新城疫广西-9的全长测序及Muketeswar疫苗株的病毒拯救

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单位代码10445学号2011021034分类号Q93研究生类别全日制硕士硕士学位论文论文题目:新城疫广西-9的全长测序及Muketeswar疫苗株的病毒拯救学科专业名称：细胞生物学申请人姓名：牛丹丹指导教师：何成强教授论文提交时间：2014年3月28日 目录中文摘要........................................................................................................................1Abstract..........................................................................................................................3综述................................................................................................................................71.有关新城疫的简介.....................................................................................................72.新城疫病毒及重要蛋白的介绍.................................................................................72.1F蛋白结构及功能..............................................................................................92.2HN蛋白的结构及功能.....................................................................................102.3HN和F蛋白的相互作用.................................................................................113NDV的分类及其进化.............................................................................................123.1I型NDV............................................................................................................123.2II型NDV..........................................................................................................123.3有关病毒的进化...............................................................................................134NDV的热点研究.....................................................................................................165NDV的反向遗传学研究意义.................................................................................16正文..............................................................................................................................18第一部分新城疫广西-9病毒全长测序及分析...................................................181材料...........................................................................................................................181.1病毒菌株质粒...............................................................................................181.2主要仪器...........................................................................................................181.3实验药品...........................................................................................................191.4溶液配方...........................................................................................................202方法..........................................................................................................................222.1各引物设计.......................................................................................................222.2广西-9病毒液的RNA提取............................................................................222.3RT-PCR得到特异性扩增片段.........................................................................232.4片段连于pMD18-T，测序.............................................................................252.5序列分析...........................................................................................................273实验结果..................................................................................................................27I 3.1引物设计...........................................................................................................273.2RT-PCR得到胶回收图片.................................................................................283.3片段连与pMD18-T并得到全长测序结果....................................................294结果讨论..................................................................................................................29第二部分新城疫Mukteswar辅助质粒的构建及病毒拯救................................301材料..........................................................................................................................301.1菌株质粒细胞...............................................................................................301.2主要仪器...........................................................................................................301.3药品试剂...........................................................................................................311.4溶液配方...........................................................................................................322方法..........................................................................................................................322.1辅助质粒pCDNA3.0-NP和pCDNA3.0-P的构建........................................322.2辅助质粒pMC18-CMV-L的构建..................................................................342.3各质粒共转染至发生细胞病变.......................................................................392.4子代病毒的鉴定...............................................................................................403实验结果..................................................................................................................423.1辅助质粒pCDNA3.0-NP和pCDNA3.0-P的构建.........................................423.2辅助质粒pMC18-CMV-L的构建..................................................................433.3病毒子代病毒的鉴定.......................................................................................474分析讨论..................................................................................................................48第三部分结论............................................................................................................50附录..............................................................................................................................50附录5-1：质粒图谱...................................................................................................51(1)pMD18-T（Takara）......................................................................................51(2)pMC18（实验室储存）.................................................................................51(3)pCDNA3.0（实验室储存）..........................................................................51(4)pMC18-M（实验室储存）............................................................................52(5)pMD18-T-NP（实验室储存）.......................................................................53(6)pMD18-T-P（实验室储存）..........................................................................53II 附录5-2：测序结果...................................................................................................53（1）广西-9病毒各测序结果...............................................................................53（2）辅助质粒pCDNA3.0-NP、pCDNA3.0-P的测序结果...............................61（3）L基因的PCR测序结果...............................................................................62（4）子代病毒RT-PCR测序结果........................................................................65附录5-3：辅助质粒连接方案...................................................................................66（1）辅助质粒pCDNA3.0-NP、pCDNA3.0-P的连接方案：........................66（2）辅助质粒pMC18-CMV-L的连接方案：...................................................68参考文献......................................................................................................................69致谢..............................................................................................................................76攻读硕士学位期间发表文章......................................................................................77III 新城疫广西-9的全长测序及Muketeswar疫苗株的病毒拯救中文摘要在全球的家禽养殖业中，新城疫已经成为巨大的威胁疫病，1926年首次暴发，至今已造成了巨大的经济损失，已经被国际兽医局列为A类传染病。在全世界范围内已经引起了广泛的关注。我国关于新城疫的报道最早造见于河南，时间为1935年。新城疫暴发的始作俑者为病毒NDV，目前，国际上通用的毒力测试指标为MDT、ICPI和IVPI，依据这三个指标的综合分析，我们可以将NDV分为强毒株、中毒株和弱毒株。NDV属于负链的不分节段的RNA病毒，归属在副粘病毒科的禽副粘病毒属。全长基因编码6个功能蛋白，分别为NP、P、M、F、HN和L。其中，与细胞的融合和毒力相关的主要蛋白是F和HN，也是研究最多的蛋白。反向遗传学目前已经广泛运用到NDV的分子研究中了，早在1999年就已经报道了NDV病毒的拯救成功案例。实验研究的是低毒力的LaSota，期间是对P基因的剪接位点进行了修饰。嵌合重组的NDV的产生也相继被报道。病毒拯救成功的条件是：全长cDNA的完整克隆、辅助质粒NP、P和L的成功构建以及可以稳定表达T7聚合酶的细胞体系。NDV的复制中，辅助质粒的作用是不可或缺的，螺旋状的核衣壳是RNA复制的主要模板，而核衣壳蛋白NP和基因组RNA共同构成了核心结构，磷蛋白P和大蛋白L附着在核心结构上，这样共同组成了转录复制复合物，这也是复制的关键所在。本实验中，为了研究广西-9毒株是否与其他的毒株存在着重组情况，我们的工作就是为此做好基础，将此毒株的全长进行测序。由于其基因组太长，我们需要分段进行测序，经过RT-PCR得到8条DNA序列，送往华大进行测序，成功得到广西-9的全长序列。实验室已经有Mukeswar的全长cDNA克隆质粒，它的起始位置添加了T7启动子序列，末端添加了丁肝核酶和T7终止子序列，还有可以表达T7聚合酶的辅助质粒，本研究中，我们将NP、P克隆到真核表达质粒pCDNA3.0上，L基因分段克隆到重新构建的新的表达载体pMC18-CMV上。后将五种质粒成功共转染至BHK-21细胞中引起细胞病变，经RT-PCR鉴定及序列比对后，确定为1 M株，为本实验室的疫苗改造等奠定了基础。关键词：新城疫病毒，辅助质粒，共转染，BHK-21细胞，RT-PCR2 TheFulllengthsequencingofGuangxi-9strainandTherescueofMukteswarstrainfromcDNAgenomeofNewcasstleDiseaseVirusAbstractNewcastledisease(ND)isaseriousaviandisease,whichwithcausedsevereeconomiclossesinthepoultryworldwideandwereclassifiedaslistAdiseasesbytheOfficeInternationaledesEpizooties(OIE).TheNDhasbeenattractedbypublicity.In1935,theNDwasreportedinHenanprovinceofourcontry.Thecausativeagentofthedisease,Newcastlediseasevirus(NDV)isamemberofthegenusAvulavirusinthefamilyParamyxoviridaeandwhichcontainsisthreepathotypesdependingontheseverityofthediseaseinbirds:lentogenic,mesogenic,andvelogenic.Therearethreetoxicityindexindexs,inclondingMDT,ICPIandIVPI.ThegenomeofNDVisanonsegmented,negative-sense,single-strandedRNAthatencodessixmajorstructuralproteins,includingnucleoprotein,phosphoprotein,matrixprotein,fusionprotein,haemagglutinin-neuraminidaseandthelargeRNA-dependentRNApolymerase.HNandFglycoproteins,whichareimportantformoststudiedandpathogenicity.Now,reversegeneticshasbeenwidelyappliedtomolecularstudiesofNDV.ThefirstreportsofNDVrescuefromcDNAwerein1999.BothgroupsusedthelentogenicNDVstrainLaSota,whichwasfurtherattenuatedbymodifyingtheRNAeditingsiteinthePgene.ThegenerationofachimericrecombinantNDVwasreported.ToconstructthelabsystemofhomologousrecombinationinNDV,thereversegeneticssystemofNDVisnecessary,whichincludescloningoffull-lengthcDNAofNDVstrains,cloningandexpressionofNP,PandLgenes.Moreover,theconstructionofacelllineswasnecessary,whichcouldstablyexpressT7RNApolymeraseandgenerationofinfectiousNDVfromfull-lengthcDNA.TheroleofthehelperplasmidsisnecessaryinthereplicationofNDV.Thehelicalnucleocapsidisthe3 templateinthereplicationofRNA,andthecorestructureareconstitutedwiththenucleocapsidproteinNPandgenomicRNA.PhosphoproteinPandproteinLattachedtothecorestructure.Inthisstudy,wesequencedthegenomeofGuangxi-9stainwhichlayedafoundationtostudywhethertherearerecombiationsbetweentheGuangxi-9strainandotherstrains.Becauseofitsgenomeistoolong,wecloned8segmentstobesequenced.Wesuccessfullyobtainedthefull-lengthsequenceofGuangxi-9.TorescueNDVMukteswar(M)strain,weconstructedhelperplasmidsrespectivelyexpressingNP,P,L.TheT7RNApolymerasepromoterwasaddedatthebeginningofthefull-lengthcDNAandtheautocatalytichepatitisdeltavirusribozymewasaddedattheend.ThehelperplasmidsNPandPwereclonedtopCDNA3.0,andLtopMC18-CMV.ThecellstrainBHK-21wasco-infectedwiththefiveplasmidsandcultureduntilcytopathogenicityoccurredtorescueMstrain.TherescuedviruswasidentifiedwithRT-PCRandsequencing.Keywords：NDV;helperplasmids;cellstrainBHK-21;co-infect;RT-PCR4 英文缩写一览表英语缩写英文全称中文全称NDVNewcastleDiseaseVirus新城疫病毒NDNewcastledisease新城疫NPnucleoprotein核衣壳蛋白Pphosphoprotein磷蛋白Mmatrix基质蛋白Ffusion融合蛋白Lthelargeprotein大聚合酶蛋白HNhemagglutinin-neuraminidase血凝素神经氨酸酶MDTmeandeathtime平均死亡时间ICPI1日龄雏鸡脑内接种致病指数IVPIintravenouspathogenicityindex静脉接种致病指数SPFspecificpathogenfree无特定病原体RT-PCRReversetranscriptionPolymerasechain反转录聚合酶链式反应reactionHAhemagglutination血凝试验HIhemagglutinationinhibition血凝抑制实验TAETris-acetate-EDTAbufferTAE缓冲液EDTAEthylenedaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸二钠PIPESPiperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonicacid)哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)IPTGIsopropy-β-D-thiogalactoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷X-gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸SDSSodiumdodecylsulphate十二烷基磺酸钠EBEthidiumbromide溴化乙锭PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸缓冲液DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜TrisTris(hydroxymethyl)aminomethane三(羟甲基)氨基甲烷5 AmpAmpicillin氨苄青霉素LBLuria-BertaincultureLB培养基E.coliEscherichiacoli大肠杆菌EPEppendorf离心管aaAminoacid氨基酸6 综述1.有关新城疫的简介新城疫在全世界的家禽养殖业中已经引起了巨大的经济损失，从1926年新城疫第一次被公开提出以后，各国已经加大重视力度，虽然在诊断和疫苗治疗的方法上有了明显的进步，但是并没能很好的控制住这个疾病，依然在世界各地影[1-4]响着家禽业的发展。2006年到2009年，在众多的动物疾病中，就感染国家数[5,6]目最多而言，排在前列的是狂犬病，新城疫和牛结核病。在家禽类的传播疾病中，有一些很容易就可以引起大量经济损失，这些疾病就包括新城疫，其排名[7-9]仅次于高致病性的流感、传染性支气管炎和低致病性的流感，排在第四。新城疫病毒可以感染超过236种的鸟类，存在于家禽类的一些强毒力的病毒也常[10]常可以在鸽子和双冠鸬鹚中发现，在其他的一些野生鸟类中偶尔也可以发现。值得我们重视的是，鸽子会将自身的强度株的基因亚型VIb传染给家禽类，同样[11]地，家禽类也能够将自身的病毒传染给鸽子。被新城疫感染后的潜伏期长短和临床病症的表现取决于多种原因。通常，感染强度株病毒后，根据宿主的不同、[12,13]免疫能力以及病毒株系和数量各方面的不同，暴露症状也从三到六天不等。感染病毒后出现的临床症状也并非特异性的，主要包括萎靡不振，羽毛粗乱，呼吸困难，体温过高和厌食，死亡前也会有体温低的症状。但是，这些症状并非是感染新城疫后的特定表现，在一些疾病中也是可见的，比如高致病性禽流感，鸡[14]传染性喉气管炎和支原体病。然而，一旦出现了大出血和淋巴组织坏死，尤其[15]是在肠内，脾脏和胸腺中，我们就该怀疑是不是感染了亲内脏的强度新城疫。由于人们在养殖过程中会进行不同程度的多种疫苗治疗，家禽就会产生持续的免疫力，这样的话它们即使感染了也不会出现明显变化除非出现了产蛋量的下降[16]。鸟类感染了亲神经性的新城疫病毒时，我们会察觉到一些变化，比如说斜颈，生活混乱，翅膀或腿瘫痪，还会出现一些明显的器官损伤。2.新城疫病毒及重要蛋白的介绍新城疫病毒在鸡类中具有很高的传染性，并且在世界的养禽业中已经引起7 了巨大的损失。NDV的毒力跨度很大，根据症状的不同，大体上可以分为强毒株、中毒株和弱毒株三种。其中弱毒株在世界上已经广泛应用在活体疫苗上了。但是，这并没有完全阻止病毒的侵染和扩散。不过，这样被免疫后，病毒株和疫苗株之间反而有了基因的交换。而这么多的病毒里，NDV仅有一种主要的血清[17-20]型。新城疫是由新城疫病毒引起的，就目前来说，新城疫病毒是1型禽副粘病毒（APMV-1）类群的唯一成员，直径为120-300nm，属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）副粘病毒属（Paramyxovirus）。全基因长约15.0kb，为不分[21]节段单股负链的RNA病毒。图2.1为该病毒的病毒粒子的电镜图，2.2为病毒粒子整体示意图。病毒粒子是由脂质双分子层包裹着的，而这个双分子层是来自[22]宿主细胞的，包括6个结构蛋白，从3′至5′依次为NP、P、M、F、HN、L。图2.3为病毒粒子蛋白位置示意图。HN和F融合糖蛋白主要是镶嵌在脂质双分子层中间。M为基质蛋白，主要在膜的内层。病毒粒子里面有三种蛋白，包括核蛋白NP、磷蛋白P和大蛋白L，三种蛋白组成转录酶复合体。这些蛋白和它[23]们相关联的基序之间的相互作用也已经有了明确的报道。在进入宿主细胞的过程中，NDV基因组的转录和复制机制是相互独立的。在这些蛋白中，与新城疫毒力强弱相关的主要蛋白有F和HN。世界各地的NDV分离株的分析结果表明，HN和F基因序列的某些位点发生了变化，会导致毒株间的毒力产生较大的差异，[24-26]抗原性也会出现差异，而其主要的抗原表位并没有发生变化。图2.1病毒粒子结构电镜图8 图2.2病毒粒子整体示意图图2.3病毒粒子蛋白位置示意图2.1F蛋白结构及功能带有膜的病毒感染细胞时，需要病毒自身的膜和细胞膜发生融合，然后将基因组转入宿主细胞内。在副粘病毒的膜融合中需要F蛋白的调节，这种蛋白另归[27]为1型的融合蛋白。目前研究界里认为1型的融合模式中，合成的融合蛋白在9 传送到细胞表面时都是处于一个亚稳定的状态。在融合蛋白的激活过程中，普遍认为这些亚稳态的蛋白分子会发生很大的构型变化，最终结果就是病毒的膜和细[28-30]胞的膜发生了融合。这种通过构型变化而激活的方式是由酸性PH或是结合[31]受体完成的。在1型的融合蛋白中，有一些基序对于膜的融合是关键的。这些蛋白原本是折叠的三聚体，而且是稳定的。在发挥作用之前，三聚体蛋白需要先分解为F1[32]和F2两个亚单位。这些新分解的氨基酸序列称为融合态（FP）。在与宿主细胞的膜融合开始的时候，融合态首先插入到靶膜上，把蛋白锚定在这里。1型的融合蛋白也包含两个七价的重复序列（HR1和HR2，或者称为HRA和HRB）,[33]这些结构可以形成一个稳定的六股螺旋盘状。这两个基序对于融合蛋白的功能开启没有关系，但是它们在融合后的F蛋白起到重要作用。这个学说可以通过F[34]蛋白的两种不同的晶体结构来得到支持。一种结构是蛋白融合之前形成的，它并不包含HR1-HR2的聚合结构，然而，另一种结构是在融合蛋白融合之后出现的，它包含之前的二聚体结构。F蛋白形成HR1-HR2这种结构的折叠作用可以[35,推动效应膜和靶膜的融合，这种模式也可以通过之前讲到的这些结构来支持36]。副粘病毒F蛋白细胞质的区域（CT）和横跨膜的区域（TM）在晶体结构中并没有完全显现出来，但是在蛋白的融合中可能会起到作用。在一些副粘病毒的F蛋白的活动中，胞质的区域已经显示出了作用，因为CT中的碱基突变和增加[37]都影响到了F蛋白的融合活动。一些研究也表明TM在蛋白融合中也是有作用的。将NDVF蛋白的TM区域替换为与其亲缘关系非常相近的一株病毒的TM区域以后，结果影响到了F蛋白融合的活动。最可能的解释就是F蛋白突变后[38-40]结构发生了变化。反常的结构可能影响到了这个蛋白亚稳态的正确折叠。2.2HN蛋白的结构及功能完整的HN蛋白纤突分为三个部分：根部（又称为胞质区）、跨膜区、胞外[41]区。其中的胞外区又分为颈部和球状体，前者靠近膜端，后者靠近纤突末端。其中的球状结构域与唾液酸受体的结合的调节有关系，而它的茎套结构则调节自[42]身与融合蛋白F的相互作用，但是引发融合的具体机制还不是很清楚。蛋白的10 球状头部结构包含了六个β螺旋结构，它们集中在唾液酸的结合位点上，也被称作I位点，这个位点也调节了神经氨酸苷酶的活性。研究证实，这个位点的许多突变，包括K236R，会影响受体的结合，神经氨酸苷酶的活性，还有各种融合，[43-45]进而也影响了HN和F蛋白相互作用的能力。研究证明，HN蛋白不仅仅与F蛋白的融合有密切联系，还可能与淋巴细胞的凋亡有关，之前有些实验曾经将只表达HN蛋白的质粒转染至鸡胚胎成纤维细胞中，与对照相比，无论是从分子[46-48]学、细胞学还是组织学上都有明显不同，显示出了凋亡的迹象。另外，由HN蛋白引起的凋亡可能包含半胱天冬酶依赖性的本身的和外在的凋亡途径。线[49]粒体膜电位和氧化应激的变化也在这个细胞的调往中发生了。从发生在成纤维[50]细胞中的所有结果推断淋巴细胞可以通过NDV的感染来调控细胞凋亡。然而，目前的研究来说，对于HN蛋白引起淋巴细胞凋亡的能力仍需要进一步的考证。通过Kommersetal早期的报道，我们了解到在鸟中由NDV感染后引起的免疫抑制反应中有NP蛋白的参与。现在的研究讲到HN蛋白也牵扯到了免疫抑制反应[51-54]中。因此，证据表明，由HN引起的凋亡还应该包括额外的发病机理。2.3HN和F蛋白的相互作用NDV的核膜上包含两种跨膜的球蛋白，那就是HN和F蛋白，这两种蛋白[55]相互配合，相互作用，共同完成融合功能，在NDV的侵染中发挥重要作用。HN蛋白主要负责在宿主细胞的表面黏连含有唾液酸受体。由于HN含有神经氨酸酶的活性，它可以从糖侧链上裂解唾液酸，从而使子代病毒粒子从被感染的细[56,57][58]胞表面释放出去。HN蛋白还可以与F蛋白作用，加速F蛋白的融合进度。实验证实，运用不同的表达载体和宿主细胞，如若只表达NDV的F蛋白的细胞并不会发生融合现象，而只有当HN和F蛋白同时表达时才有融合现象的发生。[59]所以推测到，HN和F结合在一起成为一个复合体，才能诱导细胞的融合。也有文献中讲到HN蛋白与受体结合后，复合物的结构发生了变化，使得F蛋白可[60,61]以插入到靶细胞，发生细胞的融合。目前为止，已经有许多的实验证实HN[62]和F蛋白相互作用，对于NDV发生作用也是不可或缺的。11 3NDV的分类及其进化根据NDV的致病性不同，通过国际上公认的毒力指标MDT、ICPI和IVPI[63]的检测，我们可以将其分为三种毒株，但是它的血清型只有一种。通过系统发[64]生学的多种分析，可以将新城疫病毒分为I型和II型。3.1I型NDV其中的I型病毒至少可以分为1-9个基因型，这些病毒主要是从野生的水禽和活禽市场中采集得到的。多数的I型为弱毒株，在许多国家的活禽市场上分离到了此类病毒。也有研究证实I型病毒很有可能会传播到鸡群中，而且其毒力也[65,66]有可能会变强并进行传播，所以对此类病毒也要加以重视，积极防范。3.2II型NDV目前分析到的NDV中，大部分是归类于II型，它们主要存在于家禽、宠物[63]鸟类和野生鸟类中。而II型也可以进一步的分成I-XI九种基因型。II型包括了大部分的强度株和一些无毒株，也包含疫苗株，其中多种基因型在世界各地分布着。基因I、II、III和IV株出现在19世纪30年代到70年代的第一场兽疫中，V和VI型则出现在19世纪70年代末的欧洲的第二场兽疫中。其中来自鸽子身上的VIb亚型很可能起源于2000年代的中东地区的第三次兽疫。VII和VIII型出现在19世纪90年代的最近的一次兽疫中，地点在远东地区、欧洲和南非地区[64]。其中的VII型又可以细分为两种亚基因型：出现在2000年代远东地区的VIIa和出现在欧洲亚洲的VIIb。VIII型最早是在南非传播的，时间约在19世纪70年代，随后又传播到东南亚地区。IX型的毒株是比较独特的一群，它发生是从[65]1948年的中国开始的，是第一次致命的暴发性病毒。随后，这种基因型的成员陆续的从中国分离得到。X型毒株则分别在1969和1981年的台湾分离得到。在所有的基因型中，在19世纪70年代之前出现的毒株基因长度都为15186nt，[66]归类于前面的基因型，而之后发现的毒株基因长度为15192nt。12 3.3有关病毒的进化(1)低毒力病毒的进化与高毒力的NDV的进化研究相比，低毒力毒株的进化研究基本上是没有的。从全球的范围来看，来自I型的和II型的基因I、II的低毒力病毒通常是从国内[67]的家禽和野生鸟类上分离得到的。野生水禽和水鸟若被一大群多样性的无毒力NDV感染后，通常不会出现任[68]何的临床症状。近来从美国的活禽市场和野生水禽水鸟中分离得到了一些病毒，对这些病毒进行系统发生的分析，结果显示，约有70％的病毒属于I型，只有30％的属于II型。大约有一半的I型病毒来自驯化的野鸭。在这个单一的种群里，I型里的9种基因亚型，有6种都被表现出来，这就说明，某些特定的种[69,70]群对于NDV的感染特别敏感，而且会将病毒储存在体内。尽管没有发现病毒株，野生的水禽水鸟都是II型病毒的主要携带者，主要是基因型I和两种新的基因亚型：IIa和Ia。其中的Ia毒株亲缘关系更接近于地方性的澳大利亚的毒株，其中也有1998年暴发的强毒株病毒。IIa型的毒株之前也在阿根廷和西班牙分离得到过。水禽水鸟得到的病毒株中，没有一株与常规的疫苗株（如B1和LaSota）[71-73]的基因II一样的。I型的病毒通常来讲都是从野生的鸟类身上得到的，而在美国和亚洲地区的家禽身上发现了大量的I型NDV毒株，这就说明在这些种群中存在着一些流行[74]病学之间的联系。1986年到2005年，在美国的家禽中和野生水禽中分离得到了一些I型的毒株，这些毒株在系统发生学上就存在着很近的关系，也就说明这[75]些病毒在家禽和野生水禽里是可以传播的。2003年在安大略湖的火鸡上分离得到了一株II型的基因型为Ia的病毒，它与在2001年新泽西的水鸟身上分离得到的毒株在系统发生上是相近的，这也可以说明这些病毒可能偶尔也会在野生的[76]鸟类和国内的家禽中传播。II型的Ia和I的病毒株之前在美国的家禽身上分离得到过。尽管从野生水禽身上分离的NDV为低毒力的，但是在复制的过程中，病毒由低毒力转向高毒力是可能的。至少在过去已经有一株强毒力的I型病毒曾经得到过。以往在野生水禽和家禽的身上也出现出现过相同基因型的强毒株病毒[77,78]。最近，有些研究人员运用生物信息学的知识分析了一组全面的NDV序列的13 数据，目的就是探究影响NDV基因组的进化原因，结果显示在融合蛋白F的分裂位点上并没有正选择压。这也就是说不管是低毒力或是高毒力的NDV的F蛋白的分裂位点上是存在着负选择压或是中性选择压的。具体来讲就是说不管是基因型不同还是毒力不同的病毒，分裂位点的基序是高度保守的，也就意味着毒力[79]发生变化是偶然的。有趣的是，从野生鸟类中提取的各种病毒的F的基因序列和完整的基因序列来看，高毒力的病毒要比低毒力的病毒的年变化率高，也就是[80]说，毒力越高对NDV的正选择可能越有优势。(2)高毒力病毒和疫苗株的进化高毒力的NDV最有可能是在被免疫过的家禽种群中潜伏，也有证据已经表[81]明对于中毒力的NDV，野生鸟类是最天然的储备场所。系统发生学上相关的基因V型的强毒力NDV是在1975年到2008年的双冠鸬鹚身上发现的，在早前的新城疫暴发中也有提到。致命的鸽副粘病毒-1在临床上诊断为亲神经组织，这种病毒最早是在1981年的鸽子身上分离到的，之后在全世界范围内的鸠鸽科[82]的野生鸟类中传播。尽管早期的亲内脏性的强毒株NDV记录是在鸽子身上发现的，典型的鸽子分离株是基因VIb的变种，但是被感染后会出现一些神经上的临床症状，有着特殊的单克隆结合模式，通常不会发生红细胞凝集反应。其他的一些致命性的毒株偶然会在进口的热带鸟类中发现，但是它们是不是天然的储蓄[83]场所依旧需要考证。实际上，一些野生的鸟类并不是强毒力NDV的天然储蓄[84]场所，但是在出口的免疫站时可以被感染。在被免疫的家禽中，和正在流行的亲内脏的强毒NDV相比，在鸬鹚和鸽子身上分离的低毒力的I型毒株和中毒力的II型V、VI基因型有着非常大的优势，也就是说明，从疫苗接种来的免疫压力可能会选择强毒NDV的变异形式。这种加强免疫带来的令人费解的奇怪现象在亚洲、非洲和中美洲地区的家禽上频繁的[85-88]出现。目前的家禽业养殖系统的现状：宿主的遗传纯合率、高密度的饲养和加强的接种免疫，这些条件就会出现以上的现象，这对于强毒NDV的进化液可能会有一定的贡献。但是，就目前的学术来讲，还没有足够的数据来很好的说明[89]接种免疫对强毒株的进化起到作用。目前许多的研究已经证明现在的疫苗可以阻止疾病的发生，但是却不能阻碍病毒的流出。已有证据显示，运用基因匹配性的疫苗可以明显的减弱病毒的流出，相反，用抗基因型的疫苗则会减弱这种阻止14 [90]病毒外流的能力，这已经在基因VII和V的病毒中证实。报道称II、III和IV株出现在19世纪70年代之前，属于老基因型，而且每[91]个基因型受到严格的地域限制。IV型毒株属于很古老的基因型，而且它不会在世界各地传播，最后的报道中它出现在欧洲的地区。但是，有趣的是，IV型毒株的基因是在1987年和2000年的印度出现的，这也就暗示了，它可能在印度有散播。而这种基因之前在印度是没有出现的，也就是说对于NDV的基因分型没有起到作用。但是其他的和记录的传播性的NDV流行类型我们是根据单克隆抗体等来分类的。在印度传统的疫苗株Fuller和LaSota属于II型。其他常用的疫苗株，如1940年代在印度被报道的Mukteswar则属于III型，和位于英国东南[92-94]部的赫特福德郡的疫苗株相近。研究表明，在印度出现的两种IV型毒株，1987年的NDV2和2000年的NDV-2K3与常用的疫苗株LaSota有着巨大的不同。现在已经有报道称针对突发的病毒株而构建的在系统发生上更接近疫苗株可[95]能会提供更好的控制，途径是通过减弱病毒从感染的鸟类身上的流出和传播。也有报道说通过疫苗接种来抵抗NDV尽管可以控制临床疾病，但是当异源基因型交换时，这种方式并不能阻碍病毒的流出。因此，在印度出现的IV型毒株不断地传播，而这种传播仅仅靠传统保守的II型疫苗株来减弱是不可能的。所以，除了II和III型疫苗株之外的基因型持续不断的传播也是会发生的。进一步来讲，对于鸽子身上的这种IV型毒株的传播就出现了一种可能性，这种可能性就是基[96-100]因型从野生的鸽子或者其他鸟类周期性的传播到商业化的家禽类上。现在有些证据显示，目前的ND疫苗对于减弱由基因型VII毒株带来的发病[101]率和死亡率是无效的，这个说法是存在争议的。一个以交叉保护实验为基础的报道中讲到，在中国，目前至少有两种抗原性的变种，分别在2001年和2003年分离得到。这个报道中显示，被LaSota免疫过后的所有鸡中，变种病毒感染后，有50％、40％和10％的鸡出现了临床症状，而没有被变种病毒感染的鸡中[102]无一出现症状的。但是，免疫状态是否变化并没有检测。也有一些研究证实，现在的疫苗对于在亚洲传播的病毒带来的发病率和死亡率是有减弱趋势的，包括LaSota和另外两种商业化的疫苗株。尽管存在着争议，由于免疫效果欠佳，NDV[103]的变异病毒仍可以创新地运用在家禽业上。15 4NDV的热点研究就目前的研究来看，NDV具有溶瘤作用，这对于癌症的治疗手段上可能会[104]有指导意义，这也将成为医学上的研究热点。最近几年里对于NDV特异性有[105]效性地杀死多样的肿瘤细胞已经有了有力的证据。然而，溶瘤的效率会依据[106]NDV毒株的基因序列不同而不同。近一步来讲，NDV蛋白和胞内凋亡蛋白的序列相似度很可能与诱导肿瘤细胞凋亡的能力密切相关。现在已经采取了多种措施来提高NDV的溶瘤潜能，比如可以通过反向遗传学的手段来构建包含点突变[107-109]和外源基因的重组NDV来实现。由于ND对家禽业的威胁特别大，目前对于ND还没有特别有效的治疗方法，[110]而疫苗接种算是一个相对有效的方法。现在，灭活疫苗和减毒的活体疫苗是[111]比较常用的，但是这种传统的疫苗是有缺陷的。活体疫苗有一定的局限性，尤其是RNA病毒，考虑到恢复的可能性，在生产过程中需要生物封闭，还有冷[112]链的要求和安全的重视等问题。使用灭活疫苗的最大问题就是免疫原性太低，[113]如果没有完全灭活的话就会带来疾病。[114]考虑到以上缺陷，NDV的疫苗接种计划就需要创新和拓展。现在有了创新的方案，比如使用DNA疫苗，它是一种新型构建疫苗，可以提高效率。由于它的安全性以及遗传稳定性，DNA疫苗的构建将称为一种具有前景的工程。它可以解除生产过程中生物的封闭，也不需要冷链的处理，还可以激活先天性免疫。目前，肌肉注射是DNA疫苗实施的主要途径，完成注射后，疫苗在细胞成员之[115,116]间移动是很困难的，仅仅可以到达一些抗原呈递细胞来诱导免疫应答。临床试验也证明了由DNA疫苗接种引发强的免疫应答是很难的，尤其是在大型的[117]动物体内。因此，DNV疫苗的发展受到了局限。不过，近几年里已经提出了可以提高DNA疫苗效果的新方法，可以通过优化质粒、提高免疫反应的传递方[118]法和途径、锁定抗原呈递细胞和利用有效的佐剂来加强免疫原性。5NDV的反向遗传学研究意义经典遗传学指的是由生物的表型着手，进而研究它的基因等遗传物质，揭示生命的发展规律。而反向遗传学与之相反，是从基因入手，对其进行修饰加工，16 [119]后通过性状的变化确定该基因的功能。反向遗传学的各种技术，如RNA干扰、基因沉默等已经广泛运用到各种研究领域内了，在RNA病毒的研究中带来了巨大的益处和方便，不仅可以研究基因的功能，还可以为疫苗的生产和改良提供新[120,121]的思路和方法。世界上第一个拯救出来的负义RNA病毒为狂犬疫苗，而目前运用反向遗传学的手段已经成功建立了多种不分节段和分节段的系统。NDV属于负义的RNA病毒，关于第一种NDV的病毒拯救系统的报道在1999年，为弱毒株的疫苗株LaSota。NDV可以作为一种很好的病毒载体，因为它的基因结构和分子特性已经研究的很透彻，我们可以进行一些疫苗的研究工作，这[122]对于家禽业来说具有广阔的应用前景。而NDV疫苗的安全性也已经证实了，它的优点也很多：比如免疫方式多样，可以通过饮水、注射等方式进行；生产成[123]本低；遗传稳定等。所以NDV的方向遗传学的研究会成为热点。同源重组也是NDV遗传多样性的分子机制之一，而NDV的反向遗传系统的成功建立正是其研究的基础。一些报道已经证实了这一理论，而关于NDV的同源重组，一些重要的问题仍有待解决。在自然界中存在NDV重组子病毒，但由于目前缺乏有力的实验室证据，这个机制对NDV遗传多样性的影响仍然不被人重视。所以，要使以NDV为代表的负链RNA病毒的这种遗传多样性机制得[124]到广泛的认可并能得以重视，必需有系统的实验室证据支持。NDV之间的重组频率有多高，也就是说这种机制在塑造病毒遗传多样性过程中有多大的作用，以及在其基因组上是否存在重组热点尚没有相关实验数据，而这些数据正是评估[125]NDV减毒疫苗是否能作为安全的疫苗载体必不可少的。还有，NDV间重组的机制完全未知。最后来讲，疫苗与野生病毒之间重组所产生的新病毒与我国NDV疫苗免疫失败之间是否存在某种联系，如重组后是否导致病毒毒力增强，或产生[126]免疫逃避直接导致了免疫失败等，缺乏直接的实验数据。而这些研究的顺利进行必须有反向遗传系统的支持，所以对于它的成功建立也是重中之重。17 正文第一部分新城疫广西-9病毒全长测序及分析本实验以新城疫广西-9病毒为实验材料，在此基础上进行RT-PCR得到全长cDNA，分别设计八对引物，以全长cDNA为模版进行PCR，克隆出八条片段。克隆片段连接在pMD18-T上，送往华大基因测序，得到各个片段序列。随后，使用DNAMAN分析，将全长拼接出来，登录NCBI网站，利用Blast比对，分析它的亲缘关系。1材料1.1病毒菌株质粒新城疫广西-9病毒由广西兽医研究所谢芝勋研究员提供；DH-5αEcoli由本实验室制备；pMD18-T购置于Takare公司；1.2主要仪器恒温摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）电泳仪（美国Bio-Rad公司）冰箱（海尔集团）恒温培养箱（上海森信）PTC-200型PCR仪（MJResearch）离心机（德国Eppendorf公司）高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）移液器（大龙）无菌操作台（北京半导体设备一厂）超低温冰箱（日本SANYO公司）18 自动三重纯水蒸馏器（上海玻璃仪器一厂）微波炉（格兰仕电器有限公司）手提式电热压力蒸汽灭菌锅（北京新华安得医疗用品有限公司）紫外吸收分析仪（温州奥利生物医学仪器厂）PH计（Startorius公司）-80℃超低温冰箱（日本SANYO公司）0.22μm的一次性滤器（MilliPORE公司）1.3实验药品TRIzolReagent(invitrogen)三氯甲烷（国药集团）异丙醇（国药集团）氯化钠（国药集团）DEPC（Sigma）无水乙醇（国药集团）E×taq(TaKaRa)LA×taq(TaKaRa)Marker(TaKaRa)琼脂糖（BBI）氨苄青霉素（上海生工有限公司）胰蛋白胨（英国OXOID公司）酵母粉（英国OXOID公司）琼脂粉（日本Solarbio公司）Tris碱（Sigma）冰醋酸（国药集团）EDTA（Sigma）PIPES（Sigma）四水合氯化锰（国药集团）19 二水合氯化钙（国药集团）氯化镁（国药集团）氯化钾（国药集团）葡萄糖（Sigma）氢氧化钠（国药集团）SDS（Sigma）乙酸钾（国药集团）T4DNA连接酶（Fermentas）ReverAidFirstStrandCdnaSynthesisKit(Thermo)Gel/PCRExtractionKit（Biomiga）高纯度质粒小提中量试剂盒（天根生化科技有限公司）质粒小提试剂盒（Biomiga）1.4溶液配方（1）SOB培养液（1L）胰蛋白胨20g酵母粉5g氯化钠0.5g配好以后，湿热灭菌20min，备用。（2）LB培养液（1L）胰蛋白胨10g酵母粉5g氯化钠10g配好以后，湿热灭菌20min，备用，若需要固体培养液，每1LLB液体培养液里加入1.8g琼脂粉。（3）Inoue转化缓冲液（1L）MnCl2.4H2O10.88gCaCl2.2H202.2gKCl18.65g20 PIPES(0.5mol/L,pH6.7)20ml加入三蒸水定容至1L，过滤除菌后分装，-20℃储存。（4）质粒粗提各种试剂：碱裂解液Ⅰ：100ml50mM葡萄糖0.9g25mMTris0.3025g10mMEDTA0.372g称完后放入烧杯，HCl调PH至8.0，定容至100ml。该裂解液配置完后需经过高压灭菌，之后置于4℃保存待用。碱裂解液Ⅱ：0.2MNaOH0.24g溶于15ml三蒸水中1%SDS0.3g溶于15ml三蒸水中使用前将配好的NaOH和SDS1：1混匀后使用。碱裂解液Ⅲ（100ml）：5M乙酸钾（100ml三蒸水加入49.08g）60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml该裂解液配置好后置于4℃保存待用。（5）50×Tris-乙酸（TAE）500mlTris碱121g冰乙酸28.55mlNa2EDTA.2H2O9.3g调PH至8.0，三蒸水定容至500ml。（6）1%的琼脂糖凝胶21 称0.15或0.3g的琼脂糖，量取20或40ml的1×TAE缓冲液，将琼脂糖溶解，微波炉加热40s至琼脂糖完全溶解，倒胶，冷却30min至凝固，待用。2方法2.1各引物设计进入NCBI的GenBank里下载参考序列DQ485230，利用Primer5软件处理分析，设计了8对引物，准备扩增8条片段，分别测序。2.2广西-9病毒液的RNA提取取出200ul的病毒液，参照TRIzolReagent的说明书，提取RNA。由于RNA极易被降解，再加上病毒的RNA含量本来就很低，之前要进行严格的处理，用来配试剂的蓝口瓶都要进行高温干热灭菌处理，将干燥箱温度调至180℃，锡箔纸将瓶口包好，热干灭菌4-6小时。枪头枪盒要湿热灭菌1到2小时，烘干。1‰DEPC水要提前配好，放置一夜，第二天灭菌处理，分装待用。TRIzol法提RNA的步骤如下：（1）取病毒液300ul，加入1ml的TRIzol裂解液，颠倒混匀10下，室温放置5min。（2）加1/5体积（总体积）的氯仿，上下颠倒15s，室温放置5min，4℃，12000r/min,离心15min。（3）用200ul的移液器取上层水相于一新的EP管中，切勿吸到有机相，加入等体积的异丙醇，混匀后，室温放置10min。（4）4℃，12000r/min,离心10min，将上清到掉，用20ul的移液器把残留的异丙醇吸干。（5）加入1ml预冷的的75％乙醇（灭好菌的1‰DEPC水配制），4℃，8000r/min,离心5-10min。（6）乙醇倒掉，20ul的移液器将残留乙醇吸干，室温放置5min，让沉淀的RNA自然干燥。（7）取20ul的含DEPC的水溶解RNA。22 注意事项一定要戴手套操作，尽可能的少说话。75％的乙醇要提前预冷。（1）若长期储存RNA，可在第5步停止，加入乙醇后直接放入-80℃冰箱。（2）离心时要按同一方向，因为RNA含量少的时候，沉淀后看不到，可按离心方向判断沉淀方向。2.3RT-PCR得到特异性扩增片段以提取的RNA为模板进行RT,体系如下（20ul）：RNA5ulRandemPrimer1ul5×ReactionBuffer4ulRiboLockRNaseInhibitor1ul10mMdNTPMix2ulRevertAidM-MuLVReverseTranscriptase1ulWater6ul反应程序如下：25℃5min42℃60min70℃5min根据以上体系和程序得到cDNA,依次为模板进行下一步的PCR扩增，扩增体系如下（20ul）：模板（cDNA）3ulLATaq0.1uldNTP1.6ul10×LABuffer2ulF1ulR1ul水11.3ul23 PCR程序如下：94℃5min94℃45s30c50℃（依Tm而变）45s72℃2min72℃8min分别扩增得到8条片段，对特异性片段胶回收，使用胶回收试剂盒进行，步骤分别为：使用之前要先将新的ezBindMiniColumns结合柱平衡一下，BufferGBL操作步骤：（1）取一个新的ezBindMiniColumns结合柱装在收集管里，取500ul平衡缓冲液加入柱子里，室温放置2min。（2）室温，12000×g离心2min。（3）倒掉收集管中的滤液，将ezBindMiniColumns结合柱重新放入收集管，按试剂盒说明书进行操作。试剂盒操作步骤：（1）从凝胶上割下带有目地条带的凝胶块放入1.5的EP管中，加入等体积的BufferGC,放入55-60℃水浴中8-10min，中间颠倒混匀几次，至胶块溶化，冷却至室温。（2）将以上混合液转移至平衡好的柱子里，一次不能超过700ul，室温，13000×g离心1min，重复步骤，至混合液全部过滤完。（3）加入650ul的DNAWashBuffer到吸附柱里，室温，13000×g离心30s，倒掉收集管里的废液，重复一次。（4）室温，13000×g，开盖离心2min，去除残余的的乙醇，离心后开盖放置几分钟，保证乙醇完全除去。（5）将吸附柱放入新的EP管中，加入30-50ul的60℃预热的ElutionBuffer，室温放置1min，13000×g离心1min，可重复这一步，提高收获率。若片段大于8Kb，加入洗脱液后，将吸附柱置于60℃放置15min后在离心。分别得到8条片段。24 2.4片段连于pMD18-T，测序得到的8条片段分别连与pMD18-T,使用之前先将T载稀释10倍，连接体系（10ul）：目的片段4ulT载1ulSoulationI5ul16℃，连接过夜。感受态细胞的制备：（1）划板，挑单菌落。（2）将挑好的单菌落接种于25ml的LB培养液里，37℃，在恒温摇床里培养6-8h，摇床调整转速至250-300r/min。（3）约晚上18点，将上述培养好的培养液取10ml接种到一个有250mlSOB培养液的锥形瓶中，18-22℃的恒温摇床里摇过夜，转速为200r/min。（4）第二天，4℃，2500g，离心10min，收集菌体。（5）弃去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上，用移液器将残余的液体抽干。（6）加80ml预冷的Inoue转化缓冲液，重悬菌体沉淀，在冰上进行，要轻轻摇动。（7）4℃，2500g，离心10min，收集菌体，弃去上清，移液器吸干残留的液体，控干。（8）加20ml的预冷的Inoue转化缓冲液重悬菌体。再加入1ml的DMSO，轻轻混匀菌液，冰上放置10min。（9）分装悬液，每管100ul的悬液，封紧管口，放入液氮迅速冰冻感受态细胞，储存在-80℃冰箱备用。连接后，经行转化，转化步骤：（1）将连接体系10ul加入100ul感受态细胞中，混匀后，冰置30min。（2）热激，42℃，水浴90s。（3）冰置2min，加入800ul的LB培养液，37℃，孵育1h。（4）7000r/min，离心3min，弃上清。（5）将剩余的100ul的混匀后的菌液涂平板，倒置培养，过夜。25 第二天，做菌落PCR。每一个单菌落挑一半做模板，另一半待用，做好标记。用通用的M13做引物，引物为M13上游引物:5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’M13下游引物:5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’菌落PCR体系（20ul）：rTaq0.1ul10×Buffer2uldNTP1.6ulM13F1ulM13R1ul水14.3ul可先配成20管的大体系，然后分装到20个小管里。PCR后，进行电泳检测，找出阳性片段，将剩余的阳性菌落的另一半挑菌，在LB培养液里扩大培养，摇6h后提质粒。质粒提取的步骤：（1）收集菌液，每5ul的菌液收集到一管里。（2）加入150ul的预冷的裂解液I，将菌液重悬，一定要吹打均匀，不要有菌块。（3）加入200ul的裂解液II（现配现用），轻轻混匀。（4）加入150ul的预冷裂解液III，轻轻混匀（此时不应出现分离的两相）。（5）将离心管置于冰上10min，至出现乳白色的沉淀，4℃，11100r/min，离心15min。（6）取上清于新管中，加入等体积的酚-氯仿，混匀抽提蛋白，11100r/min。离心10min。（7）取上清于一新管中，加入0.6倍的异丙醇，室温放置10min，11100r/min，离心15min。弃上清，将异丙醇除净，滤纸吸干。（8）加入1ml的75％乙醇，洗一到两遍，弃上清，吸干残余的乙醇，室温放置5min，加20-50ul的含有RNA酶的TE溶解沉淀。提完质粒，找到两个合适的限制性内切酶，做酶切，条带正确后送往华大测序。26 2.5序列分析将得到片段导入DNAMAN软件经行拼接，得到全长序列，利用NCBI网站里的Blast比对分析，得出结论。3实验结果3.1引物设计在引物设计中，我们考虑到GC含量和上下游引物的退火温度，选取最佳引物，利用参考序列设计的引物如下表所示Primer名称碱基序列F1(1-20)5'-ACCAAACAGAGAATCTGTGA-3'R1(2270-2288)5'-TTTAGCATTGGACGATTTA-3'F2(1556-1573)5-'GCATCCCAAGACAACGAC-3'R2(3715-3732)5'-TTTGCCACAACCATACAG-3'F3(3166-3183)5'-AACACCCCAAACAACAGC-3'R3(4820-4837)5'-GCCAAGAGGAGTGAGCAA-3'F4(4064-4084)5'-ATAGAGGAAAAGATAAGGAGA-3'R4(6701-6720)5'-AGATTCAGTGTTTAGTAGCG-3'F5(6100-6119)5'-TAGTCTGGTTTTAGCGTGTT-3'R5(8589-8606)5'-GCCCGAGTTTTATCATTC-3'F6(8165-8182)5'-AGGATGGTTGGGAAGACG-3'R6(10918-10935)5'-GCAATGTTGGCACAGGAC-3'F7(10631-10650)5'-CAAGGTGACAATCAAGTAAT-3'R7(13138-13155)5'-CATAATCGGGAAATCAGT-3'F8(12760-12777)5'-AGATGTGGTCCGCCTGTT-3'R8(15173-15192)5'-ACCAAACAAAGATTTGGTGA-3'27 3.2RT-PCR得到胶回收图片经过RT-PCR得到了八条片段，分别经行胶回收，胶回收图片如图1-1和1-2：1：片段1；2：5000Marker；3：片段21:segment1;2:5000Marker;3:segment1图1-1：片段1和2PCR胶回收Fig.1-1:gelextractionofsegments1and21-2：片段3；3-4：片段4；5：片段5；6：片段6；7：片段7；8：片段8；9：5000Marker1-2:segment3;3-4:segment4;5:segment5;6:segment6;7:segment7;8:segment8图1-2：片段3至8PCR胶回收Fig.1-2:gelextractionofsegments3to828 3.3片段连与pMD18-T并得到全长测序结果八条片段分别连与pMD18-T载体上，经转化，菌落PCR初步验证后，挑出一个菌落的菌液送去测序，得到了八段序列。将序列重新导入DNAMAN里，拼接后得到全长，结果在附录5-2中。4结果讨论在这个实验中，RNA的提取很重要，也是关键，病毒的RNA含量很低，所以操作过程中应更加谨慎。在操作过程中，手套和口罩必须得戴，还有离心过程中EP管方向要一致，因为RNA的含量太少，肉眼很难看到，只能凭着方向来判断。引物设计的环节中，我们要综合考虑最终得分，要考虑GC含量，最重要的是Tm值，相应的上下游引物退火温度不能相差太大，不宜太低也不宜太高，最好在50℃-60℃之间，而且软件设计出来的引物，Tm值与真实合出来的引物是有差距的，所以只能做一个参考。以cDNA为模板，分别PCR扩增八条片段，3-8片段都很顺利，1和2片段出了点问题，所以分别降低退火温度，条带也是很弱，分析原因可能是引物特异性不高，但是也做出了相应的结果。在我们测序之前，广西-9病毒株的基因测序已经被广西兽医研究所在2003年提交到NCBI里了，通过生物学软件分析，它为病毒株FWM和Mukteswar的重组株。而扬州大学兽医学院的动物传染病实验室在病毒学杂志上发表了一篇文章，讲到广西-9经过研究分析并没有发现重组现象。针对争议，我们重新进行了测序，结果证明没有重组信号。对于之前出现的分析错误，原因可能就是之前测序的过程人为原因造成的，在PCR的过程中模板的混淆导致了测序出现了差异。通过这个实验的进行，我们应该注意到其中的问题，包括PCR的一些操作方式，要注意枪头的更换等问题。29 第二部分新城疫Mukteswar辅助质粒的构建及病毒拯救本实验通过分子克隆的方法，成功构建了辅助质粒pCDNA3.0-NP、pCDNA3.0-P、pMC18-CMV-L，利用反向遗传学的手段，通过细胞培养，在脂质体2000的介导下，成功的将实验室原有的全长cDNA克隆质粒pMC18-M、pN3-T7RNAP和新构建的三个辅助质粒pCDNA3.0-NP、pCDNA3.0-P、pMC18-CMV-L共转染至BHK-21细胞中，并成功表达，通过RT-PCR的检测，从分子水平上验证病毒的拯救。1材料1.1菌株质粒细胞DH5α感受态细胞（-80℃超低温冰箱保存）pMD18-T（购置于TaKaRa公司）pMC18（实验室储存）pCDNA3.0（实验室储存）pMC18-M（实验室储存）pMD18-T-NP（实验室储存）pMD18-T-P（实验室储存）pN3-T7RNAP（实验室储存）BHK-21细胞（实验室储存）SPF鸡（购置于家禽所）SPF鸡胚（购置于家禽所）1.2主要仪器CO2恒温培养箱电热恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）超净工作台（苏州净化）数码倒置显微镜（济南奥仁）30 台式鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）超声波清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）PH计（上海梅特勒-托利多）高速离心机（ClemensScientific）冰柜（海尔）低温冷冻离心机（Eppendorf）SZ-97自动三重纯水整流器（上海亚荣生化仪器厂）含枸橼酸钠的抗凝管一次性注射器0.22μm的一次性滤器（MilliPORE公司）血凝板24孔板（Costar）60mm和90mm的一次性细胞培养皿（NEST）1.3药品试剂胰酶（碧云天）双抗（碧云天）碘伏（国药）医用酒精（国药）蜡烛各种限制性内切酶（TaKaRa）脂质体2000（invintrogen）DMEM高糖培养液（Hyclone）DMSO（索莱宝）胎牛血清（四季青）Opti-MEM（gibco）2×TransTaqHiFiPCRSuperMix（TRANS）ETaqVersion2.0(TaKaRa)PrimeScript™RTreagentKitwithgDNAEraser(TaKaRa)31 1.4溶液配方细胞培养有关溶液PBS（10×）100mlNaCl8gKCl0.2gNa2HPO41.44gKH2PO40.24g称取以上药品，溶解后，定容至100ml，放入蓝口瓶，湿热灭菌20min，待用。含血清的高糖培养液先将胎牛血清灭活30min，取5ml的灭活血清加入一干净灭好菌的50ml的离心管，再加入双抗液500ul，在超净工作台中，悬空加入新鲜高糖培养液至50ml，保存于4℃，待用。细胞冻存液按完全培养液：血清：DMSO为7：2：1的比列加入干净的血清瓶中，外面用锡箔纸包好，避光保存在4℃，待用。2方法2.1辅助质粒pCDNA3.0-NP和pCDNA3.0-P的构建将质粒pMD18-T-NP和pMD18-T-P用合适的酶切开，分别克隆至真核表达载体pCDNA3.0上。酶切体系分别为：(1)20ul体系pMD18-T-NP10ulHindIII0.6ulBamHI0.6ul10×KBuffer2ulH2O7.8ul32 （2）20ul体系pCDNA3.015ulHindIII0.6ulBamHI0.6ul10×KBuffer2ulH2O2.8ul37℃，酶切2h后胶回收所需片段，做下一步的连接，连接体系pMD18-T-NP双酶切后片段（约1400bp）7ulpCDNA3.0双酶切后片段（约5400bp）0.5ulT4DNA连接酶0.5ul5×buffer2ul22℃，连接15min，经转化、挑菌、摇菌、提质粒后，纯化后将pCDNA3.0-NP做酶切鉴定。纯化用天根的试剂盒来进行，步骤如下：（1）平衡吸附柱，向CP4吸附柱里加入500ul的平衡液BL，12000rpm，离心1min，弃去废液。（2）向粗提后的50ul质粒里加入250ul的溶液P1，吹打均匀。（3）继续加入250ul的溶液P2，轻轻上下颠倒数次。（4）继续加入300ul的溶液P3，轻轻上下颠倒6-8次，充分混匀后，12000rpm，离心10min。(5)取上清于过滤柱CS中，12000rpm，离心2min。（6）将收集管中的溶液加入平衡后的吸附柱中，12000rpm，离心1min，弃去废液。（7）向吸附柱里加入500ul的去蛋白液PD，12000rpm，离心1min，弃去废液。（8）继续向吸附柱里加入600ul的漂洗液PW，静止2min，12000rpm，离心1min，重复步骤（8），弃去废液。（9）将吸附柱CP4开盖离心2min，室温放置数分钟。（10）将吸附柱置于一新的EP管中，悬空滴加50-100ul的TB，室温静止2min，12000rpm，离心1min，重复步骤（10）。33 得到的纯化质粒可以直接做以下实验。同样的方法，不同的限制性内切酶，将pCDNA3.0-P连接好。两个辅助质粒的酶切验证体系:（1）10ul体系pCDNA3.0-NP5ulHindIII0.3ulBamHI0.3ul10×KBuffer1ulH2O3.7ul（2）10ul体系pCDNA3.0-P5ulNotI0.3ulBamHI0.3ul10×KBuffer0.5ulBSA1ulH2O3.2ul经过酶切正确后送往华大基因进行测序。2.2辅助质粒pMC18-CMV-L的构建(1)各引物设计从NCBI里下载参考序列JF950509,将参考序列和pCDNA3.0的序列导入primer5里进行序列分析，并添加合适的酶切位点，设计辅助质粒L所需的引物，交给华大基因合成。(2)PCR扩增特异性片段①以实验室保存的全长克隆cDNA为模板，原质粒稀释100倍，利用合成好的引物扩增L基因片段，由于L基因太长，分两段克隆。L基因的PCR体系如下（25ul）：模板（pMC18-M）1ulF1ul34 R1ul2×HiFiMix12.5ulH2O9.5ulPCR程序：94℃5min94℃30s30c52℃/60℃30s72℃4min72℃8min将扩增出来的特异性片段进行胶回收，待用。②以pCDNA3.0为模板，用合成好的引物，扩增出质粒的CMV的启动序列，体系为（25ul）：模板（pCDNA3.0）1ulETaq0.3uldNTP2ul10×Buffer2.5ulP上1ulP下1ulH2O17.2ulPCR程序94℃5min94℃45s30c58℃45s72℃1min72℃8min将扩增的CMV的启动序列胶回收待用。(3)扩增特异性片段连与pMD18-T上，鉴定将扩增出的L基因的两条片段及pCDNA3.0的CMV基因片段分别连与pMD18-T上，连接体系如下（10ul）35 目的片段4ulT载1ulSoulationI5ul16℃，连接过夜。连接转化后，经菌落PCR得出阳性菌落。挑菌摇菌，经LB培养液培养4-6h后，碱法提质粒，各片段经酶切鉴定，各酶切体系①pMD18-T-L1的酶切鉴定（10ul）pMD18-T-L13ulEcoRV0.3ul10×HBuffer1ulH2O5.7ul②pMD18-T-L2的酶切鉴定（10ul）pMD18-T-L23ulEcoRV0.3ulBamHI0.3ul10×KBuffer1ulH2O5.4ul酶切在37℃恒温培养箱里2h后鉴定。片段经初步酶切鉴定正确后，送往华大基因测序。(4)重组载体pMC18-CMV的构建及鉴定将pMD18-T-CMV与pMC18双酶切,酶切体系：①20ul体系：pMD18-T-CMV5ulSacII0.4ulSalI0.4ul10×TBuffer3ulBSA2ulH2O9.2ul②20ul体系：pMC1810ul36 SacII0.4ulSalI0.4ul10×TBuffer3ulBSA2ulH2O4.2ul37℃，酶切2h，胶回收所需片段，经行下一步的连接，连接体系为（10ul）：pMD18-T-CMV双酶切后片段（约1400bp）7ulpMC18双酶切后片段（约5300）0.5ulT4DNA连接酶0.5ul5×buffer2ul连接反应条件为22℃，15min，反应后，经转化，挑菌摇菌提质粒后，酶切鉴定，酶切体系为（10ul）：pMC18-CMV5ulSalI0.3ulSacII0.3ul10×TBuffer1.5ulBSA1ulH2O1.9ul37℃，2h后电泳检测。(5)辅助质粒pMC18-CMV-L的构建将pMD18-T-L1、pMD18-T-L2和pMC18-CMV分别用合适的酶切开，酶切分别为：①20ul体系：pMC18-CMV10ulHindIII0.6ulNotI0.6ul10×KBuffer1ulBSA2ulH2O5.8ul37 ②20ul体系：pMD18-T-L110ulSmaI0.6ulHindIII0.6ulVspI0.6ul10×TangoBuffer2ulH2O6.2ul③10ul体系：pMD18-T-L25ulSmaI0.5ulNotI0.5ul10×TBuffer1ulBSA2ulH2O11ul37℃，2h后，做胶回收，得到三条所需片段，做连接，连接体系为（10ul）：pMC18-CMV酶切后片段（约6600bp）2ulpMD18-T-L1酶切后片段（约2800bp）4ulpMD18-T-L2酶切后片段（约3800bp）2.5ulT4DNA连接酶0.5ul10×Buffer1ul22℃，连接15min后，经转化，挑菌摇菌后，提取质粒做酶切鉴定，检测结果。两组酶切体系如下：①10ul体系：pMC18-CMV-L5ulEcoRV0.3ul10×RBuffer1ulH2O3.7ul②10ul体系：38 pMC18-CMV-L5ulHindIII0.3ul10×RBuffer1ulH2O3.7ul37℃，酶切2h后，电泳检测。2.3各质粒共转染至发生细胞病变(1)BHK-21细胞的培养取实验室冻存的细胞复苏，复苏的具体过程：遵循细胞快融慢冻的原则，将细胞拿出来之后立马在37℃的水中融解，快速摇动冻存管至冰完全融化。随后，将细胞转移入细胞培养瓶里，培养6h后及时换液。转染的前一夜均匀铺板，可以分出梯度多铺几个孔，分别为50ul、100ul、150ul和200ul，第二天依细胞长势选择实验组。(2)转染及细胞传代等细胞长到70％-80％的时候可以经行转染，转染步骤如下：①脂质体制备：A取50ul的opti-MEM稀释2ul的脂质体2000，室温孵育5min。B取50ul的opti-MEM稀释0.8ug的质粒混合物。以下为各质粒的浓度及所取的量：pMC18-M（278.8ng/ul）1.5ulpN3-T7RNAP(688.2ng/ul)0.4ulpCDNA3.0-NP(581ng/ul)0.2ulpCDNA3.0-P(429ng/ul)0.2ulpMC18-CMV-L(867.1ng/ul)0.1ulC将A和B轻轻混匀，室温孵育20min②实验前细胞的处理：用500ul的无血清的培养液清洗两遍，再加入400ul的opti-MEM培养液。③将制备好的脂质体混合物轻轻滴加入24孔板里，十字型摇动，混匀，孵育4-6h后更换含血清的培养液，培养过夜。39 等细胞长满的时候经行传代，传代过程为：将细胞的代谢液收集起来，PBS洗两遍，胰酶消化1min，除去消化液，补加新的培养液，将细胞重悬起来，加入到新的60mm的一次性培养皿里，加入1ml的收集起来的细胞代谢液。传代至细胞状态发生变化。2.4子代病毒的鉴定(1)子代病毒RT-PCR的鉴定将发生病变的细胞取出300ul经行RT-PCR。同样使用的是TRzol裂解液来提取RNA，使用的是TaKaRa的PrimeScript™RTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒来得到模板来进行RT-PCR，两步法步骤如下：一步：体系（10ul）5×gDNAEraserBuffer2ulgDNAEraser1ultotalRNA6ulRNaseFreeH2O1ul体系配好后，室温放置5min（可以4℃保存），为下一步做好准备。二步：体系（20ul）Reactionsolutionfromstep110ul5×PrimeScriptBuffer24ulPrimeScriptRTEnzymeMixI1ulMasterMixRTRrimerMix1ul10ulRNaseFreedH2O4ul体系配好后，按一下程序进行：37℃15min85℃5sRT-PCR后，以cDNA为模板，利用合成的特异性引物经行PCR。特异性引物为F（4351-4372）：5'-TACCATCGCTAAATACAATCCC-3'，R（5064-5085）：5'-TTTCCAACTGCCACTGCTAACT-3'。PCR体系为（25ul）：40 cDNA(模板)3ulF（4351-4372）1ulR（5064-5085）1ulETaqVersion12.5ulH2O7.5ul程序为：98℃10s52℃30s30c72℃1min最后胶回收，将胶回收产物送往华大测序鉴定。(2)子代病毒血凝鉴定将拯救后的子代病毒先在9-11日龄的鸡胚内复壮，接鸡胚步骤如下：①选9一11日龄鸡胚，照蛋器照射，找出气室，在气室交界边缘以上约1mm处画一条横线，在此横线上缘并避开血管的一面0.5mm范围内作一标记此即为注射点。②在注射点周围先用碘伏消毒，再用75％的酒精消毒一遍，要求从内往外消毒。③用打孔器在注射点处打一小孔，勿损伤壳膜。④将鸡胚气室竖直向上放置，注入子代病毒1ml，接到尿囊腔中。⑤蜡油封口，鸡胚置37—38℃恒温培养箱内孵育培养。培养48-72h后收病毒，将鸡胚置于操作台上，先消毒，后拿镊子轻轻敲开气室以上的壳，轻轻晃一下，找出尿囊的位置，用一次性的注射器轻轻插入尿囊里，慢慢吸取尿囊液，直至吸不动为止。将收集的尿囊液做下一步的血凝实验，具体过程为：实验前先制备1％的鸡红细胞：①选取SPF鸡，翅静脉采血，每管抗凝管采5ml，采完后放在4℃，数小时后，观察是否凝结。②平衡后，2500rpm，离心10min，弃上清，用移液器将血细胞沉淀表面的薄膜吸净。41 ③用5倍血细胞泥的生理盐水洗血细胞，2000rpm，离心10min，重复洗5遍。④吸取1ml的血细胞泥，加入99ml的生理盐水，配成1％的红血球备用。红细胞血凝实验步骤：①取一块洁净的血凝板，一列孔中加入50ml的生理盐水。②取待测子代病毒液50ul加入第1孔，移液器充分混匀后取50ul加入第2孔，依次经行至11孔，轻轻混匀，弃去50ul，第12孔不加病毒，作为对照。③每孔加入1％的鸡红细胞各50ul，轻轻振荡3min，室温下放置15min，后每5min观察一次，直至1h，一般可以以生理盐水对照孔图像清晰出现为准。④结果判定：A红细胞在反应底部全部铺开为完全凝集。B红细胞在反应底部集为一个小红点为沉淀。C红细胞在反应底部为一小红点，四周为凝集的红细胞为不完全凝集。⑤当红细胞出现完全凝集的抗原的最高稀释度为该抗原的凝集价。同样平行实验，以强毒株广西-9做对照试验。3实验结果3.1辅助质粒pCDNA3.0-NP和pCDNA3.0-P的构建质粒pMD18-T-NP和pMD18-T-P分别经双酶切，再胶回收，连接、转化、酶切、测序鉴定，确认得到辅助质粒pCDNA3.0-NP(图2-1)和pCDNA3.0-P（图2-2）,测序结果见附录。42 1：HindIII和BamHI双酶切；2：15000Marker1：pcDNA3.0-NPdigestedwithHindIIIandBamHI；2：DL15000Marker图2-1pCDNA3.0-NP酶切鉴定Fig.2-1IdentificationofpCDNA3.0-NPwithrestrictionenzymedigestion1：BamHI和NotI双酶切；2：15000Marker1：pCDNA3.0-PdigestedwithBamHIandNotI；2：DL15000Marker图2-2pCDNA3.0-P酶切鉴定Fig.2-2IdentificationofpCDNA3.0-Pwithrestrictionenzymedigestion3.2辅助质粒pMC18-CMV-L的构建以全长cDNA和pCDNA3.0为参考序列，利用primer5设计的引物如表2-143 表2-1L基因各片段、pCDNA3.0基因的扩增引物Table2-1TheprimersforLgeneandpCDNA3.0引物酶切位点引物序列RestrictionPrimerenzymePrimersequencescuttingsiteL1上游（1-16)HindIII5'-CCCAAGCTTGCCACCATGGCGGGCTCCGGAC-3'L1下游（2886-2911）KpnI5'-CGGGGTACCAATCTCCATTTCCAGG-3'L2上游（2752-2770)5'-TCCCCCGGGTGAGTAACCTTCAATACT-3'L2下游（6593-6615）NotI5'-TAAGCGGCCGCTTAAGAGTCACAGTTACTATA-3'Pc上游（129-147）SalI5'-GCGTCGACATTTAAGCTACAACAAGG-3'Pc下游（1487-1505）SacII5'-AGGCCGCGGACTAAATCGGAACCCTAA-3'以pCDNA3.0为模板，利用本实验设计的特异性引物引物，扩增出了约1400bp的片段，胶回收图片如图2-3。1-5：CMV扩增片段胶回收；6：2000Marker1-5：segmentofCMV;6:2000Marker图2-3：CMV胶回收图片Fig.2-3:gelextractionofCMV回收片段后经连接、转化和酶切克隆于pMD18-T上，将构建好的pMD18-T-CMV和pMC18经双酶切后胶回收，图片见2-4。44 1-3:pMD18-T-CMV双酶切（SalI和SacII）；4：5000Marker；5-8：pMC18（SalI和SacII）图2-4：pMD18-T-CMV和pMC18双酶切胶回收图片将胶回收后的片段经连接转化，酶切分析后，确认获得了pMC18-CMV重组质粒（图2-5）。1:SalI和SacII双酶切；2：15000Marker1:pMC18-CMVdigestedwithSalIandSacII；2：DL15000Marker图2-5pMC18-CMV酶切鉴定Fig.2-5IdentificationofpMC18-CMVwithrestrictionenzymedigestion分别以全长cDNA为模板，分别扩增出约2900bp和3800bp的片段，先经连接、转化和酶切鉴定克隆于pMD18-T上并送往华大测序，测序结果见附录，后将pMD18-T-L1、pMD18-T-L2和pMC18-CMV酶切后胶回收，回收图片如图2-6。45 1-2：pMD18-T-L2双酶切（SmaI和NotI）；4-5：pMD18-T-L1双酶切（SmaI、HindIII和VspI）；6：15000Marker；7-8：pMC18-CMV双酶切（HindIII和NotI）1-2:pMD18-T-L2digestedwithSmaIandNotI；4-5：pMD18-T-L1digestedwithSmaIHindIIIandVspI；6：15000Marker；7-8：pMC18-CMVdigestedwithHindIIIandNotI图2-6：pMD18-T-L1、pMD18-T-L2和pMC18-CMV双酶切后胶回收图片后依次将LI和L2克隆于重组质粒pMC18-CMV上，最后酶切鉴定，确认获得pMC18-CMV-L（图2-7）。1:EcoRV酶切；2：HindIII酶切；3：15000Marker1:pCDNA3.0-pMC18-LdigestedwithEcoRV；2：pCDNA3.0-pMC18-LdigestedwithHindIII；3：DL15000Marker图2-7pMC18-CMV-L酶切鉴定Fig.2-7IdentificationofpMC18-CMV-Lwithrestrictionenzymedigestion46 3.3病毒子代病毒的鉴定（1）子代病毒RT-PCR鉴定转染后细胞传了5代，观察到细胞的变化。取细胞裂解液提取RNA，经行RT-PCR检查病毒核酸。分别以水、未反转录的RNA为对照，利用本实验中设计的引物PCR，只有以cDNA为模板的体系中出现了阳性片段，约740bp（图2-8）。将该片段胶回收经序列分析鉴定，与参考序列吻合，测序结果见附录。表明病毒拯救成功。1:2000Marker；2：阴性对照（以水为模板）；3：实验组（以cDNA为模板）；4：阴性对照（以RNA为模板）1：DL2000Marker；2：Negativecontrol（H2O）;3:experimentalgroup（cDNA）4:Negativecontrol（RNA）图2-8RT-PCR鉴定结果Fig.2-8TherescueofNDVMstrainbyRT-PCR（2）子代病毒血凝鉴定将子代病毒在9日龄的鸡胚内复壮后做血凝检测实验，强毒广西9株做对照试验，结果对照组1-7号为完全凝集，8和9号为不完全凝集，剩余的为沉淀，，而实验组没有结果，全部为沉淀。47 4分析讨论在辅助质粒构建的过程中出现了很多的问题，尤其是在辅助质粒L的构建上，本身基因L长约6600bp，如果一次性克隆出来不能保证没有突变，而且直接将其克隆到真核表达载体上有些困难，试了几次都没有成功。所以我们将其分成两段克隆，另外，还有一个问题就是真核表达载体pCDNA3.0本身长还不到6000bp，其容载量相对来说是有限的，这样我们准备将其改造一下。因为我们的全长cDNA已经克隆到pMC18上了，而全长约为15000bp，这就说明pMC18的容载量很大，就利用它的这一优点来改造载体，将真核表达载体的CMV启动序列克隆到pMC18上，这样新的载体容载量就大了。另一个大的问题是单独将L1或L2接到新载体上并没有成功，所以我们尝试着将两个片段同时往上连，这样做了，结果克隆成功了。以后我们遇到这种多片段连接的时候也可以尝试。在NDV的拯救过程中，一般来讲会出现细胞病变，这是特征性的变化，出现了病变才可以进行以后的进一步检测，包括分子水平上的RT-PCR检测，这是最准确的检测方法。一旦出现了阳性结果，证明该病毒初步鉴定是拯救成功的。接下来就是一些宏观指标，血凝实验和血凝抑制实验、动力学曲线的实验以及毒力指标的实验鉴定，通过这些实验来检测拯救出来的病毒的效价，从而与原病毒进行比较，做进一步的分析和实验。只有全部的实验都出现了阳性结果才能真正的说明病毒拯救完全的成功。我们的实验中，虽然在分子水平上反复检测到拯救的Muketeswar子代病毒，但血凝实验没有检测到子代病毒的存在，分析原因，可能是病毒滴度不足所致，因此，重新分析了全长cDNA的序列，发现了几个特异性的碱基突变，而且会导致氨基酸的改变。如下表格所示：蛋白名称起始位点突变数目突变位点突变前氨基酸突变后氨基酸NP122-15911255R（碱性）M（含硫）P1887-30740M3290-438423090N（酰胺类）D（酸性）3144I（脂肪族）T（羟基类）F4544-620534929K（碱性）Q（酰胺类）5214K（碱性）E（酸性）6099T（羟基类）A（脂肪族）HN6412-812716432T（羟基类）A（脂肪族）L8381-14995212732Y（芳香族）F（芳香族）13284L（碱性）P（亚氨基酸类）48 在这些突变的氨基酸中，来逐一分析一下，NP蛋白里的突变由R变成M，R为碱性氨基酸，而M为含硫的脂肪族氨基酸，极性中性氨基酸，这样看来极性发生了变化，很有可能会影响到整个结构的性质。M蛋白里的两组氨基酸突变相对来说更安全一些，D和N同为酸性氨基酸，I和T也为同族的脂肪族氨基酸，性质差距小，可能不会影响到结构。下一组，F蛋白里的前两组突变更危险一些，K为碱性氨基酸，Q为酸性氨基酸，E也为酸性氨基酸，差距大，更能影响整体结构。T和A为同族脂肪族氨基酸，Y和F同为芳香族氨基酸，这两组安全系数会高点，对整体结构影响小。最后一组的L和P,前者为碱性的氨基酸，后者为亚氨基酸类的杂环氨基酸，这个氨基酸为个性的氨基酸，这个变化也大一些，很有可能影响到结构。在我们知道的镰刀贫血症的发病机理中，只有一个氨基酸突变是发病的原因，所以我们怀疑在这些氨基酸突变会影响到全长的复制，导致的是病毒滴度太低，无法完成正常的工作，这样就使得血凝实验没有结果。我们的下一步实验就是要从这几个突变点入手，如果可以进一步的研究到这几个突变真正影响到了实验的结果，这对于我们的研究会带来突破性的进展。目前，对于负义RNA病毒的遗传多样性的原因我们认为有两种，基因突变和同源重组，而大家多数认为后者发生的几率还是很低的，但是也有研究已经分析得到同源重组确实存在于负义RNA病毒中。同源重组也是导致NDV遗传多样性的分子机制之一，对于这个观点目前来看还缺乏充分的实验室依据，而我们的研究旨在建立研究NDV同源重组的实验室系统。这个研究的首要前提就是摸索出拯救病毒的实验室条件，所以本论文的研究是基础工作。只有成功拯救出活病毒，才能在这个基础上对全长的cDNA进行各种改造，拯救各种缺失病毒，从而进一步为同源重组的实验室证据做出贡献。反向遗传学的运用已经较为普遍，尤其在病毒的研究中更为明显，方便我们从分子水平上对病毒进行基因改造。反向遗传学已经运用到NDV上，可以在cDNA水平上进行特定基因改造，也可以从分子水平上进行疫苗改造，这都将会给家禽产业带来巨大收益。总之，本研究构建了三个辅助质粒，经转染、细胞传代，观察到了细胞的变化，又经RT-PCR，得到阳性片段，测序分析，从分子水平上鉴定拯救成功，初步建立了完整的反向遗传学的实验室体系，为以后的研究奠定了基础。49 第三部分结论（1）在广西-9的全长测序中，共得到8条片段的测序结果，我们利用DNAMAN软件将它们组合起来，得到全长测序结果，分析发现其基因组上并不存在重组信号。（2）病毒M株的拯救过程中，我们成功构建了辅助质粒pCDNA3.0-NP、pCDNA3.0-P和pMC18-CMV-L，，并且成功拯救了Muketeswar病毒株。50 附录附录5-1：质粒图谱(1)pMD18-T（Takara）(2)pMC18（实验室储存）(3)pCDNA3.0（实验室储存）51 (4)pMC18-M（实验室储存）1F1-11-pMC1820737bpMukteswar全长cDNA52 (5)pMD18-T-NP（实验室储存）(6)pMD18-T-P（实验室储存）附录5-2：测序结果（1）广西-9病毒各测序结果pMD18-T-1的测序结果：ACGACGGCAGTGCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTACCAAACAGAGAATCTGTGAGATGCGATAAAAGGCGAAGAAGCAATCGAGATCGTACGGGTAGAAGGTGTGAACCCCGAGCGCGAGGCCGAAGCCTGAACTTGAGGGAACCTTCTACCGATATGTCGTCTGTTTTTGACGAATACGAGCAGCTCCTCGCTGCCCAGACCCGCCCTAACGGAACTCATGGAGGGGGAGAGAAAGGGAGCACTTTAAAAGTTGAGGTCCCAGTATTTACCCTAAACAGTGATGATCCAGAGGA53 TAGATGGAATTTTGCTGTATTCTGTCTCCGGATTGCTGTTAGCGAGGATGCCAACAAACCACTCAGGCAAGGTGCTCTTATATCCCTCTTATGCTCTCATTCTCAGGTGATGAGAAACCATGTTGCCCTTGCAGGGAAACAGAATGAAGCCACACTGGCTGTTCTTGAGATCGATGGTTTTGCTAACAATGTGCCCCAGTTCAACAATAGGAGTGGAGTGTCTGAGGAGAGAGCACAGAGATTCATGGTAATCGCAGGATCTCTTCCTCGGGCGTGCAGTAATGGTACTCCGTTTGTCACAGCTGGGGTTGAAGATGATGCACCAGAAGATATCACTGACACTCTGGAAAGAATCCTATCTATCCAAGTTCAGGTATGGGTCACAGTAGCAAAGGCCATGACTGCATATGAGACAGCAGATGAGTCAGAAACAAGAAGAATAAATAAGTATATGCAGCAAGGTAGAGTTCAGAAGAAATACATCCTTCATCCTGTATGCAGGAGTGCAATTCAACTCACAATCAGACATTCTCTGGCAGTCCGTATTTTCCTAGTTAGTGAGCTCAAGAGGGGCCGCAATACAGCAGGTGGGAGCTCTACATATTACAACTTGGTCGGGGATGTAGACTCATACATCAGAAACACCGGGCTTACTGCATTTTTCCTAACACTCAAATATGGAATCAATACCAAGACGTCAGCTCTCGCACTCAGCAGCCTCACAGGTGATATCCAAAAAATGAAACAGCTCATGCGTTTATATCGGATGAAAGGTGAAAATGCACCATACATGACATTGTTAGGTGACAGTGACCAGATGAGCTTTGCACCAGCTGAGTATGCACAACTCTATTCTTTGCCATGGGCATGGCATCAGTCTTAGATAAGGGAACTGGCAAGTACCAATTCGCCAGGGACTTTATGAGCACATCATTCTGGAGACTTGGAGTAGAGTATGCTCAGGCTCAGGGAAGTAGCATCAATGAGGATATGGCTGCTGAGCTAAAACTAACCCCGGCAGCAAGGAGAGGCCTGGCAGCTGCTGCCCAACGAGTATCTGAAGAAATCGGCAGCGTGGACATTCCTACTCAACAGGCGGGAGTCCTCACCGGGCTCAGTGACGAAAACCCCCGAACTCCACAGGGCGGATCAAACAAGCCGCAAGGGCAACCAGATGCCGGGGATGGGGAGACCCAATTTTTGGATTTTATGAGAGCAGTGGCGAACAGCATGCGGGAAGCGCCAAATCCTGCACAGAGCACCACCCATCCAGAGCCTCCCCCAACCCCTGGGGCATCCCAAGACAACGACACTGACTGGGGGTACTGATCGACAACACCCAGCCTGCCTTCACAGGATCGCACCAAACCCTCCGCCCAAAACCCCCCCACACTCCTCGACCCACAACCCCGCACGACCACACCAACAAAAACTCCCCCCCACCCTCTCCCCCACTCCCAGCCACACGATCCCACCCACCCGGGACAACACAGGCACAGCTCAGTTCGTCAACAATCCGCCCAGAGCCCAAGGAATTAGAAAAAAATACGGGTAGAAGAGAGACATCCAGAGACCAGGACGGGTCACCGAGTTCTCTGTTCTCCCTTCTACCCAGTGAACTAGGGTGAAGATGGCCACTTTTACAGATGCGGAGATAGATGACATATTTGAGACCAGTGGGACTGTCATTGACAGCATAATTACGGCCCAGGGCAAATCAGCTGAGACCGTCGGAAGGAGCGCGATCCCGCAGGGCAAGACCAAAGCTCTAAGCACAGCATGGGAGAAGCACGGGAGTGTCCAGCCACACGCTAGTCAGGACGCCTCTGACCAACAAGACGGAACGGAAAAACAGCCATCCACACCTGAGCAGGCGACTCTACACAACAACCCGCCGATCACATCCACTGAACCGCCTCCCACTCAGGCCGCAAGCGAGACCAGCGACACACAGCTCAAGACCGGAGCAAGCAACTCCCTTCTGTCCATGCTCGACAAACTGAGCAATAAATCGTCCAATGCTAAAAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATCGTAATCAGTCATGTCGC注：斜体为病毒的起始端pMD18-T-2的测序结果：GTGCGGATCGACGGCAGTGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCCGACGATTTTTGCCACAACCATACAGCTTTGCAGCACCCGAGGTGCCTGCACTACTGAGAAGACTATTCTCTCAGTGTTAGTTGCACTCTTCTTGCAAGTTATCACCATGGTGAGGCAGGCTCTCGCCAGCTCAACAAGATCTCCGTCGTTCGGGACACTCCCTAAGCAGAGCATTGCGGAAGAGAGTAGCTCGTGCCTGGGATTGTCATTGATCACACCGACGGTGGCTTCTTCATTCCCAATTTGAAAGATGAACCCGTAGGTGGTGATGAATACCGAGTCTTCCTTACTGTCTGTCCACGAATCAAGACGCTGGATCCTGTATTGTGGGGTGATTTGCTTCTTCCCGTCTCCTGTGTCTTGTAAGACAATCGGAAATGCTA54 ACAGGCTGCTGGAAGGGAGGGCAGAATCAAAGTACAGCCCGATTGTCCTGGATGAGTCCATTTTGGTGCAATCAAGGCACTTTGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTTCTAATGCTGCTGGATTGGTTGCAGTTGCGCAGTCATTCGGGGGTTTGGGGGGGGCGAGAGAAGGCTGTTGTTTTGGGTGTTGAAGCGTGGATTAGCGAGGGGGGGCCCCCGAGAGATTCCGTGTGATGCTGAAGTGACGGGAGCCTGTTATGAGTTGTGATGGCCATCAACCATTCAGCGCAAGGCGTTTGATCTTCCTGATCTCTTCAATTGACCTGGCTGCGTCTAGCTTGCTCAGGAGCTTAGCCGAGGAGCTTGGATGCATCGGGCGCGAGGTGATTAATGCGCGGACAGTGTCTTTCTCCACTCCCATGTCAGGCCCGCTTGCAGTGGCAGACTTAATCAATTCGGAGGGGTGCTGCACCGGTTGTGAGAGTTTATTGAGCGTCATTTCACCCCCTTGTGTCACGTAAGGAGATGGGTCTCCAGGGCCTGAAACTAGGACTGGGTGGGATCGGGCTACTGCCCGGAGATCACTTAAGGATGAAACGTTAGCACAACCAGGGTCCAGAATTTTCATCATGCCTAAGTTAGCTTCCATAATCGCAACAGATGTCTTGAGCTGTTGGATTTCAGATCGCATCACAGGAATGGAGGATGTCTGTTTCAAGACTAGGTCCAGCTGATGATCAACTTTACTTACCTTTTGTGATAATGCCTCCATCATAGACATCATCGCCTGCGCAAAGTCGGCAGGTAGCTGGACACGATCCACAGGTACAGGAGTATTGTCTTGGCTCTGCCCTGACTGGGGCGCATGAGGGGTTGCACCAGCTGATGGTTGTGACTCCTTCCGTTGTCCATGATATGCTGTGTTCTCGTCTGTGTTCCGGTTCCCAGGGACGGCCTTGGCCTGGTGCTGCGGTCTTCCCTGGTTGCTTCCATAGCTCGGCTGGTTCCCGTGTTGTTGGGCCGGAGGTTGGTGATGCCCTTCTTGGGGGCCCGTCCATAGGCCCTTTTTAGCATTGGACGATTTATTGCTCAGTTTGTCGAGCATGGACAGAAGGGAGTTGCTTGCTCCGGTCTTGAGCTGTGTGTCGCTGGTCTCGCTTGCGGCCTGAGTGGGAGGCGGTTCAGTGGATGTGATCGGCGGGTTGTTGTGTAGAGTCGCCTGCTCAGGTGTGGATGGCTGTTTTTCCGTTCCGTCTTGTTGGTCAGAGGCGTCCTGACTAGCGTGTGGCTGGACACTCCCGTGCTTCTCCCATGCTGTGCTTAGAGCTTTGGTCTTGCCCTGCGGGATCGCGCTCCTTCCGACGGTCTCAGCTGATTTGCCCTGGGCCGTAATTATGCTGTCAATGACAGTCCCACTGGTCTCAAATATGTCATCTATCTCCGCATCTGTAAAAGTGGCCATCTTCACCCTAGTTCACTGGGTAGAAGGGAGAACAGAGAACTCGGTGACCCGTCCTGGTCTCTGGATGTCTCTCTTCTACCCGTATTTTTTTCTAATTCCTTGGGCTCTGGGCGGATTGTTGACGAACTGAGCTGTGCCTGTGTTGTCGATCAGTACCCCCAGTCAGTGTCGTTGTCTTGGGATGCAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATCGTAATCAGTCATGTCCGTpMD18-T-3的测序结果：CGAGCTCGGTACCGGGGATCCTCTAGAGATTGCCAAGAGGAGTGAGCAAAGTAGTCAGTGTTCTGTTATATGCCTCTAATGGGGCTTTTGCACACGCCTCCTTATCTCTGGGCATATTCGGGAGCAACTTGACTATGATTGACCCTGTCTGAGACGAGGTGTATACATTGACTGCCTTATCCCCTGTTACTACAATTCCTGCAGCTGCAAGAGGCCTGCCGTCAAGGGAGCTTGTCAGACGGATACAGCTCAATATCAGCATAATCCGAATGATCAGCATTAGAGGTGCTGGGCTCCTGGTAGAAGGTTTGGATCCCATATTGTGTCCTGAATGTGCCGGTCGGGATCCAGACTCTTCTACCCGTGTTTTTTCTAATTTGCTAGACAGGTGAACTAACTATAAGCAGTCGAGATGGATCATTATCTGGTTTCATGGTGATTAAGGGAAGCAGGTGAACTGCAGTCTTAGGGATGCAACTTATTTCCTGAAAGGATTGTATTTAGCAATGGCGTGCCTCCTCTCTATCTTAGTGGAGGTTACCTCATGATCAGCGGTCACCGCGACAGCACGCTGAGTGCCGGCTTGAATGATGACTTTCACACTCCGCAGGTGCGCGGTTTGGCTCCAGAGTATCTTGGCAACCTGGGGAGAGGCATTTGCTATAGGATAGCAGGCTGTCCCACTGCTAGAGAAGAAAGGAGCAAGTAGCTTAGTCCGTGCACCTCTCGCCTTCACAAGCACAGAGGGTCCGAGCACATCACTGAGCCCGACAGATAGATTGAGTCTCCTTATCTTTTCCTCTATCTTGTCAAATGTCACTTTCTTTCCCTTCTTATCTACAGTGGACATAAGCCCGATATGCAGAAAAAGATTCGCATAGTATCCGCTATCGGACTTAGAAAGGGATTT55 GACTAACGGGCTCTTCGGATCCACGTCCACATCAATCGTGACATTGAGCGCAAGATTGTACAGGCTTGAGCCAGACACTTTCAATACTGCAGTTGGGATCCTGTAGACATCCCTTCTCGGCACCACGGTCAAAGAGACAAAATTCACTTTATACTCTAGGGTTCCGCTCCCAGGGATCTTTTCTGGCGCCTTCACATGCTTCACTGCATTCACTGATGAGTACCTATTTGACACAACCATACAGCTTTGCAGCACCCGAGGTGCCTGCACTACTGAGAAGACTATTCTCTCAGTGTTAGTTGCACTCTTCTTGCAAGTTATCACCATGGTGAGGCAGGCTCTCGCCAGCTCAACAAGATCTCCGTCGTTCGGGACACTCCCTAAGCAGAGCATTGCGGAAGAGAGTAGCTCGTGCCTGGGATTGTCATTGATCACACCGACGGTGGCTTCTTCATTCCCAATTTGAAAGATGAACCCGTAGGTGGTGATGAATACCGAGTCTTCCTTACTGTCTGTCCACGAATCAAGACGCTGGATCCTGTATTGTGGGGTGATTTGCTTCTTCCCGTCTCCTGTGTCTTGTAAGACAATCGGAAATGCTAACAGGCTGCTGGAAGGGAGGGCAGAATCAAAGTACAGCCCGATTGTCCTGGATGAGTCCATTTTGGTGCAATCAAGGCACTTTGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTTCTAATGCTGCTGGATTGGTTGCAGTTGTGCAGTCATTCGGGGGTTTGGGGGGGGCGAGAGAAGGCTGTTGTTTGGGGTGTAATCGTCGACTGCAGCTACGGCpMD18-T-4的测序结果：TCAGCTCGGTACCGGGGATCCTCTAGAGATTAGATTCAGTGTTTAGTAGCGCCAGCGGGGATTCAAGAGCCACCTGCTTGTATATCCTATCTATCACATCTTGACTTGAACTGAGTAAAGACGTAACCTTATCTTCTGTCTCGGAGATCACAGTAGATATGCCTGCGAGATCGTGCGGCGTACTGGCCCCCATGCTGTATGCCAGGGCAGCTGCGGAGATAGCTAGAGTCATTACTATTAAAAGTAAGACTGCGATCCGGAAAACCAGGCGCCATGTGTTCTTTGCTTCTCTTTCCTCATTCTCCAGCACGACTCTGTTAACCGCGCGGTCCATGATCGACTCTTGTTGCTGGTGATGTGGTAGAACGGATGCTGTGAAGCCTAATTTTCGATTGAAGGGTGGCTCCTCTAACCGTTCTACCCGTGTATTGCTCTTTGGTTGCTTGTTCCCAATAGTTTTTTCTTAAGTCTTCTACTTGGCAGGTTATCGGAATTGACACACAGGCTGCTGTTGGGTATATATCCACCTCTTATCTGCATTCATGCTCTTGTAGTGGCTCTCATCTGATCGAGGGTATTATTCCCAAGCCATAGCAAGGTCTTTTGTTGTGCCTTCTGTTTGTACATCAGGTAACACGCTAAAACCAGACTAAGTGCACCGAAAATTAAAGAAATGACAGTTAGAACAATATAGGTAATGAGAGCAGATGTGCTGGTTAGTCTGACATTGACTTTTTCTAGCTTGCTGTTGCTTTCTGCCAACCTATCCAAGGCATTGCTGATTGAATTGTTGACGTTTCCGAGTTCAGTTGATATATCAAGATTGCCTGTCACGATGACTTGAGAATCTAGTATTGAGATGTTCTTTTGATAAGTTGCATCAAATTCCCCACTGAGCCTCAGAGTTATCCCGTCTAATGATAAGACATTGCATGAATGTCTATCTATCAGGGATACAGCTTCTCCATAATCTTGCGATATGATACCAGGGGGGTCTGTACATCTACATGTTGTTATCTTACAATTGGCAATAACTGAGCCTTTAAGGGCCATATACGGCGTAGTGAGTGCGCCTTCAGTCTTTGAATACATGCAAGCTGATGTGTTGCCGCTCAAACAGGAATAAATACCTGGGGACATGGGGAATGTCACTATTCTAGTGCAGTATAAATCCAGATCGGACTCTATACAATATGAGGTGTCAAGCTCTTCTATCACAGAACCGACTTGTGTCACTACTTTCGGGACAAGTGCTGAGGCATATCCTTTGGTTGTACTTACAGATAAGGTCTCCAAATAGGTGGCACGCATATTATTTAAGTTCCCGACTGAGGGCAAATTCACTTGTATGCCCAAGAGTTGAGTCTGTGAGTCATACAGTATAGGGTAACCAGTGATCAGGCCGCTACCAGTTAATGAGCTGAGTTGATTGTTCCCTATACCTAACTTAGTTAATAAGTAATCCATATTGCCACCAGCTAAATTATAAAGTGCCTGGATGGTCAGCTGAGTTAATGCAGGGGAGGTGATCTGTGGCCCGAATACTGTAGTCAATTCAGTTAGGTATAGGTTGAGTTCTACACCAACCTGTTGTGTGATTTTTATACAGTCCAATTCTCGCGCCGTATTATTAAACTGGTCATTGACAAATTGCTGCATCTTCCCAACTGCCACTGATAGTTGTGATAATCCGTCGGTGACTTCATGCACAGCTTCATTGGTTGCAGCAATGCTCTCCTTAAGCCGGAGGATGTTGGCGGCATTC56 TGGTTGGCTTGTATTAGGGCCGCAGCTGCTGTTATCTGTGCCGCCGTTGCAACCCCAAGAGCTACACTGCCAATAACAGCACCTATAAAGCGTTTTTGTCTCCTTCCTCCAGACGTGGACACAGACCCTTGGATCTTGCGGATGGAGTCGCCAAGAGGAGTGAGCAAAGTAGTCAGTGTTCTGTTATATGCCTCTAATGGGGCTTTTGCACACGCCTCCTTATCTCTGGGCATATTCGGGAGCAACTTGACTATGATTGACCCTGTCTGAGACGAGGTGTATACATTGACTGCCTTATCCCCTGTTACTACAATTCCTGCAGCTGCAAGAGGCCTGCCGTCAAGGGAGCTTGTCAGACGGATACAGCTCAATATCAGCATAATCCGAATGATCAGCATTAGAGGTGCTGGGCTCCTGGTAGAAGGTTTGGATCCCATATTGTGTCCTGAATGTGCCGGTCGGGATCCAGACTCTTCTACCCGTGTTTTTTCTAATTTGCTAGACAGGTGAACTAACTATAAGCAGTCGAGATGGATCATTATCTGGTTTCATGGTGATTAAGGGAAGCAGGTGAACTGCAGTCTTAGGGATGCAACTTATTTCCTGAAAGGATTGTATTTAGCAATGGCGTGCCTCCTCTCTATCTTAGTGGAGGTTACCTCATGATCAGCGGTCACTGCGACAGCACGCTGAGTGCCGGCTTGAATGATGACTTTCACACTCCGCAGGTGCGCGGTTTGGCTCCAGAGTATCTTGGCAACCTGGGGAGAGGCATTTGCTATAGGATAGCAGGCTGTCCCACTGCTAGAGAAGAAAGGAGCGAAGTAGCTTAGTCCGTGCACCTCTCGCCTTCACAAGCACAGAGGGTCCGAGCACATCACTGAGCCCGACAGATAGATTGAGTCTCCTTATCTTTCCTCTATAATCGTCGACTGCAGCTACGCpMD18-T-5的测序结果：TCGGTACCGGGGATCCTCTAGAGATTAGTCTGGTTTTAGCGTGTTACCTGATGTACAAACAGAAGGCACAACAAAAGACCTTGCTATGGCTTGGGAATAATACCCTCGATCAGATGAGAGCCACTACAAGAGCATGAATGCAGATAAGAGGTGGATATATACCCAACAGCAGCCTGTGTGTCAATTCCGATAACCTGTCAAGTAGAAGACTTAAGAAAAAACTATTGGGAACAAGCAACCAAAGAGCAATACACGGGTAGAACGGTCAGAGGAGCCACCCTTCAATCGAAAATTAGGCTTCACAGCATCCGTTCTACCACATCACCAGCAACAAGAGTCGATCATGGACCGCGCGGTTAACAGAGTCGTGCTGGAGAATGAGGAAAGAGAAGCAAAGAACACATGGCGCCTGGTTTTCCGGATCGCAGTCTTACTTTTAATAGTAATGACTCTAGCTATCTCCGCAGCTGCCCTGGCATACAGCATGGGGGCCAGTACGCCGCACGATCTCGCAGGCATATCTACTGTGATCTCCGAGACAGAAGATAAGGTTACGTCTTTACTCAGTTCAAGTCAAGATGTGATAGATAGGATATACAAGCAGGTGGCTCTTGAATCCCCGCTGGCGCTACTAAACACTGAATCTATAATTATGAATGCAATAACCTCTCTTTCTTATCAAATTAACGAGGCTGCGAACAATAGCGGATGTGGGGCGCCTGTTCATGACCCAGATTATATCGGGGGGATAGGCAAAGAACTCATAGTGGACGACATCAGTGATGTCACATCATTTTATCCTTCTGCATATCAAGAACACTTGAATTTTATCCCGGCGCCTACTACAGGATCCGGTTGCACTCGGATACCCTCATTTGACATGAGCACCACCCATTATTGTTATACTCACAATGTGATACTATCCGGTTGCAGAGATCACTCACACTCACATCAATACTTAGCACTTGGTGTGCTTCGGACATCTGCAACAGGGAGGGTATTCTTTTCTACTCTGCGCTCCATCAATTTAGATGACACCCAAAATCGGAAGTCCTGCAGTGTGAGTGCAACCCCTTTAGGTTGTGATATGCTGTGCTCTAAGGTCACAGGGACTGAAGAGGAGGATTACAAGTCAGTTGCCCCCACATCAATGGTGCACGGAAGGCTAGGATTTGACGGTCAATACCATGAGAAGGACTTAGACACCACGATCTTATTTAAGGATTGGGTGGCAAATTACCCAGGAGTGGGAGGAGGGTCTTTTATTGACGACCGTGTATGGTTCCCAGTTTACGGAGGGCTCAAACCCAATTCACCCAGTGACACTGCACAAGAAGGGAAATATGTAATATACAAGCGCCATAACAACACATGCCCCGATGGACAAGATTACCAAATTCGGATGGCTAAGTCTTCATATAAGCCCGGGCGATTTGGTGGAAAGCGCGTACAGCAAGCCATCTTATCCATCAAAGTGTCAACATCCTTGGGTAAGGACCCGGTGCTGACTATTCCACCTAATACAGTCACGCTCATGGGAGCCGAAGGCAGGATCCTCACAGTAGGGACATCTCACTTCTTGTACCAACGAGGGTCTTCATATTTCTCCCCTGCCTTATTATATCCCAT57 GACAGTAAATAACAAAACGGCTACACTCCATCGTCCTTATACGTTTAATGCTTTCACTCGGCCAGGTAGTGTCCCTTGTCAGGCATCAGCAAGATGCCCCAACTCATGCATCACTGGGGTCTACACTGATCCATATCCCTTAATCTTCTATAGGAATCATACTCTACGAGGGGTCTTCGGGACGATGCTTGATGATGAACAAGCGAGACTTAACCCCGTATCTGCAGTATTCGACAACATATCCCGCAGTCGTGTCACCCGGGTGAGTTCAAGCAACACCAAGGCAGCATACACGACATCGACATGTTTTAAAGTTGTCAAGACTAATAAAGCTTATTGTCTTAGTATTGCAGAAATATCCAATACCCTATTCGGGGAATTTAGGATCGTTCCCTTACTAGTTGAGATCCTCAAGGATGATAGAGTTTAAGAAGTTAGACTTGGCCGATTGAGCCAATCATAGGATGGTTGGGAAGACGACACCGCACCAATCAGCTCTCACAATGCTTAGAGTCAAGCTGAATATTAACATAAGTCAGGATCCCATGTTGTTGGGCAGCCACAATCCGACAATGCTGACATGATTATTCTGAGTCCCGCCCACTGTCACTTTATTAAGAAAAAATACAAAAAACAATGAGATATAAGGGAAAACGACCAACAGGAGAGAGCACGGGTAGGACATGGCGGGCTCCGGTCCCGAAAGGGCAGAGCACCAGATCATCCTACCAGAGTCACATCTATCCTCTCCATTAGTCAAGCACAAATTGCTATACTACTGGAAATTGACTGGGCTACCGCTTCCTGATGAATGCGACTTTGATCATCTCATTATCAGCAGGCAATGGAAGAGAATACTGGAGTCGGCCACTCCTGACACAGAGAGAATGATAAAACTCGGGCAATCGTCGACTGCAGCTACGGpMD18-T-6的测序结果：GCAGTCGACGATTAGGATGGTTGGGAAGACGACACCGCACCAATCAGCTCTCACAATGCTTAGAGTCAAGCTGAATATTAACATAAGTCAGGATCCCATGTTGTTGGGCAGCCACAATCCGACAATGCTGACATGATTATTCTGAGTCCCGCCCACTGTCACTTTATTAAGAAAAAATACAAAAAACAATGAGATATAAGGGAAAACGACCAACAGGAGAGAGCACGGGTAGGACATGGCGGGCTCCGGTCCCGAAAGGGCAGAGCACCAGATCATCCTACCAGAGTCACATCTATCCTCTCCATTAGTCAAGCACAAATTGCTATACTACTGGAAATTGACTGGGCTACCGCTTCCTGATGAATGCGACTTTGATCATCTCATTATCAGCAGGCAATGGAAGAGAATACTGGAGTCGGCCACTCCTGACACAGAGAGAATGATAAAACTCGGGCGGGCAGTGCACCAGACTCTCAACCACAGTTCCAAGATAACCGGAGTGCTCCATCCCAGGTGTTTAGAAGGACTGGCTAGTATTGAGGTCCCTGATTCAACTAACAAATTCCGGAAGATTGAAAAGAAGATCCAGATTCACAACACAAGGTATGGAGACCTGTTCACAAAGCTGTGCACGCATGTTGAGAAGAAATTGCTAGGATCATCCCGGTCTAATAATGTCTCACGATCAGAGGAATTCAGCAGCATCCGTACAGATCCGGCATTTTGGTTTCACTCAAAATGGTCCAGAGCCAAGTTCGCGTGGCTCCATATAAAACAAGTCCAAAGGCATCTGATTGTAGCAGCAAGGACAAGGTCTGCAGTCAACAAGTTAGTAACATTAAGTCATAAGATAGGCCGCGTCTTTGTTACTCCTGAGCTTGTCATTGTGACACATACAGATGAGAACAAGTTCACATGCCTCACCCAGGAACTTGTATTGATGTATGCGGATATGCTGGAAGGCAGGGACATGGTCAATATAATATCTTCTACAGCAGCTCATCTCAGAAACCTATCCGAGAAAATTGATGATGTTCTGCGGCTGGTAGATGCTCTGGCAAAGGACTTAGGTAATCAAGTCTATGATGTTGTAGCATTGATGGAGGGATTCGCGTACGGTGCCGTTCAGCTGCTTGAGCCATCAGGTACATTTGCAGGAGATTTTTTTGCATTTAACCTACAGGAGCTCAAAGACACTTTAATCGAACTTCTCCCAAATAATATAGCGGAATCAGTAACTCACGCTATTGCCACTGTATTCTCCGGCTTAGAACAGAATCAAGCAGCTGAGATGTTGTGCTTGCTGCGTTTGTGGGGCCACCCATTGCTCGAGTCTCGTAGTGCAGCAAGAGCAGTCAGGAGCCAGATGTGCGCACCAAAGATGGTAGACTTCGATATGATCCTCCAGGTATTATCTTTCTTTAAAGGAACAATCATCAATGGATACAGAAAGAAGAACTCAGGTGTGTGGCCGCGTGTCAAAGTAGATACAATATACGGGAATATCATTGGGCAGCTACATGCTGATTCAGCAGAGATCTCACATGATGTCATGTTGAGAGAGTACAAGAGTTTATCTGCTCTTGAATTTGAGCCATGTATAGATTATGACCCTGTTACCAATCTAA58 GCATGTTCCTAAAAGACAAGGCAATCGCACATCCTAGTGATAACTGGCTCGCCTCATTTAGGCGGAACCTGCTCTCTGAGGACCAGAAGAAACAGATAAAAGAGGCAACTTCAACTAACCGCCTCCTGATAGAGTTCTTAGAATCAAATGATTTTGATCCATATAAAGAAATGGAATACCTGACAACCCTCGAGTACCTAAGAGATGACAGTGTGGCGGTATCGTACTCACTCAAAGAGAAAGAGGTGAAAGTGAATGGGCGGATTTTTGCTAAGTTAACAAAGAAACTAAGGAACTGCCAGGTAATGGCAGAAGGAATTCTAGCTGACCAGATTGCACCTTTCTTTCAGGGAAATGGGGTCATTCAAGATAGCATATCCTTGACAAAGAGTATGTTAGCGATGAGTCAACTGTCCTTTAACAGCAATAAGAAACGTGTCACTGACTGCAAGGAGAGGGTTTCCTCAAACCGCAATCATGATCCGAAGAGCAAGAATCGTAGAAGAGTTGCCACTTTTATCACGACTGACCTACAAAAGTATTGTCTTAACTGGAGATATCAGACAGTCAAACTATTCGCCCATGCTATCAATCAGCTGATGGGCCTACCTCATTTCTTTGAGTGGATCCATCTTAGGCTGATGGACACTACAATGTTTGTAGGGGATCCTTTCAATCCTCCAAGTGACCCGACTGACTGTGATCTATCGAGAGTCCCAAATGATGACATATATATTGTCAGTGCTAGAGGGGGGCATTGAGGGACTCTGCCAGAAGCTATGGACGATGATCTCAATTGCTGCAATCCAACTTGCTGCAGCAAGATCTCATTGTCGAGTTGCCTGCATGGTACAAGGTGACAATCAAGTAATAGCTGTAACGAGAGAGGTAAGATCAGATGATTCCCCGGATATGGTGTTGACGCAGTTGCATCAAGCTAGTGATAATTTCTTCAAGGAATTGATTCATGTCAATCATCTGATTGGCCATAACCTGAAGGATCGTGAAACCATTAGATCAGACACATTCTTCATTTACAGCAAACGAATATTCAAAGATGGAGCAATACTCAGTCAGGTCCTCAAGAATTCATCTAAATTGGTGCTAATATCAGGCGACCTTAGCGAAAACACTGTAATGTCCTGTGCCAACATTGCAATCTCTAGAGGATCCCCGGTACCGAGCTGATCGpMD18-T-7的测序结果：TGGACGTAGCTGCAGTCGACGATTCAGGTGACAATCAAGTAATAGCTGTAACGAGAGAGGTAAGATCAGATGATTCCCCGGATATGGTGTTGACGCAGTTGCATCAAGCTAGTGATAATTTCTTCAAGGAATTGATTCATGTCAATCATCTGATTGGCCATAACCTGAAGGATCGTGAAACCATTAGATCAGACACATTCTTCATTTACAGCAAACGAATATTCAAAGATGGAGCAATACTCAGTCAGGTCCTCAAGAATTCATCTAAATTGGTGCTAATATCAGGCGACCTTAGCGAAAACACTGTAATGTCCTGTGCCAACATTGCATCCACTGTAGCACGACTATGTGAGAATGGGCTTCCTAAGGATTTCTGTTACTATTTGAATTACCTAATGAGTTGCGTGCAGACATACTTTGATTCGGAGTTTTCTATTACCCACAGCTCGCAATCAGGTTCCAACCAGTCCTGGATTGAGGATATCTCTTTCGTACACTCATACGTGTTAACCCCTGCCCAGCTGGGGGGACTGAGCAACCTTCAATACTCAAGGCTCTACACAAGGAATATTGGTGACCCAGGGACCACTGCTTTCGCAGAGGTCAAGCGACTAGAAGCAGTGGGGTTGCTGAGTCCCAGCATCATGACTAACATCTTAACCAGGCCACCTGGCGATGGAGACTGGGCCAGCCTATGCAACGACCCATACTCTTTTAATTTTGAGACTGTTGCAAGCCCAAATATTGTCCTCAAGAAACATACACAGAAAGTCCTATTTGAGACATGTTCAAACCCCTTATTATCCGGGGTACATACAGAGGACAATGAGGCAGAAGAGAAAGCATTGGCTGAATTCTTACTCAATCAAGAAGTGATTCACCCACGTGTCGCACATGCTATCATGGAAGCAAGCTCGGTGGGTAGGAGAAAGCAAATTCAAGGGCTTGTTGACACAACGAACACCGTGATTAAGATTGCACTGACTAGGAGGCCACTCGGTATCAAAAGGCTGATGCGGATAATCAATTACTCGAGCATGCATGCAATGTTGTTCAGAGATGATATTTTCTTATCCAATAGATCCAACCACCCATTAGTTTCTTCTAATATGTGCTCGCTGACGCTAGCAGATTATGCCCGGAACAGAAGCTGGTCACCCCTGACAGGGGGCAGGAAAATACTGGGTGTATCCAACCCCGATACCATAGAACTTGTGGAGGGAGAGATTCTCAGCGTCAGTGGAGGGTGCACAAAATGTGACAGCGGAGATGAGCAGTTTACTTGGTTCCATCTTCCAAGCAATATAGAGCTGACTGATGACACCAGCAAAAATCCCCCGATGAGAGTGCCATATCTCGGGTCGAAGACTCAAGAGAGGAGAGCTGCCT59 CGCTTGCGAAAATAGCCCACATGTCACCACATGTGAAAGCAGCACTAAGGGCATCATCCGTGTTAATCTGGGCTTATGGGGACAACGAAGTGAACTGGACTGCTGCTCTTAATATTGCAAGGTCTCGATGCAACATAAGCTCAGAGTATCTTCGGCTATTGTCACCCCTGCCCACAGCTGGGAATCTCCAACATAGATTGGATGATGGCATAACCCAGATGACATTTACCCCTGCATCTCTCTACAGAGTGTCGCCTTACGTTCACATATCCAATGATTCTCAAAGGCTATTCACAGAAGAAGGGGTCAAAGAGGGAAACGTGGTTTACCAACAAGTTATGCTCTTGGGTTTATCTCTAATTGAATCACTCTTCCCAATGACAACAACCAGAACATATGATGAGATCACATTACACCTCCACAGTAAATTTAGCTGCTGTATCCGAGAAGCGCCTGTTGCGGTTCCTTTCGAGCTCCTCGGGCTGGCACCGGAATTAAGGATGGTAACCTCAAATAAGTTCATGTATGATCCTAGCCCTATATCAGAGAGAGATTTTGCGAGACTTGACTTAGCTATCTTCAAGAGTTACGAGCTTAATTTGGAATCATATTCCACGCTGGAGCTAATGAACATTCTTTCAATATCTAGCGGGAAATTGATTGGCCAGTCCGTGGTTTCTTATGATGAAGATACTTCTATAAAGAATGATGCTATAATAGTGTATGACAACACACGAAATTGGATTAGTGAGGCGCAGAACTCAGATGTGGTCCGCCTGTTTGAGTATGCAGCACTCGAAGTGCTCCTTGACTGCGCTTATCAACTCTACTATCTGAGGGTAAGGGGTCTAAACAACATCGTCCTATACATGAATGACTTATATAAGAACATGCCAGGGATCCTACTCTCCAATATTGCGGCCACGATATCCCACCCCATCATTCACTCAAGGTTGAATGCAGTAGGCCTAATTAACCATGACGGGTCACACCAGCTTGCAGATATAGACTTCGTCGAGGTGTCTGCGAGATTGTTAGTCTCTTGCACTCGACGCGTGGTTTCAGGCTTATATGCAGGGAATAAGTACGATCTGCTGTTTCCATCTGTCTTAGATGATAACCTGAATGAGAAGATGCTTCAACTGATTTCCCGATTATGAATCTCTAGAGGATCCCCGGTACCGAGCTCGATTCTpMD18-T-8的测序结果：AGCTCGGTACCGGGGATCCTCTAGAGATTACCAAACAAAGATTTGGTGAATGACATAACTATAATTAGGGACGACTTTGCGCACTTTTGCTTAAAGTTAACTAACTGAATCCGAATACGAGTTCCAAAGAGTCGGAATTTAACTTTTTTCTAACCCGGTATAATTAAGTCAGTGAGGGAGTCATCAGTTAAGAAGATAACTGATTGGCGTACGATTGCCCTTAAGAGTCATTATTACTGTAATATCCCTTGGCAGCATTACCTATGGTTTTCATGTAGAATTTTTGTTGAGCACGAGTCAAGTACAGTAACGAGGTATCTGTGAACATTTCTTTGAGCTTAGTAATACCTAGGACCGCTTTCAGGTATTTAGGGCAGGTACTGCGCTTCAGGTATGTCCTTAATGGGATGAGATCCTCTAGGGAAACCGCACCTCTGAGTACTAAGCTGATTACATCACCTACTTTATTGATATCTTTGGCTCTGAGACCCAGTATTGTGACTTCCAAGATCTGTTTGGTGCACTGCTTAAGTGATGTTCTCTTTTTACCGTCTGTGGATAGATTGTATGGAGTAAATAAGAACACTGTGTCGGCGAGGTCACCCTCAGCCTCCATGTAAATCACAGACCGAATGACTGTGTCAATGTGGCTGGCAATGATCTGAGTTGTCTGGGTCATATCTGTTAGTGTGCTCACCAAACTTTCTGCACAGAATGGACGGACGGGCTGTCCCCCGGCTTCAATTAGTGCAGCATCAATATTTTCTCTCAAGAGCTTCATTAGCTTCGGTAAAGGGCTGGATAGGATATCTGTTACACGACGCTGCTGTGAGGTAAATAGCTTAGTCAATGTAATTTCATCTGATTTAGATAGAAGTGTGCCGTGTCGTTGTATTAGAGTTTTTGCCATCCTTACCACTTCGTGCACGAAGGTGGGCCCGCCTAAGTAGCCCATAACGAATATCAGGTAACACTCCATATCCCCTCTACAGGCATAGCCGTTGGAGAGTATATATCCTTTCGTGGAACATGGAGTGAATAAATTCATGAGTAAATGGAAGTAGTACCCCATTGCATACAGTACTTTAATGATCACTACCCCGCCCTCCCTCACAGAATGCATGGCAATCAGGGACAAATTAGTAGCCAGTTGATCTAATAGGCTTTGATTGGACCCTGGAGGAATCTCAATGTCACAATGTAGTAATGATACAGACCTGTAGGGTACCACAGATGTGATATATCCAACTGCCTTATCTGAGGTCAGGTCACTTTCTTCTGCATTCTCTCTCCATAATGGGCAGAACTCCTGGACATATCCCTCTTTACATGGCACTTCCGCTTGTAGATTCCTATAAACGACCGAGTTTAGAAACTGCGTTGGTGTAGGTCCGAAATGT60 CGCTGTGGAGGGTTCATCTCATTCGAGAAAAGTGTATTGTAATAGATAGTCTCATGTGGTATATGCAATTCAAGAAGACTCATGATGGCTCCACTTCCTTCCGCTAAGTATAAGGAACTCCCATGTCTTGCACACCTGACCTCAGGTACGGATAGAAGATGAGATGCCTTATACCAAGAAGATGAAGCAGTCCCTATTCCTCTGAACAAGTACCGTACTAGGTAATCTTCCTTTGGGTTCGGTAATGTGTGCTCGAAGCAAACCTTACTCAGTGTAAATGCGTCGTACCTTGCTGGGGCACTCAGATCTAGCTCTTGTATGAATGATGCGGGTTGTCGGGTAAACGGGTCTTTCACTCGAGCACCTATGTCTTGTACTGGGCGAAGCTCAAGCAGTGGTTCCTGAGGGAACAACAACGACAAGATAGTATCTCTGTCCTCTCTTTCTCTGATCAAATTAAGGCTCTTCCTAGACATGTAATATAGATTGGCTGGGAACGTGATTATGTTGGGAGACATGATAGAACTCACTTGTTCGGGCCTAAGCAATGGTTTTACAGCATCTGACAGTAGATACTCAGTGAGTATTGAGCATTTCTCTTCTGCCGATAGGCCCCTTATTTTTGGGATTTCTCTTGTTGTAGCAAAGAGCACTGTGTACAGACAGCATAATCGGGAAATCAGTTGAAGCATCTTCTCATTCAGGTTATCATCTAAGACAGATGGAAACAGCAGATCGTACTTATTCCCTGCATATAAGCCTGAAACCACGCGTCGAGTGCAAGAGACTAACAATCTCGCAGACACCTCGACGAAGTCTATATCTGCAAGCTGGTGTGACCCGTCATGGTTAATTAGGCCTACTGCATTCAACCTTGAGTGAATGATGGGGTGGGATATCGTGGCCGCAATATTGGAGAGTAGGATCCCTGGCATGTTCTTATATAAGTCATTCATGTATAGAACGATGTTGTTTAGACCCCTTACCCTCAGATAGTAGAGTTGATAAGCGCAGTCAAGGAGCACTTCGAGTGCTGCATACTCAAACAGGCGGACCACATCTAATCGTCGACCCTG（2）辅助质粒pCDNA3.0-NP、pCDNA3.0-P的测序结果pCDNA3.0-NP的测序结果：ATGTCTTCCGTATTTGACGAGTACGAACAGCTCCTCGCGGCTCAGACTCGCCCTAATGGAGCTCACGGAGGAGGAGAGAAGGGGAGCACCTTAAAAGTTGAAGTCCCGGTATTCACTCTTAACAGTGACGACCCAGAAGATAGATGGAACTTTGCAGTATTCTGTCTTAGGATTGCTGTTAGCGAAGATGCCAACAAACCACTCAGACAAGGTGCTCTCATATCTCTCTTATGCTCCCATTCTCAAGTGATGATGAACCATGTCGCCCTTGCAGGGAAACAGAATGAGGCCACACTGGCTGTTCTTGAGATCGATGGTTTCACCAACAGCGTGCCTCAATTCAACAACAGGAGTGGAGTGTCTGAGGAGAGAGCACAGAGATTCTTGATGATAGCAGGGTCCCTCCCTCGGGCATGCAGCAACGGTACCCCGTTCATCACAGCTGGGGTTGAAGATGATGCACCAGAAGACATCACTGATACTCTGGAAAGAATCATCTCTATCCAGGCTCAAGTATGGGTCACGGTAGCAAAGGCCATGACTGCATATGAGACAGCGGATGAGTCGGAAACAAGAAGAATCAATAAGTATATGCAGCAAGGCAGAGTCCAGAAGAAGTACATCCTCCACCCCGTATGTAGGAGCGCAATTCAACTCACGATTAGACAATCTCTGGCAGTCCGCATTTTCTTGGTTAGCGAGCTTAAGAGAGGCCGCAACACGGCAGGTGGAAGTTCCACTTATTATAGCTTGGTAGGGGACATAGACTCATACATCAGGAACACCGGGCTTACTGCATTCTTCCTGACACTCAAGTATGGAATCAACACCAAGACATCAGCCCTTGCACTCAGCAGCCTCGCAGGCGATATCCAAAAAATGAAGCAGCTCATGCGTCTATATCGGATGAAAGGAGATAATGCGCCGTACATGACACTGCTCGGTGACAGTGACCAGATGAGCTTTGCACCGGCTGAGTATGCACAACTCTACTCTTTTGCAATGGGTATGGCATCCGTCCTAGACAAAGGAACTGGCAAGTACCAGTTCGCCAGAGACTTTATGAGCACATCATTCTGGAGACTTGGAGTAGAGTATGCTCGGGCTCAGGGAAGCAGCATCAATGAGGATATGGCTGCCGAGCTAAAGCTGACCCCAGCGGCAAGGAGGGGCCTGGCAGCTGCTGCCCAACGAGCGTCCGAGGAGACCGGCAGCATGGACATTCCCACTCAACAAGCTGGGGTCCTCACAGGGCTCAGCGACGGAGGCCCTCAAGCCCCACAAGGTGGACTGAACAGGTCGCAAGGGCAACCGGACGCCGGAGATGGGGAGACCCAATTTTTAGATTTGATGAGAGCAGTGGCAAATAGTATGAGAGAAGCGCCAAACTCTGTGCAGAACACCACTCAGCAGGAGCCTCCATCTACTCCTGGGCCATCTCAGGACAACGACACCGACTGGG61 GATACTGApCDNA3.0-P的测序结果：ATGGCCACCTTCACGGATGCAGAGATCGACGATCTATTTGAAACCAGTGGAACTGTCATTGACAGCATAATTACGGCCCAAGGCAACCCAGTAGAGACTGTTGGAAGGAGCGCAATCCCACAAGGCAAAACTAAAGCATTGAGTGCAGCATGGGAGAAACATGGAAGCACCCAACCGCCGGCCGGCCAAGACACCCCTGATCGAATGGACAGATCAGACAAACAACCATCCCCACCCGAACAGGCAACCACACACAACAGCCCGCCAGCCACATCCACCGACCAGCCCCCCACCCAGGCCGCAGGCGAAGCCGGTGACACACAGCTCAAGACTGGAGCAAGCAACTCCCTCCTGTCAATGCTCGACAAGCTTAGCAATAAATCGTCCAATGCTAAAAAGGGCCCACGGTCGAGTCCCCAGGAAGGGCACCACCAACCTCCGACCCAGCAGCAAGGGGGTCAACAGAGCCGCGGAAACAGTCAGGAGAGATCGCAAAACCAGGTCAAGGCCGCCTCTGGAGACCAGGGCACAGACGCGAACACAGCATATCATGGACAATGGAAGGAGTCACAACCATCAGCTGGTGCAATCCCTCATGCTCTCCGGTCAGGGCAGAGCCAAGACAATACTCCTGCATCTGTGGATCATGTCCAGCTACCTGTCGACTTTGTGCAGGCGATGATGTCTATGATGGAGGCGATATCACAGAAGGTAAATAAAGTCGACTATCAGCTAGACCTTGTCTCAAAGCAGACATCCTCCATCCCCATGATGCGATCTGAAATCCAACAGCTGAAAACATCCGTTGCGGTCATGGAAGCCAACCTGGGCATGATGAAGATTCTGGACCCTGGTTGTGCTAACGTTTCATCTTTAAGTGACCTACGGGCGGTCGCCCGCTCTCACCCAGTTTTAGTTTCAGGCCCCGGAGACCCATCTCCTTATGTGACACAAGGGGGTGAATTGATACTCAATAAACTCTCGCAACCAGTGCAACATCCTTCTGAGTTGATTAAACCTGCCACGATAAGCGGGCCTGATATAGGAGTGGAGAAGGACACTGTCCGTGCATTGATCACCTCACGCCCAATGCATCCGAGCTCTTCAGCTAAGCTCCTGAGTAAGCTGGATGCAGCCGGGTCGATAGAAGAAATTAGGAAAATCAAACGCCTTGCGCTGAATGGCTGA-（3）L基因的PCR测序结果pMD-18-T-L1测序结果：GGAGTACGACGGCAGTGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTCCCAAGCTTGCCACCATGGCGGGCTCCGGACCCGAAAGGGCAGAGCATCAGATTATCCTACCAGAGTCACATCTGTCCTCACCATTGGTCAAGCATAAATTGCTTTATTACTGGAAATTAACTGGGCTACCGCTTCCTGACGAATGTGACTTCGACCACCTTATTATCAGCCGACAATGGAAGAAGGTACTTGAATCGGCCACCCCTGACATTGAGAGAATGATAAAACTAGGGCGGGCAGTACACCAGACTCTCAACCACAATTCCAGGATAACCGGAGTACTCCATCCCCGGTGTTTAGAGGAACTGGCTAGTATTGAGGTTCCTGATTCAACCAACAAATTTCGGAAGATCGAGAAAAAGATCCAGATTCACAACACAAGGTATGGAGAACTGTTCACAAGATTATGCACGCATGTAGAAAAGAAACTATTGGGGTCATCTTGGTCTAACAATGTCCCACGGTCAGAGGAATTCAACAGCATCCGTACAGATCCGGCATTTTGGTTTCACTCAAAATGGTCCACAGCCAAATTTGCATGGCTCCATATAAAACAGGTCCAGAGGCATCTGATTGTAGCAGCAAGAACAAGGTCCGCAGTCAACAAATTAGTGACGCTGACCCATAAGGTAGGCCAAATCTTTGTTACTCCTGAGCTTGTCATTGTGACACATACAGATGAGAACAAGTTCACGTGTCTTACCCAGGAACTTGTGTTGATGTATGCAGATATGATGGAGGGCAGAGATATGGTCAGCATAATATCATCCACGGCGGCACATCTTAGGAGCTTATCAGAGAAAATTGATGATATTCTGCGGTTAGTAGATGCTCTGGCAAGAGATTTGGGCAATCAAGTCTACGATGTTGTAGCACTAATGGAGGGATTCGCATACGGCGCTGTTCAGCTGCTTGAACCGTCAGGTACATTTGCGGGGGATTTCTTCGCATTCAACCTGCAGGAGCTCAAAGATACTCTAACCGGACTCCTCCCCAAGGATATCGCAGAATCTGTGACTCACGCAATCGCAACCATATTCTCTGGCTTAGAACAAAATCAAGCAGCTGAGATGTTGTGCCTGTTGCGTCTGTGGGGTCACCCACTACTCGAGTCCCGTATTGCAGCAAAAGCAGTTAGGAGTCAAATGTGCGCACCAAAA62 ATGGTAGACTTTGATATGATCCTCCAGGTATTATCTTTCTTTAAAGGAACAATCATCAATGGATATAGAAAGAAGAATGCAGGCGTGTGGCCACGTGTCAAGATAGATACGATATACGGGAAGGTCATAGGGCAGCTACACGCAGATTCTGCAGAGATTTCACATGATGTCATGTTGAGGGAATACAAGAGTTTATCTGCACTTGAATTCGAGCCATGTATAGAATATGACCCTGTCACCAATCTGAGCATGTTTTTAAAAGACAAGGCAATCGCACACCCGAAAGACAACTGGCTCGCTTCGTTTAGGCGAAACCTTCTCTCTGAGGACCAGAAGAAACATGTAAGAGAGGCAACCTCAACTAACCGCCTCTTGATAGAGTTCTTAGAGTCAAATGATTTTGATCCATATAAAGAGATGGAATATCTGACGACCCTTGAGTACCTAAGAGATGATAATGTGGCAGTATCATACTCACTCAAAGAAAAAGAGGTGAAAGTTAATGGGCGGATTTTCGCAAAGCTAACAAATAGATTAAGGAATTGTCAGGTAATGGCAGAAGGGATCCTAGCTGACCAGATTGCACCTTTCTTCCAGGGAAATGGGGTCATTCAGGATAGCATATCTTTGACTAAAAGTATGCTAGCGATGAGTCAACTGTCTTTCAACAGCAACAAGAAACGTATTACTGACTGCAAAGAAAGAGTATCCTCAAACCGCAATCATGATCCGAAGAGCAAGAATCGTCGGAGAGTTGCCACTTTTGTAACTACCGACCTGCAAAAGTATTGTCTCAATTGGAGATATCAGACAGTCAAGCTGTTCGCTCATGCCATCAATCAGCTGATGGGCTTACCTCACTTCTTCGAGTGGATTCATCTTAGACTAATGGATACTACGATGTTTGTAGGGGACCCTTTCAATCCTCCAAGTGACCCTACGGACTGTGATCTATCAAGAGTCCCAAATGATGACATATATATTGTCAGTGCTAGGGGAGGCATTGAGGGATTATGCCAGAAGCTATGGACAATGATCTCAATTGCTGCAATCCAGCTTGCTGCAGCAAGATCACATTGTCGCGTTGCCTGTATGGTACAAGGCGACAATCAAGTAATAGCTGTAACGAGAGAGGTAAGATCAGATGACTCCCCAGAGATGGTGTTAACACAATTGCATCAAGCCAGTGATAATTTCTTCAAGGAATTGATTCATGTCAATCATTTGATCGGCCATAATTTGAAGGATCGTGAAACCATCAGGTCAGACACGTTCTTCATATACAGCAAACGAATATTCAAAGATGGAGCAATACTCAGTCAGGTCCTCAAAAACTCATCTAAATTAGTGCTAATATCAGGCGACCTTAGTGAAAACACTGTAATGTCTTGTGCCAACATTGCATCTACTGTAGCACGGTTATGCGAGAACGGGCTTCCTAAGGATTTCTGTTATTACTTAAACTACTTAATGAGTTGCGTGCAGACATACTTCGATTCTGAATTTTCCATCACCAACAACTCGCAACTCGATTCTAACCAGTCGTGGATAGAGGACATTTCTTTTGTGCACTCATATGTCCTGACCCCTGCTCAACTGGGGGGACTGAGTAACCTTCAATACTCAAGGCTCTACACAAGGAACATCGGCGACCCGGGAACCACTGCTTTTGCAGAGATCAAGAGATTAGAGGCAGTGGGGTTACTGAGTCCTAGCATTATGACTAACATCTTAACTAGGCCGCCTGGAAATGGAGATTGGTACCCCGAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATCGTAATCATGTCCA注：斜体为PCR引物，带有下划线的依次为所需酶切位点HindIII和KpnI。pMD-18-T-L2测序结果:GGAGTACGACGCAGTGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTTCCCCCGGGTGAGTAACCTTCAATACTCAAGGCTCTACACAAGGAACATCGGCGACCCGGGAACCACTGCTTTTGCAGAGATCAAGAGATTAGAGGCAGTGGGGTTACTGAGTCCTAGCATTATGACTAACATCTTAACTAGGCCGCCTGGAAATGGAGATTGGGCCAGTCTGTGCAACGATCCATACTCCTTTAATTTTGAGACTGTCGCAAGCCCAAATATTGTCCTTAAGAAACATACACAAAGAGTCCTATTTGAAACTTGCTCGAATCCCTTATTATCTGGAGTGCACACAGAGGATAATGAGGCAGAAGAGAAGGCATTGGCTGAATTCTTGCTCAATCAAGAAATGATTCATCCACGTGTCGCGCATGCTATCATGGAAGCAAGCTCTGTAGGTAGGAGAAAGCAAATTCAGGGGCTTGTTGACACAACAAACACCGTGATTAAGATTGCACTGACTAGGAGGCCACTCGGCATCAAGAGGCTGATGCGGATAGTCAATTATTCGAGCATGCATGCAATGCTATTTAGAGATGATGTTTTCTCGTCTAATAGATCCAACCATCCCTTAGTCTCTTCTGATATGTGTTCTCTGACACTGGCAGACTATGCACGG63 AACAGAAGCTGGTCACCTTTGACAGGGGGTAGAAAAATACTGGGTGTATCTAATCCTGATACCATAGAACTTGTAGAGGGTGAGATCCTTAGTGTCAGTGGAGGGTGCACAAGATGTGACAGTGGGGATGAACAGTTTACTTGGTTCCATCTTCCAAGCAATATAGAGCTAAACGATGACACCAGCAAGAATCCTCCAATGAGAGTGCCATATCTCGGGTCAAAGACTCAAGAGAGGAGAGCCGCCTCGCTTGCGAAAATAGCTCATATGTCACCACACGTGAAGGCGGCTCTAAGGGCGTCATCTGTGTTAATCTGGGCTTATGGGGACAACGAAATAAACTGGACTGCTGCTCTTAAGATTGCAAGGTCTCGGCGCAACATAAGCTCAGAGTACCTTCGACTATTGTCACCCTTGCCTACAGCTGGGAATCTCCAACATAGATTGGACGACGGCATAACTCAGATGACATTCACCCCTGCATCTCTATACAGGGTGTCACCTTACATTCATATATCTAATGATTCTCAAAGGCTATTTACTGAAGAAGGAGTCAAAGAGGGGAATGTGGTTTATCAGCAAATCATGCTCTTGGGTTTGTCCTTAATTGAGTCACTCTTCCCAATGACAACAACCAAGACATATGATGAAATCACATTGCACCTCCACAGTAAATTTAGCTGCTGTATCAGGGAAGCACCTGTTGCAGTTCCTTTCGAGCTACTCGGGTTGGCACCGGAACTAAGGGCAGTAACCTCAAATAAGTTTATGTATGATCCTAGCCCTGTATCAGAGGGAGACTTTGCGAGACTTGACTTAGCTATCTTTAAGAGTTATGAACTTAATTTAGAGTCATATTCCACAATAGAGCTAATGAACGTTCTTTCAATATCTAGTGGGAAGTTGATTGGCCAGTCTGTGGTTTCTTATGATGAAGATACCTCCATAAAGAATGACGCTATAATGGTGTATGACAACACACGGAATTGGATCAGCGAAGCTCAGAATTCAGATGTGGTCCGCCTATTCGAGTATGCGGCACTCGAAGTGCTCCTCGACTGTTCTTATCAACTCTACTATCTGAGAGTAAGAGGCCTGAACAATATCGTCCTGTACATGAGTGATTTATACAAGAATATGCCAGGAATTCTACTCTCTAATATTGCAGCTACAATATCTCACCCTGTCATCCATTCAAGGTTGAATGCAGTAGGTCTGGTCAACCATGGCGGGTCACACCAACTTGCAGACACAGATTTCATTGAAATGTCTGCAAAACTGCTAGTCTCTTGCACTCGACGCGTGGTCTCAGGTTTACATGCAGGGAATAAGTATGACCTGCTGTTCCCATCTGTCTTGGATGATAACCTAAGTGAGAAGATGCTTCAGTTGATATCCCAATTATGCTGTCTGTATACGGTGCTCTTTGCTACAACAAGAGAAATCCCGAAAATAAGAGGCTTATCTGCGGAAGAGAAATGTTCAGTACTTACTGAGTACCTACTGTCAGATGCTGTGAAACCATTACTTGGGTCCGAGCAAGTGAGCTCTATCATGTCTCCCAACATAGTTACGTTCCCAGCCAATCTGTATTACATGTCTAGGAAGAGCCTTAATTTGATCAGGGAGAGAGAGGACAGGGATACTATCTTGGCATTGTTGTTCCCTCAAGAACCGCTGCTCGAGTTTCCTCTGGTACGAGATATTGGTGCTCGTGTAAAAGATCCATTTACCCGACAACCTGCGGCGTTTTTACAAGAGTTAGATTTGAGTGCTCCGGCAAGGTATGACGCATTCACAATCAGTCAGGCGCATTCTGAACACATATTGCCAAACCCAGAGGAAGATCACTTAGTACGATACTTGTTCAGAGGAATAGGGACTGCGTCCTCCTCTTGGTATAAGGCATCCCATCTTCTTTCTGTACCCGAGGTCAGATGTGCAAGGCATGGGAACTCCTTATATTTAGCAGAAGGAAGTGGAGCCATCATGAGTCTTCTCGAATTGCATATACCACACGAAACTATCTATTACAATACACTTTTCTCGAACGAGATGAACCCCCCACAGCGACATTTCGGACCAACTCCAACACAGTTTCTGAATTCGGTTGTTTTTAGGAATTTACAGGCGGAAGTACCATGCAAGGATGGATTTGTCCAGGAGTTCCGTCCGTTATGGAGAGAGAATACAGAAGAAAGCGATCTGACCTCAGATAAAGCAGTGGGATATATCACATCTGTAGTGCCGTACAGGTCTGTATCATTGCTGCATTGTGACATTGAAATCCCTCCAGGATCTAATCAAAGCTTACTAGATCAGCTGGCTACCAATCTGTCTCTGATTGCCATGCATTCTGTGAAGGAGGGCGGGGTCGTGATTATCAAAGTACTGTATGCAATGGGATATTACTTCCACCTACTCATGAACTTGTTTACTCCATGTTCCACGAAAGGATATATTCTCTCTAATGGCTATGCCTGTAGAGGGGATATGGAGTGTTACCTGATATTTGTCATGGGCTACCTAGGCGGGCCTACATTTGTACATGAGGTGGTGAGGATGGCAAAAACGCTAGTACAGCGGCATGGCACACTTTTGTCTAAGTCAGATGAGATTACACTGACTAGGTTATTTACTTCACAGCAACAGCGTGTAACAGA64 CATCCCATCCAGCCCTTTACCGAGACTAATGAAGTACTTGAGAGAGAATATTGATACTGCACTGATTGAAGCCGGGGGACAGCCTGTCCGTCCATTCTGTGCAGAGAGTTTAGTGAGCACACTAACAGACATGACTCAGACAACCCAGATCATCGCCAGCCACATTGATACAGTCATTCGATCTGTGATCTATATGGAAGCAGAGGGTGATCTTGCTGACACAGTATTCTTATTTACCCCTTACAACCTCTCTATGGACGGGAAAAAGAGAACATCACTTAAACAGTGCACAAGACAGATCTTAGAGGTCACAATACTGGGTCTCAGAGTCAAAAATCTCAATAAAGTAGGTGATGTAATCAGCCTAGTACTCAGAGGTATGATTTCTCTGGAGGACCTTCTCCCACTGAGAACCTACTTGAAGTGTAGTACCTGCCCTAAGTATTTGAAGGCTGTCCTAGGTATTACCAAACTCAAAGAAATGTTCACAGACGCCTCTTTATTATACTTGACTCGTGCTCAACAAAAATTCTACACGAAAACTATAGGCAATGCAGTCAAGGGATACTATAGTAACTGTGACTCTTAAGCGGCCGCTTAAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATCGTAATCATTTCATGGTC注：斜体为PCR引物，带有下划线的碱基为NotI的酶切位点。（4）子代病毒RT-PCR测序结果TCCGATTTCCTGGGGACTGCATTCACCCGCCTTCCCAAAACACCATGACACCAGATAATGATCTGTCTTGATTACTTACAGTTAGTTTCCCTGTCTATCAAATTAGAAAAAACACGGGTAGAAGAGTTCGGATCCCGGCCGGCGCACCAAAAGCGCAAGATGGGCCCCAGATCTTCTACCAGGATCCCAGTACCTCTAATGCTGACCATACGGATCACGCTGGCACTGAGTTATGTCCGTCTGACAAGTTCTCTTGATGGCAGGCCTCTTGCAGCCGCAGGGATCGTGGTAACAGGGGATAAAGCAGTTAACATATACACCTCATCCCAGACAGGGTCAATCATAGTCAAGTTACTCCCAAATATGCCCAAGGACAAAGAGGCATGTGCAAAAGCCCCATTGGAGGCTTACAACAGGACACTGACTACTTTGCTTACCCCCCTTGGTGATTCTATCCGCAGGATACAAGAGTCTGTGACTACATCCGGAGGAAGGAGACAGAGACGCTTTATAGGTGCCATTATTGGCAGTGTAGCTCTAGGGGTTGCAACAGCTGCACAGATAACGGCAGCCTCGGCTCTGATACAAGCCAACCAGAATGCTGCTAACATCCTCCGGCTTAAGGAGAGCATTGCTGCAACCAATGAAGCTGTACACGAGGTCACTGGCGGATTGTCACAGTTAGCAGTGGAGATTTGGAAA65 附录5-3：辅助质粒连接方案（1）辅助质粒pCDNA3.0-NP、pCDNA3.0-P的连接方案：66 67 （2）辅助质粒pMC18-CMV-L的连接方案：68 参考文献1.王永坤and陆杏梅,鹅副粘病毒病的研究.江苏农学院学报,1998.19(1):p.59-62.2.Duncan,R.,F.A.Murphy,andR.R.Mirkovic,Characterizationofanovelsyncytium-inducingbaboonreovirus.Virology,1995.212(2):p.752-756.3.Park,M.-S.,etal.,NewcastlediseasevirusVproteinisadeterminantofhostrangerestriction.Journalofvirology,2003.77(17):p.9522-9532.4.股震and刘景华,动物病毒学,1997,北京:科学出版社.5.Peeters,B.P.,etal.,RescueofNewcastlediseasevirusfromclonedcDNA:evidencethatcleavabilityofthefusionproteinisamajordeterminantforvirulence.Journalofvirology,1999.73(6):p.5001-5009.6.Römer-Oberdörfer,A.,etal.,GenerationofrecombinantlentogenicNewcastlediseasevirusfromcDNA.Journalofgeneralvirology,1999.80(11):p.2987-2995.7.胡顺林,etal.,鹅源新城疫病毒拯救体系的建立.微生物学通报,2007.34(3):p.426-429.8.刘华雷,etal.,一株ClassⅠ新城疫病毒的分离与分子特性研究.中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集,2008.9.刘玉良,从cDNA克隆产生感染性ZJI株鹅源新城疫病毒,2005,扬州大学.10.陈云霞,etal.,Ⅰ类新城疫病毒NDV08-004株微型基因组的构建及其功能鉴定.中国动物检疫,2011.28(9):p.27-31.11.刘光清,刘在新,and谢庆阁,反向遗传学技术及其在FMDV研究中的应用Ξ.生物技术通报,2003(3).12.Stone-Hulslander,J.andT.G.Morrison,Mutationalanalysisofheptadrepeatsinthemembrane-proximalregionofNewcastlediseasevirusHNprotein.Journalofvirology,1999.73(5):p.3630-3637.13.王运湘and余为一,新城疫病毒的分子生物学研究进展(综述).安徽农业大学学报,1997.24(3):p.320-322.14.Swayne,D.E.,laboratorymanualfortheisolationandidentificationofavianpathogens1998:AmericanAssociationofAvianPathologists,UniversityofPennsylvania.15.Barr,J.N.,S.Whelan,andG.W.Wertz,RoleoftheintergenicdinucleotideinvesicularstomatitisvirusRNAtranscription.Journalofvirology,1997.71(3):p.1794-1801.16.Bukreyev,A.,B.R.Murphy,andP.L.Collins,Respiratorysyncytialviruscantolerateanintergenicsequenceofatleast160nucleotideswithlittleeffectontranscriptionorreplicationinvitroandinvivo.Journalofvirology,2000.74(23):p.11017-11026.17.Baker,K.A.,etal.,Structuralbasisforparamyxovirus-mediatedmembranefusion.Molecularcell,1999.3(3):p.309-319.18.Chen,L.,etal.,ThestructureofthefusionglycoproteinofNewcastlediseasevirussuggestsanovelparadigmforthemolecularmechanismofmembranefusion.Structure,2001.9(3):p.255-266.19.Dutch,R.E.,etal.,Paramyxovirusfusion(F)protein:aconformationalchangeoncleavageactivation.Virology,2001.281(1):p.138-150.20.Eckert,D.M.andP.S.Kim,Mechanismsofviralmembranefusionanditsinhibition.Annualreviewofbiochemistry,2001.70(1):p.777-810.69 21.Gorman,J.,etal.,CharacterizationofthesitesofproteolyticactivationofNewcastlediseasevirusmembraneglycoproteinprecursors.JournalofBiologicalChemistry,1988.263(25):p.12522-12531.22.Lambert,D.,etal.,Peptidesfromconservedregionsofparamyxovirusfusion(F)proteinsarepotentinhibitorsofviralfusion.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1996.93(5):p.2186-2191.23.Li,Z.,etal.,Effectofcleavagemutantsonsyncytiumformationdirectedbythewild-typefusionproteinofNewcastlediseasevirus.Journalofvirology,1998.72(5):p.3789-3795.24.McGinnes,L.andT.Morrison,NucleotidesequenceofthegeneencodingtheNewcastlediseasevirusfusionproteinandcomparisonsofparamyxovirusfusionproteinsequences.Virusresearch,1986.5(4):p.343-356.25.Russell,R.,R.G.Paterson,andR.A.Lamb,Studieswithcross-linkingreagentsontheoligomericformoftheparamyxovirusfusionprotein.Virology,1994.199(1):p.160-168.26.吴明华and李维召,鸡新城疫免疫研究.畜牧兽医科技信息,2006(3):p.17-18.27.郑海学,动物RNA病毒反向遗传系统的研究和建立,2007,中国农业科学院博士论文.28.孙建宏,etal.,NDVLaSota株,V4株F蛋白表位的预测.动物医学进展,2005.26(3):p.72-75.29.Collins,M.,I.Strong,andD.Alexander,EvaluationofthemolecularbasisofpathogenicityofthevariantNewcastlediseasevirusestermed“pigeonPMV-1viruses”.Archivesofvirology,1994.134(3-4):p.403-411.30.Collins,P.L.,Y.T.Huang,andG.W.Wertz,Nucleotidesequenceofthegeneencodingthefusion(F)glycoproteinofhumanrespiratorysyncytialvirus.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1984.81(24):p.7683-7687.31.Errington,W.andP.T.Emmerson,AssemblyofrecombinantNewcastlediseasevirusnucleocapsidproteinintonucleocapsid-likestructuresisinhibitedbythephosphoprotein.Journalofgeneralvirology,1997.78(9):p.2335-2339.32.Alexander,D.J.,Avianparamyxoviruses—otherthanNewcastlediseasevirus.World'spoultrysciencejournal,1982.38(02):p.97-104.33.Deng,R.,etal.,Localizationofadomainontheparamyxovirusattachmentproteinrequiredforthepromotionofcellularfusionbyitshomologousfusionproteinspike.Virology,1995.209(2):p.457-469.34.Dietzschold,B.,etal.,Differencesincell-to-cellspreadofpathogenicandapathogenicrabiesvirusinvivoandinvitro.Journalofvirology,1985.56(1):p.12-18.35.Dortmans,J.,etal.,TheviralreplicationcomplexisassociatedwiththevirulenceofNewcastlediseasevirus.Journalofvirology,2010.84(19):p.10113-10120.36.Duesberg,P.H.andW.S.Robinson,IsolationofthenucleicacidofNewcastlediseasevirus(NDV).ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1965.54(3):p.794.37.Krishnamurthy,S.,Z.Huang,andS.K.Samal,RecoveryofavirulentstrainofNewcastlediseasevirusfromclonedcDNA:expressionofaforeigngeneresultsingrowthretardationandattenuation.Virology,2000.278(1):p.168-182.38.Kumar,S.,etal.,Completegenomesequenceofavianparamyxovirustype3revealsanunusuallylongtrailerregion.Virusresearch,2008.137(2):p.189-197.39.Lamb,R.A.,Paramyxovirusfusion:ahypothesisforchanges.Virology,1993.197(1):p.1-11.70 40.Lamb,R.A.,R.G.Paterson,andT.S.Jardetzky,Paramyxovirusmembranefusion:lessonsfromtheFandHNatomicstructures.Virology,2006.344(1):p.30-37.41.Kövamees,J.,etal.,Hemagglutinin-neuraminidase(HN)aminoacidalterationsinneutralizationescapemutantsofKilhammumpsvirus.Virusresearch,1990.17(2):p.119-129.42.刘艳华,etal.,血清I型鸭源副粘病毒HN蛋白基因的遗传变异及原核表达.中国兽医学报,2007.27(3):p.315.318.43.Lana,D.,etal.,CharacterizationofabatteryofmonoclonalantibodiesfordifferentiationofNewcastlediseasevirusandpigeonparamyxovirus-1strains.Aviandiseases,1988.32(2):p.273.44.Mayer,V.,J.Schulman,andE.Kilbourne,NonlinkageofneurovirulenceexclusivelytoviralhemagglutininorneuraminidaseingeneticrecombinantsofA/NWS(H0N1)influenzavirus.Journalofvirology,1973.11(2):p.272-278.45.Mayo,M.,AsummaryoftaxonomicchangesrecentlyapprovedbyICTV.Archivesofvirology,2002.147(8):p.1655-1656.46.吴艳涛and倪雪霞,我国部分地区不同动物来源新城疫病毒的分子流行病学研究.病毒学报,2002.18(3):p.264-269.47.陈亚波,etal.,新城疫病毒HN蛋白抗原表位分析及结构域基因原核表达.中国预防兽医学报,2007.29(1):p.32-35.48.McGinnes,L.W.andT.G.Morrison,ModulationoftheactivitiesofHNproteinofNewcastlediseasevirusbynonconservedcysteineresidues.Virusresearch,1994.34(3):p.305-316.49.张立娜and贾竞波,不同基因型新城疫病毒HN基因保守区域的克隆表达及免疫活性的比较.中国生物工程杂志,2008.28(5):p.93-98.50.冉旭华,etal.,新城疫病毒F和HN蛋白的原核表达.生物技术,2008.18(3):p.11-13.51.Yusoff,K.,etal.,LocationofneutralizingepitopesonthefusionproteinofNewcastlediseasevirusstrainBeaudetteC.Journalofgeneralvirology,1989.70(11):p.3105-3109.52.Panda,A.,etal.,RoleoffusionproteincleavagesiteinthevirulenceofNewcastlediseasevirus.Microbialpathogenesis,2004.36(1):p.1-10.53.Potier,M.,etal.,Fluorometricassayofneuraminidasewithasodium(4-methylumbelliferyl-α-d-N-acetylneuraminate)substrate.Analyticalbiochemistry,1979.94(2):p.287-296.54.Yu,L.,etal.,CharacterizationofnewlyemergingNewcastlediseasevirusisolatesfromthePeople'sRepublicofChinaandTaiwan.Journalofclinicalmicrobiology,2001.39(10):p.3512-3519.55.Hasan,M.K.,etal.,CreationofaninfectiousrecombinantSendaivirusexpressingthefireflyluciferasegenefromthe3'proximalfirstlocus.Journalofgeneralvirology,1997.78(11):p.2813-2820.56.He,B.,etal.,RecoveryofinfectiousSV5fromclonedDNAandexpressionofaforeigngene.Virology,1997.237(2):p.249-260.57.Hitchner,S.andE.Johnson,AvirusoflowvirulenceforimmunizingfowlsagainstNewcastledisease;avianpneumoencephalitis.Veterinarymedicine,1948.43(12):p.525-530.58.Hoffman,M.A.andA.K.Banerjee,Aninfectiouscloneofhumanparainfluenzavirustype3.Journalofvirology,1997.71(6):p.4272-4277.59.邹键,鹅副粘病毒SF02全基因组克隆与序列分析及锤头状核酶对病毒复制的抑制作用,71 2003,中国科学院研究生院(上海生命科学研究院).60.Egelman,E.,etal.,TheSendaivirusnucleocapsidexistsinatleastfourdifferenthelicalstates.Journalofvirology,1989.63(5):p.2233-2243.61.Fauquet,C.M.,etal.,Virustaxonomy:VIIIthreportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses2005:AcademicPress.62.Beard,C.,etal.,Diseasesofpoultry.Diseasesofpoultry,1984.63.Steward,M.,etal.,RNAeditinginNewcastlediseasevirus.Journalofgeneralvirology,1993.74(12):p.2539-2548.64.Collins,M.,J.Bashiruddin,andD.Alexander,DeducedaminoacidsequencesatthefusionproteincleavagesiteofNewcastlediseasevirusesshowingvariationinantigenicityandpathogenicity.Archivesofvirology,1993.128(3-4):p.363-370.65.Lomniczi,B.,etal.,NewcastlediseaseoutbreaksinrecentyearsinwesternEuropewerecausedbyanold(VI)andanovelgenotype(VII).Archivesofvirology,1998.143(1):p.49-64.66.Herczeg,J.,etal.,Twonovelgeneticgroups(VIIbandVIII)responsibleforrecentNewcastlediseaseoutbreaksinSouthernAfrica,one(VIIb)ofwhichreachedSouthernEurope.Archivesofvirology,1999.144(11):p.2087-2099.67.Huang,Z.,etal.,NewcastlediseasevirusVproteinisassociatedwithviralpathogenesisandfunctionsasanalphainterferonantagonist.Journalofvirology,2003.77(16):p.8676-8685.68.Mase,M.,T.Inoue,andT.Imada,GenotypingofNewcastlediseasevirusesisolatedfrom2001to2007inJapan.TheJournalofveterinarymedicalscience/theJapaneseSocietyofVeterinaryScience,2009.71(8):p.1101-1104.69.Claas,E.C.,etal.,HumaninfluenzaAH5N1virusrelatedtoahighlypathogenicavianinfluenzavirus.TheLancet,1998.351(9101):p.472-477.70.Munir,M.,etal.,Completegenomeanalysisofanavianparamyxovirustype1strainisolatedin1994fromanasymptomaticblack-headedgull(Larusridibundus)insouthernSweden.Aviandiseases,2010.54(2):p.923-930.71.Lamb,A.,Paramyxoviridae:thevirusandtheirreplication.Fieldsvirology,1996.72.Mast,J.,etal.,Ultrastructuralchangesofthetrachealepitheliumaftervaccinationofday-oldchickenswiththeLaSotastrainofNewcastlediseasevirus.VeterinaryPathologyOnline,2005.42(5):p.559-565.73.Miller,P.J.,E.L.Decanini,andC.L.Afonso,Newcastledisease:evolutionofgenotypesandtherelateddiagnosticchallenges.Infection,geneticsandevolution,2010.10(1):p.26-35.74.Francki,R.I.B.,etal.,Classificationandnomenclatureofviruses.FifthreportoftheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses1991.75.Cook,J.K.,etal.,Breadthofprotectionoftherespiratorytractprovidedbydifferentlive-attenuatedinfectiousbronchitisvaccinesagainstchallengewithinfectiousbronchitisvirusesofheterologousserotypes.AvianPathology,1999.28(5):p.477-485.76.Cubillos,A.,etal.,CharacterisationofstrainsofinfectiousbronchitisvirusisolatedinChile.AvianPathology,1991.20(1):p.85-99.77.Perozo,F.,etal.,TheVG/GAstrainofNewcastlediseasevirus:mucosalimmunity,protectionagainstlethalchallengeandmolecularanalysis.AvianPathology,2008.37(3):p.237-245.78.deLeeuw,O.andB.Peeters,CompletenucleotidesequenceofNewcastlediseasevirus:evidencefortheexistenceofanewgenuswithinthesubfamilyParamyxovirinae.Journalof72 generalvirology,1999.80(1):p.131-136.79.Rauw,F.,etal.,Humoral,cell-mediatedandmucosalimmunityinducedbyoculo-nasalvaccinationofone-day-oldSPFandconventionallayerchickswithtwodifferentliveNewcastlediseasevaccines.Vaccine,2009.27(27):p.3631-3642.80.Alexander,D.J.,Newcastlediseasevirus—Anavianparamyxovirus1988:Springer.81.Kaleta,E.,D.Alexander,andP.Russell,Thefirstisolationoftheavianpmv‐1virusresponsibleforthecurrentpanzooticinpigeons?AvianPathology,1985.14(4):p.553-557.82.McGinnes,L.,C.McQuain,andT.Morrison,ThePproteinandthenonstructural38Kand29KproteinsofNewcastlediseasevirusarederivedfromthesameopenreadingframe.Virology,1988.164(1):p.256-264.83.Liu,X.,etal.,PathotypicalandgenotypicalcharacterizationofstrainsofNewcastlediseasevirusisolatedfromoutbreaksinchickenandgooseflocksinsomeregionsofChinaduring1985–2001.Archivesofvirology,2003.148(7):p.1387-1403.84.Hooper,P.,etal.,LesionsintheupperrespiratorytractinchickensexperimentallyinfectedwithNewcastlediseasevirusesisolatedinAustralia.Australianveterinaryjournal,1999.77(1):p.50-51.85.Khattar,S.K.,etal.,AY526QmutationintheNewcastlediseasevirusHNproteinreducesitsfunctionalactivitiesandattenuatesvirusreplicationandpathogenicity.Journalofvirology,2009.83(15):p.7779-7782.86.Rout,S.N.andS.K.Samal,ThelargepolymeraseproteinisassociatedwiththevirulenceofNewcastlediseasevirus.Journalofvirology,2008.82(16):p.7828-7836.87.Huang,Z.,etal.,Thehemagglutinin-neuraminidaseproteinofNewcastlediseasevirusdeterminestropismandvirulence.Journalofvirology,2004.78(8):p.4176-4184.88.Miller,P.J.,etal.,AntigenicdifferencesamongNewcastlediseasevirusstrainsofdifferentgenotypesusedinvaccineformulationaffectviralsheddingafteravirulentchallenge.Vaccine,2007.25(41):p.7238-7246.89.Kapczynski,D.R.andD.J.King,ProtectionofchickensagainstovertclinicaldiseaseanddeterminationofviralsheddingfollowingvaccinationwithcommerciallyavailableNewcastlediseasevirusvaccinesuponchallengewithhighlyvirulentvirusfromtheCalifornia2002exoticNewcastlediseaseoutbreak.Vaccine,2005.23(26):p.3424-3433.90.Vickers,M.andR.Hanson,CharacterizationofisolatesofNewcastlediseasevirusfrommigratorybirdsandturkeys.Aviandiseases,1982:p.127-133.91.Westbury,H.,ComparisonoftheimmunogenicityofNewcastlediseasevirusstrainsV4,B1andLaSotainchickens.Australianveterinaryjournal,1984.61(1):p.5-9.92.Russell,P.andG.Ezeifeka,TheHitchnerB1strainofNewcastlediseasevirusinduceshighlevelsofIgA,IgGandIgMinnewlyhatchedchicks.Vaccine,1995.13(1):p.61-66.93.Seal,B.S.,D.J.King,andH.S.Sellers,TheavianresponsetoNewcastlediseasevirus.Developmental&ComparativeImmunology,2000.24(2):p.257-268.94.Senne,D.,D.King,andD.Kapczynski,ControlofNewcastlediseasebyvaccination.Developmentsinbiologicals,2003.119:p.165-170.95.Hamaguchi,M.,etal.,TranscriptivecomplexofNewcastlediseasevirus:I.BothLandPproteinsarerequiredtoconstituteanactivecomplex.Virology,1983.128(1):p.105-117.96.Leighton,F.A.andR.A.Heckert,Newcastlediseaseandrelatedavianparamyxoviruses.Infectiousdiseasesofwildbirds,2007:p.3-16.73 97.Snoeck,C.J.,etal.,NewcastlediseasevirusinWestAfrica:newvirulentstrainsidentifiedinnon-commercialfarms.Archivesofvirology,2009.154(1):p.47-54.98.Cattoli,G.,etal.,EmergenceofanewgeneticlineageofNewcastlediseasevirusinWestandCentralAfrica—implicationsfordiagnosisandcontrol.Veterinarymicrobiology,2010.142(3):p.168-176.99.Czeglédi,A.,etal.,Thirdgenomesizecategoryofavianparamyxovirusserotype1(Newcastlediseasevirus)andevolutionaryimplications.Virusresearch,2006.120(1):p.36-48.100.Bhella,D.,etal.,SignificantdifferencesinnucleocapsidmorphologywithintheParamyxoviridae.Journalofgeneralvirology,2002.83(8):p.1831-1839.101.Jørgensen,P.H.,etal.,Strainsofavianparamyxovirustype1oflowpathogenicityforchickensisolatedfrompoultryandwildbirdsinDenmark.Veterinaryrecord:journaloftheBritishVeterinaryAssociation,2004.154(16).102.Onapa,M.O.,etal.,ApreliminarystudyoftheroleofducksinthetransmissionofNewcastlediseasevirustoin-contactruralfree-rangechickens.Tropicalanimalhealthandproduction,2006.38(4):p.285-289.103.Liu,H.,etal.,CharacterizationofNewcastlediseasevirusisolatedfromwaterfowlinChina.Aviandiseases,2008.52(1):p.150-155.104.Aldous,E.,etal.,Amolecularepidemiologicalstudyofavianparamyxovirustype1(Newcastlediseasevirus)isolatesbyphylogeneticanalysisofapartialnucleotidesequenceofthefusionproteingene.AvianPathology,2003.32(3):p.237-255.105.Alexander,D.,Newcastlediseaseandotheravianparamyxoviruses.Revuescientifiqueettechnique(InternationalOfficeofEpizootics),2000.19(2):p.443-462.106.Alexander,D.,etal.,CharacterisationofanantigenicallyunusualvirusresponsiblefortwooutbreaksofNewcastlediseaseintheRepublicofIrelandin1990.VeterinaryRecord,1992.130(4):p.65-68.107.Alexander,D.,etal.,Antigenicdiversityandsimilaritiesdetectedinavianparamyxovirustype1(Newcastlediseasevirus)isolatesusingmonoclonalantibodies.AvianPathology,1997.26(2):p.399-418.108.Dortmans,J.C.,etal.,Virulenceofpigeonparamyxovirustype1doesnotalwayscorrelatewiththecleavabilityofitsfusionprotein.Journalofgeneralvirology,2009.90(11):p.2746-2750.109.Dortmans,J.,etal.,Virulenceofnewcastlediseasevirus:whatisknownsofar.VetRes,2011.42(122):p.1-11.110.Park,M.-S.,etal.,Newcastlediseasevirus(NDV)-basedassaydemonstratesinterferon-antagonistactivityfortheNDVVproteinandtheNipahvirusV,W,andCproteins.Journalofvirology,2003.77(2):p.1501-1511.111.Yoshida,T.,etal.,StudiesontheroleofMproteininvirusassemblyusingaismutantofHVJ(Sendaivirus).Virology,1979.92(1):p.139-154.112.Wise,M.G.,etal.,RNA-dependentRNApolymerasegeneanalysisofworldwideNewcastlediseasevirusisolatesrepresentingdifferentvirulencetypesandtheirphylogeneticrelationshipwithothermembersoftheparamyxoviridae.Virusresearch,2004.104(1):p.71-80.113.Xiao,S.,etal.,Completegenomesequenceofavianparamyxovirustype7(strainTennessee)andcomparisonwithotherparamyxoviruses.Virusresearch,2009.145(1):p.80-91.114.Zhao,H.andB.P.Peeters,RecombinantNewcastlediseasevirusasaviralvector:effectof74 genomiclocationofforeigngeneongeneexpressionandvirusreplication.Journalofgeneralvirology,2003.84(4):p.781-788.115.Neumann,G.,etal.,GenerationofinfluenzaAvirusesentirelyfromclonedcDNAs.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1999.96(16):p.9345-9350.116.Peeples,M.E.,etal.,NuclearentryandnucleolarlocalizationoftheNewcastlediseasevirus(NDV)matrixproteinoccurearlyininfectionanddonotrequireotherNDVproteins.Journalofvirology,1992.66(5):p.3263-3269.117.闻晓波,新城疫病毒样颗粒的构建及其出芽机制的研究[D],2006,中国农业科学院.118.Nakaya,T.,etal.,RecombinantNewcastlediseasevirusasavaccinevector.Journalofvirology,2001.75(23):p.11868-11873.119.智海东and王云峰,反向遗传操作在新城疫病毒中的应用.畜禽业,2003(1):p.44-45.120.赵长光,etal.,新城疫病毒反向遗传技术研究进展.中国兽医杂志,2011.47(10):p.56-59.121.杨彬,王雪峰,and王凤龙,反向遗传学技术的应用.中国畜牧兽医,2009.35(12):p.62-64.122.葛金英,新城疫病毒反向遗传操作基础与应用研究[D],2006,南京农业大学博士毕业论文.123.王延树,尤永君,and段占起,新城疫病毒反向遗传技术的研究进展.中国家禽,2009.31(23):p.58-61.124.Afonso,C.L.,NotsofastonrecombinationanalysisofNewcastlediseasevirus.Journalofvirology,2008.82(18):p.9303-9303.125.武治印,etal.,中国口蹄疫病毒同源重组研究.ProgressinBiochemistryandBiophysics,2009.36(6):p.689-695.126.谢芝勋,etal.,三株新城疫广西分离株全基因组序列的测定与分析.中国病毒学,2006.21(3):p.261-266.75 致谢在次论文完成之际,我要感谢何成强老师对我的悉心指导。研究生的三年里，衷心感谢导师的对我学业上孜孜不倦的教诲。何老师在论文完成的期间给了我充足的时间和空间，并在我遇到问题和难关时给予启发，指明努力方向，使我克服了个个难关，最终顺利完成课题。在此期间，我不仅学到了科研精神，更使我在以后的为人处事和工作生活中获益匪浅。衷心感谢丁乃峥老师、孟小倩老师、李国荣老师，潘杰老师，耿越老师，杨桂文老师在实验过程中对我的指导和帮助；感谢实验室的兄弟姐妹们在平日里对我的支持与鼓励，让我可以乐观自信的完成论文；感谢我的家人对我的培育与支持，是他们不断的鼓励我克服困难，不怕失败，努力向前。研究生的三年时间里我不断的成长，从原来的浮躁到现在的沉稳，这对我来说会受益终身。完成实验的过程里，我学会了找问题解决问题，也锻炼了自己的毅力，学会了该如何面对接下来的生活。回想三年时间里的磨练，我觉得非常值得，这将成为我一生的财富。牛丹丹2014年4月76 攻读硕士学位期间发表文章1《VaccinationinfluencestheEvolutionofClassicalswinefevervirus》，InfectionGeneticsEvolution，2014，第二作者。2《Identificationoftwoseverefeverwiththrombocytopeniasyndromevirusstrainsoriginatingfromreassortment》，VirusResearch，2013,Pages543–546，第三作者。3《猪瘟病毒非结构蛋白功能研究进展》，中国科技期刊数据库，2012年第24期，第三作者。77