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分类号：密级：公开学号：2015201719单位代码：10759石河子大学硕士学位论文新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定学位申请人张培生屈勇刚副教授指导教师涂长春研究员申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称预防兽医学研究方向动物传染病诊断与防治所在学院动物科技学院中国•新疆•石河子2018年6月 InvestigationonMarmotacaudatavirome,discoveryandcharacterizationofnovelvirusesinXinjiangADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByZhangPeisheng（Preventiveveterinaryscience）DissertationSupervisor:A.Prof.QuYonggangJune,2018 课题来源项目来源：NSFC-新疆联合基金项目名称：新疆重要自然宿主和媒介昆虫携带人兽共患病毒的病原生态学与分子流行病学研究项目编号：U1503283 摘要近年来新发传染病屡见不鲜，种类越来越多，流行本底越来越复杂、防控形势越发严峻，已经成为人类健康和社会发展的一个严重的威胁。因此，有效预测和防控新发突发传染病已成为人类公共卫生事业亟待解决的重大科学问题之一。啮齿动物是全球地理分布最广、种类最多的哺乳动物种群，是哺乳动物中数量最大的目，全球约有2277种，占所有哺乳动物种类的42%左右，也是重要的人兽共患病自然宿主之一。所以了解啮齿目动物病毒组对新发传染病的预警溯源体系具有非常重要的意义。旱獭作为啮齿动物重要物种，分布广泛，在北美地区旱獭中发现引起脑炎的PowassanVirus(POW)、狂犬病毒、土拨鼠肝炎病毒（包括乙肝病毒和丁肝病毒）等。而长尾旱獭作为帕米尔高原代表性物种，对其携带病毒组的研究尚未开展，所以对长尾旱獭病毒组进行研究十分必要。目的：了解帕米尔高原地区长尾旱獭携带病毒的病原本底数据和潜在新发病毒情况，为预测和防范旱獭源新发突发人兽共患病提供基础数据。方法：解剖旱獭，取肺脏、肠道、肝脏、肾脏、淋巴、脾脏保存备用。将肺脏、肠道、肾脏、淋巴组织样品混合，提取混样中病毒核酸，反转录成cDNA并加入锚定引物，合成dscDNA，通过PCR扩增，电泳检测产物，合格样品送至深圳华大科技有限公司进行高通量测序。对测序结果进行病毒宏基因组学分析，通过PCR方法对部分病毒进行验证，根据验证结果对病毒进行流行率检测、全基因组扩增及遗传演化分析等。结果：（1）共收集101只长尾旱獭，通过病毒宏基因组学分析，共发现25个病毒科，其中脊椎动物病毒13个科18个属，昆虫病毒有2个科2个属，植物病毒有6个科和6个属，噬病毒体1个科1个属及噬菌体3个科25个属。（2）本研究着重对腺病毒科、疱疹病毒科、星状病毒科、指环病毒科、圆环病毒科、多头瘤病毒科、细小病毒科、呼肠孤病毒科、小双节RNA病毒科及小RNA病毒科等病毒科进行鉴定分析，发现阳性率介于1.0%-76.2%。对检测片段进行初步的遗传进化分析，发现腺病毒检测片段可分成两个组，并得到DNAPol、Hexon及IVa2三段基因；疱疹病毒检测片段分成两个组，得到一株DNAPol基因；星状病毒检测片段可分成四个组；指环病毒检测片段为三种病毒基因；细小病毒检测片段为两种病毒基因；小双节RNA病毒检测片段为同一种病毒基因；小RNA病毒检测片段为四种病毒基因。（3）得到两株圆环病毒及三株多头瘤病毒全基因组序列。结论：本研究通过病毒宏基因组学方法对新疆长尾旱獭病毒组进行全面调查，发现并验证11种脊椎动物病毒科病毒，1种昆虫病毒科病毒，1种大病毒依赖科病毒。根据ICTV最新分类标准，初步遗传进化分析显示都是新的病毒种或亚种，其中两株圆环病毒和五株腺病毒新种；一株多头瘤病毒、一株疱疹病毒和四株星状病毒，暗示可能为新的种。本研究对新疆长尾旱獭进行病毒宏基因组学研究，这些病毒的发现，丰富了新疆长尾旱獭病毒组学数据，体现了病毒宏基因组学分析对于挖掘病毒信息的效率，有突破性的作用。关键词：新疆；长尾旱獭；病毒宏基因组学分析；病毒鉴定I AbstractInrecentyears,newinfectiousdiseasesarecommon,moreandmorenewinfectiousdiseases,moreandmorecomplex,andmoreseverepreventionandcontrolsituation,havebecomeaseriousthreattohumanhealthandsocialdevelopment.Therefore,theeffectivepredictionandpreventionandcontrolofnewonsetinfectiousdiseaseshasbecomeoneofthemajorscientificproblemstobesolvedinhumanpublichealth.Thereareabout2277speciesintheworld,accountingforabout42%ofallmammals.Rodentsarethemostwidelydistributedandmostdiversemammalianspeciesintheworld.Theyarealsooneofthemostimportantnaturalhostsofzoonosis.Theycancarrymorethan180viruses.Therefore,itisofgreatsignificancetounderstandthesystemofrodentvirusintheearlywarningsystemofnewinfectiousdiseases.Atpresent,thereisalackofresearchonrodentcarryingvirusgroupathomeandabroad.Inourcountry,thereisalackoflargescaleresearchonrodentcarryingvirusgroup.Marmotacaudata,asaspecialspeciesinthePamirsPlateau,hasnotbeencarriedoutinthestudyofitsviromes,andthePowassanVirus(POW),RabiesvirusandWoodchuckHepatitisVirus(includingHepatitisBvirus,HepatitisDvirus)thatcauseencephalitisarefoundintheNorthAmericanmarmot,soitisnecessarytostudythemarmotcarryingviromes.Objective:TounderstandthebackgrounddataandpotentialnewvirusoftheviruscarriedbyMarmotacaudatainthePamirsPlateauinordertoprovidebasicdataforpredictingandpreventingthenewonsetofzoonosisinthesourceofmarmot.Methods:Theanatomyofmarmots,lungs,intestines,liver,kidney,lymphandspleenpreservationreserve.Thesamplesofthelungs,intestines,kidneysandlymphoidtissuesweremixedtoextractthevirusnucleicacidinthemixedsample,andreversetranscriptionalcDNAandaddanchoredprimers.ThenthedscDNAwassynthesizedandthe5μLelectrophoresiswastakenbyPCR.ThequalifiedsamplesweresenttotheHuadaCompanyofShenzhenforhigh-throughputsequencing.Thesequencingresultswereanalyzedbyvirusmetagenomicsandthevirusprevalencewasdetected,fullgeneamplification,geneticevolutionanalysis,andsoon,accordingtotheresultsofmacrogenomics.Results:(1)Collectedatotalof101Marmotacaudata,thevirusthroughmetagenomicanalysis,foundatotalof25families,includingvertebratevirus13familiesand18genera,theinsectvirushas2familiesand2genera,plantvirushas6familiesand6generaandvirophagehas1familyandphagehas3familiesand25genera.ThisprojectfocusesontheidentificationandanalysisofAdenoviridae,Herpesviridae,Astoviridae,Anelloviridae,Circoviridae,Polyomaviridae,Parvoviridae,Reoviridae,PicornabiviridaeandPicornaviridae.Thepositiveratewasfoundtobe1.0%-76.2%.Apreliminarygeneticanalysisofthedetectedfragmentswascarriedout.Itwasfoundthatthedetectionfragmentsoftheadenovirusweredividedintotwogroups,andthreesegmentsofDNAPol,HexonandIVa2wereobtained.TheherpesvirusII detectionfragmentwasdividedintotwogroups,andaDNAPolgenewasobtained;thedetectionfragmentoftheastroviruscouldalsobedividedintofourgroups;thedetectionfragmentoftheanelloviruswasthreediseases.Thedetectionfragmentofparvoviruswastwovirusgenes,thedetectionfragmentofthepicobirnaviruswasthesamevirusgene,andthepicornavirusdetectionfragmentwasfourvirusgenes.(3)Thecompletegenomesequencesoftwostrainsofcircovirusandthreestrainsofpolyomaviruswereobtained.Conclusion:ThisstudyconductedacomprehensivesurveyoftheXinjiangMarmotacaudataviromebythemethodofviralmetagenomics.Theepidemiologicalinvestigationof11vertebratevirusfamilies,1insectvirusfamily,and1LavidaviridaeinXinjiangMarmotacaudatawerefoundandverified.AccordingtothelatestICTVclassificationcriteria,preliminarygeneticevolutionanalysisshowsthatallarenewvirusspeciesorsubspecies.Amongthem,twonewstrainsofcircovirusandfivenewadenovirus,apolyomavirus,aherpesvirusandfourastrovirus,implythatitmaybeanewspecies.ThestudyofMarmotacaudatainXinjiangwasstudiedbyvirusmetagenomics.Thediscoveryofthesevirusesenrichedthedataofrodentviromes,andreflectedthebreakthrougheffectofvirusmetagenomicsanalysisontheefficiencyofvirusinformationmining.Keyword:Xinjiang;Marmotacaudata;Viralmetagenomicanalysis;ViralidentificationIII 目录摘要...............................................................................................................................................IAbstract............................................................................................................................................II英文缩略词表...............................................................................................................................VII引言..............................................................................................................................................VIII第一章文献综述.............................................................................................................................11病毒宏基因组学的研究进展.......................................................................................................11.1病毒宏基因组学的概念....................................................................................................11.2病毒宏基因组学的研究方法............................................................................................11.3病毒宏基因组学的应用....................................................................................................21.3.1环境病毒宏基因组学的应用.................................................................................21.3.2肠道及组织病毒宏基因组学.................................................................................22啮齿动物病毒宏基因组学研究...................................................................................................32.1啮齿动物与传染病............................................................................................................32.2啮齿动物病毒宏基因组学研究........................................................................................33长尾旱獭人兽共患病的研究.......................................................................................................4第二章新疆长尾旱獭病毒宏基因组学研究.................................................................................51材料................................................................................................................................................51.1主要试剂及耗材................................................................................................................51.2实验仪器............................................................................................................................71.3生物信息学软件................................................................................................................72方法...............................................................................................................................................72.1长尾旱獭种类鉴定及解剖................................................................................................72.1.1提取DNA...............................................................................................................72.1.2聚合酶链式反应检测.............................................................................................72.2长尾旱獭样品的研磨........................................................................................................82.3病毒宏基因组学处理........................................................................................................82.3.1上清过滤除菌.........................................................................................................82.3.2核酸酶消化.............................................................................................................82.3.3旱獭样品RNA提取及反转录..............................................................................82.3.4双链cDNA合成....................................................................................................92.3.5单引物扩增.............................................................................................................92.3.6非特异性单引物扩增产物电泳及纯化...............................................................103病毒宏基因组学测序.................................................................................................................103.1高通量测序......................................................................................................................103.2宏基因组学注释..............................................................................................................114宏基因组结果PCR验证...........................................................................................................114.1宏基因组结果病毒引物设计及引物制备......................................................................114.2旱獭组织核酸提取..........................................................................................................114.3病毒RNA反转录...........................................................................................................114.4病毒核酸PCR扩增........................................................................................................124.5扩增片段进化分析..........................................................................................................125结果.............................................................................................................................................12IV 5.1旱獭种类鉴定及样品采集信息......................................................................................125.2病毒宏基因组学结果分析..............................................................................................12第三章新疆长尾旱獭宏基因结果验证.......................................................................................161病毒序列分析及检测结果.........................................................................................................161.1腺病毒检测结果..............................................................................................................161.2指环病毒检测结果..........................................................................................................171.3轮状病毒检测结果..........................................................................................................181.4星状病毒检测结果..........................................................................................................191.5圆环病毒检测结果..........................................................................................................201.6疱疹病毒检测结果..........................................................................................................221.7细小病毒检测结果..........................................................................................................221.8小双节RNA病毒检测结果...........................................................................................251.9小RNA病毒目检测结果...............................................................................................261.10多头瘤病毒检测结果....................................................................................................271.11其他病毒及混样宏基因组验证结果............................................................................281.11.1昆虫、植物及噬病毒体检测结果.....................................................................281.11.2混样宏基因组验证结果.....................................................................................292结论.............................................................................................................................................30第四章新型旱獭病毒的鉴定.......................................................................................................321材料.............................................................................................................................................321.1旱獭样品..........................................................................................................................321.2试剂及耗材......................................................................................................................321.3实验仪器..........................................................................................................................321.4生物信息学软件..............................................................................................................322方法.............................................................................................................................................332.1病毒核酸提取..................................................................................................................332.1.1病毒DNA提取....................................................................................................332.1.2病毒RNA提取及反转录....................................................................................332.2引物设计..........................................................................................................................332.3旱獭样品检测..................................................................................................................332.4病毒全基因组扩增及检测..............................................................................................342.4.1普通PCR扩增方法.............................................................................................342.4.2载体连接、转化及克隆培养...............................................................................343结果.............................................................................................................................................353.1腺病毒鉴定结果..............................................................................................................353.2星状病毒鉴定结果..........................................................................................................393.3疱疹病毒鉴定结果..........................................................................................................403.4圆环病毒鉴定结果..........................................................................................................443.5多头瘤病毒鉴定结果......................................................................................................483.6病毒单样检测结果..........................................................................................................504结论.............................................................................................................................................50全文结论.........................................................................................................................................52主要创新点.....................................................................................................................................53参考文献.........................................................................................................................................54V 附录.................................................................................................................................................59致谢.................................................................................................................................................64作者简介.........................................................................................................................................65石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表................................................66VI 英文缩略词表英文缩写英文全称中文名称AAAminoacids氨基酸ADPrimerArbitraryDegeneratePrimer随机简并引物BLASTBasiclocalalignmentsearchtool基本局部匹配查询工具bpBasepair碱基对cDNAComplementaryDNA互补DNAdscDNADouble-strandedcomplementaryDNA双链互补DNAdsRNADouble-strandedRNA双链RNAddH2ODoubledistilledwater双蒸水DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPDeoxyribonucleictriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸InternationalCommitteeonTaxonomyofICTV国际病毒分类委员会ViruseskbKilobases千碱基SARSSevereacuterespirationsyndromes非典型肺炎MERSMiddleEastrespiratorysyndrome中东呼吸综合症CoVCoronavirus冠状病毒LBLysogenybroth菌液肉汤minMinute分钟NCBINationalCenterforBiotechnologyInformation美国国立生物技术信息中心NRNonredundantdatabase非冗余数据库ntNucleotide核苷酸OIEOfficeinternationalepizooties世界动物卫生组织ORFOpenreadingframe开放性阅读框PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应RNARibonucleicAcid核糖核酸RT-PCRReversetranscriptionpolymerasechainreaction逆转录聚合酶链式反应SecSecond秒Sequence-independentsingleprimerSISPA序列非依赖性单引物扩增amplificationSPSpecificPrimer特异性引物AdVAdenovirus腺病毒AstVAstovirus星状病毒CVCircovirus圆环病毒PyVPolyomavirus多头瘤病毒PVParvovirus细小病毒HePVHerpesvirus疱疹病毒NoVNodavirus野田村病毒AnVAnellovirus指环病毒PiVPicobirnavirus小双节RNA病毒RVRotavirus轮状病毒IfvIflavirus传染性软腐病毒VII 引言啮齿动物属于啮齿目、松鼠科，是世界上种类最多、分布最广的哺乳动物，栖息环境多种多样，与人类接触密切，还是重要的病毒储存库，能携带大量的病毒，包括汉坦病毒[1]、冠状病毒[2]、砂粒病毒[3]等，是一些新发的人兽共患病病毒重要来源。目前，全球关于新发突发传染病疫情的报道层出不穷。重大传染病疫情的发生不仅严重威胁人类健康，并且由于所引起的人群恐慌、区域性限制等，给社会稳定和经济发展等带来了巨大冲击。野生动物遍布全球各地，很多新发动物性传染病是来源于野生动物，这为世界范围内的公共卫生安全和传染病防控带来极大隐患。过去，由于我们对动物源性传染病宿主所携带的病毒情况缺乏了解，面对突发新发传染病爆发的时候并不能找到其传染源头和有效的防控措施。但随着第二代测序技术的发展，野生动物携带病毒的发掘工作越来越多，例如蝙蝠、各种野生鸟类、啮齿动物等，但全球范围内啮齿目动物携带病毒组的研究工作仍处于起步阶段，而我国更缺少针对啮齿目动物携带病毒组的大规模系统性研究。长尾旱獭作为帕米尔高原地区特有土著种，建国以来，对长尾旱獭等新疆野生啮齿动物携带鼠疫菌情况的研究有了很大进展，发现多处鼠疫疫源地并分离出大量鼠疫菌株。但对于长尾旱獭携带病毒情况研究较少，本课题组采取宏基因组学方法，对新疆塔什库尔干自治县境内长尾旱獭携带病毒组的情况进行了研究。新疆长尾旱獭水平分布区与天山旱獭及喜马拉雅旱獭相衔接。该地区地处我国西北边境线，地广人稀，自然环境比较恶劣，与巴基斯坦、克什米尔、阿富汗、塔吉克斯坦、吉尔吉斯斯坦毗邻。长尾旱獭是鼠疫的自然宿主之一，早在1935年乌恰县境内帕米尔高原北坡哈勒牧场的牧民因接触旱獭而染疫，并造成一次肺鼠疫流行[4]。根据病毒宏基因组学结果，本研究对长尾旱獭携带的疱疹病毒科、腺病毒科、多头瘤病毒科、指环病毒科、圆环病毒科、呼肠孤病毒科、细小病毒科、小双节RNA病毒科、小RNA病毒科、星状病毒科、双顺反子病毒科及大病毒依赖科病毒，进行宏基因组学分析和PCR验证等，并尝试鉴定新的病毒种。本研究主要分两个部分。第一部分主要是对新疆长尾旱獭进行采集，并使用实验室已建立的病毒宏基因组学方法对长尾旱獭样品进行研究，以期望获得新疆长尾旱獭携带病毒组情况。第二部分主要是基于第一部分的病毒宏基因组学结果注释信息，对有意义的病毒进行深入研究。VIII 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定第一章文献综述1病毒宏基因组学的研究进展1.1病毒宏基因组学的概念病毒是地球上最为丰富的微生物之一，形态和种类多种多样。尤其是2002-2003年爆发的SARS冠状病毒疫情[5]，1997年至今不断变异的高致病性禽流感H5和H7[6-9]，2009年的甲型H1N1[10]，2010年的新型布尼亚病毒[11]等，这些病毒性传染病无不都造成重大的经济损失和社会影响，广大人民群众的生命安全遭受了严重的威胁。我们对于疾病的监控不仅要集中于人类自身，还要对野生动物进行实时的监测和预警，掌握病毒在动物和环境中的分布情况，这对于防控病毒性传染病具有重大意义。传统的病毒检测方法有病毒的细胞分离、电镜观察、血清学反应、聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction,PCR）、酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）等。而很多病毒缺乏敏感的细胞系或没有细胞病变（Cytopathiceffect，CPE），电镜观察病毒灵敏性较低，高效特异性抗体的缺乏都限制了传统方法作用的发挥。而近些年来一种新兴的病毒检测方法，即基于高通量测序技术的病毒宏基因组学，其在监测病毒变异、关注病毒群落，发现新病毒等方面具有广阔的应用前景，为人类预防和诊断新发突发病毒性传染病提供了有效的检测技术[12]。宏基因组技术是一种能够直接对环境中的微生物样品进行基因组或转录组高通量测序和分析，而不需要对病原微生物进行培养的检测方法[13]。1991年，Schmidt等人首次提出环境基因组学（EnvironmentalGenomics）的概念[14]。1998年，Handelsman等人将土壤中所有微生物基因组的总合命名为土壤宏基因组（TheMetagenomeoftheSoil），不仅全面的定义了宏基因组（Metagenome）的概念，还阐明了宏基因组是对特定环境中微生物基因组总合的非培养的研究。在初期的病毒宏基因组学研究中，经常涉及到样品的初步制备及DNA的剪切和克隆，这些步骤是为获取环境样品中低丰度的病毒核酸（如每100L海水约有10mg病毒核酸)[15]。宏基因组学在病毒学领域的第一次应用是对在美国圣地亚哥两个近岸海洋地点取样的病毒群落进行的分析。宏基因组学研究现在涵盖广泛的研究领域，包括海洋环境研究、植物和农业生物技术、人类遗传学和人类疾病诊断[16]。简单来说，病毒宏基因组学就是通过各种手段，将环境中除病毒外的所有核酸去除掉，然后将病毒组的核酸与现有数据库进行比较，以期获得环境病毒组组成情况。环境中所有病毒组数据就是病毒宏基因组文库（MetagonomicLibrary）。该方法无论对于可培养的还是不可培养的，已知的或新的病毒，都可以很容易地用病毒宏基因组方法检测到。1 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定1.2病毒宏基因组学的研究方法宏基因组学的发展，自然离不开过去十几年在测序技术和生物信息学领域的飞速发展。近些年来发展起来的高通量测序技术，已经成为病毒宏基因组学研究的新宠儿。自从各种第二代测序(next-generationsequencing,NGS)平台出现以来，宏基因组学也对兽医科学和病原体检测产生了影响。病毒宏基因组学对于检测预警新发突发传染病具有重要的作用。不同的测序平台根据测序原理、测序速度、成本和读取长度而有所不同，但这些平台也遵循一个典型的宏基因组处理程序。即一般包括三个步骤：（1）样品准备；（2）高通量测序；（3）生物信息学分析。通常宏基因组结果数据都非常庞大，测序结果也需要专门的软件来处理，如RAMMCAP和MetaStats[17]。1.3病毒宏基因组学的应用宏基因组学在多种样本中识别新病毒的成功，为新的应用领域打开了大门，特别是在公共卫生和传染病预防领域。虽然宏基因组学尚未成为常规诊断的一部分，但临床病毒学研究的结果为临床病毒学实践提供了有价值的信息。例如，Finkbeiner等人使用宏基因组学分析12名腹泻儿童样本，并鉴定了大量已知的真核生物病毒但来自于新病毒的序列[18]。2009年甲型流感大流行（2009H1N1）也证明，宏基因组学对于快速确定流感病毒全基因组提供了有力帮助[19]。Palacios等人利用宏基因组学方法，在病毒细胞培养、PCR、血清学和寡核苷酸探针检测为阴性的标本中发现了一种病毒[20]。近些年来，病毒宏基因组学的应用大大拓宽了人们对环境病毒组的认知。1.3.1环境病毒宏基因组学的应用人类生活环境基本包括空气、海洋、土壤和各种水系等无机环境，其中包含有大量微生物。如流感病毒可以借助空气传播，肠道病毒和肠胃炎病毒是水体典型病毒，土壤中存在大量噬菌体。当我们把目光转到这些地方，我们不禁要问，这里有多少种病毒，含量是多少，有哪些与人类生活息息相关的病毒。随着病毒宏基因组学的发展，人们已经将这些研究深入到海洋、湖水、热泉和下水道等无机环境[13,21,22]。如在2012年，ShannonJ等人对整个印度洋海域进行不同点的多样品浮游生物病毒的宏基因组学研究，他们采用一种新的分类方法-MGTAXA（宏基因组序列分类软件），通过预测假定寄主属的分类，对印度洋病毒与寄主关系进行评价，其中原球菌、棘球蚴和SAR86群的成员含量最丰富。这是第一次从整体上研究多个不同大小的浮游生物病毒动态，并提供对病毒多样性的前所未有的检测，代谢潜能与病毒-宿主相互作用[23]。宏基因组学与社会生活也息息相关，在生产实践中也发挥着作用。在2014年，AnastasiaS等人应用不同的分析方法，对两个城市相似土壤环境的样本随机全基因组测序。结果发现随机引物DNA扩增对两地相似土壤具有敏锐的鉴别能力，可以对法医鉴定提供直接证据[24]。类似的应用研究还非常多，人类也在不断开拓宏基因组学的新边疆，这将对人类对于病毒和生命科学的认知提供极大的帮助。1.3.2肠道及组织病毒宏基因组学病毒宏基因组学的应用不仅有无机环境，还有各种有机环境，如各种哺乳动物或、2 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定野生鸟类、家禽家畜等的血清、组织脏器，发现大量新的病毒。将宏基因组学应用于人类肠道微生物学研究，发现宏基因组学不仅可以识别人肠道微生物体的多样性，而且还可以揭示新的基因和微生物途径，揭示功能失调。宏基因组学的应用在揭示人类肠道微生物体与疾病的机制和相互关系方面具有巨大的潜力[25]。如2017年敖元云等对我国广西龙虎山野生猕猴粪便所携带的病毒组进行宏基因组学研究，发现人诺如病毒GL3和GⅡ17基因型即具有潜在公共卫生意义的新型小RNA病毒（肠道病毒）、类人星状病毒、人博卡病毒样细小病毒等，为动物源性病毒的预警提供了本底数据[26]。这对于检测发病动物携带病毒情况，解释发病动物致病机理，预防和控制相关疾病均有重大意义。2啮齿动物病毒宏基因组学研究2.1啮齿动物与传染病啮齿类动物属于啮齿目，包括松鼠形亚目、河狸亚目、豪猪亚目、鼠形亚目和鳞尾松鼠亚目5个亚目，35个科，389个属，约2700种，占哺乳动物的43%，是地球上最大的哺乳动物种群，分布在我国的将近200种啮齿类动物[27,28]。它们广泛地分布在除南极洲以外的所有大洲，是世界上分布最广的哺乳动物。啮齿动物不仅具有分布广泛、种类众多、多群居迁移生活的特点，而且栖息环境具有多样性，是重要的病毒储存库，能携带大量的病毒。有些啮齿动物与人类接触密切，通过尿液、粪便或体外寄生的节肢动物（如蜱、螨虫和跳蚤）导致多种病毒交叉传播[29-33]。已知啮齿动物能够传播多种病毒，包括砂粒病毒科、呼肠孤病毒科、披膜病毒科、小RNA病毒科和黄病毒科[3,29,34]。汉坦病毒肺综合征（hantaviruspulmonarysyndrome,HPS）是一种死亡率极高的传染病，最早发现于美国西南部，是由一种名为辛诺柏病毒（SinNombrevirus，SNV）的人兽共患病引起的，起源于鹿鼠[35]（PeromyscusManculatus）。从那时起，HPS在美国各地区被发现，大部分有SNV引起。而从啮齿动物传播的汉坦病毒属的病毒有汉坦病毒、贝尔格莱德病毒、首尔病毒和普马拉病毒，这些病毒在全球各地引起肾综合征出血热（hemorrahagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS）[36-42]。HFRS在我国31个省中的28个省流行，是一种重要的公共卫生疾病。2007年我国发生1200多例HFRS病例。据报道，内蒙古约有8300例HFRS患者，自1955-2006年间有261（3.14%）人死亡[43]。2.2啮齿动物病毒宏基因组学研究较早的宏基因组学研究来自于美国加州旧金山血液系统研究所做的野生啮齿动物粪便病毒组的研究。他们在美国加利福尼亚和弗吉尼亚采集3种共计105只啮齿动物，通过病毒宏基因组学方法，发现哺乳动物病毒有圆环病毒、小双节RNA病毒、小RNA病毒、星状病毒、细小病毒、乳头瘤病毒、腺病毒和冠状病毒；发现17种小型环状DNA病毒，与圆环病毒相近，可能是新的圆环科病毒；发现两种与致人疾病的Aichivirus相近的病毒；检测到第一例鼠的萨佩洛病毒属和小双节RNA病毒，首次检测到小鼠星状3 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定病毒基因组；同时还有鼠乳头瘤病毒基因组和新型腺病毒、腺联病毒基因片段。宏基因组学结果还发现昆虫病毒和植物相关病毒。而进一步对全部和部分病毒基因组的系统发育分析揭示了许多以前未报告的病毒种类、属和科。这项研究提高了我们对野生啮齿动物病毒多样性的理解，并突出了哺乳动物中仍有大量未被鉴定的病毒[44]。而国内对啮齿动物研究也是处于起步阶段，2017年中国疾病预防控制中心杜江博士的研究课题：《啮齿目动物沙粒病毒科、黄病毒科等7科病毒组及进化研究》，是比较早的啮齿动物宏基因组学研究。其研究共采集啮齿目6个科51种动物，鼩形目鼩鼱科和兔形目鼠兔科4种动物，共计6010份咽拭子和肛拭子样品。目前已完成7个病毒科28个病毒属65株病毒全基因组序列、73株病毒基因组序列，建议新的病毒属7个、新的病毒种55个。在国际上首次发现啮齿目动物携带黄病毒科瘟病毒属的病毒，及跳鼠科的三趾跳鼠携带沙粒病毒[45]。3长尾旱獭人兽共患病的研究旱獭属于啮齿目松鼠科，我国分布有四个旱獭种类，分别是新疆灰旱獭(Marmotabaibacina)、新疆长尾旱獭（Marmotacaudata）、喜马拉雅旱獭（Marmotahimalayana）和西伯利亚旱獭（Marmotacaudata），主要分布于新疆、西藏、青海和内蒙古。近些年来，关于旱獭携带人兽共患病的研究逐年增多，长尾旱獭作为帕米尔高原地区代表性物种，也被发现多种人兽共患病。长尾旱獭是鼠疫耶尔森菌最重要的动物宿主之一，我国很早就展开鼠疫自然宿主的调查，发现很多种啮齿动物都可携带鼠疫杆菌，其中就在长尾旱獭及其寄生的跳蚤中分离到37株鼠疫杆菌，主要储存宿主是红旱獭，而传播媒介是谢氏山蚤[46]。2011年，F.C.Origgi等人，在瑞士一个海拔2000米的小动物园里，发现7只从中亚引进的长尾旱獭，冬眠时发生死亡，他们在这7只长尾旱獭体内发现犬瘟热病毒及其与正痘病毒属病毒的混合感染[47]。这说明犬瘟热可能发生跨物种传播；犬瘟热还可以和其他病毒混合感染，而它们的混合感染则可能导致动物的死亡。喜马拉雅旱獭作为高原特有物种之一，近些年来研究逐渐增多，2016年张翠媛硕士通过病毒宏基因组学方法对青海省的喜马拉雅旱獭粪便进行处理，发现一株新型甲肝病毒[48]。同时，宏基因组学结果也注释到圆环病毒科、小双节RNA病毒科、小RNA病毒科、细小病毒科等，此外也有植物病毒和昆虫病毒。2018年4月25日，中国疾病预防控制中心、传染病预防控制国家重点实验室徐建国院士团队在EmergingMicrobes&Infections杂志发表文章，首次报道一种新型的蜱传脑炎病毒，命名为喜马拉雅型蜱传脑炎病毒（Himalayan,Him-TBEV）。徐建国团队在喜马拉雅旱獭器官组织中检测到蜱传脑炎病毒全基因组，进化分析表明，喜马拉雅型蜱传脑炎病毒最早和欧洲型蜱传脑炎病毒分化，分别向欧洲和亚洲扩散，后来才分化出西伯利亚型和远东型蜱传脑炎病毒。也就是说。喜马拉雅型森林脑炎病毒在进化史上，是西伯利亚和远东型森林脑炎病毒的祖先[49]。4 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定第二章新疆长尾旱獭病毒宏基因组学研究新疆地处我国西北边陲，占我国国土面积的六分之一，与八个国家接壤，有着漫长的陆地边境线。这里有丰富的动植物资源，也是我国路上通往中亚、西亚、南亚、欧洲的必经之路，著名的“丝绸之路”就在这里。新疆战略地位之重要，不言而喻。新疆气候为温带大陆性气候，全年少雨，境内有阿尔泰山、天山和昆仑山，准格尔盆地和塔里木盆地形成独特的地理特点，因此有“三山夹两盆”之称。新疆长尾旱獭的流行病学研究较少，尤其是对其携带病毒组的研究更少，较多的是其携带鼠疫的研究。本研究采用本实验室建立的病毒宏基因组学方法，对新疆长尾旱獭携带病毒组的本底情况进行调查。利用病毒宏基因组学分析方法，对宏基因结果进行发现研究，为了解我国新疆地区长尾旱獭携带病毒组的情况提供基础数据。1材料1.1主要试剂及耗材样品采集：长尾旱獭的采集时间为2016年8月份，采集数量为101只，采样地点为喀什地区的塔什库尔干塔吉克自治县。长尾旱獭采集地理分布图如图1.1所示；长尾旱獭采集信息如表1.1所示。试剂：核酸消化酶：脱氧核糖核酸酶I（DNaseI）、10×DNaseIbuffer、脱氧核糖核酸酶A（RNaseA）购自大连宝生物（TaKaRa）公司。核酸提取试剂：RNA提取试剂盒（RneasyMiNiKit）购自德国Qiagen公司；DNA提取试剂盒（TIANampGenomicDNAKit）购自天根生化科技（北京）有限公司。反转录及PCR试剂：随机引物（RandomPrimer-6mer）、反转录酶（ReverseTranscriptaseM-MLV）、RNA酶抑制剂（RibonucleaseInhibitor）、5×RTBuffer、无RNA酶水（RNase-freeWater）、dNTPMixture（10nM）、10×KlenowBuffer、Klenowfragment购自中国大连宝生物（TaKaRa）公司，TaqPCRMasterMix购自天根生化科技（北京）有限公司。电泳试剂：琼脂糖购自西班牙Biowest公司；GelRed核酸染料购自美国Biotium公司。引物合成：由北京Invitrogen公司和吉林省库美生物科技有限公司完成。普通样品测序是由吉林省库美生物科技有限公司完成；病毒宏基因组学测序及生物信息学分析是由深圳华大科技有限公司完成。耗材：0.2mLPCR管购自美国Axygen公司；0.45μM和0.22μM孔径的针头滤器购自美国Millipore公司。5 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定200公里图1.1新疆长尾旱獭采样地点（黑色圆点）。Figure1.1ThesamplingsitesofMarmotacaudatainXinjiang(blackdots).6 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定表1.1新疆长尾旱獭采集信息Table1.1NumbersandlocationinformationofMarmotacaudatainXinjiangBarcode州/地区县乡镇数量1喀什地区塔什库尔干塔吉克自治县马尔洋乡10喀什地区塔什库尔干塔吉克自治县瓦恰乡62喀什地区塔什库尔干塔吉克自治县塔合曼乡43喀什地区塔什库尔干塔吉克自治县红其拉甫144/5喀什地区塔什库尔干塔吉克自治县红其拉甫206喀什地区塔什库尔干塔吉克自治县红其拉甫117喀什地区塔什库尔干塔吉克自治县卡拉苏乡108/9喀什地区塔什库尔干塔吉克自治县红其拉甫26总计2251011.2实验仪器玻璃组织研磨器购自江苏海门市玻璃制品厂；生物安全Ⅱ级操作台购自美国Thermo公司；PCR扩增仪购自美国Bid-Rad公司；紫外凝胶成像系统购自美国UVITEC公司；电泳仪和电泳槽购自北京六一公司；台式高速离心机购自德国eppendorf公司；NanoDrop核酸检测仪购自美国ThermoFisher公司。1.3生物信息学软件引物设计软件：PrimerPremier5.0;序列比对搜索工具：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi；遗传进化分析软件：MEGA6.06；序列分析：DNAStar软件包。2方法2.1长尾旱獭种类鉴定及解剖采集的旱獭样品干冰保存并运送到实验室后，经过PCR扩增旱獭肌肉线粒体细胞色素b进行分子鉴定，扩增片段长503bp。2.1.1提取DNA取火柴头大小的旱獭肌肉组织，约50mg，放入玻璃研磨器中，加入400μL无菌SMBuffer研磨液进行研磨，使用天根DNA提取试剂盒并按照操作说明书提取DNA。2.1.2聚合酶链式反应检测检测旱獭种类引物序列见附录2。反应体系如表1.2。7 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定表1.2旱獭种类鉴定PCR反应体系Table1.2ThecompositionofPCRamplificationtoidentifytheMarmotspecies组份用量2×TaqPCRMasterMix12.5μLddH2O9.5mLPrimerS2μLPrimerA2μLDNA模板1μL反应条件:94°C5min;(94°C,30s;56°C,1min;72°C,1min)40cycles；72°C,10min；4℃保存。反应产物经1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像系统下观察电泳结果，将产物直接送至吉林省库美生物技术有限公司进行Sanger测序，检测结果在NCBIBLAST比对，结果中同源性最高的基因组信息所对应的旱獭种类即为旱獭种类。鉴定过种类的旱獭使用解剖器械在Ⅱ级安全柜中解剖，取肠道、肺脏、肾脏、淋巴的宏基因组混样和备份混样，同时取肺、肠、肝、肾、淋巴、脾的组织单样装于1.5mL的无菌离心管中，-80℃保存。2.2长尾旱獭样品的研磨向肠道、肺脏、肾脏、淋巴的宏基因组混样中加入800μL的SMBuffer研磨液进行研磨。研磨后的液体，在4℃10,000×g离心10min，取上清。其中Barcode4/5和8/9都是前者是肠、肺混样，后者是肾和淋巴混样，其余Barcode为四种脏器混样。2.3病毒宏基因组学处理2.3.1上清过滤除菌为尽可能降低细菌、细胞碎片等杂质对样品的污染，离心收集的上清通过0.22μm的滤膜过滤除菌，收集滤过液。2.3.2核酸酶消化使用表1.3体系进行DNA酶和RNA酶消化：表1.3核酸消化反应体系Table1.3Thecompositionofthereactionofnucleicdigestion组份用量过滤后液体130μLRecombinantDnaseI4μL10×DnaseIbuffer15μLRNaseA工作液1μL37℃孵育1小时，然后立即进行RNA提取。2.3.3旱獭样品RNA提取及反转录使用RNA提取试剂盒（RneasyMiNiKit），按操作说明书进行提取，并测定提取RNA8 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定的浓度。将提取的RNA，加入反转录试剂。反转录时使用锚定了20nt的标签序列六聚随机引物（Hexamer），其序列有PrimoRandomv.3.4设计。反转录体系如表1.4。表1.4病毒RNA反转录体系Table1.4ThecompositionofviralRNAreversetranscription组份用量RandomPrimerforRT（50μM）1μLRNA模板13μL反应条件：65℃预变性5min，立即冰浴2min，再加入如下组份：组份用量dNTPs（10mM）1μLRNAsin0.5μL5×RTBuffer4μLM-MLVRtase1μL42℃60分钟，75℃10分钟灭活酶的活性。2.3.4双链cDNA合成将反转录得到的sscDNA进行dscDNA的合成，体系如表1.5：表1.5dscDNA合成体系Table1.5ThecompositionofdscDNAsynthesis组份用量sscDNA20μLRandomPrimerforRT（50μM）0.1μL92℃2min，立即进行冰浴5min。再加入如下组份：组份用量dNTPs（10mM）0.2μL10×KlenowBuffer3μLKlenowfragment1μLddH2O5.7μL37℃60分钟，75℃10分钟。2.3.5单引物扩增将2.3.4中得到的dscDNA产物，进行SISPA扩增，扩增体系如表1.6：表1.6SISPA扩增体系Table1.6ThecompositionofSISPAusinganchoredprimers组份用量Template5μLAnchoredPrimerforPCR（50μM）1μL2×MasterMix25μLddH2O19μL反应条件：94°C2min;(94°C,30s;40℃30s；50°C,30s;72°C,1min)30cycles；72°C,10min；4℃保存。9 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定2.3.6非特异性单引物扩增产物电泳及纯化琼脂糖凝胶电泳：称取1.0g琼脂糖，加入100mL的1×TAE电泳缓冲液，煮沸后加入10μL的GelRed核酸染料，倒入制胶器中，待胶凝固后，取5μLPCR产物进行电泳，电泳条件为130V，恒压运行30min，电泳结束后在紫外凝胶成像仪中观察。将扩增条带呈现Smear带，介于200~1000bp之间，多集中于300bp附近的产物进行纯化，如图1.2。乙醇沉淀提纯：i)收集SISPA扩增的产物，加入10%（v/v）体积的3MNaAc（pH5.2）；ii)加入1倍体积的预冷异丙醇，充分振荡混匀；iii)将其转移于-20℃下静置30分钟以上；iv)然后在4℃，12,000rpm下离心15分钟，沉淀DNA;v)弃掉上清，加500μL乙醇，漂洗沉淀，再4℃，10,000rpm下离心10分钟；vi)弃掉上清，待干燥后，添加60μLRNase-freeWater溶解沉淀。图1.2SISPA纯化产物电泳图Figure1.2ElectrophoreticmapofSISPApurifiedproduct3病毒宏基因组学测序3.1高通量测序将2.3.6得到的纯化产物送交深圳华大科技有限公司在SolexaHiSeq2000平台上进行高通量测序。首先将扩增片段超声波破碎到180bp大小，用Klenow酶和dATP在片段两端产生oligoA突起，然后连接在Solexa接头上，根据接头引物进行PCR扩增成DNA文库；最后DNA文库结合到芯片上，通过“边合成边测序（”Sequencing-by-Synthesis,SBS）进行测序。测得的读长（Reads）后经过GAPipeline软件进行碱基呼叫（BaseCalling），将未被呼叫上的序列和接头序列去除掉，大于100bp的序列通过SOAPdenove软件进行10 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定组装成为重叠序列（Contigs）。3.2宏基因组学注释所有的重叠序列通过BLASTx和BLASTn在线注释序列的信息，将BLAST所得到的hit的e值小于10e-5的序列定为有意义的序列，将序列按照注释的信息分为细菌相关序列、真核生物相关序列和病毒相关序列。4宏基因组结果PCR验证4.1宏基因组结果病毒引物设计及引物制备将病毒宏基因组学结果给出的病毒序列在GenBank的非冗余数据库（Nonredundantdatabase,NR）中用BLAST工具进行比对搜索，得到相似度最高的比对结果，同时查阅ICTV报告，找出该病毒的属分类级的明细，将NR库比对的结果和ICTV报告的属分类明细的序列信息从GenBank中下载下来，然后用MEGA6.0.6软件比对，截取保守区域（长度最好为400-800bp），将该区域用PrimerPremier5.0进行引物设计，优先考虑套式引物，引物序列信息见附件表S2。引物合成后，用TEbuffer（pH8.0）溶解为10mM浓度备用。4.2旱獭组织核酸提取101只旱獭的混样（包括肺脏、肠道、肝脏、肾脏、淋巴、脾脏）取火柴头大小，每一只旱獭作为一个混样（核酸名称取为H1-H101）。加入500μLSM缓冲液用玻璃研磨器彻底研磨，研磨液12,000×g离心10min，收取上清提取核酸。取100μL上清用DNA提取试剂盒（TIANampGenomicDNAKit）提取DNA;取100μL上清用RNeasyKit（Qiagen）试剂盒提取RNA。4.3病毒RNA反转录提取的RNA按照下列体系进行反转录，合成cDNA：表1.7RNA反转录体系Table1.7ThecompositionofviralRNAreversetranscription组份用量RandomPrimer-6mer（50pmol/μL）3μLOligod（T）15primers（50pmol/μL）1μLTemplate31μL反应条件：85℃预变性5min，迅速冰浴10min，再加入如下组份：组份用量ReverseTranscriptaseM-MLV（200U/μL）1μLRibonucleaseInhibitor（40U/μL）1μL5×M-MLVBuffer10μLdNTPMixture（10mMeach）3μL11 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定反应条件：42℃80min，80℃灭活5min，4℃保存。4.4病毒核酸PCR扩增加入稀释的引物、模板及PCR预混液试剂，设ddH2O做阴性对照，PCR反应体系见表1.8：表1.8PCR扩增反应体系Table1.8ThecompositionofPCRamplification组份用量2×TaqPCRMasterMix12.5μLddH2O9.5μLForwardprimer（10pmol/μL）1μLReverseprimer（10pmol/μL）1μLDNA模板1μL反应条件：94℃5min；（94℃30s;50-60℃1min；72℃1min）35cycles;72℃10min；4℃保存。退火温度以引物实际的退火温度为准。普通PCR40个循环，外套PCR30个循环，内套PCR35个循环。所有的混样都进行宏基因组结果病毒的验证。扩增阳性片段直接送吉林省库美生物科技有限公司进行Sanger测序，获得扩增片段的序列信息。4.5扩增片段进化分析将测序得到的片段进行BLAST比对，找出最高同源性的序列，同时按照ICTV分类目录，从GenBank中下载“属”分类级上的代表序列。将所有的序列经ClustalW多重比对后，多余序列手工裁剪到合适的长度，然后再次比对，比对结果经MEGA6.06进行最大似然法（Maximum-likelihood）或邻间法（Neighbor-joining）画进化树，步展值取1000。5结果5.1旱獭种类鉴定及样品采集信息旱獭样品信息见图1.1和表1.1。所收集的旱獭为松鼠科（Sciuridae）旱獭属（Marmota）长尾旱獭（Marmotacaudata）种。5.2病毒宏基因组学结果分析经过测序分析，将Virus-likecontigs进行进一步的研究。经过分析整理，得出这些Contigs注释到25个病毒科和51个病毒属，病毒统计见表1.10、图1.2。其中，包括脊椎动物病毒有13个科18个属，昆虫病毒有2个科2个属，植物病毒有6个科和6个属，噬病毒体科1个科1个属，3个噬菌体病毒科25个属。其中脊椎动物病毒主要有腺病毒科（Adenoviridae）的哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）、指环病毒科（Anelloviridae）的δ指环病毒属和ι指环病毒属、星状病毒科（Astroviridae）的哺乳动物星状病毒12 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定（Mamastrovirus）、圆环病毒科（Circoviridae）的圆环病毒属（Circovirus）、疱疹病毒科（Herpesviridae）的鼠巨细胞病毒属（Muromegalovirus）、野田村病毒科（Nodaviridae）、细小病毒科（Parvoviridae）的博卡细小病毒属（Bocaparvovirus）和依赖病毒属（Dependoparvovirus）、小双节RNA病毒科（Picobirnaviridae）的小双节RNA病毒属（Picobirnavirus）、小RNA病毒科（Picornaviridae）的Hunivirus和Mosavirus、多头瘤病毒科（Polyomaviridae）、呼肠孤病毒科（Reoviridae）的A型轮状病毒属（RotavirusA）、逆转录病毒科（Retroviridae）的α逆转录病毒属（Alpharetrovirus）和β逆转录病毒属（Betaretrovirus）及γ逆转录病毒属（Gamaretrovirus）、弹状病毒科（Rhabdoviridae）；昆虫病毒包括传染性软腐病毒科（Iflaviridae）及双顺反子病毒科（Dicistroviridae）；噬病毒体病毒大病毒依赖科（Lavidaviridae）。13 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定Adenoviridae(20)Anelloviridae(120)Astroviridae(3)Circoviridae(88621)Herpesviridae(367)Nodaviridae(609)Parvoviridae(206563)Picobirnaviridae(27)Picornaviridae(7)Polyomaviridae(144)Reoviridae(22)Retroviridae(4502)Rhabdoviridae(407)Iflaviridae(2)Dicistroviridae(32)Alphaflexiviridae(1)Geminiviridae(17)Potyviridae(14)Tombusviridae(2)Phycodnaviridae(1892)Partitiviridae(2)Lavidaviridae(3)图1.2病毒宏基因组学序列注释信息Figure1.2ViralMetagenomictaxonomyofviral-likesequencesinXinjiangLavidaviridae3Partitiviridae2Phycodnaviridae1892Tombusviridae2Potyviridae14Geminiviridae17Alphaflexiviridae1Dicistroviridae32Iflaviridae2Rhabdoviridae407Retroviridae4502Reoviridae22Polyomaviridae144Picornaviridae7Picobirnaviridae27Parvoviridae206563Nodaviridae609Herpesviridae367Circoviridae88621Astroviridae3Anelloviridae120Adenoviridae20050000100000150000200000250000图1.3病毒宏基因组学注释信息Figure1.3ViralMetagenomictaxonomyofviral-likesequencesinXinjiang14 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定表1.10新疆旱獭病毒宏基因组学病毒序列注释信息Table1.10Viraltaxonomyofviral-likesequencesinXinjiangMarmotaCaudataHostViralfamilyViralgenusNO.ofReadsNO.ofContigsIdentity（nt）Identity（aa）VertebrateAdenoviridaeMastadenovirus20386%54%Deltatorquevirus113869-76%44-53%AnelloviridaeLotatorquevirus7174%61%AstroviridaeMamastrovirus3377-78%78-94%CircoviridaeCircovirus886212875-86%53-79%HerpesviridaeMuromegalovirus3677770-86%33-75%NodaviridaeUnclassified6097-39%Bocaparvovirus1956097076-90%70-94%ParvoviridaeDependoparvovirus109544669-94%42-93%PicobirnaviridaePicobirnavirus27771-76%42-78%Hunnivirus21-74%PicornaviridaeMosavirus51-65%PolyomaviridaeUnclassified14421ReoviridaeRotavirus22570-93%90%RetroviridaeAlpharetrovirus744--Betaretrovirus36648856-62%74-93%Gammaretrovirus76410660-72%70-80%RhabdoviridaeUnclassified407990-100%60-69%IflaviridaeUnclassified2271-80%80-88%InsectDicistroviridaeUnclassified322-52-59%AlphaflexiviridaePotexvirus1181%-15 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定GeminiviridaeGemycircularvirus17261%74%PotyviridaeUnclassified14270%-PlantTombusviridaeAlphacarmovirus2170%77%PhycodnaviridaeUnclassified189227976%-PartitiviridaePartitivirus21-63%VirophageLavidaviridaeMavirus3175%80%Total2227303377776注：-：粗体部分为本研究已验证病毒。这些脊椎动物病毒中，Virus-likecontigs中最多的是逆转录病毒科，有106条，这些Contigs的注释信息经BLAST后显示与目前NCBI所收录疱疹病毒核酸同源性为70%-86%，氨基酸同源性为33%-75%。从注释信息看来，Mastadenovirus、Deltatorquevirus、Iotatorquevirus、Mamastrovirus、Circovirus、Muromegalovirus、Bocaparvovirus、Dependoparvovirus、Picobirnavirus、Hunnivirus、Mosavirus、Rotavirus与现在有的数据库的序列同源性基本都在60%以上；而植物病毒如：Potexvirus、Gemycircularvirus、Alphacarmovirus等核苷酸同源性也都不低于60%。16 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定第三章新疆长尾旱獭宏基因结果验证1病毒序列分析及检测结果病毒宏基因组学结果展示出来丰富的病毒信息，本研究重点抓住能感染脊椎动物的病毒，分别是腺病毒、指环病毒、星状病毒、圆环病毒、疱疹病毒、细小病毒、小双节RNA病毒、小RNA病毒、多头瘤病毒进行特异性PCR验证分析。1.1腺病毒检测结果腺病毒（Adenovirus）为无囊膜双链DNA病毒，病毒粒子约90nm，基因组约35-36kb，基因组两端均有倒置重复序列（invertedterminalrepetitions，ITR），属于腺病毒科（Adenoviridae）。腺病毒宿主范围丰富多样，包括哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼类，同时还能造成多种疾病[50,51]。在病毒宏基因组学注释信息中，有20条序列注释到哺乳动物腺病毒属，拼接成3条重叠序列，经验证两条为病毒序列，如图1.4，与一株Simianadenovirus44具有核酸最高同源性为86%。本研究对101只旱獭混样DNA均进行PCR验证，发现有22.8%（23/101）的阳性率，扩增基因是位于腺病毒Hexon基因的一段长767bp的片段，腺病毒检测电泳结果如图1.5。这些检测片段通过多序列比较发现，两两之间核酸同源性在64.3%-98.2%之间，与当前NCBI数据库收录病毒BLAST比对显示，核苷酸同源性在66%-84%，氨基酸同源性在63%-70%之间。挑取核酸同源性差异最大的两份并命名为：RodentAdenovirusXinjiangH48（RoAdVXJ-H48）和RodentAdenovirusXinjiangH82（RoAdVXJ-H82），经过BLAST发现，RoAdVXJ-H48与一株Squirreladenovirus1核酸同源性最高为75%；H82与一株HumanadenovirusE4核酸同源性最高为81%。采用邻间法（Neighbor-Joining，NJ），应用MEGA6.06软件进行进化分析，如图1.6。图1.4拼成的contig位置Figure1.4Thecontigpositionoftheassembly17 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定图1.5腺病毒电泳检测结果Figure1.5Detectionresultsofadenoviruselectrophoresis图1.6遗传进化分析RoAdVXJ-H48和RoAdVXJ-H82，分析片段为767bp的Hexon基因。本研究中的序列标记为黑三角。Figure1.6PhylogeneticanalysesofRoAdVXJ-H48andRoAdVXJ-H82basedon767bphexonntsequence.Thesequenceinourstudyisidentifiedbyafilledtriangle.1.2指环病毒检测结果指环病毒科（Anelloviridae）是单链环状DNA病毒，最新国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofVirus,ICTV）报告显示，该病毒科包含12个病毒属，68个病毒种[52]。该病毒是仅次于圆环病毒的第二小病毒，成熟的病毒粒子无囊膜，成二十面体对称球形，直径30~32nm，病毒基因组为2.0~3.9kb[53]。病毒宿主范围广阔，除人类外，其他灵长类、家畜家禽、啮齿动物及节肢动物都有发现[54]。根据病毒宏基因组结果，指环病毒有两个属（Deltatorquevirus、Iotatorquevirus）四种病毒（Torquetenotupaiavirus、Torquetenosusvirus1a、MosquitoVEMAnellovirusSDBVLA、RodentTorquetenovirus1），δ细环病毒有113条序列，拼接成8条重叠序18 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定列，经验证有5条病毒序列，如图1.7，与一株Anelloviridaesp.IsolateRtNn-AneV/ZJ2016最高核酸同源性为75%；ι细环病毒有7条序列，可拼接成1条重叠序列，与一株Giantpandaanellovirus具有最高氨基酸同源性为49%；MosquitoVEMAnellovirusSDBVLA有92条序列，拼接成4条重叠序列，有1条有效序列，与MosquitoVEMAnellovirusSDBVLA核酸最高同源性为67%。本研究针对这前三种病毒设计引物进行检测，检测结果如表1.11。由表可知，δ细环病毒核酸同源性为66%-99%，ι细环病毒核酸同源性为73%-75%，MosquitoVEMAnellovirusSDBVLA核酸同源性为65%-78%。这些信息提示可能发现新的病毒种或亚种。956MosquitoVEMAnellovirusORF11131图1.7拼成的contig位置Figure1.7Thecontigpositionoftheassembly表1.11指环病毒宏基因组学验证结果Table1.11TheViralconsequenceofPCRamplificationforAnellovirdae病毒属病毒种阳性率%Identity(nt)Identity(aa)DeltatorquevirusTorquetenotupaiavirus13.9(14/101)66%-90%46%-54%IotatorquevirusTorqueTenoSusVirus14.9(15/101)73%-75%54%-55%MosquitoVEMUnclassified9.9(10/101)65%-78%52%-63%anellovirus1.3轮状病毒检测结果轮状病毒（Rotavirus）是一种双链RNA病毒，病毒无囊膜结构，基因组包含10到12个片段，编码10到14种蛋白质，每段基因大小约0.2-3.0kb，基因组总大小在18.2-30.5kb之间，属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）。轮状病毒包括八个种，几乎世界上每个儿童都感染过轮状病毒。A型轮状病毒是最普遍存在的轮状病毒，人类的轮状病毒感染90%以上是A型轮状病毒导致的。病毒宏基因组结果显示，有22条reads注释到呼肠孤病毒科轮状病毒属，可以拼接成6条重叠序列，有两条病毒序列，与如图1.8，与一株蝙蝠轮状病毒VP3基因核苷酸同源性为70%-93%，氨基酸同源性为90%。本研究根据宏基因组结果设计了三种轮状病毒检测引物，包括人源轮状病毒、牛源轮状病毒和羊源轮状病毒，三种引物均检测到同一个阳性样品H64，阳性率为1%（1/101）。检测结构进行BLAST同源性分析，得到三种同源性最高为分别为人、牛和羊的轮状病毒，核苷酸同源性为93%-97%，氨基酸同源性为95%-98%，与引物设计参考序列一致。19 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定1816RotavirusAVP32104523RotavirusANSP2695图1.8拼成的contig位置Figure1.8Thecontigpositionoftheassembly1.4星状病毒检测结果哺乳动物星状病毒（Mamastrovirus）是单股正链RNA病毒，基因组约6.8-7.0kb，5'末端有一个VPg蛋白，3'末端有一个poly(A)尾，属于星状病毒科（Astroviridae）。其宿主广泛，是一种可感染猪、奶牛、猫、貂、绵羊等动物，又可感染人，可导致人或牲畜的急性胃肠炎，具有重要的公共卫生学意义[55-59]。病毒宏基因组学结果显示，有3条序列注释到哺乳动物星状病毒，不能拼接，直接验证有两条为病毒序列，如图1.9，与一株AstrovirusMLB2RNA具有最高核酸同源性为79%。本研究用哺乳动物星状病毒属RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，RdRp）基因通用引物进行检测，内套为422bp。通过进一步PCR验证，发现101只旱獭阳性率为7.9%（8/101）。这些检测片段之间核酸同源性为57.1%-99.7%，经BLAST比对，这些检测片段核苷酸同源性在76%-81%，氨基酸同源性在81%-89%，提示星状病毒间基因差异性较大，可能有新的星状病毒种。将该片段命名为RodentAstrovirusXinjiangH11（RoAstVXJ-H11）使用该检测片段以及邻间法，用MEGA6.06构建系统进化树，如图1.10。1465AstrovirusMLB216501999HHMAstV2ORF1a2178图1.9拼成的contig位置Figure1.9Thecontigpositionoftheassembly20 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定图1.10遗传进化分析RoAstVXJ-H11，分析片段为RdRp基因。本研究中的序列标记为黑圆圈，同源性最高星状病毒序列标记为白色圆圈。Figure1.10PhylogeneticanalysesofRoAstVXJ-H11basedonpartialRdRpgenentsequence.Thesequenceinourstudyisidentifiedbyafilledcircularsandthemostsimilaradenovirussequencebyopencircular.1.5圆环病毒检测结果圆环病毒（Circovirus）是一种单股负链环状DNA病毒，基因组约1.8-3.8kb，属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属，是目前发现最小的环状病毒。圆环病毒宿主范围广泛，主要包括野猪、家猪、乌鸦、鹦鹉及鹅等动物，均对圆环病毒易感[60-65]。在病毒宏基因组学结果中，有88621条序列均注释到了圆环病毒属，这些序列拼接成了217条重叠序列，经验证有205条为病毒序列，如图1.11。BLAST比对，发现与中国的鼠耳蝠核酸同源性最高的为86%，氨基酸76%；与法属奎亚那吸血蝙蝠核苷酸最高同源性为94%，氨基酸74%；与中华姬鼠核苷酸最高同源性为94%，氨基酸86%。使用圆环病毒属Rep基因通用引物进行PCR检测101只旱獭，发现圆环病毒阳性率为50.5%(51/101)，这些片段间的同源性为82.3%-99%，均与中华姬鼠和中国鼠耳蝠有最高核苷酸同源性,核苷酸同源性在72%-75%，氨基酸同源性在66%-69%。使用该检测21 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定片段进行遗传进化分析，并将该毒株命名为RodentCircovirusXinjiangH10（RoCVXJ-H10），如图1.12，电泳结果如图1.13。875RoCVRepgene30图1.11拼成的contig位置Figure1.11Thecontigpositionoftheassembly图1.12遗传进化分析RoCVXJ-H10，分析片段为部分Rep基因。本研究中的序列标记为黑三角。Figure1.12PhylogeneticanalysesofRoCVXJ-H10basedonpartialRepgenentsequence.Thesequenceinourstudyisidentifiedbyafilledtriangle.22 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定440bp440bp图1.13圆环病毒检测电泳图Figure1.13Circovirusdetectionelectrophoreticmap1.6疱疹病毒检测结果疱疹病毒（Herpesvirus）是双链环状DNA病毒，属于疱疹病毒目成员。最新的ICTV分类显示，疱疹病毒目（Herpesvirales）包括三个科：甲型疱疹病毒科（Alloherpesviridae）、疱疹病毒科（Herpesviridae）和Malacoherpesviridae[66]。疱疹病毒宿主范围非常广泛，甲型疱疹病毒科主要感染两栖动物和鸟类；疱疹病毒科主要感染哺乳动物、鸟类和爬行类；而Malacoherpesviridae主要感染无脊椎贝壳类[67]。病毒宏基因结果显示，有367条序列注释到了疱疹病毒科，可以拼接成拼接成77条重叠序列，经验证发现有55条有效序列。对这些有效序列进行BLAST比对后发现，与一株小家鼠疱疹病毒Ⅰ型核苷酸最高同源性达82%。使用内套180bp的疱疹病毒科DPOL基因通用引物进行PCR检测，发现101只旱獭疱疹病毒阳性率为18.8%（19/101）。这些检测片段核苷酸同源性在45.3%-99.6%之间，对检测片段进行BLAST比对分析，核苷酸同源性在81%-83%，氨基酸同源性在57%-67%，显示与一株非洲刺毛鼠属疱疹病毒核酸同源性最高达83%。23 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定1.7细小病毒检测结果细小病毒（Parvovirus）属于细小病毒科（Parvoviridae），为单链DNA病毒，包括细小病毒亚科（Parvovirinae）和浓核病毒亚科（Densovirinae）。最新的ICTV报告显示，细小病毒亚科包括8个病毒属，即Amdoparvovirus、Aveparvovirus、Bocaparvovirus、Copiparvovirus、Dependoparvovirus、Erythroparvovirus、Protoparvovirus、Tetraparvovirus[66]。博卡细小病毒属（Bocaparvovirus）和依赖细小病毒属（Dependoparvovirus）能感染人、猪、牛、蝙蝠、鸟类及鸭等多种宿主[68,69]。根据病毒宏基因组学结果显示，有195609条序列注释到博卡细小病毒属(Bocaparvovirus)，这些序列可以拼成69条重叠序列，经验证这69条都是有效序列，最长达2832nt。通过BLAST比对发现，这些序列主要注释到了博卡病毒VP1/VP2蛋白区域，与一株喜马拉雅旱獭博卡病毒（Himalayanmarmotbocaparvovirus1）核酸最高同源性达90%。有9955条序列注释到了依赖细小病毒属（Dependoparvovirus），这些序列可以拼成47条重叠序列，经验证发现这47条都是有效序列，最长达2864nt。经过BLAST比对发现，其中7条序列与一株啮齿类细小病毒亚科（Parvovirinaesp.isolateRtCd-ParV/HeB2014VP1gene）核酸最高同源性达94%，另有40条序列与一株腺联病毒（Adeno-associatedvirus12）核酸最高同源性达82%。分别使用这三种病毒的重叠序列设计三种特异性引物，结果发现，同源性最高分别比对到喜马拉雅旱獭博卡细小病毒、啮齿类细小病毒、腺联细小病毒，阳性率分别为92.1%（93/101）、20.8%（21/101）、10.9%（11/101），将这三株扩增序列依次命名为RodentHimalayanmarmotbocaparvovirusXinjiangH100（RoHiMaBoPVXJ-H00）、RodentParvovirusXinjiangH1（RoPVXJ-H1）、RodentParvovirusXinjiangH21（RoAAVXJ-H21）。将RoHiMaBoPV和RoPV测序结果进行拼接，可以拼成约1100bp的片段，这两种病毒是同一种，即啮齿动物细小病毒。依据最新的ICTV分类报告对应的细小病毒科基因序列和NCBI中具有的全基因序列或部分序列，以及三株病毒同源性最高的三条基因序列，使用MEGA6.06软件及邻间法进行多序列比较和构建系统进化树，电泳结果如图1.14，进化分析如图1.15、1.16。24 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定图1.14喜马拉雅旱獭细小病毒电泳结果Figure1.14ElectrophoreticresultsmapofRodentHimalayanmarmotbocaparvovirus图1.15遗传进化分析RoPVXJ-H1，分析片段为部分VP1基因。本研究中的序列标记为黑三角，同源性最高博卡病毒病毒序列标记为白三角。Figure1.15PhylogeneticanalysesofRoPVXJ-H1basedonpartialVP1genentsequence.ThesequenceinourstudyisidentifiedbyafilledtriangleandthemostsimilarBocaparvovirussequencebyopentriangles.25 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定图1.16遗传进化分析RoAdaVXJ-H21，分析片段为部分Rep基因。本研究中的序列标记为黑三角，同源性最高腺联细小病毒序列标记为白三角。Figure1.16PhylogeneticanalysesofRoAdaVXJ-H21basedonpartialRepgenentsequence.ThesequenceinourstudyisidentifiedbyafilledtriangleandthemostsimilarBocaparvovirussequencebyopentriangles.1.8小双节RNA病毒检测结果小双节RNA病毒（Picobirnavirus）属于小双节RNA病毒科（Picobirnaviridae），是一种双链RNA病毒，目前仅有一个属：小双节RNA病毒属，包括两种病毒，即Humanpicobirnavirus和Rabbitpicobirnavirus。该病毒自1988年从人类和一种黑脚矮稻鼠体内发现，并确定为双链RNA病毒，命名为Picobirnavirus（PBV）以来，它就在多种驯养和人工养殖的动物中被发现[70,71]。PBVs常常伴随其它病原微生物导致腹泻，如轮状病毒、星状病毒、杯状病毒、大肠杆菌和沙门氏菌[72-76]。病毒宏基因结果显示，有27条序列注释到了小双节RNA病毒属，可以拼接成7条重叠序列，其中有5条为有效序列。经BLAST比对发现，与美国火鸡的小双节RNA病毒RdRp基因核酸同源性达74%。使用小双节RNA病毒属RdRp基因通用引物，内套200bp，对101只旱獭进行检测，发现其阳性率为7.9%（8/101）。这些检测片段之间核苷酸同源性在61.6%-96.4%之26 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定间，经BLAST比对，发现核苷酸同源性在77%-84%，氨基酸同源性在77%-92%之间，差异较大，进一步可以分成三个组，对第二组RodentPicornabivirusXinjiangH11（RoPiVXJ-H11）株进行进化分析，如图1.17。图1.17遗传进化分析RoPiVXJ-H11，分析片段为部分RdRp基因。本研究中的序列标记为黑三角，同源性最高的腺联细小病毒序列标记为白三角。Figure1.17PhylogeneticanalysesofRoPiVXJ-H11basedonpartialRdRpgenentsequence.ThesequenceinourstudyisidentifiedbyafilledtriangleandthemostsimilarPicobirnavirussequencebyopentriangles.1.9小RNA病毒目检测结果小RNA病毒属于小RNA病毒目（Picornavirales）小RNA病毒科（Picornaviridae），最新的ICTV分类显示，小RNA病毒目包括五个病毒科，共计48个属。小RNA病毒科是小RNA病毒群中最小的群，没有囊膜，为单股正链RNA病毒[77]。其宿主范围广泛，能引起多种重要疾病，例如肠道病毒（Enterovirus）的猪水泡性口炎、柯萨基病毒和脊髓灰质炎病毒，口蹄疫病毒属（Aphthovirus）的口蹄疫病毒等，心病毒属（Cardiovirus）的脑心肌炎病毒等等，该病毒可引起多种哺乳动物、灵长类动物及鸟类感染急性传染病，是一种重要的人兽共患病[78,79]。宏基因结果显示，有1472条序列注释到小RNA病毒目，可以拼成165条重叠序列，经验证有26条为有效序列，BLAST比对后发现与比利时一种Blackbirdarilivirus核酸同源性最高有73%。有5条序列注释到了Mosavirus，不能拼接成重叠序列，BLAST比对后发现有3条有效序列，与MosavirusA2strain核酸最高同源性达80%。有2条序列注释到了Hunnivirus，可以拼接成1条有效序列。27 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定本研究根据宏基因组学结果，针对小RNA病毒目中三种病毒：Arivirus1、Arivirus2、Tetnovirus2及小RNA病毒科MouseMosavirus共计四种病毒设计特异性引物，对101只旱獭进行检测，结果如表1.12。表1.12小RNA病毒宏基因组学验证结果Table1.12TheViralconsequenceofPCRamplificationforPicornavirus病毒目/科病毒种阳性率%Identity(nt)Identity(aa)Arivirus11.9（2/101）71%-PicornaviralesArivirus23.9（4/101）71%47%-50%Tetnovirus23.9（4/101）-49%-51%PicornaviridaeMouseMosavirus7.9（8/101）69%-72%58%-61%1.10多头瘤病毒检测结果多头瘤病毒（Polyomavirus）是一种双链环状DNA病毒，属于多头瘤病毒科（Polyomaviridae），基因组大小约5.0kb左右。目前有四个属，分别是Alphapolyomavirus、Betapolyomavirus、Gammapolyomavirus和Deltapolyomavirus。该病毒宿主范围广泛，α属多头瘤病毒主要感染人类和一些哺乳类，常常导致宿主的癌症；β属多头瘤病毒主要感染哺乳动物，研究表明，人类多头瘤病毒JCVirus和BKVirus与肾病（nephropathy）和渐进性多灶性白质脑病（progressivemultifocalleukoencephalopathy）相关；γ属多头瘤病毒成员主要感染鸟类，一些成员可导致严重疾病甚至死亡，但其导致肿瘤的特性还没被证明；δ属多头瘤病毒主要有人多头瘤病毒6、7、10及11，通常在胃肠道被发现。一般认为多头瘤病毒进化模式是伴随着宿主共同进化[80,81]。病毒宏基因组学结果显示，有144条序列注释到多头瘤病毒，可以拼接成13个重叠序列，经BLAST发现，有12条有效序列，与非洲假吸血蝙蝠属多头瘤（CardiodermapolyomavirusisolateKY336）核酸同源性最高达77%。使用多头瘤病毒科α和β属通用引物进行检测，内套250bp。发现101旱獭阳性率达76.2%（77/101）。这些检测片段核苷酸同源性在63.6%-99.6%，氨基酸同源性63.4%-100%。经BLAST比对发现，检测片段核苷酸同源性在70%-77%，氨基酸在71%-81%之间。根据检测片段进行进化分析，发现这些多头瘤又可以分成三个小的进化分支，分别命名为RodentPolyomavirusXinjiangH66（RoPyVXJ-A-H66）、RodentPolyomavirusXinjiangH4（RoPyVXJ-B-H4）、RodentPolyomavirusXinjiangH73（RoPyVXJ-C-H73）。使用邻间法及MEGA6.06软件，进行初步的遗传进化分析结果如图1.18。28 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定图1.18遗传进化分析RoPyVXJ-A-H66、RoPyVXJ-B-H4和RoPyVXJ-C-H73，分析片段为部分VP1基因。本研究中的序列标记为黑三角，同源性最高多头瘤病毒序列标记为白三角。Figure1.18PhylogeneticanalysesofRoPyVXJ-A-H66、RoPyVXJ-B-H4andRoPyVXJ-C-H73basedonpartialVP1genentsequence.ThesequenceinourstudyisidentifiedbyafilledtriangleandthemostsimilarBocaparvovirussequencebyopentriangles.1.11其他病毒及混样宏基因组验证结果1.11.1昆虫、植物及噬病毒体检测结果在本次宏基因组学结果中，还有一些序列注释到昆虫（Insect）、植物（Plant）及噬病毒体(virophage)等病毒，其中昆虫病毒有传染性软腐病毒科（Iflaviridae）和双顺反子病毒科（Dicistroviridae）；植物病毒包括联体病毒科（Geminiviridae）、矮缩病毒科（Nanoviridae）、甲型线状病毒科（Alphaflexiviridae）、Potyviridae、番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）、双分病毒科（Partitiviridae）、藻类DNA病毒科（Phycodnaviridae）;还有一种比较少见的病毒大病毒依赖科（Lavidaviridae）,又叫噬病毒体。双顺反子病毒科（Dicistroviridae）是一个迅速壮大的RNA病毒，感染节肢动物，主要是昆虫。这个科的名字来源于两个开放阅读框（ORF），或叫顺反子，是病毒基因组编码遗传物质的主要区域。值得注意的是双顺反子病毒和双顺反子样病毒已经在从海洋到人体肠道宏基因组结果中确定，如Taurasyndromevirus（TSV）对对虾产业和近期以色列急性麻痹病毒对蜜蜂蜂群崩溃失调症的危害[82-85]。病毒宏基因结果显示，有32条序列注释到了该病毒科，可以拼成2条有效重叠序列。根据Contigs设计特异性引物进行检测，发现混样阳性率为2.9%（3/101），单样阳性率为16.7%（3/18）。29 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定野田村病毒（Nodaviruse）是一种小型RNA病毒，属于野田村病毒科（Nodaviridae）。通常认为α属野田村病毒感染昆虫，β属野田村病毒感染鱼类，γ属野田村病毒感染虾类。最近在中国、印尼、新加坡和印度爆发的疾病严重影响了水产养殖业[86]。宏基因结果有609条序列注释到Fesavirus4病毒，可以拼接成7条重叠序列，只有1条有效序列。根据Contig设计特异性引物，发现混样阳性率为12.9%（13/101），单样阳性率为20.5%（16/78），经BLAST比对发现与美国一种家猫的Fesavirus4毒株核苷酸同源性最高为40%。大病毒依赖病毒是一种大型的双链DNA病毒，基因组约17-29kbp，属于大病毒依赖科（Lavidaviridae）。它们广泛的分布于世界范围内，包括海洋和内陆。对于其感染的后果和与宿主间的相互作用值得在真核细胞中进一步研究[87]。病毒宏基因组学结果显示，有3条序列注释到该科，可以拼成1条有效序列。根据Contig设计特异性引物进行检测，结果显示101只旱獭有16.8%（17/101）的阳性率。1.11.2混样宏基因组验证结果30 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定表1.13红旱獭混样宏基因结果DNA病毒验证工作Table1.13TheconsequencesofViralmetagenomicforprovingDNAvirusesinMarmotacaudata科采样地点总计Barcode1Barcode2Barcode3Barcode4/5Barcode6Barcode7Barcode8/9马尔洋乡瓦恰乡/塔合曼乡红旗拉普麻扎红旗拉普红旗拉普卡拉苏乡红旗拉普H8H16H35H54H66H80H9H65H46H56H71H82AdenoviridaeH49H58H74H8722H59H94H99H5H11H32H70H77H7H13H71H82HerpesviridaeH8H16H75H8319H95H99H1/2/4/6H11/12/15H17/18/20H31/33/35H51/52/53H67/68/69H76/77/78H7/9/10H16/62/63H21/24/25H36/37/38H55/56/60H73/75H79/80/81H64/65H26/27/28H39/40/41H82/83/84PolyomaviridaeH29/30H43/44/47H85/86/8776H48/49/50H89/92/93H94/95/96H97/98/99H100/101H2/10H11/13/15H29H31/32/33H51/52/53H66/67/71H76/77/78H63H35/36/37H54/55/56H80/81/82H38/41/42H57/59H83/84/8531 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定CircovirdaeH44/45/47H86/87/8951H48/49H92/93/95H96/99/100H101表1.14红旱獭混样宏基因结果RNA病毒验证工作Table1.14TheconsequencesofViralmetagenomicforprovingRNAvirusesinMarmotacaudata科采样地点总计Barcode1Barcode2Barcode3Barcode4/5Barcode6Barcode7Barcode8/9马尔洋乡瓦恰乡/塔合曼乡红旗拉普麻扎红旗拉普红旗拉普卡拉苏乡红旗拉普H11H19H67PicobirnaviridaeH12H227H13H23RotavirusH641H11H19H42H13H20cornaviralesH168H64H65H11H24H43H54PicornaviridaeH63H448H65H47H11H42H68H84H13H43Astrovirdae8H48H5032 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定表1.15红旱獭混样宏基因结果病毒验证汇总Table1.15ThesummaryconsequencesofViralmetagenomicforprovingvirusesinMarmotacaudata红旱獭混样宏基因结果病毒验证工作小结总数科数量种类阳性率(%)Adenoviridae22121.8(22/101)Lavidaviridae918.9（9/101）dsDNAHerpesviridae19218.8(19/101)Polyomaviridae76376.2(76/101)Anelloviridae27326.7(27/101)ssDNACircoviridae51150.5(51/101)101Picobirnaviridae717.9(8/101)dsRNAReoviridae131.0(1/101)Picornavirales837.9(8/101)(+)ssRNAPicornaviridae817.9(8/101)Astrovirdae817.9(8/101)ssRNANodaviridae13112.9%（13/101）Dicistroviridae312.9%（3/101）33 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定2结论本研究针对13种脊椎动物病毒科，1种昆虫病毒科，1种噬病毒体做了病毒的宏基因组学结果鉴定，见表1.10。本研究还针对宏基因组学结果，对脊椎动物病毒，包括腺病毒、指环病毒、星状病毒、圆环病毒、轮状病毒、疱疹病毒、野田村病毒、细小病毒、小双节RNA病毒、小RNA病毒、多头瘤病毒；昆虫病毒，即双顺反子病毒；噬病毒体，即大病毒依赖科病毒，进行宏基因组学结果的PCR验证及进化分析，见表2.2、2.3和2.4。从检测结果发现，腺病毒、疱疹病毒、多头瘤病毒及圆环病毒，基本上在各个地区旱獭体内都检测到，尤其是圆环病毒及多头瘤病毒阳性率非常高，分别为50.5%及76.2%，如此高的阳性率，暗示长尾旱獭群体普遍携带这两种病毒，可能是该病毒的自然宿主。发现腺病毒、指环病毒、星状病毒、圆环病毒、疱疹病毒、细小病毒、小双节RNA病毒、小RNA病毒及多头瘤病毒与当前病毒科的进化分类关系较远，核苷酸同源性较低，暗示可能发现新的病毒种。根据宏基因组学结果，还发现有多种植物病毒，包括甲型线状病毒科（Alphaflexiviridae）、矮缩病毒科（Nanoviridae）、番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）、双分病毒科（Partitiviridae）和藻类DNA病毒科（Phycodnaviridae）及一个昆虫病毒科，传染性软腐病毒科进行宏基因组结果的分析和BLAST比对，发现这些序列均是有效序列，本研究主要着眼于脊椎动物病毒的验证工作，宏基因组学结果的验证研究还可以进一步深入挖掘。宏基因组学结果还发现有多种病毒，如甲型疱疹病毒科（Allohepesviridae）、非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae）、杯状病毒科（Caliciviridae）、黄病毒科（Flaviridae）、戊型肝炎病毒科（Hepeviridae）、乳头瘤病毒科（Papollomaviridae）、痘病毒科（Poxviridae）及虹彩病毒科（Iridoviridae）等多个病毒科。这些病毒科通过序列拼接比对，发现均不是病毒的序列，多批次的宏基因组学结果均出现这种现象。很多病毒为能够在宿主体内进行增殖和复制，病毒会将其部分基因整合到宿主基因组内，形成与宿主基因组同源且不易被免疫系统捕获，从而达到复制的目的[88-95]。高通量测序后，得到大量原始数据，拼接成Contigs后，与NCBI病毒数据库进行比对，这些具有整合宿主基因和宿主有高度同源的序列，反而注释到相应的病毒。而在哺乳动物基因库中，也能找到这些病毒信息的身影。本研究重点关注的是脊椎动物病毒，因其常常是人兽共患病源，产生跨物种传播的风险巨大，比如狂犬病毒、冠状病毒和布尼亚病毒等，但从啮齿动物体内检测到的病毒基因组与已确定的感染人与动物的病毒基因组之间还是有很大差异的，是否具有感染人类的潜力，很大程度上都是未知的，这对于预防和控制新发突发传染病同样具有重大公共卫生学意义。调查我国新疆边境地区野生长尾旱獭病毒组情况，发现旱獭携带有脊椎动物病毒并进行着重研究，同时也验证部分昆虫动物病毒和噬病毒体，不仅体现了旱獭体内携带病34 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定毒的多样性，而且也说明作为一种杂食动物，除了以青草为食，偶尔也吃些小型昆虫，所以体内有昆虫病毒残留，同样，植物病毒也可能是这样被摄入体内的。新疆长尾旱獭宏基因组注释及验证结果也充分说明了该物种携带病毒的多样性，展现了其作为帕米尔高原特有物种的分子流行病学研究价值，对于长尾旱獭的病毒学研究工作有待进一步加深。35 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定第四章新型旱獭病毒的鉴定新疆塔什库尔干自治县地处我国西北部，这里山体连绵不断，连接着阿富汗、巴基斯坦、塔吉克斯坦和印度等国，分布有帕米尔高原特有物种长尾旱獭。本试验第一章通过病毒宏基因组学研究发现长尾旱獭携带脊椎动物病毒13个科18个属，主要针对这些脊椎动物病毒进行了PCR验证和分析。在本章中，要对其中的腺病毒、星状病毒、疱疹病毒、圆环病毒及多头瘤病毒进行研究介绍。通过全基因组学和生物信息分析进行研究。1材料1.1旱獭样品通过特异性PCR检测为病毒阳性的组织核酸样品。1.2试剂及耗材核酸提取试剂：RNA提取试剂盒RNeasyKit购自德国Qiagen公司；DNA提取试剂盒（TIANampGenomicDNAKit）和pLB零背景快速克隆试剂盒购自天根生化科技有限公司；AxyprepDNA凝胶回收试剂盒购自美国Axygen公司。反转录及PCR试剂：普通RNA反转录试剂盒、DL-2000DNAMarker、pMD18-TVector、无RNA酶水（RNase-freeWater）及TakaraPrimeSTAR®MaxDNAPolymerase购自大连宝生物（TaKaRa）公司；TaqPCRMasterMix预混液购自天根生化科技（北京）有限公司；DH5α感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。电泳试剂：琼脂糖购自西班牙Biowest公司；GelRed核酸染料购自美国Biotium公司。引物合成及测序：由北京Invitrogen公司和吉林省库美生物科技有限公司完成。耗材：1.5mL离心管、0.2mLPCR管购自美国Axygen公司。1.3实验仪器玻璃组织研磨器购自江苏海门市玻璃制品厂；NanoDrop核酸检测仪、生物安全Ⅱ级操作台购自美国Thermo公司；PCR扩增仪购自美国Bid-Rad公司；紫外凝胶成像系统购自美国UVITEC公司；电泳仪和电泳槽购自北京六一公司；台式高速离心机购自德国eppendorf公司；干式恒温金属浴购自北京天根生化科技有限。1.4生物信息学软件引物设计软件：PrimerPremier5.0;基本局部比对搜索工具：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi；ORFFinder:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/;遗传进化分析软件：MEGA6.06；36 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定序列绘图及同源性比较：DNAStar软件包;序列拼接软件：VectorNTⅠ11.5.1。2方法2.1病毒核酸提取2.1.1病毒DNA提取见第二章2.1.1旱獭肌肉组织核酸提取步骤。2.1.2病毒RNA提取及反转录将旱獭组织样品从-80℃冰箱取出，放置于冰盒上，取火柴头大小样品，放入玻璃研磨器中，加入500μLSMbuffer研磨液进行研磨。10,000×g离心10min，取上清。使用RNA提取试剂盒（RneasyMiNiKit），按操作说明书进行提取，并测定提取RNA的浓度。将提取的RNA，加入反转录试剂。2.2引物设计依据病毒宏基因组学结果，经BLAST比对，下载与该序列同源性最高或是相同属的基因序列，使用ClustalX2软件进行多序列比较，选取保守区域设计引物。保守区域引物无法检测或扩增病毒基因时，尝试选用病毒宏基因组学结果拼接成的重叠序列设计引物。为提高扩增片段的特异性，依据巢氏PCR扩增法设计套式引物。2.3旱獭样品检测根据宏基因组学混样检测结果，将所有RNA病毒（即小双节RNA病毒、小RNA病毒、轮状病毒和星状病毒）和部分DNA病毒（腺病毒和疱疹病毒）检测阳性的样品单样提取核酸，为下一步扩增基因组全序列做准备，同时也可反应病毒在旱獭各个组织脏器的分布情况。核酸提取如表2.1。表2.1旱獭混样核酸提取表Table2.1Themixedsampelsofnucleicacidextractiontable阳性旱獭提取肺、肠、肝、肾、淋巴、脾的DNA和RNA总计H5H7H8H9H11H13H16H32H35H46H49H54H56H58DNAH59H60H61H65H66H68H7033只/198份H71H73H74H75H77H80H82H83H87H94H95H99H11H12H13H16H19H20H22H23H24H42H43H44H47H48RNA22只/132份H50H54H63H64H65H67H68H84针对以上旱獭组织的肺脏、肠脏、肝脏、肾脏、淋巴和脾脏组织单样，进行腺病毒、星状病毒、疱疹病毒、多头瘤病毒（部分阳性样品）进行检测或扩增全序列。引物同步37 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定骤4.1，见附件S2。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，将目的条带送至吉林省库美生物科技有限公司进行测序。2.4病毒全基因组扩增及检测2.4.1普通PCR扩增方法依据本实验室保存的各种病毒通用引物及根据Contigs设计的特异性引物，PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带与目的条带一致的片段进行送测。如果出现非特异性扩增，条带不唯一，则可以使用宽空的胶重新电泳，在紫外光下将目的条带切下来，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行胶回收，使用核酸蛋白检测仪测量回收质量，然后再送测。对于圆环病毒，进行全基因组扩增时，在已获得片段基础上，设计反向引物扩增全序列；多头瘤则根据Contigs和已获得序列重新设计引物，拼接成全序列；腺病毒和疱疹病毒则通过查找相关文献，扩增出ICTV病毒分类标准的片段及重要编码区基因。以上片段均使用TakaraPrimeSTAR®MaxDNAPolymerase扩增。PCR条件按高保真酶使用说明进行。2.4.2载体连接、转化及克隆培养病毒基因的扩增，常常出现测序不理想、产物浓度低、出现发卡结构等无法测序情况，为了测序准确，就需要将扩增片段连接到载体上，克隆培养后再测序。使用高保真酶扩增的产物，须在末端加T碱基或使用专门连接平末端的载体试剂盒进行连接。具体方法如下：1）对扩增片段，使用1%琼脂糖凝胶电泳，对明亮条带进行切胶回收；2）使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒胶回收，并使用核酸蛋白检测仪测量回收质量；3）在pMD18-T载体1μL（50mg，0.03pmol）以及插入DNA的摩尔数比为0.1pmol~0.3pmol下，使用公式：模板使用量（μL）=nmol数×660×InsertDNA的质量浓度，算出插入DNA分子使用量；4）于0.2μLPCR管中，配置反应体系，见表2.2。表2.2pMD18-T载体反应体系Table2.2ThecompositionofpMD18-TVector试剂用量pMD18-TVector1μLTempleteDNAXμLSolutionⅠ5μLddH2O补至10μL5)16℃条件下反应过夜；6）从-80℃冰箱中取出DH5α感受态细胞，置于冰上约3min；38 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定7）取5μL的载体反应液和50μL的DH5α感受态细胞于1.5mL离心管中轻轻手指敲打混合，然后放置冰上30min;8）将离心管放置42℃恒温90s，然后冰浴5min；9）向离心管中加入900μL不含抗生素的LB培养液，混匀。在37℃和转速为150r/min条件下，振荡培养45min；10）将离心管内液体混匀，吸取200μL液体涂抹在含有100ug/mL氨苄抗生素的LB固体琼脂培养基上，37℃条件下培养10~12h；11）待LB固体琼脂培养基上长出单个白色菌落后，用无菌镊子夹取10μL无菌枪头挑取单个菌落于含有100ug/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中进行培养，37℃条件下培养8~10h;12)用pMD18-T载体通用引物对菌液进行PCR扩增检测。反应体系如表2.3。表2.3检测插入DNA的PCR反应体系Table2.3ThecompositionofPCRamplificationontodetecttheinsertDNA试剂用量2×TaqPCRMasterMix12.5μLM13F(-47)(10pmol/μL）1μLRV-M（10pmol/μL）1μL菌液1μLddH2O9.5μL13）对鉴定连接片段大小与目的条带一致的单克隆菌液，送吉林省库美生物科技有限公司测序。3结果3.1腺病毒鉴定结果用哺乳动物腺病毒属成员Hexon基因通用引物，内套767bp，对宏基因组学验证结果为腺病毒阳性的22只旱獭样品进行单样的验证，共计132份，PCR结果发现阳性率为8.3%（11/132），通过多序列比较，发现这些序列又可进一步分成三个不同组，分别命名为Mastadenovirus-related1/2/3。彼此间同源性为36.1%-84.0%，其中哺乳动物腺病毒属相关病毒1包含7株病毒，彼此间同源性为59.7%-84.0%，与一株德国松鼠腺病毒最高同源性为75%；哺乳动物腺病毒属相关病毒2包含3株病毒，彼此间同源性71.8%-74.6%，与中国的一株HumanAdenovirusE4最高同源性为83%；哺乳动物腺病毒属相关病毒3与一株SimianadenovirusC最高同源性为85%。根据最新ICTV关于腺病毒分类标准，哺乳动物腺病毒属分类标准是DNA依赖性DNA聚合酶基因的氨基酸序列遗传进化距离大于15%，如果这个遗传距离在5%-15%之间，一些其他的因素，如不同的宿主、G+C含量、基因组组织、中和反应和血凝特性应被考虑进来。通过查阅相关文献和Contigs，设计相关引物，分别扩增腺病毒IVa2、DNAPol和Hexon基因。39 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定本研究扩增阳性样品DNAPol基因序列5株，分别命名为：RodentAdenovirusXinjiang16F（RoAdVXJ-16F）、RodentAdenovirusXinjiang46C（RoAdVXJ-46C）、，对RodentAdenovirusXinjiang51C（RoAdVXJ-51C）、RodentAdenovirusXinjiang66C（RoAdVXJ-66C）、RodentAdenovirusXinjiang82C（RoAdVXJ-82C）。这些序列间核苷酸同源性在88.1%-97.9%之间，经BLAST比对，发现与中国云南晋宁一株松鼠腺病毒有最高核酸同源性为73%。通过多序列比较，发现这五株毒株与Aviadenovirus、Mastadenovirus、Siadenovirus、Atadenovirus氨基酸遗传距离均大于15%，说明这五株毒株可能是一个新的属。同时，将扩增Hexon基因毒株命名为RodentAdenovirusXinjiang82C（RoAdVXJ-82C），发现其与Humanadenovirus38毒株核苷酸最高同源性为74%，对其进行遗传进化分析，见图2.1、图2.2，表2.4。图2.1遗传进化分析啮齿动物腺病毒，分析片段为部分DNA依赖性DNA聚合酶基因。本研究中的序列标记为黑三角。Figure2.1PhylogeneticanalysesofRodentAdenovirusbasedonpartialDNA-dependentDNApolymerasegenentsequence.Thesequenceinourstudyisidentifiedbyafilledtriangle.40 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定图2.2遗传进化分析RoAdVXJ-82C，分析片段为部分Hexon基因。本研究中的序列标记为黑三角，同源性最高腺病毒序列标记为白三角。Figure2.2PhylogeneticanalysesofRoAdVXJ-82CbasedonpartialHexongenentsequence.ThesequenceinourstudyisidentifiedbyafilledtriangleandthemostsimilarAdenovirussequencebyopentriangles.41 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定表2.4RoAdVXJ-16F和RoAdVXJ-82C毒株基因同源性分析Table2.4PercentidentityofthenucleotidesequenceofRoAdVXJ-16FandRoAdVXJ-82CRoAdVXJ-16Fidentity（%）ofDNARoAdVXJ-82Cidentity（%）of病毒属病毒种基因登录号病毒名PolHexonntaantaaFowladenovirus5KC493646FAdV-549.438.852.836.3Duckadenovirus2KJ469653DAdV-249.540.649.632.0AviadenovirusFowladenovirus2KT862805FAdV-249.240.351.333.5FowlaviadenovirusAKX247011FAdV-A48.340.552.335.7Fowlaviadenovirus4KY636400FAdV-448.941.452.134.3BatmastadenovirusKT698855BtAdV-WIV1164.864.5NANAWIV11*HumanadenovirusEF151417HAdV38H44NANA67.047.738H44#BatadenovirusTJMGU226970BtAdV-TJM63.161.0NANASimianadenovirus48HQ241818SAdV-4863.361.663.844.0Humanadenovirus29JN226754HAdV-2963.761.065.746.3Batadenovirus2JN252129BtAdV-261.761.166.546.6MastadenovirusChimpanzeeadenovirusJN254802ChAdV-Y2564.262.264.344.2Y25Bovineadenovirus3JN381195BAdV-360.765.365.743.9Equineadenovirus1JN418926EAdV-162.162.5NANABatmastadenovirusKT698852BtAdV-WIV1355.059.861.341.6WIV13BatKT698853BtAdV-WIV964.764.567.046.2mastadenovirus-WIV9BatmastadenovirusKT698856BtAdV-WIV1255.760.060.340.542 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定WIV12BatmastadenovirusKX961095BtAdV-WIV1755.963.762.340.2WIV17Humanadenovirus55KY471318HAdV-5563.162.6NANAHemorrhagicenteritisAF074946HeAdV52.646.648.028.3virusSiadenovirusFrogadenovirus1AF224336FAdV-151.848.048.229.9Greattitadenovirus1FJ849795GtAdV-153.748.347.929.3Snakeadenovirus1DQ106414SAdV-154.544.556.040.4Lizardadenovirus2KJ156523LAdV-254.646.655.237.6AtadenovirusDuckadenovirus1KJ452170DAdV-154.846.353.636.4BovineadenovirusDNC_002685BAdV-D52.645.352.232.1Ovineadenovirus7U40839OAdV-752.260.252.232.0NA:表示没有数据；*：RoAdVXJ-16F株腺病毒参考序列；#：RoAdVXJ-82C株腺病毒参考序列由表可知，RoAdVXJ-16FDNAPol基因与禽腺病毒属成员核苷酸同源性为48.3%-49.5%；与哺乳动物腺病毒属成员核苷酸同源性为55.0%-64.8%；与Siadenovirus成员核苷酸同源性为51.8%-53.7%；与Atadenovirus成员核苷酸同源性为52.2%-54.8%。RoAdVXJ-16FDNAPol基因与禽腺病毒属成员氨基酸同源性为38.8%-41.4%；与哺乳动物腺病毒属成员氨基酸同源性为59.8%-64.5%；与Siadenovirus成员氨基酸同源性为46.6%-48.3%；与Atadenovirus属成员氨基酸同源性为44.5%-60.2%。RoAdVXJ-82CHexon基因与禽腺病毒属成员核苷酸同源性为49.6%-52.8%；与哺乳动物腺病毒属成员核苷酸同源性为61.4%-67.4%；与Siadenovirus成员核苷酸同源性为51.8%-53.7%。Hexon基因与禽腺病毒属成员氨基酸同源性为31.8%-35.1%%；与哺乳动物腺病毒属成员氨基酸同源性为38.0%-47.0%；与Siadenovirus成员氨基酸同源性为26.5%-29.6%。43 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定3.2星状病毒鉴定结果用星状病毒RdRp基因，内套400bp，对宏基因组学验证结果为哺乳动物星状病毒阳性的8份混样，对其各组织脏器单样进行PCR检测，共计48份，发现星状病毒阳性率为20.8%（10/48），电泳检测如图2.3。多序列比较发现，这些序列间的同源性为53.4%-100%。通过对这些序列的初步遗传进化分析，发现又可以分成四个小组，依照ICTV命名规则命名为哺乳动物星状病毒相关病毒1、2、3和4（Mamastrovirus-related1/2/3/4）。哺乳动物星状病毒相关病毒1包括三株病毒，与BovineastrovirusisolateSC449核苷酸最高同源性86%，氨基酸同源性为90%；哺乳动物星状病毒相关病毒2包括四株病毒，与MurineastrovirusisolateJap/PharC/BALBc/1核苷酸最高同源性为83%，氨基酸为83%，氨基酸最高同源性为；哺乳动物星状病毒相关病毒3包括两株病毒，与VoleastrovirusEc/FG033/Yunnannonstructuralpolyprotein1ABgene核苷酸最高同源性为92%，氨基酸为82%；哺乳动物星状病毒相关病毒4包括一株病毒，与Porcineastrovirus2核苷酸同源性达98%，氨基酸达98%。分别命名为RodentAstrovirusR1Xinjiang11C（RoAstV-R1XJ-11C）、RodentAstrovirusR2Xinjiang43C（RoAstV-R2XJ-43C）、RodentAstrovirusR3Xinjiang50C（RoAstV-R3XJ-50C）、RodentAstrovirusR4Xinjiang43L（RoAstV-R4XJ-43L）将这些毒株与ICTV公布的19种星状病毒代表序列和8个片段进行遗传进化分析，结果如图2.4。从进化树可以看出，RoAstV-R1XJ-11C、RoAstV-R3XJ-50C和RoAstV-R4XJ-43L处于一个进化分支的三小支，属于未分类的哺乳动物星状病毒属，与哺乳动物星状病毒属3型最接近，暗示可能是新的星状病毒属；RoAstV-R2XJ-43C处在不同的进化分支，与哺乳动物星状病毒6型最接近。图2.3星状病毒电泳结果Figure2.3ElectrophoreticresultsmapofAstrovirus44 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定图2.4遗传进化分析RoAstV-R1XJ-11C、RoAstV-R2XJ-43C、RoAstV-R3XJ-50C、RoAstV-R4XJ-43L，分析片段为部分RdRp基因。本研究中的序列标记为黑三角，同源性最高星状病毒序列标记为白三角。Figure2.4PhylogeneticanalysesofRoAstV-R1XJ-11C、RoAstV-R2XJ-43C、RoAstV-R3XJ-50C、RoAstV-R4XJ-43LbasedonpartialRdRpntsequence.ThesequenceinourstudyisidentifiedbyafilledtriangleandthemostsimilarAstrovirussequencebyopentriangles3.3疱疹病毒鉴定结果疱疹病毒宏基因组学结果有19份混样阳性样品，使用疱疹病毒DNAPol基因通用引物对这19份阳性单样进行检测，共计114份，发现阳性率为16.7%（19/114），主要分布于淋巴组织。每份阳性样品均连载体，至少挑取三个单克隆，送测。通过多序列比较，发现这些序列间核苷酸同源性差异巨大，同源性为15.5%-100%，通过对检测片段的初步进化分析，这些序列又可以进一步分成两个小组，挑选代表毒株，分别命名为RodentHerpesvirusXinjiang16G（RoHePVXJ-16G）、RodentHerpesvirusXinjiang16L(RoHePVXJ-16L)。而且发现同一只旱獭，同一种脏器，可同时携带这两种病毒；不同脏器也可携带不同病毒；不同旱獭会携带相同毒株。选取疱疹病毒科毒株和标准毒株及参考序列，用邻间法及MEGA6.06建进化树,如图2.5。两株病毒处在不同的进化分支上，RoHePVXJ-16L与一株α疱疹病毒亚科Scutavirus纤维乳头状瘤相关龟疱疹病毒处45 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定在一个进化分支上，与RoHePVXJ-16G株同源性为19%，分别在不同亚科的进化分支上，暗示这是两种不同的疱疹病毒种。同时查阅相关资料并结合Contigs，设计引物，扩增DNAPol基因，内套1300bp，命名为RodentHerpesvirusXinjiang60G（RoHePVXJ-60G），对其进行多序列比较，如表2.5所示。分析发现，其与β疱疹病毒亚科巨细胞病毒属成员Apodemusflavicolliscytomegalovirus3最高核苷酸同源性63.2%，进化分析显示它们处于同一进化分支，所以本研究的疱疹病毒株RoHePVXJ-60G与Apodemusflavicolliscytomegalovirus3同属于巨细胞病毒属成员，且分别为不同的亚种。图2.5遗传进化分析RoHePVXJ-16G、RoHePVXJ-16L，分析片段为部分DNAPol基因。本研究中的序列标记为黑三角。Figure2.5PhylogeneticanalysesofRoHePVXJ-16G、RoHePVXJ-16LbasedonpartialDNAPolntsequence.Thesequenceinourstudyisidentifiedbyafilledtriangle.46 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定表2.5RoHePVXJ-60G株病毒基因同源性分析Table2.5PercentidentityofthenucleotidesequencesofRoHePVXJ-60GRoHePVXJ-60Gidentity（%）病毒科病毒种基因登录号病毒名ntaaFloridagreenturtleherpesvirusAF035004FgtuHV44.928.9OliveridleyturtleherpesvirusAF049904OrtuHV44.727.9Bovineherpesvirustype1.1AJ004801BoHV1.147.430.5Passeridherpesvirus1DQ287312PaHV141.124.7AlphaherpesvirinaeApodemusflavicolliscytomegalovirus3EF125064AflCMV355.837.4Aotineherpesvirus1FJ483970AoHV143.727.4Gaviidherpesvirus1GU130289GaHV151.132.1Canidherpesvirus1KT819632CaHV147.229.5Humanherpesvirus3X04370HHV353.334.2Apodemusflavicolliscytomegalovirus3EF125064AflCMV363.245.8Batbetaherpesvirus2AB517983BtHV259.642.1Tupaiaherpesvirusstrain1AF074327TuHV145.427.9MuromegalovirusG4EU579859MuHVG46046.3MuHVMuromegalovirusWP15BEU5798606046.3BetaherpesvirinaeWP15BMuHVMuromegalovirusC4AEU5798616046.3C4ASaimiriineherpesvirus4FJ483967SaHV458.842.1Cebineherpesvirus1JQ264772CeHV160.444.7PorcinecytomegalovirusstrainBJ09KF017583PCNV58.440.5Porcinelymphotropicherpesvirus1AF118399PLHV143.526.947 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定Callitrichineherpesvirus3AF319782CaHV350.932.1GammaherpesvirinaeBadgerherpesvirusAF376034BaHV48.929.5VervetcytomegalovirusCSGAY049066VCMV52.135.3Gorillagorillalymphocryptovirus2AY129395GgLMV249.130.5MfuLMVMacacafuscatalymphocryptovirus2AY17295450.231.62Gorillarhadinovirus1AY177144GoRH147.727.5Cebusalbifronslymphocryptovirus2JF692210CalLMV242.124.748 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定3.4圆环病毒鉴定结果使用圆环病毒科Rep基因通用引物检测三份圆环病毒阳性样品H11、H35、H71单样，发现11F、11S、35S、71C四份阳性单样，根据测序结果设计反向引物，扩增获得两株新疆长尾旱獭圆环病毒全基因组序列，命名为RodentcircovirusisolateXJ-11S（RoCVXJ-11S）和RodentcircovirusisolateXJ-71C（RoCVXJ-71C）。目前NCBI收录的啮齿动物圆环病毒全序列较少，与美国洛杉矶一株Mousecyclovirus毒株全序列相比，全基因组短490nt；与中国一株Rodentcircovirus毒株Rep基因相比短9个碱基，少编码3个氨基酸；Cap蛋白核苷酸和氨基酸序列同源性都很低，应该是很新的序列。通过NCBI在线ORFFinder，也都预测出了Rep蛋白和Cap蛋白两个蛋白。两株病毒Rep基因均为903nt，编码301个氨基酸，Cap基因645nt，编码215个氨基酸，中间存在非编码区。使用DNASTAR7.1软件包SeqBuilder绘制RoCVXJ-11S株及RoCVXJ-71C株圆环病毒结构示意图，如图2.6(a)、(b)。依据ICTV圆环病毒属最新分类标准，与圆环病毒代表种全基因序列同源性小于80%的序列，将作为新的病毒种。因此，使用圆环病毒属代表毒株及本研究两株圆环病毒，使用MEGA6.06软件，依据最大似然法（Maximumlikelihoodmethod）建进化树，如图2.7。对两株圆环病毒进行全基因组学分析，发现RoCVXJ-11S和RoCVXJ-71C都获得了1739nt基因组序列，核苷酸同源性为94.4%，氨基酸同源性93.4%，它们都与中国一株RodentcircovirusRep基因核苷酸同源性最高，都为75%。同时，两株圆环病毒与目前ICTV代表毒株核苷酸同源性均低于80%，所以应该是新的种。与蝙蝠圆环病毒相比，都和缅甸的马铁菊头蝠圆环病毒XOR株核苷酸有最高同源性，分别为40.8%和40.9%；与其他蝙蝠病毒圆环病毒同源性在26.0%-37.9%和26.0%-37.3%；与圆环病毒属确定种类的圆环病毒同源性在31.3%-38.3%和31.1%-38.1%；同时与我国流行的猪圆环病毒同源性为38.1%-38.4%和37.7%-38.0%。这两株圆环病毒Rep基因核苷酸同源性为95%，与全基因组相同，与中国一株RodentcircovirusRep基因核苷酸同源性最高，都为75%。与蝙蝠圆环病毒相比，都和缅甸的马铁菊头蝠圆环病毒XOR株核苷酸有最高同源性，分别为52.2%和51.9%；与圆环病毒属确定种类的圆环病毒同源性在28.0%-47.2%和27.8%-46.7%；同时与我国流行的猪圆环病毒同源性为46.9%-47.2%和46.6%-47.0%。Rep基因氨基酸方面，与蝙蝠圆环病毒相比，与缅甸的马铁菊头蝠XOR株氨基酸同源性最高，分别为39.2%和38.6%；与其他蝙蝠圆环病毒氨基酸同源性在15.8%-34.7%和16.1%-34.4%；与圆环病毒属确定种类的圆环病毒氨基酸同源性均为34.1%-42.8%，详见表2.6。49 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定图2.6新疆两株长尾旱獭圆环病毒基因结构图Figure2.6GenomeschematicsoftwoMarmotacaudatacircovirusinXinjiangProvince图2.7圆环病毒属代表种全序列最大似然法进化树。本研究序列标记为黑色三角。Figure2.7Maximumlikelihoodphylogenetictreeofthecircovirusrepresentativespeciesfullgenomesequences.Thesequenceinourstudyisidentifiedbyafilledtriangle.50 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定表2.6RoCVXJ-11S和RoCVXJ-71C病毒基因同源性分析Table2.6PercentidentityofRoCVXJ-11SandRoCVXJ-71CRoCVXJ-11Sidentity（%）RoCVXJ-71Cidentity（%）病毒种基因登录号病毒名CompleteRepCompleteRepntntaantntaaBeakandfeatherAF080560BFDV36.254.437.335.853.837.9diseasevirusCanarycircovirusAJ301633CaCV36.754.441.036.654.741.0DuckcircovirusAY228555DuCV35.349.435.535.049.035.8FinshcircovirusDQ845075FiCV37.555.742.836.855.442.8PigeoncircovirusAF252610PiCV37.252.942.037.352.741.0Porcinecircovirus-2AF027217PCV-2-pws38.147.034.437.746.734.1Porcinecircovirus-1Y09921PCV-131.348.234.131.147.534.4StarlingcircovirusDQ172906StCV38.355.141.738.154.942.0SwancircovirusEU056309SwCV32.547.634.532.347.334.5Porcinecircovirus-2AY686764PCV2-ZJ38.346.934.737.946.835.7HM038027PCV2-SH38.246.934.437.746.735.4HM038034PCV2-LG38.146.934.437.846.834.7HM641752PCV2-DBN-SX07238.447.234.738.047.035.7FJ598044PCV-WH38.446.934.437.946.634.4UnclassifiedDQ146997RaCV-4113136.353.039.236.152.739.9circovirusKP260926FoCV-VS710000350.452.336.050.550.935.7KT946839CaCV-JZ98201450.050.536.350.150.335.7JF938079BtCV-YN-132.542.631.032.442.231.3JF938080BtCV-YN-233.943.028.334.342.928.9JF938081BtCV-YN-332.242.428.732.542.530.351 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定JX863737BtCV-XOR40.852.239.240.951.938.6KC339249BtCV-XOR737.947.234.737.346.734.4BtMf-CV-1/GD201KJ64171833.138.824.433.339.125.12KM382269BtCV/POA-2012-Ⅱ26.028.015.826.027.816.13.5多头瘤病毒鉴定结果本研究使用多头瘤病毒α和β属通用引物检测101只旱獭混样，发现77只阳性样品，阳性率达76.2%。对其中19份混样，共计114份单样组织进行检测，发现49份阳性组织样品，阳性率为43%。这些检测片段又可进一步分成三个小的进化分支，彼此间核苷酸同源性为56.4%-100%，氨基酸为10.6%-100%。分别命名为RodentpolymavirusXinjiang9P（RoPyVXJ-9P）、RodentpolymavirusXinjiang49S（RoPyVXJ-49S）、RodentpolymavirusXinjiang65C（RoPyVXJ-65C）。RoPyVXJ-9P与新西兰虎皮鹦鹉多头瘤核苷酸同源性为72%，氨基酸75%；RoPyVXJ-49S与印度狐蝠多头瘤核苷酸同源性为73%，氨基酸为80%；RoPyVXJ-65C与科特迪瓦塔纳河红疣猴核苷酸同源性为73%，氨基酸为78%。使用RoPyVXJ-9P株多头瘤病毒VP1基因与多头瘤病毒科四个属的毒株进行遗传进化分析及多序列比较，如图2.8，表2.7。52 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定图2.8遗传进化分析RoPyVXJ-65C，分析片段为VP1基因。本研究中的序列标记为黑三角。Figure2.8PhylogeneticanalysesofRoPyVXJ-65CbasedonVP1ntsequence.Thesequenceinourstudyisidentifiedbyafilledtriangle.53 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定表2.7RoPyVXJ-65C株病毒VP1基因同源性分析Table2.7PercentidentityofRoPyVXJ-65CVP1geneRoPyVXJ-65CVP1identity病毒属病毒种基因登录号病毒名ntaaChlorocebuspygerythruspolyomavirus1AB767298VmPyV171.455.1Acerodoncelebensispolyomavirus1AB972940BatPyV5b-257.039.2Pongoabeliipolyomavirus1FN356901OraPyV-Pi58.841.5Pantroglodytespolyomavirus1FR692334ChPyV-Bob70.854.1Humanpolyomavirus8GU989205TSPyV56.237.9Humanpolyomavirus5HM011556MCPyVisolateR17b59.141.1Pantroglodytespolyomavirus2HQ385746PtrovPyV1a58.338.9AlphapolyomavirusGorillagorillapolyomavirus1HQ385752GgorgPyV158.640.8Artibeusplanirostrispolyomavirus2JQ958886BatPyV-3a69.451.1Carolliaperspicillatapolyomavirus1JQ958889BatPyV-4b58.741.6Macacafascicularispolyomavirus1JX159986MfasPyV161.942.3Otomopsmartienssenipolyomavirus1JX520658OtomopsPyV-KY15669.951.1Cardiodermacorpolyomavirus1JX520659CardiodermaPyV-KY33657.937.9Acerodoncelebensispolyomavirus2AB972941BatPyV6a55.639.4BetapolyomavirusKIPyVstrainStockholmHumanpolyomavirus3EF12790641.820.36054 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定Artibeusplanirostrispolyomavirus1JQ958890BatPyV-2c57.941.0Desmodusrotunduspolyomavirus1JQ958892BatPyV2a57.440.7Cercopithecuserythrotispolyomavirus1JX159985CeryPyV156.738.9Cebusalbifronspolyomavirus1JX159988CalbPyV154.236.9Anseranserpolyomavirus1AY140894GHPyV55.837.5Corvusmonedulapolyomavirus1DQ192570CPyV57.940.9GammapolyomavirusCracticustorquatuspolyomavirus1KF360862ButcherbirdPyV58.541.4Pygoscelisadeliaepolyomavirus1KP033140AdPyV54.335.3Humanpolyomavirus6HM011560HPyV6strain607a42.221.6DeltapolyomavirusHumanpolyomavirus7HM011566HPyV7strain713a40.620.6Humanpolyomavirus10JQ898291MWPyVstrainMA09556.634.555 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定由同源性分析表可知，RoPyVXJ-65C与一株赞比亚青腹绿猴多头瘤核苷酸同源性最高达71.4%，氨基酸为55.1%；与其他α多头瘤病毒属核苷酸同源性在56.2%-70.8%，氨基酸在37.9%-54.1%；与β多头瘤病毒属核苷酸同源性在41.8%-57.9%，氨基酸在20.3%-41.0%；与γ多头瘤病毒属核苷酸同源性在54.3%-58.5%，氨基酸在35.3%-41.4%；与δ多头瘤病毒属核苷酸同源性在40.6%-56.6%，氨基酸在20.6%-34.5%。本研究RoPyVXJ-65C毒株VP1基因与多头瘤科毒株最高核苷酸同源性低于71.4%，表明本研究的毒株很可能是新的病毒种。3.6病毒单样检测结果本研究对腺病毒、疱疹病毒、小双节RNA病毒、小RNA病毒、星状病毒阳性样品分别提取肺脏、肠道、肝脏、肾脏、淋巴、脾脏的DNA和RNA，均进行了单样组织样品的PCR检测。同时对与多头瘤病毒有交叉的阳性单样也进行了靶器官的核酸检测。通过对各种病毒的单样检测发现了多种病毒典型的寄生器官，见表2.8。表2.8宏基因组阳性单样验证结果表Table2.8PositivesingletestresulttableofViralMetagenomic肺肠肝肾淋脾遗传物质科属阳性率（%）脏道脏脏巴脏AdenoviridaeMastadenovirus1800006.5(9/138)dsDNAHerpesviridaeMuromegalovirus204013016.7(19/114)UnclassifiedPolymaviridae7367141243(49/114)PolyomaviridaedsRNAPicobirnaviridaePicobirnavirus04010011.9(5/42)UnclassifiedPicornavirales07000014.6(7/48)PicornaviralesUnclassified(+)ssRNAPicornaviridae0400008.3(4/48)PicornaviridaeAstrovirdaeMamastrovirus17001120.8(10/48)ssRNADicistroviridaeUnclassified0300002.9(3/101)4结论对22份腺病毒检测阳性混样样品共计132份组织单样进行PCR检测，发现9份组织单样阳性，肺脏和肠道分别是1份和8份。经检测片段的初步遗传进化分析，可进一步分成三个小组，暗示着长尾旱獭体内可能携带有多种腺病毒。对其中RoAdVXJ-16F株腺病毒扩增DNAPol基因，进行遗传进化分析，发现与当前腺病毒属成员DNAPol56 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定基因氨基酸序列遗传距离大于15%，依据ICTV分类标准，该毒株可能是一个新的腺病毒属。对19份疱疹病毒阳性混样，共计114份组织单样进行了检测，共检出19份阳性单样，肺脏、肝脏和淋巴各2、4及13份阳性样品，同时扩增六株疱疹病毒DNAPol基因，发现它们之间核苷酸同源性在97.9%-99.8%，属于同一种。其中RoHePVXJ-60G毒株与β疱疹病毒亚科（Beatherpesvirinae）巨细胞病毒属（Cytomegalovirus）成员Apodemusflavicolliscytomegalovirus3DNAPol基因有63.2%核苷酸同源性，依据ICTV疱疹病毒分类标准，RoHePVXJ-60G毒株与Apodemusflavicolliscytomegalovirus3应为贝塔疱疹病毒亚科巨细胞病毒属新的种，分别是不同亚种。从检测数据也可看出，疱疹病毒主要寄生于淋巴组织。对8份混样共计48份星状病毒单样进行检测，肺脏、肠道、淋巴及脾脏分别检出1、7、1和1份阳性单样，从检出的阳性组织数量分布也验证了星状病毒主要寄生于肠道组织。它们之间核苷酸同源性在57.3%-90.3%，对这些检测片段进行遗传进化分析，发现它们可以分成四个不同的遗传进化小组，说明旱獭体内可能携带有多种星状病毒。同时将它们与星状病毒科成员做进化分析，显示RoAstV-R4XJ-43L外，另外三株星状病毒均独立进化为不同侧支，也说明这些星状病毒与当前ICTV收录的毒株差异较大，很可能是新的星状病毒属。本实验室对圆环病毒的研究工作开始与2011年，并在缅甸的蝙蝠样品检测出两株蝙蝠圆环病毒[96]。本研究采用宏基因组学技术从新疆长尾旱獭体内检测到两株圆环病毒，并且获得全基因组序列，都是1739nt。经分析发现，这两株圆环病毒全基因组间核苷酸同源性为94.4%，氨基酸同源性93.4%，它们都与中国一株RodentcircovirusRep基因核苷酸同源性最高，都为75%。根据ICTV最新圆环病毒属分类标准，本研究发现的两株圆环病毒与当前圆环病毒属代表毒株核苷酸同源性均低于80%，应作为圆环病毒属新的病毒种。而且研究发现圆环病毒在长尾旱獭体内阳性率达50.5%，可见该病毒是旱獭体内常见毒种，暗示长尾旱獭可能是圆环病毒的自然宿主。通过对19只旱獭多头瘤混样，共计114份组织单样的检测，检出49份阳性样品，发现了三株多头瘤病毒，通过遗传进化分析暗示可能都是新的病毒种；在这49份阳性样品中，发现同一只旱獭不同组织可能携带2-3种多头瘤病毒，不同旱獭不同组织也会携带相同多头瘤病毒，说明多头瘤病毒在旱獭体内呈现普遍感染或者说是持续带毒状态，但旱獭不表现发病状态，暗示旱獭很可能是多头瘤病毒的自然宿主。同时分析发现多头瘤病毒在各个组织脏器均有分布，主要集中分布于淋巴和脾脏。本研究对我国边境地区长尾旱獭携带病毒情况进行病毒分子流行病学调查，了解长尾旱獭病毒组情况，掌握其携带病毒的本地数据，并对潜在的可能引发人兽共患病的脊椎动物并对重点研究，获得了丰富的病毒组数据，充实了我国新疆地区野生长尾旱獭病毒组数据库，系统的了解和掌握其携带病毒的多样性，对评估新疆野生长尾旱獭在公共卫生的威胁提供基础数据。57 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定全文结论一、采用宏基因组学方法对塔什库尔干自治县长尾旱獭进行分子流行病学调查，获得了长尾旱獭病毒组本底数据。鉴定了两株圆环病毒、一株腺病毒为新种，一株疱疹病毒、两株多头瘤病毒和四株星状病毒可能是新种。二、发现并验证了11种脊椎动物病毒科，1种昆虫病毒科及1种大病毒依赖科病毒科，其中脊椎动物病毒包括腺病毒科、指环病毒科、星状病毒科、圆环病毒科、野田村病毒科、疱疹病毒科、细小病毒科、小双节RNA病毒科、小RNA病毒科、多头瘤病毒科、呼肠孤病毒科病毒在新疆长尾旱獭中的流行病学调查，其携带率介于1.0%-76.2%。三、获得两株圆环病毒全序列，根据ICTV最新圆环病毒属分类标准，这两株圆环病毒都是新的种。获得三株多头瘤病毒全序列，目前还无法准确分析其基因组，通过VP1基因分析发现均暗示属于哺乳动物多头瘤属新的种。58 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定主要创新点通过对我国新疆长尾旱獭携带病毒情况的流行病学调查，获得了其携带病毒的本底数据，并重点对潜在的可能引发人兽共患病的脊椎动物病毒进行研究，系统的了解和掌握了长尾旱獭携带病毒的多样性，对评估新疆长尾旱獭对公共卫生的威胁提供基础数据。59 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定参考文献[1]郭刚,吴熙然,郭利萍,等.汉坦病毒感染生态流行病学研究现状.口岸卫生控制[J],2016(03):58-63.[2]WangW,LinXD,GuoWP,etal.Discovery,diversityandevolutionofnovelcoronavirusessampledfromrodentsinChina.Virology[J],2015.474:19-27.[3]LiK,LinXD,WangW,etal.IsolationandcharacterizationofanovelarenavirusharboredbyRodentsandShrewsinZhejiangprovince,China.Virology[J],2015.476:37-42.[4]刘云鹏.新疆维吾尔自治区鼠疫疫源地调查报告.长春鼠疫防治所[J],1957:4-9.[5]DR.G.MigrationsandhominginbatsinBiologyofBats.NewYork:AcademicPress[J],1970:233-264.[6]YuenKY,ChanPK,PeirisM,etal.ClinicalfeaturesandrapidviraldiagnosisofhumandiseaseassociatedwithavianinfluenzaAH5N1virus.Lancet[J],1998.351(9101):467-471.[7]GaoR,CaoB,HuY,etal.Humaninfectionwithanovelavian-origininfluenzaA(H7N9)virus.NEnglJMed[J],2013.368(20):1888-1897.[8]ZhuQY,QinED,WangW,etal.FatalinfectionwithinfluenzaA(H5N1)virusinChina.NEnglJMed[J],2006.354(25):2731-2732.[9]LiuJ,XiaoH,LeiF,etal.HighlypathogenicH5N1influenzavirusinfectioninmigratorybirds.Science[J],2005.309(5738):1206.[10]CaoB,LiXW,MaoY,etal.Clinicalfeaturesoftheinitialcasesof2009pandemicinfluenzaA(H1N1)virusinfectioninChina.NEnglJMed[J],2009.361(26):2507-2517.[11]YuXJ,LiangMF,ZhangSY,etal.FeverwiththrombocytopeniaassociatedwithanovelbunyavirusinChina.NEnglJMed[J],2011.364(16):1523-1532.[12]WangD,UrismanA,LiuYT,etal.ViraldiscoveryandsequencerecoveryusingDNAmicroarrays.PLoSBiol[J],2003.1(2):E2.[13]DjikengA,KuzmickasR,AndersonNG,etal.MetagenomicanalysisofRNAvirusinfreshwater[J].2009.[14]SchmidtTM,DeLongEF,PaceNR.Analysisofamarinepicoplanktoncommunityby16SrRNAgenecloningandsequencing.JBacteriol[J],1991.173(14):4371-4378.[15]HandelsmanJ,RondonMR,BradySF,etal.Molecularbiologicalaccesstothechemistryofunknownsoilmicrobes:anewfrontierfornaturalproducts.ChemBiol[J],1998.5(10):R245-249.[16]BreitbartM,SalamonP,AndresenB,etal.Genomicanalysisofunculturedmarineviralcommunities.ProcNatlAcadSciUSA[J],2002.99(22):14250-14255.[17]WhiteJR,NagarajanN,PopM.Statisticalmethodsfordetectingdifferentiallyabundantfeaturesinclinicalmetagenomicsamples.PLoSComputBiol[J],2009.5(4):e1000352.[18]FinkbeinerSR,AllredAF,TarrPI,etal.Metagenomicanalysisofhumandiarrhea:viraldetectionanddiscovery.PLoSPathog[J],2008.4(2):e1000011.[19]GreningerAL,ChenEC,SittlerT,etal.AmetagenomicanalysisofpandemicinfluenzaA(2009H1N1)infectioninpatientsfromNorthAmerica.PLoSOne[J],2010.60 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新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定附录附录1溶液配制一、缓冲液配制1、SMBuffer缓冲液配制先配制1MTris-HCl（pH7.5）溶液；1)先用天平称量121.1gTris于1L烧杯中；2)加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解；3)在酸碱测定仪下，加入约70mL的浓盐酸，调节pH至7.5；4)使用容量瓶定容至1L后，分装并高压灭菌，室温保存。再配制1×SM缓冲液（不加明胶）；1)先称取MgSO4•7H2O试剂2g和NaCl试剂5.8g于1L烧杯中；2)加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解；3)再加入50mL的Tris-HCl（1M，pH7.5）；4)使用容量瓶定容至1L；5)高压灭菌并在室温保存。2、10×TE缓冲液配制先配制1MTris-HCl（pH8.0）溶液；1)先用天平称量121.1gTris于1L烧杯中；2)加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解；3)在酸碱测定仪下，加入约70mL的浓盐酸，调节pH至8.0；4)使用容量瓶定容至1L后，分装并高压灭菌，室温保存。再配制0.5MEDTA（pH8.0）溶液：1)先用天平称量186.1g的Na2EDTA•2H2O于1L烧杯中；2)加入约800mL的去离子水，充分搅拌；3)用NaOH调节pH值至8.0（约20gNaOH方可使EDTA完全溶解）；4)加去离子水将溶液定容至1L；5)高压灭菌并在室温保存。最后配制10×TE缓冲液：1)量取100mL的（1M，pH8.0）溶液和20mL的0.5MEDTA（pH8.0）溶液于1L烧杯中；2)向烧杯中加入约800mL的去离子水，混合均匀；3)测量pH值，在7.9~8.0（±0.5）范围即可，并将溶液定容至1L；4)高温高压分装并在室温保存。3、TAE电泳液配制1)先用天平称量37.2g的Na2EDTA•2H2O和242g的Tris于1L烧杯中；2)加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解；65 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定3)加入57.1mL的醋酸，充分搅拌；4)加入去离子水定容至1L，室温保存。二、细菌培养基1、LB液体培养基配制1)先用天平称量10g的Tryptone、5g的YeastExtract和10g的NaCl于1L烧杯中；2)加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解；3)加入NaOH调节pH至7.0；4)加去离子水定容至1L；5)高温高压灭菌，4℃保存。2、含100μg/mL氨苄西林LB液体培养基配制1)先用天平称量10g的Tryptone、5g的YeastExtract和10g的NaCl于1L烧杯中；2)加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解；3)加入NaOH调节pH至7.0；4)加去离子水定容至1L；5)高温高压灭菌，待冷却至55~65℃后，加入1mL的Ampicillin（100mg/mL）；6)4℃保存。3、含100μg/mL氨苄西林LB固体培养基配制1)先用天平称量10g的Tryptone、5g的YeastExtract和10g的NaCl和20g的Agar于1L烧杯中；2)加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解；3)加入NaOH调节pH至7.0；4)加去离子水定容至1L；5)高温高压灭菌，待冷却至55~65℃后，加入1mL的Ampicillin（100mg/mL）；6)4℃保存。66 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定附录2引物附表本研究所用引物TableTheprimersusedinthisstudyTargetPrimernameSequence（5'-3'）Fm-570AACTGTGGCTTTGAYYTAGCMosquitoanellovirusRm-916TCCACCAYTTYACMTSRTTAGGFt-811GGRTTTGACTTRGSAARATAYTTTorquetenotupaiavirusRt-1019GCTGGTCTAGGTAWCCAYATFs-902AGGAGGATRKTCAAKMGGAGTorquetenosusvirus1aRs-1286AWRTCTATRMAGRCTRCAGTACCAV-F11GARTTYGATTGGRCKCGKTAYGAAV-F12GARTTYGATTGGRCKAGGTAYGAAstrovirusAV-R1GGYTTKACCCACATICCRAAAV-F21CGKTAYGATGGKACKATICCAV-F22AGGTAYGATGGKACKATICCPBV-F1TGGMGMGGRCAGGAAGGTPicobirnavirusPBV-F2CARCGKGTRMTWTTYATGTTCCCPBV-R1CAAGTCCGAATTRAARTGYTGGTCADV-F1TGGTCKTWCATGCACATCGAdenovirus通用引物ADV-F2ACATGGCCAGCACSTACTTYGADV-RTCCACAGCYTGRTTCCACIV-F4463CCTCCCAGTTCYTCCATGCATTCPol-R5826CCAATCACATTCTTRGAAGCCGATGACG根据reads,contigs和参Pol-F5826CGTCATCGGCTTCYAAGAATGTGATTGG考序列设计AdenovirusPol-R7804GATGTAGAAACMTACACSTGGCACGG扩增引物ADV-F1TGGTCKTWCATGCACATCGHex-R19249TGGAAGTTCCKCATGAAWGAGTABTCV-F1CIGIWYICCICAYYKICARGCircovirus通用引物BTCV-R1AWCCAICCRYRRAARTCRTCBTCV-R2TGYTIYTIRTAICCRTCCCAAdaVFCTACMTCTCCTTCAACKCCAdaViFTTCGGSAAGAGGAACACCAdaVRTKCCKCCCAGGATSGCCTPVFAATGATCTMACTGCCGGRGTParvovirus检测引物PViFTCACATCARTATCCATACTCACPVRGTATGTTGTGTCAGCTGATGHi-PVF1CAAGTGTTCCCTRTTGTRCGCHi-PVF2GATCCAGTACAACTTCCTGAAGHi-PVRAGAYCCAGGAAGTTCTGGAAG根据测序片段设计圆环aCVF1CCYGGAGTTGGCAAGACTCGKCAT病毒全序列扩增引物aCVR1ACTCCCAATCTCCGTATACTG67 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定aCVR2TACGTCTGATTCTCCWGATCGGbCVF1CCAGCGTACAGATGGTGTTbCVF2ATTATAGGCAAAGAGGTTGGbCVR1AACTCATCAAACGGCAACMouseMosavirusF2TTYACWGARAGRAATGGATTTGACPicornaviridaeR2TCRTCTCCGTAMGCAAGCATGCGGF1ACTTCKCCWGGRTATCCKTArivirus2R1GCKYTTACCCAATTKARGATF-ArV1GAATTTTGGGTACTYACYCCArivirus1R-ArV1GMTTGATTWTSRTATGTRATCTGF-TeVCWGGSTCACCAACYACMWCTGTetnovirus2R-TeVAAAGWAGCGGSAGATAAAAGG285sDFAGAYTTYGCIAGYYTITAYCC285sILKTCCTGGACAAGCAGCARIYSGCIMTIAAHerpesvirus通用引物285asKG1GTCTTGCTCACCAGITCIACICCYTT286sTGVTGTAACTCGGTGTAYGGITTYACIGGIGT286asIYGCACAGAGTCCGTRTCICCRTAIAT根据contigs和参考序列Hep-13F1TGCTCCMTSACATACTTWGGATCTTCG设计HerpesvirusDPOLHep-38R1TGAGAAAAGTMATWTTCGATGGRCAGCA基因扩增引物，套式，Hep-13F2CTTWGGATCTTCGGCYAKCTCATAATT1300bpHep-38R2TTTACACMTGTCTYTTGGAAGARTGTGCPyV-1FCCAGACCCAACTARRAATGARAAPyV-1RAACAAGAGACACAAATNTTTCCNCCPolyomavirus通用引物PyV-2FATGAAAATGGGGTTGGCCCNCTNTGPyV-2RCCCTCATAAACCCGAACYTCYTCHACYTG3/5-F1GAACWGCYCCATCCARATAATCTCT3/5-R1GAAGGARGAGGTYTGTAATTGGAATAA17-F1CCTAAATTGYTRATAAAAGGRGGAGTDGAAGT根据Meta设计17-R1ACCATAYTTCCACAGGRTAAAAMCCATCPolyomavirus扩增引物17-F2TATSACTTGTGAMACTTTVATGATGTGGGA7-F1GGTACWGYTCCATCAAGRTRATCTCT7-R1ATTTGGCWGGGGTKGCWTGGTATPolyomavirus扩增引物，3/5-F1GAACWGCYCCATCCARATAATCTCT半套式外套3700bp内17-R1ACCATAYTTCCACAGGRTAAAAMCCATC套3700bp7-F1GGTACWGYTCCATCAAGRTRATCTCTPolyomavirus扩增引物，17-F1CCTAAATTGYTRATAAAAGGRGGAGTDGAAGT半套式外套2600bp内3/5-R1GAAGGARGAGGTYTGTAATTGGAATAA套2330bp17-F2TATSACTTGTGAMACTTTVATGATGTGGGA3000FTTATTCCAATTACARACCTCYTCCTTC反向互补扩增3000R1TCCCACATCATBAAAGTKTCACAAGTSATApolyomavirus3000R2ACTTCHACTCCYCCTTTTATYARCAATTTAGG根据Contig1和参考序Dic-F1GCAATAATTGTSGACACWTTGAAAGATG68 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定列设计Dicistroviridae检Dic-R1AGTCKTTTGAAAAGAAGKTCCCAYTC测引物Dic-R2CCCTCTCKTTTGAAGTCKTTTGLav1-F1TTGGGCTACCAACGGAACTATTLav1-R1CTGATATCCTGAGCGATGAAACLav1-F2GCTACCAACGGAACTATTCAAAC根据2条Contigs各设计Lav1-R2GCGATGAAACCAAGATGAATACGLavidaviridae检测引物Lav2-F1CGCCACAAAAGGCAGTATAAATACLav2-R1CATACCTATTTCATTCATGGATTCTTCLav2-F2GGCAGTATAAATACATCAGACGTALav2-R2TTCATGGATTCTTCAATCTCTTGTGNod-1-FGGTCTATCTGCCAAAGTTGATCTNod-1-R1GATAGGCCAGTAACATCGTAGAANod-1-R2TCGTAGAAGGCAGGAATGATTGA根据contigs设计扩增Nod-2-F1GATCCTTATGCTATTTCTCCTGCNodavirus检测引物，半Nod-2-F2AGATTGCTCGTGTTCGTGAGTA套式Nod-2-RAGGGTAGCAATAAGATGATCGAGNod-3-FCATTTTAGAGCACCCCCTTGATANod-3-R1GATGAGAGATGAAGTCTTGAATTTCNod-3-R2ATTTCATGAGGGCTCTTACCAGF-HRVAGAGTACTTAATGCATGTT人源轮状病毒R-HRVGTTTYAGTGATTCARAGCGF-BRVCWGRCTTGGRCAATTAGTYG牛源轮状病毒R-BRVAGTGTTTGTGGACTTGGTATF-LRVTGTCARAATGCAGCTACAGATG羊源轮状病毒R-LRVCTAGGTCCAACRTTAAYTACCytoCFATGACCAACATYCGIAAATCHCAYCC旱獭物种鉴定引物CytoCRGGAGGAAGTGCAGGGCRAARAATCG69 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定致谢子曰：“逝者如斯夫，不舍昼夜”。三年的研究生生涯就如一抔黄沙，我想留也所剩不多了。这是忙碌的三年，也是充实的三年；这是灰色的三年，也是五彩缤纷的三年；这是播种的三年，也是收获的三年。这三年认识了很多老师、同学，和他们一起生活的日子，让我获益匪浅，成长良多。首先衷心的感谢我导师老师屈勇刚副教授，是他开导我开启研究生生涯，给我初步的实验室指导，同时还给我生活上的指导，让我对人生有许多新的认知，并将我送到了长春兽医研究所学习；感谢涂长春研究员，给我在长春兽医研究所学习的机会，并给我实验方向的指导，组会上的教导让我明白今后的实验方向，生活里的沟通开启我认知的新天地；感谢何彪老师，作为我在兽研所学习实验的直接辅导老师，他认真负责，对待工作一丝不苟，是他教会我设计引物、分析宏基因组结果、指导我实验的方向。他一手创立的“JingyueTalk”，每周一人一次的小组总结，还有做实验的“葵花宝典”，即“VET小组研究所能力与素质培养”，使我们互相学习，共同进步；还要感谢徐琳师姐，作为我毕业课题的合作者，我们一起展开了对新疆野生长尾旱獭病毒组的研究工作，我们分工加合作，这期间师姐设计了大量检测和扩增病毒的引物，我则据此开展实验层面的工作，使实验工作进展神速，再次感谢徐琳师姐对我毕业课题的帮助。感谢实验室的郭焕成老师、冯烨老师、刘艳老师和龚文杰老师。他们和我们研究生一起工作学习，当我在学习或生活上遇到问题或困难时，他们给了我极大的支持和鼓励，因此我才能完成我的硕士学习。感谢张岩博士，帮我们订购试剂，解答我实验中的疑惑。感谢王素珍阿姨、信秀芹阿姨，正是由于他们的辛勤工作，我们的实验才能有强大的后勤保障，让我们顺利做实验。感谢我们研究小组的孟菲博士、蔡建秋硕士、刘东晓硕士、杨灵恩硕士、谈之舟硕士、朱爱薇硕士、张畅硕士、燕超硕士，我们共同交流学习的日子，让我终生难忘。感谢实验室的涂忠忠博士、张必凯硕士、罗庆华硕士、于明洋硕士、米士江硕士、包菲硕士、任照文硕士、王宇洋硕士等人和许炜迪助理、赵梓含助理、刘婷芳助理等人，他们和我一起在涂老师课题组里学习生活，给我很多帮助，让我的生活更丰富多彩。感谢我石河子大学的同学张倩硕士、于会举硕士、刘鸽硕士、杨慧敏硕士、宋敏硕士、吴圆圆硕士等人，硕士生涯与你们相遇相识，我感到很幸运，感谢你们在我离校的时候，给我办了很多事情，你们是最美的人。感激我的父母亲、兄弟姐妹，几十年来一直接受在我同龄人里你们能给的最好的教育，从小就上私立小学、中学，才有机会上县里最好的高中。一路走来，我认真踏实努力上进，没给你们二老节外生枝。我从母亲身上学到了坚强，从父亲身上看到了辛劳与关爱，真心的感谢你们，望你们身体健康，快快乐乐，儿子今后也一定能走好自己的路。最后，向所有那些关心我，帮助我的老师、师兄师姐、师弟师妹们，表示我最真挚的谢意，希望你们今后的学习生活和工作之路，都一帆风顺，芝麻开花节节高。70 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定作者简介张培生，男性，汉族，生于1991年12月，籍贯河南。2011-2015年就读于河南科技大学动物科技学院动物医学专业，2015年6月毕业，获得农学学士学位，同年考入石河子大学动物科技学院预防兽医学专业，攻读预防兽医硕士学位。在学期间主要参与的研究项目新疆重要自然宿主和媒介昆虫携带人兽共患病毒的病原生态学与分子流行病学研究（项目号：U1503283）。在校期间发表的文章张培生,谈之舟,徐琳,赵梓含,涂长春,屈勇刚,何彪.新疆乌拉尔田鼠细环病毒的分析与鉴定.病毒学报[J]，2017(3):898-904.71 新疆长尾旱獭病毒组学及其新病毒的鉴定7266
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