的致病型及宿主基因型的不同而不同。早在感染后3-4天脾细胞中γ干扰素（IFN-γ）的mRNA水平上调，但是循环血白细胞没有这种现象。另外两种促炎细胞因子IL-6和IL-18也上调(Parcellsetal.,2001)。细胞因子表达的上升，也可解释引起脾肿大的淋巴样和网状细胞增生。早期免疫接种或存在母源抗体等因素可以改变早期病理变化，减少溶细胞性感染，继而减少潜伏感染细胞的数量，减少肿瘤数量或者推迟肿瘤形成的时间。1日龄雏鸡接种马立克病病毒后的溶细胞性感染时间要比2周龄或7周龄鸡的溶细胞性感染时间长(Buscagliaetal.,1988)。同样，毒株的致病性也会影响早期感染的严重程度。超强毒株(如Md5株)和特超强毒株(如RK-1株)，比低致瘤毒株引起更严重的淋巴器官萎缩(Buscagliaetal.,1988;Calneketal.,1998)，导致早期死亡综合征。1.1.4.2潜伏感染在感染一周后，此时进入潜伏感染时期。该时期活化的CD4+T细胞是主要的潜伏感染细胞，CD8+T细胞和B细胞也可参与潜伏感染，但关于潜伏期诱导过程中病毒与细胞之间的相互作用，目前仍不完全清楚。潜伏期能够因细胞介导免疫受损害或用毒力更强的病毒感染等因素推迟进入。可溶性因子IFN-α、IFN-γ、潜伏维持因子LMF与潜伏期诱导有关（竭航，2013）。上清中含有干扰素时用RB1B病毒感染CEF，证明干扰素在晚期基因翻译之前就可以阻断病毒复制(Calneketal.,1980;Leeetal.,2000)。脊神经节中，施旺细胞和卫星细胞存在明显的潜伏感染，但非淋巴细胞样细胞潜伏感染的程度尚不清楚。1.1.4.3第二次溶细胞感染5 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别宿主的抗病力和毒株的毒力决定着第二次溶细胞性感染的发展和程度，且决定肿瘤发生率。有遗传抗病力的鸡往往不会进入该时期，但易感鸡会在第2或3周后由潜伏感染转为第二次溶细胞感染(Adldingeretal.,1973)。这一时期，淋巴器官再次受到损害、发生萎缩，各内脏器官出现局灶性感染，产生持久性免疫抑制。皮肤羽囊上皮细胞受到感染，复制出大量传染性病毒，其病毒复制方式独特，是已知能复制出完全病毒的唯一部位，而且不同毒力的马立克病病毒毒株在遗传抗病鸡及易感鸡都能进行这种复制。马立克病病毒最可能是通过感染的淋巴细胞转运到羽毛囊上皮细胞。CVI988感染后仅7天就可以用荧光定量PCR的方法检测到病毒DNA。由带有核内包涵体的小淋巴细胞组成淋巴集合，早在感染后7天就可在真皮毛囊周围检测到。淋巴组织集合可进一步发展成由羽毛囊上皮细胞和变性淋巴细胞组成的坏死灶或发展成皮肤肿瘤。前者与pp38大量表达有关，但后者仅有少量pp38阳性细胞。vIL-8和pp38的缺失突变株可以在羽毛囊上皮细胞中复制全病毒，说明病毒在羽毛囊上皮细胞中可能是被从潜伏状态中重新激活(Choetal.,1996)。1.1.4.4肿瘤细胞增生期淋巴组织增生性变化构成了疾病的最终应答，进一步可发展成肿瘤。淋巴瘤由多种细胞组成，成分复杂，有炎性细胞、肿瘤细胞以及免疫学上参与或非参与细胞等，也存在T细胞和B细胞，T细胞较多。尽管肿瘤具有不同表现型，但是转化的靶细胞通常是活化的CD4+T细胞，可能是T辅助细胞(Buscagliaetal.,1988)。如果感染条件是经过实验改进的，其他的T细胞亚群都是可转化的，包括CD4+、CD8+及CD4-、CD8-细胞(Buscagliaetal.,1988;Morimuraetal.,1999)。在一些非感染的活化T淋巴细胞群体中发现MATSA、AV37两种马立克肿瘤特异抗原(Witteretal.,1997;Rossetal.,1999)，可能是表达在转化细胞表面的标志，有些品系鸡的马立克病淋巴瘤含有表达鸡致死性抗原的细胞，表明肿瘤细胞去分化的程度随品系不同而不同。1.1.5MDV的免疫抑制鸡只感染MDV会引起体液和细胞介导的免疫应答抑制，它与马立克病病毒毒株的毒力有关，且能够改变宿主对其他病原体的易感性。免疫应答的最早损伤是第一次溶细胞感染时淋巴细胞溶解的结果。肿瘤的最终形成与持久免疫抑制以及第二次溶细胞性感染相关(Schatetal.,1978)。马立克病在产蛋周期中的暴发可能与出现的免疫抑制和溶细胞性感染阶段的细胞活化有一定的关联。然而，免疫抑制并不是肿瘤发生的前提条件。Witter等发现，强毒马立克病病毒JM株与REV共培养后得到RM1克隆株，该克隆株6 山东农业大学硕士学位论文具有反转录病毒LTR。研究表明，该克隆株仍能引起严重的早期溶细胞性感染，但不再具有致瘤性，这对进一步分析病毒诱导的免疫抑制和致瘤性之间的关系有重要意义。1.1.6流行病学鸡是MD的主要宿主，火鸡、鹌鹑、山鸡也能感染病毒和产生病变(Kobayashietal.,1986;Imaietal.,1990)，鸭、麻雀、鹧鸪对马立克病具有抵抗力，但马立克病病毒接种鸭可产生抗体(Baxendaleetal.,1969;Kenzyetal.,1969)。以前有报道火鸡偶尔发生马立克病样肿瘤，但很少出现自然暴发。然而火鸡对马立克病病毒试验感染易感，自然发病和试验感染都很少或未见外周神经肿大。病毒感染特征与鸡的相似，但通常会有所减弱。感染火鸡的外周血液淋巴细胞中可再分离到病毒，且淋巴组织和肺中可以检测到抗原，但均比鸡的检出率和检出量低。病鸡和带毒鸡在鸡群间通过气源途径直接或间接接触其他正常鸡只，散播病毒造成其他鸡只感染，是主要的传染源(Biggs,1985)，感染后24h后可在肺内检测到病毒抗原，可能是吞噬性肺细胞摄取病毒并将其带到其他器官中去，导致大多数组织和器官（如血液和肿瘤细胞）几乎终生带有病毒，感染鸡长久排毒(Witteretal.,2005)。在羽囊上皮细胞繁殖的病毒具有很强的传染性(Calneketal.,1980)，能随着羽毛和皮屑脱落进入周围环境，可在室温下至少4-8个月内保持传染性。利用荧光定量PCR方法可以测定羽囊上皮细胞和淋巴细胞等病毒的含量。感染鸡的不断排毒和病毒对外界较强的抵抗力是造成感染流行的主要原因。由于很少有病毒能在孵化的温度和湿度条件下存活，这就说明了MDV不能由蛋外污染造成的母体到子代的垂直传播(Calneketal.,1973)。不同品种的鸡对马立克病的易感性差异很大，有的高度易感，有的具有很强抵抗力。有抵抗力的鸡被感染后，病毒在体内繁殖并排出，进一步感染正常鸡，感染在鸡群中一经建立，可在群内广泛传播，大部分鸡在性成熟时已被感染，但有抵抗力的鸡能够产生特异抗体，本身可以不发病。马立克病的发生率差异很大，除少数鸡可从临诊疾病恢复，一般情况下，死亡率和发病率相等。病原体、宿主、外界应激、其他病原的共感染以及饲养管理因素均能影响MD发病率和死亡率。病原体因素包括毒株的毒力、感染的剂量和途径，毒株毒力与MD发病率成正比。同样，在自然条件下，污染严重感染量越大发病率也越高。同时，鸡群中存在免疫抑制性病原，如禽白血病病毒(ALV)、网状内皮组织增生症病病毒(REV)、鸡传染性贫血病病毒(CIAV)等均可加重马立克病的发生。1.1.7临床症状及病理变化7 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别MD从感染到发病有较长的潜伏期，1-18月龄的鸡均可发病，一般以2-3月龄的鸡发病最为严重，超强毒株和特超强毒株感染所引起的早期死亡综合是例外，可发生在感染后8-16天。根据发病症状及病变发生的部位，MD在临诊上分为四种类型：早期死亡综合征、古典型、急性型和眼型。早期死亡综合征主要发生在雏鸡感染马立克病病毒强毒后8-16天，导致高死亡率，症状出现后48h内发生死亡，死前精神沉郁和昏迷，部分感染鸡死亡前颈部麻痹无力；神经型主要发生于3-4月龄鸡群，多侵害坐骨神经、臂神经以及迷走神经等外周神经(Payneetal.,1976)。病鸡或呈现“大劈叉”式特征姿态，或斜颈，扭头、呼吸困难；内脏型多呈急性暴发，病性急骤，以50-70日龄鸡多见，死亡率一般为25%-30%，表现精神委顿，共济失调。部分病鸡死亡而无特征临诊症状；眼型淋巴瘤症状罕见，转化的淋巴细胞渗出使虹膜呈弥散性灰白色(Biggsetal.,1968)，瞳孔边缘不整齐，视力减退或消失，称“白眼病”。病理变化主要包括神经损伤和内脏淋巴瘤(Payneetal.,1976)，脑部未见大体病变，但脊髓神经节明显肿大。达到正常大小的2-3倍粗或是更甚，显微镜下可观察到外周神经由多行性淋巴细胞团块组成或是小淋巴细胞和浆细胞的弥漫性浸润的特征。淋巴瘤性损害可见于卵巢、睾丸、胸腺、肝脏、虹膜、脾脏、骨骼肌、法氏囊等，内脏器官淋巴瘤多为大小不一的局灶状或结节状生长，或者表现为弥散性肿大。显微镜下可观察到胸腺的皮质和髓质的淋巴细胞缺失，以及法氏囊的滤泡变性、淋巴组织坏死和囊肿形成。1.1.8诊断技术1.1.8.1常规诊断根据马立克病流行病学特点、病理变化和肿瘤特异标记可诊断马立克病，监测鸡群感染情况主要采用血清学方法和病毒学方法。内脏型马立克病与鸡淋巴白血病(LL)两者发病年龄和病变分布不同。应用组织学或细胞学方法可提高诊断的准确性。用常规的苏木精-伊红染色的石蜡切片可看到马立克病肿瘤由淋巴细胞、浆细胞和马立克病细胞的混合群体组成。1.1.8.2病毒分离与鉴定根据MDV的细胞结合性特点，可以采用活细胞样品（如外周淋巴细胞、分离的肿瘤细胞或脾细胞）进行病毒分离监测马立克病，可将分离的血液淋巴细胞悬液接种到易感细胞中进行培养，约5~7天形成病毒蚀斑，病毒量少时，可将细胞传代扩大病毒量，待出现典型蚀斑后可用特异性血清作免疫荧光(IF)进一步确定病毒的血清型。1.1.8.3聚合酶链反应技术（PCR）8 山东农业大学硕士学位论文PCR技术因快速、便捷，在MD检测方面得到广泛应用，根据1型MDV基因组中含有特异性的132bp重复序列片段(Beckeretal.,1992)，可以设计针对此片段的引物对MDV进行检测，区分野毒株、致弱株及肿瘤中的病毒DNA。1.1.8.4实时荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR(RTFQ-PCR)方法灵敏、迅速，能够快速诊断MD。该方法能够准确定量样品中MDV的拷贝数，检测MDV在各组织器官的分布状况(Bumsteadetal.,1997;Burgessetal.,1999;Reddyetal.,2000)，从而更好的认识病毒的感染、增殖以及扩散。1.1.9MD疫苗的研究进展自MD疫苗问世以后，MD已经被有效控制，大大降低了大多数国家因MD造成的损失。上世纪70年代，HVT(Fc-126株)疫苗获得生产许可，由细胞结合苗发展出冻干苗(Witteretal.,1970)；随后，CVI988/Rispens株疫苗获得生产许可，且具有更好的免疫保护效果(Witteretal.,1984)。上世纪80年代，出现HVT+SB-1二价疫苗，两种疫苗联合使用具有更好的保护效果。随着MD疫苗的大量使用，MDV从四五十年代的温和型毒株、六七十年代的强毒毒株，不断发展至八九十年代的超强毒毒株，再到目前的特超强毒毒株(Witter,etal.,1997;Nairetal.,2005)，毒力的不断增强也推动了新型疫苗的研发进程。近几年，不断有研究者利用MDV作为载体构建各种类型的重组DNA疫苗。1.1.9.1疫苗的免疫机理使用MD疫苗，能够抵抗强毒攻击后淋巴器官的早期复制，降低潜伏感染水平，导致天然免疫和获得性免疫应答的激活(Morimuraetal.,1999;Kareletal.,2000)。自然杀伤(NK)细胞在免疫后3天被激活，可能产生IFN-γ并杀死有限的病毒感染的B细胞(Lessardetal.,1996)。IFN-γ能够刺激巨噬细胞启动一氧化氮合成酶(iNOs)合成，iNOs在接种后3~7内产生一氧化氮(NO)。研究表明，NO被认为在杀伤病原体中发挥重要作用，这就限制攻击病毒的复制。抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在接种后7天开始形成，并可能与抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)协同作用消灭病毒攻击后的其他感染细胞。两者的协同作用使病毒进入潜伏状态。记忆性细胞毒性T淋巴细胞能快速消除重新活化的病毒感染细胞(Omaretal.,1998)。当然，MDV引起的免疫逃逸能够影响疫苗免疫力，其他免疫抑制病原如ALV或者REV的感染、外界环境的应激同样也会影响疫苗免疫效果。1.1.9.2疫苗的种类9 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别日前全世界使用的疫苗毒株有三种：第一种是人工致弱的1型马立克病病毒毒株，如荷兰Rrispens的CVI988株、美国Witter的MD11/75/R2株，国内哈尔滨兽医研究所的K株(814)等；第二种是自然不致瘤的2型马立克病病毒毒株，如美国的SB1和国内的Z4株；第三种是3型马立克病病毒毒株，如HVTFc-126株。CVI988疫苗是我国目前使用最广泛的一种单价疫苗，其免疫效力比火鸡疱疹病毒疫苗更好，能抵抗超强毒MDV的攻击；火鸡疱疹病毒与马立克病病毒有交叉免疫作用，对鸡和火鸡均不致瘤，用它免疫后能抵抗强毒马立克病病毒的致瘤作用。Fc-126是已知最好的火鸡疱疹病毒疫苗毒株，细胞结合的火鸡疱疹病毒苗比冻干疫苗效果更好，曾经是使用最广泛的单价疫苗，生产成本低，便于保存、运输和使用；双价和多价疫苗主要是由1型+3型或2型+3型马立克病病毒组成的双价疫苗以及1型+2型+3型马立克病病毒组成的三价疫苗。如国外生产的火鸡疱疹病毒(Fc-126)+SB1(301B/1)双价疫苗，国内注册的火鸡疱疹病毒(Fc-126+Z4)双价疫苗。但是目前，CVI988/Rispens疫苗免疫地区也常常会被报道发生MDV的流行和爆发，由此，研究者们正在不断研发新型MD疫苗。随着深入研究MDV，发现它有一些复制非必需部位可供插入和表达外源基因及特定的马立克病病毒基因。这种马立克病病毒为载体的疫苗具有同时提供抗马立克病和其他病原体保护的优点，而且从潜伏感染再激活可以增强抗马立克病和其他病原体的免疫应答。不断有研究者构建出MDV重组疫苗，Sonoda等将NDV与MDV进行重组，该重组病毒能够对含有母源抗体的鸡提供保护由新城疫病毒引起的死亡，但不能抑制NDV的复制(Sonodaetal.,2000)；2016年，YongzhenLiu等将ALV-Jenv或gag+env基因插入马立克病病毒的US2基因中构建了两种有效的ALV-J疫苗，在动物保护试验中鸡显示诱导出阳性血清抗体，为控制MDV和ALV-J共感染开辟了新的途径(Liuetal.,2016)。1.2禽白血病（AL）的研究进展禽白血病(Avianleukosis,AL)能够引起禽类多种肿瘤性疾病，主要宿主是鸡，感染后能够引起多个具有传染性的良性或恶性肿瘤(Dongetal.,2015)，临床诊断以淋巴白血病为主，其次是成红细胞白血病、成髓细胞白血病，以及包括结缔组织肿瘤、肾瘤和肾胚细胞瘤等(Payneetal.,2012)。自Roloff1868年首次报道淋巴白血病以来，ALV已经分布全世界各地，并认为该病几乎波及所有商品鸡群。在1988年前后，英国首先从白羽肉鸡中发现了致毒性更强的J亚群禽白血病病毒(subgroupJAvianleukosisvirus，即ALV-J)(Baietal.,1995;Bensonetal.,1998)，随后，该病毒传入到我国。1998年，杜岩等10 山东农业大学硕士学位论文从白羽父母代肉鸡和商品代肉鸡中分离到了4株ALV-J（杜岩等,1999,2000）。2005年，徐镔蕊等首次从商品蛋鸡中分离到J亚群禽白血病病毒（徐镔蕊等，2005），说明ALV-J已经由之前的对肉鸡敏感转为可以同时感染肉鸡和蛋鸡。近几年不断有报道表明商品代肉鸡、蛋鸡以及一些地方品系鸡存在感染ALV-J的现象(成子强等,2005;Laietal.,2011;Panetal.,2012)。由此可见，ALV-J在我国鸡群中的感染仍然非常普遍(Caietal.,2013;Lietal.,2013;Zengetal.,2014;Dongetal.,2015)。由于ALV以垂直传播为主，难以控制，严重影响了鸡群的增重和产蛋，尤其是患鸡抵抗力下降，容易感染多种疾病，为鸡群的饲养管理造成极大困难。1.2.1病原学特点根据国际病毒分类委员会(ICTV)的最新分类，将禽白血病的病原归为反转录病毒科的α反转录病毒属。ALV是反转录病毒属的典型种，具有反转录酶。ALV对热不稳定，温度升高会加快ALV的灭活，但低温有助于保存。在-15℃条件下，ALV的半衰期少于1周，在-60℃条件以下，ALV能够在不降低感染力的同时保存数年。同时，病毒在保存时要注意温度合适，这是由于反复冻融会引起病毒发生裂解，从而使其释放特异性抗原。根据病毒囊膜糖蛋白抗原结构，将ALV划分为A-J共10个亚群(Hanafusa,1973;Hanafusaetal.,1976;Frisbyetal.,1979;Troeschetal.,1985;Baietal.,1995)。A、B、C、D、F、G、H、I、J这9个亚群是外源性ALV，均有致病能力，同时，A、B、C、D、E和J这六个亚群能够自然感染鸡群。其中，因J亚群与其它亚群的抗原性差异最显著，致病性和传染性最强。1.2.2流行病学特征禽白血病病毒不能在外界环境中长时间存活，抵抗力较弱，故ALV的横向传播能力较弱。经卵垂直传播是ALV的主要传播方式。研究发现，母鸡的输卵管壶腹部含有大量的病毒，种蛋在携带禽白血病病毒后，孵出的雏鸡将终生带毒，这种通过种蛋的垂直传播方式，使得群体感染率持续上升，并使病毒在群体中持续感染。鸡先天感染后，导致持久的免疫耐受，雏鸡出现病毒血症，产蛋鸡的产蛋率和存活率与水平传播感染的鸡相比低(Payneetal.,1993)。1.2.3免疫抑制机制与致病性感染了禽白血病病毒的鸡只通常会有约1%到2%的死亡，但是在产蛋高峰期前后偶尔也会达到20%甚至更高的死亡率，产蛋量显著降低。不过由于大多数的禽白血病病毒毒株属于慢性转化型病毒，并不携带致肿瘤基因，所以在病毒感染的初期阶段不会导致11 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别感染鸡只发生肿瘤，一般只是引起鸡体消瘦、免疫抑制、精神状态不良以及生长发育欠佳等。感染ALV后导致的免疫抑制能够降低鸡群对疫苗的免疫应答，降低新城疫疫苗、呼肠孤病毒疫苗等疫苗的保护效率，致使感染鸡只对病毒更加敏感，并且细菌的继发感染也会有所增加。先天感染的子代鸡只免疫抑制作用尤为突出，并且鸡只的死淘率也会明显升高（韦平等,2000;祝丽等,2008）。淋巴组织发生萎缩，白细胞骤减，淋巴细胞转化能力减弱等是剖检和组织学观察最主要的变化。在家禽的免疫系统中，B淋巴细胞、T淋巴细胞以及巨噬细胞是至关重要的三种细胞类型。ALV感染后最有可能危害的就是淋巴细胞或者是成淋巴细胞。在受精鸡蛋的形成过程中，母源抗体分泌进入卵黄，而且在鸡胚发育前3周内，B淋巴细胞和T淋巴细胞会移行至法氏囊及胸腺的上皮组织，并通过法氏囊分化调节使得细胞再移向鸡体其他部位，如脾脏、盲肠扁桃体、骨髓等（孙贝贝等，2009）。在淋巴白血病患病鸡只中，其法氏囊淋巴滤泡出现异常，转化的B淋巴细胞失去由产生免疫球蛋白M(IgM)发育为产生免疫球蛋白G(IgG)细胞的能力，其表面仅带有IgM。这可能与功能性白细胞介素2(IL-2)的合成受到干扰，从而导致B细胞成熟停止和抑制性T细胞发育阻断有关。有关研究已经证实，决定禽白血病病毒免疫抑制的关键在TM区。TM区又被称为免疫抑制区，由27个氨基酸组成的高度保守区域。该序列在不同亚群ALV毒株间几乎相同，同源性极高。禽白血病能够引起多个组织的肿瘤，继而造成病禽的死亡、淘汰，影响禽类的生产性能，降低疫苗的免疫应答水平，从而造成疫苗的免疫失败，进而影响到其它禽类相关产品的生产与研究工作。禽白血病病毒能够导致病鸡肝脏、脾脏等多种脏器表现不同形式的肿瘤，如髓样细胞瘤、纤维肉瘤等。其中，ALV-J对骨髓源性的细胞有亲嗜性，主要引发肉鸡的髓细胞肿瘤，造成肝脏肿大，其表面的细小白色小结节多呈弥漫性分布，同时还表现出免疫抑制、体重下降、产蛋下降等非肿瘤性的症状，ALV-J的免疫抑制作用比其他亚群更强。1.3MDV与ALV混合感染家禽的免疫系统包括天然免疫和后天获得性免疫，能够帮助家禽抵御病原微生物的入侵、繁殖与扩散。当家禽遭受免疫抑制性病毒感染（如禽白血病病毒、马立克病病毒、鸡传染性贫血病毒）时，免疫系统遭到破坏，机体出现暂时或永久性免疫应答障碍，免疫器官发生萎缩，免疫细胞受到损伤，从而造成免疫抑制。当鸡体遭受免疫抑制时，疫苗免疫后不能正常诱发机体免疫应答，无法产生良好的免疫保护效果，导致鸡群生长迟12 山东农业大学硕士学位论文缓、生产功能下降。ALV因其较强的垂直传播能力，多次被报道发现鸡场中存在ALV-J感染，而且伴随与MDV、REV、CAV共感染的现象（张洪海等，2009；秦立廷等，2010；王波等，2014），其共同感染的发生率在20%左右，同时三种疾病共感染的发生率也接近20%（秦立廷等，2005）。1.4本研究的目的和意义1.4.1先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响马立克病和禽白血病作为家禽的两大肿瘤性疾病，都会诱导鸡群发生免疫抑制、产生肿瘤，引起禽群消耗性死亡，而MDV与ALV的共感染更能加重禽群的发病率、死亡率，对生产造成严重的经济损失。有些鸡场虽接种了鸡马立克病疫苗，但它所产生的免疫保护作用很容易被突破(Gimenoetal.,2008;Davisonetal.,2014;Zhangetal.,2015;Cuietal.,2016)，马立克病仍然时有发生。研究发现，MDV感染鸡群常伴随其他免疫抑制性病原，特别是ALV的感染。由此可以推测，先天感染ALV可能是造成免疫了CVI988/Rispens疫苗鸡群仍发生MD的原因之一。因此，本研究利用SPF鸡模拟先天感染ALV-J探究对CVI988/Rispens疫苗免疫保护效果的影响以及MD频发的因素，能够对加强鸡群MD的防控提供参考，为规模化养禽业良好发展提供参考依据。1.4.2不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立近年来，随着疫苗的使用，MDV的毒力近年来呈现逐渐增强的趋势，CVI988/Rispens疫苗株已经无法提供完全的免疫保护(Gimenoetal.,2008;Davisonetal.,2014;Zhangetal.,2015;Cuietal.,2016)，研制免疫效果更好的MD疫苗已经成为迫切需求。本实验室苏帅等在GX0101的细菌人工感染性克隆bac-GX0101的基础上，利用高通量测序的方法完成了病毒基因组的测序分析，并进一步利用同源重组技术敲除GX0101meq基因，构建了基因缺失疫苗株SC9-1(苏帅等，2013)。大量的研究结果已经证实SC9-1不但彻底丧失致病性，而且能够对免疫鸡群提供比CVI988/Rispens更好的保护效果（段伦涛等，2014；Suetal.,2015,2016）。因此，通过利用SC9-1疫苗株基因组中特有的REV-LTR片段和缺失meq基因的分子标志，建立了PCR扩增和核酸斑点杂交方法，可以有效区分SC9-1与市场其他MD疫苗株，为MD新型疫苗的研发和推广提供技术支持。该方法简便快捷、迅速灵敏，可操作性强，同时也为未来在鸡群免疫SC9-1疫苗后，对MD野毒感染的检测方法以及其病毒增殖动态的追踪提供参考思路和奠定理论基础。13 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别2材料和方法2.1试验材料2.1.1病毒MDV-GX0101毒株(GenBank登录号JX844666)是本实验室在广西某鸡场分离到的一株基因组上带有禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis,REV)的长末端重复序列(LTR)的天然重组病毒（张志等，2005年；Zhangetal.,2005），由本实验室保存；ALV-JNX0101株(GenBank登录号DQ115805)是本实验室在宁夏某种鸡场分离得到(Cuietal.,2003a)，经检测无其他病毒污染，其传染性克隆毒株由本实验室制备和保存（张纪元等，2005）。2.1.2疫苗与质粒MDVmeq基因缺失疫苗株SC9-1是在其亲本病毒GX0101的感染性克隆bac-GX0101基础上，利用同源重组技术敲除meq基因，并进一步敲除卡那霉素抗性基因，构建的新型MD疫苗（孙爱军，2009；苏帅，2013），由本实验室构建并保存。商品化MD疫苗CVI988/Rispens株、814株、HVTFc-126株均由北京翎羽生物科技有限公司提供。鸡新城疫灭活疫苗和H9亚型禽流感灭活疫苗均购自齐鲁动物保健品有限公司。GX0101BAC质粒、SC9-1BAC质粒以及GX0101ΔLTRBAC质粒由本实验室构建保存。2.1.3主要试剂与仪器主要仪器：HERAcellCO2细胞培养箱；加拿大Cabinets公司的超净工作台；PCR仪；DYYnl-3/3IB型核酸电泳槽和DYYnl-2型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器）；SUB28型恒温水浴锅（英国Grant）；台式冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；Thermo公司的0.1-2.5µL/0.5-10µL/20-200µL/100-1000µL型号的移液器；NIKONECLIPSETS100型倒置显微镜；ABI公司的7500荧光定量PCR仪；ELISA洗板机（美国BioTek）；GDLDOCEQ凝胶成像分析系统（美国BIO-RAD）。SWKQ系列微电脑全自动孵化器；主要试剂：IDEXX公司的ALV特异性抗原p27检测试剂盒AvianLeukosisVirusAntigenTestkit；尼龙膜、PCRDIGProbeSynthesisKit购自Roche公司；OMEGA公司的凝胶试剂盒；Amreso公司的琼脂糖、蛋白酶K、氨苄青霉素；Solarbio的淋巴细胞分离液、红细胞裂解液、平衡酚；大连TaKaRa公司的PCR反应试剂、DL2000/DL1500014 山东农业大学硕士学位论文Marker、rTaq、SYBRPremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)试剂盒；甲醇、无水乙醇等试剂为国产分析纯。2.1.4其他试剂的配制1）TE(pH7.4)：将100mmol/LTris-cl和10mmol/LEDTA溶解于1000mL去离子水中，搅拌充分溶解，室温干燥保存。2）PBS溶液：准确称量8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4以及0.24gKH2PO4，依次加入到三角瓶中，再加入1L去离子水，充分混匀使之完全溶解，将PH调至7.0-7.2之间，分装，高压灭菌后保存使用。3）50×TAE：将盛有80mL去离子水的三角瓶中，加入10mL0.5MEDTA(pH8.0)，5.71mL冰乙酸以及24.2gTris碱，然后将其混匀，再加去离子水定容至100mL。4）柠檬酸三钠抗凝剂：称取4.33g柠檬酸三钠抗放入三角瓶中，向其加入100mL去离子水，混匀定容，高压灭菌后保存备用。5）组织抽提液：准确称量0.61gTris-Cl(pH8.0)，18.61gEDTA以及2.5g0.5%SDS，加入500mL去离子水，充分混匀备用。6）70%乙醇溶液：用量筒准确量取70mL无水乙醇，加入30mL去离子水，混匀备用。7）福尔马林固定液：量取10mL40%的甲醛，再加入90mL的PBS，10倍稀释，充分混匀备用。2.1.5试验动物与SPF饲养设施从山东济南斯帕法斯家禽有限公司购买SPF种蛋，放入自动孵化器经21天孵化后得到1日龄SPF雏鸡，饲养于山东农业大学南校区动物房负压空气过滤隔离罩内。2.2方法2.2.1鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备1）选择发育良好的SPF鸡胚，9-11日龄内均可，在超净台内将鸡胚气室朝上放置蛋托，先用碘酒在气室由中央向四周均匀消毒，再用酒精棉脱碘。2）敲破蛋壳，用镊子沿着气室边缘顺时针方向依次取掉蛋壳，此时注意避免蛋壳碎屑掉入蛋内。3）用无菌镊子揭开壳膜，取出鸡胚放入高压灭菌的平皿中。4）用无菌镊子、手术剪刀去除头、四肢、内脏，用PBS冲洗3遍，放置小型烧杯中。5）用无菌手术剪刀剪碎胚体，至1mm3左右后移入无菌的三角瓶中。15 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别6）向三角瓶中加入约胚体两倍体积的消化液，消化液含有0.025%的胰酶以及0.001mol/L的EDTA，37℃水浴消化10-15min，消化时间根据鸡胚的大小而定。7）用无菌滤网过滤消化液，转入锥形瓶，加入适量小牛血清混匀，终止消化。8）若剩余组织块仍未消化完全，可重复第6步，此时消化时间与加入消化液的量根据剩余组织块而定。9）最终消化完全后，将收集到的混合液分装至多个10mL的无菌离心管中，230g/5min离心。10）弃去上清，用小牛血清小心吹散细胞团块，使用台盼蓝进行活细胞计数。11）按照500万/瓶的浓度接种细胞瓶中，置于37C，5%CO2培养箱中培养，可用于病毒的扩增、鉴定和定量。2.2.2MDV的增殖与定量将制备好的原代CEF细胞接种到细胞瓶（500万/瓶）中，培养至长满时，将GX0101毒株接种到细胞瓶中，维持4天以上，待出现大量蚀斑时将细胞消化，离心收集，按DMSO：FBS：DMEM=1：3：6配制冻存液，重悬细胞分装至冻存管，最终放置液氮保存。从液氮中取出一支GX0101病毒原液迅速放置37℃水浴锅中融解，在灭菌的1.5mL离心管中用空白的DMEM作连续2倍的倍比稀释，即每个离心管加500μL空白DMEM，然后向第一管中加入500μL病毒原液，充分混匀后取出500μL加入到第二孔中，以此类推，倍比稀释，一直稀释到212稀释倍数，再将稀释好的病毒按照稀释倍数依次接种于铺满CEF的96孔板中，每一稀释度的病毒接种一纵排共8孔，每孔接种100μL。在培养至第7天和第9天后数出每个孔中的蚀斑数。根据两次的结果计算出原始液体中MDV的含量。2.2.3ALV的增殖与定量将DF-1细胞接种在细胞瓶中，至长满70%~80%时，从液氮中取出ALV-JNX0101株将其接种到细胞瓶，8-12小时后换2%FBS的维持液，继续放至37℃5%CO2培养箱维持3天以上，可进行传代，扩大病毒量，收集细胞上清液放于液氮保存备用。取病毒原液室温融化后，用空白的DMEM对病毒原液进行101、102、103、104、105、106、107倍比稀释，将稀释好的病毒按照稀释倍数从小到大依次接种到铺有DF-1细胞的96孔板中，每一纵排接种一个稀释度，每孔接种100μL。2小时后换维持液，16 山东农业大学硕士学位论文37oC，5%CO2培养箱中培养9天后，取细胞上清用ELISA的方法检测p27。计算方法：lgTCID50=L+d(s-0.5)L：最高稀释度的对数d：稀释度对数之间的差s：阳性孔比率总和2.2.4先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响2.2.4.1试验设计将购买的SPF种蛋放置自动孵化器中孵化，至6胚龄时，对1﹑2两组（试验共分1、2、3、4、5五组）卵黄囊接种500TCID50的ALV-JNX0101毒株，做好标记。待21天后，将孵化出的小鸡每组35只（1、2两组先天感染ALV-J）。具体实验分组情况如下（表1）：对第1组在6胚龄时接种500TCID50的ALV-JNX0101毒株，1日龄时免疫一羽份CVI988/Rispens疫苗；对第2组在6胚龄时接种500TCID50的ALV-JNX0101毒株，1日龄时免疫一羽份CVI988/Rispens疫苗，6日龄时腹腔接种2000PFU/只的GX0101病毒(攻毒用体积为0.2mL)；对第3组在1日龄时免疫一羽份CVI988/Rispens疫苗，6日龄时腹腔接种2000PFU/只的GX0101病毒(攻毒用体积为0.2mL)；对第4组在6日龄时腹腔接种2000PFU/只的GX0101病毒(攻毒用体积为0.2mL)；对第5组在1日龄时免疫一羽份CVI988/Rispens疫苗；对所有组鸡在10日龄颈部皮下免疫AIV-H9、NDV灭活苗，每只鸡0.2mL所有组试验动物均单独饲养于能够负压过滤空气的隔离罩内，为其他组腹腔注射等量的生理盐水。在腹腔注射造成意外死亡的情况下，前7天死亡的SPF鸡被认为是意外死亡，并排除在后面的数据分析。17 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别表1试验分组与处理Table1Animalexperimentgroupingandtreatment处理Treatment6胚龄接种1日龄免疫6日龄接种GX010110日龄免疫AIV/NDV组别数量ALV-JCVI988/Rispens超强毒灭活苗GroupsNumbersInoculateALV-JInfectat1dayoldwithInjectMDVGX0101atInfectat10daysoldwithCVI988/Rispensattheageof66daysoldAIV–H9andNDVembryosinactivatedvaccines135++—+235++++335—+++435——++535—+—+2.2.4.2鸡的死亡率及肿瘤发生率SPF鸡按照以上的分组饲养，整个饲养周期为90天，详细记录试验周期内死亡鸡的数量，试验结束后剖杀存活鸡，统计死亡率、肿瘤发生率。免疫效力由保护指数（PI=protectionindex）来确定（Leeetal.,2008）。2.2.4.3体重和免疫器官指数的测定分别在GX0101攻毒后第1、2、3、4、5、6周对5组SPF鸡的体重进行称重，比较GX0101、CVI988/Rispens和ALV-J感染对SPF鸡生长性能的影响。在GX0101攻毒后第7天，每组各随机选取5只鸡称重并剖检，取其胸腺，法氏囊称重，测定免疫器官指数，免疫器官指数(mg/g)=免疫器官鲜重(mg)/活体重(g)×100%。2.2.4.4AIV-H9和NDV灭活疫苗的免疫和抗体水平的测定SPF鸡在10日龄时于颈部皮下接种AIV-H9、NDV灭活苗，每只鸡0.2mL。免疫后第3、4、5周，采集血液分离血清，血凝血抑检测AIV-H9、NDV抗体水平，比较分析各组免疫AIV-H9、NDV灭活苗后诱导抗体水平的差异。（1）制备1%鸡红细胞用灭菌注射器吸取适量柠檬酸三钠抗凝剂，从成年SPF公鸡的翅静脉中采集新鲜血液。与抗凝剂充分混匀后转移至10mL离心管中，230g/5min离心，弃去上层的抗凝剂和血浆液体；加入适量的生理盐水轻轻吹打，使其与下层的红细胞充分的混匀，230g/5min离心，用1mL的移液器轻轻吸除上层的清液以及红细胞表面的白细胞层；重复上述操作洗涤3次，最后以230g/离心5min。尽量吸净上清液，用移液器加入5mL生理18 山东农业大学硕士学位论文盐水轻轻地将红细胞稀释混匀，从中吸出5mL后，将剩余的红细胞沿着瓶子内壁缓慢地加入广口瓶中，与瓶中事先量取好的生理盐水充分混匀，注意此时要动作轻柔，避免红细胞溶血，1%鸡红细胞即配制完成。（2）配制四单位抗原向96孔反应板中的每孔均加入50μL生理盐水，再向左侧第1孔加入50μL待检抗原，混合均匀后吸出50μL加入到第2孔，再次混匀吸出50μL至第3孔，以此类推倍比稀释到第11孔，最后第12孔作为空白对照。然后自左向右每孔中加入50μL1%的鸡红细胞，轻微混合震荡使待检抗原与鸡红细胞充分接触，37oC温箱中孵育15min后进行结果判定，按照能使100%红细胞凝集的最大稀释倍数作为病毒血凝价。按照病毒血凝价计算配制四单位抗原，以备凝集抑制实验使用。（3）血凝抑制实验自左至右向96孔反应板中的每孔各加50μL生理盐水；向左侧第一纵排加入待检血清50μL，充分混合均匀后，吸出50μL至第2孔，再混合均匀后吸出50μL至第3孔，依次倍比稀释第11孔，弃去50μL。最后第12孔不稀释，作为对照；自左至右依次向每孔中各加50μL上述配制好的4单位病毒；轻微混合振荡混匀后，37oC温箱中孵育15min；再自左向右依次向每孔中加入1%的鸡红细胞悬液50μL；轻微混合振荡后，37oC温箱中孵育15min；观察结果，能够完全抑制红细胞凝集的反应孔即为该血清的抗体滴度，血清抗体滴度以2的指数表示。2.2.4.5外周血淋巴细胞DNA的提取各组随机选取6只鸡并编号，在攻毒GX0101后第5、10、14、21、28天，采集抗凝血提取外周血淋巴细胞DNA。1）向2mL离心管中加入1mL外周血淋巴细胞分离液，然后将采集的1mL新鲜抗凝血液缓慢打入到2mL离心管中，此时要避免震荡。2）400g离心6-7min，离心后观察离心管可看到由上至下分别为血浆层、淋巴细胞层、分离液层以及最底层的红细胞层。3）将第二层的淋巴细胞层吸出至1.5mL离心管中，13800g离心2min，此时淋巴细胞聚集在离心管底部，并夹杂少量红细胞。4）倒掉上清，用1mL红细胞裂解液重悬细胞，4oC放置30min后裂解掉红细胞，13800g离心2min，倒掉上清得到纯淋巴细胞。19 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别5）向离心管中加入490μL的组织抽提液和10μL的蛋白酶K，将淋巴细胞重悬并混匀，放入55oC水浴锅内水浴消化过夜。6）消化结束后，向离心管中加入等量苯酚，震荡混匀，4oC13800g离心15min，将上层水相吸出至新的离心管中，并做好标记。7）重复步骤68）向离心管中加入等量氯仿，小心混匀，4oC13800g离心15min，将上层水相吸出至新的离心管中，再加入2倍量的无水乙醇，小心颠倒混匀后，能够看到白色絮状物。9）将样品放置-20oC沉淀DNA2h，4oC13800g离心30min后，倒掉上清，白色DNA聚集在离心管底部。10）再向离心管中加入提前配制好的1mL70%的乙醇，将DNA重悬起来，4oC13800g离心15min。倒掉上清，再次13800g离心2min，将离心管底部的液体吸出，将DNA放置在通风处晾干，加入适量TEBuffer溶解DNA，并加入适量RNase，降解RNA。11）将最终提取的DNA定量后稀释到大约50ng/μL，用作荧光定量PCR的模板。2.2.4.6GX0101的增殖动态根据MDV-GX0101毒株基因组上带有REV-LTR序列，与其他毒株存在差异，设计针对REV-LTR序列的荧光定量PCR引物（表2），将上述提取的DNA样品进行荧光定量PCR反应（段伦涛等，2014），每份样品设3个重复，检测第2、3、4三组中GX0101病毒在鸡体内的增殖动态。反应体系共20μL，包括10μLSYBRPremixExTaqTM(200×)，0.4μLROXReferenceDyeⅡ(50×)，0.4μL引物P1(10μM)，0.4μL引物P2(10μM)，2.0μLDNA样品，6.8μL灭菌蒸馏水。反应条件为：95oC预变性15s；95oC变性5s，60oC退火34s，扩增40个循环。为了分析SYBRGreenIPCR扩增特异性，应对扩增产物制作熔解曲线，条件为：95oC15s，60oC1min，95oC15s，60oC15s。表2荧光定量PCR引物序列Table2GenesequenceoftheprimersusedinReal-TimePCR引物序列片段用途，PrimernamePrimersequences（5-3）Productssize/bpUseofprimerLTR-FTATCATTTCTCGGAATCGGCATCusedastheSYBRGreenReal-timePCR317LTR-RAAATCTCCTCTCACTGCCAATCTprimerstodetectMDVGX0101LTR.20 山东农业大学硕士学位论文2.2.4.7病理学检测及时解剖试验期间死亡鸡只，选取有肿瘤部位的肝脏、脾脏、心脏和肾脏，用福尔马林溶液固定，制作石蜡组织切片，HE染色观察组织病变。用同样方法对待90日龄后剖杀有肿瘤发生的个体。HE染色之前需要用二甲苯、乙醇将石蜡切片进行脱蜡复水，具体步骤为，两次二甲苯，每次15min，两次无水乙醇，每次10min，一次95%乙醇10min，一次85%乙醇5min，一次70%乙醇5min，再用蒸馏水清洗5min。然后将切片用苏木精水溶液染色5min，过两次蒸馏水，盐酸酒精分化2s，流水冲反蓝5至10min，再放入80%乙醇1min，放入伊红染色液中40s，过两次蒸馏水，再放入70%乙醇5s，85%乙醇5s，95%乙醇5s，100%乙醇5s，二甲苯透明。最后晾干，用中性树胶进行封片处理。HE染色中，苏木精是碱性染料，根据细胞核及核糖体内含有噬碱性物质的特点，苏木精能够使细胞核及核糖体呈现蓝色；而伊红是酸性染料，根据细胞质中有噬酸性物质的特性，伊红染料能够使细胞质呈现红色。红蓝颜色的差异能够更好呈现组织结构病变。2.2.4.8统计学分析将各组鸡的体重、免疫器官指数、AIV-H9和NDV的抗体水平、淋巴细胞中GX0101病毒的拷贝数以及死亡率、肿瘤发生率，使用SPSS专业数据软件进行差异显著性分析，以P<0.05为差异显著。2.2.5不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立2.2.5.1PCR引物的设计与合成依据MDVGX0101的全基因组序列(Suetal.,2012,2013)设计引物（表3）。引物F1/R1位于GX0101meq基因的外侧，扩增包含完整meq基因的MDV基因片段；引物F2/R2位于GX0101meq基因内，扩增meq基因的部分基因片段；引物F3/R3扩增GX0101基因组中独特的REV-LTR重组片段（图2）。2.2.5.2疫苗DNA的提取通过酚氯仿抽提方法分别提取SC9-1、CVI988/Rispens、814、HVTFc-1264种MD疫苗株的DNA以及鸡胚成纤维细胞的DNA，定量后置-20oC保存。2.2.5.3PCR扩增体系及条件优化PCR扩增体系：10×PCRbuffer(含Mg+)2.5μL，dNTP(2.5mM)2μL，上下游引物各0.5μL，模板DNA0.5μL，rTaq0.5μL，ddH2018.5μL，共计25μL。21 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别引物(F1/R1)扩增条件为：预变性95oC5min；变性95oC30s，退火55oC30s，延伸72oC1min20s，共30个循环；最后延伸10min。引物(F2/R2)扩增条件为：预变性95oC5min；变性95oC30s，退火55oC30s，延伸72oC40s，共30个循环；最后延伸10min。引物(F3/R3)扩增条件为：预变性95oC5min；变性95oC30s，退火55oC30s，延伸72oC40s，共30个循环；最后延伸10min。22 山东农业大学硕士学位论文表3MDVmeq基因缺失疫苗株SC9-1与商品化疫苗的鉴别PCR扩增引物Table3PrimersusedforidentificationofMDVmeq-deletedSC9-1andothercommercialvaccines引物序列病毒基因组位置片段扩增基因片段PrimersSequences（5’-3’）MDVLocationingenomestructureProductssizeAmplificationofgenes4421～4440Amplificationofgenescontaining1020bpGX01011120bp5521～5540meqgene―Amplificationof184bpsequencesSC9-1184bpF1AGAAACATGGG―containingFRTsiteGCATAGACG5161～5180Amplificationofgenescontaining1197bpCVI9881297bp6438～6457meqgeneR1CTTGCAGGTGTA4290～4309Amplificationofgenescontaining1197bp8141297bpTACCAGGG5567～5586meqgene―HVT―serotype-IIIMDViswithoutmeqgene―133768～133788Amplificationof569bppartofthemeqGX0101569bp134319～134336gene―F2SC9-1―LackofmeqgeneGAGAAACAGAA―GCTGGAAAGG136196～136216Amplificationof746bppartofthemeqCVI988746bp136924～136941gene133240～133260Amplificationof746bppartofthemeq814746bpGGGCAGAAGAG133968～133985geneR2GGAATGG―HVT―serotype-IIIMDViswithoutmeqgene―152747～152765Amplificationof512bppartoftheREVGX0101512bp153238～153258LTRsequences―Amplificationof512bppartoftheREVSC9-1512bp―LTRsequencesF3AATGTGGGAGG―GAGCTCCGCVI988―ThegenomedoesnotcontainREVLTR――R3TGTTGTACCGAA814―ThegenomedoesnotcontainREVLTR―ATACTACGG―HVT―ThegenomedoesnotcontainREVLTR―23 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别图2鉴别引物在SC9-1株和其它商品化疫苗株的基因组示意图Fig.2LocationofprimersusedforidentificationofMDVmeq-deletedvaccineSC9-1andcommercialvaccines2.2.5.4地高辛标记DNA探针的制备按照PCRDIGProbeSynthesisKit说明书，利用F2/R2、F3/R3引物，以GX0101BAC质粒DNA为模板，合成地高辛标记的meq(569bp)、REV-LTR(512bp)基因片段作为探针。2.2.5.5核酸斑点杂交检测按照DIGNucleicAcidDetectionKit说明书，将提取的疫苗DNA进行核酸斑点杂交，进一步验证PCR方法的准确性。同时以GX0101BAC质粒、SC9-1BAC质粒、GX0101ΔLTRBAC质粒作为对照。核酸斑点杂交方法如下：1）根据样品数量在尼龙膜上划好1cm×1cm的格子，在格子右下方做好组别标记。2）分别将DNA样品点在划好的格子里，每个格子点1μL，每张膜上做一次重复，同时做好阴阳对照。24 山东农业大学硕士学位论文3）待尼龙膜吸收DNA样品后，放入变性液中完全沉浸变性10min，再放入中和液里完全沉浸中和5min。4）取出尼龙膜放入平皿中，用滤纸吸干至没有明显水珠，放入80oC的烘干箱中固定DNA2h。5）固定结束后，将尼龙膜放入预杂交液中完全沉浸，68oC，2h。6）制备杂交液，将上述制备好的探针放置在沸水中变性10min，再放入冰水混合液中冷却5min，此时探针已变性，将其倒入预杂交液中，摇晃混匀，即为杂交液。7）预杂交结束后，将尼龙膜放入杂交液中完全沉浸，68oC，杂交过夜。8）杂交结束后，回收杂交液，将尼龙膜放置洗液I中洗涤2次，每次15min。9）再将尼龙膜放置洗液II中在68oC条件下洗涤2次，同样每次15min。10）洗涤结束后，再将尼龙膜放置BufferI中洗涤1min。11）再将尼龙膜放置在BufferII中37oC浸沉半个小时，结束后再放置于BufferI中洗涤1min。12）向盛有20mlBufferII的平皿的四个角中各加入1μL抗Digoxiaenin抗体，混匀，再将尼龙膜放入其中，37oC浸沉半个小时。13）结束后将尼龙膜放入BufferI中，将平皿放在摇床上洗涤5次，每次5min。14）洗涤结束后，用BufferIII冲洗一下尼龙膜。15）最后，向平皿中加入10mL的BufferIII和100μL的显色底物，显色底物的量根据样品数量而定，将尼龙膜放入其中显色，显色完成后，加入去离子水终止显色反应，观察实验结果。25 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别3试验结果3.1先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响3.1.1MDV毒株GX0101以及ALV-J毒株NX0101含量测定结果对培养至第7天和第9天的GX0101病毒数出每孔中的蚀斑数。根据两次的结果计算出原始液体GX0101的病毒含量为2.5×105PFU/mL；对培养9天后的ALV-J病毒，取细胞上清用ELISA的方法检测p27，计算得出ALV-J的细胞半数感染量为TCID4.050=10/100μL。3.1.2SPF鸡的死亡率及肿瘤发生率整个试验过程中，第5组鸡只未发生死亡；第3组死亡1只，剖检无眼观肿瘤出现，试验结束后，剖检存活鸡只均正常；第4组死亡13只（图6），比例为13/35，其中，2只鸡肝脏出现明显肿瘤，试验结束后，剖检存活鸡发现1只鸡肝脏出现明显肿瘤、肾脏肿大，1只鸡脾脏出现明显肿瘤（图4），取病变组织做切片镜检可观察到病理变化（图5）。第1组在整个试验过程中死亡2只鸡，剖检无眼观病变。第2组在整个试验过程中共死亡7只鸡（图6），剖检死亡鸡只，其中1只鸡肝脏出现肿瘤（图3），取病变组织做切片镜检可观察到病理变化（图5），90日龄后，剖检存活鸡均正常。试验结束后，CVI988/Rispens疫苗能够提供97.1%的保护效果，但先天感染ALV-J后，CVI988/Rispens疫苗仅能提供77.1%的保护效果（表4）。表4CVI988/Rispens疫苗的免疫保护效果Table4ProtectiveefficacyofCVI988/RispensagainstchallengeofvvMDVGX0101inSPFchickens.组别疫苗攻毒死亡率肿瘤率病变率PIGroupsVaccinesChallengedMortalityTumorsrateLesions1CVI988/RispensALV-J5.7%05.7%―2CVI988/RispensALV-J+GX010120%2.9%22.9%77.1%3CVI988/RispensGX01012.9%02.9%97.1%4―GX010137.1%11.4%100%―5CVI988/Rispens―――――26 山东农业大学硕士学位论文图3第2组GX0101攻毒后鸡出现神经症状，死亡鸡肝脏出现肿瘤Fig.3NerveparalysisandlivertumorofcongenitalinfectionwithALV-JandCVI988/Rispens-immuneGX0101-challengedchicken图4GX0101攻毒组死亡鸡只剖检时出现肝脏、脾脏肿瘤Fig.4LivertumorandspleentumorofchickenchallengedwithGX0101AB图5肝脏病理组织切片（A先天感染ALV-J，CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组；BGX0101攻毒组）Fig.5Grosslesionsandhistologicallesionsofliver(A:CongenitalinfectionwithALV-JandCVI988/Rispens-immuneGX0101-challengedgroup;B:challengedwithGX0101group)27 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别图6SPF鸡各组死亡曲线Fig.6MortalitycurveoftheSPFchickens3.1.3SPF鸡各组体重对所有组别鸡只在GX0101攻毒后第1、2、3、4、5、6周进行称重，结果显示（表5，图7），3组和5组体重没有显著差异(P>0.05)，第4组体重显著低于3、5两组(P<0.05)，表明CVI988/Rispens疫苗能够保护SPF鸡不因感染GX0101而降低体重。1、3两组在1、2、3、4周时体重显著差异(P<0.05)，此后，随着日龄增长，两组体重差距变小。第2组在整个称重期间体重均比第3组低，呈现显著差异(P<0.05)，在2、3、4周体重显著低于第1组(P<0.05)，表明先天感染ALV-J显著抑制了CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒鸡体重的增重。表5GX0101攻毒后各组SPF鸡平均体重Table5Thebodyweightofchickensineachgrouppost-infectionwithGX0101组别1周2周3周4周5周6周Groups1week2week3week4week5week6weekALV-J+CVI98887.50±13.29a141.04±24.20b203.05±30.78b278.05±39.06b359.00±36.63bc461.37±44.52bcALV-J+CVI98883.21±12.85a127.05±17.64a185.97±29.06a255.91±41.61a338.00±35.63ab445.59±30.58b+GX0101CVI988+GX010194.73±9.36b153.40±15.90c220.18±26.53c304.16±35.62c383.59±37.12cd479.82±41.87cGX010188.70±8.64a132.39±14.62ab182.65±34.66a249.83±36.31a314.25±35.20a388.21±41.69aCVI98895.46±8.95b152.41±16.77c214.50±30.36bc300.84±26.92c389.20±36.16d481.84±37.51c*每列中字母相同者表示差异未达显著水平(P0.05)，字母不同者表示差异达显著水平(P0.05)Thesamealphabetsinrightsideofthesamelistshownosignificance(P0.05),onthecontrary,havingsignificance(P0.05)28 山东农业大学硕士学位论文图7GX0101攻毒后各组SPF鸡平均体重Fig.7Thebodyweightofchickensineachgrouppost-infectionwithGX0101注：图中字母相同者表示差异未达显著水平(P0.05)，字母不同者表示差异达显著水平(P0.05)Note:Thesamealphabetsinfigureshownosignificance(P0.05),onthecontrary,havingsignificance(P0.05)3.1.4SPF鸡AIV-H9疫苗免疫后抗体水平测定所有组别鸡只在10日龄时免疫AIV-H9灭活油乳疫苗，在免疫后3、4、5周采血检测AIV-H9抗体水平。结果表明，相比于第3组，第2组AIV-H9的抗体水平显著降低(P<0.05)。同时，免疫后4、5周，第2组的AIV-H9的抗体水平显著低于第1组(P<0.05)。疫苗免疫后3、4、5周，第3组的AIV-H9的抗体水平与第5组没有显著差异(P>0.05)（表6，图8）。表6SPF鸡各组AIV-H9抗体水平Table6TheantibodyresponsetovaccinationwithAIV–H9inactivatedvaccines组别3周4周5周Groups3week4week5weekALV-J+CVI988/Rispens4.50±0.80a5.00±1.11b5.38±0.77bALV-J+CVI988/Rispens+GX01014.11±0.89a4.27±0.70a4.79±0.80aCVI988/Rispens+GX01015.29±0.91b5.59±0.80bc6.14±0.99cGX01014.13±0.92a4.23±0.83a4.44±0.63aCVI988/Rispens5.54±0.83b5.82±1.05c6.21±0.88c*表中相同字母表示差异不显著(P0.05)，不同者表示差异显著(P0.05)Thesamealphabetsshownosignificance(P0.05),onthecontrary,showingsignificance(P0.05)29 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别图8SPF鸡各组AIV-H9抗体水平Fig.8TheantibodyresponsetovaccinationwithAIV–H9inactivatedvaccines注：图中字母相同者表示差异未达显著水平(P0.05)，字母不同者表示差异达显著水平(P0.05)Note:Thesamealphabetsinfigureshownosignificance(P0.05),onthecontrary,havingsignificance(P0.05)3.1.5SPF鸡NDV疫苗免疫后抗体水平测定所有组别鸡只在10日龄时免疫NDV灭活油乳疫苗，在免疫后3、4、5周采血检测NDV抗体水平。由表6可知，免疫后3、4、5周，第2组的NDV的抗体水平显著低于第3组(P<0.05)。免疫后第4周，第2组的NDV的抗体水平显著低于第1组(P<0.05)。疫苗免疫后3、4、5周，第3组的NDV的抗体水平与第5组没有显著差异(P>0.05)（表7，图9）。表7SPF鸡各组NDV抗体水平Table7TheantibodyresponsetovaccinationwithNDVinactivatedvaccines组别3周4周5周Groups3week4week5weekALV-J+CVI988/Rispens4.38±1.15bc5.06±0.57b4.75±0.77aALV-J+CVI988/Rispens+GX01014.13±0.81ab4.25±1.13a4.5±1.21aCVI988/Rispens+GX01015.00±0.73c5.25±0.68b5.5±0.89bGX01013.50±1.03a4.13±1.41a3.88±0.81aCVI988/Rispens5.13±0.62c5.50±0.73b5.38±0.89b*表中相同字母表示差异不显著(P0.05)，不同者表示差异显著(P0.05)Thesamealphabetsshownosignificance(P0.05),onthecontrary,showingsignificance(P0.05)30 山东农业大学硕士学位论文图9SPF鸡各组NDV抗体水平Fig.9TheantibodyresponsetovaccinationwithNDVinactivatedvaccines注：图中字母相同者表示差异未达显著水平(P0.05)，字母不同者表示差异达显著水平(P0.05)Note:Thesamealphabetsinfigureshownosignificance(P0.05),onthecontrary,havingsignificance(P0.05)3.1.6SPF鸡中枢免疫器官指数GX0101攻毒后第7天，每组剖检5只鸡，称量体重、胸腺、法氏囊，计算相对免疫器官指数。由表8可知，与第3组相比，第2组的胸腺、法氏囊发生明显萎缩，两组差异显著(P<0.05)。同时，1、2两组胸腺的免疫器官指数差异显著(P<0.05)。表8SPF鸡各组免疫器官指数Table8Theresultsofrelativeimmuneorgansweight组别体重(g)胸腺(%)法氏囊(%)GroupsBodyweightThymusBursaALV-J+CVI988/Rispens87.89±2.47ab0.29±0.07b0.22±0.02abALV-J+CVI988/Rispens+GX010185.17±3.38a0.18±0.06a0.19±0.06aCVI988/Rispens+GX010194.64±3.48b0.32±0.02b0.28±0.05bGX010186.57±6.47ab0.15±0.05a0.19±0.01aCVI98896.21±6.10bc0.35±0.11b0.27±0.05b*表中相同字母表示差异不显著(P0.05)，不同者表示差异显著(P0.05)Thesamealphabetsshownosignificance(P0.05),onthecontrary,showingsignificance(P0.05)31 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别3.1.7SPF鸡GX0101病毒增殖动态GX0101攻毒后第5、10、14、21、28天，对2、3、4三组每组随机选取6只鸡采集抗凝血提取淋巴细胞DNA，利用GX0101病毒特有的REV-LTR片段设计引物，进行荧光定量PCR。结果显示，第4组的淋巴细胞GX0101病毒含量不断升高，第3组GX0101病毒含量在第14天达到最高，随后开始下降，而第2组的GX0101病毒含量呈现逐渐上升趋势，在第14、21、28天显著高于第3组(P<0.05)（图10）。图10GX0101接种病毒在SPF鸡体内的增殖动态Fig.10ReplicationkineticsofMDVGX0101inchickens注：图中字母相同者表示差异未达显著水平(P0.05)，字母不同者表示差异达显著水平(P0.05)Note:Thesamealphabetsinfigureshownosignificance(P0.05),onthecontrary,havingsignificance(P0.05)3.2不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立3.2.1PCR方法对MDVmeq基因缺失疫苗SC9-1与商品化疫苗的鉴别结果以SC9-1以及商品化MD疫苗CVI988/Rispens株、814株、HVTFc-126株提取的DNA为模板进行PCR扩增。以F1/R1作为引物，结果显示，以CVI988/Rispens株、814株DNA为模板，均能扩增出1297bp条带（图11A），HVTFc-126株DNA为模板无任何条带（图11A），以SC9-1株DNA为模板均能扩增出184bp条带（图11A）。以F2/R2作为引物，结果显示，以CVI988/Rispens株、814株DNA为模板，均能扩增出746bp条带（图11B），以SC9-1株、HVTFc-126株DNA为模板均无条带（图11B）。以F3/R3作为引物，结果显示，以CVI988/Rispens株、814株、HVTFc-126株DNA为模板，均32 山东农业大学硕士学位论文无任何条带出现（图11C），以SC9-1株DNA为模板，扩增出512bp条带（图11C）。分别对三对引物的PCR扩增产物进行测序，测序结果均正确。图11MDVmeq基因缺失疫苗株SC9-1与商品化疫苗的鉴别PCR扩增结果Fig.11PCRamplificationofMDVmeq-deletedvaccineSC9-1andothercommercialvaccinestrains注：A:引物F1/R1的扩增结果.B:引物F2/R2的扩增结果.C:引物F3/R3的扩增结果.Note:A:PCRamplificationoffourvaccinestrainsDNAusingprimerF1/R1.B:PCRamplificationoffourvaccinestrainsDNAusingprimerF2/R2.C:PCRamplificationoffourvaccinestrainsusingprimerF3/R3.M:DNAmarker;1–7:SC9-1;8:CVI988/Rispens;9:814;10:HVT;11:CEFDNA;12:ddH2O.3.2.2核酸斑点杂交方法对MDVmeq基因缺失疫苗SC9-1与商品化疫苗的鉴别结果3.2.2.1探针标记结果将标记好的meq(569bp)、REV-LTR(512bp)探针与普通dNTP扩增的meq、REV-LTR条带进行核酸电泳（图12），从电泳图谱上看，明显滞后于普通的dNTP扩增产物条带，表明标记成功。33 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别图12meq、REV-LTR核酸探针标记结果Fig.12Nucleicacidprobelabelingresultsofmeq、REV-LTR注：1和3是探针标记后条带(1:meq;3:REV-LTR);2和4是普通dNTP条带(2:meq;4:REV-LTR)Note:1and3areprobesamplifiedbydigoxigenin-labeledPCR(1:meq;3:REV-LTR);2and4aretheresultofconventionalPCR(2:meq;4:REV-LTR);M,2000DNAmarker3.2.2.2核酸斑点杂交结果以SC9-1以及商品化MD疫苗CVI988/Rispens株、814株、HVTFc-126株病毒DNA作为模板进行核酸斑点杂交鉴定。以地高辛标记的meq基因片段作为探针进行检测，CVI988/Rispens株、814株病毒DNA（图13A），以及GX0101BAC质粒DNA、敲除REV-LTR片段的GX0101ΔLTRBAC质粒DNA均显示阳性结果（图13A），而敲除meq基因的SC9-1BAC质粒DNA以及SC9-1株病毒DNA均没有显示颜色（图13A）；HVTFc-126株病毒DNA没有显示颜色（图13A）。以地高辛标记的REV-LTR基因片段作为探针进行核酸斑点杂交检测，GX0101BAC质粒DNA、敲除meq基因的SC9-1BAC质粒DNA以及SC9-1株病毒DNA均显示阳性结果（图13B）；而敲除REV-LTR片段的GX0101ΔLTRBAC质粒DNA以及CVI988/Rispens株、814株、HVTFc-126株病毒DNA均没有显示颜色（图13B）。34 山东农业大学硕士学位论文图13MDVmeq基因缺失疫苗株SC9-1与商品化疫苗的鉴别核酸斑点杂交结果Fig.13Dot-blothybridizationofMDVmeq-deletedvaccinestrainsSC9-1andothercommercialvaccinesusingprobesspecificforthemeqgeneandREV-LTRsequence注:A:以meq基因片段为探针的核酸斑点杂交.B:以REV-LTR基因片段为探针的核酸斑点杂交.Note:A:Nucleicdot-blothybridizationoffourvaccinestrainsusingprobesspecificforthemeqgene.B:Nucleicdot-blothybridizationoffourvaccinestrainsusingprobesspecificfortheREV-LTRsequence.1–7:SC9-1;8:CVI988/Rispens;9:814;10:HVT;11:GX0101BAC;12:SC9-1BAC;13:GX0101ΔLTRBAC.35 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别4讨论4.1先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响马立克病是由马立克病病毒引起的一种鸡的免疫抑制病，病毒可经空气、灰尘传播，具有较强的传染力，给鸡群带来严重危害。MD疫苗由非致病性的III型MDVHVTFc-126株逐渐发展到传代致弱的I型MDCVI988/Rispens株。目前，国内鸡群使用最普遍的是CVI988/Rispens株疫苗，该疫苗的广泛使用有效控制了鸡群MD的爆发。然而，随着疫苗的使用，MDV的毒力近年来呈现逐渐增强的趋势，国内免疫鸡群多次发生MD野毒感染。研究发现发病鸡群常伴随其它ALV、CIAV、REV等免疫抑制病毒感染的现象（张洪海等，2009；秦立廷等，2010；王波等，2014），其中感染ALV对MD爆发的影响越来越引起人们的重视。ALV是一种具有较强免疫抑制活性的致瘤性反转录病毒，共分A到J十个亚群，其中，J亚群流行广泛、致病性较强，给我国养禽业特别是蛋鸡行业造成严重影响。家禽感染禽白血病后可以引起许多具有传染性的良性肿瘤或恶性肿瘤(Dongetal.,2015)，ALV-J因易受外界环境影响，其横向传播能力较弱，在流行上多为垂直传播，主要通过感染的母鸡垂直感染鸡胚，鸡先天感染后，导致持久的免疫耐受，抗体显阴性，雏鸡出现病毒血症。因此，ALV-J的这种流行病学特点为与其他免疫抑制病原共同感染鸡群提供可能。本研究利用SPF鸡模拟探究先天感染ALV-J对MD疫苗免疫保护效果的影响。对试验结果分析，先天感染ALV-J增加了CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒鸡的死亡率和肿瘤率，1、2、3、4、5各组鸡的死亡率分别为：5.7%、20%、2.9%、37.1%、0%；CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组与CVI988/Rispens免疫组相比较，其体重、AIV-H9与NDV的抗体水平以及免疫器官指数均无显著差异(P>0.05)，表明CVI988/Ripens疫苗能够对感染GX0101的SPF鸡提供较好的免疫保护。然而，先天感染ALV-J同时CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组鸡与CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组鸡相比，体重显著降低(P<0.05)，引起胸腺和法氏囊的萎缩(P<0.05)，显著抑制感染鸡AIV-H9、NDV抗体的产生(P<0.05)。同时，CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组的GX0101拷贝数在第14天出现高峰，随后开始下降。而先天感染ALV-J、CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组GX0101的拷贝数在检测时期呈不断上升趋势，且在第14、21、28天均显著高于CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组。由此，先天感染ALV-J能够降低CVI988/Rispens36 山东农业大学硕士学位论文疫苗对GX0101超强毒的免疫保护效果，增强其在鸡体内的复制水平以及致病性，这或许表明先天感染ALV或其他免疫抑制病原是不断发生MD的原因之一。因此，为了增进对鸡群MD的防控，要加强对鸡群ALV、CIAV、REV等免疫抑制病毒的检测和净化。据国内外报道，目前养鸡业普遍存在两种甚至是多种免疫抑制性病毒的共同感染，在过去的二十年里，虽然很多种鸡场已开始ALV-J的净化工作，但仍有地方品系鸡感染ALV-J的报道，这就要求种鸡场实施更为严格的净化措施（崔治中，2015），采取多种检测方法检测ALV等免疫抑制病毒。总之，本研究利用SPF鸡模拟先天感染ALV-J对CVI988/Rispens疫苗免疫保护效果的影响，探究国内MD频发的原因，为更好防控MD提供理论依据，为其他免疫抑制病感染的研究提供借鉴。4.2不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立马立克病是目前世界上唯一能用疫苗预防的禽病毒性肿瘤病。马立克病病毒三种血清型基因组结构相似，但是基因组成员具有较大差异。I型MDV野毒的meq基因编码339个氨基酸，但是在CVI988/Rispens疫苗株、814疫苗株中meq基因有一段177bp的插入序列，导致编码富含脯氨酸结构域的阅读框发生移位(Biggsetal.,1965;Lampertetal.,1977)，使I型MDV野毒株与疫苗株的meq基因片段大小有所不同。HVTFc-126株属于血清III型，CVI988/Rispens株是目前国内鸡群最普遍使用的疫苗。近年来随着MDV毒力的不断增强，国内外学者正在研究比CVI988/Rispens具有更好免疫效果的疫苗。SC9-1株是在其亲本病毒GX0101的感染性克隆bac-GX0101基础上，利用同源重组技术敲除meq基因，并进一步敲除卡那霉素抗性基因，构建的新型MD疫苗(孙爱军，2009；李延鹏，2010；苏帅，2013)。SC9-1疫苗经过大量的临床试验已经证实其生物安全性，并且不再具备致病性和致肿瘤性，具有良好的免疫保护效果，是一株理想的新型疫苗株，可以期待未来在鸡群免疫中的应用（段伦涛等，2014；Suetal.,2015,2016）。同其余疫苗株相比，SC9-1基因组中含有一段独特的REV-LTR序列，该序列的插入增强了其横向传播能力(Sunetal.,2009)。REV-LTR片段能够在SC9-1基因组中稳定遗传(Sunetal.,2009,2010)，因此可以作为检测SC9-1株的分子标志。为了便于对SC9-1与其它疫苗株进行鉴别，我们在基因组序列分析的基础上，分别建立了PCR扩增和核酸斑点杂交的检测方法。首先，我们根据SC9-1基因组结构的meq基因缺失以及REV-LTR插入片段的独特特点，设计三对引物进行PCR扩增。引物F1/R1位于GX0101meq基因的外侧，扩增包含完整meq基因的MDV基因片段，以四种疫苗株DNA为模板，CVI988/Rispens株、814株均能扩增出完整meq基因片段，HVTFc-12637 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别株没有条带，SC9-1株仅能扩增出包含FRT位点的184bp条带；引物F2/R2位于GX0101meq基因内，扩增meq基因的部分基因片段，以四种疫苗株DNA为模板，CVI988/Rispens株、814株均能扩增出746bp条带，SC9-1株、HVTFc-126株均不能扩增出条带；引物F3/R3扩增GX0101基因组中独特的REV-LTR重组片段，以四种疫苗株DNA为模板，CVI988/Rispens株、814株、HVTFc-126株均没有条带扩增，只有SC9-1株能够扩增出512bp条带。以上结果表明三对引物可以快速有效的区别SC9-1与I型MD疫苗CVI988/Rispens株、814株以及III型MD疫苗HVTFc-126株。同时，斑点杂交方法具有反应灵敏、特异性高等优点，因此，我们又建立了以F2/R2、F3/R3为引物合成地高辛标记的meq(569bp)、REV-LTR(512bp)基因片段作为探针的斑点杂交方法，对SC9-1与CVI988/Rispens株、814株、HVTFc-126株MD疫苗进行鉴别，都可以达到预期理想的结果，说明利用特异性地高辛探针也能够准确区别SC9-1疫苗与CVI988/Rispens株、814株、HVTFc-126株MD疫苗。总之，本研究基于SC9-1株基因组中特有的REV-LTR片段和缺失meq基因的分子标志，建立的PCR扩增和核酸斑点杂交方法，能够有效区别SC9-1株与市场其他MD疫苗株。该方法简便快捷、迅速灵敏，可操作性强。同时也进一步为SC9-1疫苗免疫后，对MD野毒感染的检测方法及其病毒增殖动态的追踪提供参考思路和奠定理论基础。38 山东农业大学硕士学位论文5结论1、本研究通过对鸡胚卵黄囊接种ALV-J，试验表明先天感染ALV-J降低了CVI988/Rispens疫苗对GX0101超强毒的免疫保护效果，增强了GX0101的复制水平以及致病性，这或许表明先天感染ALV或其他免疫抑制病原是不断发生MD的原因之一。2、本研究基于SC9-1株基因组中特有的REV-LTR片段和缺失meq基因的分子标志，建立的PCR扩增和核酸斑点杂交方法，能够有效区别SC9-1株与CVI988/Rispens株、814株、HVTFc-126株MD疫苗。39 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别6参考文献崔治中.我国J亚群禽白血病的防控及其启示.中国家禽,2015,37(6):1-3成子强,张利,刘思当,张玲娟,崔治中.中国麻鸡中发现禽J亚群白血病.微生物学报,2005,45(4):584-587杜岩,崔治中,秦爱建.从市场商品肉鸡中检出J亚群禽白血病病毒.中国家禽学报,1999,3(1):1-4杜岩,崔治中,秦爱建,RFSilve,LFlee.鸡的J亚群白血病病毒的分离及部分序列比较.病毒学报,2000,16(4):341-346段伦涛,苏帅,王一新,李思菲,孙鹏,陈文青,崔治中.敲除Meq基因的重组鸡马立克氏病毒与CVI988/Rispens疫苗株免疫保护效力的比较.微生物学报,2014,54(11):1353-1361段伦涛.敲除Meq基因的重组鸡马立克氏病毒与CV1988/Rispens疫苗株免疫保护效力的比较研究.山东农业大学硕士学位论文,2014竭航.马立克氏病毒对鸡淋巴器官Toll样受体通路基因表达量的影响.四川农业大学硕士学位论文,2013李延鹏.马立克氏病病毒meq基因缺失株生物学特性及其免疫效果研究.中国农业科学院博士毕业论文,2010秦立廷,高玉龙,潘伟,邓小芸,孙芬芬,李凯,祁小乐,高宏雷,刘超男,王笑梅.我国部分地区蛋鸡群ALV-J及与REV、MDV、CAV混合感染检测.中国预防兽医学报,2010,32(2):90-93施维松,刘长军,张艳萍,秦运安,张晓巍,李晶梅,陈洪岩.4株鸡马立克氏病病毒国内分离株Meq基因的克隆与序列分析.病毒学报,2008,24(2):117-124孙贝贝,不同日龄SPF鸡感染ALV-J后病毒血症和抗体反应的动态比较.山东农业大学硕士学位论文,2009苏帅,李延鹏,孙爱军,赵鹏,丁家波,朱鸿飞,崔治中.敲除meq的鸡马立克氏病毒强毒株对超强毒的免疫保护作用.微生物学报,2010,50(3):380-386苏帅,重组马立克氏病毒及其突变株生物学活性的比较研究.山东农业大学博士毕业论文,2013孙爱军,PetherbridgeL,ZhaoYG.带有REV-LTR片段的MDV野毒株GX0101BAC克隆的构建及拯救病毒的致病性分析.科学通报,2009,54(11):1541-4640 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山东农业大学硕士学位论文7致谢三年的硕士研究生生活即将划上句号，这三年的求学生涯在导师、亲友、同学的支持与帮助下我收获颇丰。首先我要衷心感谢我的导师崔治中教授，导师年逾古稀，却依然兢兢业业、身体力行。指导我科研，关心我学习，关怀我生活，能师从崔老师是我的荣幸，师恩厚重，铭记在心，在此表示我诚挚的敬意和感谢，衷心祝愿恩师幸福安康、万事顺遂！衷心感谢赵鹏副教授、苏帅老师、常爽老师、王一新老师以及动物科技学院所有老师在我攻读硕士期间给予的帮助和鼓励！衷心祝愿老师们身体健康、工作顺利！感谢家禽肿瘤病实验室孟凡峰等博士师兄以及孙鹏、崔贺、苏红芹、李思菲、陈俊霞、房立春、栾怀彪、许书珍等硕士师兄师姐在我求学过程中给予的帮助！感谢我的同级张言坤、崔帅、任志浩、刘英楠、李晓晗、赵颖洁、吕艳艳、付佳媛以及田似报、任衍倍、李秋辰、董桂伟、苏奇、张玉标、张亚文、张智慧、柳晓峰、甄岳等兄弟姐妹的大力协助！感谢动物科技学院预防兽医平台的王淑静老师和家禽肿瘤病实验室的科研辅助人员孙文丽、鲁金、吕汉英等人对我的实验给予的帮助！最后，我要特别感谢我的家人在我求学生涯中给予的物质和精神的支持，感谢好友对我的激励，你们始终是我最坚强的后盾，是我砥砺前行最有力的盔甲！衷心感谢帮助鼓励我的每一个人！感恩！49 先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别8攻读学位期间发表论文情况韩妮,张言坤,陈俊霞,苏帅,赵鹏,崔治中.马立克病病毒基因缺失疫苗与商品化疫苗的分子鉴别方法[J].病毒学报,2017,33（04）:598-603张言坤,韩妮,孙鹏,陈俊霞,苏帅,赵鹏,崔治中.马立克氏病毒meq基因缺失株SC9-1通过自然重组获得meq能力的分析[J].病毒学报,2017,33(01):89-95陈俊霞,韩妮,张言坤,孙鹏,周忠文,苏帅,崔治中.不同代次缺失meq基因的重组马立克病毒SC9-1株主要基因序列同源性分析.中国兽医学报,2017,37(05):804-810.ZhangY,CuiN,HanN,WuJ,CuiZ,SuS.DepressionofVaccinalImmunitytoMarek'sDiseasebyInfectionwithChickenInfectiousAnemiaVirus.FrontMicrobiol,2017,8:1863.50