先天性心脏病伴染色体异常患儿相关致病区段分析

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上海交通大学医学院硕士学位论文先天性心脏病伴染色体异常患儿相关致病区段分析作者姓名：蒲田指导教师：陈笋副教授导师组成员：杨健萍、徐让白海涛、白凯学科专业：儿科学研究方向：小儿心血管基金项目：国家自然科学基金（81070135）培养单位：新华医院申请学位：硕士学位学号：1127229326答辩日期：2015年5月8日 TheMasterDegreeDissertationofShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicineAnalysisofrelevantpathogenicregionsinpatientswithcongenitalheartdiseaseandchromosomeabnormalityAuthorname:TianPuSupervisor:SunChen,AssociateProfessorMentormembers：JianpingYang、RangXuHaitaoBai、KaiBaiAcademicMajor:DepartmentofPediatricCardiovascularResearchfield:CardiovasculardiseaseFunding:NationalNaturalScienceFoundationofChina（81070135）Institute:XinhuaHospitalDegreeApplied:MasterDegreeStudentNumber:1127229326OralDefense:08/05/2015 上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：2015年5月11日 上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：2015年5月11日日期：2015年5月11日 上海交通大学医学院硕士学位论文摘要背景与目的先天性心脏病是婴幼儿最常见的出生缺陷疾病，通常伴发其他脏器器官的畸形。在先天性心脏病伴有染色体异常的患儿中，存在拷贝数变异的患儿比例约占25%，因此明确染色体异常的病因对提高先天性心脏病患儿生存率和生存质量有着重要意义。确定患者携带的染色体缺失或重复区域，并从中筛选出与其临床特征相符合的候选致病基因，从而对相应的临床表型进行解释。方法临床上收集2例先天性心脏病伴有染色体异常患者，通过染色体核型分析、AgilentCGHArray4×180K芯片分析、AffymetrixCytoScanHD芯片分析和Real-timePCR技术确定患者是否存在染色体结构或数目异常和拷贝数变异。利用全外显子测序技术检测患者基因组编码区可能存在的基因突变。根据OMIM和Pubmed数据库，筛选出和临床表型可能相关的候选致病基因进行分析。结果1、两个患者染色体核型分析结果显示均存在染色体异常，染色体核型分别46,XX,del(9)(q31.1q32)和45,XY,der(13)t(13;18)(p12;q11.2)。2、AgilentCGHArray4×180K芯片结果显示患儿1存在9q31.1-q32(105190105-117195154)区域缺失，其长度为12.01Mb，AffymetrixCytoScanHDAssay芯片结果显示患儿2存在18p11.32-q11.1(136226-18529578)区域缺失，长度为18.393Mb，并且13号染色体和18号染色体发生易位。3、Real-timePCR验证结果显示患者1携带SMC2，CTNNAL1和DFNB31基因缺失，患者2携带TYMS和TGIF1基因缺失。4、全外显子检测结果显示患者1不存在已知候选基因NIPBL、SMC1A、SMC3、MRPS22、RAD21和HDAC8基因突变。结论1、本研究通过染色体核型分析、aCGH芯片技术、CytoScanHD芯片技术确定了两个患者的染色体缺失区域，并且筛选出和临床特征相关的候选基因。2、通过对9q21-q34区段缺失患者的临床表征进行比对，发现他们的临床表现和CdL综合征相似。3、首次把SMC2基因和CdL综合征缺失联系起来。4、推测18p染色体缺失患者其心脏表型可能和TYMS基因相关。关键词先天性心脏病，染色体异常，9q缺失，SMC2基因，18p缺失，TYMS基因 上海交通大学医学院硕士学位论文AbstractCongenitalheartdisease(CHD)isthemostcommontypeofbirthdefect.CHDoftenoccursinassociationwithotherbirthmalformations.25%ofchildrenwithCHDandadditionalmalformationshadabnormalcopynumberchanges,therefore,itisveyimportanttoconfirmthepathogenesisofchromosomeabnormalityforimprovingsurvivalrateandthequalityoflife.ObjectiveToidentifythedeletionsorduplicationsregionsofchromosomeandscreenforpathogenicgeneswhichconformwithclinicalfeatures.Toexplorethecorrelationbetweenthecandidategenesandthephenotype.MethodsWehavecollectedtwopatientsfromtwofamilies.Toidentifythechromosomeabnormalityandcopynumbervariations,weinvestigatedtheprobandsbykaryotyping,AgilentCGHArray、AffymetrixCytoScanHDandreal-timePCR.Furthermore,weusedwholeexomesequencingtodetectthegenemutations.AccordingtothedatabaseofOMIMandPubmed,relavantcandidategenesrelatedwithclinicalcharacteristicwereselected.Results1.Karyotypingofthemembersinthetwofamilyshowedabnormalities,46,XX,del(9)(q31.1q32)and45,XY,der(13)t(13;18)(p12;q11.2),respectively.2.ResultsofAgilentCGHArray4×180Kshowedadeletionof9q31.1-q32(105190105-117195154),andthedeletionlengthis12.01Mb.ResultsofAffymetrixCytoScanHDAssaydemonstratedadeletionof18p11.32-q11.1(136226-18529578),thedeletionlengthis18.393Mb.3.qPCRshowedthatpatient1carriedSMC2、CTNNAL1andDFBN31genedeletion,andpatient2carriedTYMSandTGIF1genedeletion.4.Wholeexomesequencingdemonstratedthatpatient1didnotcarrycandidategenemutations,suchasNIPBL、SMC1A、SMC3、MRPS22、RAD21andHDAC8gene.Conclusion1.Inthisstudy,weidentifiedtwodeletionregionsoftwochromosomeabnormalitiespatientsbykaryotyping,AgilentCGHArray,CytoScanHDandwholeexomesequencing,andselectedseveralgeneswhichisrelatedtosomeclinicalfeatures.2.Thecomparisonofourpatientwith11previouslyreportedcaseswithpartiallyoverlappingdeletionsshowedsimilarphenotypes,andthesephenotypesaresimilartothoseofCdLS.3.Inthisstudy,wefirstlinkSMC2geneand 上海交通大学医学院硕士学位论文CdLsyndrome.4.WespeculatedthecardiacphenotypeiscorrelatedwithTYMSgenein18pchromosomedeletion.Keywordscongenitalheartdisease,chromosomeabnormality,9qdeletion,SMC2gene,18pdeletion,TYMSgene. 上海交通大学医学院硕士学位论文目录中英文缩略语.......................................................1绪论..............................................................4第一章一例9q中间区域缺失患儿致病区段分析..........................7引言...............................................................71.材料与方法.......................................................81.1主要试剂与材料...............................................81.1.1基因组DNA抽提试剂.......................................81.1.2染色体核型分析试剂.........................................81.1.3AgilentCGHArray4×180K芯片...............................81.1.4Real-timePCR试剂..........................................81.2实验仪器、器械及耗材.........................................81.3研究对象....................................................91.4实验方法....................................................91.4.1外周血基因组DNA抽提.....................................91.4.2外周血细胞培养及染色体核型分析............................101.4.3AgilentCGHArray4×180K芯片..............................111.4.4引物设计.................................................121.4.5PCR反应检测引物特异性以及确定引物退火温度................121.4.6SMC2、CTNNAL1、DFBN31基因和GAPDH基因引物效率测定..131.4.7Real-timePCR验证.........................................131.4.8全外显子测序分析..........................................132实验结果.........................................................142.1患者信息...................................................142.2染色体异常分析结果.........................................16 上海交通大学医学院硕士学位论文2.3与该患儿缺失区域重叠的11例患者进行临床表型及缺失区域分析...162.4CNVs分析结果...............................................192.4.1DNA质检结果.............................................192.4.2AgilentCGHArray4×180K芯片结果分析......................192.5qPCR验证结果..............................................212.6全外显子测序结果...........................................212.6.1测序文库质检..............................................212.6.2测序结果质控..............................................222.6.3序列比对信息..............................................222.6.4捕获富集分析..............................................232.6.5全外显子测序分析结果......................................233讨论.............................................................243.19q21-q34区段缺失患者临床特征相似..........................243.2与CdLS相似的几种综合征表现................................263.39q31.1-q32区段缺失患者候选基因SMC2.......................273.49q31.1-q32区段缺失患者候选基因DFNB31....................283.59q31.1-q32区段缺失患者候选基因CTNNAL1....................29第二章一例18P缺失综合征患儿致病区段分析..........................30引言..............................................................301.资料与方法.....................................................311.1主要试剂与材料..............................................311.1.1基因组DNA抽提试剂......................................311.1.2染色体核型分析试剂........................................311.1.3AffymetrixCytoScanHDAssay芯片...........................311.1.4Real-timePCR试剂盒.......................................311.2主要仪器、器械及耗材........................................311.3研究对象...................................................32 上海交通大学医学院硕士学位论文1.4实验方法...................................................321.4.1外周血基因组DNA抽提....................................321.4.2外周血细胞培养及染色体核型分析............................321.4.3AffymetrixCytoScanHDAssay芯片...........................321.4.4引物设计.................................................351.4.5常规PCR检测引物的特异性和确定引物的退火温度.............351.4.6TYMS基因和TGIF1基因引物效率测定.......................351.4.7Real-timePCR验证.......................................352实验结果.........................................................362.1患者信息...................................................362.2染色体变异分析结果.........................................372.3CNVs分析结果...............................................382.4qPCR验证结果..............................................393讨论............................................................40结论..............................................................43课题局限性........................................................44参考文献..........................................................45致谢..............................................................58学术论文和科研成果目录.............................................61 上海交通大学医学院硕士学位论文中英文缩略语英文缩写英文名称中文全称CHDCongenitalHeartDisease先天性心脏病FISHFluorescenceInSituHybridization荧光原位杂交DSDownSyndrome21-三体综合征ESEdwardsSyndrome18-三体综合征DGSDigerogeSyndromeDigeroge综合征AVSDAtrioventricularSeptalDefect房室间隔缺损VSDVentricularSeptalDefect室间隔缺损ASDAtrialSeptalDefect房间隔缺损PDAPatentDuctusArteriosus动脉导管未闭TOFTetralogyofFallot法洛氏四联症HSA21HumanChromosome21人类21号染色体DORVDoubleoutletrightventricle右室双出口TSTurnerSyndromeTurner综合征1 上海交通大学医学院硕士学位论文BAVBicuspidAorticValve二叶式主动脉瓣ETAElongatedTransversearchofaorta主动脉弓延长CoAAorticCoarctation主动脉缩窄IAAInterruptedAorticArch主动脉弓离断SVASSupravalvularAorticStenosis主动脉瓣上狭窄CNVsCopyNumberVariants拷贝数变异aCGHComparativeGenomicHybridization高通量比较基因组杂交芯片qPCRQuantitativePolymerasechainreaction实时定量荧光PCRCNPsCopyNumberPolymorphic拷贝数多态PFOPatentForamenOvale卵圆孔未闭PAPulmonaryAtresia肺动脉闭锁ASAorticStenosis主动脉瓣狭窄CdLSCorneliadeLangeSyndromeCdL综合征HLHSHypoplasticLeftHeartSyndrome左心发育不良综合征CSSCoffin-SirisSyndromeCoffin-Siris综合征2 上海交通大学医学院硕士学位论文FSFrynsSyndromeFryns综合征RSRobertsSyndromeRoberts综合征SMCStructuralMaintenanceofChromosome染色体结构维持家族CTCFCCTC-bindingfactorCTCF结合因子Autosomalrecessivenon-syndromic常染色体隐性遗传性非综合征耳ARNSHLhearingloss聋HPEHoloprosencephaly前脑无裂畸形PTAPersistentTruncusArteriosus永存动脉干CCSDsCongenitalCardiacSeptalDefect先天性心脏间隔缺损3 上海交通大学医学院硕士学位论文绪论先天性心脏病（congenitalheartdisease，简称先心病）是一类先天性心血管系统发育障碍疾病，主要是由于胚胎在发育过程中心脏、大血管局部解剖结构异常导致。全国每年平均有12～20万先心病患儿出生，是婴幼儿先天性出生畸形中最常见的疾病之一，约占先天性异[1-3]常疾病的1/3。全球先心病的发病率在4‰至12‰范围内波动。Reller报道了1998-2005[4]年间美国亚特兰大地区398140名新生儿的先心病患病率是8.14‰。加拿大先天性疾病检测[5]系统的统计数据表明先心病的发病率为10.4‰。Wu等对台湾地区2000年至2006年间先心[6]病患者发病率进行统计，结果显示发病率是13.08‰。尽管产后心脏干预手段和技术已经在[7-9][8-11]很大程度上提高了先心病患者的预后，但是先心病患者的生存率仍然面临着巨大挑战。先心病病因主要包括遗传因素、环境因素以及母孕因素等方面，其中胚胎期染色体异常、基因突变、母孕年龄、原发疾病、孕期营养不良、低氧环境、电离辐射、微生物感染以及化[12-13]学品和化学药物接触史等均和先心病的发生发展有密切关联。染色体异常是遗传因素中最早发现的病因，直至今天仍然是先心病病因的主要因素之一，约占先心病病因的[14]8%-13%。染色体异常通常是由于染色体发生畸变所致。通过染色体核型分析和荧光原位[15-16]杂交技术（FISH）检测出的染色体异常患者中，多达25%-30%的患儿合并先天性心脏病，其中常见的临床类型有Down综合征(DS)、18-三体综合征(ES)、13-三体综合征、DiGeorge综合征（DGS）和其他染色体综合征等。染色体畸形患儿常见的临床表现为智力发育障碍、精神发育迟滞、特殊面容和机体各系统器官异常等。很多染色体异常综合征都伴发心脏畸形，例如21-三体综合征是染色体异常患儿中最常见的类型之一，除了智力低下、肌张力减退、运动障碍和白血病等常见疾病外，通常还会伴随先心病的发生。Down综合征患儿先心病发[17]病率为40%-65%，同时先心病患儿中10%是由Down综合征引起的。房室间隔缺损（AVSD）[17][18]和室间隔缺损(VSD)是DS患者中最常见的先心病表型，分别约占45%和35%。其他较为常见的类型诸如房间隔缺损（ASD）、动脉导管未闭（PDA）和法洛氏四联症（TOF）则分[19-20]别约占8%，7%和4%。DavidPatterson认为定位在人类21号染色体的某些特定基因和[21]Down综合征的临床表型或表型中的某一方面必然相关。18-三体综合征中心脏缺陷的发病[22-23]率已经高达80%-100%。根据文献统计，ES患者中心脏缺陷的表型呈现多样化，最常见4 上海交通大学医学院硕士学位论文[24-25]的是VSD、PDA以及房室瓣和半月瓣疾病。另有10%的ES患者伴发右室双出口（DORV）[26-28]和心内膜垫缺损，该类型的心脏缺陷可能和ES患者的早期死亡相关。Turner综合征（TS）是一种十分罕见的性染色体异常疾病，通常伴有身材矮小、原发性闭经以及心血管系统异常[29-30][31-33]。在TS患者中，活产婴儿和胎儿发生先心病的比例分别为25%-45%和75%。其中常见的表现主要集中在左心房左心室，包括二叶型主动脉瓣（BAV）、主动脉弓延长（ETA）[34-37]和主动脉缩窄（CoA）。DiGeorge综合征是由于22q11.2的缺失引起的染色体缺陷综合征。通过对22q11.2缺失区域患者进行统计分析，圆锥动脉干畸形、VSD、TOF和主动脉弓[38-40]离断（IAA）均是DGS患者常见的心脏表型。研究发现TBX1基因是导致DiGeorge综[41]合征的关键基因之一，特异性敲除小鼠TBX1基因可导致小鼠圆锥动脉干发育畸形。Williams综合征常见的心血管疾病包括主动脉瓣上狭窄（SVAS）、周围肺动脉狭窄和原发性[42-43]高血压。目前对ELN基因微缺失进行检测已经成为公认的实验室诊断方法。综上所述，明确先心病伴有染色体异常病因有着十分重要意义。近年来随着检测方法及技术的不断发展，染色体异常疾病的诊断也有了质的飞跃。从对患者的临床体征、症状等进行分析，并结合实验室检查完成对患者的表型诊断到从引起疾病的病因入手进行的基因诊断，都在说明染色体异常已经进入了一种全新的诊疗模式。早在20世纪五十年代就已经开展了对染色体异常患儿进行染色体核型的分析工作。染色体核型分析是染色体异常的诊断金标准，但由于细胞培养时间和诊断周期较长，核型分析分辨率偏低，针对片段<5M的缺失和重复无法检测，遂逐渐发展了其他诊断技术弥补其不足。拷贝数变异（CNVs）可以覆盖人类基因组的12%，甚至涵盖了上千个基因，2007年一项研究表明CNVs[44]和20%的人类基因表达变化有关。通常情况下定位在CNV区域的基因表达水平相较于[45]CNV以外的区域有更明显的变化。目前，用于CNVs检测的方法主要是微阵列比较基因[46]组芯片技术（Array-comparativegenomichybridization，aCGH），其中aCGH技术是一种高通量、高分辨率的检测方法，可以用来确定染色体拷贝数的微变化，为染色体异常的病因学研究提供了新思路和新方法。ThienpontB等对60名先心病伴染色体异常患者应用aCGH技术进行检测，发现30%患者存在CNVs，其中有三个CNVs(NKX2.5、NOTCH1和NSD1)是[47]已知的先心病相关基因。CNVs的大小不同，所导致的畸形类型和严重程度也不尽相同。因此对致病区段进行CNVs分析有助于寻找合适的候选致病基因，也可以进一步对临床表型5 上海交通大学医学院硕士学位论文与基因型的关系进行研究。本研究共收集到2个先心病伴染色体异常患儿，一个患儿为9q缺失，缺失长度为12.01Mb，另一个患儿为18p缺失综合征，缺失长度为18.39Mb。为寻找患者可能的致病原因，我们利用染色体核型分析和Agilent公司aCGH芯片及Affymetrix公司的CytoScanHD芯片对两个患儿进行染色体核型和CNVs检测，发现两个患者染色体均存在不同程度的较大片段缺失。同时进行qPCR和全外显子测序等方法进行验证和筛选分析。最终排除可能存在的拷贝数多态（CNPs），利用其CNVs结果进行综合比对筛选出与患儿临床表型一致的可能致病基因。6 上海交通大学医学院硕士学位论文第一章一例9q中间区域缺失患儿致病区段分析引言9号染色体长臂中间缺失是一类十分罕见的染色体异常疾病，目前主要通过传统的细胞遗传学技术进行检测和诊断。早在2002年，Dawson等就通过荧光原位杂交技术（FISH）对[48-49]9号染色体长臂的近端粒区域缺失和重排进行分析。据文献统计，目前仅报道了大约20[49-53][49-50,54]例患者的缺失区段从9q21横跨到9q34，8例患者缺失区段包含在q32至q33中。9q缺失片段无论从缺失长度还是缺失位置来看均各不相同，但这些患者都伴有不同程度的生长发育迟缓、小头畸形、身材矮小、神经系统功能异常、耳位偏低、鼻根低平和上睑下[55]垂。9号染色体长臂缺失还和某些恶性肿瘤疾病的发生相关，Naoto等在胃癌患者中发现[56]9q31.1存在800Kb缺失，无论分化型、未分化型还是胃癌早期该缺失十分常见，这说明定位于该区域的某些基因可能和胃癌的发生发展有关。AngelikaG等对148名肾透明细胞癌患[57]者进行aCGH芯片筛查，发现9q缺失可能是患者发生脑转移的高危因素。Mucciolo指出9q31.1-q31.3区域缺失的患者中常见的临床表型可能和该区域的基因单倍体剂量不足有关，这些患者通常伴有中度智力障碍、异常面容和身材矮小等。我们应该通过长期的随访确定某些代谢性疾病（2型糖尿病、高血压和高胆固醇血症）和心脏表型是否为9q缺失患者的特殊[58]表现。2008年Kulharya发现携带相同缺失区域9q32的患者均出现了不同程度的小头畸形、[50]身材矮小、神经系统异常和发育迟滞。9q缺失患儿约有50%出现先心病，其中心脏表型多样，包括ASD、VSD、卵圆孔未闭(PFO)、TOF、肺动脉闭锁(PA)和主动脉瓣狭窄(AS)可以[58-59]同时出现、而梗阻性肥厚性心肌病、三尖瓣畸形、二尖瓣狭窄和DORV都只是个别报道。目前，对9q中间缺失患儿的诊断主要依靠细胞遗传学技术，由于9q缺失伴有较高比例的先心病，即便患儿没有任何临床表现也需要进行超声心动图检查。同时听力筛查、智力测试和视力检查均为必备检查项目。先心病伴染色体异常或其他心外症状的发病率一直维持在较高比例，近乎一半的染色体[60]异常患儿均检查出先心病，有些研究的患病比例甚至高达79%。这些心外症状对先心病患儿的预后和生存质量产生了严重威胁，但引起这些症状的原因并不十分清楚。本课题从收集的一例9q缺失患者入手，通过染色体异常、基因突变以及拷贝数变异三个角度对患者可能的7 上海交通大学医学院硕士学位论文致病原因进行分析。该研究根据文献报道共收集了11例与该患儿缺失区域重叠的患者进行临床表型及缺失区域分析，缺失区段从9q21横跨到9q34。通过染色体核型分析技术，AgilentCGHArray4×180K芯片技术和全外显子测序技术等手段逐层把患儿的临床表型和某些特定的基因进行关联，从而推测病因为产前遗传咨询提供指导。1.材料与方法1.1主要试剂与材料1.1.1基因组DNA抽提试剂QIAampDNABloodMiniKit（Qiagen公司，德国）包括BufferAL、蛋白酶K、滤柱、集液管、洗脱液AW1和洗脱液AW2，RNA酶，无水乙醇，双蒸水。1.1.2染色体核型分析试剂RPMI-1640液体培养基（Gibco公司，美国）、胎牛血清（Gibco，美国）、无菌DPBS（Hyclone公司，美国）、青霉素、链霉素（碧云天公司，中国）、秋水仙碱、甲醇、冰醋酸、Giemsa染料、0.2%肝素溶液、2%植物凝集素（PHA）溶液（Sigma公司，美国）、2.5%胰酶、1N氢氧化钠、磷酸缓冲液（PH=6.8）、氯化钾低渗液、1N盐酸。1.1.3AgilentCGHArray4×180K芯片本次研究所使用的基因芯片是安捷伦科技有限公司生产，芯片格式为4×180k。共包含170334个探针，其中重复探针有1000个（5倍），内部质控探针为6539个。探针间距为13kb，探针设计参照数据库为UCSChg18（NCBIBuild36，March2006）。1.1.4Real-timePCR试剂®○RSYBRPremixExTaqTM（TliRNaseHPlus）试剂盒(TaKaRa公司，日本）包括2×SYBRTM®2+®PremixExTaq（TaKaRaExTaqHS，dNTPMixture，Mg，TliRNaseH，SYBRGreenI）和50×ROXReferenceDyeII。1.2实验仪器、器械及耗材4℃冰柜（SANYO公司，日本），-20℃冰箱（Thermofish公司，美国），-80℃8 上海交通大学医学院硕士学位论文超低温冰箱（Panasonic，日本），台式高速离心机（Eppendorf5417R，德国），低速冷冻离心机（HitachiLimitedSCR20BA，日本），高速冷冻离心机（Beckman公司，美国），电热恒温水浴箱（康乐，中国），液氮罐（Thermofish公司，美国），CO2培养箱（Thermofish公司，美国），1.5mlEP管（Corning公司，美国），CA-920-4垂直层流洁净工作台（上海净化，中国），倒置显微镜（OLYMPUS），制冰机（SCOTSMAN，美国），超纯水仪Milli-Q和超纯水仪Elix-5（MILLIPORE，美国），ABIVeriti梯度PCR仪（AppliedBiosystems，美国），微量加样枪（Eppendorf公司，德国），ABI7500RealtimePCR仪（AppliedBiosystems，美国）。10cm细胞培养皿（Corning公司，美国），15ml及50ml离心管（Corning公司，美国），Tip枪头（Axygen，美国）、PCR管（Axygen，美国）、离心管（Axygen公司）、HiSeq2500测序仪（Illumina公司），Nanodrop紫外分光光度计（ThermoScientific），漩涡震荡混合器：XW-80A(上海青浦沪西仪器厂，中国)，A2生物安全柜（Thermo公司，美国），剪刀，镊子，酒精灯，采血器材，试管架，吸管，试管架，天平，量筒，烧杯，Marker笔（黑、红），10ml注射器，玻片架，二甲苯，镜油。1.3研究对象该患儿为2013年6月在上海交通大学附属新华医院小儿心血管科就诊的女性患儿，就诊年龄18个月。我们对该患儿进行了详细的临床相关资料收集和家系调查，利用超声心动图检查患儿的心脏结构异常，同时对患儿的智力，听力，视力和其他脏器器官进行检查。抽取患儿及其父母静脉血2ml，抽提全基因组DNA，放置-20℃冰箱备用。1.4实验方法1.4.1外周血基因组DNA抽提（1）2ml全血3000rpm离心5min弃上层血浆，将血细胞分装在1.5mlEP管中，每管400ul。（2）400ul血细胞中加入40ul蛋白酶和8ulRNA酶，涡旋振荡15s，1000rpm低速离心30s。（3）加入400ulAL溶液，上下颠倒混匀，涡旋振荡1min，1000rpm离心30s。（4）56℃水浴恒温箱中3小时。（5）水浴后上下颠倒EP管，观察细胞裂解是否充分，1000rpm低速离心20s。（6）加入无水乙醇400ul。9 上海交通大学医学院硕士学位论文（7）上下颠倒15次，涡旋振荡30s。1000rpm低速离心1min。（8）微量移液器吸取650ul（约1/2）混合液加入滤柱，静置4min，10000rpm高速离心2min弃去滤液。（9）将剩下的1/2混合液（约650ul溶液）加入滤柱，静置4min，10000rpm高速离心2min，弃去滤液。（10）向滤柱中加入500ulAW1洗脱液，静置5min，10000rpm高速离心3min，弃去洗脱液。（11）向滤柱中加入500ulAW2洗脱液，静置5min，12000rpm高速离心3min，弃去洗脱液。（12）10000rpm空转离心2min，弃去剩余液体。（13）取出滤柱，放在超净工作台中凉至5min，使剩余液体挥发。（14）将滤柱放入新的1.5ml管中，加入30ulddH2O，静置3min，10000rpm高速离心2min。（15）再加入30ulddH2O，静置3min，10000rpm高速离心2min。（16）Nanodrop紫外分光光度计测定DNA浓度后放置在-80℃超低温冰箱备用。1.4.2外周血细胞培养及染色体核型分析1.4.2.1采血及接种培养（1）抽取患儿外周静脉血2ml，给予肝素抗凝。（2）超净工作台中准备好RPMI1640培养液，包含10%胎牛血清和PHA60mg/ml，将混匀后的血液取1ml注入含5ml培养液的无菌培养瓶中，摇动混匀。（3）放置在37℃恒温箱中培养72小时，培养过程中每天摇晃培养瓶1次，使血液悬浮放入培养箱中继续培养，余下血液样本置于4℃冰箱保存。（4）培养终止前1-2小时，加秋水仙碱使其终浓度为0.1ug/ml。轻摇动培养瓶，继续培养至72小时。1.4.2.2制片（1）终止培养，用吸管吸取培养液至15ml离心管，充分混匀培养物，1500rpm低速离心10min（配平）。（2）弃去上清液，加入37℃预热的0.075mol/L氯化钾溶液9ml，用吸管吹打充分混匀，放置在37℃水浴箱中孵育30min。（3）加入新配制固定液（甲醇:冰醋酸=3:1）1ml，用吸管吹打细胞团液，1500rpm低速离心10 上海交通大学医学院硕士学位论文5min后弃去上清。（4）继续加入8ml固定剂，吹打混匀，室温固定20min，1500rpm低速离心10min。（5）弃去上清液，重复固定一次。（6）加入新配制固定液数滴，滴数根据细胞数量决定，将沉淀调制适当浓度，将剩余细胞悬液于-20℃冰箱中保存。（7）吸少许细胞悬液，滴2-3滴于玻片上（冰水浸泡），晾干后于70℃烘箱中烘烤2小时。标本置于Giemsa染色液10分钟，水洗晾干。（8）使用显微镜观察染色体标本，主要是分裂相及分散情况。（9）37℃预热的2.5%胰酶5ml和45ml生理盐水加入染色缸中，用1NHCL或1NNaOH调节胰酶溶液PH值，使PH值在6.8-7.2之间。（10）将染色体玻片放置在37℃预热的Nacl溶液中，蒸馏水漂洗2次，浸入10%Gimsa染料中染色15min，水流冲洗，干燥后镜检。1.4.3AgilentCGHArray4×180K芯片本次实验由博尔诚（北京）科技有限公司完成，其主要步骤大致如下：（1）荧光染料分别标记实验组和对照组基因组DNA：利用荧光染料Cy3-dUTP和Cy5-dUT对患者基因组DNA及正常对照的DNA进行标记，分别为红色荧光和蓝色荧光。（2）样品放入PCR仪器中10分钟变性（98℃），迅速冷却1min。（3）加入20ulKlenow酶反应物。（4）PCR仪器中37℃放置2小时，加0.5MEDTA10ul终止Klenow反应。（5）暗室放置10min，离心20min，弃去上清。（6）80%冰冻酒精500ul洗脱DNA沉淀，离心2min，弃去上清。（7）加入20ulddH2O溶解DNA，将病例组与对照组DNA混合放入高速真空器干燥。（8）95℃变性5min，于65℃进行杂交24h后注入芯片。（9）将片子放入洗液1中2min，洗液2中1min，洗液3中15s，干燥1min。（10）将芯片放入AgilentHumangenomeCGH180K中测序，测序过程由AgilentDNAMicroarrayScanner监测。（11）Cy3和Cy5的荧光强度通过AgilentFeatureExtractionSoftware进行分析。11 上海交通大学医学院硕士学位论文（12）使用AgilentWorkbenchSoftware采集CNVs数据。（13）选取CNVs长度大于100kb的片段并与DatabaseofGenomicVariants(DGV,http://dgvbeta.tcag.ca/dgv/app/home)数据库和OnlineMendelianInheritanceinMan(OMIM,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/)数据库比对，从而确定候选CNVs。1.4.4引物设计（1）从NCBI（NationalCentreforBiotechnologyInformation）网站获取SMC2、CANNAL2和DFNB31序列信息。（2）利用Primier5软件设计引物。（3）通过NCBIBlast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）对设计的引物进行特异性分析。（4）设计引物由上海生工生物工程有限公司合成。（5）设计引物序列如下（表1）：Table1PrimersequenceofSMC2、CTNNAL1andDFNB31geneamplification表1SMC2、CTNNAL1和DFNB31引物序列引物名称ForwardReverseSMC2ATTTTATTTTAGGTTCGGGCTTCAATCCTCTTAGTGATAGAATGTGCCTNNAL1ACTGTGCATCTTCATATTGCCAGTTTCTCACCTCGTCTTCCTTDFNB31CCTGTTCCACCTTCTAGTAGGATTCGAACTCAGGCTGGTC1.4.5PCR反应检测引物特异性以及确定引物退火温度（1）聚合酶链式反应（PCR）扩增体系，共30ul：ddH2O11.6ul、上游引物1.2ul、下游引物1.2ul、DNA模板为患者外周血基因组DNA1ul、MyTaqHS酶15ul（2）反应程序为98℃1min，98℃20s、54-58℃30s、72℃30s，共30个循环，72℃10分钟，4℃保存。（3）PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后(130v，30min)观察每个温度是否有条带，条带是否单一。12 上海交通大学医学院硕士学位论文1.4.6SMC2、CTNNAL1、DFBN31基因和GAPDH基因引物效率测定（1）根据二倍稀释法将DNA稀释成不同的浓度梯度，分别将这些浓度的DNA作为模板，从而进行引物效率的测定。（2）配置20ul反应体系：2×SYBRPremixExTaq10ul、10uM上游引物0.3ul、10uM下游引物0.3ul、50×ROXReferenceDyeII0.4ul、ddH2O8ul及DNA模板1ul。（3）反应程序：预变性95℃30秒；循环扩增95℃5秒，60℃30秒，共40个循环，溶解曲线测定时间95℃15秒,60℃1分钟,95℃15秒。1.4.7Real-timePCR验证（1）配置20ul反应体系：2×SYBRPremixExTaq10ul、10uM上游引物0.3ul、10uM下游引物0.3ul、50×ROXReferenceDyeII0.4ul、ddH2O8ul及DNA模板1ul。操作过程中避光。（2）加样后混匀、离心、轻轻敲打去气泡后上机。（5）反应程序：预变性95℃30秒；循环扩增95℃5秒，60℃30秒，共40个循环，溶解曲线测定时间95℃15秒,60℃1分钟,95℃15秒。（6）数据分析：记录CT值，利用相对定量法计算出基因的拷贝数数值。1.4.8全外显子测序分析本实验由博豪生物有限公司完成，其具体步骤概括如下：（1）DNA质检：质检结果合格后进行后续试验。（2）测序文库构建：按照实验说明书对基因组DNA进行片段化，末端修复、3’末端加A、连接、富集，杂交，洗脱和扩增等步骤，进而完成测序样本文库构建。（3）构建文库使用Qubit®2.0Fluorometer仪器进行浓度检测，Agilent2100系统用来检测文库的大小和纯度。（4）Cluster生成：根据cBotUserGuide(Part#15006165,Rev.F,Illumina)所示的相应流程，在IllumminaHiSeq2500测序仪配套的cBot上完成Cluster生成以及第一向测序引物杂交。（5）上机测序：根据HiSeq2500UserGuide准备测序试剂，将携带cluster的flowcell进行上机测序(仪器型号：HiSeq2500,Illumina)。测试程序选用paired-end，进行pairedend2×10013 上海交通大学医学院硕士学位论文ntmultiplex测序。整个测序过程由datacollectionsoftware（Illumina提供）进行控制，并进行实时数据分析。（6）测序结果质控标准：样品提供测序后原始reads（Rawreads）数目不少于10G；外显子区平均覆盖度在100X左右，若平均覆盖度低于90X会进行补测；每向碱基质量大于20（Q20）的比例不小于85%；在100X的覆盖度的情况下，至少85%的外显子区域有一个或以上的序列覆盖。（7）mapping信息：使用BWA(Burrows-WheelerAlignment)软件，version0.5.9进行序列比对（mapping）；参考基因组是人的hg19。利用Samtools-0.1.18的rmdup工具去除可能的PCR重复，通过flagstat工具统计mapping信息。（8）以hg19为参考基因组，通过BWA(Burrows-WheelerAlignment)软件进行序列比对获得结果。（9）捕获富集分析：主要进行样本在目标区域内的reads分布和样本的捕获富集统计。2实验结果2.1患者信息（1）患儿临床特征：该患儿在我院就诊时18个月大，患儿出生时呼吸困难并伴有异常面容：左耳大且突出、眼眶发育不完全、睫毛长且卷曲、嘴唇偏薄、嘴角下弯、颈部较短、前后发际线低、鼻孔前倾、眉弓弯曲、人中偏长和小颌畸形等（图1）。（2）患儿出生情况：母亲怀孕41周因羊水过少剖腹产，患儿出生体重1300g，出生时身长48cm，因低出生体重在新生儿重症监护室住院15天进行治疗。（3）出生后各器官发育：患儿出生后伴有明显的生长发育迟滞：5个月抬头、10个月可以坐，直到18个月就诊时还不能说话和行走，听力障碍，出生后1个月患儿体检查出ASD。根据盖塞尔发育量表（GesellDevelopmentalScale）对比，患儿18个月时体重8000g，身长73cm，其发育程度相当于11个月正常婴儿大小。（4）该患儿在我院小儿心血管科进行超声心动图检查：房间隔缺损大小为0.313cm（图2）。14 上海交通大学医学院硕士学位论文（4）其他：患儿无兄弟姐妹，父母否认有任何家族病史，母孕期无明显异常，孕早期无见红，感冒及其他药物接触史。Figure1Ourpatientwithdistinctivefacialfeatures.Alargeprotrudingear,underdevelopedorbitalarches,longcurlyeyelashes,thinlips,downturnedangleofthemouth,shortneckwithlowanteriorandposteriorhairlines,antevertednares,well-definedandarchedeyebrows,longphiltrum,anteriormedianfissure,andmicrognathia.图1该患儿面部呈现出异常特征：左耳大且突出、眼眶发育不完全、睫毛长且卷曲、嘴唇偏薄、嘴角下弯、颈部较短、前后发际线低、鼻孔前倾、眉弓弯曲、人中偏长和小颌畸形等。Figure2Echocardiographyimagesofthiscase:theendpointsoftheASD图2患儿超声心动图显示房间隔缺损0.313cm15 上海交通大学医学院硕士学位论文2.2染色体异常分析结果患儿及其父母外周血细胞中期染色体制备成功，计数20个细胞，共配对3个核型，显带分辨率为320-400BPHS。染色体核型分析结果显示为46，XX，del(9)(q31.1-q32)，即9号染色体长臂3区1带1亚带到3区2带区域缺失（图3）。同时患儿父母染色体核型分析结果表明父母的染色体数目及结构均无明显异常。Figure3Thekaryotypeanalysisresultsofthefamilymember.Thekaryotypeof46,XX,del(9)(q31.1q32).Thearrowatchromosome9indicatesthebreakpoint图3患儿染色体核型分析结果。染色体核型为46，XX，del(9)(q31.1-q32)2.3与该患儿缺失区域重叠的11例患者进行临床表型及缺失区域分析本研究从文献报道中收集了11例患者，他们的缺失区段从9q21横跨到9q34。从患者的生长发育，神经功能，面部特征，肢体运动以及各器官发育情况等方面分别对临床表型和重叠缺失区域进行比较研究（表2，图4）。16 上海交通大学医学院硕士学位论文Table2Thecharacteristicsofthepreviouspatientwithanoverlappingdeletionwithin9q31.1-q32表2与患儿9q31.1-q32缺失区段重叠的11例患者临床表现FeaturesoftheCdLSOurcase123.13.245678910phenotypeGrowthretardation++++++++++++Neurodevelopmentpsychomotordevelopment++++++++++++Communicateskills+++-++++++++Autism--+----+----Seizures---------++-Self-injuriousbehaviour------------CraniofacialdevelopmentMicrocephaly--+----+-+--1Eyebrow+--++++--+++2Ears++--+-+++--+3Nose++-+-+++++++4Mouth+-------+---SmallJaw+-------++-+High-archedPalate++---+--+-++Clefting++---------+ShortNeck+--+-++++--+5LimbabnormalitiesFootanomalies------++-++-Handanomalies++++--++-+-+Gastrointestinal/respiratory+-+-++-----+6systemsHearingLoss+++--++-----Kidneydevelopment-+-----+---+Cardiacproblems+++++-+---+-Hypoplasticmalegenitalia-----++---+-7Hairdevelopment+--++---+--+Dentalproblems+----+++---+8Others--HGGNSS-S-HNS17 上海交通大学医学院硕士学位论文表2中五官常见的异常表现为连形眉和拱形眉、耳位偏、嘴唇偏薄、嘴角下弯和长睫毛。四肢中较为常见的表型是锥形手、手指或脚趾屈曲、手掌和脚掌较小、手指和脚趾短。机体主要脏器器官结构和功能出现明显异常，例如胃食管反流、内脏易位、肠道重叠、食管狭窄、幽门狭窄、先天性膈疝、多毛和先天性心脏缺陷。表中NS代表皮肤赘生物，G代表弓背，S代表脊柱侧凸，H代表眼距过宽。所有患者均表现出生长发育迟滞和智力障碍，神经精神方面绝大部分患者沟通能力障碍，但其自闭症、癫痫和自虐倾向不是十分明显。图4对10例患者染色体的重叠缺失区域进行比较，其中病例3的两个患者缺失区域重叠。病例1DECIPHERID是250887，缺失区域为chr9:q22.32-9q32(101997966-115022084)区间；病例2的缺失区域是106,859,697-117,190,101区间；病例3缺失区域是chr9q31.1-q31.3(107970kb-114341kb)区间；病例4DECIPHERID是270439，缺失区域是chr9:q22.32-9q31.2(98218538-110294149)区间；病例5的缺失区域是chr9q31.1-q33.1(110672051-120997502)区间；病例6的缺失大小区间在106.2-113.27Mb之间；病例7的缺失区域为111,330,304-121,013,839区间；病例8的缺失区域115,369,807-121,843,479；病例9缺失区域chr9q22.3-q31.3(94Mb-106Mb)；病例10缺失区段是chr9q22.32-9q33.2Figure4Schematicrepresentationofourcaseandthe11previouslypresentedcaseshaving9qdeletionspartiallyoverlappingwiththeregionofchr:9q31.1-32(105190105-117195154).ThephysicalpositionsofthebasepairherearebasedonGRch/hg19.图4与患儿9q31.1-q32缺失区段重叠的10例患者示意图18 上海交通大学医学院硕士学位论文2.4CNVs分析结果2.4.1DNA质检结果抽提患儿基因组DNA，检测DNA浓度为78.8ng/μL，A260/A280是1.86，A260/A230是1.77，DNA总量为3.94μg，质量检测结果为总量偏低，但不影响进行测序等后续试验（表3）。Table3ThequliatydetectionofDNA表3患者DNA质量检测No.SampleCon.Vol.A260A260TotalResult/序Name/浓度/体积/A280/A230/总量(μg)/结果号/样本名称(ng/μL)(μL)1Patient78.801.861.77503.94总量偏低2.4.2AgilentCGHArray4×180K芯片结果分析利用AgilentCGHArray4×180K芯片对患儿进行CNVs检测，将所得结果以至少包含连续5个探针且大于或等于100kb的CNVs为条件进行过滤，发现9号染色体q31.1-q32(105,104,179–117,250,435)区段缺失，缺失长度为12.01Mb（图4）。其中9q31.1-q32缺失区域共包含22个OMIM基因，根据患儿的临床表型和查阅文献，筛选出三个可能和临床表现相关的候选基因分别为SMC2、CTNNAL1和DFNB31基因，DFNB31和听力相关，CTNNAL1可能和呼吸系统及肿瘤的发生异常相关，SMC2和染色体有丝分裂密切相关（图5）。19 上海交通大学医学院硕士学位论文Figure4TheAgilentCGHArray4×180Karrayresultofthepatient.Chromosomalviewofthe12.1-Mbdeletionatchromosomebands9q31.1–q32[arr9q31.1q32(105,104,179–117,250,435)]图4患儿AgilentCGHArray4×180K芯片结果：患儿存在9q31.1-q32（105,190,105-117,195,154）区段缺失，缺失区段长度为12.01Mb。Figure5zoomed-inview.RedspotsindicatethethreegenesweverifiedbyqPCR图5SMC2、CTNNAL1和DFNB31三个相关候选基因位置20 上海交通大学医学院硕士学位论文2.5qPCR验证结果为了研究以及验证9q31.1-q32（105,190,105-117,195,154）的缺失对患儿临床表型的作用，利用qPCR技术对该患儿及其父母的9q31.1-q32区域进行拷贝数检测。检测结果显示父母9q31.1-q32区域拷贝数水平正常，患儿的9q31.1-q32区域拷贝数存在缺失（图6）。SMC2CTNNAL1DFNB31Figure6TheReal-timePCRresultofbrotherofthefamilypatient.图6患儿及其父母Real-timePCR结果:患儿9q31.1-q32区域拷贝数缺失，父母拷贝数正常。2.6全外显子测序结果2.6.1测序文库质检Qubit®2.0Fluorometer仪器和Agilent2100系统分别检测患者浓度、大小和纯度。浓度为3.52ng/μL，长度为299bp（图7），经检测文库浓度及片段大小均符合质控标准，可以进行上机测序。21 上海交通大学医学院硕士学位论文Figure7ElectrophoresisImangedetectionbyAgilent2100图7Agilent2100检测电泳图像2.6.2测序结果质控本次测序平均深度为155.39X，其中99.86%以上基因的测序深度>1X，总reads数目71,505,794，总bases数是7,150,579,400，正向碱基质量大于20（Q20）的比例是98.44%，反向碱基质量大于20的比例是97.22%，质控标准合格（表4）。Table4Resultsofsequencingqualitycontrol表4测序质控结果SampleOrientationTotalreadsTotalbasesQ20Depth1X(%)ResultnamePatient-1Forward71,505,7947,150,579,40098.44%合格155.3999.86Patient-2Reverse71,505,7947,150,579,40097.22%合格2.6.3序列比对信息使用BWA软件进行序列比对，可读reads数目为136,164,264,比对到参考序列上的reads数目为134,476,695，mapratio为98.76%，去除可能的PCR重复后uninquemappedreads数目为120,680,085，uninquemappedratio为89.74%（表5）。22 上海交通大学医学院硕士学位论文Table5Resultsofmappingdata表5序列比对结果UniqueUniqueGoodMappedSampleMapRatioMappedMappedReadsReadsReadsRatioPatient136,164,264134,476,69598.76%120,680,08589.74%2.6.4捕获富集分析样本的reads在基因组上的富集统计情况如图所示（图8）。捕获富集第一根蓝色柱子表示on-target的序列百分比，代表捕获的效率；第二根柱子表示该样本的平均覆盖深度，达到155。其余的柱子分别表示1X~250X的百分比。Figure8enrichmentcapturestatisticsofsample图8样品的捕获富集统计2.6.5全外显子测序分析结果全外显子测序数据以1000G出现频率<0.01，SIFT软件预测评分<0.05的非同义突变或stopgain、stoploss，基因定位在外显子区域或可变剪切位点为条件进行过滤，共筛出310个23 上海交通大学医学院硕士学位论文基因。余下的基因进一步利用OMIM数据库和Pubmed数据库查询基因功能，当基因功能与某些临床表型相关时，入选为候选基因。通过分析比对并没有发现和患者临床表型相关的基因突变。与此同时，我们确定了可能和某些综合征相关的5个候选基因，分别是NIPBL、SMC1A、SMC3、MRPS22和HDAC8基因。5个候选基因的相关参数如下（表6），但仍未发现基因突变。Table6ThesequencingqualityofCdLsrelatedgenes表6为相关候选基因测序参数TargetgeneSequencingTargetMeanCoverageCoverage≥Coverage≥dataamountbasedepth≥1X(%)10X(%)20X(%)NIPBL189146310921173.195100.00%98.89%98.89%SMC1A9660955708169.253100.00%100.00%100.00%SMC313163168994146.355100.00%99.97%98.67%MRPS223168361931164.079100.00%100.00%100.00%HDAC85895383525167.245100.00%100.00%100.00%3讨论本课题从先天性心脏病伴染色体异常患儿入手，通过利用染色体核型分析技术、AgilentCGHArray4×180K芯片及全外显子测序分析等细胞遗传学和分子生物学技术方法，分别从染色体异常，拷贝数变异和基因突变等角度探究与患儿临床表现可能的相关致病原因。该患儿面容呈现明显异常，伴有左耳大且突出、眼眶发育不完全、睫毛长且卷曲、嘴唇偏薄、嘴角下弯、颈部较短、前后发际线低、鼻孔前倾、眉弓弯曲、人中偏长和小颌畸形等，生长及认知发育迟滞、心脏解剖结构异常（ASD）、听力障碍、手指畸形和某些器官等。染色体核型分析和aCGH芯片检查结果为9号染色体q31.1-q32片段有12.01MB缺失，该缺失区域共包括22个OMIM基因，查阅文献及分析比较后确定SMC2、CTNNAL1和DFNB31三个候选基因可能和患者的某些临床表型相关。24 上海交通大学医学院硕士学位论文3.19q21-q34区段缺失患者临床特征相似目前关于9号染色体缺失病例的报道较为少见，大约仅有20位患者的缺失片段从9q21[51-54]横跨至9q34。本研究从之前的文献报道中收集了11例患者，并将患者的主要临床表现及缺失区域与该患儿进行比较。通过对比可以看出12例患者的缺失区域均有不同程度的覆盖和重叠，患儿临床表型涉及多个系统和脏器器官。所有患者均表现出生长发育迟滞和智力障碍，足以见得这两个临床表现为染色体异常患者的非特征性表现。神经精神方面绝大部分患者沟通能力障碍，但其自闭症、癫痫和自虐倾向不是十分明显。11例患者中面部特征都有明显改变，主要为小头畸形、连眉或拱眉、耳位偏低、鼻孔前倾、鼻梁宽大低平、嘴唇薄、嘴角下、足弓过高和短颈等。该缺失区段出现的肢体畸形较其他染色体异常明显，11例患者中8例都出现手部畸形，4例出现脚畸形，例如锥形手、手指屈曲、手指短和指甲发育不全、并趾、脚趾小且短等，以上四肢畸形表明该缺失区段可能包括和四肢发育相关的候选基因。其他脏器器官结构和功能异常也都有报道：胃食管反流，食管狭窄、先天性膈疝和先天性心脏缺陷等，其中患儿发生心脏畸形的比例明显高于其他脏器器官（41.6%）。心脏畸形较多见于ASD和VSD。大部分携带9号染色体长臂缺失的患者，尤其缺失区间和该患儿有重叠的均有相似的临床表型，例如生长发育迟滞、智力障碍、颅面畸形和肢体畸形。通过临床表型比对以及染色体检查，尽管目前没有充分的研究数据证明某个综合征疾病和9q31.1-q32区段缺失相关，报道的所有患者其携带的缺失区段也都不尽相同，但是患儿在我院住院期间，我们发现其临床表现和CorneliadeLange综合征（CdLS）相似。CdLS综合征也称为Brachmann-deLange综合征，是一种非常罕见的多器官遗传异质性疾病。CdLS发病率为1/10000到1/60000之间，女性患者较为常见（1.3：1）。CdLS的典型临床表现为低出生体重、特殊面容、生长发育迟缓、多毛症和四肢畸形等。面部特征为拱形眉、连眉、鼻孔前倾、鼻梁扁平宽大，小颌等，也常伴有自闭症，癫痫、先心病、胃肠功能紊乱等其他脏器器官异常。CdLS患者中先心病出现的比例约为25%-30%，最常见的心脏缺陷为VSD、ASD、[61]PS、TOF和左心发育不良综合征（HLHS）。大部分CdLS患者为散发，只有10%的病例[62]染色体结构改变发生在3q26.2-q23，且迄今只发现了5个候选基因和CdLS相关：NIPBL、[63-67]SMCIA、SMC3、RAD21和HDAC8基因，2004年Krantz和Tonkin等学者在5号染色体上克隆出CdLS致病基因NIPBL，随后相继几年里，2006年Musio等发现了SMC1A基因，2007年Deardorff等找到SMC3基因。其中约60%CdLS患者是由于NIPBL基因突变导致，25 上海交通大学医学院硕士学位论文约5%患者由SMC1A基因突变引起，1例患者发现了SMC3基因缺失。NIPBL基因单倍体剂量不足（无义突变、错义突变、缺失、重复、剪切位点突变和移码突、大片段重复和缺失等）可以导致严重的生长、认知和肢体发育缺陷。NIPBL基因转录产物在人类细胞中表达十分广泛，其中骨骼肌和心脏中的表达含量最高，已经在391名患者中发现了333个不同的杂合突[68-70]变。通常情况下，SMC1A和SMC3基因突变可以导致轻中度CdLS表型，不伴有脏器[66]器官的结构异常。除了以上三种较为常见的候选基因，还包括内聚蛋白（cohesin）相关基[67,71-72]因以及8p23.1缺失区段，例如RAD21和HDAC8。目前CdLS患者中发现的所有突变均影响着内聚蛋白途径的酶功能，常见的五种基因与DNA的位置关系如图所示（图9）。[73]Figure9Overviewofthecohesionringanditsassociatedproteins.图9cohesin环及相关蛋白示意图3.2与CdLS相似的几种综合征表现既往，临床上主要通过CdLS患者的面部特征对此类综合征进行诊断，但是对于一些临床表征并不十分显著的患者，往往需要和其他表征类似的综合征进行鉴别诊断。Coffin-Siris综合征（CSS）和CdLS都伴有身体发育障碍、多毛症和手足畸形，但Coffin-Siris综合征患者的四肢常伴有指甲或趾甲缺如。Gijs等通过全外显子测序技术对CSS患者进行分析，发现[74]AID1B基因发生了截短突变，认为该基因和CSS的智力障碍和语言功能受损等表现相关。[75]Fryns综合征（FS）是一种罕见的常染色体隐性疾病，发病率约为0.7/10000。和CdLS相似，都有多毛症、睑裂狭小、鼻梁扁平、小颌畸形、鼻头上翘、腭裂、四肢畸形、先天性膈26 上海交通大学医学院硕士学位论文疝以及先天性心脏、肾脏等器官畸形。FS患者的出生体重正常，上唇呈帐篷型，嘴较大，该[76]类患者的诊断主要依靠临床特征，目前为止并没有明确的基因表明和FS相关。除了宫内发育迟缓、生长不良、小头畸形、多毛症、上唇薄和心脏缺陷等临床表现与CdLS相似，胎[77]儿酒精综合征(FAS)患儿并不表现出短指症，语言障碍也没有CdLS表现明显。Roberts综[78]合征（RS）通常有明显的面部特征，例如唇裂、睑裂向下倾斜、颧骨扁平和未发育的鼻翼，KBG综合征患儿出生体重在正常范围内，但身长通常低于平均值的3%，认知障碍较典型[79]CdLS患者轻。我们通过全外显子测序技术对患儿的基因组外显子区域进行测序，在编码区并没有发现[80]和CdLS相关的候选致病基因突变，而约有35%CdLS患者不携带候选致病基因突变，因此，把患者的临床表型和缺失区域中的某些特定基因联系在一起成为分析病因的关键，也提示我们可能存在其他和疾病相关的候选基因等待研究。我们从该患者缺失区域中的22个OMIM基因中确定了3个候选基因进行分析。分别为染色体结构维持家族（StructuralMaintenanceofChromosome，即SMC）中的成员SMC2、耳聋表型相关的DFNB31基因和癌症及呼吸系统相关基因CTNNAL1。3.39q31.1-q32区段缺失患者候选基因SMC2染色体结构的动态变化与遗传物质信息能否准确传递给子代细胞密切相关，该过程既有姐妹染色单体的内聚作用又包含染色体的集缩作用。SMC1A、SMC2和SMC3均是染色体结构维持家族（StructuralMaintenanceofChromosome，即SMC）的成员。SMC家族是一类高保守性的蛋白分子，其在染色体高级结构的形成和维持过程中发挥重要作用。SMC蛋白N端是核苷结合序列，C端为DA盒的保守序列。DA盒与ATP酶的特征序列十分相似，与N[81]端的ATP结合区域组成ATP酶功能域，属于一类染色体ATP酶。SMC家族的成员通过异源二聚体的形式组成三种复合物，各成员与细胞生存密切相关。其中SMC1和SMC3组成的cohesin（内聚蛋白）可以使复制的DNA聚合，SMC2和SMC4组成的condensin（集缩蛋白）可以将DNA凝缩成染色体，两种蛋白在细胞有丝分裂、染色体分离时必不可少，而第三类由异源二聚体SMC5和SMC6为核心组成的SMC复合物，目前对其功能了解甚少，有学者[82-85]认为其可能在非SMC蛋白成员（non-SMCelement）的参与下与DNA的损伤修复相关。27 上海交通大学医学院硕士学位论文在9q21-34区段缺失的患者中曾发现SMC1A和SMC3基因突变，由二者构成的cohesin复合体在细胞的增生、分化、DNA修复和姐妹染色单体内聚过程中都起到了十分重要的作用。Cohesin最初被认为是在姐妹染色单体形成复制叉过程中建立了两条单体之间的某些生物学联系。在内聚蛋白的作用下，两条姐妹染色单体的连接从G2期一直保持到有丝分裂中期，[86]由中期进入后期单体之间的联接得以消除。因此，在细胞增殖过程中内聚蛋白可以确保遗传物质准确的传递给子代细胞。目前已发现至少有两种人类染色体综合征疾病和内聚蛋白功能异常有关：CornliadeLangesyndrome(CdLS)和Robertssyndrome(RBS)。在哺乳动物中，CTCF结合蛋白（CCTC-bindingfactor）和内聚蛋白在哺乳动物基因组中共定位，在一些CTCF[87-88]定位的基因座上cohesin通过促进染色质环的形成发挥功能。对内聚蛋白敲除的小鼠进行研究发现CTCF结合蛋白的表达量下调，从而推测内聚蛋白通过CTCF的调控机制影响基[89]因表达。Condensin（集缩蛋白）在DNA修复和细胞有丝分裂过程中起着关键作用。在细胞有丝分裂过程中，集缩蛋白抑制了复制蛋白A（RPA）的活性，并且在分裂间期促进DNA[90]退火过程的进行。SMC2铰链区基因突变可以导致细胞生存活性的严重下降，并且在姐妹[91]染色单体内聚过程中不可或缺。近来研究指出SMC2可以通过CTCF结合蛋白抑制核糖体RNA(rRNA)的基因转录，SMC2和CTCF主要以竞争的方式结合在rRNA的特定位置上，[92]如果SMC2被敲除就会促进CTCF结合在rRNA上，同时也可以促使rRNA的基因转录。综上所述，SMC2可以通过CTCF调节基因的转录。3.49q31.1-q32区段缺失患者候选基因DFNB31耳聋是最常见的感官系统类疾病，可严重影响患儿的语言、智力发育和沟通交流。通常情况下，青少年期之前的耳聋有50%-60%由遗传因素引起，约有85%为非综合型耳聋，该类耳聋不伴有其他临床症状，其余的30%耳聋常合并一些临床症状也称为综合征型耳聋。DFNB31基因位于9号染色体q31.2，是常染色体隐性遗传性非综合征耳聋（ARNSHL）的致病基[93]因。遗传型耳聋疾病中ARNSHL是最常见的病因，约占80%，目前DFNB31基因已经作[94]为Usher综合征的候选致病基因之一。在CdLS患者中耳聋作为典型症状之一，大约有40%[95]-80%的患者有临床表现。该患儿在17个月大时诊断出听力障碍，因此，该患儿听力障碍是CdL综合征的表型之一还是由其他疾病引起值得商榷。如果该患儿耳聋症状是由ARNSH28 上海交通大学医学院硕士学位论文L引起的，在患儿染色体中可以发现DFNB31突变，纵观整个全外显子测序结果并没有发现[96]DFNB31基因存在功能性突变。而在之前统计的10例患者中有5例患者出现耳聋症状（41.7%），这也和文献中的统计数据结果一致。5例患者中只有2例患者的缺失区间包括DFNB31基因，因此9q缺失患者的耳聋症状可能并不是由DFNB31基因突变导致，而是CdL综合征的相关表型之一。3.59q31.1-q32区段缺失患者候选基因CTNNAL1CTNNAL1也称为黏附分子相关蛋白α1，定位在人染色体9q31.2，cDNA长度为2,45kb，其mRNA广泛分布在全身。CTNNAL1基因的表达水平变化与很多疾病都有密切关联，曾有[97]学者在胰腺癌细胞中发现CTNNAL1表达量下调，在哮喘病人及动物模型中都曾发现[98]CTNNAL1基因下调，其mRNA的表达水平与呼吸道的阻力呈负相关。黏附分子在气道高反应和气道损伤过程中起着重要作用，对维持上皮细胞的结构稳定有着重要意义。研究认[99]为CTNNAL1参与Rho信号转导途径，RhoGTP蛋白酶参与细胞骨架中的肌动蛋白组成[100]和细胞的同源黏附。WiesnerC曾指出CTNNAL1和IκB-ß激酶（IKK）的相互作用，CTNNAL1的表达异常可以激活NF-κB的活性，促进细胞迁移运动和增加细胞的抗凋亡性[101]。本研究中患儿还未出现气道高反应性和哮喘，但real-timePCR已经验证CTNNAL1基因存在拷贝数变异，可能提示我们患儿有高发哮喘及呼吸道其他疾病的可能性，对患儿进行定期随访可以有效的了解疾病的发展情况。本研究从9q31.1-q32缺失区段入手，分析比较重叠缺失区域发现了相似的临床表征。还首次把该缺失区域中的SMC2基因与CdLS综合征联系在一起，认为SMC2属于SMC家族成员，可能通过CTCF结合蛋白与SMC家族其他成员相互作用，后续SMC2基因功能验证试验有待进行。29 上海交通大学医学院硕士学位论文第二章一例18P缺失综合征患儿致病区段分析引言18号染色体短臂部分或完全缺失导致的染色体异常称为18p单体型，在常染色体缺失综[102]合征中占第二位。早在1963年，Grouchy报道了世界上第一例18p缺失综合征患儿，该综合征是唯一一个患者可以长期生存的常染色体缺失综合征。18号染色体短臂长约16Mb，[103]18p缺失的发生率大约为1/50000，男女比例为3:2。目前世界范围内大约报道了150例患[104]者，其中2/3的病例均为新发缺失区域，1/6是由于18号染色体长臂易位引起，其余可能[105]是由于家族性易位，染色体倒置和复杂性易位等原因引起。18p缺失综合征的临床表型不一，报道的临床表征包括轻到中度精神及生长发育迟滞、圆脸、嘴角下弯、耳发育不良、上睑下垂、斜视、眼距过宽、鼻子扁平、生长激素缺乏、较[106-107]为严重的先心病及脑发育不良。母孕期及出生史无明显异常情况，患儿的平均出生体重低于正常范围。正因如此，18p缺失的诊断相较于其他绝大部分染色体异常更为困难,更容易漏诊。18p缺失综合征分为短臂完全缺失和部分缺失两类，短臂完全缺失是引起上述临床表征的主要原因，部分短臂缺失通常是由于染色体的不平衡易位引起的，从而可以解释18p[106]综合征临床表现的多样性。生长发育迟滞可能是由于生长激素缺乏所致，大多数患者伴随[108]垂体功能减退，针对此类患者应该及时的对体内生长激素水平进行检测，及早进行替代治疗提高患者的生存质量。肌张力障碍仅在7例18p缺失综合征患者中有过报道，而和该表型[109]相关的基因也已经有所研究。部分患者会出现自身免疫系统疾病，例如青少年糖尿病、风[110]湿性关节炎、甲状腺炎和Graves病，同时患者血浆中IgA含量降低也有过报道，而免疫[111]异常和18p缺失的关系并不十分明确。18p缺失综合征患者中约有10%出现先心病，常见[112-113]的心脏表型包括心室肥厚、PDA和TOF。Zhou等从一例18p缺失患者着手，缺失长度4.5Mb，该患儿心脏表型为TOF,认为18号染色体短臂在心脏发育中起着重要作用，但具体的[114]作用机制及其相关基因功能目前仍不十分清楚。18p缺失患者中前脑无裂畸形（HPE）的比例约占10%，TGIF基因已经成为HPE的关键候选基因之一，携带TGIF基因突变的患者[115-116]中HPE的发生率约为2%。这些临床特征因人而异，即使携带重叠致病区域的患者临床表现也会轻重不一。30 上海交通大学医学院硕士学位论文本课题收集了一例18p缺失同时伴有13号染色体易位的患者，通过染色体核型分析，CytoScanHD芯片和qPCR等技术手段对患儿的染色体缺失区间与某些临床表型进行关联研究，从而分析患者某些特征性临床表型的病因所在。1.资料与方法1.1主要试剂与材料1.1.1基因组DNA抽提试剂主要试剂与第一章相同1.1.2染色体核型分析试剂主要试剂与第一章相同1.1.3AffymetrixCytoScanHDAssay芯片本次研究的基因芯片所使用的基因芯片是Affymetrix公司生产（1）CytoScanTMHD芯片参数：CNV探针数2696550个，其中包含SNP探针数743304个和non-polymorphic探针数1953246个。基因内探针数为1410535个，基因间探针数为1286015个，常染色体探针数为2491915个，拟常染色体探针数4624个，genotype-ableSNP探针数749157个。（2）基因覆盖情况：ISCA（340）和癌症基因（526）均为100%，OMIM相关基因（2640）98%覆盖，X染色体OMIM相关基因（177）100%覆盖，RefSeq基因（36121）96%覆盖。（3）标记平均间隔：基因内平均间隔为880bp，ISCA平均间隔384bp，癌症基因553bp，OMIMMorbid基因659bp，X染色体OMIMMorbid基因486bp，RefSeq基因880bp，基因间（非基因骨架）1737bp，基因和非基因骨架总数为1148bp。1.1.4Real-timePCR试剂盒主要试剂与第一章相同1.2主要仪器、器械及耗材与第一章相同31 上海交通大学医学院硕士学位论文1.3研究对象该患者为2014年9月在上海交通大学附属新华医院小儿心血管科就诊的男性患者，就诊年龄16岁。患者5岁曾在上海儿童医学中心行TOF根治术。我们对该患儿进行了详细的临床相关资料收集和家系调查，通过超声心动图检查患儿的心脏结构异常，同时对患儿的智力，听力，视力和其他脏器器官进行检查。抽取患儿及其父母，妹妹静脉血2ml，抽提基因组DNA，-20度冰箱备用。1.4实验方法1.4.1外周血基因组DNA抽提提取步骤和第一章相同1.4.2外周血细胞培养及染色体核型分析细胞培养和制片步骤和第一章相同1.4.3AffymetrixCytoScanHDAssay芯片本实验由上海市儿科医学研究所完成，其主要步骤概括为基因组DNA消化、连接、PCR、PCR产物纯、定量、片段化、标记、杂交、洗脱、染色以及扫描等。1.4.3.1基因组DNA消化（1）消化体系：ChilledAffymetrix®Nuclease-FreeWater11.55µL,10×NspIBuffer2µL,100×BSA0.2µL,NspI1µL,总体积为14.75µL。（2）5µL基因组DNA作为阳性对照，5µL含低量EDTA的TE为阴性对照。（3）高速涡旋振荡混合液三次，每次1s，减慢转速。（4）每管中DNA5µL，消化混合液14.75µL，总体积19.75µL。确保热循环仪提前加热。（5）CytoScan消化条件：37℃2小时，65℃20分钟，4℃保存。1.4.3.2连接反应（1）连接反应体系：10×T4DNAligasebuffer2.5µL，50μMAdaptor,NspI0.75µL，T4DNALigase2µL，总体积为5.25µL。32 上海交通大学医学院硕士学位论文（2）高速涡旋振荡连接混合液三次，每次1s，减慢转速。（3）每管中消化混合液19.75µL，连接混合液5.25µL，总体积25µL。，并密封胶板。（4）CytoScan连接条件：16℃3小时，70℃20分钟，4℃保存。1.4.3.3PCR反应（1）稀释连接混合液：混合液中加入ChilledAffymetrix®Nuclease-FreeWater75µL，总体积100µL。（2）PCR混合液体系：ChilledAffymetrix®Nuclease-FreeWater39.5µL，10×TITANIUM™TaqPCRbuffer10µL，GC-Meltreagent20µL，dNTPmixture14µL，PCR引物0024.5µL，50×TITANIUM™TaqDNA多聚酶2µL，共计90µL。（3）PCR反应条件：94℃3min，94℃30s、60℃45s、68℃15s，共30个循环，68℃7min，4℃保存。（4）PCR电泳观察条带：2%琼脂糖凝胶，5µLUSB50-2000bpladder，5V/cm、45min1.4.3.4PCR产物纯化。（1）每个样本中加入720µL纯化磁珠，上下颠倒10次。（2）室温放置10分钟。（3）高速离心16100rcf，3min。（4）将离心管放在磁力架上，吸去上清，避免碰到磁珠。（5）离心管中加入1ml纯化洗脱液，洗脱液使用前需加入45ml无水乙醇。（6）涡旋振荡2min。（7）高速离心16100rcf，3min。（8）吸去上清液，避免碰触磁力珠。（9）使残留的纯化洗脱液蒸发，开盖10min。（10）重复过程7和8，最终使磁力珠全部贴附。（11）吸出47µL的样本移至96孔板中，密封胶板。1.4.3.5定量检测33 上海交通大学医学院硕士学位论文准备定量板，测量PCR产物260nm、280nm和320nm的OD值。测量标准为OD260/280在1.8-2.0之间，OD320<0.1。1.4.3.6产物片段化（1）裂解混合液分为5个浓度梯度：2U/µL，2.25U/µL，2.5U/µL，2.75U/µL，3.0U/µLChilledAffymetrix®Nuclease-FreeWater体积依次为122.4µL、123.2µL、123.8µL、124.4µL和124.8µL，10×Fragmentationbuffer体积均是158.4µL，Fragmentation试剂体积均是7.2µL，共288µL。（2）涡旋振荡三次，1s。（3）Ep管中纯化PCR产物45µL，裂解混合物10µL，共55µL。（4）反应条件：37℃35min，95℃15min，4℃保存。（5）片段产物电泳观察条带：4%TBE胶，2µLTracklt™25bpDNAladder，5V/cm、45min。1.4.3.7产物标记（1）标记混合液：5×TdTbuffer14µL，30mMDNA标记试剂2µL，TdT3.5µL，共19.5µL。（2）涡旋振荡三次，1s。（3）Ep管中DNA片段51µL，标记混合物19.5µL，总体积70.5µL。（4）反应条件：37℃4h，95℃15min，4℃保存。1.4.3.8杂交（1）杂交混合液：Hybbufferpart1165µL，Hybbufferpart215µL，Hybbufferpart37µL，Hybbufferpart41µL，Oligo对照试剂2µL，总体积190µL。（2）杂交条件：95℃10min，49℃保存。1.4.3.9洗脱、染色和扫描（1）将染色液1，染色液2和芯片缓冲液分别装进3个Ep管中，含量分别为500µL，500µL，800µL。（2）根据fluidics说明书进行洗脱染色。TM（3）利用CytoScanAssayUserManual进行扫描分析。1.4.3.10数据分析流程（1）生成原始cel文件，使用AGCC软件进行芯片图像显示分析。34 上海交通大学医学院硕士学位论文（2）利用CHAS软件把原始文件转换成cychp文件。（3）利用CHAS软件分析患者中存在的CNVs。Cychp文件QC值标准为mapd≤0.25,SNPQC≥15，wavinessSD≤0.12。（4）患者中的CNVs如果存在于DGV数据库的正常人群中则为正常多态性CNVs，如果不存在则为罕见CNVs。（5）通过OMIM数据库查询有无报道，从以往相关表性患者、拷贝数变异来源等角度分别进行分析。1.4.4引物设计（1）根据NCBI网站获得TYMS和TGIF1基因序列。（2）从PrimerBank（http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）数据库中获得候选基因TYMS和TGIF1的real-timePCR引物序列。（3）通过NCBIBlast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）进行引物特异性评价。（4）设计引物由上海生工生物工程有限公司合成。（5）设计引物序列如下（表7）：Table7PrimersequenceofTYMSandTGIF1geneamplification表7TYMS和TGIF1基因引物序列引物名称ForwardReverseTYMSGGGCAACAAGAGCGAAACTAGCAGGCATCCAGGTAAATCTGIF1CACACCTGGATGAGCAGAACTGCCTGAGAAATAACCCTGTC1.4.5常规PCR检测引物的特异性和确定引物的退火温度步骤同第一章1.4.6TYMS基因和TGIF1基因引物效率测定步骤同第一章1.4.7Real-timePCR验证步骤同第一章35 上海交通大学医学院硕士学位论文2实验结果2.1患者信息我们收集到18号染色体短臂缺失患者1人，家系中父母及小女儿均正常，大儿子因法洛氏四联症及智力发育障碍来我院就诊，家系图如下（图10）。Figure10Thefamilytreeofthe18pdeletionpatient图101号为父亲，2号为母亲，4号为小女儿，均体健，3号为大儿子，检查结果为9q缺失。（1）患者临床特征：该患儿在我院就诊时16岁大，面容呈现异常特征：嘴角下弯、耳朵肥大、上睑下垂、斜视、眼距过宽、鼻子扁平。同时伴有法洛氏四联症（术后）及智力发育异常（图11）。（2）患儿出生情况：母亲足月顺产，据患者母亲主诉孕期曾在塑料厂工作，患儿出生体重3000g，出生时身长48cm。（3）生后各器官发育：患者视力欠佳，血尿，先天性心脏病，其余各器官未见明显异常。（4）该患儿在上海儿童医学中心行超声图心动图检查发现法洛氏四联症，后行根治术治愈。患儿有一妹妹10岁，目前体健，父母否认有任何家族病史，孕早期未见红，有化学物质接触史。36 上海交通大学医学院硕士学位论文Figure11Ourpatientshoweddistinctivefacialfeatures.Alargeprotrudingear,downturnedangleofthemouth,ptosis、ocularhypertelorismandflatnose.图11该患儿面部呈现出异常特征：嘴角下弯、耳朵肥大、上睑下垂、斜视、眼距过宽、鼻子扁平。2.2染色体变异分析结果患儿及其父母外周血细胞中期染色体制备均成功，计数20个细胞，共配对3个核型，显带分辨率为320-400BPHS。染色体核型分析结果显示45，XY，der(13)t(13;18)(p12;q11.2)，即18号染色体短臂至长臂q11.2部分单体综合征（图12）。患儿父母及其妹妹染色体数目及染色体结构无明显异常。37 上海交通大学医学院硕士学位论文Figure12Thekaryotypeanalysisresultsofthefamilymember.Thekaryotypeof45，XY，der(13)t(13;18)(p12;q11.2)Thearrowatchromosome13indicatesthebreakpoint图12患儿核型分析结果2.3CNVs分析结果对患者进行AffymetrixCytoScanHDAssay芯片检测，过滤条件为至少包含连续5个探针的大于或等于100kb的CNVs，共发现10个CNVs，其中18pter-q11.2上的缺失和13号染色体q21.2为致病性CNVs（表8）。18号染色体p11.32-q11.1（136226-18529578）区段缺失，缺失长度为18.393Mb（图13）。18p11.32-q11.1缺失区域共包含87个OMIM基因，根据患儿38 上海交通大学医学院硕士学位论文的临床表型进行文献查看，筛选出两个个可能和该患者临床表现相关的候选基因，分别为TYMS和TGIF1基因，其中TYMS可能和心脏发育相关，TGIF1和脑发育尤其是HPE相关。Table8TheAffymetrixCytoScanHDAssayresultofthefamilypatient.表8家系患儿AffymetrixCytoScanHDAssay检测结果。染色体区段位置拷贝数大小（Mb）致病性1Chr18p11.32136226-18529578118.393致病2Chr11q11162514534-16261914110.078多态性3Chr11p15.138296176-3839372130.020多态性4Chr22q11.2264691936-6508018330.192多态性5Chr14q32.337239491-775358330.283多态性6ChrXp21.319728641-2041423200.014多态性7Chr13q21.220432851-2217397710.080致病8Chr8p11.2234735949-3488027510.139多态性9Chr11p11.1218965224-1908109213.429多态性10chrXq2318641409-2180166100.006多态性Figure13TheAffymetrixCytoScanHDAssayresultofthepatient.Chromosomalviewofthe18.393Mbdeletionatchromosomebands18p11.32-q11.1（136226-18529578）.图13患儿AffymetrixCytoScanHDAssay芯片结果：患儿存在18p11.32-q11.1（136226-18529578）区段缺失，缺失区段长度为18.393Mb。2.4qPCR验证结果我们在该片段的中间共设计了2对引物。利用qPCR技术对该患儿及其父母和妹妹的18p11.32-q11.1区域拷贝数进行检测。检测结果显示父母和妹妹18p11.32-q11.1区域拷贝数水平正常，患儿18p11.32-q11.1区域拷贝数存在缺失（图14）。39 上海交通大学医学院硕士学位论文Figure14TheReal-timePCRresultofthefamilymembers.图14患儿及其父母、妹妹Real-timePCR结果:患儿18p11.32-q11.1区域缺失，父母和妹妹拷贝数正常。3讨论18p缺失综合征的临床表现有很大的个体差异，因此和其他常染色体缺失综合征相比该类疾病诊断起来更加困难。18p缺失综合征典型的临床表现包括先天性心脏缺陷，脑发育异常主要伴有前脑无裂畸形，精神障碍，身材矮小和一些异常面容特征，例如独眼畸形、上睑下、圆脸、嘴角下弯、耳发育不良、斜视、眼距过宽和鼻子扁平。本研究利用染色体核型分析和AffymetrixCytoScanHD芯片技术，从染色体异常和拷贝数变异方向分析可能相关的致病原因。该患儿呈现出嘴角下弯、耳朵肥大、上睑下垂、斜视、眼距过宽、鼻子扁平等异常面容，同时伴有TOF（术后）、生长发育迟缓、智力障碍和视力减弱等临床表现。尽管18p缺失综合征临床表现多样，但患者的表型和报道的18p缺失综合征吻合。同时染色体核型分析和CytoScanHD芯片结果显示18p11.32-q11.1（136226-18529578）区段缺失，缺失区段长度为18.393Mb，该缺失区域包括87个OMIM基因，包括TGIF、TYMS、USP1、PTPN、THOC1、COLEC1、CETN1和CLUL1等基因，这些缺失基因均为单倍体剂量不足基因。根据以往文献报道以及分析后确定TYMS和TGIF1两个候选基因。40 上海交通大学医学院硕士学位论文3.118号染色体缺失伴其他染色体异常引起的心脏表型18p缺失综合征分为完全缺失和部分缺失两类，短臂完全缺失是引起上述临床表征的主要原因，部分短臂缺失通常是由于染色体的不平衡易位引起的，18号染色体缺失同时伴随其他染色体异常的报道很多。Decipher数据库编号为4092的患者18号染色体短臂150,408–4,564,563区间缺失，缺失长度为4.41Mb。同时该患者1号染色体236,054,857–248,865,374区间插入12.81Mb片段，患者身材矮小、三角脸、新生儿期黄疸持续时间长、PDA、CoA、小颌畸形、耳位偏低、胼胝体发育不全、腭裂和胆道闭锁等多发畸形。编号为266276的患者18号染色体131,700–5,780,829区间有5.65Mb缺失，同时伴随19号染色体275,925–5,431,142区间5.16Mb插入，患者表现为TOF和永存动脉干（PTA）。Sireteanu等报道一患者14号染[1色体和18号染色体出现易位，该患者的临床表型同时类似Turner综合征和18p缺失综合征17]。BeaterSchmidt报道了两例18号染色体和7号染色体发生不平衡易位，两个患者先天性[118]心脏缺陷的表型为BAV和TOF。本研究中的患儿不仅18p缺失，还发生13号和18号染色体的易位，患儿心脏表型为TOF。18p缺失综合征患者发生心脏缺陷的比例为10%左右，如果同时伴随其他染色体异常也会出现心脏缺陷且表型异常，由此可见18号染色体短臂缺失区域可能在心脏发育中起重要作用。3.218p缺失综合征常见临床表型候选基因TYMS和TGIF流行病学研究表明母孕期叶酸摄入可以显著降低先心病的发病比例，尤其是先天性心脏[119-127]间隔缺损（CCSDs）和圆锥动脉干畸形。TYMS（OMIM188350）亦称胸苷酸合成酶，[128]参与dTMP的合成，是DNA复制和修复的关键酶。目前很多研究都集中在TYMS编码区，从基因多态性和突变的角度探究其与许多疾病的联系，例如结肠癌、淋巴瘤和急性淋巴细胞[129-131]白血病。TYMS和MTHFR的底物都是5,10亚甲基四氢叶酸，血浆中的叶酸含量主要[132]和MTHFR多态性相关。因此很多报道在先心病病人中筛查TYMS非编区多态性并没有[133-135]发现，说明TYMS基因多态性可能并不是导致先心病发生的一个独立危险因素。叶酸[136]代谢途径对于DNA的从头合成和甲基化起主要作用，而胚胎心脏发育过程中DNA和蛋白质的甲基化和先天性心脏间隔缺损的发生关系密切，因此TYMS基因突变导致的功能和剂量变化均可能引起严重的心脏缺陷甚至死亡。41 上海交通大学医学院硕士学位论文TGIF基因位于18p11.3，属于TGIF同源结构域家族。TGIF可以抑制TGF-ß信号通路[137-139][140-141]，突变可以抑制和SMAD2的结合，从而导致HPE和肿瘤的发生。有研究在部[142]分HPE患者中检测到TGIF突变，18p缺失综合征除了HPE脑部异常表现还包括精神发育障碍，这提示我们18p在脑发育过程中起着重要作用。在本研究中，该患者虽然携带TGIF基因缺失但并未出现HPE，患儿表现出智力发育异常和认知功能障碍等其他脑功能缺陷，和之前文献报道仅有10%患儿出现HPE一致。本研究中我们通过染色体核型分析和CytoHD芯片技术检测，确定了该患儿染色体的缺失区域，并精确的定位在18号染色体和13号染色体。由此可见，芯片技术在发现染色体亚显微结构中有着重要作用，也为临床诊断提供了遗传学依据。通过对患儿缺失区域CNVs的分析，认为18p缺失综合征中的TYMS为综合征中出现心脏表型的主要候选致病基因，但具体机制仍有待进一步进行动物实验研究。42 上海交通大学医学院硕士学位论文结论1、本研究通过染色体核型分析、aCGH芯片，CytoScanHD技术确定了两个染色体异常患者的缺失区域，筛选分析出和其临床特征相关的候选基因。2、通过对9q31.1-q32区段缺失患者的临床表征进行比对，发现他们的临床表现和CdL综合征相似。3、该研究通过aCGH芯片及全外显子测序技术，首次把SMC2基因和CdLS联系在一起，扩展了CdLS的候选基因范围。4、18p缺失综合征患者中心脏缺陷可能和TYMS基因甲基化有关。43 上海交通大学医学院硕士学位论文课题局限性1.第一部分研究结果提示我们，由于只收集到一例CdLS缺失病人，需要进一步在CdLS中检测SMC2基因突变。2.针对携带18p染色体缺失的患者，其缺失区域很长但临床表型并不是十分明显，需要进一步明确TYMS基因甲基化在先心病中的作用。44 上海交通大学医学院硕士学位论文参考文献1.MoonsP,SluysmansT,DeWolfD,etal.Congenitalheartdiseasein111225birthsinBelgium:birthprevalence,treatmentandsurvivalinthe21stcentury.ActaPaediatr.2009,98(3):472-477.2.HoffmanJI,KaplanS.Theincidenceofcongenitalheartdisease.JAmCollCardiol.2002,39(12):1890-1900.3.vanderLindeD,KoningsEE,SlagerMA,etal.Birthprevalenceofcongenitalheartdiseaseworldwide:asystematicreviewandmeta-analysis.JAmCollCardiol.2011,58:2241-2247.4.RellerMD,StricklandMJ,Riehle-ColarussoT,etal.PrevalenceofCongenitalHeartDefectsinMetropolitanAtlanta,1998-2005.TheJournalofPediatrics.2008,153(6):807-813.5.AlanFung,CedricManlhiot,SapnaNaik,etal.ImpactofPrenatalRiskFactorsonCongenitalHeartDiseaseintheCurrentEra.JAmHeartAssoc.2013,2(3):e000064.6.WuMH,ChenHC,LuCW,etal.PrevalenceofcongenitalheartdiseaseatlivebirthinTaiwan.JPediatr.2010,156(5):782-785.7.DadvandP,RankinJ,ShirleyMD,etal.DescriptiveepidemiologyofcongenitalheartdiseaseinNorthernEngland.PaediatrPerinatEpidemiol.2009,23(1):58-65.8.GilboaSM,SalemiJL,NembhardWN,etal.MortalityresultingfromcongenitalheartdiseaseamongchildrenandadultsintheUnitedStates,1999to2006.Circulation.2010,122(22):2254-2263.9.MoonsP,BovijnL,BudtsW,etal.Temporaltrendsinsurvivaltoadulthoodamongpatientsbornwithcongenitalheartdiseasefrom1970to1992inBelgium.Circulation.2010,122(22):2264-2272.10.KhairyP,Ionescu-IttuR,MackieAS,etal.Changingmortalityincongenitalheartdisease.JAmCollCardiol.2010,56:1149-1157.11.SunR,LiuM,LuL,etal.Congenitalheartdisease:causes,diagnosis,symptoms,andtreatment.CellBiochemBiophys.2015,feb1.45 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上海交通大学医学院硕士学位论文137.MelhuishTA,WottonD.Theinteractionofthecarboxyl-terminus-bindingproteinwiththeSmadcorepressorTGIFisdisruptedbyaholoprosencephalymutationinTGIF.JBiolChem.2000,275(50):39762-39766.138.WottonD,KnoepflerPS,LahertyCD,etal.TheSmadtranscriptionalcorepressorTGIFrecruitsmSin3.CellGrowthDiffer.2001,12(9):457-463.139.LoRS,WottonD,MassagueJ.EpidermalgrowthfactorsignalingviaRascontrolstheSmadtranscriptionalco-repressorTGID.EMBOJ.2001,20(1):128-136.140.GrippKW,WottonD,EdwardsMC,etal.MutationsinTGIFcauseholoprosencephalyandlinkNODALsignalingtohumanneuralaxisdetermination.NatGenet.2000,25(2):205-208.141.NakakukiK,ImotoI,PimkhaokhamA,etal.Noveltargetsforthe18p11.3amplificationfrequentlyobservedinesophagealsquamouscellcarcinomas.Carcinogenesis.2002,23(1):19-24.142.ChenCP,HuangJP,ChenYY,etal.Chromosome18pdeletionsyndromepresentingholoprosencephalyandpremaxillaryagenesis:prenataldiagnosisandaCGHcharacterizationusingunculturedamniocytes.Gene.2013,527(2):636-641.57 上海交通大学医学院硕士学位论文致谢白驹过隙，忽然而已。转眼间来到上海已经有三年的时间了。此时樱花随四月悄悄走来，尽管对这个充满魅力的城市有诸多不舍，但时间的齿轮不曾停止，我依然要继续前行。还记得三年前初来这里，当时的我懵懂迷茫，对未来的一切怀有强烈的好奇心，又对自己的能力持怀疑态度。现如今，当我完成我的硕士学位论文，看着自己三年来的学术成果时百感交集，想起三年来给予我帮助和照顾的良师益友，太多的感谢涌入心间。感谢恩师陈笋老师。陈老师在我硕士生涯的三年学习生活中给予了我莫大的帮助和关怀，从论文选题、临床研究到撰写的每个过程，均隐射着老师的用心良苦和悉心栽培。陈老师经常说：“小儿科并不是成人科的缩小版，真正意义上掌握并理解儿科并非易事。”三年间的言传身教让我深深的热爱上了小儿心血管这个特殊的学科。门诊中陈老师都会从患者角度考虑，尽量照顾患者的感受。遇到危重病人或术后患者出现情况，无论多晚陈老师都会从家里赶到医院进行及时的处理，让我感慨颇多。感谢陈老师做出的榜样，为我今后的执医生涯指明方向，让我重新思考了当初学医的初衷。衷心感谢小儿心血管科的陈树宝教授。陈教授虽然年近古稀，但他为人和蔼，思路清晰，思维敏捷，我们都敬称他为陈爷爷。每周跟随陈爷爷的门诊已经成为我学习临床技能，培养科研思维的主要方式之一。门诊中，陈爷爷对待每一个患者的耐心态度和细心询问都曾深深的震撼着我。由于科室患者群体的特殊性，面对每一个前来咨询检查的准妈妈，陈爷爷都会尽量以一种通俗易懂的方式让患者了解疾病的本身、疾病的病情发展和可能出现的后果，最大程度上减轻患者的焦虑，从一点一滴中让我真正明白医者仁心的深刻内涵。感谢小儿心血管科的孙锟教授和科研中心的徐让教授。孙教授为人幽默风趣，平易近人且学富五车。孙老师总是把生活中一些蕴含深刻哲理的事情当成故事讲给我们，他将寓教于乐渗透到我们生活的各个方面。孙老师的工作十分繁忙，但他总会不定期的抽出时间询问我的近况，有时尽管是三言片语，但已经给了我很多鼓励。徐老师是我的科研指导老师，三年来是徐老师让我从一个科研初入门者变成了科研思路清晰的硕士研究生。遥想三年间和徐老师相处的点滴使我明白，科研工作者严谨的科研态度和一丝不苟的工作精神对科研工作来说有着十分重要的意义。十分感谢两位老师在科研和生活中对我的帮助和关怀。58 上海交通大学医学院硕士学位论文感谢武育蓉老师、沈加老师、孙晶老师、焦先婷老师、陶芳芳老师以及超声室的姚丽萍老师、赵丽娇老师和席丽丽老师在超声及临床方面的指导，是你们让我逐渐了解了超声心动图看图说话的魅力，了解和患者沟通的技巧和态度的重要性。感谢科研中心的冯超老师、唐宁老师、许勤老师和钮蓓蓓老师，三年间正是你们的辛勤工作和付出让我在科研工作中节约了大量的宝贵时间。感谢王丽丽老师和龙飞老师教会我芯片分析技术和实验操作技术，让我了解了很多当今科研前沿工作。感谢徐月娟师姐，师姐几乎每天都是最早到达实验室，最后一个从实验室离开的人，努力刻苦的工作态度让我坚信付出就一定会有回报，也让我看到科研人该有的严谨和认真，在我疲惫倦怠时时刻激励着我；感谢远在美国的方绍海师兄和加拿大的李文娟师姐在科研中对我的耐心指导；感谢郭倩倩师姐、辛甜甜师姐、谢静师姐和张玲雪子师姐，犹记得研一时你们对我的照顾和关怀，让我初来上海的不适和担忧很快得到了调整。三年间我的生活中因你们的出现而变得有所不同，师姐们对我课题上的帮助和生活上的陪伴让我今后无论走到哪里心里都是满满的感激之情；感谢曹瑞雪同学，本课题在研究过程中曹瑞雪同学付出了很多，温婉的性格使我们之间的相处十分融洽；感谢王丽平师姐、马周瑞师兄、于云鹏师兄、汪希柯师姐、王鉴同学、刘洋师妹、刘惠东师弟、李婷婷师妹、汪晴师妹、赵丽晴师妹、徐丽娟师妹、张尔格师妹和刘春洁师妹等三年来的陪伴和照顾，因为有你们，精彩继续。感谢我的寝室同学叶园园、王军和陈晓梦同学，尽管我们每个人性格迥异，生活习惯不同，但三年的相处过程却一直十分融洽，感谢你们三年来的陪伴。感谢王琛同学、张晓曼同学和叶婷婷同学，在我心情焦虑，科研学习不顺利，生活遇到挫折时你们总是会第一时间给予我安慰和鼓励，三年来我们相处的点点滴滴总是会萦绕在我的心头，每每回想起这些都是我人生生涯中宝贵的财富。今后我们可能因为学业和生活天各一方，但我们的友情不会有任何改变，有了你们，我的生活才多姿多彩。感谢我的父母，给予我最宝贵的生命，二十多年的悉心照顾和养育几乎倾注了你们全部的心血。是你们在我每一次的人生决定中都给予了我无条件的支持，是你们在我遇到困难挫折想要放弃时不断的给我力量和信心，是你们让我懂得了做人的大智慧和相处的小细节，让我在跌跌撞撞的二十多年人生中学到了不可多得的经验。感谢我生命中曾出现的很多人，是你们的出现成就了今天的我，感激并珍惜每一次和你们的相遇。59 上海交通大学医学院硕士学位论文毕业在即，生活未完，精彩继续。60 上海交通大学医学院硕士学位论文学术论文和科研成果目录##1.CaoR,PuT,FangS,LongF,XieJ,XuY,ChenS,SunK,XuR.PatientsCarrying9q31.1-q32DeletionShareCommonFeatureswithCorneliadeLangeSyndrome.CellPhysiolBiochem.2015;35(1):270-80.#*2.PuT,GuoQQ,CaoRX,XuR,SunK,ChenS.UsingexomesequencingtoidentifythecauseofmyocardialhypertrophyinaChinesefamily.MolecularMedicineReports.2015.（已接收）3.蒲田，谢静，杨健萍，陈笋，沈加。上海地区汉族川崎病患者CD40基因单核苷酸多态性分析。上海交通大学学报医学版。2015；35（2）：233-237。61