肿瘤相关成纤维细胞因子Connexin+43及α-SMA在口腔鳞状细胞早期浸润癌病理诊断中的价值

《肿瘤相关成纤维细胞因子Connexin+43及α-SMA在口腔鳞状细胞早期浸润癌病理诊断中的价值》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

学校代码10459学号或申请号201522443944密级公开专业硕士学位论文肿瘤相关成纤维细胞因子Connexin43及ɑ-SMA在口腔鳞状细胞早期浸润癌病理诊断中的价值作者姓名：白忻如导师姓名：吕新全教授专业学位名称：临床病理学培养院系：郑州大学第一附属医院完成时间：2018年5月 AdissertationsubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterThevalueofcarcinoma-associatedfibroblastfactorsConnexin43andɑ-SMAinpathologicaldiagnosisofearlyinvasivecarcinomaoforalsquamouscellsByXinruBaiSupervisor:Prof.XinquanLvClinicalPathologyTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMay2018 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期；別８年£月以日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品。，知识产权归属郑州大学根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时一，第署名单位仍然为郑－州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：９丨和日期ｒ年５月以日巧 肿瘤相关成纤维细胞因子Connexin43及ɑ-SMA在口腔鳞状细胞早期浸润癌病理诊断中的价值硕士研究生：白忻如导师：吕新全教授郑州大学第一附属医院病理科河南郑州450052摘要研究背景口腔鳞状细胞癌（oralsquamouscellcarcinoma,OSCC）是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，过去十年其发病率增加了50%，大多发生在40岁以上的男性，严重影响着人类的身心健康与生活质量。大部分的OSCC诊断时即进展至Ⅲ～Ⅳ期，5年生存率仅有53%，为提高患者的生活质量，OSCC的早期诊断尤为重要。口腔黏膜鳞状上皮异常增生的程度越高，则潜在恶性越高，因此明确口腔鳞状上皮重度不典型增生（oralsquamousepithelialseveredysplasia,OSESD）、口腔鳞状细胞原位癌（oralsquamouscellcarcinomainsitu,OSCCIS）、口腔鳞状细胞原位癌伴微浸润（oralsquamouscellcarcinomainsituwithmicro-infiltration,OSCCISM）的诊断与患者的治疗与预后息息相关。近年来，对肿瘤微环境的研究越来越多，对肿瘤微环境的主要成分-肿瘤相关成纤维细胞（carcinoma-associatedfibroblasts,CAFs）有关的研究也有了不小收获。它能激活转化生长因子-β以调控角质细胞间的黏附性，亦可分泌广泛的细胞因子，例如生长因子、趋化因子、激素等，使其在肿瘤的生长、转移、浸润及肿瘤引起的炎症反应和免疫逃逸方面都发挥着重要作用，同时CAFs的增加预示着较差的预后。很多研究都认为CAFs是由肿瘤间质中的正常成纤维细胞在受到相关因子的刺激下转变而来，且CAFs表达ɑ-SMA，而正常口腔成纤维细胞（normaloralfibroblasts,NOF）不表达ɑ-SMA，同时CAFs也会表达Connexin43。I 从理论上讲，只有当癌变细胞离开原位上皮，开始浸润上皮下纤维组织时，才会使正常纤维组织转化为CAFs。据此，我们推测检测CAFs相关指标，有助于判断癌的早期浸润。本课题收集了口腔黏膜不同类型的鳞状上皮内病变、早期浸润癌及浸润癌，应用免疫组化方法对CAFs因子Connexin43及ɑ-SMA进行免疫组化单染及双染，从而判断这些指标是否具有协助判断鳞状细胞癌早期浸润的价值。目的应用免疫组化单染及双染方法，分别及联合检测Connexin43及ɑ-SMA在口腔黏膜不同类型鳞状上皮病变中的表达情况，探讨二者是否具有协助判断鳞状细胞癌早期浸润的价值。材料和方法1.收集郑州大学第一附属医院2011年至2014年住院患者口腔黏膜病变切除标本197例。经病理诊断后，OSESD组织54例，OSCCIS组织58例，OSCCISM/OSCC组织75例，作为对照组的口腔黏膜慢性炎（chronicinflammationoforalmucosa，CIOM）10例。2.应用免疫组化单染及双染检测10例CIOM、54例OSESD、58例OSCCIS、75例OSCCISM/OSCC患者的病理组织中Connexin43和ɑ-SMA蛋白的表达情况以及Connexin43及ɑ-SMA蛋白的共同表达情况，分析Connexin43、ɑ-SMA及其所代表的CAFs与口腔鳞状上皮病变临床病理诊断的关系。3.随访：以电话沟通方式对OSESD及OSCCIS患者进行随访，观察记录患者疾病进展情况。4.统计学处理：采用SPSS21.0统计软件进行数据分析和χ2检验，P＜0.05时认为差异有统计学意义。结果1.Connexin43单染：在CIOM、OSESD、OSCCIS、OSCCISM/OSCC的间质中，Connexin43的阳性率分别为10.00%、11.11%、43.10%、61.33%，除CIOMII 与OSESD之间差异无统计学意义外，其余组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；2.ɑ-SMA与ERG双染：在CIOM、OSESD、OSCCIS、OSCCISM/OSCC的间质中，除外血管区域，ɑ-SMA的阳性率分别为0.00%、9.30%、34.48%、68.00%,除CIOM与OSESD之间差异无统计学意义外，其余组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。3.Connexin43及ɑ-SMA双染：在CIOM、OSESD、OSCCIS、OSCCISM/OSCC的间质中，CAFs的阳性率分别为10.00%、16.67%、55.17%、85.33%，除CIOM与OSESD之间差异无统计学意义外，其余组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。4.在OSCCISM/OSCC中，可明显观察到浸润癌周边的间质呈CAFs相关因子阳性表达；在OSESD及OSCCIS的随访结果中，间质呈CAFs阳性的患者较CAFs阴性的患者更易进展至OSCC。结论1.本研究验证了Connexin43及ɑ-SMA所代表的CAFs在口腔黏膜鳞状上皮不同病变程度中的表达有明显差异，CAFs的阳性率随口腔黏膜鳞状上皮病变程度的增加而升高；2.根据对OSESD及OSCCIS病人的随访结果，CAFs的增加是不良的预后指标，提示肿瘤进展的机率增加；3.在判断OSCCIS局部是否有浸润时，若可疑癌周边的间质呈CAFs阳性表达，则更支持浸润癌的诊断，因此Connexin43及ɑ-SMA对口腔鳞状上皮病变及鳞状细胞癌早期浸润的诊断具有一定的价值。关键词：口腔鳞状上皮病变；口腔鳞状细胞癌；原位癌伴微浸润；Connexin43；ɑ-SMAIII Thevalueofcarcinoma-associatedfibroblastsfactorsConnexin43andɑ-SMAinpathologicaldiagnosisofearlyinvasivecarcinomaoforalsquamouscellPostgraduate:XinruBaiSupervisors:Prof.XinquanLvDepartmentofPathology,TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityZhengzhou,Henan450052AbstractBackgroundOralsquamouscellcarcinoma（OSCC）isacommonmalignanttumorinoralandmaxillofacialregion,whichseriouslyaffectshumanhealthandqualityoflife.Theincidenceoforalsquamouscellcarcinomahasincreasedby50%inthepasttenyears.Mostly,itoccursinmalesovertheageof40.MostoftheOSCCdiagnosisprogressestoⅢ～Ⅳstage,5-yearsurvivalratewasonly53%,inordertoimprovethequalityoflifeofpatients,theearlydiagnosisofOSCCisparticularlyimportant.Thehigherthedegreeofdysplasiaoforalmucosalsquamousepithelium,thehigherthepotentialmalignancy.Therefore,aclearandearlydiagnosisoforalsquamousepithelialseveredysplasia（OSESD）,oralsquamouscellcarcinomainsitu（OSCCIS）,andoralsquamouscellcarcinomainsituwithmicro-infiltration（OSCCISM）arecloselyrelatedtothetreatmentandprognosisofpatients.Inrecentyears,moreandmoreresearcheshavemadeontumormicroenvi-ronment,andthestudyoftumor-associatedfibroblasts,themaincomponentoftumormicroenvironment,havealsomadeagreatprogress.Itcanactivatetransforminggrowthfactor-βtoregulatekeratinocyteadhesionandsecreteawiderangeofcytokines,suchasgrowthfactors,chemokines,hormones,andplayanimportantroleIV intumorgrowth,metastasis,invasionandtumor-inducedinflammationandimmuneevasion.Atthesametime,theincreaseofCAFsindicatespoorprognosis.ManystudiessuggestthatCAFsaretransformedbythenormalfibroblastsinthetumorstromastimulatedbytherelevantfactorssecretedbytumorcells.somestudieshaveshownthatCAFsexpressɑ-SMA,whilenormaloralfibroblastsdonotexpressɑ-SMA,andCAFsalsoexpressConnexin43.Intheory,normalfibroustissueisconvertedtoCAFsonlywhencancerouscellsinfiltratesubepithelialfibroustissuefromtheepitheliuminsitu.Basedonthis,wespeculatethatthedetectionofrelevantindicatorsofCAFscanhelpdeterminetheearlyinfiltrationofcancer.Thissubjecthascollecteddifferenttypesoforalmucosalsquamousintraepitheliallesions,earlyinvasivecarcinomaandinvasivecarcinoma.ImmunohistochemistrywasusedtoanalyzethesinglestaininganddoublestainingofCAFsfactorsConnexin43andɑ-SMAtojudgewhethertheseindexeshavethevalueofassistinginjudgingtheearlyinvasionofsquamouscellcarcinoma.ObjectiveTheuseofimmunohistochemicalstaininganddoublestainingmethodstodetecttheexpressionofConnexin43andɑ-SMAindifferenttypesofsquamousepitheliallesionsoftheoralmucosa,andtoexplorewhethertheyhavethevalueofassistinginjudgingtheearlyinvasionofsquamouscellcarcinoma.Methods1.Collected197casesoforalmucosallesionresectioninpatientsfrom2011to2014intheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity.Weselected54OSESD,58OSCCIS,and75OSCCISM/OSCC.Inaddition,10chronicinflammationoforalmucosa（CIOM）asthecontrolgroup；2.Theimmunohistochemicalsinglestaining（Connexin43），double-staining（ɑ-SMAandERG,whichcanremovevascularsmoothmuscle）anddouble-staining（Connexin43andɑ-SMA,whichcanimprovethedetectionrateofCAFs）wereV usedin10CIOM,54OSESD,58OSCCIS,and75OSCCISM/OSCCtodetecttheexpressionofConnexin43proteinandɑ-SMAprotein，aswellastheco-expressionofConnexin43andɑ-SMAprotein，toanalyzetherelationshipamongConnexin43,ɑ-SMA,andtheCAFstheyrepresentwiththeclinicopathologicaldiagnosisoforalsquamousepitheliopathy.3.Follow-up:Follow-upbyphonetopatientswithOSESDandOSCCISandobservetheprogressofthedisease.4.Statisticalanalysis:SPSS21.0statisticalsoftwarewasusedfordataanalysisandχ2test,P<0.05wasconsideredstatisticallysignificantdifferences.Results1.Connexin43singlestain：ThepositiveratesofConnexin43inthestromaofCIOM,OSESD,OSCCISandOSCCISM/OSCCwere10.00%,11.11%,43.10%and61.33%respectively.ExceptforthedifferencebetweenCIOMandOSESDwasnotstatisticallysignificant,thedifferencesbetweentheothergroupswerestatisticallysignificant(P<0.05).2.ɑ-SMAandERGdoublestaining：Exceptforthevasculararea，thepositiveratesofɑ-SMAwere0.00%,9.30%,34.48%,68.00%inthestromaofCIOM,OSESD,OSCCISandOSCCISM/OSCC.ExceptforthedifferencebetweenCIOMandOSESDwasnotstatisticallysignificant,thedifferencesbetweentheothergroupswerestatisticallysignificant(P<0.05).3.Connexin43andɑ-SMAdoublestaining:ThepositiveratesofCAFsinthestromaofCIOM,OSESD,OSCCISandOSCCISM/OSCCwere10.00%,16.67%,55.17%and85.33%.ExceptforthedifferencebetweenCIOMandOSESDwasnotstatisticallysignificant,thedifferencesbetweentheothergroupswerestatisticallysignificant(P<0.05).4.InOSCCISM/OSCC,stromacellssurroundinginfiltratingcarcinomawereclearlypositiveforCAFsfactors.AmongOSESDandOSCCISfollow-upresults,PatientswithpositiveCAFsinstromaaremorelikelytoprogresstoOSCCthanpatientswithnegativeCAFs.VI Conclusions1.ThisstudydemonstratedthesignificantdifferencesintheexpressionofCAFs,whichexpressedinConnexin43andɑ-SMA,indifferentdegreesoforalmucosalsquamousepitheliallesions.2.Accordingtothefollow-upresultsofOSESDandOSCCISpatients,theincreaseofCAFsisapoorprognosticindicator,suggestinganincreasedprobabilityoftumorprogression.3.IndeterminingwhetherthereispartialinfiltrationofOSCCIS,iftheexpressionofCAFswerepositiveinthesurroundingstromaofthesuspiciouscancer,thediagnosisismoresupportiveofinvasivecancer.Therefore,Connexin43andɑ-SMAhavesomevalueinthediagnosisoforalsquamouscellcarcinomaandearlyinvasionofsquamouscellcarcinoma.Keywords：oralsquamousintraepitheliallesion;oralsquamouscellcarcinoma;carcinomainsituwithmicro-infiltration;Connexin43;ɑ-SMAVII 目录正文部分中英文缩略词对照表............................................................................................I肿瘤相关成纤维细胞因子Connexin43及ɑ-SMA在口腔鳞状细胞早期浸润癌病理诊断中的价值................................................................................................1前言....................................................................................................................1材料与方法............................................................................................................3实验结果..............................................................................................................12讨论..................................................................................................................20结论..................................................................................................................23参考文献..............................................................................................................24综述部分肿瘤相关成纤维细胞在肿瘤中的研究进展......................................................27参考文献..............................................................................................................36附录部分个人简历..............................................................................................................44致谢..................................................................................................................45 中英文缩略词对照表英文缩略词英文全称中文释义CIOMChronicinflammationoforalmucosa口腔黏膜慢性炎OSESDoralsquamousepithelialseveredysplasia口腔鳞状上皮重度不典型增生OSCCISoralsquamouscellcarcinomainsitu口腔鳞状细胞原位癌OSCCISMoralsquamouscellcarcinomainsituwithmicro-infiltration口腔鳞状细胞原位癌伴微浸润OSCCoralsquamouscellcarcinoma口腔鳞状细胞癌CAFscarcinoma-associatedfibroblasts肿瘤相关成纤维细胞NOFnormaloralfibroblasts正常口腔成纤维细胞α-SMAα-smoothmuscleactinα-平滑肌激动蛋白FSP-1fibroblast-specificprotein-1成纤维细胞特异性蛋白-1I 肿瘤相关成纤维细胞因子Connexin43及ɑ-SMA在口腔鳞状细胞早期浸润癌病理诊断中的价值硕士研究生：白忻如导师：吕新全教授郑州大学第一附属医院病理科河南郑州450052前言口腔鳞状细胞癌（oralsquamouscellcarcinoma,OSCC）约占头颈部癌的95%，是口腔颌面部常见的恶性肿瘤[1]，也是我国最常见的恶性肿瘤之一。在全球范围内OSCC占所有新发癌症病例的4%～7%[2]，是影响人群健康的重要疾病，严重威胁人们的生活和健康，过去十年其发病率增加了50%[3]，且大多发生在40岁以上的男性[4]。关于病变部位，赵福运等人[5]曾总结了570例口腔鳞状细胞癌，其中舌癌136例（23.9%），下牙龈癌133例（23.3%），唇癌（原发部位为唇黏膜）92例（16.1%），颊癌70例（12.3%），上牙龈癌62例（10.9%），硬腭癌47例（8.2%），口底癌30例（5.3%）。随着近几十年来对OSCC研究的增加，相关治疗技术也有了很大的进步，除了传统的手术方法，化疗、放疗等也依次用于患者的治疗，尤其是新辅助化疗药物的使用为患者争取了更多的治疗机会，但统计分析患者的生存率后我们发现，患者的5年生存率并没有得到显著改变[6-9]，且仅有53%[10-12]。这是因为大部分的OSCC诊断时即进展至Ⅲ～Ⅳ期，这显著降低了患者的生存率及生活质量。为提高患者的生存率及生活质量，OSCC的早期诊断显得尤为重要。口腔黏膜鳞状上皮异常增生的程度越高，则潜在恶性越高，因此明确口腔鳞状上皮重度不典型增生（oralsquamousepithelialseveredysplasia,OSESD）、口腔鳞状细胞原位癌（oralsquamouscellcarcinomainsitu,OSCCIS）、口腔鳞状细胞原位癌伴微浸润（oralsquamouscellcarcinomainsituwithmicro-infiltration,OSCCISM）的诊断与患者的治疗与预后息息相关。肿瘤间质由很多细胞组成，如肿瘤相关成纤维细胞（carcinoma-associated1 fibroblasts，CAFs）、血管内皮细胞、周细胞、巨噬细胞及其他免疫细胞等，这些细胞和它们的产物组成了一个适宜肿瘤生长、侵袭、转移并产生耐药的微环境[13,14]。近年来肿瘤微环境得到了大家的广泛关注，对肿瘤的微环境中的主要成分CAFs有关的研究也有了不小的收获。它能激活转化生长因子-β以调控角质细胞间的黏附性[15]，亦可分泌广泛的细胞因子，例如生长因子、趋化因子、激素等[16-18]，使其在肿瘤的发生、进展、转移、浸润、耐药及肿瘤引起的炎症反应和免疫逃逸方面都发挥着重要作用[11,19-26]，且CAFs增加预示着较差的预后[27-29]。关于CAFs的来源，目前尚未得到明确的阐述，很多研究都认为CAFs都是由间质内的正常成纤维细胞经肿瘤细胞分泌的相关因子刺激后活化而来[30]，还有部分认为是由癌细胞经上皮-间质转化过程转化而来[31]，其他的来源还有骨髓间充质干细胞[32,33]、经内皮-间质转化的内皮细胞[34]以及脂肪细胞等[35]。目前很多文献对CAFs的免疫标型都有所描述，如α-平滑肌激动蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）[23]、波形蛋白（Vimentin）、成纤维细胞激活蛋白（Fibroblastactivationprotein，FAP）、连接蛋白43（Connexin43）[22]、成纤维细胞特异性蛋白-1（fibroblast-specificprotein-1，FSP-1）等，到目前为止，CAFs尚没有一种明确的免疫标记物，但是上述免疫指标的使用都能够帮助我们来识别它。有研究表明CAFs表达ɑ-SMA，而正常口腔成纤维细胞（normaloralfibroblasts,NOF）不表达ɑ-SMA[23]，因此本研究选取了Connexin43及ɑ-SMA作为CAFs的免疫标记物，对CAFs进行Connexin43单染、ɑ-SMA和ERG双染（可以去除血管平滑肌）以及Connexin43与ɑ-SMA双染，观察Connexin43及ɑ-SMA在CIOM、OSESD、OSCCIS及OSCCISM/OSCC中的表达情况，以期能够帮助诊断口腔黏膜鳞状上皮病变以及病变局部是否有浸润，然后我们对OSESD及OSCCIS的病人进行随访，观察CAFs的阳性表达是否对患者的预后有提示作用。2 材料与方法1实验材料1.1组织标本的收集筛选郑州大学第一附属医院2011年～2014年住院患者对口腔黏膜病变行手术切除的标本197例。所有标本均由2名诊断经验丰富的病理医师复验病理切片后共同确诊。其中，口腔黏膜慢性炎（chronicinflammationoforalmucosa,CIOM）10例，OSESD54例，OSCCIS58例，OSCCISM/OSCC75例。1.2临床资料分析在所选取的197例组织标本中，男女比例约为4:1，年龄在3-88岁之间，平均年龄为60岁，中位年龄为62岁。病变部位所占的比例分别为声带（48.4%）、咽喉（25.9%）、颊部（8.8%）、舌部（7.2%）、腭部（3.8%）、口底（3.3%）、牙龈（1.6%）、唇（1.0%）。1.3主要试剂1.浓缩型Connexin43兔多克隆抗体（GJA1，Ig分类：兔IgG）购自艾博抗（上海）贸易有限公司；2.浓缩型ɑ-SMA鼠单克隆抗体（克隆号：1A4，Ig分类：IgG1/K）及浓缩型ERG兔单克隆抗体（克隆号：EP111（EPR3864），Ig分类：兔IgG）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；3.即用型快捷免疫组化MaxVisionTMHRP试剂盒（兔，KIT-5004）、即用型快捷免疫组化MaxVisionTMAP试剂盒（鼠，KIT-5101）、即用型快捷免疫组MaxVisionTMHRP试剂盒（抗鼠/兔，KIT-5020）、内源性过氧化物酶阻断剂（SPKIT-A2）、正常非免疫山羊血清（SPKIT-B2）、AEC水性封片剂（AEC-1039）、EDTA抗原修复液、柠檬酸钠抗原修复液（PH8.0）、苏木素及伊红染液均购自福州迈新生物技术开发有限公司；浓缩型DAB显色试剂盒（ZLI-9018）及磷酸酶底物AP-Red显色试剂盒（ZLI-9042）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；4.其他试剂及材料：Connexin43阳性对照片（人睾丸组织）、抗体稀释液、3 PBS缓冲液、PCI系列粘附载玻片、盖玻片、滤纸、蒸馏水、免疫组化湿盒、10%中性福尔马林固定液、二甲苯、无水乙醇、95%酒精、85%酒精、75%酒精、盐酸酒精分化液、中性树脂等。1.4主要实验设备切片机德国莱卡公司光学显微镜奥林巴斯BX53低温冰箱青岛海尔集团有限公司电热鼓风干燥箱上海博讯医疗生物仪器有限公司生物组织摊片烤片机济南鑫贝西生物技术有限公司高压蒸汽锅武汉金光电子器械有限公司电磁炉美的集团量筒上海书培实验设备有限公司微量加样器上海力辰邦西仪器科技有限公司染色缸上海锐谷生物科技有限公司其他：一次性手套、枪头、染色架、EP管等。1.5主要试剂配制1.Connexin43抗体配制：严格按照试剂说明书配制，取适量Connexin43浓缩液与抗体稀释液分别按照1:500、1:1000、1:2000、1:3000的浓度梯度稀释进行预实验，发现以1:1000比例稀释染色效果最好，因此Connexin43按照1:1000的比例配制。2.ɑ-SMA与ERG抗体配制：因ɑ-SMA与ERG均为浓缩液，因此需进行预实验以获得二者的最适稀释比例。严格按照试剂说明书配制，取适量ɑ-SMA浓缩液与抗体稀释液分别按照1:50、1:100、1:150、1:200的浓度梯度稀释，取适量ERG浓缩液使其与抗体稀释液的比例分别为1:10、1:20、1:30、1:40进行预实验，最终结果发现发现ɑ-SMA以1:150、ERG以1:20的比例所获得的效果最佳，因此ɑ-SMA与ERG的浓度按照上述比例配制。3.Connexin43与ɑ-SMA鸡尾酒双染抗体配制：Connexin43与ɑ-SMA的用量需按照1:1的比例进行配制，因Connexin43与ɑ-SMA均为浓缩液，因此需进行预实验以获得二者的最适稀释比例。严格按照试剂说明书配制，取适量4 Connexin43浓缩液与抗体稀释液分别按照1:500、1:1000、1:2000、1:3000的浓度梯度稀释，同时在相应溶液内分别加入ɑ-SMA浓缩液使其与抗体稀释液的比例分别为1:50、1:100、1:150、1:200进行预实验，最终结果发现发现Connexin43以1:1000、ɑ-SMA以1:150的比例所获得的效果最佳，因此Connexin43与ɑ-SMA鸡尾酒双染抗体浓度按照上述比例配制。4.鸡尾酒双染二抗：取适量快捷型酶标羊抗小鼠IgG聚合物与快捷型酶标羊抗兔IgG聚合物按照1:1的比例加入试剂配制瓶中，充分混匀。5.柠檬酸钠抗原修复液：严格按照试剂说明书进行配制，将一包柠檬酸钠粉置于5L蒸馏水中搅拌使其充分混匀，浓度配制成0.01mol/L，PH约6.0即可。6.EDTA抗原修复液：严格按照试剂说明书进行配制，取适量EDTA溶液，将其与蒸馏水按照1:50的比例稀释混匀，浓度配制成0.01mol/L，PH约8.0即可。7.磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）：严格按照试剂说明书进行配制，将一包PBS粉置于5L蒸馏水中搅拌使其充分混匀，浓度配制成0.01mol/L，PH在7.2～7.4范围内即可。8.DAB显色液：严格按照试剂说明书进行配制，在1毫升试剂2（DAB底物液）中加入1滴（约50μl）试剂1（DAB浓缩液），混合均匀，即配成DAB工作液。此溶液必须现用现配，配好后避光保存，6h内使用，剩余的液体应弃去。9.AP-Red显色液：严格按照试剂说明书进行配制，首先在试管中分别滴加一滴试剂A（AP-Red底物增强剂约50μl）和一滴试剂B（AP-Red浓缩液约50μl），室温孵育混合物2～5min；然后在上述混合液中加入2ml蒸馏水；最后再加入二滴（约100μl）试剂C（底物缓冲液浓缩液）于其中，混匀即可。2实验方法2.1组织切片的制备所有经手术切除后的组织标本都经过10%中性福尔马林固定液充分固定，按照标准取材，常规脱水、石蜡包埋，经切片机按照3μm厚连续切片，在摊片烤片机上控水烤片以增加组织与玻片的粘附，然后在60℃电热鼓风干燥箱内烘烤1～2h，常温冷却后将组织切片放置在4℃冰箱储存或直接使用。5 2.2苏木素-伊红（HE）染色步骤1.二甲苯Ⅰ5min；2.二甲苯Ⅱ3min；3.无水乙醇Ⅰ2min；4.无水乙醇Ⅱ2min；5.95%酒精10s；6.75%酒精10s；7.水冲1min；8.苏木素6min；9.水冲1min；10.分化液1s；11.水冲1min；12.伊红2min；13.水冲10s；14.75%酒精2s；15.95%酒精2s；16.无水乙醇Ⅱ1min；17.无水乙醇Ⅰ1min；18.二甲苯Ⅱ1min；19.二甲苯Ⅰ1min；20.中性树脂封片2.3免疫组化MaxVision二步法染色步骤1.烤片：将储存在4℃冰箱的切片拿出，放置至常温后置于60℃烤箱中烘烤1h，直至组织内所含蜡完全溶解，将切片拿出放置至常温；2.脱蜡、水化切片：将切片分别放置在二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min脱蜡，然后再经无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、95%酒精5min、85%酒精5min、75%酒精5min水化，然后将玻片用PBS缓冲液水冲3次，每次3～5min；3.抗原修复：根据一抗说明书的要求，对组织进行相应的抗原修复。本研究中Connexin43单染采用柠檬酸钠修复液进行抗原修复，具体方法如下：将1-2L柠檬酸钠抗原修复液放置于高压蒸汽锅中，然后将放置于染色架中的切片置于6 该液体中，液体的量应以切片完全没入其中为宜；将高压蒸汽锅放在电磁炉上，功率调制800w，加热至沸腾，待压力阀门开始喷气时开始计时，2min后关闭电源，自然冷却10min，然后用自来水冲高压蒸汽锅外壁10min快速冷却，将切片取出，用PBS缓冲液冲洗3次，每次3～5min；4.灭活内源性过氧化物酶活性：在切片上滴加1～2滴内源性过氧化物酶阻断剂3%H2O2（50～100μl），保证组织均被过氧化物阻断酶覆盖后将切片水平置于湿盒中，于室温下孵育10～15min后，将切片用PBS缓冲液冲洗3次，每次3～5min；5.封闭非特异性结合位点：在每张切片上滴加1～2滴（50～100μl）正常非免疫山羊血清，保证组织均被山羊血清覆盖后将切片平放于湿盒中，于室温下孵育20min，用滤纸擦去多余血清；6.滴加一抗：每张切片滴加1～2滴（50～100μl）配制好的一抗试剂（Connexin43），使组织完全被一抗试剂覆盖，然后平放于湿盒中，于4℃冰箱内孵育12-14h；7.复温：将放置组织切片的湿盒从4℃冰箱内取出，在室温下放置1h，用PBS缓冲液冲洗3次，每次3～5min；8.滴加二抗：每张切片滴加1～2滴（50～100μl）二抗试剂快捷型酶标羊抗小鼠/兔IgG,确保组织被二抗完全覆盖后将切片水平置于湿盒中，室温孵育30min后用PBS缓冲液冲洗3次，每次3～5min；9.DAB显色剂显色：每张切片滴加1～2滴（50～100μl）新鲜配制的DAB显色液，在奥林巴斯光学显微镜下观察显色情况，一般约3～5min，若显色不够可适当延长时间，待显色充分后及时终止，用自来水冲洗10～15min；10.苏木素复染：每张切片滴加1～2滴（50～100μl）苏木素染液，染色30s～1min，根据染色情况决定是否需要需要用分化液分化，若需要分化，则在盐酸酒精分化液中分化1～3s，然后用自来水冲10-15min；11.脱水、透明：切片按照75%酒精、85%酒精、95%酒精、无水乙醇Ⅱ、无水乙醇Ⅰ的顺序，每缸溶液各浸泡5min进行脱水，然后再分别放入二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ溶液中，各浸泡10min透明；12.封片：将切片从二甲苯Ⅰ溶液中取出后，快速用中性树脂封片。7 2.4免疫组化顺序双染法（ɑ-SMA、ERG）染色步骤1.烤片：将储存在4℃冰箱的切片拿出，放置至常温后置于60℃烤箱中烘烤1h，直至组织内所含蜡完全溶解，将切片拿出放置至常温；2.脱蜡、水化切片：将切片分别放置在二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min脱蜡，然后再经无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、95%酒精5min、85%酒精5min、75%酒精5min水化，然后将玻片用PBS缓冲液水冲3次，每次3～5min；3.抗原修复：根据一抗说明书的要求，对组织进行相应的抗原修复。在本研究中ɑ-SMA与ERG顺序双染采用EDTA抗原修复液进行抗原修复，具体方法如下：将1-2LEDTA抗原修复液放置于高压蒸汽锅中，然后将置于染色架中的切片置于该液体中，液体的量应以切片完全没入其中为宜；将高压蒸汽锅放在电磁炉上，功率调制800w，加热至沸腾，待压力阀门开始喷气时开始计时，2min后关闭电源，自然冷却10min，然后用自来水冲高压蒸汽锅外壁10min快速冷却，将切片取出，用PBS缓冲液冲洗3次，每次3～5min；4.灭活内源性过氧化物酶活性：在切片上滴加1～2滴内源性过氧化物酶阻断剂3%H2O2（50～100μl），保证组织均被过氧化物阻断酶覆盖后将切片水平置于湿盒中，于室温下孵育10min后，将切片用PBS缓冲液冲洗3次，每次3～5min；5.封闭非特异性结合位点：在每张切片上滴加1～2滴（50～100μl）正常非免疫山羊血清，保证组织均被山羊血清覆盖后将切片平放于湿盒中，于室温下孵育20min，用滤纸擦去多余血清；6.滴加一抗（ɑ-SMA）：每张切片滴加1～2滴（50～100μl）配制好的ɑ-SMA抗体，使组织完全被ɑ-SMA抗体覆盖，然后平放于湿盒中，室温孵育1h，然后用PBS缓冲液水冲3次，每次3～5min；7.滴加二抗：每张切片滴加1～2滴（50～100μl）二抗试剂（快捷型酶标羊抗鼠IgG），确保组织被二抗完全覆盖后将切片水平置于湿盒中，室温孵育20min后用PBS缓冲液冲洗3次，每次3～5min；8.AP-Red显色剂显色：每张切片滴加1～2滴（50～100μl）新鲜配制的AP-Red显色剂，在奥林巴斯光学显微镜下观察显色情况，一般约20～30min，若显色不够可适当延长时间，待显色充分后及时终止，用PBS缓冲液冲洗3次，每次3～5min；9.滴加一抗（ERG）：每张切片滴加1～2滴（50～100μl）配制好的ERG，8 使组织完全被ERG试剂覆盖，然后平放于湿盒中，室温孵育1h，然后用PBS缓冲液水冲3次，每次3～5min；10.滴加二抗：每张切片滴加1～2滴（50～100μl）二抗试剂（快捷型酶标羊抗兔IgG），确保组织被二抗完全覆盖后将切片水平置于湿盒中，室温孵育20min后用PBS缓冲液冲洗3次，每次3～5min；11.DAB显色剂显色：每张切片滴加1～2滴（50～100μl）新鲜配制的DAB显色液，在奥林巴斯光学显微镜下观察显色情况，一般约3～5min，若显色不够可适当延长时间，待显色充分后及时终止，用自来水冲洗10～15min；12.苏木素复染：每张切片滴加1～2滴（50～100μl）苏木素染液，染色30s～1min，根据染色情况决定是否需要需要用分化液分化，若需要分化，则在盐酸酒精分化液中分化1～3s，然后用自来水冲10-15min；13.封片：在每张切片上滴加1～2滴（50～100μl）水性封片剂，使组织被均匀覆盖，水平置于60℃烤箱中烘烤15-20min后取出，待自然冷却后用中性树脂封片。2.5免疫组化鸡尾酒双染法（Connexin43、ɑ-SMA）染色步骤1.烤片：将储存在4℃冰箱的切片拿出，放置至常温后置于60℃烤箱中烘烤1h，直至组织内所含蜡完全溶解，将切片拿出放置至常温；2.脱蜡、水化切片：将切片分别放置在二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min脱蜡，然后再经无水乙醇Ⅰ5min、无水乙醇Ⅱ5min、95%酒精5min、85%酒精5min、75%酒精5min水化，然后将玻片用PBS缓冲液水冲3次，每次3～5min；3.抗原修复：根据一抗说明书的要求，对组织进行相应的抗原修复。在本研究中Connexin43与ɑ-SMA鸡尾酒双染采用柠檬酸钠修复液进行抗原修复，具体方法同前。4.灭活内源性过氧化物酶活性：在切片上滴加1～2滴内源性过氧化物酶阻断剂3%H2O2（50～100μl），保证组织均被过氧化物阻断酶覆盖后将切片水平置于湿盒中，于室温下孵育10min，然后将切片用PBS缓冲液冲洗3次，每次3～5min；5.封闭非特异性结合位点：在每张切片上滴加1～2滴（50～100μl）正常非免疫山羊血清，保证组织均被山羊血清覆盖后将切片平放于湿盒中，于室温下孵育20min，用滤纸擦去多余血清；9 6.滴加一抗：每张切片滴加1～2滴（50～100μl）配制好的Connexin43与ɑ-SMA鸡尾酒双染抗体，使组织完全被抗体覆盖，然后平放于湿盒中，于4℃冰箱内孵育12-14h；7.复温：将放置组织切片的湿盒从4℃冰箱内取出，在室温下放置1h，用PBS缓冲液冲洗3次，每次3～5min；8.滴加二抗：每张切片滴加1～2滴（50～100μl）新鲜配制的鸡尾酒双染二抗（快捷型酶标羊抗鼠IgG/快捷型酶标羊抗兔IgG），确保组织被鸡尾酒双染二抗完全覆盖后将切片水平置于湿盒中，室温孵育30min后先用PBS缓冲液冲洗3次，每次3～5min，再用蒸馏水冲洗3次，每次3～5min；9.AP-Red显色剂显色：每张切片滴加1～2滴（50～100μl）新鲜配制的AP-Red显色剂，在奥林巴斯光学显微镜下观察显色情况，一般约20～30min，若显色不够可适当延长时间，待显色充分后及时终止，用蒸馏水冲洗3次，每次3～5min；10.DAB显色剂显色：每张切片滴加1～2滴（50～100μl）新鲜配制的DAB显色液，在奥林巴斯光学显微镜下观察显色情况，一般约5～10min，若显色不够可适当延长时间，待显色充分后及时终止，用自来水冲洗10～15min；12.苏木素复染：每张切片滴加1～2滴（50～100μl）苏木素染液，染色30s～1min，根据染色情况决定是否需要需要用分化液分化，若需要分化，则在盐酸酒精分化液中分化1～3s，然后用自来水冲10-15min；13.封片：在每张切片上滴加1～2滴（50～100μl）水性封片剂，使组织被均匀覆盖，水平置于60℃烤箱中烘烤15-20min后取出，待自然冷却后用中性树脂封片。2.6结果判读标准1.Connexin43单染切片：光镜下，Connexin43在鳞状细胞及癌变区域间质中的CAFs中呈膜阳性表达[22]，Connexin43阳性信号呈棕黄色。若间质中出现Connexin43阳性表达的区域则记为CAFs阳性，否则记为CAFs阴性；若Connexin43阳性信号表达在鳞状细胞中则记为鳞状细胞阳性，否则记为鳞状细胞阴性，且本研究中Connexin43的阳性判断标准选取人睾丸组织内支持细胞及间质细胞的膜阳性表达为对照；2.ɑ-SMA与ERG双染切片：光镜下，ɑ-SMA表达于肿瘤间质中的CAFs[23]10 与血管平滑肌细胞胞质中，ERG表达于血管内皮细胞胞核中，ɑ-SMA阳性信号呈红色，ERG阳性信号呈棕黄色。在本研究中，若出现ɑ-SMA阳性信号和ERG阳性信号共表达的区域表明该结构为血管，出现只表达ɑ-SMA阳性信号的区域，表明其为CAFs，记为阳性，否则记为阴性，且本研究中ɑ-SMA的阳性判断标准选取血管平滑肌细胞胞浆中ɑ-SMA的阳性表达作为内对照；3.Connexin43与ɑ-SMA双染切片：光镜下，Connexin43在鳞状细胞及癌变区域间质中的CAFs中呈膜阳性表达，Connexin43阳性信号呈棕黄色，ɑ-SMA表达于肿瘤间质中的CAFs[23]与血管平滑肌细胞胞质中，ɑ-SMA阳性信号呈红色。若间质中出现Connexin43阳性或ɑ-SMA阳性（根据镜下结构特点排除血管后）或Connexin43与ɑ-SMA阳性信号共表达的区域表明该组织成分为CAFs，记为阳性，否则记为阴性。2.7随访以电话沟通的方式对OSESD及OSCCIS术后患者进行随访，随访截止时间2017年11月，观察记录患者在此期间疾病的进展情况。2.8统计学分析采用SPSS21.0统计软件进行数据分析，对CIOM、OSESD、OSCCIS、OSCCISM/OSCC四组间质内Connexin43、ɑ-SMA、CAFs的表达情况以及OSESD和OSCCIS患者的随访结果分别进行χ2检验，P＜0.05时认为差异有统计学意义。11 实验结果1HE染色结果常规HE染色后，在CIOM组织中，黏膜上皮层由数层鳞状细胞构成，细胞形态未见异常、排列有极性，未见明显的上皮增生，固有层中可见大量炎细胞浸润（图1A）；在OSESD组织中，上皮细胞结构紊乱，超过上皮的2/3，合并细胞非典型性变化（图1B）；在OSCCIS组织中，非典型增生的上皮细胞达到上皮全层，但未突破基底膜，细胞核异性明显，核深染，核分裂象易见，可见病理性核分裂象（图1C）；在OSCCISM组织中，非典型增生的上皮细胞突破基底膜向间质内浸润，浸润深度＜2mm（图1D）；在OSCC组织中，非典型增生的上皮突破基膜向深层浸润形成不规则条索形癌巢（图1E）。2Connexin43单染结果除外鳞状上皮区域,随着口腔黏膜鳞状上皮病变程度的增加，间质中的Connexin43阳性率逐步增加（表1），在CIOM组织中仅有1例的间质染色呈阳性（图2A），其余9例CIOM组织间质均呈阴性（图2B），大多数OSESD组织的间质呈Connexin43阴性（图2C），仅有数例OSESD组织呈阳性（图2D），在OSCCIS组织中，接近1/2的病例间质呈阳性（图2E、F）,大部分OSCCISM/OSCC组织的间质呈阳性（图2G、H），在CIOM、OSESD、OSCCIS、OSCCISM/OSCC组织间质中，Connexin43的阳性率分别为10.00%（1/10）、11.11%（6/54）、43.10%（25/58）、61.33%（46/75）。其中CIOM与OSESD组间的差异没有统计学意义（χ2=0.011，P>0.05）；CIOM与OSCCIS组间差异有统计学意义（χ2=3.985，P＜0.05）；CIOM与OSCCISM/OSCC组间差异显著（χ2=9.406，P＜0.01）；OSESD与OSCCIS组间差异显著（χ2=14.298，P<0.01）；OSESD与OSCCISM/OSCC组间差异显著（χ2=32.911，P<0.01）；OSCCIS与OSCCISM/OSCC组间差异有统计学意义（χ2=4.368，P＜0.05）（表2）。同时本研究发现，Connexin43在鳞状细胞中亦呈阳性表达（表1，图1），在四组中，其阳性率依次为90.00%（9/10）、87.04%（47/54）、89.66%（52/58）、92.00%（69/75），各组间差异均无统计学意义（表2）。12 3ɑ-SMA与ERG双染结果除外血管区域，随着口腔黏膜鳞状上皮病变程度的增加，间质中ɑ-SMA阳性率逐步增加（表1），在10例CIOM的组织中未发现中未发现ɑ-SMA单独表达的区域（图3A），而大多数OSESD组织中呈ɑ-SMA阴性（图3B、C），仅有数例OSESD组织间质呈阳性（图3D），小部分OSCCIS组织间质呈阳性（图3E）,大多数OSCCISM/OSCC组织间质呈阳性（图3F、G、H），且除外血管区域，在CIOM、OSESD、OSCCIS、OSCCISM/OSCC组织间质中ɑ-SMA阳性率依次为0.00%（0/10）、9.30%（5/54）、34.48%（20/58）、68.00%（51/75）。其中CIOM与OSESD组间的差异没有统计学意义（χ2=1.004，P>0.05）；CIOM与OSCCIS组间差异有统计学意义（χ2=4.885，P＜0.05）；CIOM与OSCCISM/OSCC组间差异显著（χ2=17.000，P＜0.01）；OSESD与OSCCIS组间差异显著（χ2=10.261，P<0.01）；OSESD与OSCCISM/OSCC组间差异显著（χ2=44.097，P<0.01）；OSCCIS与OSCCISM/OSCC组间差异显著（χ2=14.765，P＜0.01）（表2）。4Connexin43与ɑ-SMA双染结果因Connexin43及ɑ-SMA均为CAFs的免疫标记物，在间质中二者若其一显示为阳性即表明间质内存在CAFs，随着口腔黏膜鳞状上皮病变程度的增加，CAFs的阳性率也逐渐增高（表1），在10例CIOM组织中，有1例间质呈CAFs阳性（图4A），其余9例均为阴性（图4B）；在OSESD组织中，有数例间质呈CAFs阳性（图4C），其余均为阴性（4D）；在OSCCIS组织中，超过一半的组织间质呈CAFs阳性（图4E、F），其余为阴性；在OSCCISM/OSCC组织中，几乎所有的组织间质均呈CAFs阳性表达（图4G、H），CAFs在CIOM、OSESD、OSCCIS、OSCCISM/OSCC组织间质中的阳性率依次为10.00%（1/10）、16.67%（9/54）、55.17%（32/58）、85.33%（64/75）。其中CIOM与OSESD组间的差异没有统计学意义（χ2=0.284，P>0.05）；CIOM与OSCCIS组间差异有统计学意义（χ2=6.968，P＜0.05）；CIOM与OSCCISM/OSCC组间差异显著（χ2=27.830，P＜0.01）；OSESD与OSCCIS组间差异显著（χ2=17.867，P<0.01）；OSESD与OSCCISM/OSCC组间差异显著（χ2=60.260，P<0.01）；OSCCIS与OSCCISM/OSCC组间差异显著（χ2=14.817，P＜0.01）（表2）。13 5随访结果分别对OSESD及OSCCIS的患者进行电话随访。在54例OSESD患者中，失访6例，共随访到48例（表3），其中CAFs阳性9例，其中6例进展至OSCC，3例未复发；CAFs阴性39例，其中0例进展至OSCC，39例未复发。在OSESD患者中，CAFs阳性患者进展至OSCC的概率与CAFs阴性相比，两组之间的差异有统计学意义（χ2=29.714，P＜0.05）；在58例OSCCIS中，失访8例，共随访到50例（表3），其中CAFs阳性25例，其中24例进展至OSCC，1例未复发；CAFs阴性25例，其中5例进展至OSCC，20例未复发。在OSCCIS患者中，CAFs阳性患者进展至OSCC的概率与CAFs阴性相比，两组之间的差异有统计学意义该两组之间比较差异有统计学意义（χ2=29.636，P＜0.05）（表3）。14 表1Connexin43、ɑ-SMA在CIOM、OSESD、OSCCIS与OSCCISM/OSCC各组内的表达情况间质鳞状上皮组别nConnexin43+Connexin43-Connexin43+Connexin43-ɑ-SMA+ɑ-SMA-ɑ-SMA+ɑ-SMA-CIOM10010991OSESD5424345477OSCCIS581312726526OSCCISM/OSCC7533131811696表2Connexin43、ɑ-SMA及CAFs在CIOM、OSESD、OSCCIS与OSCCISM/OSCC各组内阳性表达的比较组间χ2222a值P值χb值P值χc值P值χd值P值CIOM与OSESD0.0111.0000.0681.0001.0041.0000.2841.000CIOM与OSCCIS3.9850.0470.0011.0004.8850.0286.9680.014CIOM与OSCCISM/OSCC9.4060.0040.0471.00017.0000.00027.8300.000OSESD与OSCCIS14.2980.0000.1870.66610.2610.00117.8670.000OSESD与OSCCISM/OSCC32.9110.0000.8530.35644.0970.00060.2600.000OSCCIS与OSCCISM/OSCC4.3680.0370.2190.64014.7650.00014.8170.000a.Connexin43在间质内阳性；b.Connexin43在鳞状细胞内阳性；c.ɑ-SMA在间质内阳性；d.CAFs在间质内阳性表3CAFs在OSESD与OSCCIS中表达情况与预后的关系Connexin43+Connexin43-ɑ-SMA进展至OSCC未复发χ2值P值进展至OSCC未复发χ2值P值OSESDOSCCISOSESDOSCCISOSESDOSCCISOSESDOSCCIS+0723340129.714a0.00029.639b0.000-3812053920a.OSESD中间质CAFs+与CAFs-相比；b.OSCCIS中间质CAFs+与CAFs-相比15 图1：口腔鳞状上皮病变的HE染色结果（×100倍）（A：CIOM组织；B：OSESD组织；C：OSCCIS组织；D：OSCCISM组织；E：OSCC组织）16 图2：口腔鳞状上皮病变中Connexin43单染染色结果（×100倍）（A、B：CIOM组织；C、D：OSESD组织；E、F：OSCCIS组织；G：OSCCISM组织；H：OSCC组织）17 图3：口腔黏膜鳞状上皮病变中ɑ-SMA与ERG双染染色结果（×100倍）（A：CIOM组织；B、C、D：OSESD组织；E：OSCCIS组织；F、G：OSCCISM组织；H：OSCC组织）18 图4：口腔黏膜鳞状上皮病变中Connexin43与ɑ-SMA双染染色结果（×100倍）（A、B：CIOM组织；C、D：OSESD组织；E、F：OSCCIS组织；G：OSCCISM组织；H：OSCC组织）19 讨论OSCC是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，近十年来其发病率快速上升，已成为严重影响着人类的身心健康与生活质量的恶性疾病[1]。因为口腔部位的特殊性，大部分的OSCC诊断时已进展至晚期，5年生存率仅有53%[10-12]，为提高患者的预后及生活质量，需要我们尽可能的早期发现、早期诊断、早期治疗OSCC。目前很多研究者针对OSCC做了许多研究，都希望找到早期诊断OSCC的方法，有研究鳞状上皮病变过程的[4,11,36]，也有研究鳞状上皮病变过程中所引起的微环境变化的[13,14,16,37]。近年来，针对OSCC内的肿瘤微环境所做的研究也越来越多，其主要成分CAFs在OSCC的发生、进展、转移、侵袭、耐药及介导肿瘤免疫逃逸、耐受等方面发挥着重要作用，且其亦影响患者的预后[11,19-29]。因此，为了早期诊断OSCC，本研究从CAFs出发，利用CAFs的免疫组化指标Connexin43及ɑ-SMA观察CAFs在CIOM、OSESD、OSCCIS、OSCCISM/OSCC中的表达情况，评估CAFs在口腔鳞状细胞早期浸润癌的诊断中是否有应用价值，并进一步验证与前人的研究是否一致，同时利用免疫组织化学双染法为临床诊断疾病提供更方便、敏捷的辅助手段。1Connexin43及ɑ-SMA与口腔黏膜鳞状上皮病变程度的关系Connexin43及ɑ-SMA均为CAFs的免疫组化指标，二者所代表的CAFs与口腔黏膜鳞状上皮病变程度密切相关。本研究发现，CIOM与OSESD之间CAFs的表达没有统计学差异,这可能是与CIOM的例数较少影响了实验结果有关，也可能是部分OSESD中不典型增生的鳞状细胞未分泌相关因子或相关因子分泌不足，以致NOF未能活化为CAFs。而在OSESD、OSCCIS、OSCCISM/OSCC中，Connexin43及ɑ-SMA及CAFs阳性率均逐步升高，且3组间的表达率有统计学差异。在OSESD的大部分病例中，Connexin43单染、ɑ-SMA与ERG双染显示为阴性，Connexin43及ɑ-SMA双染亦为阴性，这表明在OSESD中较少存在CAFs，这可能与固有层中的相关间质细胞以及未达到癌变性质的鳞状细胞尚未能分泌足够的因子来促使间质中的NOF转化为CAFs有关，而在OSCCIS、OSCCISM/OSCC中，可见到间质呈Connexin43及ɑ-SMA阳性表达，且其比例20 明显逐步升高，这应与口腔黏膜鳞状上皮病变已进展至癌有关，无论是原位癌还是浸润癌，在肿瘤的微环境中，口腔黏膜内的NOF已被癌细胞及间质细胞所分泌的相关活化因子激活为CAFs，且OSCCISM/OSCC与OSCCIS相比，CAFs的阳性率明显更高，这表明在OSCCISM/OSCC中CAFs更易形成。Connexin43单染、ɑ-SMA与ERG双染以及Connexin43与ɑ-SMA双染中CAFs阳性结果的一致性进一步验证了CAFs在口腔黏膜鳞状上皮的病变过程中发挥着重要作用，本研究同时发现Connexin43亦会在鳞状细胞中表达，然各组间差异均无统计学意义，这表明Connexin43在鳞状细胞中的阳性表达可能对病变程度并无相关提示作用。2Connexin43及ɑ-SMA双染在口腔黏膜鳞状上皮病变中的应用及与疾病进展的关系根据Connexin43与ɑ-SMA的双染结果，本研究发现，在CIOM、OSESD、OSCCIS与OSCCISM/OSCC四组中，Connexin43及ɑ-SMA的表达具有一定的重合，即各组内均有部分组织间质呈Connexin43及ɑ-SMA双阳性，部分仅呈Connexin43或ɑ-SMA单阳性，部分呈Connexin43及ɑ-SMA双阴性表达，因Connexin43及ɑ-SMA均为CAFs的免疫组化指标[22,23]，二者若其一显示为阳性即证明间质内存在CAFs，对比Connexin43与ɑ-SMA双染结果与Connexin43单染、ɑ-SMA与ERG双染结果，我们发现，除外CIOM，OSESD、OSCCIS与OSCCISM/OSCC三组内CAFs的阳性率均有所提升，尤其是OSCCIS与OSCCISM/OSCC的阳性率提升明显。同时回顾相关文献我们发现，在肿瘤微环境中，因CAFs的分化来源不同，CAFs会有不同的亚型，而这些亚型又会表现出不同的免疫表型，因而CAFs也就有了很多的免疫标记物[30-35]，本研究所选取的Connexin43及ɑ-SMA蛋白可能为CAFs中某两种亚型的标记物，因而部分组织会呈现Connexin43或ɑ-SMA单阳性，Connexin43及ɑ-SMA双染能够将间质内表现这两种免疫指标的CAFs都标记出来，故Connexin43及ɑ-SMA二者的联合应用能提高间质中CAFs的检出率。这同时也对我们提示，若针对CAFs进行各种相关免疫指标的双染组合，甚至三染组合，将会进一步提高CAFs的检出率。因CAFs在口腔黏膜鳞状上皮病变中随病变程度的增加而表达升高，结合对OSESD及OSCCIS病人的随访，我们发现在间质中CAFs的阳性表达与疾病21 的进展密切相关，间质呈现CAFs阳性表达的病人进展至OSCC的概率明显高于间质呈CAFs阴性表达的病人，这表明间质呈CAFs阳性表达预示着病人更易进展至OSCC，这也与前人所研究得出的CAFs的增加预示着较差的预后相符合[27-29]，而CAFs的检出这将有助于临床对这类病人进行合适的治疗并建议病人进行密切随诊，以期能够早期发现疾病的进展。3Connexin43及ɑ-SMA与OSCCISM的关系及在临床病理诊断中的应用价值由于口腔部位的特殊性，口腔黏膜鳞状上皮病变一旦进展至癌，这将给病人的生活质量以及生存预后带来重大的影响，因此病变的早期诊断显得尤为重要，在临床病理诊断中，仅通过组织学形态来诊断判断OSCCIS是否有浸润有时十分困难，此时免疫组化染色是重要的区分方法。在本研究中的75例OSCCISM及OSCC中，前者间质中CAFs的阳性率与后者无统计学差异，故在分组时将二者放在一起，这进一步证实OSCCISM与OSCC的间质本质相同，再次判读切片，可发现在OSCCISM的病例中，微浸润癌周边的间质可明显观察到包绕其排列的CAFs（图3F，图2、3、4G），结合Connexin43及ɑ-SMA在口腔黏膜鳞状上皮病变中的阳性表达预示着疾病的高进展至癌的可能，我们推测在一些难以判断OSCCIS局部是否有浸润的病例中，行Connexin43或ɑ-SMA或Connexin43与ɑ-SMA双染等免疫组化染色，若间质中出现CAFs的阳性表达，则表明可疑浸润的癌组织极有可能是真正的癌组织，同时应提醒临床对这类病人采取相应的治疗措施。Connexin43单染能标记出病变区域间质的CAFs，ɑ-SMA与ERG双染能够使病变间质中的CAFs观察更清楚直观，Connexin43与ɑ-SMA双染能提高CAFs的检出率，对于一些难以判断原位癌局部是否有浸润的区域有一定的提示作用，且能够帮助临床对这类病人提起高度警惕，以期能够早期发现病变的进展，对病人进行早期治疗，提高病人的生存率以及生活质量，因此利用在口腔黏膜鳞状上皮病变过程中间质内所产生的CAFs而进行的Connexin43免疫组化单染法、ɑ-SMA与ERG免疫组化双染法以及Connexin43与ɑ-SMA免疫组化双染法在口腔黏膜鳞状上皮病变以及鳞状细胞早期浸润癌的诊断中有一定的应用价值。22 结论本研究验证了Connexin43及ɑ-SMA所代表的CAFs在口腔黏膜鳞状上皮不同病变程度中的表达有明显差异，CAFs的阳性率随口腔黏膜鳞状上皮病变程度的增加而升高；CAFs的表达对一些患者的预后具有提示作用,CAFs的增加是不良的预后指标，提示肿瘤进展的几率增加；在判断OSCCIS局部是否有浸润时，若可疑浸润癌周边的间质呈CAFs阳性表达，则更支持浸润癌的诊断，因此CAFs因子Connexin43及ɑ-SMA对口腔鳞状上皮病变及鳞状细胞癌早期浸润的诊断具有一定的价值。23 参考文献[1]吴蒙,孙玉满,杨俊泉等.口腔鳞状细胞癌组织中HPV感染及EGFR、Sox2蛋白表达与肿瘤预后的相关性[J].临床与实验病理学杂志,2016,32(7):749-752.[2]JemalA，SiegelR，XuJ，etal.Cancerstatistics[J].CACancerJClin，2010，60:277-300.[3]RiveraC,VenegasB.Histologicalandmolecularaspectsoforalsquamouscellcarcinoma(Review)[J].OncolLett,2014,8(1):7-11.[4]CostaLC,LeiteCF,CardosoSV,etal.Expressionofepithelial-mesenchymaltransitionmarkersattheinvasivefrontoforalsquamouscellcarcinoma[J].JApplOralSci,2015,23(2):169-178.[5]赵福运,章魁华,马大权等.570例口腔鳞状细胞癌治疗经验[J].中华口腔医学杂志,1990,25(2):92-94.[6]MyersJN,ElkinsT,RobertsD,etal.Squamouscellcarcinomaofthetongueinyoungadults:increasingincidenceandfactorsthatpredicttreatmentoutcomes[J].OtolaryngolHeadNeckSurg.2000Jan;122(1):44-51.[7]IldaPR,FranciscoM,FranciscoC,etal.Geneticgainsandlossesinoralsquamouscellcarcinoma:impactonclinicalmanagement[J].Cellularoncology(Dordrecht),2014,37(1):29-39.[8]NakaokaT,OtaA,OnoT,KarnanS,etal.Combinedarsenictrioxide-cisplatintreatmentenhancesapoptosisinoralsquamouscellcarcinomacells[J].CellOncol(Dordr).2014Apr;37(2):119-29.[9]Sato-KuwabaraY,FregnaniJH,JampietroJ,etal.Comparativeanalysisofbasaloidandconventionalsquamouscellcarcinomasoftheesophagus:prognosticrelevanceofclinicopathologicalfeaturesandproteinexpression[J].TumourBiol.2016,37(5):6691-9.[10]WangsaD,RyottM,Avall-LundqvistE,etal.Ki-67expressionpredictslocoregionalrecurrenceinstageIoraltonguecarcinoma[J].BrJCancer,2008,99(7):1121-1128.[11]JungDW,CheZM,KimJ,etal.Tumor-stromalcrosstalkininvasionoforalsquamouscellcarcinoma:apivotalroleofCCL7[J].IntJCancer,2010,127(2):332-344.[12]ParkinDM,BrayF,FerlayJ,etal.Globalcancerstatistics,2002[J].CACancerJClin,2005,55(2):74-108.[13]SunY.Translationalhorizonsinthetumormicroenvironment:harnessingbreakthroughsandtargetingcures[J].Medicinalresearchreviews.2015,35(2):408–36.[14]CastellsM,ThibaultB,DelordJP,etal.Implicationoftumormicroenvironmentinchemoresistance:tumor-associatedstromalcellsprotecttumorcellsfromcelldeathJ].IntJMolSci.2012;13(8):9545–71.[15]CirilloN,HassonaY,CelentanoA,etal.Cancer-associatedfibroblastsregulatekeratinocytecell-celladhesionviaTGF-β-dependentpathwaysingenotype-specificoral24 cancer[J].Carcinogenesis,2017,38(1):76-85.[16]GandelliniP,AndrianiF,MerlinoG,etal.Complexityinthetumourmicroenvironment:Cancerassociatedfibroblastgeneexpressionpatternsidentifybothcommonanduniquefeaturesoftumour-stromacrosstalkacrosscancertypes[J].SeminCancerBiol,2015,35:96-106.[17]DouradoRC,PortoLPA,LeitãoÁCGH,etal.ImmunohistochemicalCharacterizationofCancer-associatedFibroblastsinOralSquamousCellCarcinoma[J].ApplImmunohistochemMolMorphol,2017Sep29.doi:10.1097/PAI.0000000000000486.[Epubaheadofprint].[18]KayamoriK,KatsubeK,SakamotoK,etal.NOTCH3IsInducedinCancer-AssociatedFibroblastsandPromotesAngiogenesisinOralSquamousCellCarcinoma[J].PLoSONE,2016,11(4):e0154112.[19]SobralLM,BufalinoA,LopesMA,etal.MyofibroblastsinthestromaoforalcancerpromotetumorigenesisviasecretionofactivinA[J].OralOncol,2011,47(9):840-846.[20]HinsleyEE,KumarS,HunterKD,etal.Endothelin-1stimulatesoralfibroblaststopromoteoralcancerinvasion[J].LifeSci,2012,91(13-14):557-561.[21]TommeleinJ,VersetL,BoterbergT,etal.Cancer-associatedfibroblastsconnectmetastasis-promotingcommunicationincolorectalcancer[J].FrontOncol,2015,5:63.[22]EssaAA,YamazakiM,MaruyamaS,etal.Tumour-associatedmacrophagesarerecruitedanddifferentiatedintheneoplasticstromaoforalsquamouscellcarcinoma[J].Pathology,2016,48(3):219-227.[23]BagordakisE,Sawazaki-CaloneI,MacedoCC,etal.Secretomeprofilingoforalsquamouscellcarcinoma-associatedfibroblastsrevealsorganizationanddisassemblyofextracellularmatrixandcollagenmetabolicprocesssignatures[J].TumourBiol,2016,37(7):9045-9057.[24]KoontongkaewS.Thetumormicroenvironmentcontributiontodevelopment,growth,invasionandmetastasisofheadandnecksquamouscellcarcinomas[J].JCancer,2013,4(1):66-83.[25]De-AssisEM,PimentaLG,Costa-e-SilvaE,etal.Stromalmyofibroblastsinoralleukoplakiaandoralsquamouscellcarcinoma[J].MedOralPatolOralCirBucal,2012,17(5):e733-e738.[26]LiX,FanQ,LiJ,etal.MiR-124down-regulationiscriticalforcancerassociatedfibroblasts-enhancedtumorgrowthoforalcarcinoma[J].ExpCellRes,2017,351(1):100-108.[27]ThodeC,JørgensenTG,DabelsteenE,etal.Significanceofmyofibroblastsinoralsquamouscellcarcinoma[J].JOralPatholMed,2011,40(3):201-207.[28]DingL,ZhangZ,ShangD,etal.α-Smoothmuscleactin-positivemyofibroblasts,inassociationwithepithelial-mesenchymaltransitionandlymphogenesis,isacriticalprognosticparameterinpatientswithoraltonguesquamouscellcarcinoma[J].JOral25 PatholMed,2014,43(5):335-343.[29]DouradoMR,GuerraENS,SaloT,etal.Prognosticvalueoftheimmunohistochemicaldetectionofcancer-associatedfibroblastsinoralcancer:Asystematicreviewandmeta-analysis[J].JOralPatholMed,2017Aug7.doi:10.1111/jop.12623.[Epubaheadofprint][30]igaK，HaraM，NagasakiT，eta1．Cancer-associatedfibroblasts：theircharacteristicsandtheirrolesintumorgrowth[J]．Cancers(Basel)，2015，7(4)：2443-2458．[31]Hay,E.D.Anoverviewofepithelio–mesenchymaltransformation[J].ActaAnat.1995,154,8–20.[32]DirekzeNC,Hodivala-DilkeK,JefferyR,etal.Bonemarrowcontributiontotumor-associatedmyofibroblastsandfibroblasts[J].CancerRes.2004;64:8492–8495.[33]DirekzeNC,AlisonMR.Bonemarrowandtumourstroma:anintimaterelationship[J].HematolOncol.2006;24:189–195.[34]ZeisbergEM,TarnavskiO,ZeisbergM,etal.Endothelial-tomesenchymaltransitioncontributestocardiacfibrosis[J].NatMed.2007;13:952–961.[35]TanJ,BuacheE,ChenardMP,etal.Adipocyteisanon-trivial,dynamicpartnerofbreastcancercells[J].Int.J.Dev.Biol.2011;55:851–859.[36]WidlakP,MrukwaG,KalinowskaM,etal.Detectionofmolecularsignaturesoforalsquamouscellcarcinomaandnormalepithelium–applicationofanovelmethodologyforunsupervisedsegmentationofimagingmassspectrometrydata[J].Proteomics.2016Jun;16(11-12):1613-21.[37]EckertAW,WickenhauserC,SalinsPC,etal.Clinicalrelevanceofthetumormicroenvironmentandimmuneescapeoforalsquamouscellcarcinoma[J].JTranslMed.2016Apr5;14:85.26 综述肿瘤相关成纤维细胞在肿瘤中的研究进展白忻如综述吕新全审校肿瘤间质由很多细胞组成，如肿瘤相关成纤维细胞（carcinoma-associatedfibroblasts，CAFs）、血管内皮细胞、周细胞、巨噬细胞及其他免疫细胞等，这些细胞和它们所分泌产生的各种物质组成了一个适宜肿瘤生长、侵袭、转移并能产生耐药的微环境[1,2]。CAFs作为肿瘤微环境的主要成分，近年来也得到了大家的广泛关注，很多研究者也针对CAFs展开了很多实验研究及讨论，它能激活转化生长因子-β（Transforminggrowthfactorβ，TGF-β）以调控角质细胞间的黏附性[3]，亦可分泌其他广泛的细胞因子，例如生长因子、趋化因子、激素等[4-6]，使其在肿瘤的发生、进展、浸润、转移、耐药及肿瘤引起的炎症反应和免疫逃逸等方面都发挥着重要作用[7-15]，且CAFs的增加预示着较差的预后[16-18]。本文通过回顾近年来众多学者针对CAFs所做的研究来总结阐述CAFs的来源以及其在肿瘤发生、发展、血管生成、转移、耐药、治疗及预后等方面所产生的作用。1CAFs的分化来源CAFs是一种细长的呈梭形且有细胞突起的细胞，它是肿瘤中结缔组织的主要成分，免疫标记α-平滑肌激动蛋白（α-Smoothmuscleactin，α-SMA）阳性，有些类似于成纤维细胞，主要位于癌细胞的周边，但又不同于血管和炎症细胞[16,19]。自20世纪70年代以来，CAFs就得到了众多学者的广泛关注，大家对其也进行了很多研究，发现它有些类似于与伤口愈合有关的成纤维细胞[20-24]，但关于CAFs的分化来源，到目前为止尚未得到明确的阐述，主要是由以下的观点组成：①成纤维细胞：很多研究都认为肿瘤细胞能分泌相关因子，如氧诱导因子1α（Oxygen-induciblefactor1α，OIF-1α）和趋化因子C-X-C基序配体12（C–X–Cmotifligand12，CXCL12）等[25]使间质中固有的正常成纤维细胞活化为CAFs，27 使其获得较强的增殖、产生胶原蛋白、分泌细胞外基质调节因子及生长因子的能力[26,27]，以促进肿瘤的生长及进展。CAFs与正常成纤维细胞相比，具有更快的增殖力，尤其是在口腔肿瘤中[28]；②经上皮-间质转化的癌细胞：在上皮-间质转化过程中，上皮细胞相互之间失去了彼此的联系，并获得了间质细胞的一些特性[29]，同时经过上皮-间质转化的癌细胞拥有了侵袭及转移的能力。一些研究也从基因改变的层面分析了癌细胞与其周围的间质细胞（包括成纤维细胞），发现二者的基因改变具有相同的频率分布[30-33]，这表明癌细胞经上皮-间质转化过程变为了间质细胞（包括成纤维细胞），③骨髓间充质干细胞：有研究证明，来源于循环系统的骨髓间充质干细胞能够在肿瘤间质区域内定位和增殖[34]，且其有助于促结缔组织增生性反应中肌成纤维细胞和成纤维细胞的增殖以及肿瘤血管的生成[35]，这提示骨髓间充质干细胞可能为CAFs的来源之一；④经内皮-间质转化的内皮细胞：内皮细胞可根据局部微环境表现出不同的表型，据报道，TGF-β能诱导正在增殖的内皮细胞进行表型转化为成纤维细胞样细胞[36]。内皮-间质转化与间叶细胞中成纤维细胞特异性蛋白-1（fibroblast-specificprotein-1，FSP-1）的出现和CD31表达的下调相关[37]，表达FSP-1的CAFs约40%会同时表达内皮细胞的标记CD31[38]。⑤脂肪细胞：在癌细胞周围的间质中出现的脂肪细胞被认为是肿瘤相关脂肪细胞（cancerassociatedadipocytes，CAAs），有研究认为CAFs能从CAAs中被分离出来[39,40]。在以上这些观点中，最为大家所接受的就是CAFs主要由成纤维细胞经肿瘤间质内的相关因子活化而来，其次为癌细胞经上皮-间质转化而来。因目前尚未有关于CAFs明确的来源阐述，所以CAFs的来源还需要大家进行进一步的研究。2CAFs的免疫表型很多细胞都有属于自己的免疫标记物，随着免疫组织化学染色技术的飞速发展，免疫标记物的使用能够帮助我们检测出组织内所含有的相关细胞，CAFs也不例外。近年来，许多文献对CAFs的免疫标记物都进行了相关描述，CAFs因其分化来源的不同，具有了很多亚型，不同的亚型又具有不同的免疫表型，因而CAFs拥有很多的免疫标记物，如其会表达肌成纤维细胞的一些标记，如α-SMA、波形蛋白（Vimentin）等；有一些会表达内皮细胞的标记，如CD31。Orimo[41]等人总结认为成纤维细胞激活蛋白（Fibroblastactivationprotein，FAP）28 及α-SMA是CAFs比较常见的免疫表型。近年来，Kayamori[6]等人研究发现在口腔鳞状细胞癌中，约1/3的CAFs会表达NOTCH-3；而Ahmed[11]等人的研究发现，在口腔鳞状细胞癌中，Connexin43亦可作为CAFs的免疫标记物，其同时会在鳞状细胞中表达，表达方式均为膜阳性；Kartha[42]等人研究发现血小板源性生长因子受体-β（Platelet-derivedgrowthfactorreceptorβ，PDGFR-β），Ⅰ型胶原（collagenⅠ）、Ⅱ型胶原（collagenⅡ）、Ⅴ型胶原（collagenⅤ）都可以作为CAFs的潜在免疫标记物。其他的一些标记，如小窝蛋白-1（caveolin-1）[43]和层黏连蛋白（laminin）[44]会在CAFs中表达下调，而比较常见的免疫标记物α-SMA[45]、Vimentin[46]和FSP-1[47]的表达会上调。到目前为止，由于CAFs的分化来源尚未得到明确阐述，导致CAFs尚没有一种明确的免疫标记物，但是上述免疫标记物的使用能够帮助我们在肿瘤间质中将CAFs识别出来。3CAFs与肿瘤的关系3.1CAFs在肿瘤发生、发展中的作用许多研究都认为CAFs在肿瘤的发生以及癌细胞的增殖过程中都发挥着重要作用，在上皮细胞发生癌变之前，间质内的成纤维细胞就可能被激活转变为CAFs并分泌促癌因子来促进肿瘤的发生[48]。CAFs亦能够产生各种生长因子和细胞因子，例如肝细胞生长因子（Hepatocytegrowthfactor，HGF）、表皮生长因子（Epidermalgrowthfactor，EGF）、成纤维细胞生长因子（Fibroblastgrowthfactor，FGF）、Wnt家族、SDF-1（CXCL12）、FOXF1和白介素6（Interleukin6，IL-6）等来促进恶性肿瘤细胞的增殖[49,50,51]。近年来研究者对一些原发的胃癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤的研究证实CAFs支持肿瘤的生长和发展[52]。有研究者从乳腺癌、恶性黑色素瘤、家族性结肠息肉病、视网膜母细胞瘤、肾母细胞瘤的患者中分离出体内的CAFs并在体外进行培养，结果显示这些成纤维细胞具有较快的增殖率，同时CAFs的较快的增殖行为可能会增加癌症的发病率[53,54]。曾有研究者利用人类乳腺上皮细胞在小鼠的乳腺间质中构建了一个乳腺导管模型，结果发现在小鼠体内，成纤维细胞内的TGF-β和HGF的过表达会诱导人类乳腺上皮发生癌变[55]；还有研究发现肿瘤细胞可通过抑制P53蛋白在CAFs中的表达，使得卵巢癌细胞中的趋化因子白介素8（Interleukin8，IL-8）、29 生长调节致癌基因α（Growthregulationoncogeneα，GRO-α）、IL-6、白介素1β（Interleukin1β，IL-1β）和血管内皮生长因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）的表达和分泌增加，进而创造了一个促进肿瘤生长的炎性微环境[56]，虽然胰岛素样生长因子受体-7（Insulin-likegrowthfactorreceptor7，IGFBP-7）被大家公认为是抑制肿瘤发展的因子，但RuppC[57]等人的研究表明，在结肠癌中，CAFs内经TGF-β转化的IGFBP-7的表达是上调的，它可间接促进肿瘤进展。Lays与Kellermann[58,59]等人的实验也证明了在口腔鳞癌中，CAFs能够分泌多种生长因子来促进肿瘤的增殖及侵袭，它通过上调活化素A（ActivinA）的表达来促进口腔鳞癌的增殖，亦能促进癌细胞分泌基质金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinases，MMPs）并以此来促进口腔鳞癌的侵袭，因为这些产物与口腔鳞癌中引起基质金属蛋白酶-2（Matrixmetalloproteinases-2，MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（Matrixmetalloproteinases-2，MMP-2）活性的引物密切相关，MMPs不仅能直接作用于肿瘤细胞，促进肿瘤的侵袭和转移，而且还参与细胞外基质（Extracellularmatrix，ECM）降解后的重建，从而促进肿瘤细胞穿过细胞外屏障，渗透和逃逸[60]，这进一步证实了CAFs在肿瘤进展、侵袭的过程中发挥着重要作用。3.2CAFs在肿瘤血管生成中的作用肿瘤的生长和转移取决于其内部血管的生长，而肿瘤微环境助长了这种病态的血管生成过程。CAFs是如何调节血管发生的机制尚未完全清楚[61]。近年来也有一些关于CAFs是如何促进肿瘤间质内血管生成的研究。任春霞[62]等人的研究证明，在卵巢癌中，CAFs可以通过GRO-α蛋白激活NF-кB促使VEGF升高，而抑制血小板反应蛋白-1（Thrombospondin，TSP-1）降低，进而调节肿瘤组织的血管形成和肿瘤生长能力。半乳凝集素-1（Galectin-1）在CAFs中高表达，且与VEGF和CD31的表达呈正相关，在共培养时，Galectin-1能够增加人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移、管腔形成能力以及促进血管内皮生长因子受体-2（Vascularendothelialgrowthfactorreceptor2，VEGFR2）磷酸化，并提高VEGF在胃癌细胞中的表达[63]。在结直肠癌中，癌细胞能促进CAFs分泌IL-6，IL-6是一种多功能细胞因子，在调节炎症反应和免疫应答中起关键作用，但它也具有血管生成细胞因子的特性，通过RT-PCR和ELISA的方法可以证明IL-6可以使CAFs内的VEGFAmRNA和VEGFA蛋白的表达上调，而VEGF是很重要的30 血管生成因子，IL-6可以刺激CAFs产生前列腺素E2（ProstaglandinE2，PGE2）来调节VEGF的分泌，然后作用于血管内皮细胞以促进血管的生成[10]，且结直肠癌细胞与CAFs在共培养时，VEGF的合成明显增加。NagasakiT[64]等人的研究也表明，用CD63在经过重组IL-6治疗的肿瘤中进行显示标记，可发现血管和血管网的形成明显增加。Hellevik[65]等人从新鲜的肺癌患者肿瘤中分离出大量CAFs，将它们暴露于电子辐射，通过使用多重蛋白检测等实验技术发现，经过电子辐射的CAFs介导的血管反应出现抑制，并且显著降低了血管诱导因子如血管生成素（Angiopoietin）和SDF-1的表达，从而减弱了内皮细胞的迁移能力。以上这些研究都表明在肿瘤进展过程中，CAFs在肿瘤间质内血管的生成的过程中起着促进作用。3.3CAFs在肿瘤转移中的作用肿瘤的实质与间质之间的屏障可以阻碍肿瘤细胞的扩散和转移，但在恶性肿瘤形成的过程中，肿瘤细胞可以突破这个屏障向周边蔓延或通过血液向机体的其他地方定居，CAFs可引发上皮-间质转化的相关通路促进肿瘤细胞的转移[66]，还能为肿瘤进展和转移提供了一个营养丰富的微环境，许多研究都表明CAFs在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥着至关重要的作用，尤其是在结肠癌、前列腺癌以及基底细胞癌等肿瘤中[67-71]，miR-21的激活与CAFs的促进转移作用有关，且miR-21的高表达与乳腺癌淋巴结转移密切相关[72,73]。Duda[65]等人的研究证明CAFs与癌细胞在血液中一起流动，可促进转移灶内癌细胞的生存及扩散。Olaso[74]等人的研究表明，位于转移灶周边的CAFs能促进转移灶内的癌细胞快速增殖，其功能与原发灶周边的CAFs相同，都是促进肿瘤的生长。Cornil[75]等人的研究系统评价了CAFs对黑色素瘤细胞增殖的影响，并发现只有转移灶内的黑色素瘤细胞才会受其作用，这表明CAFs可能为转移灶内癌细胞的生长提供了一个良好的环境，以此来促进肿瘤转移灶的增殖。还有研究表明，在CAFs内FSP-1表达有缺陷的小鼠模型中，肿瘤的生长和转移明显减少[76]。Gandeuini[77]等人的实验发现在前列腺癌中miR-205的异常过表达可以抵消CAFs诱导的上皮-间质转化，并且它还可以通过减少炎细胞因子的分泌来阻断肿瘤细胞激活周围的成纤维细胞，从而抑制肿瘤细胞的产生及转移。YuRen[72]等人的研究发现被miR-21激活的CAFs能够促进肿瘤的转移，在小鼠肿瘤模型中利用miR-21的小分子抑制剂AC1MMYR2可以通过NF-кB/miR-21/VHL通路来重塑CAFs，小鼠31 肿瘤的生长及转移显著减少。以上这些研究都支持在肿瘤进展过程中CAFs对肿瘤的转移起着促进的作用。3.4CAFs在肿瘤免疫抑制、逃逸中的作用恶性肿瘤患者普遍表现出来的都是免疫抑制状态，大量证据表明，肿瘤间质的活化可以通过调节免疫发病机制来促进肿瘤的生长和进展[78]。肿瘤微环境被认为是由炎症细胞组成的一个动态系统，其本身并不是炎症，而是为肿瘤的生长提供了一个适宜的炎症背景，内含大量促炎因子[79]。在黑色素瘤、乳腺癌和结肠癌中，肿瘤微环境中的CAFs可以产生多种抑制因子作用于免疫细胞来参与肿瘤的免疫抑制及免疫逃逸过程，它还能通过招募TH17细胞并通过分泌受激活调节正常T细胞表达和分泌因子（regulateduponactivationnormalTcellexpressedandsecretedfactors,RANTES）和单核细胞趋化蛋白1（Monocytechemotacticprotein-1，MCP-1）来上调白介素17（Interleukin17，IL-17）的表达，产生促炎症细胞因子的环境，促进细胞之间的接触，参与肿瘤的免疫抑制过程[80,81]。Barnas[82]等人的研究表明，从非小细胞肺癌中分离出的CAFs能与T细胞相互作用，CAFs通过IL-6作用于肿瘤相关的T细胞，诱导并上调IL-17A和干扰素γ（INF-γ）的表达，当应用抗IL-6药物时，CAFs的作用被明显减弱。CAFs还能高表达PD-L1和PD-L2，PD-L1和PD-L2能够诱导免疫耐受，当肿瘤相关T细胞与CAFs共培养时，肿瘤相关T细胞的功能明显被抑制，当加入抗PD-L1药物时，肿瘤相关T细胞的功能获得重新恢复，这表明CAFs能够通过PD-L1/PD-1的通路调节肿瘤相关T细胞的功能[80]。另外很多研究发现，在肿瘤微环境中，CAFs能分泌一些可溶性因子来有效调节NK细胞的功能。Brown[83]等人的研究表明，在乳腺癌中，CAFs可作用于NK细胞使其不能产生有效的抗肿瘤反应，并能抑制NK细胞的细胞毒性。在转移性黑色素瘤中，CAFs通过分泌抑制NKp44和NKp30表达的PGE2来触发NK细胞的功能障碍，还可以抑制免疫细胞对恶性肿瘤细胞的消除作用，从而促进肿瘤细胞的生长和转移，更有趣的是NK细胞还能促进CAFs产生PGE2，二者的相互作用构成一个抑制循环[84]。LiT[85]等人研究也表明，肝脏内的CAFs也能通过分泌PGE2和吲哚胺-2,3-双加氧酶（Indoleamine-2,3-dioxygenase）来抑制NK细胞的活性并触发NK细胞的功能障碍，同时还能降低细胞毒性分子及细胞活化所需的表面标记的表达，减少相关因子的分泌以及杀伤肿瘤细胞的细胞毒性，这些综合作用造成肿瘤对32 免疫反应的无应答状态。还有研究发现，在结肠癌中的CAFs也能通过分泌PGE2来大幅度地抑制NK细胞的功能[86]，以上这些证据都提示在肿瘤微环境中，CAFs可分泌相关因子作用于肿瘤相关T细胞及NK细胞，从而介导肿瘤的免疫耐受，当然，CAFs亦可能分泌相关因子作用于其他的免疫细胞来介导肿瘤的免疫耐受，这需要进一步的研究证实。3.5CAFs在肿瘤耐药中的作用大量的数据表明肿瘤的耐药性是难以成功消除肿瘤细胞的一个主要障碍，癌细胞可以在初始接触药物后采用多种策略以利于生存，很多研究也都是从肿瘤细胞自身机制方面来揭示肿瘤的耐药性，如通过药物转运蛋白的过表达来降低细胞内的药物浓度，通过点突变或靶基因的过度表达来改变药物作用的靶点，或者提高修复DNA损伤的能力以及抗凋亡信号通路的激活等[87]，然而事实上，肿瘤的易感性与耐药性部分也取决于肿瘤细胞与其微环境之间的动态相互作用。CAFs是肿瘤微环境的主要组成成分，它能通过分泌各种生长因子、细胞因子和细胞外基质来调节相邻的癌细胞的行为[88,89,90]。越来越多的证据表明，CAFs介导的肿瘤耐药现象较为普遍。CAFs能够释放一些可溶性因子来降低胰腺癌的癌细胞对防化疗的敏感性[91]，它还可以分泌MMPs来保护颈部鳞状细胞癌细胞对西妥昔单抗产生耐药[92]，亦能上调BCL-XL的表达来保护PC3细胞免受索拉非尼诱导的细胞死亡[93]，这些证据都表明CAFs在肿瘤耐药中起着决定性的作用[94,95]。Lotti[96]等人的研究表明，CAFs能分泌IL-17A与肿瘤干细胞中的IL-17A受体相结合以上调NF-кB通路，以此来介导肿瘤干细胞的耐药。还有研究表明，碳酸酐酶IX（CAIX）能使肿瘤微环境发生酸化以促进癌细胞获得转移及耐药的能力[97,98]。在前列腺癌中，CAFs能表达CAIX使肿瘤微环境发生酸化来增强MMP-2和MMP-9的活性，还能使癌细胞发生上皮-间质转化[99]。LiXY[100]等人认为，CAFs让肿瘤细胞在发生上皮-间质转化的过程拥有了肿瘤干细胞的特性，因而获得了耐药的能力。因而，CAFs在肿瘤产生耐药性的过程中发挥着重要的作用。3.6CAFs与肿瘤的治疗近年来的研究都表明CAFs在肿瘤的发生、进展、转移、耐药等方面都起着至关重要的作用，CAFs可通过重组细胞外间质来增加其流体压力，从而阻碍药33 物输送，使化疗药物在肿瘤内集聚减少，导致了肿瘤治疗失败[101,102]。近年来，越来越多的人也把肿瘤治疗的研究方向放在了CAFs身上，试图通过调节CAFs来有效的治疗肿瘤，其中大多数的研究也都是从抑制CAFs的活化或者是干扰CAFs在阻碍抗肿瘤药物运输方面的功能方面来着手。LiuJ[103]及Olive[104]等人的研究表明抑制CAFs中比较常见的信号通路的的活化，如TGF-β、血管紧张素Ⅱ受体等，可促进CAFs及细胞外基质的减少，以此来提高抗肿瘤药物的运输，达到抑制肿瘤的生长及转移的目的。另一方面，将CAFs逆转为回非CAFs的状态或者是抑制CAFs诱导的促癌信号也是一个治疗方向。miRNAs能够通过抑制成百上千个基因的表达来调控许多细胞过程。在很多肿瘤中，CAFs中miRNAs的表达是失调的[105]，因此miRNAs是一个逆转CAFs表型的有趣靶点。使用抗miRNA来上调CAFs中miRNA的表达或用模仿的寡核苷酸来下调CAFs中miRNA的表达，可以诱导CAFs向非CAFs表型转变。Kuninty[106]的研究表明，胰腺癌病人的CAFs中miR-199a和miR-214的表达是上调的，抑制miR-199a和miR-214的表达可以导致CAFs的去分化、胰腺星形细胞的活化以及抑制肿瘤的旁分泌作用。Duluc[107]等人表明，用生长激素抑制剂类似物SOM230抑制CAFs中的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）通路可以降低CAFs介导的IL-6因子的分泌，减少肿瘤的耐药性并增强肿瘤对抗肿瘤药物的敏感性。因而通过抗miRNA来诱导CAFs表型的转变以及抑制CAFs诱导的促癌信号也是治疗肿瘤的好方法。另外，针对CAFs分泌的生长因子的受体及其下游通路所进行的靶向治疗也是治疗肿瘤的方法之一，目前也已经取得了一定的进展。例如应用mTOR抑制剂可克服乳腺癌内分泌治疗的耐药，提高乳腺内分泌治疗的疗效[108,109]。所以，目前以CAFs作为靶点来治疗肿瘤也逐渐成为研究热门。3.7CAFs与肿瘤的预后肿瘤的预后与很多因素有关，如肿瘤的大小、部位、手术方式、手术范围以及肿瘤是否有转移等，CAFs也与肿瘤的预后息息相关。近年来，关于CAFs与肿瘤预后关系的研究也越来越多。Ha[110]等人用五种免疫标记物FAP、SMA、FSP-1、PDGFRα及PDGFRβ来标记食管鳞状细胞癌中的CAFs，并分析了CAFs这些指标阳性表达与预后的关系，发现在食管鳞状细胞癌中，SMA阳性的CAFs与肿瘤的体积偏大、较晚的TNM分期、淋巴结转移及预后不良有关；FSP-1阳34 性的CAFs与低生存率密切相关。在对乳腺癌进行研究时，Sotgia[111]等人发现，对接收三苯氧胺治疗的乳腺癌患者来说，CAFs中caveolin-1基因的表达预示着其预后不良；Sloan[112]等人也证明在乳腺癌患者的间质中CAFs内caveolin-1的表达是疾病复发及转移较早、预后较差的独立预测因子。Schoppmann[113]等人的研究表明，若乳腺癌间质中CAFs表达平足蛋白，则表明这类乳腺癌具有高侵袭性。而在对肺癌的研究过程中，ZhaoQian[114]等人发现，在非小细胞肺癌的间质中CAFs内TNFSF13的过表达与不良预后密切相关；Ono[115]等人选取了142例Ⅰ期肺鳞状细胞癌患者，并对癌细胞及CAF进行相关免疫指标的标记，统计分析何种免疫指标可作为患者预后指标，结果发现E-钙黏蛋白（E-cad）的低表达、CAFs中podoplanin的高表达与较差的预后相关，且其可作为Ⅰ期肺鳞状细胞癌患者总生存期的独立预后因子。Shindo[116]等人亦研究了在胰腺癌患者中podoplanin的表达在判断预后中的应用价值，通过检测105例经手术切除的胰腺浸润性导管癌标本中podoplanin的水平，发现在肿瘤间质CAFs中podoplanin的表达与淋巴管浸润、血管侵犯、肿瘤直径≥3cm、组织学分级、国际抗癌联盟分类的T分期以及生存时间等有关。而且胰腺癌细胞株（PANC-1、SUIT-2）的迁移和侵袭能力与CAFs内podoplanin的表达有关，在二者共培养时，胰腺癌细胞株（PANC-1、SUIT-2）的迁移和侵袭能力增强，因此，CAFs中podoplanin的阳性表达也可作为判断胰腺癌患者预后不良的指标。所以，通过检查肿瘤中CAFs相关免疫组化指标的阳性表达可以对肿瘤的预后判断。4小结综上所述，经过近几十年来的研究，对CAFs及其对肿瘤相关作用机制研究的成果已经很丰富，但CAFs的起源尚未清楚，且其还未有一个明确的免疫组化指标，这还需要我们不断的努力探索求证。在肿瘤的发生、进展、血管生成、转移、耐药等方面CAFs起着促进作用，更多的机制也需要我们不断去发掘探索，以期能够找到将CAFs作为靶点来治疗肿瘤的新药物，另外CAFs还可以作为判断预后的指标。但是要在临床上广泛使用CAFs及其相关指标预测肿瘤疗效、判断患者预后，还有许多问题需要深入探讨，这是一个漫长的道路。35 参考文献[1]SunY.Translationalhorizonsinthetumormicroenvironment:harnessingbreakthroughsandtargetingcures.Medicinalresearchreviews,2015,35(2):408–36.[2]CastellsM,ThibaultB,DelordJP,etal.Implicationoftumormicroenvironmentinchemoresistance:tumor-associatedstromalcellsprotecttumorcellsfromcelldeath.IntJMolSci,2012,13(8):9545–71.[3]CirilloN,HassonaY,CelentanoA,etal.Cancer-associatedfibroblastsregulatekeratinocytecell-celladhesionviaTGF-β-dependentpathwaysingenotype-specificoralcancer[J].Carcinogenesis,2017,38(1):76-85.[4]GandelliniP,AndrianiF,MerlinoG,etal.Complexityinthetumourmicroenvironment:Cancerassociatedfibroblastgeneexpressionpatternsidentifybothcommonanduniquefeaturesoftumour-stromacrosstalkacrosscancertypes[J].SeminCancerBiol,2015,35:96-106.[5]DouradoRC,PortoLPA,LeitãoÁCGH,etal.ImmunohistochemicalCharacterizationofCancer-associatedFibroblastsinOralSquamousCellCarcinoma[J].ApplImmunohistochemMolMorphol,2017Sep29.doi:10.1097/PAI.0000000000000486.[Epubaheadofprint].[6]KayamoriK,KatsubeK,SakamotoK,etal.NOTCH3IsInducedinCancer-AssociatedFibroblastsandPromotesAngiogenesisinOralSquamousCellCarcinoma[J].PLoSONE,2016,11(4):e0154112.[7]JungDW,CheZM,KimJ,etal.Tumor-stromalcrosstalkininvasionoforalsquamouscellcarcinoma:apivotalroleofCCL7[J].IntJCancer,2010,127(2):332-344.[8]SobralLM,BufalinoA,LopesMA,etal.MyofibroblastsinthestromaoforalcancerpromotetumorigenesisviasecretionofactivinA[J].OralOncol,2011,47(9):840-846.[9]HinsleyEE,KumarS,HunterKD,etal.Endothelin-1stimulatesoralfibroblaststopromoteoralcancerinvasion[J].LifeSci,2012,91(13-14):557-561.[10]TommeleinJ,VersetL,BoterbergT,etal.Cancer-associatedfibroblastsconnectmetastasis-promotingcommunicationincolorectalcancer[J].FrontOncol,2015,5:63.[11]EssaAA,YamazakiM,MaruyamaS,etal.Tumour-associatedmacrophagesarerecruitedanddifferentiatedintheneoplasticstromaoforalsquamouscellcarcinoma[J].Pathology,2016,48(3):219-227.[12]BagordakisE,Sawazaki-CaloneI,MacedoCC,etal.Secretomeprofilingoforalsquamouscellcarcinoma-associatedfibroblastsrevealsorganizationanddisassemblyofextracellularmatrixandcollagenmetabolicprocesssignatures[J].TumourBiol,2016,37(7):9045-9057.[13]KoontongkaewS.Thetumormicroenvironmentcontributiontodevelopment,growth,36 invasionandmetastasisofheadandnecksquamouscellcarcinomas[J].JCancer,2013,4(1):66-83.[14]De-AssisEM,PimentaLG,Costa-e-SilvaE,etal.Stromalmyofibroblastsinoralleukoplakiaandoralsquamouscellcarcinoma[J].MedOralPatolOralCirBucal,2012,17(5):e733-e738.[15]LiX,FanQ,LiJ,etal.MiR-124down-regulationiscriticalforcancerassociatedfibroblasts-enhancedtumorgrowthoforalcarcinoma[J].ExpCellRes,2017,351(1):100-108.[16]ThodeC,JørgensenTG,DabelsteenE,etal.Significanceofmyofibroblastsinoralsquamouscellcarcinoma[J].JOralPatholMed,2011,40(3):201-207.[17]DingL,ZhangZ,ShangD,etal.α-Smoothmuscleactin-positivemyofibroblasts,inassociationwithepithelial-mesenchymaltransitionandlymphogenesis,isacriticalprognosticparameterinpatientswithoraltonguesquamouscellcarcinoma[J].JOralPatholMed,2014,43(5):335-343.[18]DouradoMR,GuerraENS,SaloT,etal.Prognosticvalueoftheimmunohistochemicaldetectionofcancer-associatedfibroblastsinoralcancer:Asystematicreviewandmeta-analysis[J].JOralPatholMed,2017Aug7.doi:10.1111/jop.12623.[Epubaheadofprint][19]TarinD,CroftCB.Ultrastructuralfeaturesofwoundhealinginmouseskin[J].Anat.1969,105,189–190.[20]RyanGB,CliffWJ,GabbianiG,etal.Myofibroblastsinanavascularfibroustissue[J].Lab.Invest.1973,29,197–206.[21]RyanGB,WalterJC,GiulioG,etal.Myofibroblastsinhumangranulationtissue[J].Hum.Pathol.1974,5:55–67.[22]TsukadaT,McNuttMA,RossR,etal.HHF35,amuscleactin-specificmonoclonalantibody.II.Reactivityinnormal,reactive,andneoplastichumantissues[J].Am.J.Pathol.1987,127,389–402.[23]SchorSL,SchorAM,GreyAM,etal.Foetalandcancerpatientfibroblastsproduceanautocrinemigration-stimulatingfactornotmadebynormaladultcells[J].CellSci.1988,90,391–399.[24]DurningP,SchorSL,SellwoodRA,etal.Fibroblastsfrompatientswithbreastcancershowabnormalmigratorybehaviourinvitro[J].Lancet1984,2,890–892.[25]igaK,HaraM,NagasakiT,etal．Cancer-associatedfibroblasts：theircharacteristicsandtheirrolesintumorgrowth[J]．Cancers(Basel),2015,7(4)：2443-2458.[26]YosefBuganim,ShalomMadar,YoachRais,etal.TranscriptionalactivityofATF3inthestromalcompartmentoftumorspromotescancerprogression[J].Carcinogenesis,2011,32(12):1749–1757.[27]ShalomMadar,RanBrosh,YosefBuganim,etal.ModulatedexpressionofWFDC1duringcarcinogenesisandcellularsenescence[J].Carcinogenesis,2009,30(1):20–27.37 [28]LiuY,HuT,ShenJ,etal.Separation,cultivationandbiologicalcharacteristicsoforalcarcinoma-associatedfibroblasts[J].OralDiseases,2006,12:375–380.[29]HayED.Anoverviewofepithelio–mesenchymaltransformation[J].ActaAnat,1995,154,8–20.[30]KoichiFukino,LeiShen,SatoshiMatsumoto,etal.Combinedtotalgenomelossofheterozygosityscanofbreastcancerstromaandepitheliumrevealsmultiplicityofstromaltargets[J].CancerRes,2004,64:7231–7236.[31]HannaTuhkanen,MaaritAnttila,Veli-MattiKosma,etal.Geneticalterationsintheperitumoralstromalcellsofmalignantandborderlineepithelialovariantumorsasindicatedbyallelicimbalanceonchromosome3p[J].Int.J.Cancer,2004,109,247–252.[32]Ellsworth,DL,EllsworthRE,LoveB,etal.Genomicpatternsofallelicimbalanceindiseasefreetissueadjacenttoprimarybreastcarcinomas[J].BreastCancerRes.Treat,2004,88:131–139.[33]Kurose,K,GilleyK,MatsumotoS,etal.FrequentsomaticmutationsinPTENandTP53aremutuallyexclusiveinthestromaofbreastcarcinomas[J].NatureGenet,2002,32:355–357.[34]DirekzeNC,Hodivala-DilkeK,JefferyR,etal.Bonemarrowcontributiontotumor-associatedmyofibroblastsandfibroblasts[J].CancerRes,2004,64:8492–8495.[35]DirekzeNC,AlisonMR.Bonemarrowandtumourstroma:anintimaterelationship[J].HematolOncol.2006,24:189–195.[36]ZeisbergEM,TarnavskiO,ZeisbergM,etal.Endothelial-tomesenchymaltransitioncontributestocardiacfibrosis[J].NatMed.2007,13:952–961.[37]PotentaS,ZeisbergE,KalluriR,etal.Theroleofendothelial-to-mesenchymaltransitionincancerprogression[J].BrJCancer,2008,99:1375–1379.[38]ZeisbergEM,PotentaS,XieL,etal.Discoveryofendothelialtomesenchymaltransitionasasourceforcarcinoma-associatedfibroblasts[J].CancerRes,2007,67:10123–10128.[39]TanJ,BuacheE,ChenardMP,etal.Adipocyteisanon-trivial,dynamicpartnerofbreastcancercells[J].Int.J.Dev.Biol,2011,55:851–859.[40]MotrescuER,RioMC.Cancercells,adipocytesandmatrixmetalloproteinase11:AviCIOMustumorprogressioncycle[J].Biol.Chem,2008,389:1037–1041.[41]OrimoA,WeinbergRA.Heterogeneityofstromalfibroblastsintumors.CancerBiol.Ther.2007;6:618–619.[42]KarthaVK,StawskiL,HanR,etal.PDGFRβIsaNovelMarkerofStromalActivationinOralSquamousCellCarcinomas[J].PLoSONE,2016,11(4):e0154645.[43]MercierI,CasimiroMC,WangC,etal.Humanbreastcancer-associatedfibroblasts(CAFs)showcaveolin-1down-regulationandRBtumorsuppressorfunctionalinactivation:Implicationsfortheresponsetohormonaltherapy[J].CancerBiology&Therapy,2008,7:1212-1225[44]TlstyTD.Stromalcellscancontributeoncogenicsignals[J].SeminCancerBiol,38 2001,11:97-104.[45]MingzhuHuang,YuqingLi,HuanleZhang,etal.BreastcancerstromalfibroblastspromotethegenerationofCD44+CD24-cellsthroughSDF-1/CXCR4interaction[J].JournalofExperimental&ClinicalCancerResearch,2010,29,80.[46]YLiu,THu,JShen,etal,Separation,cultivationandbiologicalcharacteristicsoforalcarcinoma-associatedfibroblasts[J].ViewissueTOC,2006,12(4):375–380.[47]SugimotoH,MundelTM,KieranMW,etal.Identificationoffibroblastheterogeneityinthetumormicroenvironment[J].cancerBiol,2006,5:1640-1646.[48]LiottaLA,KohnEC.Themicroenvironmentofthetumour-hostinterface[J].Nature.2001,411:375-379.[49]GiulianelliS,CerlianiJP,LambCA,etal.Carcinoma-associatedfibroblastsactivateprogesteronereceptorsandinducehormoneindependentmammarytumorgrowth:ArolefortheFGF-2/FGFR-2axis[J].IntJCancer.2008,123:2518-2531.[50]FuL,ZhangC,ZhangLY,etal.Wnt2secretedbytumourfibroblastspromotestumourprogressioninoesophagealcancerbyactivationoftheWnt/β-cateninsignallingpathway.Gut.2011,60:1635-1643.[51]SaitoRA,MickeP,PaulssonJ,etal.ForkheadboxF1regulatestumor-promotingpropertiesofcancer-associatedfibroblastsinlungcancer[J].CancerRes,2010,70:2644-2654.[52]BelloIO,VeredM,DayanD,etal.Cancer-associatedfibroblasts,aparameterofthetumormicroenvironment,overcomecarcinoma-associatedparametersintheprognosisofpatientswithmobiletonguecancer[J].OralOncol,2011,47:33–38.[53]KopelovichL.Geneticpredispositiontocancerinman:invitrostudies[J].Int.Rev.Cytol.77,63–88(1982).[54]SchorSL,HaggieJA,DurningP,etal.Occurrenceofafetalfibroblastphenotypeinfamilialbreastcancer[J].Int.J.Cancer,1986,37:831–836.[55]KuperwasserC,ChavarriaT,WuM,etal.Reconstructionoffunctionallynormalandmalignanthumanbreasttissuesinmice[J].Proc.NatlAcad.Sci.USA,2004,101:4966–4971.[56]SchauerIG,ZhangJ,XingZ,etal.Interleukin-1βpromotesovariantumorigenesisthroughaP53/NF-κB--mediatedinflammatoryresponseinstromalfibroblasts[J].Neoplasia.2013,15(4):409-20[57]RuppC,ScherzerM,RudischA,etal.IGFBP7,anoveltumorstromamarker,withgrowth-promotingeffectsincoloncancerthroughaparacrinetumor-stromainteraction[J].Oncogene,2014,34:815–25.[58]SobralLM,BufalinoA,LopesMA,etal.MyofibroblastsinthestromaoforalcancerpromotetumorigenesisviasecretionofactivinA[J].OralOncology,2011,47(9):840-6[59]KellermannMG,SobralLM,daSilvaSD,etal.Mutualparacrineeffectsoforalsquamouscellcarcinomacellsandnormaloralfibroblasts:inductionoffibroblastto39 myofibroblasttransdifferentiationandmodulationoftumorcellproliferation[J].OralOncol,2008,44(5):509–17.[60]HuangL,XuAM,LiuS，etal.Cancer-associatedfibroblastsindigestivetumors[J].WorldJGastroenterol,2014,20(47):17804-18.[61]赵菡,尚谦慧,马智菲等．癌相关成纤维细胞与肿瘤发生发展关系的研究进展[J].大连医科大学学报,2016,38（5）：487-491.[62]任春霞,徐娜,宋亚琴等．癌相关成纤维细胞通过GRO-α激活NF-кB核转位和VEGF表达促进卵巢癌的生长[J]．中国癌症杂志,2014,24（5）：321-328.[63]KazuyoshiShiga,MasayasuHara,TakayaNagasaki,etal.Cancer-AssociatedFibroblasts:TheirCharacteristicsandTheirRolesinTumorGrowth[J].Cancers(Basel).2015,7(4):2443–2458.[64]NagasakiT,HaraM,NakanishiH,etal.Interleukin-6releasedbycoloncancer-associatedfibroblastsiscriticalfortumourangiogenesis:anti-interleukin-6receptorantibodysuppressedangiogenesisandinhibitedtumour-stromainteraction[J].BrJCancer,2014,110:469–78.[65]DudaDG,DuyvermanAM,KohnoM,etal.Malignantcellsfacilitatelungmetastasisbybringingtheirownsoil[J].ProcNatlAcadSciUSA.2010,107(50):21677-82.[66]PrakashJ.Cancer-AssociatedFibroblasts:PerspectivesinCancerTherapy[J].TrendsCancer.2016,2(6):277-279.[67]FrancoOE,ShawAK,StrandDW,etal.Cancerassociatedfibroblastsincancerpathogenesis[J].SeminCellDevBiol2010,21(1):33–9[68]SeriniG,GabbianiG.Mechanismsofmyofibroblastactivityandphenotypicmodulation[J].ExpCellRes1999,250(2):273–83.[69]DeWeverO,DemetterP,MareelM,etal.Stromalmyofibroblastsaredriversofinvasivecancergrowth[J].IntJCancer2008,123(10):2229–38.[70]HillR,SongY,CardiffRD,etal.Selectiveevolutionofstromalmesenchymewithp53lossinresponsetoepithelialtumorigenesis[J].Cell,2005,123(6):1001–11.[71]MarshD,DickinsonS,NeillGW,etal.Alphavbeta6Integrinpromotestheinvasionofmorphoeicbasalcellcarcinomathroughstromalmodulation[J].CancerRes2008,68(9):3295–303.[72]YuRen，XuanZhou,XiaLiu,etal.ReprogrammingcarcinomaassociatedfibroblastsbyAC1MMYR2impedestumormetastasisandimproveschemotherapyefficacy[J].CancerLetters,2016,374(1)：96-106.[73]KawashiriS,TanakaA,NoguchiN,etal.Significanceofstromaldesmoplasiaandmyofibroblastappearanceattheinvasivefrontinsquamouscellcarcinomaoftheoralcavity[J].HeadNeck2009,31(10):1346–53.[74]OlasoE,SantistebanA,BidaurrazagaJ,etal.Tumor-dependentactivationofrodenthepaticstellatecellsduringexperimentalmelanomametastasis[J].Hepatology,1997,26:634–642.40 [75]CornilI,TheodorescuD,ManS,etal.Fibroblastcellinteractionswithhumanmelanomacellsaffecttumorcellgrowthasafunctionoftumorprogression[J].Proc.NatlAcad.Sci.USA,1991,88:6028–6032.[76]Grum-SchwensenB,KlingelhoferJ,BergCH,etal.SuppressionoftumordevelopmentandmetastasisformationinmicelackingtheS100A4(mts1)gene[J].CancerRes,2005,65:3772–3780.[77]GandelliniP,GiannoniE,CasamicheleA,etal.miR-205hindersthemalignantinterplaybetweenprostatecancercellsandassociatedfibroblasts[J].AntioxidRedoxSignal.2014,20(7):1045-59.[78]KuangDM,ZhaoQ,PengC,etal.ActivatedmonocytesinperitumoralstromaofhepatocellularcarcinomafosterimmuneprivilegeanddiseaseprogressionthroughPD-L1[J].JExpMed.2009,206:1327-1337.[79]KimS,TakahashiH,LinWW,etal.Carcinoma-producedfactorsactivatemyeloidcellsthroughTLR2tostimulatemetastasis[J].Nature.2009,457:102-106.[80]NazarethMR,BroderickL,Simpson-AbelsonMR,etal.Characterizationofhumanlungtumor-associatedfibroblastsandtheirabilitytomodulatetheactivationoftumor-associatedTcells[J].JImmunol.2007,178:5552-5562.[81]SuX,YeJ,HsuehEC,etal.TumormicroenvironmentsdirecttherecruitmentandexpansionofhumanTh17cells[J].JImmunol.2010;184:1630-1641.[82]BarnasJL,Simpson-AbelsonMR,BrooksSP,etal.ReciprocalfunctionalmodulationoftheactivationofTlymphocytesandfibroblastsderivedfromhumansolidtumors[J].JImmunol.2010,185:2681-2692.[83]BrownJR,DuBoisRN.COX-2:amoleculartargetforcolorectalcancerprevention[J].JClinOncol.2005,23:2840-2855.[84]BalsamoM,ScordamagliaF,PietraG,etal.Melanoma-associatedfibroblastsmodulateNKcellphenotypeandantitumorcytotoxicity[J].ProcNatlAcadSciUSA.2009,106:20847-20852.[85]LiT,YangY,HuaX,etal.Hepatocellularcarcinoma-associatedfibroblaststriggerNKcelldysfunctionviaPGE2andIDO[J].CancerLett.2012,318:154-161.[86]LiT,YiS,LiuW,etal.Colorectalcarcinoma-derivedfibroblastsmodulatenaturalkillercellphenotypeandantitumorcytotoxicity[J].MedOncol.2013,30:663.[87]HazlehurstLA,LandowskiTH,DaltonWS.Roleofthetumormicroenvironmentinmediatingdenovoresistancetodrugsandphysiologicalmediatorsofcelldeath[J].Oncogene,2003,22:7396-7402.[88]OrimoA,WeinbergRA.Stromalfibroblastsincancer:anoveltumor-promotingcelltype[J].CellCycle,2006,5:1597-1601.[89]WorthleyDL,GiraudAS,WangTC.Stromalfibroblastsindigestivecancer[J].CancerMicroenviron,2010,3:117-125.[90]GondaTA,VarroA,WangTC,etal.Molecularbiologyofcancer-associatedfibroblasts:41 canthesecellsbetargetedinanticancertherapy?[J].SeminCellDevBiol,2010,21:2-10.[91]HwangRF,MooreT,ArumugamT,etal.Cancer-associatedstromalfibroblastspromotepancreatictumorprogression[J].CancerRes,2008,68:918-926.[92]JohanssonAC,AnsellA,JerhammarF,etal.Cancer-associatedfibroblastsinducematrixmetalloproteinase-mediatedcetuximabresistanceinheadandnecksquamouscellcarcinomacells[J].MolCancerRes,2012,10:1158-1168.[93]KharazihaP,RodriguezP,LIQ,etal.Targetingofdistinctsignalingcascadesandcancer-associatedfibroblastsdefinetheefficacyofSorafenibagainstprostatecancercells[J].CellDeathDis,2012,3:e262.[94]CrawfordY,KasmanI,YUL,etal.PDGF-Cmediatestheangiogenicandtumorigenicpropertiesoffibroblastsassociatedwithtumorsrefractorytoanti-VEGFtreatment[J].CancerCell,2009,15:21-34.[95]PorterDC,FarmakiE,AltiliaS,etal.Cyclin-dependentkinase8mediateschemotherapy-inducedtumorpromotingparacrineactivities[J].ProcNatlAcadSciUSA,2012,109:13799-13804.[96]LottiF,JarrarAM,PaiRK,etal.Chemotherapyactivatescancer-associatedfibroblaststomaintaincolorectalcancer-initiatingcellsbyIL-17A[J].JExpMed,2013,210:2851-2872.[97]ŠVASTOVÁE,HULÍKOVÁA,RAFAJOVÁM,etal.Hypoxiaactivatesthecapacityoftumor-associatedcarbonicanhydraseIXtoacidifyextracellularpH[J].FEBSLett,2004,577:439-445.[98]SwietachP,HulikovaA,Vaughan-JonesRD,etal.NewinsightsintothephysiologicalroleofcarbonicanhydraseIXintumourpHregulation[J].Oncogene,2010,29:6509-6521.[99]FiaschiT,GiannoniE,TiaddeiML,etal.CarbonicanhydraseIXfromcancer-associatedfibroblastsdrivesepithelial-mesenchymaltransitioninprostatecarcinomacells[J].CellCycle,2013;12:1791-1801.[100]LiXY,HuSQ,XiaoL.Thecancer-associatedfibroblastsanddrugresistance[J].EurRevMedPharmacolSci,2015,19(11):2112-2119.[101]ÖhlundD,ElyadaE,TuvesonD,etal.Fibroblastheterogeneityinthecancerwound[J].J.Exp.Med,2014,211:1503–1523.[102]CirriP,ChiarugiP.Cancerassociatedfibroblasts:thedarksideofthecoin[J].Am.J.CancerRes,2011,1,482–49.[103]LiuJ,LiaoS,Diop-FrimpongB.etal.TGF-βblockadeimprovesthedistributionandefficacyoftherapeuticsinbreastcarcinomabynormalizingthetumorstroma[J].ProcNatlAcadSciUSA,2012,109(41):16618-23.[104]OliveKP,JacobetzMA,DavidsonCJ,etal.Inhibitionofhedgehogsignalingenhancesdeliveryofchemotherapyinamousemodelofpancreaticcancer[J].Science,2009,324:1457–1461.[105]KunintyPR,SchnittertJ,StormG,etal.MicroRNAtargetingtomodulatetumormicroenvironment[J].FrontOncol,2016,6:3.42 [106]KunintyPR,BojmarL,TjomslandV,etal.MicroRNA-199aand-214aspotentialtherapeutictargetsinpancreaticstellatecellsinpancreatictumor[J].Oncotarget,2016,7(13):16396-408.[107]DulucC,Moatassim-BillahS,Chalabi-DcharM,etal.PharmacologicaltargetingoftheproteinsynthesismTOR/4E-BP1pathwayincancer-associatedfibroblastsabrogatespancreatictumourchemoresistance[J].EMBOMolMed,2015,7(6):735-53.[108]BaselgaJ,CamponeM,PiccartM,etal.Everolimusinpostmenopausalhormone-receptor-positiveadvancedbreastcancer[J].NEnglJMed,2012,366(6):520-529[109]李开富,张晓耀,康骅.肿瘤相关成纤维细胞在乳腺癌内分泌治疗中作用的研究进展[J].中国普通外科杂志,2015,24(5):733–738.[110]SangYunHa,So-YoungYeo,Yan-hiuaXuan,etal.ThePrognosticSignificanceofCancer-AssociatedFibroblastsinEsophagealSquamousCellCarcinoma[J].PLoSOne,2014;9(6):e99955.[111]SotgiaF,DelGaldoF,CasimiroMC,etal.Caveolin-1-/-nullmammarystromalfbroblastssharecharacteristicswithhumanbreastcancer-associatedfbroblasts[J].AmJPathol,2009,174:746-761.[112]SloanEK,CioccaDR,PouliotN,etal.Stromalcellexpressionofcaveolin-1predictsoutcomeinbreastcancer[J].AmJPathol,2009,174:2035-2043.[113]SchoppmannSF,BerghoffA,DinhofC,etal.Podoplanin-expressingcancer-associatedfibroblastsareassociatedwithpoorprognosisininvasivebreastcancer[J].BreastCancerResTreat,2012,134:237-244.[114]ZhaoQian,CaiQingshan,JinChun,etal.HighExpressionofTNFSF13inTumorCellsandFibroblastsIsAssociatedWithPoorPrognosisinNon–SmallCellLungCancer[J].AmericanJournalofClinicalPathology,2014,141(2):226–233.[115]OnoS,IshiiG,NagaiK,etal.Podoplanin-positivecancerassociatedfibroblastscouldhaveprognosticvalueindependentofcancercellphenotypeinstageⅠlungsquamouscellcarcinoma：usefulnessofcombininganalysisofbothcancercellphenotypeandcancer-associatedfibroblastphenotype[J].Chest，2013，143(4)：963-970.[116]ShindoK,AishimaS,OhuchidaK,etal.Podoplaninexpressionincancer-associatedfibroblastsenhancestumorprogressionofinvasiveductalcarcinomaofthepancreas[J].MolCancer，2013，12(1)：168.43 个人简历基本信息白忻如，女，汉族。2010年9月至2015年7月就读于新乡医学院，临床医学专业。2015年9月至今，于郑州大学第一附属医院病理科攻读临床病理学专业硕士学位。在学期间发表的学术论文与研究成果[1]白忻如，程书亚，吴倩文，吕新全.口腔鳞状细胞病变中Connexin43及ɑ-SMA的表达及在鳞状细胞癌早期浸润诊断中的应用[J].临床与实验病理学杂志，2018,34(5):507-511.[2]Shu-YaCheng,KeShi,Xin-RuBai,Qian-WenWu,Xin-QuanLv.Double-stainingofE-cadherinandpodoplaninofferhelpinthepathologicaldiagnosisofindecisiveearly-invasiveoralsquamouscellcarcinoma[J].IntJClinExpPathol2018;11(1):38-47.44 致谢从2015年9月开始步入研究生生涯，至今即将三年，回首望，在这三年内我学到了很多，也收获了很多，在此，我要向教导我、帮助我的各位老师以及同窗好友说一句由衷的感谢，谢谢您们陪伴我度过这难忘的三年！首先感谢我的恩师吕新全教授，感谢您这三年来对我的辛勤培养，虽然我是一名专业型硕士，但是您不仅只重视我实践技能的培养，还教会我了我有关科研方面的知识。在科研上，避除填鸭式的教育，您更注重让我主动思考、发散思维来找到研究的重点并找到适合自己学习的方法，同时及时纠正我的错误，让我受益颇深。除了在学习上给予我帮助外，在日常中，您平易近人、和蔼可亲，关心学生的生活，在我们有困难的时候给予帮助，我为有您这样的老师而深感自豪，您将永远学习的榜样！其次，感谢郑州大学第一附属医院病理科的全体老师，在日常工作中，是你们教会了我如何处理标本、取材、切片、制片，在学习看片的道路上很多老师都给予了我很多帮助，为我解答疑惑，特别感谢李文才教授、李道明教授、李惠翔教授、李珊珊教授、陈壬寅教授、陈奎生教授、高冬玲老师、李晟磊老师、赵志华老师、马怡晖老师、刘宇琼老师、王冠男老师、张丹丹老师、高献争老师、韩静老师、严淑萍老师、李新强老师、李烨老师、庞霞老师、黄培老师、赵华莹老师、张敏老师、孙敏静老师，谢谢你们在我学习看片的途中及时给予我指引和帮助，让我在这三年来收获颇丰，具备成为一名合格的专业型病理医师所需的技能。再次，感谢我的同窗好友，高汉青、牛朝荣、白玄业、陈天东、程书亚、孙松、罗冬云、陈海瑞、刁长英、王晓慧、杨召阳、林姜鑫、赵宇轩，是你们陪伴了我走过这三年的时间，在学习中，是你们让我感受到支持，在生活中，我们就像一个大家庭，是你们让我感受到友情、温暖与爱，让这三年的学习时光不再枯燥，变得更加美好，谢谢你们的陪伴，让我们友谊长存。还要感谢我的师妹吴倩文、于运运、王青杰、黄清洁、牛丽华、谢艺琳，谢谢你们在我工作、学习及生活过程中给予的帮助，祝愿你们都能够学业有成，快乐成长！最后，感谢我的家人们，我的父母及我的姐姐，是你们的默默付出以及无言的支持让我在这三年来能够毫无后顾之忧的安心学习，是你们的温暖、支持与爱让我顺利走过这三年，谢谢你们！再次由衷的感谢所有教导我、指引我、陪伴我的各位老师、同窗好友、师妹们及家人，祝愿大家都能够工作顺利，生活愉快！45