向日葵枯萎病拮抗木霉的筛选及防治作用研究

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全日制农业硕士学位论文向日葵枯萎病拮抗木霉的筛选及防治作用研究研究生：刘万斌指导教师：谷祖敏副教授合作指导教师：王芊研究员申请学位类别：农业硕士专业领域名称：植物保护研究方向：农药学所在学院：植物保护学院2018年6月 DissertationforMasterScreeningofantagonisticTrichodermaagainstsunflowerwiltandresearchonthecontroleffectCandidate：WanbinLiuSupervisor：ZuminGuassociateprofessorSpeciality：PlantprotectionResearchField：PesticidescienceShenyangAgriculturalUniversityJune,2018 沈阳农业大学专业硕士学位论文目录摘要.....................................................................................................................................1Abstract...............................................................................................................................3第一章向日葵枯萎病硏究概况及木霉菌生防应用(文献综述)................................51.1向日葵枯萎病的发生及防治.............................................................................51.1.1向日葵枯萎病的发生与危害..................................................................51.1.2向日葵枯萎病病原菌...............................................................................51.1.3向日葵枯萎病的化学防治存在问题......................................................51.1.4向日葵枯萎病的生物防治......................................................................61.2生防木霉菌的研究进展......................................................................................61.2.1生防木霉菌...............................................................................................61.2.2生防木霉菌的特点...................................................................................61.2.3生防木霉菌的分类...................................................................................71.2.4生防木霉菌防治土传病害......................................................................81.2.5生防木霉菌剂型的研究进展..................................................................81.3生防木霉菌生物防治的作用机理.....................................................................91.3.1拮抗作用.....................................................................................................91.3.2竞争作用.....................................................................................................91.3.3重寄生作用..............................................................................................101.3.4诱导抗性...................................................................................................101.4本论文研究的目的和意义...............................................................................10第二章向日葵枯萎病病原菌分离.............................................................................122.1试验材料............................................................................................................122.1.1植物材料..................................................................................................122.1.2供试培养基.............................................................................................122.1.3供试土壤..................................................................................................122.1.4试验仪器..................................................................................................122.2试验方法............................................................................................................122.2.1病原菌分离.............................................................................................122.2.2柯赫式法则验证.....................................................................................132.2.3病原菌形态特征观察.............................................................................132.2.4向日葵枯萎病镰刀菌接种方法的选择................................................132.3结果与分析........................................................................................................142.3.1病害症状..................................................................................................142.3.2柯赫氏法则证病.....................................................................................142.3.3病原菌形态特征.....................................................................................152.3.4向日葵镰刀菌接种方法的选择结果....................................................162.4本章小结............................................................................................................16第三章向日葵枯萎病拮抗木霉的分离与筛选..........................................................173.1试验材料............................................................................................................173.1.1供试土样..................................................................................................173.1.2供试菌株..................................................................................................173.1.3供试培养基.............................................................................................17I 目录3.1.4试验仪器..................................................................................................173.2试验方法............................................................................................................173.2.1向日葵枯萎病镰刀菌拮抗木霉菌株的分离.......................................173.2.1.1土样采集.......................................................................................173.2.1.2土壤中生防木霉菌的分离...........................................................183.2.2向日葵枯萎病镰刀菌拮抗木霉菌株的筛选.......................................183.2.2.1初筛................................................................................................183.2.2.2复筛................................................................................................183.2.3向日葵枯萎病镰刀菌高效拮抗木霉菌的鉴定...................................193.3结果与分析........................................................................................................193.3.1木霉菌株的分离.....................................................................................193.3.2向日葵枯萎病菌拮抗木霉初筛结果....................................................203.3.3向日葵枯萎病菌拮抗木霉复筛结果....................................................223.3.4向日葵枯萎病菌高效拮抗木霉菌株的鉴定结果...............................223.4本章小结............................................................................................................23第四章绿色木霉HS-4固体发酵条件的研究............................................................244.1试验材料............................................................................................................244.1.1供试菌株..................................................................................................244.1.2发酵基质..................................................................................................244.2试验方法............................................................................................................244.2.1木霉菌液体发酵.....................................................................................244.2.2绿色木霉HS-4固体发酵培养基的筛选.............................................244.2.2.1固体发酵培养基种类的筛选......................................................244.2.2.2绿色木霉HS-4固体发酵培养基的正交设计..........................244.2.3绿色木霉HS-4固体发酵条件的研究.................................................254.2.3.1绿色木霉HS-4固体发酵瓶装量的选择...................................254.2.3.2绿色木霉HS-4固体发酵温度的选择.......................................254.2.3.3绿色木霉HS-4固体发酵接菌量的选择...................................254.2.3.4绿色木霉HS-4固体发酵pH的选择........................................254.2.3.5绿色木霉HS-4固体发酵加水量的选择...................................264.2.4数据处理..................................................................................................264.3结果与分析........................................................................................................264.3.1绿色木霉HS-4固体发酵培养基的筛选.............................................264.3.2绿色木霉HS-4固体发酵的正交组合筛选.........................................274.3.3绿色木霉HS-4固体发酵条件的确定.................................................274.4本章小结............................................................................................................30第五章绿色木霉HS-4颗粒剂的制备......................................................................315.1试验材料............................................................................................................315.1.1供试菌株..................................................................................................315.1.2供试试剂..................................................................................................315.1.3供试仪器..................................................................................................315.1.4试验土壤..................................................................................................315.2试验方法............................................................................................................315.2.1绿色木霉HS-4孢子粉制备..................................................................31II 沈阳农业大学专业硕士学位论文5.2.2绿色木霉HS-4助剂筛选......................................................................315.2.3绿色木霉HS-4颗粒剂制造过程..........................................................325.2.4绿色木霉HS-4颗粒剂贮藏稳定性测定.............................................325.2.5绿色木霉HS-4颗粒剂对向日葵促生作用的测定方法....................335.2.6不同镰刀菌浓度下绿色木霉HS-4颗粒剂防治作用的测定............335.2.7不同湿度下绿色木霉HS-4颗粒剂防治作用的测定........................335.2.8不同温度下绿色木霉HS-4颗粒剂防治作用的测定........................335.2.9数据处理..................................................................................................335.3结果与分析........................................................................................................335.3.1绿色木霉HS-4孢子粉助剂筛选...........................................................335.3.1.1稳定剂的筛选...............................................................................345.3.1.2粘结剂的筛选...............................................................................345.3.1.3载体的筛选...................................................................................345.3.1.4崩解剂的筛选...............................................................................355.3.2绿色木霉HS-4颗粒剂的生产工艺.....................................................355.3.3绿色木霉HS-4颗粒剂贮藏稳定性测定.............................................365.3.4绿色木霉HS-4颗粒剂对向日葵的促生作用结果............................365.3.5不同镰刀菌浓度下绿色木霉HS-4颗粒剂的防治效果....................375.3.6不同湿度下绿色木霉HS-4颗粒剂的防治效果.................................375.3.7不同温度下绿色木霉HS-4颗粒剂的防治效果.................................385.4本章小结............................................................................................................38第六章结论与讨论........................................................................................................406.1向日葵枯萎病病原菌分离与鉴定..................................................................406.2向日葵枯萎病拮抗木霉的分离与筛选..........................................................406.3绿色木霉HS-4固体发酵条件的研究............................................................416.4绿色木霉HS-4颗粒剂的制备........................................................................42参考文献...........................................................................................................................44附录...................................................................................................................................50致谢...................................................................................................................................52III ContentsContentsChineseAbstract.................................................................................................................1EnglishAbstract..................................................................................................................3Chapter1ResearchprogressonSunflowerFusariumwiltandtheapplicationofTrichodermabiocontrol(Literaturereview).....................................................................51.1TheoccurrenceandcontrolofsunflowerFusariumwilt...................................51.1.1TheoccurrenceanddamageofsunflowerFusariumwilt........................51.1.2PathogenofsunflowersFusariumwiltdisease........................................51.1.3ProblemsinchemicalcontrolofsunflowerFusariumwilt.....................51.1.4BiologicalcontrolofsunflowerFusariumwilt........................................61.2ResearchprogressonbiocontrolofTrichoderma............................................61.2.1Trichoderma................................................................................................61.2.2CharacteristicsofTrichoderma.................................................................61.2.3ClassificationofTrichoderma...................................................................71.2.4Trichodermainhibitssoil-bornediseases..................................................81.2.5ResearchProgressofTrichodermaForms................................................81.3ActionmechanismofbiologicalcontrolofTrichoderma...................................91.3.1Antagonismaction......................................................................................91.3.2Competitiveaction......................................................................................91.3.3Mycoparasitism.........................................................................................101.3.4Induceddiseaseresistance.......................................................................101.4Theobjectiveandthesignificanceofpaper......................................................10Chapter2Sunflowerfusariumwiltpathogenisolation...................................................102.1Experimentmaterial............................................................................................122.1.1Plantmaterial............................................................................................122.1.2Testmedium..............................................................................................122.1.3Testsoil.....................................................................................................122.1.4TestInstruments........................................................................................122.2Experimentmethod.............................................................................................122.2.1Pathogenisolation....................................................................................122.2.2Koch'slawverification.............................................................................132.2.3Morphologicalcharacteristicsofpathogenicbacteria............................132.2.4SelectionofFusariuminoculationmethodsforsunflowerwiltdisease.............................................................................................................................132.3Resultsandanalysis............................................................................................14IV 沈阳农业大学专业硕士学位论文2.3.1Diseasesymptoms....................................................................................142.3.2Koch'srulesyndrome...............................................................................142.3.3Pathogenicbacteria...................................................................................152.3.4SelectioneesultsofsunflowerFusariuminoculationmethods.............162.4Chapterconclusions............................................................................................16Chapter3IsolationandscreeningofantagonisticTrichodermaagainstofsunflowerFusariumwilt....................................................................................................................173.1Experimentmaterial............................................................................................173.1.1Testsoil.....................................................................................................173.1.2Teststrain..................................................................................................173.1.3Testmedium..............................................................................................173.1.4TestInstruments........................................................................................173.2Experimentmethod.............................................................................................173.2.1IsolationofantagonisticTrichodermastrainsofsunflowerFusariumwilt......................................................................................................................173.2.1.1Soilsamplecollection...................................................................173.2.1.2SeparationofTrichodermainsoil................................................183.2.2ScreeningofantagonisticTrichodermastrainsofsunflowerFusariumwilt......................................................................................................................183.2.2.1Initialscreening..............................................................................183.2.2.2Screenagain....................................................................................183.2.3IdentificationofhighlyeffectiventagonisticTrichodermastrainsofsunflowerFusariumwilt...................................................................................193.3Resultsandanalysis............................................................................................193.3.1IsolationofTrichodermastrains..............................................................193.3.2antagonisticTrichodermascreeningresultsofsunflowerFusariumwilt.............................................................................................................................203.3.3antagonisticTrichodermarescreeningofsunflowerFusariumwilt.....223.3.4TheresultofhighlyeffectiventagonisticTrichodermastrainsofsunflowerFusariumwilt...................................................................................233.4Chapterconclusions............................................................................................23Chapter4StudyonthefermentationconditionsofTrichodermavirideHS-4.............244.1Experimentmaterial............................................................................................244.1.1Teststrain..................................................................................................244.1.2Fermentationsubstrate.............................................................................24V Contents4.2Experimentmethod.............................................................................................244.2.1Trichodermaliquidfermentation.............................................................244.2.2Screeningofsolidfermentationmedia...................................................244.2.2.1Screeningofsolidfermentationmedium......................................244.2.2.2Orthogonaldesignofsolidfermentationmedium.......................244.2.3StudyonthefermentationconditionsofTrichodermavirideHS-4......254.2.3.1SelectionofsolidfermentationbottlevolumeofTrichodermavirideHS-4..................................................................................................254.2.3.2SelectionofsolidfermentationtemperatureofTrichodermavirideHS-4..................................................................................................254.2.3.3SelectionofsolidfermentationcapacityofTrichodermavirideHS-4…………………………………………………....………………254.2.3.4ThechoiceofsolidfermentationpHofTrichodermavirideHS-4.....................................................................................................................254.2.3.5ThechoiceofsolidfermentationwateradditionofTrichodermavirideHS-4..................................................................................................264.2.4Dataprocessing.........................................................................................264.3Resultsandanalysis............................................................................................264.3.1Screeningofsolidfermentationmedia...................................................264.3.2Orthogonalcombinationscreeningofsolidfermentation.....................274.3.3DeterminationofsolidfermentationconditionsofTrichodermavirideHS-4....................................................................................................................274.4Chapterconclusions............................................................................................30Chapter5PreparationofTrichodermavirideHS-4granules.....................................315.1Experimentmaterial............................................................................................315.1.1Teststrain..................................................................................................315.1.2Reagent......................................................................................................315.1.3Instrument.................................................................................................315.1.4Testsoil.....................................................................................................315.2Experimentmethod.............................................................................................315.2.1TrichodermavirideHS-4sporepowderpreparation..............................315.2.2TrichodermavirideHS-4auxiliaryscreening........................................315.2.3TrichodermaHS-4granulemanufacturingprocess................................325.2.4DeterminationofstoragestabilityofTrichodermaHS-4granules.......325.2.5EffectofTrichodermavirideHS-4granulesonsunflowergrowth.......335.2.6DeterminationofthecontroleffectofTrichodermavirideHS-4VI 沈阳农业大学专业硕士学位论文granulesatdifferentFusariumconcentrations.................................................335.2.7DeterminationofthecontroleffectofTrichodermavirideHS-4granulesunderdifferenthumidity.....................................................................335.2.8DeterminationofthecontroleffectofTrichodermavirideHS-4granulesatdifferenttemperatures.....................................................................335.2.9Dataprocessing.........................................................................................335.3Resultsandanalysis............................................................................................335.3.1ScreeningofTrichodermavirideHS-4sporepowderadditives...........335.3.1.1Stabilizerscreening........................................................................345.3.1.2Binderscreening.............................................................................345.3.1.3Vectorscreening.............................................................................345.3.1.4Disintegrantscreening...................................................................355.3.2TrichodermaHS-4granulesproductionprocess....................................355.3.3DeterminationofstoragestabilityofTrichodermaHS-4granules.......365.3.4TheeffectofTrichodermavirideHS-4granulesonsunflowergrowth365.3.5ControleffectofTrichodermaHS-4granulesatdifferentFusariumconcentrations....................................................................................................375.3.6ThecontroleffectofTrichodermaHS-4granulesatdifferenthumidity.............................................................................................................................375.3.7ThecontroleffectofTrichodermaHS-4granulesatdifferenttemperatures.......................................................................................................385.4Chapterconclusions............................................................................................38Chapter6Conclusionanddiscussion..............................................................................406.1IsolationandidentificationofpathogensofsunflowerFusariumwilt............406.2IsolationandscreeningofantagonisticTrichodermaagainstsunflowerFusariumwilt..........................................................................................................406.3StudyonsolidfermentationconditionsofTrichodermaHS-4........................416.4PreparationofTrichodermaHS-4granules.......................................................42Reference..........................................................................................................................44Appendix...........................................................................................................................50Acknowledgement............................................................................................................52VII 沈阳农业大学专业硕士学位论文摘要向日葵枯萎病是由镰刀菌属（Fusariumspp.）引起的病害，发病严重时植株整株枯死。本试验分离得到向日葵枯萎病病原菌，利用柯赫式法则进行了证病，筛选出对向日葵枯萎病菌有明显拮抗作用的木霉菌株。优化了高效木霉固体发酵培养基质，探索其发酵条件。筛选出与木霉有良好相容性的助剂，研制出防治向日葵枯萎病的木霉菌颗粒剂，测定了木霉菌颗粒剂对向日葵幼苗生长的促生作用及不同条件下对向日葵枯萎病的防治作用。从内蒙采集向日葵枯萎病病株，采用组织分离法获得向日葵枯萎病病原菌，通过柯赫式法进行证病。根据病原菌的形态特征，鉴定病原菌为镰刀菌(Fusariumspp.)。比较浸根法，灌根法，拌土法接种病原菌后向日葵枯萎病的发病情况，筛选出拌土法作为盆栽试验向日葵上接种镰刀菌的方法。从浙江杭州、辽宁庄河、盘锦、沈阳地区采集土壤样本160份，分离出59株木霉菌，通过与向日葵枯萎病菌的对峙培养试验初筛出抑菌效果达70%以上的木霉菌株6株，盆栽试验复筛筛选出对向日葵枯萎病防治效果最好的HS-4菌株，防效达到66.04%，并且可以促进地上和地下部分植株生长，地上鲜重增长率为34.25%，地下根系增长率为32.07%。经形态学鉴定为绿色木霉(Trichodermaviride)。通过正交试验筛选绿色木霉HS-4的固体发酵培养基质，当玉米粉：稻壳：9麦麸=3：3：1(质量比)配制时，产孢量最高，为3.726×10个/g。通过单因素试验明确HS-4菌株最优发酵条件为：250mL三角瓶中加入20g的混合固体培养基，加水量6mL，接种量5mL，pH=6，变温发酵7d。通过助剂与木霉HS-4菌株相容性测试，明确了木霉HS-4颗粒剂配方，碳酸钙为稳定剂、明胶为粘结剂、硅藻土为载体、硫酸钠为崩解剂。将碳酸钙1g，明胶1g，硅藻土5g，硫酸钠3g，与适量木霉HS-4孢子粉均匀混合后加入5mL水，经过旋转式造粒机挤压造粒后，自然风干后得到木霉HS-4颗粒剂。6个月贮藏稳定性试验表明，室温25℃贮藏时活孢率为46.19%，4℃低温贮藏活孢率为63.47%。盆栽试验证实木霉HS-4颗粒剂对向日葵的生长表现促生作用，叶片饱满厚重，根系粗壮。育苗时，以药土比为1：12.5施加HS-4颗粒剂，地下根系生长1 摘要量提高了29.09%，地上鲜重提高了27.13%。防病试验证实，在土壤中向日葵枯萎病菌的含量为2%时，温度为25℃时，HS-4颗粒剂对向日葵枯萎病的防治效果最好，防效达到56.78%，土壤湿度对防效影响不大。关键词：向日葵枯萎病；木霉菌株；颗粒剂；生物防治2 沈阳农业大学专业硕士学位论文AbstractSunflowerwiltisadiseasecausedbyFusariumspp.Whenthediseaseissevere,thewholeplantwilldie.Inthisexperiment,pathogensofsunflowerwiltdiseasewereisolated.TheKoch-typerulewasusedtoidentifythedisease,andtheTrichodermastrainswithobviousantagonismagainstFusariumspp.wiltofsunflowerwerescreenedout.Optimizedthehigh-efficiencyTrichodermafermentationbrothandexploreditsfermentationconditions.ScreeningforadditiveswithgoodcompatibilitywithTrichoderma,andTrichodermagranulesforcontrollingsunflowerFusariumwiltweredeveloped.ThegrowthpromotingeffectofTrichodermagranulesonsunflowerseedlingswasmeasuredandthecontrolofsunflowerFusariumwiltunderdifferentconditionsweremeasured.ThesunflowerFusariumwiltdiseasedplantswerecollectedfromInnerMongolia,andthepathogensofsunflowerFusariumwiltdiseasewereobtainedbytissueseparationmethod.TheKoch-typemethodwasusedforsyndromes.Accordingtothemorphologicalcharacteristicsofthepathogen,thepathogenwasidentifiedasFusarium.Comparingtheoccurrenceofsunflowerwiltdiseaseafterinoculationwithpathogenicbacteriainthemethodsofimmersingroots,irrigatingroots,andmixingsoils,thesoilmixingmethodwasselectedasamethodforinoculatingFusariumonpottedsunflower.Collected160soilsamplesfromHangzhou,Zhuanghe,PanjinandShenyang.ThroughacountercultureexperimentwithFusariumoxysporum,Isolated59strainsofTrichodermasppandscreeningof6strainsofTrichodermastrainswithabacteriostaticeffectofmorethan70%.ThepottedtestrescreeningscreenedthebestHS-4strainforthecontrolofsunflowerFusariumwiltdisease,thecontroleffectwas66.04%,anditcanpromotethegrowthofplantsonthegroundandunderground,thegrowthrateoffreshweightonthegroundis34.25%,andthegrowthrateofundergroundrootsis32.07%.ThroughthemorphologyidentificationwasidentifiedasTrichodermaviride.Theorthogonaltestwasusedtoscreenthesolidfermentationbrothof3 AbstractTrichodermavirideHS-4.Whencornmeal:ricehull:wheatbran=3:3:1(massratio),9thehighestconidialyieldwas3.726×10/g.Throughsingle-factortests,theoptimalfermentationconditionsforHS-4strainswere:20gofmixedsolidmediumwasaddedtoa250mLconicalflask,6mLofwaterwasadded,5mLofinoculum,pH=6,andthetemperaturewaschangedfor7days.ThroughthecompatibilitytestofadditivesandTrichodermastrainHS-4,theformulationofTrichodermaHS-4granuleswasclarified,Usingcalciumcarbonateasastabilizer,gelatinasabinder,diatomaceousearthasacarrier,andsodiumsulfateasadisintegrant.1gofcalciumcarbonate,1gofgelatin,5gofdiatomaceousearth,3gofsodiumsulfate,andasuitableamountofsporepowderofTrichodermastrainHS-4wereuniformlymixedandaddedwith5mLofwater.Afterbeingsqueezedandgranulatedbyarotarygranulator,themixturewasnaturallyair-driedtoobtainTrichodermaHS-4granules.The6-monthstoragestabilitytestshowedthatthecellviabilitywas46.19%atroomtemperatureat25℃and63.47%at4℃.ThepotexperimentshowedthattheHS-4granulesofthewoodymildewpromotedthegrowthofthesunflower.Theleaveswerefullandheavy,andtherootswerethick.Whengrowingseedlings,theHS-4granuleswereappliedataratioof1:12.5forthesoil,theundergroundrootgrowthwasincreasedby29.09%,andthefreshweightonthegroundwasincreasedby27.13%.Thedisease-preventiontestconfirmedthatHS-4granuleshadthebestcontroleffectonsunflowerFusariumwiltwhenthetemperaturewas25°CandthecontentofFusariumwiltinsoilwas2%,andthecontroleffectwas56.78%;Soilmoisturehaslittleeffectoncontrolefficiency.Keywords:Sunflowerwilt;Trichoderma;Granules;Biologicalcontrol4 沈阳农业大学专业硕士学位论文第一章向日葵枯萎病硏究概况及木霉菌生防应用(文献综述)1.1向日葵枯萎病的发生及防治1.1.1向日葵枯萎病的发生与危害向日葵枯萎病是一种由镰刀菌(Fusariumspp.)引起的向日葵土传病害，病原菌破坏维管束细胞，枯萎病病株是自下而上逐次萎蔫，从而使得向日葵整株枯萎。枯萎病的发生受环境温度的影响，在29℃-32℃时发病最明显，叶色由绿逐渐变淡，最终转化为褐色，髓部变色或褐化。用刀切开病茎，可发现维管束组织发生黑褐色的环状病变。纵切茎基部，能够看出维管束组织的纤维成褐色絮状结构，挤压有液体流出(杜宾等，2018)。向日葵刚被镰刀菌侵染初期，症状不明显，早晨和晚上蒸腾作用小，植物表现正常；中午或是高温时候，才有明显症状。侵染中后期仔细观察向日葵基部茎，可以在粗糙的表皮裂缝中间看到白色或粉红色霉状物，这些霉状物也是区分镰刀菌性枯萎病和生理性缺水的明显特征之一。,1.1.2向日葵枯萎病病原菌向日葵枯萎病的病原菌是镰刀菌(Fusariumspp.)。镰刀菌无性时期属于半知菌亚门，有性时期为子囊菌亚门，是十分常见的腐生菌、附生菌。Link（1809）最早发现了镰刀菌，镰刀菌属的种类繁多，已报道的镰刀菌有500多种。它们分布十分广泛，普遍存在于土壤及动物有机体上。世界上第一个报道了向日葵枯萎病是由镰刀菌引起的国家是20世纪70年代的美国(OrellanaRG等)。之后世界各地区在对向日葵病害调查的过程中都发现镰刀菌可造成向日葵枯萎病，亚洲的印度、巴基斯坦、塞尔维亚等地区发现不同种属的镰刀菌都可造成向日葵枯萎病病害(BhargavaSN，1976、ZazzeriniA，1992、JasnicS，2006)。突尼斯在20世纪80年代报道了一种专化型镰刀菌可以引起向日葵维管束枯萎病(ElMahjoubM.)，2014年我国第一次报道了由层出镰刀菌引起的向日葵枯萎病，这一发现使得我国向日葵枯萎病的研究空白被打破。(RenJ，ZhangG，ZhangYY，2015)。1.1.3向日葵枯萎病化学防治存在的问题目前化学农药是防治向日葵枯萎病的主要方法之一。化学防治成本低，效果快，适应防治对象广，使用方法简便，但许多问题也在使用过程中被发现。第一，5 第一章向日葵枯萎病硏究概况及木霉菌生防应用(文献综述)化学农药对环境的污染。化学农药在使用的过程中会通过不同方式进入到空气中，随着空气的传播进而扩大污染范围。喷洒作为农药施用的主要方式，会对种植作物的土壤在一定程度上造成污染。农药从地表渗入到地下水中，使得地下水中含有农药，农药随着地下水的流动对周围水体造成一定程度的污染。第二，目前使用的化学农药毒性相对较高，有些高毒农药会直接造成人畜的死亡，而一些新型的低毒、低残留的复合化学农药产品防治效果慢，不易被农民接受。第三，农民缺乏科学使用农药技术知识，各种不正确的使用方法使得化学农药造成污染。第四，病菌、害虫、杂草等易产生抗药性甚至耐药性，引起猖獗的灾害再度爆发。第五，化学农药的药害现象日趋严重，每年农药的直接药害和间接药害都有不同程度发生。第六，农药残留造成的影响受到世界各国的高度关注，我国的农药残留标准制定不够完善、残留检测方法不够系统。1.1.4向日葵枯萎病的生物防治世界上使用生物防治来防治向日葵枯萎病也有许多成果。苜蓿根瘤菌可以通过土壤处理等方式来抑制向日葵镰刀菌的发病情况(Ehteshamul-Haque1993)。水黄皮等植物的叶片提取液能显著抑制向日葵镰刀菌的孢子萌发、孢子产生和菌丝体生长(ThiribhuvanamalaG1998)。利用乌墨蒲桃、芫荽、辣椒、印楝4种种子浸泡过后的水溶液处理向日葵种子，可降低向日葵镰刀菌的数目(RaufB，AhmadI2001)。木霉菌也可以有效地减少向日葵镰刀菌枯萎病的发病率。1.2生防木霉菌的研究进展1.2.1生防木霉菌木霉属(Trichodermaspp.)广泛存在于不同环境下的土壤中，大多数木霉菌可以产生对病原菌、细菌、害虫具有拮抗作用的物质，并能促进植物生长发育，提高农作物产品产量和质量，具有重要经济价值。由于化学药剂对环境带来各种污染及破坏，部分病原菌的抗药性日益显著，因此采用生物防治来消灭病原菌、细菌、害虫、杂草十分必要。木霉菌作为一种重要的生防菌(杨合同等，1999)，被广泛应用于生物防治，也可与农作物肥料混用。1.2.2生防木霉菌的特点广谱性：木霉菌对多种重要植物病原真菌有拮抗作用，例如镰刀菌、腐霉菌、轮枝菌等。木霉菌防治病害的对象十分广泛，主要是用于防治花卉植物，蔬菜的6 沈阳农业大学专业硕士学位论文土传真菌病害，有棉花枯黄萎病、黄萎病、猝倒病、小麦纹枯病、各种蔬菜的苗期病害等。多机制性：木霉菌的作用机制多种多样，因此而受到生物农药研究人员以及农药厂商的高度重视，这也是木霉菌防治效果良好的一个重要原因。多机制性包括抗菌代谢产物的杀菌作用、溶菌作用、毒性蛋白、重寄生作用、竞争作用、蛋白酶等。广泛适应性：土壤、水体以及其他生态环境中都可以发现木霉菌的存在。木霉菌是各种生态环境中微生物的重要组成部分。木霉菌的菌丝生长及孢子萌发对温度、湿度、pH等环境条件有较广的适应范围。木霉菌本身也对一些高毒农药具有抗性，可以减少高毒农药对作物和环境的影响。其它：木霉菌生长对其所处的环境条件以及营养成分要求宽松，与其他生防菌比生长速度相对较快，符合将来工业化生产的基本要求。1.2.3生防木霉菌的分类1969年Rifai第一个提出木霉属的分类系统(Rifai，1969)，他从产孢结构、孢子梗的分枝状态还有孢子的特征将木霉初步分成了9个集合种。Bissett在研究了木霉菌的形态变异后，结合了Doi等(1987)和其他学者的研究进展，对木霉属的分类进行了新的定义，建立了Bisset系统(Bissett，1984，1991，1992)。20世纪90年代末期GamsW.和Bissett等人对Bissett分类系统重新进行了修订，新的分类系统没有过多的更改原系统的内容，只是将其中的部分内容作出了调整。新分类系统对现有木霉菌种属的有性型资料进行了总结，为将来寻找有经济价值的各种木霉菌种资源以及鉴定新的木霉菌株类型提供了参考(杨合同，1999)。近年来，我国研究人员对各个省份的木霉菌种类也进行了调查及鉴定。孙军等(2006)从辽宁地区的173份土壤样品中分离到54个木霉菌株，分属12种。潘争艳等(2007)对辽宁地区63份药用土壤样品进行分离，得到木霉菌株75株，鉴定出9种木霉菌。李广记等(2011)从华东地区采集土壤样品发现了一株我国新纪录种拟康宁木霉T.koningiopsis。颜一红等(2011)从食用菌中分离得到91株木霉，鉴定得到7个种别。陈凯等(2017)在洞庭湖地区从采集到的土样和水样中分离到木霉菌114株，分属16个木霉种类。目前，我国己发现木霉菌有40余种，其中大多数木霉菌都具有生防潜力。7 第一章向日葵枯萎病硏究概况及木霉菌生防应用(文献综述)1.2.4生防木霉菌防治土传病害生防木霉菌在防治土传病害中有十分良好的效果，如A.Perello(2002)利用木霉菌株防治阿根廷小麦褐斑病，有良好的防治效果。S.Maurya(2008)采用哈茨木霉处理镰刀菌侵染过的鹰嘴豆，降低了鹰嘴豆15-25%的死亡率并且促进了鹰嘴豆的生长。中国的陈树华(2008)报道了哈茨木霉防治香蕉枯萎病，防效高达87%。张丽荣等(2011)利用木霉菌防治西瓜枯萎病，防效达71.4%-85.4%。涂广平(2016)使用木霉菌颗粒剂TCF-1防治玉米茎腐病，平均防效在60%以上：防治纹枯病平均防效53%以上。朱萍萍(2015)等研究表明，深绿木霉防治番茄青枯病，防效达50%-92.7%。毕卉(2016)利用木霉菌防治黄瓜枯萎病，最高防效为67.13%。常媛等(2017)发现长枝木霉TI-70对3种土传病害均有良好的防治效果。夏海波等(2017)采用哈茨木霉Tr-20防治立枯丝核菌引起的土传病害，防效达到63.50%。1.2.5生防木霉菌剂型的研究进展木霉菌是一种对于环境不产生负面影响的生防菌，在防治各类作物土传病害、提高农作物产量、以及增强对病害防御性方面表现突出(Harman，2000；燕嗣皇等，2005；吴海燕等，2006)。可湿性粉剂是我国农药网登记木霉菌剂最多的一个剂型。因为可湿性粉剂在运输和使用方面简单易行，并且适用于植株不同部位病害的防治，大部分作用于花卉植物和蔬菜，但是不适合处理栽培土壤和作物种子(陈伯清等，2008)。所以对于创造适合实际生产情况的木霉菌剂十分重要。木霉菌颗粒剂与化肥混合后可作为生物肥料施用，且对作物种子可以进行包衣处理，从而对土传病害的防治效果大大增加。对于生防木霉菌剂来说，制剂分为两种，分别是厚垣孢子制剂和分生孢子制剂。木霉菌分生孢子的产量大，并且生产周期也相对较短，而厚垣孢子的存活期长，抗逆性强，但是，分生孢子的产量远高于厚垣孢子，且发酵条件易控制，发酵周期也较短，两者各有利弊(赵永强等，2010)。木霉水剂：田连生等(2002)报道了木霉水剂防治番茄枯萎病，防效高达93.3%。李雪玲等(2003)使用木霉菌水剂防治棉花枯萎病。邓勋等(2012)利用绿色木霉T43水剂防治樟子松枯梢病，防效为81.66%。木霉水分散粒剂：李秀明等(2013)研制出哈茨木霉T4的水分散粒剂。景芳等(2016)用长枝木霉T6水分散粒剂对作物进行促生。梁荣等(2016)以”巨峰”，”8 沈阳农业大学专业硕士学位论文黄玫瑰”葡萄为试材，喷施哈茨木霉水分散粒剂，对葡萄霜霉病防效为87.80%，还能有效降低土壤盐分含量。木霉颗粒剂：王永东等(2007)利用哈茨木霉H-13发酵产物促进玉米生长。赵永强等(2010)通过木霉颗粒剂防治大豆根腐病，不仅促进了大豆生长，对根腐病的防治效果为42.79%。吴晓儒等(2015)利用木霉颗粒剂防治玉米茎腐病，最高防效达80%，玉米增产效果在8%以上。木霉可湿性粉剂：吴晓青等(2015)通过施加木霉可湿性粉剂处理冬小麦，发现对纹枯病病情缓解了36.49%、对条锈病缓解了35.14%，并且促进冬小麦的生长。孔德颖等(2016)证明在有小斑病菌的玉米叶片上喷洒木霉可湿性粉剂可以抑制病原菌对玉米叶片的侵染。1.3生防木霉菌生物防治的作用机理木霉菌在病虫害的生物防治中作用十分明显，是有潜力，易获得，易开发的生防因子。木霉菌作为由土壤真菌、叶和果实感染的植物致病真菌引起的植物病害的有效生物控制制剂被证实是有效的。木霉菌通常生长速度非常快，并能够迅速在底物中定殖，可以对30种左右的病原真菌产生拮抗作用，其中对土传病害真菌的拮抗作用最明显(杨合同等，1999)。木霉菌的作用机制有很多，包括拮抗作用、竞争作用、重寄生作用、诱导抗性等(李世贵，2010)。1.3.1拮抗作用高丽辉等(2010)研究发现木霉菌T-115D对马铃薯早疫病菌拮抗作用十分显著，拮抗机制主要是抑制病原菌的菌丝生长。蒋妮等(2011)证明了哈茨木霉和绿色木霉对山豆根根腐病拮抗作用较强，通过缠绕、寄生等方式使根腐病病原菌失效。姚艳平等(2013)发现哈茨木霉对白娟病菌、西瓜枯萎病菌具有不同程度的拮抗作用。秦云霞等(2015)测定了8种木霉菌株对橡胶树红根病病原菌的拮抗作用。孙川等(2015)发现2株木霉菌株对禾谷镰刀菌以及线虫有良好的拮抗作用。1.3.2竞争作用竞争作用是木霉菌通过生长，繁殖能力的强势来争夺病原菌的水分和养分，占据病原菌的生长空间等方式来削弱以致排除同一生长环境中的病原菌。Sivan等(1989)研究了哈茨木霉菌(T.harzianum)对镰刀菌防治中发挥最重要的是竞争作用。Knudsen等(2013)确定了木霉菌株ThzID1-M3对镰刀菌的主要作9 第一章向日葵枯萎病硏究概况及木霉菌生防应用(文献综述)用机制为竞争作用。Segarra等(2013)发现木霉菌株T34通过竞争作用来控制镰刀菌引起番茄上的病害。Andreas等(2006)证明深绿木霉的存在使得禾谷镰刀菌生长受抑制，使得禾谷镰刀菌小麦专化型的产量降低了36%。1.3.3重寄生作用重寄生作用是指木霉菌可以寄生在病原菌上。木霉菌通过识别病原菌分泌的某些物质，吸附在寄主病原菌的菌丝上，穿透寄主菌丝细胞壁，获取自身生长需要的养分(杨萍，2012)。Elad等(1983)证明了木霉细胞壁上的半乳糖与凝集素结合，产生了识别寄主病菌的信号。张建等(2015)发现NJAU4742木霉菌通过重寄生作用破坏了Foc4菌丝最重要的物质，NJAU4742对于多种植物病原真菌都有较强的重寄生作用。木霉菌重寄生作用主要是产生几丁质酶、蛋白酶等降解病原菌细胞壁的水解酶。1.3.4诱导抗性诱导抗性是指植物在木霉菌的刺激下，植物本身产生对病原菌的抗性现象，使植物自身能免受或减轻病原菌或害虫的侵害。徐同等(2003)通过哈茨木霉NF9对白叶枯病菌不同菌株诱导产生抗性，认为诱导抗病性可能是生防机制之一。刘士旺等(2003)发现绿色木霉可以表达诱导植物抗性蛋白，建立了绿色木霉转化体系，表明绿色木霉分泌的CryPt具有一定专化型。刘亚力(2006)研究了4个木霉菌株的木聚糖酶诱导抗性。郭敏等(2009)研究了拟康氏木霉菌胞壁多糖通过人工接菌等方法对黄瓜幼苗抗病性的诱导作用。1.4本论文研究的目的和意义向日葵枯萎病是由镰刀菌侵染引起的向日葵病害，病原菌破坏向日葵维管束细胞，枯萎病病株是自下而上逐次萎蔫，从而使得向日葵整株枯萎。传统防治土传病害主要以化学防治为主，主要有土壤熏蒸、苗床消毒、药剂灌根、土壤拌药等。化学防治污染生态环境，病虫草易产生耐药性甚至抗药性，引起病虫害再度爆发。现代化农业的可持续发展理念使得化学农药的大量使用不符合国情，随着习总书记提出的可持续农业观念不断深入，运用生物防治手段控制病虫草害已经越来越受到人们的重视，木霉菌防治病害的优点包括选择性强，对人畜安全，病原菌、害虫、杂草不易产生抗性，对生态环境影响较小等，是具有发展潜力的新型防治方法之一。10 沈阳农业大学专业硕士学位论文木霉菌具有生长适应性强，杀菌谱广，生长繁殖快等优点，主要用于防治植物的土传病害以及通过其他方式侵染的病害，它不仅能防治病虫草害，还能促进植物生长发育，提高农作物产品的产量和质量，提高农作物抗逆性，具有重要经济价值。因此木霉菌是一种十分理想，有着广阔应用前景的生防资源。本试验通过研究镰刀菌引起的向日葵枯萎病，利用木霉对镰刀菌具有拮抗作用的特点，筛选出对向日葵枯萎病有明显拮抗作用的木霉菌株，制成颗粒剂，对我国今后利用木霉制剂大面积防治向日葵枯萎病奠定基础。11 第二章向日葵枯萎病病原菌分离第二章向日葵枯萎病病原菌分离向日葵枯萎病是由镰刀菌侵染引起的一种向日葵土传病害，枯萎的病株自下而上逐次萎蔫，是因为病原菌破坏向日葵维管束细胞，最终使得向日葵整株枯萎。向日葵枯萎病在内蒙古向日葵产区有所发生，严重时会造成50%左右的减产。以在2016年内蒙古地区向日葵病害普査过程中采集到的向日葵病株作为研究材料，运用柯赫式法则对采集的向日葵枯萎病病原菌进行鉴定，明确内蒙古地区向日葵枯萎病的病原菌种类。这一研究结果为该病原菌的防治奠定基础。2.1试验材料2.1.1植物材料供试病株：向日葵发病根茎，采集内蒙古地区。供试植株：向日葵幼苗(美葵3188)，在育苗盘中培养2周，选取2叶期的向日葵幼苗进行试验2.1.2供试培养基PDA培养基(葡萄糖20g；琼脂18-20g；马铃薯200g；水1000mL)，用于平板培养病原菌用。玉米粉沙土培养基(沙土：玉米粉：水=1:1:0.8)，用于扩繁向日葵枯萎病菌接种物的盆栽试验。2.1.3供试土壤沈阳农业大学后山黄土以及育苗土(9：1)混合在121℃的高温高压下灭菌2h。2.1.4试验仪器电子天平，振荡器，酒精灯，微波炉，接菌针，无菌操作台，灭菌锅等。2.2试验方法2.2.1病原菌分离2016年在内蒙古地区发现发病的病株，采集发病部位。选取发病部位裁剪成1cm左右，将裁剪好的向日葵病茎先放入70%的酒精消毒30s后(消除寄主表面的气泡，减少表面张力)，接着将发病的向日葵根茎部分移入0.1%的升汞中进行表面消毒，消毒时间做3个梯度；分别为10s，30s，50s，然后放入3个装有无菌水的培养皿中洗涤，接着用无菌纸吸去发病组织表面多余的水分，最后接种12 沈阳农业大学专业硕士学位论文于PDA平板上，置于25℃恒温培养箱中培养3-5d。等到平板中长出菌丝后，挑取病原菌的菌丝接种到PDA培养基上培养3-5d。待菌落铺满整个PDA平板后用平板稀释法进行单孢分离，获得纯培养的病原菌，于PDA斜面培养基保存，放置于4℃冷藏冰箱中备用。2.2.2柯赫式法则验证将纯化好的菌株接种在PDA培养基上常规培养6d后，把病原菌通过玉米粉沙土培养基扩繁后加入供试土壤中，培养，观察向日葵发病情况。按照2.2.1的方法重新分离并鉴定病原菌，试验进行3次重复。2.2.3病原菌形态特征观察将病原菌接种在PDA平板上，28℃培养4-6d，按照《植病研究法》观察病原菌菌落的颜色变化、形态特征，分生孢子梗分枝特点，分生孢子的形状以及大小。2.2.4向日葵枯萎病镰刀菌接种方法的选择选用拌土法，灌根法，浸根法将镰刀菌接种到向日葵上，筛选出适合向日葵发病的最佳接种方式。拌土法：把分离得到的镰刀菌加入含有30g玉米粉沙土培养基的三角瓶中扩繁培养6d，每个三角瓶中加入4个镰刀菌菌饼，待镰刀菌菌丝长满培养基表面时和育苗土充分混合（比例1:19）。灌根法：培养5d的镰刀菌培养皿中加入5mL蒸馏水，用接菌针轻轻刮取PDA表面的菌丝和孢子，将上述悬浮液加入含有45mL蒸馏水的锥形瓶中，在6悬浮仪上震荡培养12h。将孢子悬浮液的浓度调整为10个/mL，把得到的孢子悬浮液50mL加入向日葵幼苗根系周围。浸根法：将向日葵幼苗根部用针刺伤后放入100mL小烧杯中，将50mL浓6度为10个/mL的病原菌孢子悬浮液加入到小烧杯中，浸泡伤根处理的向日葵幼苗30min，之后将向日葵幼苗移栽到花盆中。病害调查方法：13 第二章向日葵枯萎病病原菌分离表2-1向日葵枯萎病分级标准Table2-1GradescaleofsunflowerFusariumwilt等级病害症状GradeDiseasesymptom0级无症状1级茎基部稍微变色2级1/3到1/2左右的茎基或根部变色或腐烂3级整个植株茎基或根部完全变色、腐烂4级全苗萎蔫枯死。(各级病株级数)病情指数=×100调查总数最高级数2.3结果与分析2.3.1病害症状向日葵髓部变色或褐化，病株自下而上开始枯萎、倒伏，发病严重时整个茎秆表皮都变色直至死亡(高婧，2016)，病株茎秆横切会看到已经变色、变质的维管束。分生孢子可以在被病原菌侵染的根茎基部或者已经死亡的病茎表面发现。2.3.2柯赫氏法则证病接种病原菌的向日葵幼苗9d后开始发病，症状与内蒙古带回来的样品症状一致(图2-1)，向日葵髓部变色或褐化，自下而上逐次萎蔫，最终导致植物全株性的枯萎。空白对照的向日葵幼苗生长良好没有发病现象(图2-2)。在发病向日葵幼苗中分离出和纯培养得到的病原菌菌落一样，分生孢子梗和分生孢子形态一致的真菌，根据柯赫式法则可以认定该菌就是导致向日葵枯萎病发生的病原菌。图2-1接种处理的向日葵图2-2空白对照向日葵Fig.2-1InoculatedsunflowerFig.2-2Blankcontrolsunflower14 沈阳农业大学专业硕士学位论文2.3.3病原菌形态特征从图2-3、2-4、2-5中可以看出病原菌在PDA平板上培养，菌落突起絮状，菌丝白色，生长茂密。菌落白色，有的呈粉白色，菌落高3-5mm，小型分生孢子着生于单生瓶梗上，常在瓶梗顶端聚成球状，单胞，卵形，大小为5-12μm；大型分生孢子镰刀形，少许弯曲。孢子大小为19.6-39.4μm。图2-3镰刀菌分生孢子梗及小型分生孢子图2-4大型分生孢子Fig2-3.FusariumconidiaandsmallconidiaFig2-4Largeconidia图2-5镰刀菌菌落Fig2-5Fusariumcolonies2.3.4向日葵接种镰刀菌的方法选择由表2-1知，在其他环境条件相同的情况下，拌土法接种镰刀菌后，向日葵枯萎病发病率最高，并且拌土法相比其他两种方法简便易行，节省时间，病原菌在土壤中分散均匀。采用此方法进行后续试验。15 第二章向日葵枯萎病病原菌分离表2-13种接种病原菌方法的对比Table2-1Comparisonofthreemethodsforinoculatingpathogens栽培数发病数发病率(%)CultivationnumberIncidencenumberIncidencerate拌土法106.6766.67aSoilmixingmethod灌根法103.3333.33cIrrigationmethod浸根法104.3343.33bImmersionmethod不同英文字母表示各处理之间有显著性差异（P<0.05），下同DifferentenglishlettersindicatesignificantdifferencesbetweentreatmentsP<0.05，Sameasbelow2.4本章小结从内蒙古向日葵发病根茎上分离获得的菌株通过柯赫式法则证明了造成向日葵枯萎病的病原菌。结合病原菌菌落的特点以及分生孢子梗、分生孢子的形态特征，确定分离的病原菌为镰刀菌(Fusarium.spp)。通过3个接种病原菌方法的比较，筛选出拌土法作为盆栽向日葵幼苗接种镰刀菌的方法，为下一步试验奠定了基础。16 沈阳农业大学专业硕士学位论文第三章向日葵枯萎病拮抗木霉的分离与筛选近年来随着生物农药的良好发展态势以及广阔的应用前景，木霉菌作为一种可以防治不同类型的植物病原菌病害得到广泛的关注。分别从浙江杭州、辽宁庄河、辽宁盘锦、沈阳农业大学后山和沈阳农业大学植物园根际土壤中采集土样，分离出木霉菌株。通过与向日葵枯萎病菌对峙培养试验的初筛以及盆栽试验的复筛，得到可以促进向日葵生长发育，能够抑制向日葵枯萎病病原菌的高效木霉菌株进行鉴定。本试验为木霉菌之后的工业化生产应用提供了科学依据。3.1试验材料3.1.1供试土样分别在浙江杭州、辽宁庄河、辽宁盘锦、沈阳农业大学天柱山和沈阳植物园地区的土壤中采集土样，根据采样地点对土壤进行编号。3.1.2供试菌株镰刀菌(Fusarium.spp)，从致病的向日葵根茎中分离纯化得到。3.1.3供试培养基PDA培养基(马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂18g；水1000mL)，用于平板培养病原菌以及木霉菌分离。玉米粉稻壳麦麸培养基(玉米粉：稻壳：麦麸=2.5:1.5:6，水分适量)，用于复筛的盆栽试验中扩繁木霉菌接种物。玉米粉沙土培养基(玉米粉：沙土：水=1:1:0.8)，用于复筛试验中扩繁向日葵枯萎病菌接种物。3.1.4试验仪器无菌操作台，电子天平，超声波振荡仪，微波炉，酒精灯，锥形瓶，接菌针，灭菌锅等。3.2试验方法3.2.1拮抗向日葵枯萎病镰刀菌木霉菌株的分离3.2.1.1土样采集使用铁铲将地面表层土壤除去，采取深度约10cm左右的土壤，将采集到的土壤充分混合均匀，装入试验袋中带回实验室保存于5℃冰箱备用。17 第三章向日葵枯萎病拮抗木霉的分离与筛选3.2.1.2土壤中生防木霉菌的分离采用平板稀释法在PDA培养基中进行分离。称取1g土壤加入含有9mL无菌水的试管中，在超声波振荡仪上振荡土壤稀释悬浮液60s，然后在装有9mL无-3-4-5菌水的试管中加入100μL悬浮液进行稀释，悬浮液最终稀释至10、10、10。从不同稀释液中吸取300μL悬浮液至PDA平板中央,将各个浓度的悬浮液均匀涂抹在培养基表面，做好标记，重复3次，将平板倒置培养在28℃人工气候箱中3-5d。3.2.2拮抗向日葵枯萎病镰刀菌的木霉菌株的筛选3.2.2.1初筛采用与向日葵枯萎病菌的对峙培养试验选择高效拮抗木霉菌，将木霉菌和镰刀菌接种在培养皿中的同一直线上，两种菌饼相距4cm-5cm，放入28℃恒温培养箱中培养，每次进行3个重复试验。分别在每天固定时间观察两种真菌的菌落状况及相互作用情况，记下镰刀菌和木霉菌菌落长满培养皿的时间(曹玉桃，2007)。对照试验为仅接种镰刀菌的PDA平板，培养7d后测量对峙培养和对照试验的镰刀菌菌落直径。计算抑菌率，初筛出对镰刀菌抑菌率高的木霉菌株。(对照组病菌菌落直径－处理组病菌菌落直径)100抑菌率(%)=对照组病菌菌落直径3.2.2.2复筛通过盆栽试验对初筛中抑菌率高的木霉菌株进行复筛选出高效拮抗菌株。在玉米粉稻壳麦麸培养基中接种4个木霉菌菌饼，扩繁初筛得到的木霉菌株。28℃培养箱中培养7d后，木霉菌分生孢子通过50目过筛后得到。在玉米粉沙土培养基中接种向日葵枯萎病病菌菌饼，每瓶5个，28℃温室培养箱培养10d，菌丝长满培养基表面时取出来待用。依照谷祖敏等(2015)盆栽试验方法进行木霉菌复筛试验。对照试验为育苗土中只加入向日葵枯萎病病菌，处理试验将育苗土和通过扩繁得到的不同木霉菌株按照m:m=9:1进行混合，接着加入向日葵枯萎病病菌，最后种植已生长2个星期大小相近的向日葵幼苗，14d后调查向日葵幼苗的发病状况，每个处理进行3次重复。(各级病株级数)病情指数=×100调查总数最高级数18 沈阳农业大学专业硕士学位论文对照组的发病株数处理组的发病株数防治效果(%)=(）×100对照组的发病株数将向日葵幼苗轻轻的从土中拔出避免断根，清洗干净、用无菌纸吸取向日葵幼苗表面多余的水分，用剪刀沿茎基部剪开，分别对地上茎叶部分和地下根系部分进行称重。处理组的茎叶重量对照组的茎叶重量地上部分鲜重促进率(%)=（）×100对照组的茎叶重量处理组的根系重量对照组的根系重量地下部分重量促进率(%)=()×100对照组的根系重量对试验得到的数据结果采用SPSS-20软件进行显著性分析(P<0.05)。3.2.3高效拮抗向日葵枯萎病镰刀菌的木霉菌的鉴定纯培养通过初筛以及复筛得到的高效拮抗木霉菌株，按照3.2.1的方法培养5d，观察菌落颜色、形状等特征，在10×40倍光学显微镜下观察木霉菌分生孢子梗分枝，孢子形态特征以及大小，利用Moticam3000显微成像系统拍照，参考Rifai(1969)，段玉玺(2006)的木霉菌种群分类系统进行木霉菌种类鉴定。3.3结果与分析3.3.1木霉菌株的分离在各地区采集土样共160份，分离到的木霉菌株有59株(如表3-1)。浙江杭州地区采集30份土壤样品，分离到10株木霉菌。辽宁庄河地区采集25份土壤样品，分离到11株木霉菌；辽宁盘锦采集25份土样，共获得10株木霉菌；沈阳植物园采集的40份土壤样品中分离到15株木霉菌；沈阳农业大学天柱山采集40份土壤样品，获得13株木霉菌。19 第三章向日葵枯萎病拮抗木霉的分离与筛选表3-1土壤采集及生防木霉菌的分离Table3-1SoilcollectionandseparationofbiocontrolTrichoderma采集地点土样(份)木霉菌株CollectionpointSoil(copy)Trichoderma杭州3010Hangzhou庄河2511ZhuangHe盘锦2510PanJin沈阳植物园4015ShenYangplantpark沈阳农业大学天柱山4013TianzhuMountainofSYAU总计16059Total3.3.2向日葵枯萎病菌拮抗木霉初筛结果分离到的59个木霉菌株，通过和向日葵枯萎病菌的对峙培养发现抑菌率在50%以上有19株(如表3-2)，培养3d后可以明显看出木霉菌的菌丝限制了菌丝生长发育，当两种真菌的菌丝接触之后向日葵枯萎病菌停止生长，木霉菌逐渐包围甚至覆盖了向日葵枯萎病菌(图3-1)。从初筛中选出抑制率在70%以上的木霉菌株共有6株，分别是ZW-1，HS-4，HZ-4，ZW-6，ZH-1，ZH-8。其中抑菌率相对较高的为HZ-4，HS-4，ZW-1，但是三者之间的抑菌率没有显著性差异，HS-4的抑菌率为81.46%；其次是ZW-1的抑菌率为78.12%，ZH-1的抑菌率为76.13%；HZ-4，ZW-6，ZH-8的抑菌率都在75%以下，分别是70.82%，71.12%，73.56%。20 沈阳农业大学专业硕士学位论文表3-2部分木霉菌株对向日葵枯萎病菌的抑制作用Table3-2TheinhibitoryeffectofsomeTrichodermaagainstF.oxysporum菌株编号镰刀菌菌落直径(cm)抑菌率(%)StrainnumberFusariumcolonydiameter(cm)Inhibitionrate(%)HS-21.5453.19dHS-40.6181.46aHS-111.4356.53dHS-131.1864.13cZW-10.7078.12aZW-41.2163.22cZW-60.9571.12bZW-91.2661.7cZW-101.0767.48bcPJ-31.2960.79cPJ-51.4256.84dPJ-71.2462.31cPJ-91.4057.45dHZ-41.0170.82bHZ-61.1764.44cHZ-71.4555.93dZH-10.7976.13aZH-80.9173.56bZH-91.4954.71dCK3.29图3-1木霉菌株与枯萎病菌的对峙培养Fig3-1ConfrontationcultivateofTrichodermaandFusariumwilt21 第三章向日葵枯萎病拮抗木霉的分离与筛选3.3.3向日葵枯萎病菌拮抗木霉复筛结果通过盆栽试验复筛可以发现木霉菌对向日葵枯萎病有显著的防效，且对向日葵植株生长和根系发育均有很好的促进作用（如表3-3）。HS-4防病效果远高于其他5株木霉，防效为66.04%。其他木霉的防病效果分别是ZW-6为60.57%，ZW-1为57.35%，HZ-4为50.53%，ZH-1为39.65%，ZH-8为62.32%。对植株生长促进作用最强的是HS-4和ZW-6，地上茎叶重量分别增加了34.25%和25.97%，地下根系重量分别增加了32.07%和38.52%。选取防病效果最好并且促进向日葵生长也十分显著的HS-4木霉菌株作为制备木霉颗粒剂的原材料。表3-3不同木霉菌株防治向日葵枯萎病和促进向日葵生长的影响Table3-3EffectsofdifferentTrichodermastrainsonthecontrolofsunflowerFusariumwiltandpromotionofsunflowergrowth菌株病情指数防效(%)地上茎叶鲜重/g促进率(%)地下根系重量/g促进率(%)TestDiseaseindexControlFreshweightofTherateoftheweightofTherateofstraineffectovergroundpartpromoteundergroundpartpromoteZW-67.36±0.2660.57bc4.023±0.03325.97b1.583±0.00838.52aHS-46.64±0.2166.04a4.286±0.01834.25a1.510±0.01632.07bZW-18.11±0.3457.35c3.842±0.00420.34b1.471±0.00928.67bHZ-49.43±0.2350.53d3.391±0.0086.21c1.252±0.0079.54dZH-111.38±0.4139.65e3.618±0.05313.27c1.279±0.00812.16dZH-87.13±0.1962.32b3.471±0.0438.71c1.369±0.01419.8cCK18.85±0.313.192±0.0061.143±0.0063.3.4向日葵枯萎病菌高效拮抗木霉菌株的鉴定HS-4菌株：菌落生长迅速，呈不定型棉絮状或致密丛束状，初期为白色，后期产生分生孢子呈深绿色，在PDA平板上明显看出同心轮纹状，菌落背面无色。细胞壁光滑，菌丝有隔分枝，分生孢子梗是菌丝的短侧枝，对衬或互生成2-3级分枝。分枝角度为锐角或近似直角，末端是瓶型小梗。分生孢子多为卵圆形或球形。鉴定结果为绿色木霉(Trichodermaviride)。22 沈阳农业大学专业硕士学位论文图3.2绿色木霉分生孢子梗、分生孢子和菌落形态Fig3-2Spores,sporesandcolonymorphologyoftheTrichodermaviride3.4本章小结从160份不同地区的土壤样品中分离得到59株木霉菌，通过初筛试验得到与向日葵枯萎病菌拮抗效果50%以上的木霉菌19株，拮抗效果70%以上的高效木霉菌株共6株，分别是ZW-6、HS-4、ZW-1、HZ-4、ZH-1、ZH-8。接下来通过与向日葵枯萎病菌的盆栽试验进行复筛，发现初筛得到的6株高效木霉菌均能对向日葵枯萎病的产生良好的防效，其中HS-4防病效果最佳，防效为66.04%，并且对向日葵幼苗以及地下部分的生长均有一定促进作用。本试验分离得到的1株高效拮抗木霉菌株，通过观察木霉菌菌落颜色变化、形态特征以及分生孢子梗的分枝特点，孢子形态大小等特征鉴定该木霉菌株为绿色木霉(Trichdermaviride)23 第四章绿色木霉HS-4固体发酵条件的研究第四章绿色木霉HS-4固体发酵工艺的研究国内外大量研究了绿色木霉菌发酵工艺，得出营养条件的好坏对绿色木霉菌生长没有太大影响，而且纤维素、几丁质等均可作为碳源被其利用(刘时轮，2008)。本试验研究各种价格低廉的粮食副产品作为培养基原料(王英姿，2007)，筛选出绿色木霉HS-4的最佳固体培养基配方，并探索培养条件对绿色木霉HS-4生长和产孢的影响，为绿色木霉HS-4今后的大规模生产应用提供参考。4.1试验材料4.1.1供试菌株绿色木霉菌株HS-4由3.3.3得到。4.1.2发酵基质麦麸，稻壳，玉米粉(3种发酵基质均采购于安徽淮南的卉茂肥业)。4.2试验方法4.2.1木霉菌液体发酵参照王英姿等(2008)，将绿色木霉菌株HS-4经PDA培养基培养4d后，以75%接种量(含分生孢子1×10个/mL)接种到250mL三角瓶内，每瓶中装100mL葡萄糖、酵母培养液，3次重复。在28℃、110r/min摇床黑暗条件下培养48h，当产孢量达到稳定的时候取出，用血球计数板测定孢子量，作为2级菌种培养液来接种木霉菌株HS-4固体发酵培养基。4.2.2绿色木霉HS-4固体发酵培养基的筛选4.2.2.1固体发酵培养基种类的筛选麦麸、玉米粉、稻壳3种物质分别作为单一物质培养基的组分；玉米粉+麦麸、玉米粉+稻壳、麦麸+稻壳、玉米粉+麦麸+稻壳的组合作为4种混合物质培养基。混合物质培养基中不同成分等比例均匀混合，每种处理进行3次重复。4.2.2.2绿色木霉HS-4固体发酵培养基的正交设计通过试验4.2.2.1，确定了麦麸、玉米粉、稻壳作为组合固体发酵培养基组分。以麦麸、玉米粉、稻壳3种农作物副产品作为组分因子，每个因子分别设3个不同质量的水平比例，以绿色木霉菌株HS-4在每种发酵培养基的产孢量为标准，采用正交设计配制成的9种配方进行固体培养基优化组合筛选(表4-1)。木霉菌24 沈阳农业大学专业硕士学位论文株HS-4在发酵培养完成之后，用0.1%的吐温80溶液洗脱分生孢子并计算各个配方的产孢量。表4-1正交组合试验设计Table4-1.Orthogonalcombinationtestdesign配方序号玉米粉稻壳麦麸RecipenumberCornflourRicehuskWheatbran1111223133134322533162237212812291334.2.3绿色木霉HS-4固体发酵条件的选择4.2.3.1绿色木霉HS-4固体发酵瓶装量的选择分别向250mL的三角瓶中添加10，15，20，25，30g优化培养基，培养7d，共5个处理，每种处理设3次重复，筛选出最适瓶装量。4.2.3.2绿色木霉HS-4固体发酵温度的选择设置20，25，28，30，32℃及一个变温处理(1-3d温度设置为28℃，4-5d的时候将温度降到20℃，第6d将温度升到25℃直到第7d培养完成)等6个处理，培养7d，每种处理进行3次重复，筛选出最适温度。4.2.3.3绿色木霉HS-4固体发酵接菌量的选择分别向20g优化培养基中加入2级木霉菌菌种培养液1，2，3，4，5，6，7mL，培养7d，一共7个处理，每种处理进行3次重复，筛选出最适接菌量。4.2.3.4绿色木霉HS-4固体发酵pH的选择设置pH=5，6，7，8，9等5个处理，培养7d，每种处理进行3次重复，筛选出最适pH。25 第四章绿色木霉HS-4固体发酵条件的研究4.2.3.5绿色木霉HS-4固体发酵加水量的选择分别向20g优化培养基中加入1，2，3，4，5，6，7，8mL的无菌水，共8次处理，培养7d，每种处理进行3次重复，筛选出最适合的加水量。4.2.4数据处理试验结果统计后，使用Excel软件和SPSS-20软件进行数据统计以及显著性差异分析(P<0.05)。4.3结果与分析4.3.1绿色木霉HS-4固体发酵培养基的筛选从图4-1的3种单一物质培养基的固体发酵结果中可以看出绿色木霉菌株8HS-4产孢量最高的是玉米粉培养基，为7.13×10个/g。其次是麦麸和稻壳，产88孢量差异不显著分别是5.48×10个/g，5.1×10个/g。图4-1单一固体发酵培养基Fig.4-1Singlesolidfermentationmedium从图4-2中发现绿色木霉HS-4在4种混合培养基中产孢量不同，以玉米粉+9麦麸+稻壳作为培养基的绿色木霉HS-4产孢量最高，为1.62×10个/g。其次是9麦麸+玉米粉1.12×10个/g，麦麸+稻壳和玉米粉+稻壳的绿色木霉HS-4产孢量88差异不显著分别是9.17×10个/g和8.29×10个/g。26 沈阳农业大学专业硕士学位论文图4-2不同固体发酵培养基Fig.4-2Differentsolidmediafermentationmedium4.3.2绿色木霉HS-4固体发酵的正交组合筛选根据4.3.1的试验结果，选取玉米粉+麦麸+稻壳作为固体发酵培养基的基本组分进行进一步的组合正交试验。对9种配方进行发酵培养，通过图4-3发现59号配方的产孢数最多，达到3.726×10个/g，之后是9号配方，菌株分生孢子的9产量为3.47×10个/g。产孢量的提高比前面混合固体培养基效果明显。除了1号配方孢子产量和混合固体发酵培养基差别不大之外，其他8种配方的孢子产量均有不同程度的提高。4aab3.5bbc39个/g2.5de2efSporeyield1.5f孢子量1×1010.50123456789图4-3固体发酵培养基正交组合筛选Fig.4-3Orthogonalcombinationscreeningofsolidfermentationmedia筛选出5号培养基为最优固体发酵培养基，即玉米粉：稻壳：麦麸=3:3:1(质量比).选取此培养基进行固体发酵条件的确定。4.3.3绿色木霉HS-4固体发酵条件的确定绿色木霉HS-4是一种对氧气含量要求较高的木霉菌株，发酵过程中三角瓶27 第四章绿色木霉HS-4固体发酵条件的研究中氧气的多少直接影响到绿色木霉HS-4产孢量，从图4-4可以看出，固体培养基在250mL三角瓶中含量为20g的时候绿色木霉HS-4产孢量最大。4ab9个/g3ccc21Sporeyield孢子量1×1001015202530瓶装量/gVolumesofmediumadded图4-4瓶装量对孢子量的影响Fig.4-4Effectofbottleamountonsporequantity从图4-5中可以看出，5个恒温处理28℃时产生的孢子量是最大的。与恒温发酵相比，在不同培养时期改变温度可以使得木霉在其他条件相同的情况下产生更多的孢子。这是因为木霉菌株发酵前期为适应期，温度保持一个相对较高的水平有利于孢子萌发，使得木霉菌株对生长环境的适应期缩短；而菌体生长期的时候生长旺盛，能够释放出大量生物热，使得培养基中的温度明显升高，此时适当降低培养环境的温度，促进热量的散失有利于孢子的大量产生；发酵后期大量孢子成熟的同时培养基质中的有效营养成分被消耗殆尽，木霉菌生长速度开始减缓甚至停止生长，此时升高培养温度，能够缩短发酵周期。图4-5不同温度对孢子量的影响Fig.4-5Effectsofdifferenttemperaturesonspores接种量和木霉菌生长有很大的联系，接种量少的话，发酵周期会加长，同时28 沈阳农业大学专业硕士学位论文也会加大其他病菌的感染几率，并且孢子量也会十分低。接种量过多可能会使得每个木霉菌孢子分得的营养较少，不利于孢子萌发。通过图4-6可以看出在其他条件相同下，固体培养基中加入5mL2级木霉菌菌种培养液产孢量最高。图4-6接菌量对孢子量的影响Fig.4-6Influenceofbacteriaonsporequantity从图4-7发现绿色木霉在偏酸性的条件下孢子量明显多于在碱性条件下的孢子量，在pH=6的时候绿色木霉有最大的产孢量，之后随着pH增加，绿色木霉的产孢量会逐渐减少。由此可知，绿色木霉在酸性条件下生长的更好，碱性条件反而会抑制木霉菌的生长。4a3.5b3c个/g92.5d2e1.5Sporeyield1孢子量1×100.5056789pH图4-7pH对孢子量的影响Fig.4-7EffectofpHonsporulationquantity固体培养基发酵的过程中加水量是影响三角瓶中氧气含量的直接因素之一，加水量也会影响绿色木霉菌菌丝的生长状态以及孢子的萌发，从而影响木霉菌的产孢量多少。从图4-8中可以看出在固体培养基中加入6mL水时，木霉菌有相对较高的孢子产量。加水量过多时，会使绿色木霉分生孢子的供氧量不足，从而导致绿色木霉产孢量反而开始下滑。29 第四章绿色木霉HS-4固体发酵条件的研究图4-8加水量对孢子量的影响Fig.4-8Effectofwateradditiononsporequantity4.4本章小结麦麸是农作物加工的副产物，含有大量纤维素、维生素以及丰富的膳食纤维。王立克等(2002)研究发现发酵后麦麸中的粗蛋白、乙醚浸提物等含量的提高水平均超过50%，这些物质可为绿色木霉HS-4生长发育提供充足养分。稻壳也是农作物加工的副产物，它的加入可以使培养基中有更多的空隙，为木霉菌HS-4生长提供了充足的空间。玉米粉本身并不适合绿色木霉HS-4生长发育，但可以提高其产孢量。筛选出玉米粉：稻壳：麦麸=3:3:1(质量比)为最优固体发酵培养基，9产孢量为3.726×10个/g。本试验同时研究了固体发酵条件对绿色木霉HS-4产孢量的影响，初步得到了绿色木霉HS-4最佳的固体发酵条件是在容量为250mL的三角瓶中加入20g3种组分混合固体培养基，接种量为5mL，pH=6，加水量为6mL，变温发酵7d。30 沈阳农业大学专业硕士学位论文第五章绿色木霉HS-4颗粒剂的制备目前我国木霉菌制剂多为可湿性粉剂和粉剂，大部分作用于花卉植物和蔬菜，而对于土传病害并没有良好的防治效果。所以创制适合土传病害的木霉菌生防制剂具有重要意义(陈伯清等，2008)。活菌制剂是现在木霉菌剂应用生产中使用最多的，应用时受到各种因素的干扰，使得木霉菌在田间自然条件下生存能力较差，对防治对象作用不显著。所以，需要研究更适宜生产实际的木霉菌制剂(茹水江，2008)。本试验通过助剂与高效木霉HS-4菌株相容性测试，明确了HS-4颗粒剂配方，为今后绿色木霉HS-4颗粒剂大范围防治土传病害奠定了基础。5.1试验材料5.1.1供试菌株绿色木霉HS-4由3.3.3得到。5.1.2试剂碳酸钙，磷酸钾，磷酸氢二钾，阿拉伯胶，明胶，可溶性淀粉，石英砂，高岭土，硅藻土，硫酸钠，硫酸铵等。5.1.3仪器无菌操作台，恒温培养箱，旋转造粒机，磁力搅拌机等。5.1.4试验土壤沈阳农业大学后山黄土和育苗土(9：1)混合，混合后的土壤经高温高压灭菌，121℃，30min5.2试验方法5.2.1绿色木霉HS-4孢子粉制备参照第四章，将5mL二级菌种培养液接种于加入20g优化混合固体培养基的250mL三角瓶中，pH=6，加水量6mL，变温发酵7d进行绿色木霉HS-4的大量繁殖，得到绿色木霉HS-4孢子粉。5.2.2绿色木霉HS-4助剂筛选绿色木霉HS-4稳定剂的筛选：用电子天平称取0.5g绿色木霉HS-4的孢子粉，在3个100mL的PDA培养基中分别添加磷酸氢二钾、碳酸钙、磷酸钾各1g，搅拌均匀，将绿色木霉HS-4的孢子粉接种在混合之后的PDA上，放置于31 第五章绿色木霉HS-4颗粒剂的制备28℃培养箱中培养7d。之后测定绿色木霉HS-4的产孢量。对照试验不加任何物质，每次处理重复3次。绿色木霉HS-4黏结剂的筛选：用电子天平称取0.5g绿色木霉HS-4的孢子粉，在3个100mL的PDA培养基中分别加入阿拉伯胶、明胶、可溶性淀粉各0.5g，搅拌均匀，将绿色木霉HS-4的孢子粉接种在混合之后的PDA上，放置于28℃培养箱中培养7d。之后测定绿色木霉HS-4的产孢量。对照试验不加任何物质，每次处理重复3次。绿色木霉HS-4载体的筛选：用电子天平称取0.5g绿色木霉HS-4的孢子粉，在3个100mL的PDA培养基中分别加入硅藻土、高岭土、石英砂各0.5g，搅拌均匀，将绿色木霉HS-4的孢子粉接种在混合之后的PDA上，放置于28℃培养箱中培养7d。之后测定绿色木霉HS-4的产孢量。对照试验不加任何物质，每次处理重复3次。绿色木霉HS-4崩解剂的筛选：用电子天平称取0.5g绿色木霉HS-4的孢子粉，在3个100mL的PDA培养基中分别加入硫酸铵、硫酸钠、可溶性淀粉各0.5g，搅拌均匀，将绿色木霉HS-4的孢子粉接种在混合之后的PDA上，放置于28℃培养箱中培养7d。之后测定绿色木霉HS-4的产孢量。对照试验不加任何物质，每次处理重复3次。5.2.3绿色HS-4木霉HS-4颗粒剂制造过程在绿色木霉HS-4孢子粉中按照筛选好的比例添加各种助剂，与蒸馏水混合均匀后加入旋转式造粒机中，挤压造粒。然后在自然条件下风干，成品即木霉菌颗粒剂。5.2.4绿色木霉HS-4颗粒剂贮藏稳定性测定分别取50g木霉HS-4颗粒剂在冷藏(4℃)和室温(25℃)条件下贮藏，测定时长为6个月，每个月对样品中绿色木霉HS-4孢子存活率进行测定，最终评估木霉HS-4颗粒剂贮藏稳定性。孢子存活率检测参照赵永强等(2008)：采用亚甲蓝染色法，用电子天平称取木霉HS-4颗粒剂样品1.0g，加入装有89mL无菌水的三角瓶中，摇晃几次后超声波震荡仪20min，接着向三角瓶中加入10mL的0.1%亚甲蓝溶液使木霉HS-4颗粒剂样品正好稀释100倍，继续震荡60s，吸取悬浮液滴在血球计数板上，在32 沈阳农业大学专业硕士学位论文10×40的光学显微镜下查找并记录活孢子数，存活孢子基本不着色，着色深的孢子已死亡，孢子存活率是木霉HS-4活孢子数与所有孢子数的比值。试验重复3次。5.2.5绿色木霉HS-4颗粒剂对向日葵促生作用试验采用盆栽处理，共设5个处理；分别是100g土壤中含有1g，2g，4g，8g木霉颗粒剂以及对照试验。将配比后的土样装入花盆中。将催芽后的向日葵种子播种在花盆中每盆6粒，每种处理5盆。14d后将向日葵从土中拔出洗干净、晾干，用剪刀沿茎基部剪开，分别称取地上部分鲜重重量和地下部分重量。5.2.6不同镰刀菌浓度下绿色木霉HS-4颗粒剂的防治效果将向日葵分别种植在枯萎菌浓度为2%，5%，8%的100g土壤中，对照分别为不加木霉颗粒剂单独含有各个浓度镰刀菌的土壤。每个处理3次重复。每个花盆中种植6粒种子，每个处理5个花盆。14d后测定向日葵枯萎病的发病状况，计算生防效果。5.2.7不同湿度下绿色木霉HS-4颗粒剂的防治效果分别把土壤湿度设置为35-40%，55-60%，70-75%3个梯度，每个土壤水分3次重复。每个花盆中种植6粒种子，每次处理5盆，每盆中加入混有木霉颗粒剂的含有镰刀菌的土壤100g。对照试验为各个土壤湿度的花盆土中不加入木霉颗粒剂。14d后测定向日葵枯萎病的发病状况，计算生防效果。5.2.8不同温度下绿色木霉HS-4颗粒剂的防治效果设置15℃，20℃，25℃，30℃，4个温度梯度，每个温度3次重复。每个花盆中种植6粒种子，每次处理5盆，每盆中加入混有木霉颗粒剂的含有镰刀菌的土壤100g。对照试验为各个温度下的花盆土中不加入木霉颗粒剂。14d后测定向日葵枯萎病的发病状况，计算生防效果。5.2.9数据处理试验结果统计后，使用Excel软件和SPSS软件进行数据统计以及差异显著性分析和多重比较。5.3结果与分析5.3.1绿色木霉HS-4孢子粉助剂筛选33 第五章绿色木霉HS-4颗粒剂的制备5.3.1.1稳定剂的筛选根据表5-1可知，在绿色木霉HS-4孢子粉中加入3种稳定剂后，加入碳酸钙和磷酸钾的绿色木霉HS-4孢子量有所提高，其中碳酸钙的孢子量最高为881.78×10个/g，磷酸氢二钾的孢子量最少为0.84×10个/g，说明磷酸氢二钾对了绿色木霉HS-4产孢具有抑制的效果。碳酸钙本身热稳定性相对较好，化学惰性与磷酸钾相比较强，并且也不抑制绿色木霉HS-4孢子的生长，所以选用碳酸钙作为稳定剂。表5-1稳定剂对孢子量的影响Table5-1EffectofStabilizingagentsonsporulationquantity8稳定剂孢子量(10个/g)StabilizingagentsSporeyield碳酸钙1.78±0.13a磷酸氢二钾0.84±0.11c磷酸钾1.22±0.08bCK1.07±0.09b5.3.1.2粘结剂的筛选根据表5-2发现，三种粘结剂对于绿色木霉HS-4孢子的孢子产量均有所提88高，其中明胶的孢子量最大，为1.69×10个/g；其次是可溶性淀粉1.31×10个/g；8阿拉伯胶对于木霉孢子的产量促进的最少为1.17×10个/g。经过比较选取明胶作为粘结剂。表5-2粘结剂对孢子量的影响Table5-2EffectofBindersonsporulationquantity8黏结剂孢子量(10个/g)BindersSporeyield阿拉伯胶1.17±0.06bc明胶1.69±0.17a可溶性淀粉1.31±0.12bCK1.04±0.09c5.3.1.3载体的筛选在测定的3种载体中，除了石英砂对绿色木霉HS-4的孢子量起抑制作用外，高岭土和硅藻土对绿色木霉HS-4的孢子量均有促进作用。硅藻土的孢子量为881.45×10个/g；高岭土的孢子量为1.59×10个/g。可以看出硅藻土和高岭土的促34 沈阳农业大学专业硕士学位论文进作用差异不显著，并且硅藻土的获得方式更加简便，化学性质稳定，在土壤中能够起到疏松土质、延长药效和肥料作用时间的特点，所以选择硅藻土作为载体。(表5-3)表5-3载体对孢子量的影响Table5-3EffectofCarriersonsporulationquantity8载体孢子量(10个/g)CarriersSporeyield石英砂0.80±0.09c高岭土1.59±0.11a硅藻土1.45±0.14aCK1.05±0.07b5.3.1.4崩解剂的筛选根据表5-4发现，硫酸钠的促进作用最强，加入硫酸钠后的绿色木霉HS-488孢子量为1.95×10个/g；其次是硫酸铵1.56×10个/g；可溶性淀粉基本没有促进8作用，孢子量为1.10×10个/g。经过对比，选择硫酸钠作为木霉HS-4颗粒剂的崩解剂。表5-4崩解剂对孢子量的影响Table5-4Theeffectofdisintegrantsonspores8崩解剂孢子量(10个/g)DisintegrantsSporeyield可溶性淀粉1.10±0.05c硫酸钠1.95±0.12a硫酸铵1.56±0.10bCK1.07±0.07c5.3.2绿色木霉HS-4颗粒剂的生产工艺经过不同助剂与木霉HS-4菌株相容性测试，确定了木霉HS-4颗粒剂配方，以碳酸钙为稳定剂、明胶为粘结剂、硅藻土为载体、硫酸钠为崩解剂。将碳酸钙1g，明胶1g，硅藻土5g，硫酸钠3g，与适量木霉HS-4孢子粉均匀混合后加入5mL水，经过旋转式造粒机挤压造粒后，自然风干后得到图5-1所示的木霉HS-4颗粒剂。35 第五章绿色木霉HS-4颗粒剂的制备图5-1木霉颗粒剂成品Fig.5-1Trichodermagranulesfinalproduct5.3.3绿色木霉HS-4颗粒剂贮藏稳定性测定通过研究木霉HS-4颗粒剂贮藏稳定性从图5-2中可以看出：在冷藏条件的贮藏制剂孢子存活率显著高于室温下贮藏的制剂。贮藏6个月的时间内，在4℃的冷藏条件下，孢子存活率为63.47%，而在室温25℃保存条件下，木霉HS-4活孢率为46.19%，可以得出低温有利于菌株的保存，使木霉HS-4颗粒剂可以更好的用于生产中。100806025℃404℃萌发率(%)200Sporegerminationrate(%)123456储藏时间(月)Storagetime(month)图5-2不同贮藏温度对木霉颗粒剂孢子萌发率的影响Fig5-2.SporegerminationrateofTrichodermagranulesatdifferenttemperatures5.3.4绿色木霉HS-4颗粒剂对向日葵促生作用根据表5-5可以看出，木霉HS-4颗粒剂在土壤中的施入对向日葵幼苗的生长具有明显的促进作用，并且不同的药土比也会使得促进作用存在差距，其中药土比为1：12.5的时候促进效果明显。与对照相比，地上部分的促进率为27.13%，地下部分的促进率为29.09%。盆栽试验表现为木霉HS-4颗粒剂处理的作物增长效果明显，而且根系发达不易折断，叶片饱满厚重。36 沈阳农业大学专业硕士学位论文表5-5不同浓度的木霉颗粒剂对向日葵的促生作用Table5-5TheeffectofdifferentconcentrationsofTrichodermagranulesonthegrowthofsunflower药土比/g地上茎叶鲜重/g促进率(%)地下根系重量/g促进率(%)DrugtosoilratioFreshweightofTherateofpromoteFreshweightofTherateofpromoteovergroundpartundergroundpart1:1003.50±0.0310.41c1.28±0.0116.36c1:503.63±0.0514.51b1.30±0.0218.18bc1:253.88±0.0522.40a1.33±0.0320.91ab1:12.54.03±0.1027.13a1.42±0.0129.09aCK3.17±0.021.10±0.055.3.5不同镰刀菌浓度下绿色木霉HS-4颗粒剂的防治效果根据表5-6可知，土壤中向日葵枯萎病菌的数量对木霉菌株的防治效果影响明显，从防治效果中可以看出，随着土壤中枯萎病菌数量不断增加，木霉HS-4颗粒剂的防效逐步减弱。当土壤中枯萎病菌含量为2%时，木霉HS-4颗粒剂防效最好，达53.36%。表5-6土壤中镰刀菌浓度对木霉颗粒剂防治效果的影响Table5-6TheeffectofdifferentconcentrationofF.oxysporumonTrichoderma’scontrolefficiencyofsunflowerwilt.枯萎病菌浓度(%)处理病情指数防效(%)ConcentrationofTreatDiseaseindexControlefficiencyF.oxysporun2%木霉颗粒剂23.9253.36aCK51.295%木霉颗粒剂30.1048.65bCK58.628%木霉颗粒剂34.6745.12cCK63.175.3.6不同湿度下绿色木霉HS-4颗粒剂的防治效果由表5-7土壤湿度对木霉HS-4颗粒剂防治向日葵枯萎病的盆栽试验可知，从防病作用方面来看，在土壤湿度为55-60%时，木霉HS-4颗粒剂的防效最高为56.36%。但是从总体来看，土壤湿度对木霉HS-4颗粒剂防治向日葵枯萎病并没有显著性差异。在土壤湿度35-40%和70-75%的时候，木霉HS-4颗粒剂防效分37 第五章绿色木霉HS-4颗粒剂的制备别是52.81%，53.67%。表5-7土壤湿度对木霉颗粒剂防治向日葵枯萎病的影响Table5-7TheeffectofsoilhumiditiesonTrichoderma’scontrolefficiencyofsunflowerwilt.土壤湿度(%)处理病情指数防效(%)SoilhumiditiesTreatDiseaseindexControlefficiency35-40木霉颗粒剂27.9252.81aCK59.1755-60木霉颗粒剂26.0256.36aCK59.6370-75木霉颗粒剂27.0853.67aCK58.455.3.7不同温度下绿色木霉HS-4颗粒剂的防治效果由表5-8得知，木霉HS-4颗粒剂对向日葵枯萎病的控制作用受温度的影响很大。随着温度的升高(15-25℃)，向日葵枯萎病发病率增加，木霉HS-4颗粒剂的防病作用也随着温度的升高而提升。在25℃时，木霉HS-4颗粒剂对向日葵枯萎病的防效达到了56.78%，显著高于其他温度下的防治效果。当温度继续上升到30℃时，向日葵枯萎病的发病率和木霉HS-4颗粒剂防治向日葵枯萎病的防效都有所下降。表5-8温度对木霉颗粒剂防治向日葵枯萎病的影响Table5-8TheeffectoftemperatureonTrichoderma’scontrolefficiencyofsunflowerwilt.温度(%)处理病情指数防效(%)TemperatureTreatDiseaseindexControlefficiency15木霉颗粒剂28.1029.25cCK39.7220木霉颗粒剂26.2942.67bCK45.8625木霉颗粒剂23.7356.78aCK54.9130木霉颗粒剂28.5540.82bCK48.245.4本章小结通过助剂与木霉HS-4菌株相容性测试，明确了木霉HS-4颗粒剂配方，以38 沈阳农业大学专业硕士学位论文碳酸钙为稳定剂、明胶为粘结剂、硅藻土为载体、硫酸钠为崩解剂。将碳酸钙1g，明胶1g，硅藻土5g，硫酸钠3g，与适量木霉HS-4孢子粉均匀混合后加入5mL水，经过旋转式造粒机挤压造粒后，自然风干得到木霉HS-4颗粒剂。在对木霉HS-4颗粒剂贮藏稳定性的研究中发现，低温贮藏可明显提高孢子萌发率。试验中发现木霉HS-4颗粒剂对向日葵的生长起到促进作用，尤其是药土比1:12.5的处理促生效果最明显。盆栽试验表现为木霉HS-4颗粒剂处理的作物增长效果明显，而且向日葵幼苗的叶片饱满厚重，根系发达不易折断。同时，从本试验中可以看出，土壤中向日葵枯萎病菌的含量为2%时，木霉颗粒剂的防治效果好，防效为53.36%：土壤湿度对木霉HS-4颗粒剂防治向日葵枯萎病的影响作用不是非常明显，而温度的变化直接影响到木霉HS-4颗粒剂的防治效果，在温度为25℃的时候，木霉HS-4颗粒剂的防治效果最佳，防效为56.78%。39 第六章结论与讨论第六章结论与讨论本研究主要针对向日葵枯萎病，确定了向日葵枯萎病的病原菌为镰刀菌。采集、分离、筛选出6株对向日葵枯萎病菌防效在70%以上的木霉菌株，选择防效最高的绿色木霉菌株HS-4。研究各种价格低廉的粮食副产品作为培养基原料，筛选出最佳的木霉HS-4固体发酵培养基配方，并初步明确了固体发酵培养基的环境条件。探究木霉HS-4颗粒剂的研制工艺，以及温度，湿度还有土壤中枯萎病菌的浓度对木霉HS-4颗粒剂防治效果的影响，为加强木霉菌株HS-4对向日葵枯萎病的防治奠定基础。6.1向日葵枯萎病病原菌分离与鉴定从向日葵发病根茎上分离获得的菌株通过柯赫式法则证明了造成向日葵枯萎病的病原菌。结合病原菌的形态特征，确定分离的病原菌为镰刀菌(Fusarium.spp)。并且筛选出拌土法作为在盆栽向日葵幼苗上接种镰刀菌的方法。镰刀菌是一种常见的土传病原菌，国内外对于它的防治有许多研究。Jones(1989)发现，尖孢镰刀菌番茄变种（F.oxysporumf.sp.lycopersici）引起的番茄枯萎病可以通过在土壤中加入生石灰来抑制其发病情况。也有通过化学农药防治镰刀菌引起的病害。李凤瑞等(2005)发现32%乙蒜酮乳油是防治镰刀菌引起的棉花枯萎病首选药剂。许文耀(2005)用恶霉灵，多抗霉素防治香蕉枯萎病的效果比多菌灵效果高10-20%。林兰隐等(2003)采用敌克松+普克混配防治香蕉枯萎病，效果十分理想。现阶段国内外都开始研究利用拮抗微生物防治植物镰刀菌枯萎病，已经获得一大批拮抗微生物可以不同程度的抑制镰刀菌，很多防治效果较好的拮抗微生物己经进入应用阶段。(施祖国，2016)本研究从内蒙古向日葵病茎分离到镰刀菌和Orellana，Mathew，高婧等人报道的向日葵枯萎病的病原菌是一致的。但并没有进行分子生物学的方法研究，没有对于镰刀菌种下种群进行鉴定。6.2向日葵枯萎病拮抗木霉的分离与筛选采集不同地区土壤样品160份，分离到木霉菌59株，从中初步筛选出6株对向日葵枯萎病拮抗效果达70%以上木霉菌株。经过盆栽试验复筛，发现6株木霉菌都对向日葵枯萎病有不同程度的防治效果，并且能够促进向日葵幼苗根系扩40 沈阳农业大学专业硕士学位论文展和植株生长，提高向日葵幼苗的鲜重。本试验分离得到的1株最高效木霉菌株，通过观察木霉菌菌落形态和颜色变化以及木霉菌分生孢子梗，分生孢子的特征鉴定为：绿色木霉。目前关于枯萎病病菌拮抗木霉菌株的研究报道己有很多，曾华兰等(2003)筛选出对丹参根腐病有显著的抑制作用的桔绿木霉T56、哈茨木霉T23；柯仿钢等(2009)得到对粉蕉枯萎病菌具有拮抗作用的木霉菌株；孙虎等(2008)分离出的绿色木霉和棘孢木霉对小麦纹枯病有拮抗作用；刘爱荣等(2010)和邵红涛等(2004)发现木霉菌可以明显抑制尖孢镰刀菌的生长发育。蒲子婧等(2011)和王英姿等(2008)报道了用木霉菌来控制黄瓜枯萎病。本试验筛选出的绿色木霉HS-4菌株在和镰刀菌平板对峙时的防效为81.46%，盆栽试验的防效为66.04%，对镰刀菌有明显的抑制作用。木霉菌具有众多优点，以及十分广泛的作用机制，在防治由真菌引起的植物土传病害中被广泛的使用。6.3绿色木霉HS-4固体发酵条件的研究筛选出玉米粉：稻壳：麦麸=3:3:1(质量比)的最优固体发酵培养基，并研究了固体发酵培养基的环境条件。初步明确了绿色木霉HS-4最佳固体发酵的条件是：250mL三角瓶中加入20g的混合固体培养基，pH=6，加水量6mL，接种量5mL，变温发酵7d。最早Lewis等(1991)利用咖啡壳粉、可可壳粉、花生壳粉、石英砂加松锯末、麦麸皮、玉米芯等固体基质发酵培养木霉菌。陈碧云等(2001)发现绿色木霉Tv36的发酵滤液可以抑制油菜菌核病病原菌的生长发育。刘小杰等(2003)以稻草粉、大麦粉、麦麸等物质对康氏木霉ZJ5的固体发酵培养基进行了优化。王英姿等(2007)用玉米碎粒、稻壳、麸皮、脲的配比为2：3：1：2得到的固体发酵培养基，木霉菌株的分生孢子产量十分可观。梁昌聪等(2014)利用响应面法筛选出玉米粉、大豆糠、KH2PO4对绿色木霉H06固体发酵培养基进行了优化。孟文斌(2017)用玉米秸秆和玉米粉混合物作为柠檬绿木霉的发酵培养基，木霉产孢数高9达2.86×10个/g。权淑静等(2018)确定了以(NH4)2SO4作为氮源，麸皮和玉米芯作为碳源的桔绿木霉发酵培养基。本试验针对筛选到的绿色木霉HS-4菌株进行了固体发酵培养基优化并且研41 第六章结论与讨论究了发酵期间环境条件对了绿色木霉HS-4产孢量的影响，利用麦麸，稻壳，玉米粉等农副产品作为原料，价廉易得，生产的绿色木霉产孢量大，具有低投入、高产出、无污染的特点。将为绿色木霉HS-4的工业化生产提供理论参考。但是本试验只进行了玉米粉、稻壳、麦麸三种物质的正交试验筛选，对于其他物质和玉米粉、稻壳、麦麸的混合物对绿色木霉发酵还有待研究。6.4绿色木霉HS-4颗粒剂的制备通过助剂与木霉HS-4菌株相容性测试，明确了木霉HS-4颗粒剂配方，以碳酸钙为稳定剂、明胶为粘结剂、硅藻土为载体、硫酸钠为崩解剂。将碳酸钙1g，明胶1g，硅藻土5g，硫酸钠3g，与适量木霉HS-4孢子粉均匀混合后加入5mL水，经过旋转式造粒机挤压造粒后，自然风干得到木霉HS-4颗粒剂。在研究木霉HS-4颗粒剂贮藏稳定性的过程中发现，低温贮藏可明显提高木霉HS-4孢子活胞率。徐雅娟等(2008)发现，菌种在低温条件下保存简单易行，而且菌种的存活率明显高于室温下保存。张爱梅等(2011)发现目前我国保存菌种的主要方式仍以低温、超低温等为主，菌种在低温下的贮藏稳定性高。本试验得到的低温有利于菌种的保存结果与徐雅娟、景芳等研究结果基本一致。但低温保存木霉菌种的方法会在运输环节上产生一定程度的障碍，因此在室温条件下保证木霉孢子存活率的方法还有待研究。盆栽试验表现出木霉HS-4颗粒剂处理的作物，增长效果明显，而且叶片饱满厚重，根系粗壮，尤其是药土比1：12.5混合的处理效果更佳明显。尤成冰(2006)研究得出哈茨木霉对小白菜，番茄等植物生长都具有促进作用。景芳(2016)对黄瓜、番茄、辣椒、油菜、白菜等幼苗施用长枝木霉T6水分散粒剂，结果表明长枝木霉T-6对几种蔬菜的生长均有促进作用。王献慧等(2017)研究发现哈茨木霉菌T2-16菌剂对花生荚果产量、饱果产量和籽仁产量比对照都有明显的提高。本试验研究出木霉HS-4颗粒剂可以提高向日葵幼苗重量和品质的结果具有实践指导意义。在颗粒剂施用方面，本试验对土壤中向日葵枯萎病菌含量，土壤湿度，温度因素进行研究。研究发现，在土壤中向日葵枯萎病菌的含量为2%时，温度为25℃时，HS-4颗粒剂对向日葵枯萎病的防治效果最好，防效达到56.78%。目前利用木霉制剂防治镰刀菌引起的病害已有相关报道，如Ahmed等(2000)利用哈茨木42 沈阳农业大学专业硕士学位论文霉菌株来防治甜椒疫病；雀岩(2013)发现俄罗斯木霉对马铃薯干腐病和黑痣病有良好的防治效果。因此，木霉HS-4颗粒剂的开发应用对提高作物产量和防治植株病害有良好的应用前景。但是本试验只进行了盆栽试验，并没有在大田进行处理，所以在木霉颗粒剂的田间应用中还有待研究。43 参考文献参考文献[1]杜宾，张占英，李文青.浅析致病性镰刀菌的生物防治方法[J].湖北植保，2018(01)：50-52.[2]Kirk，P.M.，Cannon，P.F.，David，J.C.andStalpersJ.A.Ainsworth&Bisby'sDictionaryoftheFungi(ninthedition)[M].CABInternational，Wallingford，Oxon，UK，2001.[3]OrellanaRG.Fusariumwiltofsunflower，Helianthusannuns：Firstreport[J].Plantdiseasereporter，1970.[4]ElMahjoubM.VascularFusariumwiltofsunflowerinTunisiacausedbyFusariumoxysporum(Sn，etH.)f.sp.Helianthinov.sp.[J].Annalesdel’ImstitutNationaldelaRechercheAgronomiquedeTunisie1975，48(3)：3-11[5]BhargavaSN，ShuklaDN，SinghN.WiltofsunflowercausedbyFusariummoniloforme[J].IndianPhytopathlogy(India)，1978[6]ZazzeriniA，TosiL.NewsunflowerdiseasecausedbyFusariumtabacinum[J].PlantDisease(USA)，1987，71(11)：1043-1044[7]JasnicS，MasirevicS.Diseaseofsunflowerseedlings[J].BiljniLwkar(PlantDoctor)，2006，34(4/5)：315-315[8]RenJ，ZhangG，ZhangYY，FirstReportofSunflowerWiltCausedbyFusariumproliferatuminInnerMongolia，China[J].Plantdisease，2015，99(9)：1275[9]Ehteshamul—HaqueS，GhaffarA．Useofrhizobiainthecontrolofrootrotdiseasesofsunflower，okra，soybeanandmung—bean[J]．JournalofPhytopathology，1993，138(2)：157—163．[10]RaufB，RahberBhattiMH，AhmadI．Effectofseeddiffusatesonfungalpopulationandgerminationofsunflowerseeds[J]．Helia，2001，24(34)：77—81．[11]ThiribhuvanamalaG，NarasimhanV．Efficacyofplantextractsonseedbornepathogensofsunflower[J]．MadrasAgriculturalJourna1，l998，85：227—230．[12]杨合同，唐文华，M.Ryder.木霉菌与植物病害的生物防治[J].山东科学，1999(04)：7-15+20.[13]ProsperoS，BlackJA，WintonLM.IsolationandcharacterizationofmicrosatellitemarkersinPhytophthoraramorum，thecausalagentofsuddenoakdeath[J].MolecularEcologyNotes，2004，4(4)：672-674.[14]RifaiMA.ArevisionofthegenusTrichoderma[J].Mycol.Pap.CMI.，1969，116.[15]BissettJ.ArevisionofthegenusTrichodermaI：sectionLongibrachiatumsoct.nov[J].Can.J.Bot.，1984，62：924-931.[16]BissettJ.ArevisionofthegenusTrichodermaⅡ：infraspecificclassification[J].Can.J.Bot.，1991a(69)：2357-2372.44 沈阳农业大学专业硕士学位论文[17]BissettJ.ArevisionofthegenusTrichodermaⅢ：sectionPachybasium[J].Can.J.Bot.，1991b(69)：2373-2417.[18]李广记.华东地区木霉菌多样性研究[D].上海交通大学，2011.[19]孙军，段玉玺，吕国忠.木霉菌及其系统分类学研究回顾[J].菌物研究，2006(01)：57-63.[20]颜一红.食用菌木霉种类鉴定及木霉、疣孢霉防治研究[D].福建农林大学，2011.[21]APerelló，CMónaco，M.RSimón，MSisterna，G.DalBello.BiocontrolefficacyofTrichodermaisolatesfortanspotofwheatinArgentina[J].CropProtection，2003，22(9).[22]S.Maurya，RashmiSingh，D.Singh，H.Singh，U.Singh，J.Srivastava.ManagementofCollarRotofChickpea(CicerArietinum)byTrichodermaHarzianumandPlantGrowthPromotingRhizobacteria[J].JournalofPlantProtectionResearch，2008，48(3).[23]SivanA.1989.ThepossibleroleofcompetitionbetweenTrichodermaharzianumandFusariumoxysporumonrhizospherecolonization.Phyopathology,79(2)：198-203.[24]TaeGwanKim,GuyR.Knudsen.RelationshipbetweenthebiocontrolfungusTrichodermaharzianumandthephytopathogenicfungusFusariumsolanif.sp.pisi[J].AppliedSoilEcology,2013,68.[25]SegarraGuillem,CasanovaEva,AvilésManuel,TrillasIsabel.TrichodermaasperellumstrainT34controlsFusariumwiltdiseaseintomatoplantsinsoillessculturethroughcompetitionforiron.[J].MicrobialEcology,2010,59(1).[26]AndreasNaef,MauroSenatore,GenevièveDéfago.AmicrosatellitebasedmethodforquantificationoffungiindecomposingplantmaterialelucidatestheroleofFusariumgraminearumDONproductioninthesaprophyticcompetitionwithTrichodermaatrovirideinmaizetissuemicrocosms[J].FEMSMicrobiologyEcology,2006,55(2).[27]陈凯，李纪顺，王贻莲，李玲，扈进冬，魏艳丽，赵忠娟，杨合同.洞庭湖湿地木霉多样性及生防活性[J].微生物学通报，2017，44(10)：2307-2319.[28]常媛，杨兴堂，姜传英，姚志红，贾让，任龙辉，张荣沭.一株能拮抗3种土传病害病原真菌的长枝木霉[J].草业科学，2017，34(02)：246-254.[29]夏海波，潘好芹，李艳青.拮抗蔬菜土传病害木霉菌株的筛选及鉴定[J].北方园艺，2017(06)：127-130.[30]孔德颖.木霉可湿性粉剂对玉米小斑病的生物防治作用[J].耕作与栽培，2016(05)：32-34.[31]高丽辉，左豫虎，台莲梅，刘淑霞.木霉菌T-115D对马铃薯早疫病菌的拮抗作用[J].农业科技通讯，2010(08)：45-47+50.[32]覃柳燕，蒋妮，唐美琼，缪剑华，李林轩.木霉菌对山豆根根腐病菌的拮抗作用[J].中药材，2011，34(04)：499-502.[33]姚艳平，李友莲，王建明，张作刚.木霉菌对植物病原真菌拮抗作用的研究[J].山西农业45 参考文献科学，2013，41(04)：369-371.[34]秦云霞，涂敏，阳美芳，戚继艳，唐朝荣.8株木霉菌对橡胶树红根病的拮抗作用[J].热带农业科学，2015，35(03)：41-45+53.[35]孙川，朱晓峰，王媛媛，刘晓宇，陈立杰，段玉玺.东北地区大豆田木霉菌种群多样性及拮抗作用[J].中国油料作物学报，2015，37(03)：349-353.[36]杨萍，杨谦.木霉重寄生过程分子机制的研究进展[J].中国农学通报,2012,28(27)：163-166.[37]张建.生防木霉（TrichodermaguizhouenseNJAU4742）重寄生分子机理研究Ⅰ中性金属肽酶NMP1和活性氧的功能分析[D].南京农业大学,2015.[38]郭敏,柳春燕,陈靠山.拟康氏木霉胞壁多糖对黄瓜抗病性的诱导作用[J].天然产物研究与开发,2009,21(05)：748-751+781.[39]刘亚力.生防木霉菌株产木聚糖酶条件及诱导水稻抗病性的研究[D].浙江大学，2006.[40]NzojiyobiriJean-Berchmans，徐同，宋凤鸣，沈瑛.哈茨木霉NF9菌株对水稻的诱导抗病性[J].中国生物防治，2003(03)：111-114.[41]刘士旺.生防绿色木霉工程菌的构建及其诱导植物抗病性研究[D].浙江大学，2003.[42]朱萍萍，凌健，席亚东，陈国华，茆振川，杨宇红，谢丙炎.蔬菜土传病害生防木霉菌株资源的筛选及其防治效果评价[J].中国蔬菜，2015(08)：28-33.[43]毕卉.不同木霉菌株对黄瓜枯萎病防治作用的研究[D].沈阳农业大学，2016.[44]陈树华.七株木霉菌对香蕉枯萎病菌的拮抗作用及盆栽防治试验[A].中国植物病理学会.中国植物病理学会2008年学术年会论文集[C].中国植物病理学会：2008：1.[45]张丽荣，康萍芝，杜玉宁，朱建祥，杨卫东.木霉制剂对西瓜枯萎病的田间防治效果[J].北方园艺，2011(17)：148-149.[46]吴海燕，孙淑荣，范作伟，刘春光，杨天宇，王丽华.玉米茎腐病生物防治技术研究[J].吉林农业科学，2006(04)：45-47.[47]田连生，张根伟，黄亚丽，张丽萍，赵芊.木霉菌剂防治番茄枯萎病效果[J].现代化农业，2002(10)：14.[48]李雪玲，厉云，张天宇，王舰.利用木霉菌防治棉花黄萎病[J].植物保护学报，2003(03)：284-288.[49]燕嗣皇，吴石平，陆德清，陈小均.木霉生防菌对根际微生物的影响与互作[J].西南农业学报，2005(01)：40-46.[50]赵永强，台莲梅，郭永霞，张亚玲，靳学慧.木霉菌T38D对大豆根腐病菌的拮抗机制[J].黑龙江八一农垦大学学报，2010，22(04)：23-26+37.[51]邓龙，邓勋，尹大川，宋瑞清.引进木霉菌株T-43对樟子松枯梢病菌的抑制效果[J].黑龙江生态工程职业学院学报，2012，25(03)：38-39.[52]吴晓青，赵忠娟，李哲，扈进冬，赵晓燕，王贻莲，黄玉杰，李纪顺，杨合同.施加木霉可湿性粉剂对冬小麦田间生长的影响[J].山东科学，2015，28(06)：35-42.46 沈阳农业大学专业硕士学位论文[53]吴晓儒，陈硕闻，杨玉红，王永宏，刘艳，陈捷.木霉菌颗粒剂对玉米茎腐病防治的应用[J].植物保护学报，2015，42(06)：1030-1035.[54]EladY，Barakr，Chetl.1983.Possibleroleoflectinsinmycoparasitism[J].J，Baeteriol，154：1431-1435.[55]谷祖敏，周飞，毕卉，李宝聚.绿色木霉复配有机肥的筛选及对黄瓜枯萎病的防治作用[J].土壤通报，2015，46(02)：453-457.[56]Iwami，K，Yasumoto，k.，Mizusawa，H.，Mitsuda，H.EnzymaticformationofathermostableantithiaminefactorinfreshfruitingbodiesofLwntinusedodes[J].journaloftheAgriculturalChemicalSocietyofJapan[NihonNogeiKagakkai-shi]，1982，56(20)：905-910.[57]刘梅，徐同.木霉的营养生长及发酵条件[J].云南农业大学学报，2000，15(3)：263-268，278.[58]王英姿，祁之秋，魏松红，程根武，张杨，谷祖敏，李兴海，纪明山.绿色木霉菌固体发酵培养基优化组合正交筛选[J].植物保护，2007(02)：61-63.[59]茹水江.木霉颗粒剂ST-6的研制及其应用研究[D].浙江大学，2008.[60]王永东，蒋立科，岳永德，等.生防菌株哈茨木霉H-13固体发酵条件的研究[J].浙江大学学报，2006，32(6)：645-650.[61]Jones，J.P.，Engelhard，A.W.andWoltz，S.S.'ManagementofFusariumwiltofvegetablesandornamentalsbymacro-andmicroelementnutrition，'[A]inSoilbornePlantPathogens：ManagementofDiseaseswithMacro-andMicro-elements，ArthurW[C].Engelhard，ed.，AmericanPhytopathologicalSociety，St.Paul，Minnesota，USA，1989：18-32.[62]许文耀，兀旭辉，林成辉.香蕉枯萎病防治剂的筛选[J]．福建农林大学学报，2005，34(4)：420-424.[63]李凤瑞，王乐正，朱秀娟，等.32%乙蒜酮乳油防治棉花枯萎病药效试验[J].江西棉花，2005，27(2)：16-18.[64]林兰隐，奚伟鹏，黄赛花.香蕉镰刀菌枯萎病防治药剂的筛选[J].生态环境，2003，12(2)：182-183.[65]施祖国.植物镰刀菌枯萎病防治的研究进展[J].现代农业科技，2016(20)：102-103.[66]蒲金基，曾会才.绿色木霉LTR12-1对黄瓜枯萎病菌防治作用机制的初步研究[J].热带农业科学，2002，22（4）：22-25.[67]纪明山，王英姿，程根武，等.西瓜枯萎病拮抗菌株筛选及田间防效试验[J].中国生物防治，2002，18（2）：71-74.[68]柯仿钢.粉蕉枯萎病菌拮抗木霉的筛选及部分生物学特性研究[A].中国植物病理学会.中国植物病理学会2009年学术年会论文集[C].中国植物病理学会：，2009：1.[69]刘爱荣，陈双臣，陈凯，林晓民，王凤华.哈茨木霉对黄瓜尖孢镰刀菌的抑制作用和抗性相关基因表达[J].植物保护学报，2010，37(03)：249-254.47 参考文献[70]LEWISJA，PapavizasGC.Biocontrolofplantdisease：Theapproachfortomorrow[J].CropProduction，1991，10：95-105[71]王立克，戴四发，孙福军.生物发酵对小麦麸皮营养成分的影响[J].安徽技术师范学院学报，2002(03)：31-33.[72]梁昌聪，刘磊，张建华，郭立佳，王伟伟，黄俊生.响应面法优化绿色木霉H06产孢发酵培养基[J].热带作物学报，2014，35(02)：333-338.[73]刘小杰，何国庆，陈启和.康氏木霉ZJ5纤维素酶发酵培养基的优化[J].浙江大学学报(工学版)，2003(05)：127-132.[74]陈碧云，周乐聪，陆致平.绿色木霉发酵配方与防治油菜菌核病的研究[J].中国生物防治，2001(02)：67-70.[75]李秀明，李卿，韦灵林，王伟.哈茨木霉T4厚垣孢子水分散粒剂的研制[J].农药，2013，52(01)：24-27+40.[76]邵红涛，许艳丽，李春杰，李兆林.筛选用于防治大豆尖孢镰刀菌根腐病的木霉菌株[J].中国油料作物学报，2004(04)：76-79.[77]权淑静，张永战，徐文涛，马焕，解复红.桔绿木霉产木聚糖酶固体发酵条件研究[J/OL].河南科学，2018(02)：165-169.[78]孟文诚.柠檬绿木霉固体发酵工艺及颗粒制剂研究[D].内蒙古农业大学，2017.[79]惠有为，潘亚妮，孙勇，赵健.耐低温木霉TR-165固态发酵条件的研究[J].西北大学学报(自然科学版)，2004(01)：69-72.[80]徐雅娟，袁桂峰，陈森洲等.29种细菌用新鲜牛乳低温保存菌种的新方法[J].海南医学，2008，19（10）150-151.[81]张爱梅，郭大城，王建丽等.国内菌种保藏材料及保藏方法研究现状[J].河南预防医学杂志，2011，22（6）405-407.[82]王献慧，梁志怀，魏林，陈玉荣，张屹.哈茨木霉T_(2-16)菌剂不同使用方法对花生防病促生长效果的研究[J].花生学报，2012，41(02)：24-27.[83]尤成冰.哈茨木霉发酵工艺及发酵物对几种蔬菜的促生长作用研究[D].安徽农业大学，2006.[84]景芳.生防菌长枝木霉T6发酵条件优化、剂型研制及促生防病作用研究[D].甘肃农业大学，2016.[85]陈燕.化学农药对农业环境的污染与防治[J].农技服务，2017(22)：142.[86]杨霞.浅析农药污染的危害与产生原因及科学防治措施[J].农技服务，2017，34(15)：142.[87]张春秀.农药污染对农作物土壤的影响及可持续治理对策[J].现代农业，2017(07)：39-40.[88]赵晓峰.伊川县农药使用现状存在问题与对策[A].河南省植物保护学会、河南省昆虫48 沈阳农业大学专业硕士学位论文学会、河南省植物病理学会.河南省植物保护学会第十一次、河南省昆虫学会第十次、河南省植物病理学会第五次会员代表大会暨学术讨论会论文集[C].河南省植物保护学会、河南省昆虫学会、河南省植物病理学会：，2017：4.[89]孙科.农药使用中存在的问题及对策建议[J].现代农业，2018(01)：30-31.[90]郑永权.农药残留研究进展与展望[J].植物保护，2013，39(05)：90-98.[91]梁荣，孙新平.哈茨木霉菌剂防治葡萄病害及土壤盐渍化[J].北方园艺，2016(23)：108-110.[92]韩金星，洪日新，周林，等．西瓜，黄瓜，甜瓜等瓜类枯萎病研究进展[J]．中国瓜莱，2009，22(2)：32-35.[93]赵帅，杜春梅，田衣度．黄瓜枯萎病综合防治研究进展[J]．中国农学通报，2014.30(7.)：254-259.[94]高婧.向日葵枯萎病菌的分离鉴定、致病力分化以及侵染过程的研究[D].内蒙古农业大学，2016.[95]孙虎.小麦纹枯病拮抗木霉的分离、筛选及鉴定[A].中国植物保护学会(ChinaSocietyofPlantProtection).公共植保与绿色防控[C].中国植物保护学会(ChinaSocietyofPlantProtection)：，2010：1.[96]AhmedSA，PerezSC，EmiliaCM.Evaluationofinductionofsystemicresistanceinpepperplants(Capsicumannuum)toPhytophthoracapsiciusingTrichodermaharzinumanditsrelationwithcapsidiolaccumulation[J].EuropeanJournalPlantPathololy，2000，106(9)：817-824.[97]崔岩.马铃薯干腐病与黑痣病菌拮抗木霉菌的筛选及木霉菌遗传多样性分析[D].甘肃农业大学，2013.49 附录附录附录1附录1部分木霉菌盆栽复筛试验Appendix1Partwoodmoldpotscreenexperiment附录2附录2部分固体发酵培养基的筛选Appendix2Partialscreeningofsolidfermentationmedia50 沈阳农业大学专业硕士学位论文附录3附录3不同浓度木霉HS-4颗粒剂对向日葵促生作用Appendix3TheeffectofdifferentconcentrationsofTrichodermaHS-4granulesonsunflowergrowth附录4附录4绿色木霉HS-4颗粒剂防治效果Appendix4TheeffectcontrolofTrichodermavirideHS-4granules51 致谢致谢时间如白驹过隙，回首间两年的研究生生活即将画上圆满的句号，两年里有过困惑，焦虑和迷茫，但在老师和同学的帮助下走了出来。两年里不仅仅收获了知识和科研态度，还有一帮推心置腹的好友，正是有了他们的存在，使我的研究生生活增添了许多乐趣。首先要感谢的是导师谷祖敏副教授，本论文是在谷祖敏副教授的悉心指导下完成的。从试验的选题以及每个步骤的实施都凝聚着导师的心血和付出，感谢谷老师在我研究生期间对我动手能力、独自解决难题能力的培养，她对试验严谨的态度、对专业知识的理解与运用都是值得我学习的榜样。教会了我在以后人生的道路上要实事求是，兢兢业业，乐观的面对所遇到的困难，不急躁，不气馁，一步一个脚印的走下去。在这里向我的导师表达最真挚的感谢与祝福！感谢农药学方向的纪明山老师、祁之秋老师、李兴海老师、张扬老师、田宏哲老师、王英姿老师、李修伟老师给予的指导。同时也感谢植物保护学院其他领导和老师对自己的支持、关怀。特别感谢刘泉泉同学在研究生期间对我的帮助，许多困难的问题都是在你的帮助下解决，希望你以后的科研道路畅通无阻，完成出国留学的心愿。也谢谢杜颖、江震、蔡楠、连娜娜、孟司齐、杨永贵、王鹏飞、陆振明、薛晨阳等同学在我研究生期间给予的指点和帮助。感谢我的父母20多年以来默默无闻的付出和对我无私的关爱。你们期盼的目光使我前行的动力，祝你们健康快乐！最后对帮助过我的老师、同学、朋友和亲人表达最真挚的谢意！52 论文图表统计表计：学位论文52页表格14个插图26个