腺病毒36型在诱导人脂肪源性干细胞棕色分化中的作用初探

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分类号：Ｒ３４密级：公开单位代码：１０７６０学号２１５８２９５：１０７６０新疆医科大学ＸｉｎＪｉａｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙ硕士学位论文ＴＨＥＳＩＳＯＦＭＡＳＴＥＲＤＥＧＲＥＥ学术性学位（学历教育）论文题目：腺病毒３６型在诱导人脂肪源性干细胞棕色分化中的作用初探研究生刘玲指导教师关亚群教授学科专业名称生物化学与分子生物学研究方向肥胖相关代谢性疾病的分子机制研究起止时间～２０１６年１２月２０１８年３月所在学院基础医学院２０１８年；３月 腺病毒36型在诱导人脂肪源性干细胞棕色分化中的作用初探研究生刘玲指导教师关亚群教授学科专业名称生物化学与分子生物学研究方向肥胖相关代谢性疾病的分子机制2018年3月 Preliminarystudyonbrowndifferentiationofhumanadipose-derivedmesenchymalstemcellinducedbyadenovirustype36ＡDissertationSubmittedtoXinjiangMedicalUniversityInPartialFullfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasteroffNaturalScienceByLiuLingBiochemistyandMolecularbiologyDissertationSupervisor:prof.YaqunGUANMarch,2018 同意 中英文缩略词对照表英文缩写英文全名中文译名Ad36adenovirustype36腺病毒36型Akt丝氨酸/苏氨酸AktAktserine/threonineproteinkinase蛋白激酶ATPsynthase,H+transporting,ATP5OmitochondrialF1complex,OATP合成酶，O亚基subunitBATbrownadiposetissue棕色脂肪组织BMIbodymassindex体重指数C/EBP-βCCAAT/enhancer-bindingprotein-βCCAAT增强子结合蛋白βCcOcytochromecoxidase细胞色素c氧化酶celldeath-inducingDNA细胞死亡诱导DFFA样效CIDEAfragmentationfactorA-likeeffector应AAcelldeath-inducingDNA细胞死亡诱导DFFA样效CIDEBfragmentationfactorA-likeeffector应BBcelldeath-inducingDNA细胞死亡诱导DFFA样效CIDECfragmentationfactorA-likeeffector应CCCOX5Bcytochromecoxidasesubunit5B细胞色素c氧化酶亚基5B DIO2iodothyroninedeiodinase2Ⅱ型脱碘酶dUTPasedeoxyuridinetriphosphokinase脱氧尿苷三磷酸激酶E4ORF1earlyregion4openreadingframe1早期开放阅读框1EBF2earlyBcellfactor2早期b细胞因子2ETCelectrontransportchain电子传递链FBSfetalbovineserμm胎牛血清FGF21fibroblastgrowthfactor21成纤维细胞生长因子21FSP27fat-specificprotein27脂肪特异性蛋白27humanadipose-derivedhADSC人脂肪源性干细胞mesenchymalstemcelliPSCinducedpluripotentstemcell诱导型多功能干细胞IRinsulinresistance胰岛素抵抗LDlipiddroplet脂滴LEPleptin瘦素 Lipo3000lipofectamine3000脂质体3000LncRNAlongchainnoncodingRNA长链非编码RNALncRNARORlongchainnoncodingRNAROR长链非编码RNARORMCP-1monocytechemoattractantprotein-1单核细胞化学引诱物蛋白1MOImultiplicityofinfection感染复数mRNAmessengerribonucleicacid信使核糖核酸mitochondriallyencodedATPMT-ATP6线粒体编码的ATP合酶6synthase6mitochondriallyencodedNADH线粒体编码的NADH脱氢MT-ND2dehydrogenase2酶2OXPHOSoxidativephosphorylation氧化磷酸化peroxisomeproliferater-activated过氧化物酶增值激活受体γPgc1αreceptorγ-coactivator1α共激活剂1αperoxisomeproliferater-activatedPPARγ过氧化物酶增值激活受体γreceptorγPRDM16PR/SETdomain16PR/SET功能域16realtimequantitative-polymerase实时荧光定量聚合酶链反RT-qPCRchainraction应 siRNAsmallinterferingRNA小干扰RNAT33，5，3’-triiodothyronine三碘甲腺原氨酸T43，5，3’，5’-tetraiodothyronine四碘甲腺原氨酸TRthyroidhormonereceptor甲状腺激素受体UCP1uncouplingprotein1解偶联蛋白1VLDLverylowdensitylipoprotein极低密度脂蛋白WATwhiteadiposetissue白色脂肪组织WBwestern-blot蛋白质免疫印迹Zfp516zincfingerprotein516锌指蛋白516β-actinβ-actinβ肌动蛋白 目录摘要.....................................................................................................................................1ABSTRACT..........................................................................................................................3前言.....................................................................................................................................5研究内容与方法...................................................................................................................81实验材料........................................................................................................................81.1实验对象.................................................................................................................81.2主要试剂及配制方法.............................................................................................91.3RNA提取及RT-qPCR所需主要试剂.................................................................91.4Western-blotting相关主要试剂及耗材................................................................91.5Western-blotting主要试剂的配制......................................................................101.6本研究所使用的主要仪器...................................................................................112实验内容与方法..........................................................................................................122.1复制Ad36诱导hADSC分化模型和鸡尾酒诱导hADSC分化模型..............122.2油红O染色观察细胞成脂情况..........................................................................142.3Ad36和鸡尾酒法诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，LncRNAROR、棕色脂肪细胞分化标记基因、线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因、LeptinmRNA表达水平的检测............................................................................................142.4Ad36和鸡尾酒法诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，LncRNAROR、棕色脂肪细胞分化标记基因、线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因、Leptin蛋白质表达水平的检测.............................................................................................162.5siRNA敲低LncRNAROR后，hADSC分化为脂肪细胞过程中，对照组和敲低组中，棕色脂肪细胞分化标记基因、线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因mRNA表达水平的检测...............................................................................172.6siRNA敲低LncRNAROR后，hADSC分化为脂肪细胞过程中，对照组和敲低组中，棕色脂肪细胞分化标记基因、线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因蛋白质表达水平的检测.................................................................................182.7利用透射电镜的方法观察并计算在hADSC诱导分化过程中两组线粒体数量的变化和差异.....................................................................................................183质量控制......................................................................................................................204统计学处理..................................................................................................................20结果...................................................................................................................................23讨论...................................................................................................................................47小结...................................................................................................................................52致谢...................................................................................................................................53 参考文献.............................................................................................................................54综述...................................................................................................................................61攻读硕士期间发表的学术论文.........................................................................................70导师评阅表.........................................................................................................................71 腺病毒36型在诱导人脂肪源性干细胞棕色分化中的作用初探研究生:刘玲导师:关亚群教授摘要目的：初步探讨腺病毒36型（adenovirustype36，Ad36）在诱导人脂肪源性干细胞分化为棕色脂肪细胞中的作用。方法：（1）分别用鸡尾酒法和Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞，于诱导第2、4、6、8天油红O染色观察细胞成脂情况。（2）分别收取鸡尾酒法诱导组和Ad36诱导组第0、2、4、6、8天的细胞，RT-qPCR方法检测两组中的LncRNAROR，棕色脂肪细胞分化标记基因Cidea、Dio2、Fgf21、Ucp1、Prdm16，线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因Cox5b、Atp5o、Atp6、Nd2以及LeptinmRNA表达水平；Western-blotting检测两组中上述基因蛋白质表达水平。（3）siRNA敲低LncRNAROR后，Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，分别收取敲低组和对照组第0、1、2、3、4天的细胞，RT-qPCR和Western-blotting方法分别检测上述基因的mRNA和蛋白质表达水平。（4）利用透射电镜的方法观察并计算在诱导分化过程中鸡尾酒法诱导组和Ad36诱导组线粒体数量的变化和差异。结果：（1）油红O染色结果显示：hADSC分化为脂肪细胞过程中，鸡尾酒诱导组的脂肪细胞中脂滴较大，而Ad36诱导组则是颗粒状较小脂滴。（2）RT-qPCR和Western-blotting结果显示，hADSC分化为脂肪细胞过程中，与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组中LncRNAROR、Cidea、Dio2、Fgf21、Ucp1、Prdm16、Cox5b、Atp5o、Atp6、Nd2mRNA及蛋白质表达水平较鸡尾酒法诱导组显著升高，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）；LeptinmRNA及蛋白质表达水平较鸡尾酒法诱导组显著降低，且差异有统计学意义（P<0.01）。（3）siRNA敲低LncRNAROR后，Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，与对照组相比，Cidea、Dio2、Fgf21、Ucp1、Prdm16、Cox5b、Atp5o、Atp6、Nd2mRNA及蛋白质表达水平较对照组显著降低，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。（4）透射电镜观察到，在脂肪细胞分化过程中，与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组细胞内的线粒体数量显著升高，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。结论：Ad36可能通过上调LncRNAROR加快了线粒体氧化1 磷酸化和能量消耗，进而促进了hADSC向棕色脂肪细胞分化。关键词:人脂肪源性干细胞；腺病毒36型；解偶联蛋白1；线粒体；棕色分化2 Preliminarystudyonbrowndifferentiationofhumanadipose-derivedmesenchymalstemcellinducedbyadenovirustype36Postgraduate:LiuLingSupervisor:Prof.GUANYaqunAbstractObjective:Toinvestigatetheroleofadenovirustype36(Ad36)intheinductionofdifferentiationofhumanadipose-derivedmesenchymalstemcellsintobrownadipocytes.Methods:(1)hADSCswereinducedbycocktailandAd36respectively,andstainedwithoilredO.Thecellswereobservedforadipogenesisat2,4,6,and8daysafterinduction.(2)CellsofthecocktailinductiongroupandAd36inductiongroupwerecollectedondays0,2,4,6,and8respectively.TheRT-qPCRmethodwasusedtodetecttheLncRNARORinthetwogroups,andbrownadipocytedifferentiationmarkergenesCidea,Dio2,Fgf21,Ucp1,Prdm16,mitochondrialrespiratorychainandoxidativephosphorylation-relatedgenesCox5b,Atp5o,Atp6,Nd2,Leptin,etc.mRNAexpressionlevels;Western-blottingdetectionoftheabovetwogenesintheproteinexpressionlevels.(3)IntheprocessofhADSCdifferentiationinducedbyAd36,LncRNARORwasknockeddownbysiRNA,andcellsfromknock-downgroupandcontrolgroupwereharvestedondays0,1,2,3,and4respectively.RT-qPCRandWestern-blottingmethodswereusedtodetecttheabove-mentionedbrownadipocytedifferentiationmarkergenes,mitochondrialrespiratorychainandoxidativephosphorylation-relatedenzymesmRNAandproteinexpressionlevels.(4)Usingtransmissionelectronmicroscopytoobserveandcalculatethechangesanddifferencesinthenumberofmitochondriaduringinductionofdifferentiation.Results:(1)TheresultsofoilredOstainingshowedthatinthedifferentiationprocessofhADSC,lipiddropletsintheadipocytesofthecocktail-inducedgroupwerelarger,whilethoseintheAd36-inducedgroupweregranularsmallerlipiddroplets.(2)RT-qPCRandWestern-blottingresultsshowedthatinthedifferentiationprocessofhADSC,LncRNA3 ROR,Cidea,Dio2,Fgf21,Ucp1,Prdm16,Cog5b,Atp5o,Atp6,Nd2intheAd36-inducedgroupcomparedwiththecocktail-inducedgroup.ThemRNAandproteinexpressionlevelsweresignificantlyincreased,andthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.01orP<0.05).ThemRNAandproteinexpressionlevelsofLeptinweresignificantlydecreased,andthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.01).(3)ThemRNAandproteinexpressionlevelsofCidea,Dio2,Fgf21,Ucp1,Prdm16,Cox5b,Atp5o,Atp6,andNd2weresignificantlydecreasedafterknockdownoftheLncRNARORbyAd36-inducedhADSCdifferentiation.Thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.01orP<0.05).(4)Transmissionelectronmicroscopyshowedthatduringadipocytedifferentiation,thenumberofmitochondriaintheAd36-inducedgroupwassignificantlyhigherthanthatinthecocktail-inducedgroup,andthedifferencewasstatisticallysignificant.Conclusion:Ad36mayacceleratemitochondrialoxidativephosphorylationandenergyexpenditurebyup-regulatingLncRNAROR,whichinturnpromotesthedifferentiationofhADSCintobrownadipocytes.Keywords:humanadipose-derivedmesenchymalstemcells;adenovirustype36;uncouplingprotein1;mitochondria;browndifferentiation4 新疆医科大学硕士学位论文前言肥胖症(obesity)是遗传和环境等多种因素相互作用所引起的体内脂肪堆积过多[1-4]和（或）分布异常、体重增加的慢性代谢性疾病。根据世界卫生组织统计，2016年全球已有6.5亿人肥胖，肥胖患病率达13%。我国«2014年国民体质监测公报»显示，成年人和老年人肥胖患病率分别为10.5%和13.9%。肥胖症作为代谢综合征的主要组分之一，与多种疾病如2型糖尿病、血脂异常、高血压、冠心病、脑卒中、肿[1-4]瘤等密切相关。肥胖症及其相关性疾病损害了患者的身心健康，使生活质量下降，[1-4]预期寿命缩短。因此，探究肥胖症的发病机制具有重要意义。腺病毒(adenovirus)是一种二十面体、非包膜、双链DNA病毒家族，其直径从[5-9]65纳米到80纳米不等，目前根据它们的血凝特性和序列同源性，将它们分为A、[5-9]B、C、D、E、F、G等7个亚组，Ad36属于腺病毒7个亚组中的D亚组，是一种与肥胖相关的病毒。在人类中，虽然自然暴露于Ad36可以引起脂肪含量的增多和[5-9]肥胖的产生，但胰岛素敏感性增加，血糖控制也更佳。此外，Ad36已被证明可以减少瘦素(leptin,LEP)的表达和分泌，并且Ad36可通过肝脏细胞促进脂质和葡萄糖的[5-9]摄取，从而诱导细胞内脂质积累。瘦素是由肥胖基因（obgene）表达的蛋白质，主要由白色脂肪细胞合成和分泌。因此，从上述研究结果得到提示，Ad36可能在脂肪细胞分化过程中抑制了白色脂肪细胞标记基因的表达。但是Ad36在诱导人脂肪源性干细胞分化为棕色脂肪细胞中的作用尚不清楚。长链非编码RNAROR(longchainnoncodingRNAROR,LncRNAROR）在胚胎干[10-18]细胞和诱导型多能干细胞(inducedpluripotentstemcell,iPSC)中高度表达。最近研究表明，LncRNAROR可以实现人类羊膜上皮细胞(humanamnioticepithelialcells,HuAECs)多能性的维持和提高他们分化成胰岛β细胞的效率，并且在糖尿病患[10-18]者和动物模型中已经证明，LncRNAROR可以帮助恢复胰岛功能。因此，LncRNA[10-18]ROR可能是一个潜在的治疗糖尿病的靶点。本课题组前期RNA-seq结果显示，hADSC分化为脂肪细胞过程中，与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组中LncRNAROR的相对表达量是鸡尾酒法诱导组的5.25倍；RT-qPCR结果也显示，hADSC分化为脂肪细胞过程中，与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组LncRNARORmRNA相对表达水平显著升高，且差异有统计学意义（P<0.01）。上述结果提示LncRNAROR可能在Ad36诱导的hADSC分化过程中发挥作用。白色脂肪组织(whiteadiposetissue,WAT)，不仅通过储存和水解甘油三酯来控制机体脂肪和能量利用，还通过产生内分泌因子参与调节饱腹感、能量利用、葡萄糖[19]敏感性、胰岛素敏感性和炎症等重要生理生化过程。因此，与肥胖相关的代谢性5 新疆医科大学硕士学位论文[19]疾病和心血管疾病与WAT中的分子事件有着密切关系。棕色脂肪组织(brownadiposetissue,BAT)富含线粒体，表达线粒体解偶联蛋白1(uncouplingprotein[20-23]1,UCP1)。UCP1位于棕色脂肪细胞的线粒体内膜上，它的作用是使呼吸链的电子传递和ADP磷酸化解偶联，从而将储存在线粒体质子梯度中的电化学势能转化为[20-23]热能。UCP1是哺乳动物脂肪产热的主要驱动因素，有研究显示，UCP1的产热[19-28]活动可以降低肥胖的发生并提高胰岛素的敏感性。PRDM16(PRdomain16,PRDM16)，用于调节脂肪组织中棕色脂肪细胞的分化、产热和能量消耗，在棕色+脂肪细胞发育中起到关键的作用，被认为是调控Myf5的前体细胞发展为肌细胞或棕[29-30]色脂肪细胞的开关。本课题组的前期研究结果显示，hADSC分化为脂肪细胞过程中，在鸡尾酒法诱导组和Ad36诱导组中均检测到棕色脂肪细胞分化标记基因Prdm16和Ucp1的表达，但在Ad36诱导组中Prdm16和Ucp1的mRNA表达水平明显升高，这提示Ad36诱导的hADSC分化可能是一种不同与鸡尾酒法诱导的棕色分化。CIDEA(celldeath-inducingDNAfragmentationfactorA-likeeffectorA,CIDEA)，是一种涉及细胞凋亡和转录调控的多功能蛋白，在成人棕色脂肪组织中含量丰富；在大鼠冷暴露情况下，CIDEA在WAT中含量明显增加提示了它在脂肪细胞棕色分化中[31-38]的可能作用。二型脱碘酶(iodothyroninedeiodinase2,DIO2)含有一种含硒半胱氨酸的活性中心，在棕色脂肪细胞中DIO2的表达促进了Ucp1和Pgc1a(peroxisome[39-46]proliferater-activatedreceptorγ-coactivator1α,Pgc1a)的表达。人类成纤维细胞生长因子21(fibroblastgrowthfactor21,FGF21)是FGF超级家族的一种内分泌成员，其主[47-57]要作用是调节糖脂代谢和能量平衡,是棕色脂肪细胞产热和营养代谢的调节器。[58-68]线粒体氧化磷酸化是生物体生成ATP的主要方式。在此过程中，位于线粒体内膜上的一系列酶和辅酶构成复合体，这些复合体在将代谢物脱下的氢原子逐次传递给O2的过程中产生质子梯度，并最终将质子梯度中的势能通过线粒体合酶转化[75-81]为ATP中的化学能，完成氧化磷酸化。NADH脱氢酶2(NADHdehydrogenase，ND2)、细胞色素c氧化酶亚基5B(cytochromecoxidasesubunit5B，COX5B)、AT+P合酶亚基O(ATPsynthase,Htransporting,mitochondrialF1complex,Osubunit，[58-81]ATP5O)、ATP合酶F0亚基6(ATPsynthaseF0subunit6)均是参与此过程的酶。[58-81]这些酶的高表达或高活性状态可促进脂肪细胞中能量生成或产热增加。有文献报道，脂肪细胞产热的增加提示了棕色脂肪细胞功能的活跃或白色脂肪组织棕色化[58-81]的发生。综合分析文献报道和课题组前期研究结果，本研究在Ad36诱导的人脂肪源性干细胞分化和鸡尾酒法诱导的人脂肪源性干细胞分化细胞模型基础上，通过使用RT-qPCR、Western-blotting、透射电镜、siRNA敲低、油红O染色等技术与方法，6 新疆医科大学硕士学位论文检测了hADSC分化为脂肪细胞过程中，Ad36诱导组和鸡尾酒法诱导组中LncRNAROR，棕色脂肪细胞分化标记基因Cidea、Dio2、Fgf21、Ucp1、Prdm16，线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因Cox5b、Atp5o、Atp6、Nd2以及Leptin表达水平的差异，以及LncRNAROR敲低后上述检测指标的表达差异，从分子和细胞形态学的角度初步探讨了Ad36可能通过LncRNAROR在诱导人脂肪源性干细胞分化为棕色脂肪细胞中的作用。7 新疆医科大学硕士学位论文研究内容与方法1实验材料1.1实验对象1.1.1研究对象本实验的研究对象是本课题组前期已分离并经鉴定的冻存细胞hADSC。1.1.2病毒腺病毒36型病毒悬液来自课题组前期购自ATCC。1.1.3样本保留hADSC保存在液氮中，Ad36病毒悬液冻存在-80℃低温冰箱中。1.2主要试剂及配制方法1.2.1细胞培养主要试剂及实验耗材主要试剂及耗材生产商DMEM低糖培养基HyClone公司(Austria)FBS无菌液体HyClone公司(Austria)胰酶溶液HyClone公司(Austria)青/链霉素双抗溶液HyClone公司(Austria)地塞米松粉剂Sigma-Aldrich(USA)胰岛素粉剂Roche(USA)3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）粉剂Sigma-Aldrich(USA)吲哚美辛粉剂Sigma-Aldrich(USA)50mL无菌离心管Corning(USA)15mL无菌离心管Corning(USA)20mL无菌注射器Millipore(USA)0.22μm无菌滤器Millipore(USA)细胞无菌培养皿Corning(USA)细胞无菌冻存管Corning(USA)移液枪Eppendorf油红O染液Sigma-Aldrich(USA)D-PBSHyClone公司(Austria)1.2.2细胞培养相关试剂的配制1.2.1.1DMEM低糖完全培养基配制超净台内配制，DMEM低糖完全培养基溶液8 新疆医科大学硕士学位论文（50mL）=青/链霉素双抗溶液（0.5mL，终浓度为1000U/mL）+FBS溶液（5mL）+DMEM低糖基础培养基溶液（44.5mL）。1.2.1.2油红O染液工作液配制按油红O染液:ddH2O=3:2比例稀释，配制成油红O染液工作液，0.22μm无菌滤器过滤后使用，现配现用。1.2.1.3胰岛素溶液配制称取100mg胰岛素粉剂，将其溶于100mL双蒸水中，配制成胰岛素母液，在超净台内用0.22μm无菌滤器过滤后，封口膜封口，-20℃保存待用，使用时工作液浓度为10μg/mL。1.2.1.4吲哚美辛溶液配制称取35.8mg吲哚美辛粉剂加入5mL乙醇溶液成淡黄色液体，配制成浓度为20mmol/L的吲哚美辛母液，在超净台内用0.22μm滤器无菌过滤后，封口膜封口，4℃保存待用，使用时工作液浓度为200μmol/L。1.2.1.53-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液配制称取115mgIBMX粉剂，将其用0.2MKOH10mL溶解，配制成IBMX母液后，超净台内用0.22μm无菌滤器过滤后，封口膜封口，-20℃保存待用，使用时工作液浓度为115μg/mL。1.2.1.6地塞米松溶液配制称取39mg地塞米松粉剂，将其溶于75%的乙醇溶液，加超纯水至100mL，配制成地塞米松母液，在超净台内用0.22μm无菌滤器过滤后，封口膜封闭，-20℃保存待用，使用时工作液浓度为3.9µg/mL。1.2.1.7鸡尾酒法成脂诱导液配制在超净台内配制，鸡尾酒法成脂诱导液（50mL）=青/链霉素双抗溶液（0.5mL，终浓度为1000U/mL）+胰岛素工作液（0.5mL）+吲哚美辛工作液（0.5mL）+地塞米松工作液（0.5mL）+IBMX工作液（0.5mL）+FBS（5mL）+DMEM低糖基础培养基溶液（42.5mL）。1.3RNA提取及RT-qPCR所需主要试剂试剂名称试剂产地QIAzolQIAGENE公司，德国RNase-Free异丙醇Merck公司，德国RNase-Free乙醇Merck公司，德国RNase-Free氯仿Sigma公司，美国RNase-freewaterTiangen公司，上海逆转录试剂盒（K1622）Thermo公司，美国TMSYBRSelectMasterMix（4472908）Thermo公司，美国1.4western-blot相关主要试剂及耗材试剂名称试剂产地SDS-PAGE凝胶配制试剂盒北京索莱宝公司，中国RIPA裂解液Thermo公司,美国9 新疆医科大学硕士学位论文蛋白酶抑制剂Thermo公司，美国EDTA溶液Thermo公司，美国PMSF溶液Thermo公司，美国细胞刮刀Corning公司，美国1.5mL无菌无酶EP管Axygen公司，美国PBS粉(配2000mL规格)武汉博士德公司，中国脱脂牛奶粉剂北京索莱宝公司，中国BCA蛋白质定量试剂盒Thermo公司，美国4×蛋白质上样缓冲液北京索莱宝公司，中国甘氨酸（Glycine）粉剂北京索莱宝公司，中国Tris粉剂北京索莱宝公司，中国SDS粉剂武汉博士德公司，中国PVDF膜Roche公司，美国彩色蛋白Marker（26616）Thermo公司，美国Tween20武汉博士德公司，中国显影定影试剂盒武汉博士德公司，中国小鼠β-actin抗体（TA-09）北京中杉金桥，中国Anti-CIDEA抗体（ab151577）Abcam公司，英国DIO2polyclonal抗体（E-AB-16392）武汉伊莱瑞特公司，中国Anti-FG21抗体（ab57059）Abcam公司，英国UCP1polyclonal抗体（EAP1663）武汉伊莱瑞特公司，中国Anti-PRDM16抗体（ab106410）Abcam公司，英国RabbitAnti-Leptin抗体（bs-0409R）Bioworld公司，美国MT-ND2polyclonal抗体（bs60187）Bioworld公司，美国ATP5Opolyclonal抗体（bs71080）Bioworld公司，美国ATP6polyclonal抗体（bs05340）Bioworld公司，美国COX5Bpolyclonal抗体（E-AB-40083）武汉伊莱瑞特公司，中国辣根酶标记山羊抗兔IgG（ZB-2301）北京中杉金桥公司，中国辣根酶标记山羊抗鼠IgG（ZB-2305）北京中杉金桥公司，中国1.5Western-blotting主要试剂的配制1.5.1蛋白质裂解液的配制蛋白质裂解液（1mL）=RIPA裂解液（970μL）+100×蛋白酶抑制剂（10μL）+100×EDTA溶液（10μL）+100×PMSF溶液（10μL）1.5.2蛋白质电泳缓冲液的配制10 新疆医科大学硕士学位论文1L蛋白质电泳缓冲液=甘氨酸（14.4g）+Tris粉（3.3g）+SDS粉（1g）+蒸馏水（1L）1.5.3蛋白质转膜缓冲液的配制1L蛋白质转膜缓冲液=甘氨酸（28.8g）+Tris粉（6g）+甲醇溶液（200mL）+蒸馏水（800mL）1.5.41×PBS缓冲液的配制将一包PBS粉溶解于2L蒸馏水即成1×PBS缓冲液。1.5.51×PBST缓冲液的配制1×PBST（2L）=1×PBS缓冲液（2L）+Tween20（1mL）1.5.65%脱脂牛奶的配制5%脱脂牛奶（100mL）=5g脱脂奶粉+100mL1×PBST缓冲液1.5.72.5%脱脂牛奶的配制2.5%脱脂牛奶（100mL）=2.5g脱脂奶粉+100mL1×PBST缓冲液1.6本研究所使用的主要仪器仪器名称仪器产地37℃，5%CO2培养箱HEALFORCE公司，日本高速低温离心机Eppendorf公司，美国生物安全柜SW-CJ-2FD，苏州荧光倒置显微镜LeicaDMI4000B/DM5000B，德国-20℃低温冰箱Haier公司，中国-80℃超低温冰箱Thermo公司，美国高压蒸汽灭菌器SANYO公司，型号：mLS-3750涡旋震荡器上海环球药化仪器厂，型号WH-851低速离心机KDC-40，中国电子分析天平青海仪器公司，上海伯乐全波长酶标仪BIORAD公司，美国伯乐垂直电泳/转膜仪BIORAD公司，美国X光片夹BIORAD公司，美国TMVeriti96-wellThermalCycler（ABI9902）Thermo公司，美国电泳仪BIORAD公司，美国TM凝胶成像仪NUARE公司，日本掌上型迷你离心机Kylin-Bell公司，型号LX-400实时荧光定量PCR热循环仪ABI公司，美国11 新疆医科大学硕士学位论文2实验内容与方法2.1复制Ad36诱导hADSC分化模型及鸡尾酒法诱导hADSC分化模型2.1.1细胞培养2.1.1.1细胞复苏超净台内配制新鲜DMEM低糖完全培养基，DMEM低糖完全培养基溶液（50mL）=青/链霉素双抗溶液（0.5mL，终浓度为1000U/mL）+FBS溶液（5mL）+DMEM低糖基础培养基溶液（44.5mL）。从液氮罐中取出一支hADSC冻存细胞，将冻存管迅速置于一干净的PE手套中，随后迅速将其置37℃水浴箱中并快速摇晃使其快速融化，待其完全融化后用75%的医用酒精喷洒至冻存管表面，用医用无菌纱布擦拭后置超净台内，快速将细胞悬液（约1mL）加至含有19mLDMEM低糖完全培养基的50mL无菌离心管中，吹打混匀后均匀接种至2个10cm无菌细胞培养皿中，约10mL/皿，标记姓名、日期、细胞代数、细胞种类，十字法摇匀后置37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，24小时后观察细胞形态并细胞换液。2.1.1.2细胞换液超净台内配制新鲜DMEM低糖完全培养基，DMEM低糖完全培养基溶液（50mL）=青/链霉素双抗溶液（0.5mL，终浓度为1000U/mL）+FBS溶液（5mL）+DMEM低糖基础培养基溶液（44.5mL）。倒置显微镜下观察待换液的细胞生长情况，确定其无污染后将其放置于超净台内。移液枪弃去培养皿中旧培养基，加入10mL新鲜配制的DMEM低糖完全培养基，置37℃、5%CO2的培养箱中继续培养。2.1.1.3细胞传代显微镜下观察hADSC细胞生长情况，当细胞达到约80%汇合率时进行传代培养。超净台内配制DMEM低糖完全培养基溶液，DMEM低糖完全培养基溶液（50mL）=青/链霉素双抗溶液（0.5mL，终浓度为1000U/mL）+FBS溶液（5mL）+DMEM低糖基础培养基溶液（44.5mL）。以10cm培养皿为例：超净台内弃旧培养基，无菌PBS缓冲液清洗培养皿（冲洗培养皿时动作要轻柔，以防把培养皿中的细胞从皿底冲下），5mL/皿，共清洗2遍。加入0.25%胰蛋白酶液，1mL/皿，37℃、5%CO2培养箱中孵育1-2min后轻轻拍打培养皿周围（约30s-60s）。显微镜下观察细胞形态，当细胞变圆并且开始从皿底脱落时,立即加入5mL新鲜DMEM低糖完全培养基。轻轻吹打皿底使细胞完全从皿底脱落，然后收集细胞悬液至50mL无菌离心管中，1000rpm离心5min。弃上清后留取皿底的细胞沉淀，用完全培养基4重悬并进去细胞计数，计数完成后按照4×10/mL的密度传代至新的无菌细胞培养皿中，标记姓名、日期、细胞代数、细胞种类，十字法摇匀后置37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。2.1.1.4细胞计数显微镜下观察hADSC细胞生长情况，当细胞达到约80%汇合率时进行传代培养。以10cm培养皿为例：超净台内弃旧培养基，无菌PBS缓冲液清洗12 新疆医科大学硕士学位论文培养皿（冲洗培养皿时动作要轻柔，以防把培养皿中的细胞从皿底冲下），5mL/皿，共清洗2遍。加入0.25%胰蛋白酶液，1mL/皿，37℃、5%CO2培养箱中孵育1-2min后轻轻拍打培养皿周围（约30s-60s）。显微镜下观察细胞形态，当细胞变圆并且开始从皿底脱落时,立即加入5mL新鲜DMEM低糖完全培养基。轻轻吹打皿底使细胞从皿底完全脱落，然后收集细胞悬液至50mL无菌离心管中，1000rpm离心5min。弃上清后留取皿底的细胞沉淀，用完全培养基重悬。取10μL细胞悬液，用4%台盼蓝染液染色。用移液枪吸取hADSC细胞悬液10uL，加至计数板中，对计数板的四角大方格内的细胞进行计数。对于压线细胞，采用“计下不计上，计左不计右”的原则。镜下观察，折光性强且不着色者为活细胞，着蓝色者为死细胞。计数公式为：4细胞悬液细胞数/mL＝4个大格细胞总数÷4×稀释倍数×10。2.1.1.5细胞冻存显微镜下观察hADSC细胞生长情况，当细胞达到约80%汇合率时进行传代培养。以10cm培养皿为例：超净台内弃旧培养基，无菌PBS缓冲液清洗培养皿（冲洗培养皿时动作要轻柔，以防把培养皿中的细胞从皿底冲下），5mL/皿，共清洗2遍。加入0.25%胰蛋白酶液，1mL/皿，37℃、5%CO2培养箱中孵育1-2min后轻轻拍打培养皿周围（约30s-60s）。显微镜下观察细胞形态，当细胞变圆并且开始从皿底脱落时,立即加入5mL新鲜DMEM低糖完全培养基。轻轻吹打皿底使细胞从皿底完全脱落，然后收集细胞悬液至50mL无菌离心管中，1000rpm离心5min。弃上清后留取皿底的细胞沉淀，用完全培养基重悬细胞并计数。超净台内配制细胞6冻存液(FBS:DMSO=9:1)。计数完成后，按1×10/管的密度冻存细胞。用冻存液重悬细胞沉淀，然后按1mL/管分装到无菌的2mL冻存管中，标记姓名、日期、细胞代数、细胞种类后放入细胞专用冻存盒中，-80℃冰箱放置24h后转到液氮中长期保存。2.1.2Ad36感染hADSC以3.5cm培养皿为例，当细胞汇合率达到约80%时，超净台内弃旧培养基。无菌PBS缓冲液清洗培养皿（冲洗培养皿时动作要轻柔，以防把培养皿中的细胞从皿底冲下），1mL/皿，共清洗2遍。1mL/皿加入DMEM低糖基础培养基，置37℃、5%CO2培养箱中培养8小时。根据腺病毒PFU计算出5MOIAd36所对应的腺病毒悬液体积，加入至细胞培养皿中，十字法摇匀后置37℃、5%CO2培养箱中孵育1h。弃去含病毒悬液的DMEM低糖基础培养基，加入2mL新鲜DMEM低糖完全培养基，置于37℃、5%CO2培养箱培养。每隔两天换液，换液时注意观察细胞形态。2.1.3鸡尾酒法诱导hADSC成脂以3.5cm培养皿为例，当细胞汇合率达到约80%时，超净台内弃旧培养基。2mL/皿向培养皿中加入鸡尾酒法成脂诱导液，置37℃，5%CO2培养箱中继续培养。每三天换一次成脂诱导液。2.1.4油红O染色13 新疆医科大学硕士学位论文以3.5cm培养皿为例，超净台内弃旧培养基。无菌PBS缓冲液冲洗细胞培养皿（冲洗培养皿时动作要轻柔，以防把培养皿中的细胞从皿底冲下），1mL/皿，共清洗3遍。4%中性多聚甲醛固定30min，弃去多聚甲醛。双蒸水清洗培养皿，1mL/皿冲洗3遍。每皿中加入1mL油红O染液工作液，15min后弃去油红O染液并用蒸馏水清洗干净，晾干后进行倒置显微镜下观察并拍照。2.2油红O染色观察细胞成脂情况2.2.1油红O染色以3.5cm皿为例，分别用鸡尾酒法和Ad36诱导hADSC分化，用油红O染色，分别于诱导第0、2、4、6、8天观察细胞成脂情况。超净台内弃旧培养基，无菌PBS缓冲液冲洗细胞培养皿（冲洗培养皿时动作要轻柔，以防把培养皿中的细胞从皿底冲下），1mL/皿，共清洗3遍。4%中性多聚甲醛固定30min，弃去多聚甲醛。双蒸水清洗培养皿，1mL/皿冲洗3遍。每皿中加入1mL油红O染液工作液，15min后弃去油红O染液并用蒸馏水清洗干净，晾干后进行倒置显微镜下观察并拍照。2.3LncRNAROR，棕色脂肪细胞分化标记基因，线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因，LeptinmRNA表达水平的检测2.3.1复制细胞模型具体方法见2.12.3.2细胞总RNA的提取以3.5cm培养皿为例，4℃预冷的无菌PBS缓冲液冲洗细胞培养皿（冲洗培养皿时动作要轻柔，以防把培养皿中的细胞从皿底冲下），1mL/皿，共清洗3遍。向皿中加入QIAzol，1mL/皿。吹打培养皿，使细胞从皿底完全脱落。将细胞悬液移至1.5mL无RNA酶EP管中，上下颠倒混匀10次，室温静置10min。向细胞悬液中加入氯仿，0.2mL/EP管。用涡旋震荡器混匀约20s。室温静置2min，4℃、14000rpm离心16min。将上层水相(400μL-500μL)移至新1.5mL无RNA酶EP管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置1-2h，4℃、12000rpm离心15min。弃上清留取管底RNA沉淀。预冷的无RNA酶的75%乙醇漂洗，1ml/EP管，4℃冰箱静置20min后，4℃、10000rpm离心8min，弃上清，待RNA沉淀变为半透明状时，加无RNA酶水30-50μL/EP管，-80℃低温冰箱保存待用或去测其浓度及纯度和跑RNA电泳测量所提取的RNA的质量。2.3.3逆转录PCRNanodrop2000核酸定量仪测定总RNA浓度，计算出1µgRNA的体积，按照逆转录试剂盒说明书加入如下反应体系：ComponentVolumeTemplateRNA1µgRandomHexamerprimer1µLWater，RNase-freeto12µL14 新疆医科大学硕士学位论文加入上述反应体系后，弹打EP管或用移液枪轻轻吹打混匀，待溶液充分混匀后，2000rpm、30s瞬时离心以确保体系均在PCR反应管的底部，然后放置逆转录PCR仪上。65℃加热5min后，将反应体系迅速转移至冰上，使其迅速降温，然后再加入如下反应体系：ComponentVolume5×ReactionBuffer4µLRiboLockRNaseInhibitor(20U/µL)1µL10mMdNTPMix2µLRevertAidM-MuLVRT(200U/µL)1µL加入上述反应体系后，弹打EP管或用移液枪轻轻吹打混匀，待溶液充分混匀后，2000rpm、30s瞬时离心以确保体系均在PCR反应管的底部，然后放置逆转录PCR仪上。25℃加热5min，42℃加热5min，70℃加热5min，4℃∞。待逆转录PCR结束后向PCR反应管中加入80µL无RNA酶水，-20℃保存待用。2.3.4实时荧光定量PCRPrimer3设计RT-qPCR引物，设计完成后由上海生工生物工程股份有限公司合成，内参为β-actin，序列见下表：基因名称引物序列(5’→3’)human-lincRNA-ROR-FGTTCCAAACACATCGCCACThuman-lincRNA-ROR-RGGAGTCAGGAGAAGGTGCTGhuman-Cidea-FGATGCCCTCGTCATCGCTAChuman-Cidea-RGCGTGTTGTCTCCCAAGGTChuman-Dio2-FAGTGGTCAACTTTGGCTCAGhuman-Dio2-RAAAGAGGAGTCCCCCGGTAThuman-Fgf21-FGGACAACTGGAATCTGGCAChuman-Fgf21-RCAGCACAGAAACCCACAGTChuman-Ucp1-FCAATCACCGCTGTGGTAAAAAChuman-Ucp1-RGTAGAGGCCGATCCTGAGAGAhuman-Prdm16-FCTGCCCAAGTGACTGAAACChuman-Prdm16-RTTTTGATACCCGGCTGACCThuman-Cox5b-FCTGGGTTGGAGAGGGAGATChuman-Cox5b-RGTCCTCTTCACAGATGCAGC15 新疆医科大学硕士学位论文human-Atp5o-FCCAAAGTGGCTGCTTCTGTThuman-Atp5o-RACTGTGCAAGGTACCTCTCChuman-Nd2-FTCATCCCCACCATCATAGCChuman-Nd2-RGTGATGAGTGTGGGGAGGAAhuman-Atp6-FCCCCTCTATTGATCCCCACChuman-Atp6-RAATGAGTGAGGCAGGAGTCChuman-Leptin-FAGGACCAGGACTATAGCCCAhuman-Leptin-RGGCAATTCACATCCCTCACRT-qPCR反应体系如下：ComponentVolume2×SYBRGreenPCRMasterMix10µLForwardsense(10µmol/L)0.8µLReversesense(10µmol/L)0.8µLTemplatecDNA2.0µLRNase-freewater6.4µLAppliedBiosystems7500FastSystem进行PCR扩增。加完反应体系后，八联管30s瞬时离心以确保体系均在八联管反应管的底部。程序为：95℃、5min，95℃、10s，-△△Ct60℃、30s，72℃、30s，共40个循环。目的基因相对表达量(RQ)=2。2.4棕色脂肪细胞分化标记基因、线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因、Leptin蛋白质表达水平的检测2.4.1复制细胞模型具体方法见2.12.4.2蛋白质的提取、定量及变性(1)总蛋白质的提取以3.5cm培养皿为例，弃旧培养基，用预冷PBS缓冲液清洗培养皿（冲洗培养皿时动作要轻柔，以防把培养皿中的细胞从皿底冲下），1mL/皿，清洗2次。向培养皿中加入细胞裂解液，80μL/皿，置冰上裂解20min。用蒸馏水清洗过的细胞刮刀将细胞从皿底刮下，将细胞裂解液转移至高压灭菌过的1.5mLEP管中，4℃、12000rpm，离心10min。吸取上清液转移至另一新1.5mLEP管中，－80℃保存待用。(2)蛋白质定量Thermo蛋白质定量试剂盒测总蛋白质的浓度。根据所测出的蛋白质浓度分别计算定量所需加的蛋白质溶液、SDS及RIPA裂解液的体积。(3)蛋白质变性将定好量的蛋白质混合液放置于100℃水浴锅中，100℃煮5分钟后开盖放气以防EP管炸裂，然后再100℃煮5分钟。蛋白质变性完成后放置于-20℃保16 新疆医科大学硕士学位论文存待用。2.4.3SDS－PAGE电泳(1)凝胶的制备根据待测蛋白质分子大小选择配制合适浓度的分离胶。按照说明书向100mL的烧杯中依次快速加入配制分离胶的各试剂溶液，将分离胶溶液混合均匀后迅速注入两层玻璃板中，液面上注入一层无水乙醇以使分离胶胶面水平。待分离胶凝固后弃去上层无水乙醇并开始配制浓缩胶，按照说明书向100mL的烧杯中依次快速加入配制浓缩胶的各试剂溶液，轻缓摇动混匀，快速向分离胶上层注入浓缩胶溶液。迅速插入梳子，待凝胶溶液凝固后，小心拔出梳子，准备上样。(2)上样向两块玻璃板内侧加入电泳液至高于上样孔，向胶孔中加入彩色蛋白质Marker，随后开始上样（上样时间尽量要短，以防上样的蛋白质溶液晕开影响实验结果。）。上样完毕后向电泳槽中继续加入电泳液至合适的高度。(3)电泳上样工作完成后，连接好仪器，采用恒压电泳，先采用80V、40min电泳以使各上样孔处于同一水平线，然后130V、60min继续电泳。（电泳时注意将电泳槽放平，周围放上冰袋或放在装有碎冰的泡沫盒中）(4)转膜（湿式电转膜）电泳结束后取出凝胶，根据所要检测的目的蛋白质大小切胶。随后制作转膜“三明治”，打开电转印夹，每侧垫上海绵垫和滤纸。将切好的凝胶平放在阴极侧滤纸上，然后将甲醇激活后的PVDF膜平放在凝胶上。去除凝胶与PVDF膜之间的气泡，夹好电转印夹置加满转膜缓冲液的转膜槽内，黑对黑，红对红。转膜槽内适当放入冰袋，连接好仪器，设置好电流及时间后开始转膜。（电流一般为80mA，可依据所需目的蛋白分子量大小适当调整转膜时间和电流大小。）(5)封闭转膜完成后将转有蛋白质的PVDF膜用甲醇激活，放入装有5%脱脂牛奶的封闭盒中，室温、摇床、2小时进行封闭。(6)孵育一抗根据说明书用2.5%脱脂牛奶稀释一抗。将一抗稀释液加入孵育盒中，放入封闭好的PVDF膜，摇床、4℃冰箱里孵育过夜。(7)孵育二抗一抗孵育完成后用1×PBST洗膜，10min/次，共3次。弃去1×PBST，加入与一抗相对应的二抗稀释液，摇床室温孵育1小时，1×PBST洗膜4次，时间分别为5min、15min、10min、10min。(8)ECL化学发光法检测将A和B两种显色试剂按照1:1比例等体积混匀，将显色底物浸湿印迹膜1-5分钟。实验结果通过放射自显影胶片显示：将胶片放置于X胶片夹压片2-6min，显影液中显影，定影液中定影，清水冲洗胶片，晾干。(9)凝胶图象分析胶片晾干后，用ImageJ图象处理软件扫描目的蛋白质并分析目的条带的灰度值，计算出目的蛋白质相对表达量。2.5siRNA敲低LncRNAROR后，棕色脂肪细胞分化标记基因、线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因mRNA表达水平的检测17 新疆医科大学硕士学位论文2.5.1复制细胞模型具体方法见2.152.5.2siRNA敲低LncRNAROR以3.5cm培养皿为例，转染前一天，将4×10个细胞接种于3.5cm皿中。取两个经高压灭菌过的1.5mLEP管，按照转染说明书配制所需的转染试剂：向一个1.5mLEP管中加入5µL的Lipofectamine3000，用250µLopti-MEM进行稀释，轻轻吹打混匀后室温孵育5min；另一个1.5mLEP管中加入5µLsiRNA，用250µLopti-MEM进行稀释，轻轻吹打混匀；将Lipofectamine3000稀释液与siRNA稀释液混匀，室温孵育20min。将最终的转染混合液加入至待转染的培养皿中；37℃，5%CO2培养箱中孵育4-6h后换成DMEM低糖完全培养基，每两天换液一次。LncRNRROR的siRNA序列由吉玛公司设计并合成，序列如下：siRNA名称引物序列(5'→3')LINC-homo-1105-sense(S1)CCACUCUGCUUAGAACCUUTTLINC-homo-1105-antisense(S1)AAGGUUCUAAGCAGAGUGGTTLINC-homo-1327-sense(S2)GGACAUGUGCACUUAGCUUTTLINC-homo-1327-antisense(S2)AAGCUAAGUGCACAUGUCCTTLINC-homo-1327-sense(S3)CCUGCAACACUCCAGCUAUTTLINC-homo-1327-antisense(S3)AUAGCUGGAGUGUUGCAGGTTNC-sense(Sc)UUCUCCGAACGUGUCACGUTTNC-antisense(Sc)ACGUGACACGUUCGGAGAATT2.5.3细胞总RNA的提取具体方法见2.3.22.5.4逆转录PCR具体方法见2.3.32.5.5RT-qPCR具体方法见2.3.42.6siRNA敲低LncRNAROR后，棕色脂肪细胞分化标记基因、线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因蛋白质表达水平的检测2.6.1复制细胞模型具体方法见2.12.6.2蛋白质的提取、定量及变性具体方法见2.4.22.6.3SDS－PAGE电泳具体方法见2.4.32.7透射电镜观察并计算在hADSC分化过程中线粒体数量的变化和差异2.7.1模型复制具体方法见2.12.7.2收取细胞以10cm培养皿为例，弃旧培养基，无菌PBS缓冲液培养皿，5mL/皿。PBS缓冲液清洗2遍后加入1mL0.25%胰蛋白酶液。37℃、5%CO2培养箱中孵育1-2min后轻轻拍打培养皿周围（约30s-60s）。显微镜下观察细胞形态，当细胞开始变圆并从皿底脱落时，立即加入5mL新鲜完全培养基。轻轻吹打皿底使细胞完全脱落，收集细胞至15mL无菌离心管中，1000rpm离心5min留取细胞沉淀，PBS18 新疆医科大学硕士学位论文将细胞沉淀重悬后1000rpm离心5min（此步骤重复3次或以上），留取细胞沉淀。加入1mLFBS重悬细胞，将细胞悬液移至一新的经高压灭菌的1.5mLEP管中，1000rpm离心5min，留取细胞沉淀，向EP管中加入0.5mL4%戊二醛溶液固定细胞，24h后对样本进行后续处理。2.7.3处理细胞样本(1)戊二醛固定24h后用PBS清洗：向EP管中加入PBS溶液，1mL/皿，室温静置20min，重复以上步骤3次。（注：动作要轻柔，以避免把EP管底的已经聚集在一起的细胞沉淀吹散开来而影响实验结果）(2)向细胞沉淀中加入约100µL的饿酸，室温孵育1h。（注：饿酸有剧毒，易挥发，操作时赢带上口罩，此步骤中加入饿酸后迅速将EP管盖子盖上以避免其挥发至空气中，引起中毒。）(3)蒸馏水清洗：向EP管中加入蒸馏水，1mL/皿，室温静置20min，重复以上步骤3次。(4)50%乙醇溶液：向EP管中加入50%乙醇，1mL/皿，室温静置20min，重复以上步骤3次。（注：将蒸馏水与无水乙醇按照1：1比例稀释即得到50%乙醇溶液）(5)70%乙醇溶液：向EP管中加入70%乙醇，1mL/皿，室温静置20min，重复以上步骤3次。（注：将蒸馏水与无水乙醇按照3：7比例稀释即得到70%乙醇溶液）(6)80%乙醇溶液：向EP管中加入80%乙醇，1mL/皿，室温静置20min，重复以上步骤3次。（注：将蒸馏水与无水乙醇按照2：8比例稀释即得到80%乙醇溶液）(7)90%乙醇溶液：向EP管中加入90%乙醇，1mL/皿，室温静置20min，重复以上步骤3次。（注：将蒸馏水与无水乙醇按照1：9比例稀释即得到90%乙醇溶液）(8)100%乙醇溶液：向EP管中加入100%乙醇，1mL/皿，室温静置20min，重复以上步骤3次。(9)100%丙酮：向EP管中加入100%丙酮，1mL/皿，室温静置20min，重复以上步骤3次。(10)包：丙酮（1:2）12h。(11)包：丙酮（2:1）12h。(12)纯包埋剂24h(13)聚合70℃48h(14)切片2.7.4透射电镜（JEOL1230）采集图像19 新疆医科大学硕士学位论文3质量控制3.1样本控制超净台内进行细胞培养的各项操作，严格按照细胞培养的无菌操作，确保细胞无污染。实验所用细胞的代数均在4-6代。分为2个组，分别是Ad36诱导组和鸡尾酒法诱导组，收取细胞时，每天每组有3个复孔，并且重复试验3次，确保了实验结果的可靠性。3.2实验技术本课题的指导老师有丰富的教学经验并熟练掌握油红O染色、细胞培养、Western-blotting、RT-qPCR、siRNA敲低等实验技术，通过传授上述实验技术，学生经过为期一年预实验期间的训练，学生已完全掌握上述实验技术。4统计学处理采用SPSS17.0软件对数据进行统计分析。所有的数据经正态性检验呈正态分布后以均数±标准差（X±S）的形式表示。两组间比较采用两独立样本的t检验方法进行统计分析，检验水准α=0.05或α=0.01。20 新疆医科大学硕士学位论文5技术路线1.hADSC分化为脂肪细胞过程中，Ad36诱导组和鸡尾酒法诱导组中：棕色脂肪细胞分化标记基因，线粒体呼吸链及氧化磷酸化相关酶基因，LeptinmRNA和蛋白质表达水平的检测；观察细胞成脂情况；透射电镜观察并计算线粒体数量hADSC复苏、传代培养鸡尾酒法诱导组Ad36感染组（5MOI）对照组分别收取hADSC诱导第用油红O染色分别于分别收取hADSC诱导第0、0、2、4、6、8天细胞，诱导第2、4、6、8天2、4、6、8天细胞，提取总提取RNA后用RT-qPCR观察细胞成脂情况；透蛋白质后用Western-blotting检测两组LncRNAROR、射电镜观察并计算诱检测两组CIDEA、DIO2、Cidea、Dio2、Fgf21、导第0、2、4、6、8天FGF21、UCP1、PRDM16、Ucp1、Prdm16、Cox5b、两组线粒体数量COX5B、ATP5O、ATP6、ND2Atp5o、Atp6、Nd2及Leptin及LEPTIN蛋白质表达水平mRNA表达水平处理数据，统计分析21 新疆医科大学硕士学位论文2.siRNA敲低LncRNAROR后，Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，对照组和敲低组棕色脂肪细胞分化标记基因、线粒体呼吸链及氧化磷酸化相关酶基因mRNA和蛋白质表达水平的检测hADSC复苏、传代培养对照组（Sc组）LncRNAROR敲低组分别收取hADSC分别收取hADSC诱导第分别收取hADSC诱导第诱导第1、2、3、41、2、3、4天的细胞，0、2、4天的细胞，提取天的细胞，提取提取RNA后RT-qPCR检总蛋白质后western-blotRNA后RT-qPCR测Cidea、Dio2、Fgf21、检测CIDEA、DIO2、检测LncRNAUcp1、Prdm16、Cox5b、FGF21、UCP1、PRDM16、ROR敲低效率Atp5o、Atp6、Nd2mRNACOX5B、ATP5O、ATP6、表达水平ND2蛋白质表达水平处理数据，统计分析22 新疆医科大学硕士学位论文结果1.hADSC分化为脂肪细胞过程中，Ad36诱导组和鸡尾酒法诱导组成脂情况比较AEBFACHDI图1Ad36和鸡尾酒诱导hADSC细胞成脂比较(油红O染色）(放大倍数：400×，比例尺：50μm)Fig1OilredOstaininghADSCcellsafterinducedbyadinovirus36orcocktailmethod(magnification:400x,scale:50microns)A、B、C、D分别为Ad36诱导第2、4、6、8天的细胞A,B,CandD,respectively,inducethecellsofthe2nd,4th,6thand8thdaysofAd36methodE、F、G、H分别为鸡尾酒法诱导第2、4、6、8天的细胞E,F,G,andH,respectively,inducethecellsofthe2nd,4th,6thand8thdaysofthecocktail23 新疆医科大学硕士学位论文hADSC诱导分化为脂肪细胞过程中，对Ad36诱导组和鸡尾酒法诱导组的第2、4、6、8天细胞进行油红O染色，荧光倒置显微镜采图，结果显示：鸡尾酒法诱导组的细胞内出现圆形较大脂滴(图1：E、F、G、H)，而Ad36诱导的细胞出现颗粒状较小脂滴(图1：A、B、C、D)。2.hADSC分化为脂肪细胞过程中，Ad36诱导组和鸡尾酒法诱导组中，LncRNAROR、棕色脂肪细胞分化标记基因、线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因、LeptinmRNA表达水平的检测2.1hADSC分化为脂肪细胞过程中，Ad36诱导组和鸡尾酒法诱导组LncRNARORmRNA表达水平检测2.2表2-1Ad36和鸡尾酒法诱导hADSC分化过程中，LncRNARORmRNA表达差异Table2-1DuringhADSCdifferentiation,Ad36inductionandcocktailmethodinducedgroupdifferencesinthelevelsofmRNAexpressionofLncRNAROR均数±标准差第0天第2天第4天第6天第8天Ad36诱导组3.26±0.4510.6±0.6619.06±2.6170.10±1.771.14±0.16鸡尾酒法诱导组1.87±2.194.03±0.566.63±0.657.92±2.32P=0.008P=0.006P=0.001P=0.000图2-1Ad36和鸡尾酒法诱导hADSC分化过程中，LncRNARORmRNA表达差异Fig2-1DuringhADSCdifferentiation,Ad36inductionandcocktailmethodinducedgroupdifferencesinthelevelsofmRNAexpressionofLncRNAROR#表示Ad36诱导组与鸡尾酒法诱导组比较P<0.01#IndicatesthatAd36inducedgroupcomparedwithcocktailmethodinducedgroupP<0.01实时荧光定量PCR结果显示：hADSC诱导分化为脂肪细胞过程中，与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组LncRNARORmRNA相对表达水平较鸡尾酒法诱导组显著升高，且差异有统计学意义（P<0.01）。24 新疆医科大学硕士学位论文2.2hADSC分化为脂肪细胞过程中，Ad36诱导组和鸡尾酒法诱导组棕色脂肪细胞分化标记基因mRNA表达水平的比较表2-2Ad36和鸡尾酒法诱导hADSC分化过程中，棕色脂肪细胞分化标记基因mRNA表达差异Table2-2DuringhADSCdifferentiation,Ad36inductionandcocktailmethodinducedgroupdifferencesinthelevelsofmRNAexpressionofbrownadipocytedifferentiationmarkergenes均数±标准差Ad36诱导组鸡尾酒法组P第0天1.03±0.04第2天9.01±0.421.34±0.03P=0.000Cidea第4天16.67±0.773.80±0.38P=0.000第6天25.82±0.264.76±0.17P=0.001第8天39.19±1.417.95±1.83P=0.001第0天0.96±0.04第2天2.48±0.341.27±0.04P=0.004Dio2第4天4.58±0.562.30±0.01P=0.002第6天9.83±0.252.19±0.05P=0.001第8天20.78±2.422.75±0.21P=0.001第0天1.01±0.03第2天1.91±0.051.02±0.03P=0.000Fgf21第4天5.94±0.261.34±0.17P=0.000第6天18.00±1.981.56±0.08P=0.000第8天29.58±2.381.84±0.13P=0.000第0天1.01±0.02第2天23.25±0.305.84±0.48P=0.002Ucp1第4天46.70±0.587.97±0.52P=0.000第6天83.04±5.0410.78±0.03P=0.001第8天170.55±3.2719.08±2.98P=0.001第0天1.02±0.04第2天28.86±1.282.85±0.11P=0.038Prdm16第4天87.33±3.644.01±0.06P=0.000第6天134.79±2.925.97±0.32P=0.000第8天198.37±23.768.15±0.63P=0.00525 新疆医科大学硕士学位论文ABCDE图2-2Ad36和鸡尾酒法诱导hADSC分化过程中，棕色脂肪细胞分化标记基因mRNA表达差异Fig2-2DuringhADSCdifferentiation,Ad36inductionandcocktailmethodinducedgroupdifferencesinthelevelsofmRNAexpressionofbrownadipocytedifferentiationmarkergenes*表示Ad36诱导组与鸡尾酒法诱导组比较P<0.05*IndicatesthatAd36inducedgroupcomparedwithcocktailmethodinducedgroupP<0.05#表示Ad36诱导组与鸡尾酒法诱导组比较P<0.01#IndicatesthatAd36inducedgroupcomparedwithcocktailmethodinducedgroupP<0.01实时荧光定量PCR结果显示：hADSC诱导分化为脂肪细胞过程中，与鸡尾酒法26 新疆医科大学硕士学位论文诱导组相比，Ad36诱导组Cidea、Dio2、Fgf21、Ucp1、Prdm16基因的mRNA相对表达水平较鸡尾酒法诱导组显著升高，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。2.3hADSC分化为脂肪细胞过程中，Ad36诱导组和鸡尾酒法诱导组线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因mRNA表达水平的比较表2-3Ad36和鸡尾酒法诱导hADSC分化过程中，线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因mRNA表达差异Table2-3DuringhADSCdifferentiation,Ad36inductionandcocktailmethodinducedgroupdifferencesinthelevelsofmRNAexpressionofmitochondrialrespiratorychainandoxidativephosphorylationrelatedenzymegene均数±标准差Ad36诱导组鸡尾酒法组P第0天0.97±0.04第2天1.41±0.031.16±0.07P=0.004Cox5b第4天1.99±0.101.27±0.01P=0.000第6天3.71±0.241.33±0.04P=0.003第8天5.42±0.371.76±0.05P=0.003第0天1.02±0.05第2天4.03±0.301.29±0.17P=0.000Atp5o第4天5.56±0.331.83±0.10P=0.000第6天7.25±0.692.11±0.10P=0.000第8天10.38±0.552.34±0.09P=0.000第0天0.98±0.03第2天2.08±0.221.06±0.14P=0.003Atp6第4天4.24±0.011.24±0.06P=0.000第6天6.46±0.161.32±0.02P=0.000第8天7.94±1.211.49±0.01P=0.012第0天1.00±0.04第2天1.63±0.171.18±0.51P=0.011Nd2第4天2.44±0.051.26±0.11P=0.000第6天4.18±0.171.89±0.15P=0.00027 新疆医科大学硕士学位论文第8天6.15±0.362.01±0.10P=0.000ABCD图2-3Ad36和鸡尾酒法诱导hADSC分化过程中，线粒体呼吸链及氧化磷酸化相关酶基因mRNA表达差异Fig2-3DuringhADSCdifferentiation,Ad36inductionandcocktailmethodinducedgroupdifferencesinthelevelsofmRNAexpressionofmitochondrialrespiratorychainandoxidativephosphorylationrelatedenzymegene*表示Ad36诱导组与鸡尾酒法诱导组比较P<0.05*IndicatesthatAd36inducedgroupcomparedwithcocktailmethodinducedgroupP<0.05#表示Ad36诱导组与鸡尾酒法诱导组比较P<0.01#IndicatesthatAd36inducedgroupcomparedwithcocktailmethodinducedgroupP<0.01实时荧光定量PCR结果显示：hADSC诱导分化为脂肪细胞过程中，与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组Cox5b、Atp5o、Atp6、Nd2基因的mRNA相对表达水平较鸡尾酒法诱导组显著升高，且差异统计学意义（P<0.01或P<0.05）。2.4hADSC分化为脂肪细胞过程中，Ad36诱导组和鸡尾酒法诱导组Leptin基因mRNA表达水平的比较。28 新疆医科大学硕士学位论文表2-4Ad36和鸡尾酒法诱导hADSC分化过程中，LeptinmRNA表达差异Table2-4DuringhADSCdifferentiation,Ad36inductionandcocktailmethodinducedgroupdifferencesinthelevelsofmRNAexpressionofLeptin均数±标准差第0天第2天第4天第6天第8天Ad36诱导组2.15±0.262.57±0.193.17±0.206.18±1.560.96±0.05鸡尾酒法诱导组11.69±0.2921.48±1.4335.10±1.1952.72±5.50P=0.000P=0.000P=0.000P=0.000图2-4Ad36和鸡尾酒法诱导hADSC分化过程中，LeptinmRNA表达水平的差异Fig2-4DuringhADSCdifferentiation，Ad36inductionandcocktailmethodinducedgroupdifferencesinthelevelsofmRNAexpressionofLeptin#表示Ad36诱导组与鸡尾酒法诱导组比较P<0.01#IndicatesthatAd36inducedgroupcomparedwithcocktailmethodinducedgroupP<0.01实时荧光定量PCR结果显示：hADSC诱导分化为脂肪细胞过程中，与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组Leptin基因的mRNA相对表达水平较鸡尾酒法诱导组显著降低，且差异有统计学意义（P<0.01）。3.hADSC分化为脂肪细胞过程中，Ad36诱导组和鸡尾酒法诱导组中，棕色脂肪细胞分化标记基因、线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因、Leptin基因蛋白质表达水平的比较3.1hADSC分化为脂肪细胞过程中，Ad36诱导组和鸡尾酒法诱导组棕色脂肪细胞分化标记基因蛋白质表达水平的比较29 新疆医科大学硕士学位论文A表3-1Ad36和鸡尾酒法诱导hADSC分化过程中，棕色脂肪细胞分化标记基因蛋白质表达差异Table3-1DuringhADSCdifferentiation，Ad36inductionandcocktailmethodinducedgroupdifferencesinthelevelsofproteinexpressionofbrownadipocytedifferentiationmarkergenes均数±标准差Ad36诱导组鸡尾酒法组P第0天1.00±0.00第2天1.28±0.031.28±0.03P=0.000CIDEA第4天1.41±0.051.41±0.05P=0.003第6天1.71±0.231.71±0.23P=0.017第8天2.36±0.192.36±0.19P=0.001第0天1.00±0.00第2天4.42±0.362.28±0.04P=0.009DIO2第4天5.83±0.022.50±0.03P=0.000第6天5.51±0.391.49±0.24P=0.000第8天6.78±0.021.24±0.03P=0.000第0天1.00±0.00第2天2.12±0.351.05±0.14P=0.003FGF21第4天3.22±0.551.10±0.11P=0.006第6天5.24±1.281.19±0.08P=0.003第8天8.15±2.091.18±0.09P=0.000第0天1.00±0.00UCP1第2天2.32±0.310.95±0.04P=0.00230 新疆医科大学硕士学位论文第4天4.44±0.451.00±0.01P=0.000第6天8.44±1.571.09±0.06P=0.001第8天10.45±1.791.19±0.07P=0.001第0天1.00±0.00第2天1.61±0.180.99±0.06P=0.004PRDM16第4天2.08±0.241.03±0.03P=0.002第6天2.34±0.421.17±0.02P=0.008第8天2.51±0.361.22±0.05P=0.003BCDEF图3-1Ad36和鸡尾酒法诱导hADSC分化过程中，棕色脂肪细胞分化标记基因蛋白质表达差异31 新疆医科大学硕士学位论文Fig3-1DuringhADSCdifferentiation,Ad36inductionandcocktailmethodinducedgroupdifferencesinthelevelsofproteinexpressionofbrownadipocytedifferentiationmarkergenes*表示Ad36诱导组与鸡尾酒法诱导组比较P<0.05*IndicatesthatAd36inducedgroupcomparedwithcocktailmethodinducedgroupP<0.05#表示Ad36诱导组与鸡尾酒法诱导组比较P<0.01#IndicatesthatAd36inducedgroupcomparedwithcocktailmethodinducedgroupP<0.01Western-blotting结果显示：hADSC诱导分化为脂肪细胞过程中，与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组CIDEA、DIO2、FGF21、UCP1和PRDM16蛋白质表达水平较鸡尾酒法诱导组显著升高，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。3.2hADSC分化为脂肪细胞过程中，Ad36诱导组和鸡尾酒法诱导组中，线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因蛋白质表达水平的比较A表3-2Ad36和鸡尾酒法诱导hADSC分化过程中，线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因蛋白质表达差异Table3-2DuringhADSCdifferentiation,Ad36inductionandcocktailmethodinducedgroupdifferencesinthelevelsofproteinexpressionofmitochondrialrespiratorychainandoxidativephosphorylationrelatedenzymegene均数±标准差Ad36诱导组鸡尾酒法组P第0天1.00±0.00第2天1.75±0.111.25±0.011P=0.006COX5B第4天2.14±0.161.41±0.08P=0.002第6天3.13±0.191.52±0.08P=0.000第8天4.66±0.081.68±0.12P=0.003ATP5O第0天1.00±0.0032 新疆医科大学硕士学位论文第2天11.57±0.721.67±0.15P=0.000第4天15.60±1.043.00±0.12P=0.000第6天19.31±1.343.65±0.12P=0.002第8天22.18±2.233.76±0.09P=0.000第0天1.00±0.00第2天1.93±0.110.93±0.09P=0.000ATP6第4天2.89±0.120.87±0.05P=0.000第6天3.49±0.151.13±0.06P=0.000第8天3.75±0.111.21±0.11P=0.012第0天1.00±0.00第2天1.53±0.171.13±0.06P=0.000ND2第4天1.94±0.151.23±0.10P=0.000第6天2.88±0.181.29±0.16P=0.000第8天3.65±0.261.61±0.08P=0.000BCDE图3-2Ad36和鸡尾酒法诱导hADSC分化过程中，33 新疆医科大学硕士学位论文线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因蛋白质表达差异Fig3-2DuringhADSCdifferentiation,Ad36inductionandcocktailmethodinducedgroupdifferencesinthelevelsofproteinexpressionofmitochondrialrespiratorychainandoxidativephosphorylationrelatedenzymegene#表示Ad36诱导组与鸡尾酒法诱导组比较P<0.01#IndicatesthatAd36inducedgroupcomparedwithcocktailmethodinducedgroupP<0.01Western-blotting结果显示：hADSC诱导分化为脂肪细胞过程中，与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组COX5B、ATP5O、ATP6和ND2蛋白质表达水平较鸡尾酒法诱导组显著升高，且差异有统计数意义（P<0.01）。3.3hADSC分化为脂肪细胞过程中，Ad36诱导组和鸡尾酒法诱导组LEPTIN蛋白质表达水平的比较A表3-3Ad36和鸡尾酒法诱导hADSC分化过程中，LEPTIN蛋白质表达差异Table3-3DuringhADSCdifferentiation,Ad36inductionandcocktailmethodinducedgroupdifferencesinthelevelsofproteinexpressionofLEPTIN均数±标准差第0天第2天第4天第6天第8天Ad36诱导组1.02±0.011.20±0.061.14±0.041.10±1.031.00±0.00鸡尾酒法诱导组1.97±0.262.03±0.282.30±0.352.44±0.50P=0.003P=0.007P=0.005P=0.010B图3-3Ad36和鸡尾酒法诱导hADSC分化过程中，LEPTIN蛋白质表达差异34 新疆医科大学硕士学位论文Fig3-3DuringhADSCdifferentiation，Ad36inductionandcocktailmethodinducedgroupdifferencesinthelevelsofproteinexpressionofLEPTIN#表示Ad36诱导组与鸡尾酒法诱导组比较P<0.01#IndicatesthatAd36inducedgroupcomparedwithcocktailmethodinducedgroupP<0.01Westerm-blotting结果显示：hADSC诱导分化为脂肪细胞过程中，与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组LEP蛋白表达水平较鸡尾酒法诱导组显著降低，且差异有统计学意义（P<0.01）。4.siRNA敲低LncRNAROR后，Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，对照组和敲低组棕色脂肪细胞分化标记基因、线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因mRNA表达水平的检测4.1siRNA敲低LncRNAROR效率检测表4-1Ad36诱导hADSC分化过程中，检测对照组和敲低组LncRNARORmRNA表达水平Table4-1DuringthedifferentiationofhADSCinducedbyAd36，thelevelsofmRNAexpressionofLncRNARORwasdetectedinknockdowngroupascomparedtocontrolgroup均数±标准差第1天第2天第3天第4天####Sc1.00±0.021.00±0.081.00±0.021.00±0.07####S10.36±0.050.20±0.020.37±0.010.43±0.03####S20.32±0.030.21±0.030.44±0.010.45±0.04*###S30.38±0.090.26±0.040.49±0.020.51±0.04注：*表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.05*IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.05#表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.01#IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.01图4-1检测对照组和敲低组LncRNARORmRNA表达水平35 新疆医科大学硕士学位论文Fig4-1ThemRNAexpressionofLncRNARORwasdetectedinknockdowngroup，ascomparedtocontrolgroup*表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.05*IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.05#表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.01#IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.01实时荧光定量PCR结果显示：Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，3对siRNA(S1、S2、S3)对LncRNAROR敲低效率均＞50%，可用于后续实验。4.2siRNA敲低LncRNAROR后，Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，对照组和敲低组棕色脂肪细胞分化标记基因mRNA表达水平的检测表4-2Ad36诱导hADSC分化过程中，检测对照组和敲低组棕色脂肪细胞分化标记基因mRNA表达水平Table4-2DuringthedifferentiationofhADSCinducedbyAd36，themRNAexpressionofbrownadipocytedifferentiationmarkergenesweredetectedinknockdowngroup，ascomparedtocontrolgroup均数±标准差ScS1S2S3###第1天1.00±0.050.64±0.080.60±0.060.58±0.10###第2天3.87±0.221.85±0.171.90±0.531.79±0.18Cidea###第3天7.59±0.653.76±0.283.47±0.614.11±0.43###第4天10.94±0.317.38±0.747.04±0.337.85±0.44第1天1.01±0.010.72±0.07*0.70±0.13*0.71±0.09*###第2天2.15±0.141.27±0.101.29±0.141.25±0.15Dio2###第3天3.17±0.081.76±0.081.77±0.121.71±0.21###第4天4.12±0.282.76±0.292.83±0.232.90±0.31##第1天0.98±0.020.73±0.10*0.70±0.100.75±0.07###第2天1.83±0.111.31±0.061.23±0.081.31±0.12Fgf21第3天2.67±0.421.64±0.11*1.72±0.15*1.62±0.03*第4天5.53±0.473.95±0.3*3.80±0.70*4.28±0.40*###第1天1.00±0.010.50±0.130.52±0.060.58±0.04Ucp1###第2天10.79±0.853.98±0.564.02±0.394.55±0.1736 新疆医科大学硕士学位论文###第3天25.97±1.3112.19±0.5012.10±0.4614.65±1.81###第4天51.06±1.9132.91±3.0329.67±2.2632.91±3.76##第1天0.97±0.020.74±0.010.74±0.070.81±0.06*###第2天5.42±0.371.77±0.122.17±0.181.58±0.02Prdm16###第3天6.81±1.072.54±0.422.68±0.442.51±0.25###第4天9.16±0.334.24±0.554.48±0.074.76±0.48注：*表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.05*IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.05#表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.01#indicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.01ABCD37 新疆医科大学硕士学位论文E图4-2检测对照组和敲低组棕色脂肪细胞分化标记基因mRNA表达水平Fig4-2ThemRNAexpressionofbrownadipocytemarkergenesweredetectedinknockdowngroup，ascomparedtocontrolgroup*表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.05*IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.05#表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.01#IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.01实时荧光定量PCR结果显示：Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，siRNA敲低LncRNAROR后，与对照组（Sc）相比，LncRNAROR敲低组的Cidea、Dio2、Fgf21、Ucp1及Prdm16基因的mRNA表达水平较对照组显著降低，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。4.3siRNA敲低LncRNAROR后，Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，对照组和敲低组中，线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因mRNA表达水平的检测表4-3Ad36诱导hADSC分化过程中，检测对照组和敲低组线粒体呼吸链及氧化磷酸化相关酶基因mRNA表达水平Table4-3DuringthedifferentiationofhADSCinducedbyAd36，themRNAexpressionofthemitochondrialrespiratorychainandoxidativephosphorylationenzymegenesweredetectedinknockdowngroup，ascomparedtocontrolgroup均数±标准差ScS1S2S3###第1天0.98±0.020.70±0.070.68±0.030.74±0.08###第2天1.41±0.030.87±0.060.88±0.070.89±0.04Cox5b###第3天1.72±0.051.11±0.041.13±0.071.71±0.21###第4天2.09±0.071.64±0.101.62±0.111.68±0.11###Atp5o第1天0.99±0.010.65±0.080.62±0.050.59±0.0238 新疆医科大学硕士学位论文###第2天1.54±0.130.72±0.110.76±0.040.74±0.11第3天2.13±0.391.25±0.06*1.27±0.09*1.38±0.24*第4天3.55±0.452.43±0.19*2.33±0.30*2.64±0.44*###第1天1.08±0.100.70±0.060.66±0.030.62±0.03###第2天1.81±0.060.87±0.060.90±0.070.90±0.06Atp6###第3天2.66±0.131.39±0.121.49±0.061.42±0.26##第4天4.36±0.112.28±0.122.49±0.092.80±0.61*第1天1.00±0.040.76±0.12*0.74±0.12*0.75±0.07*###第2天1.77±0.061.25±0.051.19±0.071.27±0.03Nd2###第3天2.24±0.031.64±0.121.73±0.161.61±0.02##第4天2.61±0.122.11±0.15*2.09±0.102.08±0.10注：*表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.05*IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.05#表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.01#IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.01ABCD图4-3检测对照组和敲低组线粒体呼吸链及氧化磷酸化相关酶基因mRNA表达水平39 新疆医科大学硕士学位论文Fig4-3ThemRNAexpressionofthemitochondrialrespiratorychainandoxidativephosphorylationenzymegenesweredetectedinknockdowngroup，ascomparedtocontrolgroup*表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.05*IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.05#表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.01#IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.01实时荧光定量PCR结果显示：Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，siRNA敲低LncRNAROR后，与对照组（Sc）相比，LncRNAROR敲低组的Cox5b、Atp5o、Atp6、Nd2基因的mRNA表达水平较对照组显著降低，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。5.siRNA敲低LncRNAROR后，Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，对照组和敲低组中，棕色脂肪细胞分化标记基因、线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因蛋白质表达水平检测5.1siRNA敲低LncRNAROR后，Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，对照组和敲低组棕色脂肪细胞分化标记基因蛋白质表达水平的检测A表5-1Ad36诱导hADSC分化过程中，检测对照组和敲低组棕色脂肪细胞分化标记基因蛋白质表达水平Table5-1DuringthedifferentiationofhADSCinducedbyAd36，theproteinexpressionofbrownadipocytedifferentiationmarkergenesweredetectedinknockdowngroup，ascomparedtocontrolgroup均数±标准差ScS1S2S3第0天1.00±0.00CIDEA###第2天1.88±0.141.29±0.141.23±0.231.26±0.19###第4天3.20±0.151.56±0.131.59±0.211.51±0.2940 新疆医科大学硕士学位论文第0天1.00±0.00###DIO2第2天1.68±0.241.08±0.081.03±0.091.06±0.11###第4天3.12±0.352.16±0.062.39±0.112.11±0.19第0天1.00±0.00###FGF21第2天1.58±0.221.09±0.121.08±0.141.16±0.10第4天2.92±0.282.16±0.12*2.29±0.31*2.11±0.14*第0天1.00±0.00###UCP1第2天1.98±0.241.09±0.041.13±0.131.16±0.09###第4天3.10±0.051.36±0.031.39±0.211.31±0.09第0天1.00±0.00第2天1.80±0.141.07±0.02###PRDM161.12±0.051.26±0.03第4天3.24±0.261.41±0.15###1.48±0.041.37±0.04注：*表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.05*IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.05#表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.01#IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.01BCDE41 新疆医科大学硕士学位论文F图5-1检测对照组和敲低组棕色脂肪细胞分化标记基因蛋白质表达量差异Fig5-1Theproteinexpressionofbrownadipocytedifferentiationmarkergenesweredetectedinknockdowngroup，ascomparedtocontrolgroup#表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.01#IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.01Western-blotting结果显示：Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，siRNA敲低LncRNAROR后，与对照组相比，LncRNAROR敲低组CIDEA、DIO2、FGF21、UCP1和PRDM16蛋白质的表达水平较对照组显著降低，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。5.2siRNA敲低LncRNAROR后，Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，对照组和敲低组线粒体呼吸链及氧化磷酸化相关酶基因蛋白质表达水平的检测A表5-2检测对照组和敲低组线粒体呼吸链及氧化磷酸化相关酶基因蛋白质表达量差异Table5-2DuringthedifferentiationofhADSCinducedbyAd36，theproteinexpressionofmitochondrialrespiratorychainandoxidativephosphorylationenzymegenesweredetectedinknockdowngroup，ascomparedtocontrolgroup均数±标准差ScS1S2S342 新疆医科大学硕士学位论文第0天1.00±0.00###COX5B第2天1.66±0.141.17±0.061.12±0.051.22±0.12###第4天2.24±0.261.71±0.181.88±0.231.67±0.24第0天1.00±0.00###ATP5O第2天1.64±0.131.12±0.111.16±0.041.14±0.11###第4天2.55±0.451.83±0.191.82±0.301.88±0.44第0天1.00±0.00###ATP6第2天1.58±0.141.03±0.091.03±0.121.06±0.08###第4天2.12±0.251.46±0.141.49±0.181.41±0.13第0天1.00±0.00###ND2第2天1.76±0.221.23±0.061.16±0.121.26±0.07###第4天2.34±0.161.68±0.131.92±0.111.60±0.19注：*表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.05*IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.05#表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.01#IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.01BCDE图5-2检测对照组和敲低组线粒体呼吸链及氧化磷酸化相关酶基因蛋白质表达量差异43 新疆医科大学硕士学位论文Fig5-2Theproteinexpressionofmitochondrialrespiratorychainandoxidativephosphorylationenzymegenesweredetectedinknockdowngroup，ascomparedtocontrolgroup*表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.05*IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.05#表示LncRNAROR敲低组与对照组比较P<0.01#IndicatesthatLncRNARORknockdowngroupandcontrolgroupcompareP<0.01Western-blotting结果显示：Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，siRNA敲低LncRNAROR后，与对照组相比，LncRNAROR敲低组COX5B、ATP5O、ATP6及ND2蛋白质表达水平较对照组显著降低，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。6.hADSC分化为脂肪细胞过程中，Ad36诱导组和鸡尾酒法诱导组线粒体数量比较ACBFCGDH44 新疆医科大学硕士学位论文EIJC图6Ad36和鸡尾酒诱导hADSC分化过程中线粒体数量比较（透射电镜放大倍数：10000×，比例尺：2μm)Fig6MitochondriacomparisonbetweenAd36-inducedgroupandcocktail-inducedgroup(TEM，magnification:10000×,scalebar:2μm)*表示Ad36诱导组与鸡尾酒法诱导组比较P<0.05*IndicatesthatAd36inducedgroupcomparedwithcocktailmethodinducedgroupP<0.05#表示Ad36诱导组与鸡尾酒法诱导组比较P<0.01#IndicatesthatAd36inducedgroupcomparedwithcocktailmethodinducedgroupP<0.01hADSC分化为脂肪细胞过程中，利用透射电镜观察并计算Ad36和鸡尾酒法诱导组的第0、2、4、6、8天细胞中，线粒体数量的变化和差异，结果显示：hADSC分化过程中，与鸡尾酒法诱导组(图6：F、G、H、I)相比，Ad36诱导组(图6：B、C、D、E)细胞内线粒体数量显著较高,且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。45 新疆医科大学硕士学位论文讨论肥胖是目前当代社会面临的最大的健康挑战之一，在全球范围内，其患病率迅[1-4]速上升，与超重和肥胖有关的不良后果也持续增加。超重和肥胖被定义为损害健[1-4]康的异常或过度的脂肪积累。世界卫生组织（WHO）将BMI（BodyMass2Index,BMI）（kg/m）等于或大于25的成人定义为超重，BMI等于或大于30的成[1-4]人定义为肥胖。一般来说，高BMI是各种代谢改变的危险因素，如葡萄糖耐受[1-4]不良，胰岛素抵抗，高瘦素血症和男性性腺机能减退等。假设达尔文进化发生在一个能源比较贫乏的环境中，促进肥胖的基因遗传可能是古代人类历史上的生存保[1-4][1-4]护因素。因此，现今大多数人似乎都具有肥胖易感性基因。研究显示，多基因变异和BMI之间具有正相关的关系，肥胖率的突然增加却只是在最近几十年才发生[1-4]的。第二次世界大战以后，随着工业化和经济的增长，导致了日益城市化和久坐[1-4]的劳动力的产生。再加上随着获得食物的便利，这种能量消耗的减少和热量摄入[1-4]的增加，促成了现在被称为“引起肥胖”环境的产生。尽管营养摄入和能量消耗之间的相互作用是调节体重的主要因素，但是许多间接的生活方式因素和其他环境因[1-4]素导致个体易于超重或肥胖。多种环境有害暴露的累积或混合，可能是我们的世[1-4]界面临肥胖率快速增加的原因。然而，并不是所有的肥胖都会引起人体血糖的升[83]高和胰岛素抵抗的产生。在1982年，据报道，犬瘟热病毒（CDV）可以导致小鼠肥胖时，由此而确定了[77-81]第一个病毒感染与体重增加之间的联系。研究发现，小鼠脑内注射CDV可导致[77-81]下丘脑病毒颗粒积聚，瘦素受体表达减少，高胰岛素血症和体重增加。此后也陆续发现了其他几种与动物的肥胖症有关的病原体，其中细菌和病毒制剂是研究最[77-81][77-81]多的。在这些感染因子中，Ad36与人类肥胖的发生有着重要的关系。迄今[66-71]为止，已经鉴定出60多种血清型的腺病毒。不同血清型的腺病毒具有不同的组[77-81]织取向，并且具有不同的临床表现。这些腺病毒通常会引起轻微的感染表现，[77-81]包括上呼吸道或下呼吸道、胃肠道或结膜炎等。报告指出Ad36可以提供一个模[77-81]板来改善血糖控制，并且研究已经证明，自然的Ad36感染与较低的2型糖尿病[77-81]的发生率有关。横断面和前瞻性研究报告也显示，自然暴露于Ad36感染和肥胖[77-81]的关系，以及在自然暴露于Ad36人体具有更好的血糖控制作用。动物实验中得到证实，对抗炎症来改善IR(insulinresistance,IR)是一种特别有吸引力的方法，并且[77-81]文献研究结果显示，减肥可以减少全身炎症并改善IR。研究发现，腺病毒的所有血清型都具有的早期开放阅读框1基因(earlyregion4openreadingframe1,E4ORF1)所编码的蛋白，与dUTPase(deoxyuridinetriphosphokinase,dUTPase)共享有保守的氨基[77-81]酸域，但是具有各不相同的功能。大量文献研究已经证实，多个人类腺病毒的46 新疆医科大学硕士学位论文E4ORF1激活了PI3K(phosphoinositol3-kinasePI3K)/AKT(Aktserine/threonineprotein[77-81]kinase,AKT)通路。体外研究表明Ad36通过E4orf1基因，增加了脂肪组织和骨[77-81]骼肌细胞的葡萄糖摄取。如果Ad36作用机制被阐明的话，就提供了利用Ad36[77-81]和E4orf1的有益特性进而改善代谢的机会。然而，现有的研究对于Ad36的降糖、降脂作用的具体分子机制并不清楚。本研究RT-qPCR和Western-blotting结果显示，在hADSC分化为脂肪细胞过程中：与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组Prdm16及Ucp1的mRNA和蛋白质相对表达水平显著升高，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）；与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组Leptin基因的mRNA和蛋白相对表达水平显著降低，且差异有统计学意义（P<0.01）。文献研究显示，棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞在脂质代谢[5-16]中发挥着相反的作用。米色脂肪细胞，被认为是一种诱导型的棕色脂肪细胞，可[5-16]以经由冷暴露和其他一些刺激因素诱导而成，它散在分布于白色脂肪细胞中，形[5-16]态上与传统的棕色脂肪细胞相似，并且含有多室脂滴以及表达UCP1的线粒体。文献研究显示，棕色脂肪细胞分化需要两个关键的转录因子的协同作用，即过氧化物酶增值激活受体γ(peroxisomeproliferater-activatedreceptorγ,PPARγ)和早期b细胞[5-16]因子2(earlyBcellfactor2,EBF2)，并且文献研究已经证实PPARγ和EBF2协同促[5-16]进了Prdm16的表达，继而驱动了前体棕色脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化的命运。PRDM16最初是在人类骨髓白血病细胞的染色体断点发现，包含N-末端PR域和10个锌指，以及其他多种多样的结合位点，支持多种蛋白-蛋白相互作用，这使其在棕[15-16]色脂肪细胞发育中起到了关键性的作用。过去几年的研究已经确定了PRDM16[15-16]是棕色脂肪细胞和米色脂肪细胞生物起源的关键调控分子。研究发现，PRDM16主要是通过蛋白质与转录因子的相互作用，如C/EBP-β、PPARγ、锌指蛋白516(zinc[5-16]fingerprotein516,Zfp516)，进而促进了棕色脂肪细胞的分化。体外研究也表明,PRDM16通过其锌指域,直接与介质复合体的MED1亚基相互作用，通过这种相互作用，PRDM16和MED1募集在棕色脂肪特异性基因Ucp1的增强子上，并以一种在生化中称之为介质依赖的模式，增强了受甲状腺激素受体(thyroidhormone[15-16]receptor，TR)驱动的转录程序。研究还表明，罗格列酮通过激活PPARγ和提高PRDM16蛋白质稳定性，进而诱导了棕色脂肪细胞分化相关基因的表达和抑制了白[1-4,15-16]色脂肪细胞分化相关基因的表达，从而诱导了WAT的棕色化。PRDM16在肌细胞或前脂肪细胞中表达时，有力地抑制了已存在的基因程序（即，肌源性基因或白色脂肪细胞选择性基因），激活了棕色脂肪细胞选择性基因程序，包括Ucp1、Pgc1a[15-16]和许多线粒体基因。相反，在培养的棕色脂肪细胞中，PRDM16的缺失会导致褐色脂肪细胞特性的显著减少，并激活了如Myf5、MyoD和Myogenin等骨骼肌选[15-16]择性基因的异常激活。ChoiJ等研究已经证实，在小鼠模型中Gelidiumelegans47 新疆医科大学硕士学位论文(GENS)-AMPK-PRDM16-UCP1途径，上调了PRDM16了表达水平，进而促进了UCP1[82]的表达，进而抑制高脂饲料诱导的肥胖小鼠的体重的增加。因此结合文献研究结果得到提示，Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，可能抑制了Leptin的mRNA和蛋白质表达水平，促进了Prdm16和Ucp1的mRNA和蛋白质表达水平，进而促进了hADSC向棕色脂肪细胞分化。棕色脂肪细胞的分化、发育和功能的实现，可由冷暴露、钠尿肽、噻唑烷二酮、甲状腺激素(如T3)、骨形成蛋白7(bonemorphogeneticprotein7,BMP7)、骨形态发生蛋白8b(bonemorphogeneticprotein8b,BMP8b)、成纤维细胞生长因子21(fibroblast[5-16]growthfactor21,FGF21)和orexin等多种刺激因素引发。研究发现FGF21不但通过激活BAT以应对寒冷暴露，还能促进冷暴露时WAT中米色脂肪细胞细胞的积累，[33-43]进而促进WAT的棕色化；而且FGF21还是脂联素的上游效应物，通过调控脂[33-43]联素的表达水平，从而起到了控制系统能量代谢的作用；FGF21可以显著地诱导Ucp1基因的表达，以及促进UCP1在棕色脂肪细胞相关的细胞培养系统中的解耦[33-43]联作用（证明了FGF21在棕色脂肪细胞分化过程中的细胞自主效应）。Dio2基因所编码的二型脱碘酶是一种二聚体跨膜蛋白，主要存在于中枢神经系统、脑垂体[25-32]前叶和棕色脂肪细胞中，通过催化活性较低的甲状腺素(thyroxin,或称四碘甲腺原氨酸：3，5，3’，5’-tetraiodothyronine，T4)转化为活性高的三碘甲腺原氨酸(3，5，[25-32]3’-triiodothyronine，T3)而发挥作用。本研究RT-qPCR和Western-blotting结果显示：hADSC分化为脂肪细胞过程中，与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组Dio2及Fgf21的mRNA和蛋白质相对表达水平显著升高，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。因此结合文献研究结果得到提示，Ad36诱导的hADSC分化为脂肪细胞过程，促进了Cidea和Fgf21的mRNA和蛋白质表达水平，进而促进了hADSC向棕色脂肪细胞分化。细胞死亡诱导DNA分裂因子A样的效应物家族蛋白，包含CIDEA、CIDEB(celldeath-inducingDNAfragmentationfactorA-likeeffectorB,CIDEB)和脂肪特异性蛋白27(fat-specificprotein27,FSP27；在人体内称为CIDEC,celldeath-inducingDNAfragmentationfactorA-likeeffectorC)，是与脂滴(lipiddroplet，LD)相关的蛋白，在脂[17-24]解、脂质氧化、LD形成、脂质分泌和低密度脂蛋白成熟中起重要作用，并且[17-24]CIDEA和CIDEC的表达水平与肥胖人群的胰岛素敏感性呈正相关。本研究在hADSC分化为脂肪细胞过程中，油红O染色结果显示鸡尾酒法诱导组的细胞内出现圆形较大脂滴，而Ad36诱导的细胞出现颗粒状较小脂滴；与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组Cidea基因的mRNA和蛋白相对表达水平显著升高，且差异有统计学意义。本研究结果与文献研究结果相结合提示，Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，促进了Cidea的mRNA和蛋白质表达水平，进而调控了脂肪细胞内颗粒状小48 新疆医科大学硕士学位论文脂滴的形成，从而使脂肪细胞内的脂滴呈现出与棕色脂肪细胞内相似的多室脂滴，进而促进了hADSC向棕色脂肪细胞分化。人线粒体DNA（mtDNA）由位于H链和L链的环状双链上的16,569个碱基对[55-60]组成，高度多态，几乎不含基因间区域。NADH脱氢酶是线粒体呼吸链中的第一个酶复合物，通过氧化NADH释放电子，产生供质子穿过内膜移位以产生质子梯[44-67]度势能，从而为ATP的合成和运输提供能量。线粒体细胞色素c氧化酶(cytochromecoxidase，CcO)是呼吸链的末端酶，催化电子从细胞色素c到氧的转移，藕联于质子穿过线粒体内膜，进而形成用于驱动ATP合成的质子动力，总反应：4cyt2++3++[44-67]c+8Hmitochondrialmatrix+O2→4cytc+4Hintermembranespace+2H2O。研究显示，COX5B(cytochromecoxidasesubunit5B，COX5B)是核编码的CcO亚基，位于复合[44-67]体IV的基质侧的膜外，通过促进细胞色素c的氧化参与ATP的合成。F1F0ATP合酶是线粒体电子传递链的第五个复合体，ATP6通过F0环的旋转在线粒体基质中[44-67]起着质子转位通道的作用，通过触发F1催化位点的变构以促进ATP的合成。本研究显示：在hADSC分化为脂肪细胞过程中，RT-qPCR和Western-blotting结果显示线粒体呼吸链及氧化磷酸化相关酶基因Cox5b、Atp5o、Atp6、Nd2的基因mRNA和蛋白表达水平显著升高，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）；在hADSC分化为脂肪细胞过程中，利用透射电镜的方法观察并计算细胞内线粒体数量，与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组细胞内的线粒体数量显著升高，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。这提示，hADSC分化过程中，与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组细胞中能量生成或产热增加。LncRNA(longnoncodingRNA，LncRNA)是一种长于200nt的非编码RNA，通常可分为五类，即意义、反义、双向、内含子和基因间LncRNAs.，在表观遗传调控、染色质修饰、基因组印迹、转录控制、转录前/转译mRNA处理等方面发挥重要作用，[68-76]近年来引起了广泛的关注。研究表明，LncRNA调控代谢组织的发育和功能，[68-76]包括脂肪生成、肝脂代谢、胰岛功能和能量平衡。人的LncRNAROR(longnoncodingRNAROR，LncRNAROR)是一种最近发现的LncRNA，长度为2.6kb，位于18号染色体，由4个外显子组成，它能够重新编程分化的细胞来诱导多能干细[68-76]胞(inducedpluripotentstemcell，iPSC)。LncRNAROR作为ceRNA，通过与microRNA反应元件(microRNArespondelementsMREs)相互作用，在转录组的调控网[68-76]络中发挥重要的作用。目前尚未有报道关于LncRNAROR在脂肪细胞棕色分化过程中的作用。JianguoHuang等研究发现，LncRNAROR与RNA结合蛋白hnRNPⅠ(heterogeneousnuclearribonucleoprotein,hnRNPⅠ)和AUF1(AU-richelementRNA-bindingprotein1,AUF1)结合，调节c-MycmRNA的稳定性，促进了c-Myc的表[85]达。本实验研究结果显示，siRNA敲低LncRNAROR后，Ad36诱导hADSC分化49 新疆医科大学硕士学位论文为脂肪细胞过程中，与对照组相比，LncRNAROR敲低组中，棕色脂肪细胞分化标记基因Cidea、Dio2、Fgf21、Ucp1、Prdm16，线粒体呼吸链及氧化磷酸化相关酶基因Cox5b、Atp5o、Atp6、Nd2的mRNA及蛋白质表达水平较对照组显著降低，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。结合文献研究，提示LncRNAROR可能参与调节了hADSC向棕色脂肪细胞分化。脂肪细胞分化过程中的机制是复杂多样的，而且脂肪细胞分化是受多种因子的调节的，因此具体机制有待进一步的研究。结合文献研究和本实验研究结果得出如下结论：Ad36可能通过上调LncRNAROR，从而使棕色脂肪标志基因Cidea、Dio2、Fgf21、Ucp1、Prdm16，线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因Cox5b、Atp5o、Atp6、Nd2的mRNA和蛋白质表达水平升高，进而促进了hADSC向棕色脂肪细胞分化。50 新疆医科大学硕士学位论文小结本研究以hADSC为研究对象，鸡尾酒法诱导分化为对照，初步探讨了Ad36在诱导人脂肪源性干细胞分化为棕色脂肪细胞中的作用。1油红O染色结果显示：hADSC分化为脂肪细胞过程中，鸡尾酒诱导组的脂肪细胞中脂滴较大，而Ad36诱导组则是颗粒状较小脂滴。2在hADSC分化为脂肪细胞过程中，与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组中LncRNAROR，棕色脂肪细胞分化标记基因Cidea、Dio2、Fgf21、Ucp1、Prdm16，线粒体呼吸链及氧化磷酸化相关酶基因Cox5b、Atp5o、Atp6、Nd2等的mRNA和蛋白质表达水平显著升高，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）；与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组Leptin的mRNA和蛋白质表达水平显著降低，且差异有统计学意义（P<0.01）。3Ad36诱导hADSC分化为脂肪细胞过程中，与对照组相比，LncRNAROR敲低组中，棕色脂肪细胞分化标记基因Cidea、Dio2、Fgf21、Ucp1、Prdm16，线粒体呼吸链及氧化磷酸化相关酶基因Cox5b、Atp5o、Atp6、Nd2的mRNA和蛋白质表达水平较对照组显著降低，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。4透射电镜观察到，在脂肪细胞分化过程中，与鸡尾酒法诱导组相比，Ad36诱导组细胞内的线粒体数量显著升高，且差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。5在hADSC分化为脂肪细胞过程中，Ad36可能通过上调LncRNAROR的mRNA表达水平，从而使Cidea、Dio2、Fgf21、Ucp1、Prdm16等棕色脂肪分化标记基因，以及线粒体呼吸链和氧化磷酸化相关酶基因Cox5b、Atp5o、Atp6、Nd2等基因的mRNA和蛋白质表达水平升高，进而促进了hADSC向棕色脂肪细胞分化。51 新疆医科大学硕士学位论文致谢毕业之际，我最感谢的人就是我的导师关亚群教授，感谢关老师一直以来对我的教导和鼓励。关老师一直都很忙，但她还是坚持每周给我们开一次课题组组会，帮我们解决实验中遇到的问题。关老师是我一生学习的楷模。能够成为关老师的学生，我很幸运。您给予我无微不至的关怀，感谢关老师这三年来对我的教育教导。感谢焦谊老师，还记得刚进实验室时我的qPCR做的不好，是焦老师亲自带着我重新做的。每天很忙还要帮我们课题组的成员订实验耗材。焦老师辛苦了。感谢梁小弟老师，第一个折线图是您教我做的，第一次WB也是您带着我做的，还帮我们出谋划策解决实验中遇到的难题。梁老师辛苦了。感谢陆剑飞老师以及一起攻读硕士学位的师兄师姐师妹师弟们，感谢你们三年来对我的帮助及关心，正是大家的相互团结协作才使我的课题顺利进行。衷心感谢生化教研室的所有老师。感谢科技楼干细胞室里的小伙伴们的帮助，感谢毕晓娟老师、陈小翠老师、李亮老师和盖敏涛老师。感谢杨勇同学和付伟同学在我胳膊摔骨折时对我的帮助。感谢李志鹏、张树文、张波和刘黎明同学对我的帮助。感谢我的父母及亲人对我硕士读书期间的宽容、理解、支持和鼓励。最后感谢各位专家及老师在百忙之中审阅我的论文。52 新疆医科大学硕士学位论文参考文献[1]MaciaE,CohenE,GueyeL,etal.PrevalenceofobesityandbodysizeperceptionsinurbanandruralSenegal:newinsightontheepidemiologicaltransitioninWestAfrica.CardiovascJAfr.2017Oct26;28:1-7.[2]HoufflynS,MatthysC,SoubryA.MaleObesity:EpigeneticOriginandEffectsinSpermandOffspring.CurrMolBiolRep.2017;3(4):288-296.[3]GaillardTR.TheMetabolicSyndromeandItsComponentsinAfrican-AmericanWomen:EmergingTrendsandImplications.FrontEndocrinol(Lausanne).2018Jan22;8:383.[4]DeRosaS,ArcidiaconoB,ChiefariE,BrunettiA,IndolfiC,FotiDP.Type2DiabetesMellitusandCardiovascularDisease:GeneticandEpigeneticLinks.FrontEndocrinol(Lausanne).2018Jan17;9:2.[5]McMurphyTB,HuangW,XiaoR,etal.HepaticExpressionofAdenovirus36E4ORF1ImprovesGlycemicControlandPromotesGlucoseMetabolismThroughAKTActivation.Diabetes.2017Feb;66(2):358-371.[6]YoonIS,ParkS,KimRH,etal.Insulin-sparingandfungibleeffectsofE4orf1combinedwithanadipocyte-targetingsequenceinmousemodelsoftype1andtype2diabetes.IntJObes(Lond).2017Oct;41(10):1601-1605.[7]VossJD,DhurandharNV.ViralInfectionsandObesity.CurrObesRep.2017Mar;6(1):28-37.[8]MinSY,KadyJ,NamM,etal.Human'brite/beige'adipocytesdevelopfromcapillarynetworks,andtheirimplantationimprovesmetabolichomeostasisinmice.NatMed.2016Mar;22(3):312-8.[9]JiaoY,AisaY,LiangX,etal.RegulationofPPARγandCIDECexpressionbyadenovirus36inadipocytedifferentiation.MolCellBiochem.2017Apr;428(1-2):1-8.[10]FirminFF,OgerF,GheeraertC,etal.TheRBM14/CoAA-interacting,longintergenicnon-codingRNAParal1regulatesadipogenesisandcoactivatesthenuclearreceptorPPARγ.SciRep.2017Oct26;7(1):14087.[11]LiuW,MaC,YangB,etal.LncRNAGm15290spongesmiR-27btopromotePPARγ-inducedfatdepositionandcontributetobodyweightgaininmice.BiochemBiophysResCommun.2017Nov25;493(3):1168-1175.53 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新疆医科大学硕士学位论文综述lncRNAs调控脂肪细胞分化研究进展刘玲综述关亚群审校脂肪是一种相当复杂的组织。它在人体所有的腔里面都可以找到，在所有组织中显示出独一无二的可塑性，并且除了它作为功能单位的脂肪细胞外还拥有很多其[1]他细胞。脂肪组织的功能取决于脂肪垫的位置、组织的细胞构成以及器官的能量利[1-2]用。在人体中，白色脂肪细胞以甘油三酯的形式将能量储存于脂滴中，棕色脂肪细胞以热能产热的方式释放能量，因为拥有相反的功能它们被认为与人体能量的平[2]衡有关。近年来大量研究数据表明lncRNAs参与了脂肪源性干细胞向脂肪细胞分[3-6]化的过程。本文根据lncRNAs的功能及脂肪细胞分化过程，对现有的lncRNAs调控脂肪细胞分化的研究进行了综述，为肥胖以及与肥胖相关的代谢性疾病提供一些理论基础和新思路。1lncRNAs生物学功能人类基因组中只有1%-2%的基因组编码蛋白，超过75%的基因组则只是转录成[3-4]非编码RNAs（non-codingRNAs，ncRNAs）。大多数的ncRNAs长度大于200[5]个核苷酸，被定义为长链非编码RNAs（longnon-codingRNAs，lncRNAs）。与mRNA一样，lncRNAs也是由RNA聚合酶Ⅱ转录并经过剪接和多聚腺苷酸化而成[6-9][6-9]。但是，这些转录物缺少功能的开放阅读框，因此被认为不能编码蛋白质。lncRNAs拥有各种各样的功能，它们可以作为支架、信号、反义的诱饵以及参与转[10-12]录的干扰。作为支架的lncRNAs通过与蛋白和其他的RNAs结合形成分子量更[8]大的功能复合体，比如端粒重复合成时所需要的端粒酶复合体以及与组蛋白修饰有[13]关的多梳状抑制复合物。lncRNAs可以作为特定发育阶段、转录调控或者特殊定[14]位的信号，如一些lncRNAs的转录可以作为共位蛋白编码基因的沉默。诱饵lncRNAs可以通过结合靶蛋白或着结合/隔离小的调节RNAs（包括miRNAs）而阻止[15-18]蛋白行使正常的功能。2脂肪细胞起源人类及其他的哺乳动物主要由两种脂肪组织组成：白色脂肪组织(Whiteadiposetissue,WAT)和棕色脂肪组织(Brownadiposetissue,BAT)。WAT以包含有单一大脂滴[19]的脂肪细胞为特征，它是一个动态的内分泌器官，通过储存和水解甘油三酯来控60 新疆医科大学硕士学位论文制机体的脂肪和能量利用；还通过产生内分泌因子参与调节饱腹感、能量利用、葡[20]萄糖敏感性、胰岛素敏感性和炎症等重要生理通路。WAT是构成正常成年人脂肪组织的主要脂肪组织类型，它遍布与人体皮下的各个部位，包裹着人体的内脏器官，[19-21]占健康成年人体重的20%。BAT主要由含有小脂滴的棕色脂肪细胞组成，分布[19]于人体的椎旁、锁骨上及肾上腺周围，主要参与产热。BAT富含线粒体，表达线粒体UCP1（uncouplingprotein1，UCP1），使线粒体中脂肪酸β氧化释放热能而不[22-23]生成ATP。另外还有一种类型的细胞也表达UCP1，即米色脂肪细胞（beige/brite（browninwhite）），它被认为是一种非传统的棕色脂肪细胞或诱导型的脂肪细胞[24-26]+。因为传统的棕色脂肪细胞来是由myf5阳性(myf5)的前体肌细胞分化而来[26-27]+；而米色脂肪细胞则是与白色脂肪细胞来源相似，既可以由myf5阳性(myf5)-[27-30]的前体肌细胞分化而来，也可由myf5阴性(myf5)的前体肌细胞分化而来。2.1白色脂肪细胞分化白色脂肪细胞没有特异的标记基因，但是一些基因如FABP4(fatty-acidbindingprotein4）、PPARγ（peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ）、C/EBPα[31-33]（CCAAT/enhancer-bindingproteinα）在白色脂肪细胞中呈现出高表达的水平。白色脂肪细胞分化过程中转录水平的调控涉及到一些转录因子PPARγ和C/EBPs的[27-31]激活，并且PPARγ是所有类型脂肪细胞分化的一个开关。C/EBPα可以维持PPARγ的表达，也可以与PPARγ调节一些基因的表达来促进脂肪细胞的分化，而且[27-33]大鼠C/EBPα的缺失抑制了其白色脂肪细胞的分化。2.2棕色脂肪细胞分化BAT是存在于小鼠、大鼠、兔子、羊、熊以及人等哺乳动物中一种特殊类型的[34]脂肪组织。BAT一直以来被认为只存在于冬眠的动物和新生儿中，直到2009年人[35-38]们才在成年人体中发现BAT。除去UCP1，棕色脂肪细胞的标志基因还包括PGC-1α（peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ-coactivator1α）、CIDEA（celldeath-inducingDNAfragmentationfactoralpha-likeeffectorA）、Dio2（iodothyronine[39]deiodinase2）等。在棕色脂肪细胞分化过程中，一些正调控因子已经被人们发现，包括蛋白PRDM16（PRdomain16），PPARα（peroxisomeproliferator-activatedreceptor[31]α），BMP7（bonemorphogeneticprotein7）等。PRDM16与其他的调节因子PPARγ，PGC-1α/β，EHMT1（euchromatichistone-lysineN-methyltransferase1），CtBPs（C-terminal-bindingproteins），以及EBF2(earlyBcellfactor2)等结合后共同参与调[40-45]节棕色脂肪细胞的分化。2.3米色脂肪细胞分化米色脂肪细胞，也被认为是这一种诱导型的棕色脂肪细胞，可以经由冷暴露和[46-47]其他一些刺激因素诱导而成。米色脂肪细胞散在分布于白色脂肪细胞中，形态61 新疆医科大学硕士学位论文上除了大小不同外与传统的棕色脂肪细胞相似，含有多室脂滴以及表达UCP1的线[48-49]粒体。米色脂肪细胞也表达棕色脂肪的特异性标志基因，如UCP1，PGC-1α，[50]CIDEA，PRDM16，C/EBPβ等。2012年]Fisher,F.M等研究发现.FGF21（fibroblastgrowthfactor21）加强了肝脏和脂肪组织中脂肪酸的β氧化，从而诱导了WAT的棕[51]色化以及保护了饮食诱导型肥胖和胰岛素抵抗。3lncRNAs调控脂肪细胞分化与miRNAs相比，lncRNAs拥有较少的保守序列，它主要是通过本身的一级结构、二级结构、三级结构与RNA结合蛋白相结合在转录水平或转录后水平调控基因[52-53]的表达。JiantaoChen课题研究小组，利用lncRNAs微阵列的实验方法分析了BAT和WAT中lncRNAs的表达情况，发现了在BAT中735个上调和877个下调的[54]lncRNAs。他们从中选出了lncRNAAK142386和lncRNAAK133540，并证实了它们分别通过调控Hoxa3（homeoboxA3）和Acad10（acyl-CoAdehydrogenasefamily[54]member10）进而影响脂肪细胞的分化过程。TengfeiXiao等研究发现LncRNAADINR(adipogenicdifferentiationinducednoncodingRNA)，与组蛋白甲基化复合物MLL3/4组蛋白甲基转移酶复合物中的PA1结合后，通过顺式作用影响C/EBPα（CCAAT/enhancer-bindingproteinα）的启动子区的H3K4me3（H3lysine4[55]trimethylation），进而调控C/EBPa的活性，以实现对脂肪细胞分化的调控。DeniseR.Cooper等研究发现，在3T3-L1细胞中，LncRNANEAT1(MENepsilon/ornuclear-enrichedabundanttranscript)通过与SRp40（serine/arginine-richsplicingprotein）相结合，调节了PPARγ2（peroxisomeproliferator-activatedreceptorγ2）的剪接进而[56]影响了脂肪细胞的分化。Xu-YunZhao等研究发现Blnc1(BrownfatlncRNA1)是一种诱导型的lncRNA，Blnc1通过与EBF2结合顺式调控EBF2，以及Blnc1-EBF2[57]形成一个正反馈网络上调了棕色脂肪细胞/米色脂肪细胞的形成。4展望一直以来，白色脂肪都被人们认为是一种“坏”或者说是“阴暗”的脂肪组织，克服[58-59]或减轻肥胖的可能方法就是抑制白色脂肪组织的增加，然而，从动物模型来看，[59-60]阻断白色脂肪分化对人体健康不宜；另外一种方法是增加棕色脂肪和（或）米色脂肪细胞的数量，根据大量动物模型研究发现，人为干预一些调控棕色脂肪细胞[39，43，46-47，50，61-63]和米色脂肪细胞分化的因子可能可行。近年来人们对于lncRNAs[52-57]研究越来越狂热，并且也有相当的研究结果证实lncRNAs参与了脂肪细胞分化。但是其中具体的分子机制尚不明了，尤其是lncRNAs对棕色脂肪细胞和米色脂肪细胞的调控机制。因此构建脂肪细胞分化的调控网络，利用lncRNAs介导脂肪细胞分化将成为治疗肥胖以及相关代谢性疾病的新思路。62 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