猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

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分类号密级公开UDC单位代码10733甘肃农业大学专业硕士学位论文猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立ExpressionandPurificationofPorcineδCoronavirusNProteinandPreliminaryEstablishmentofIndirectELISAAssay刘岳指导教师姓名樊江峰副教授（甘肃农业大学动物医学院兰州730070）刘光亮研究员(兰州兽医研究所兰州730046)学位名称兽医硕士专业领域兽医学论文答辩日期2018年5月27日学位授予日期2018年6月答辩委员会主席马保华教授评阅人姚大伟副教授孙世琪研究员2018年5月 甘肃农业大学2018届硕士学位论文目录目录..................................................................I摘要..................................................................IVAbstract................................................................V第一章文献综述........................................................11.1冠状病毒的分类及猪δ冠状病毒的发现与由来............................................11.2猪δ冠状病毒的分子生物学特征...............................................................21.3猪δ冠状病毒的流行病学.........................................................................41.4猪δ冠状病毒的临床症状.........................................................................61.5猪δ冠状病毒的诊断方法与防控...............................................................81.6ELISA检测方法......................................................................................91.7研究的目的与意义.................................................................................10第二章PDCoV-N基因的克隆及其编码蛋白的原核表达与纯化..................11引言...................................................................112.1实验材料..............................................................................................112.1.1毒株及血清..................................................................................112.1.2主要试剂.....................................................................................112.1.3试剂盒........................................................................................122.1.4主要仪器和设备...........................................................................122.1.5蛋白纯化溶液的配制.....................................................................132.2实验方法..............................................................................................132.2.1PDCoV-N基因扩增.......................................................................132.2.2克隆载体rPDCoV-N的构建...........................................................152.2.3重组质粒rPDCoV-N在大肠杆菌中的表达.......................................172.2.4Westernblotting分析.....................................................................182.2.5PDCoV-N蛋白表达条件的优化......................................................182.2.6PDCoVN蛋白纯化.......................................................................18I 甘肃农业大学2018届硕士学位论文2.3.实验结果..............................................................................................202.3.1PDCoV-N基因扩增结果................................................................202.3.2rPDCoV-N重组表达载体的构建与鉴定...........................................202.3.3目的蛋白表达及Western-blot鉴定..................................................212.3.4目的蛋白表达条件的优化..............................................................222.3.5PDCoV-N蛋白纯化.......................................................................232.4讨论.....................................................................................................232.5小结.....................................................................................................24第三章PDCoV-N蛋白的间接ELISA检测方法的建立..........................25引言...................................................................253.1材料.....................................................................................................253.1.1试剂............................................................................................253.1.2溶液配制.....................................................................................253.1.3仪器............................................................................................263.2方法.....................................................................................................263.2.1包被抗原有效性验证.....................................................................263.2.2包被抗原蛋白浓度的测定..............................................................263.2.3间接ELISA方法的初步建立..........................................................263.3实验结果.........................................................293.3.1包被抗原的制备............................................................................293.3.2ELISA条件优化的结果.................................................................303.4讨论.....................................................................................................343.5小结.....................................................................................................35结论..................................................................36参考文献...............................................................37致谢..................................................................42个人简介...............................................................43导师简介...............................................................44原创性声明.............................................................44II 甘肃农业大学2018届硕士学位论文学位论文版权认定和使用授权书...........................................46III 甘肃农业大学2018届硕士学位论文摘要猪δ冠状病毒（PorcineDeltacoronavirus,PDCoV）是一种新发现的冠状病毒，主要引起仔猪腹泻，呕吐和脱水。PDCoV自2012年在中国香港首次报道以来在世界多国迅速扩散，给养猪业造成了巨大的经济损失。由于该病毒在近几年新发，尚无有效的疫苗及商品化的检测、诊断方法和试剂盒。本研究旨在利用表达纯化PDCoVN蛋白建立一种检测该病原抗体的间接ELISA检测方法，为临床上检测、诊断PDCoV感染提供有效的依据。为获得高纯度PDCoVN蛋白，本研究从PDCoVcDNA中利用PCR技术扩增获得N基因的核酸，目的片段经酶切处理后克隆至原核表达载体pET-30a（+）中，重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序验证后命名为rPDCoV-N。将重组质粒rPDCoV-N转化至BL21感受态细胞，经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE蛋白电泳分析及Western-blot鉴定。结果表明，目的蛋白在表达体系中被成功表达，其蛋白分子量大小为50.4KDa。此后，对IPTG诱导浓度、诱导温度及表达时间等进行优化，并采用镍柱亲和层析纯化目的蛋白。结果表明，本研究获得了大量高纯度PDCoVN蛋白，可用作本研究ELISA的包被抗原。采用纯化的重组N蛋白为包被抗原，PDCoV感染的阳性猪血清为一抗，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗猪IgG为二抗，建立了检测PDCoVN蛋白抗体的间接ELISA方法。此后，本研究从抗原包被浓度、包被温度、封闭液浓度及封闭时间、一抗稀释度及孵育时间、二抗稀释度及孵育时间、显色时间等方面对ELISA检测条件进行了优化，获得了如下最佳反应条件：抗原的最佳包被量为100ng/孔，抗原的最佳包被温度及时间为4℃、1h，最佳封闭物浓度、温度及时间分别为2.5%BSA、37℃、1h，一抗最佳稀释度为1:25，一抗最佳孵育时间为37℃1.5h，二抗最佳稀释浓度为1:5000，二抗的最佳孵育时间为1.5h，最佳显色时间为5min。由此可见，本研究已初步建立了基于PDCoV-N蛋白的间接ELISA抗体检测方法，为临床上对猪群PDCoV感染的监测和流行病学调查提供了技术保障。关键词：猪δ冠状病毒；克隆；纯化蛋白；间接ELISAIV 甘肃农业大学2018届硕士学位论文AbstractPorcineDeltacoronavirus(PDCoV)isanewlyemergedporcinecoronavirusthatcausesdiarrhea,vomitinganddehydrationinpiglets.SinceitwasfirstreportedinHongKong,Chinain2012,PDCoVhasrapidlyspreadthroughouttheworldandhascausedhugeeconomiclossesinthepigindustry.Thereisnoeffectivevaccineandtherearenocommerciallyavailabledetectionmethodsanddiagnostickitsbecauseitisanewlyemergedvirus.ThepurposeofthisstudywastousepurifiedPDCoVNproteintoestablishanindirectELISAassaytodetecttheantibodyofthepathogen,providinganeffectivemethodforclinicaldetectionanddiagnosisofPDCoVinfection.First,inordertoobtainhigh-purityofPDCoVNprotein,thenucleicacidsequenceofNproteinwasamplifiedfromthePDCoVcDNAbyPCRandthenclonedintotheprokaryoticexpressionvectorpET-30a(+)afterenzymedigestion.Therecombinantplasmidwasverifiedbyenzymedigestion,PCRidentificationandDNAsequencing,andnamedasrPDCoV-N.Lately,therecombinantplasmidrPDCoV-NwastransformedintoBL21competentcells.InducedbyIPTG,theexpressionofrecombinantproteinwasanalyzedbySDS-PAGEproteinelectrophoresisandWestern-blotassay.Theresultsshowedthatthetargetproteinwassuccessfullyexpressedanditssizewas50.4KDa.Then,theexpressionconditionsofrPDCoV-Nwereoptimizedandusedtoexpressthetargetprotein.TherecombinantNproteinofPDCoVwaspurifiedwithnickelcolumnaffinitychromatography.InordertoestablishanindirectELISAmethodfordetectingPDCoVNproteinantibody,purifiedrecombinantNproteinwasusedascoatingantigen,PDCoVinfectedpositivepigserumwasusedasprimaryantibody,andhorseradishperoxidase(HRP)labeledgoatanti-porcineIgGwasusedassecondaryantibodies.Aseriesofreactionconditions,forinstance,coatingantigenconcentration,coatingtemperature,blockingsolutionconcentrationandblockingtime,primaryantibodydilutionandincubationtime,secondaryantibodydilutionandincubationtime,anddevelopingtime,wereoptimized.Thefinaloptimalreactionconditionswerelistedasfollows.Theoptimalamountofcoatingantigenis100ng/well.Theoptimalantigencoatingtemperatureandtimedurationwas4°Cfor1h.Theoptimalconcentrationoftheblockingagent,temperature,andtimedurationwas2.5%BSAat37°Cfor1h,respectively.Forprimaryantibody,theoptimalreactionconditionswas1:25,1.5hincubationat37°C.Forbestresults,thesecondaryantibodywasoptimizedtoadilutionof1:5000,andincubatedatroomtemperatureat1.5h.Theoptimaldevelopingtimewas5minatroomtemperature.AlltheseresultsdemonstratedthatanindirectELISAassaybasedonPDCoV-Nproteinhasbeendevelopedinthisstudy,providingasolidandeffectivemethodfortheclinicaldetection,monitoringandepidemiologicalinvestigationofPDCoVinfectioninpigs.Keywords:porcineδcoronavirus;cloning;purifiedprotein;indirectELISAV 甘肃农业大学2018届硕士学位论文第一章文献综述1.1冠状病毒的分类及猪δ冠状病毒的发现与由来冠状病毒（Coronavirus）最早于1937年从鸡身上分离而来，国际病毒命名和分类委员会在1975年正式命名为冠状病毒科（Coronaviridae）[1]。根据其基因组结构、形态和基因表达情况将冠状病毒家族分为两个亚科，即隆病毒属和冠状病毒属[2]。其中，隆病毒属包括伯尔尼病毒、布里达病毒等；冠状病毒属包括小鼠肝炎病毒、犬冠状病毒、鸡传染性支气管炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒等。冠状病毒是冠状病毒科冠状病毒属有囊膜的单股正链RNA病毒[3,4]。最初，大部分文献都将该病毒根据其抗原性分为了3群，其中第1群和第2群为哺乳动物病毒，第3群为禽类病毒[5]。随着时间的推移以及越来越多的新型冠状病毒被发现，第四类冠状病毒被鉴定出来。由于非典型肺炎SARS-CoV病毒基因组序列与已有的三群冠状病毒的基因序列同源性都不高，所以该冠状病毒被认为是第4群冠状病毒[6]。2009年，国际病毒分类学委员会冠状病毒研究组在原先根据冠状病毒抗原性分类传统的3群冠状病毒的基础上，依据遗传学和血清学特性，分别将上述3群病毒替换为三种属，即α冠状病毒、β冠状病毒和γ冠状病毒[7]。α冠状病毒主要分为2个群，1群主要包括猫的肠道冠状病毒（FECV）、猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）、犬冠状病毒（CCoV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）；2群主要包括鼬全身冠状病毒（FRSCV）、水貂冠状病毒（MCOV）、鼬肠道冠状病毒（FRECV）、人类冠状病毒229E（HCoV-229E）、人类冠状病毒NL63（HCoV-NL63）、菊头蝙蝠冠状HKU2（RH-BatCoVHKU2）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）。β冠状病毒主要分为4个亚群（A、B、C和D），A群主要包括牛冠状病毒（BCoV）、猪凝血脑脊髓炎病毒（PHEV）、人冠状病毒HKU1（HCoV-HKU1）、人类冠状病毒OC43（HCoV-OC43）、鼠肝炎病毒（MHV）和马冠状病毒(ECoV)；B群主要包括菊头蝙蝠SARS冠状病毒HKU3（SARSr-Rh-1 甘肃农业大学2018届硕士学位论文BatCoVHKU3）和人SARS冠状病毒（SARS-CoV）；C群主要包括伏翼属冠状病毒HKU5（Pi-BatCoV-HKU5）和扁颅蝠属冠状病毒HKU4（Ty-BatCoV-HKU4）；D群主要包括果蝠属冠状病毒HKU9（Ro-BatCoV-HKU9）。γ冠状病毒属主要包括火鸡冠状病毒（TucoV）、白鲸冠状病毒（BWCoVSW1）和鸡传染性支气管炎病毒（IBV）。通常情况下，α和β冠状病毒属感染主要以哺乳动物为主，γ冠状病毒属主要以鸟类冠状病毒为主[8]。2007年，香港学者Dong等通过病毒宏基因组学方法在活动物市场上从亚洲豹猫和中国白鼬獾群中检测到一种新的冠状病毒，由于与其他的冠状病毒相比，该病毒的与其他冠状病毒的亲缘关系较远，随后命名了一个新的δ冠状病毒属[9]。δ冠状病毒属既包括哺乳动物冠状病毒，也含有鸟类冠状病毒[8]，δ冠状病毒主要包括麻雀冠状病毒（Sparrowcoronavirus,SPCoV）、文鸟冠状病毒（Muniacoronavirus,MunCoV）、鹅口疮冠状病毒（Thrushcoronavirus,ThCoV）、黑水鸡冠状病毒（Commonmoorhencoronavirus,CMCoV）、绣眼鸟冠状病毒（White-eyecoronavirus,WECoV）、亚洲豹猫冠状病毒（Asianleopardcatscoronavirus,ALCCoV）、中国白鼬獾冠状病毒（Chineseferretbadgercoronavirus,CFBVCoV）以及猪δ冠状病毒（Porcinedelatcoronavirus,PDCoV）等[9,10]。猪δ冠状病毒是中国香港Woo等学者在2012年进行大规模流行病学调查时通过全基因组测序发现该病毒，与δ冠状病毒属成员的亲缘关系在同一分支，由此可见，PDCoV被我国香港学者首次报道[11]。在2014年，该病毒在美国被成功分离，通过用该病毒感染进行动物实验，证明了PDCoV对仔猪的致病性较强[11]，随后该病在各个国家相继发生。1.2猪δ冠状病毒的分子生物学特征猪δ冠状病毒（PDCoV）属于冠状病毒科，δ冠状病毒属[12]的一种新型病原体，其病毒粒子结构与其他冠状病毒相似，呈典型的冠状病毒形态，电镜观察显示，PDCoV病毒粒子的直径约为120nm~180nm，具有囊膜、纤突，呈球形[13]（如图1-1A，1-1B）。主要引起猪的肠道疾病，其特征主要与猪流行性腹泻（PED）和传染性胃肠炎（TGE）水样腹泻相似。2 甘肃农业大学2018届硕士学位论文图1-1病毒粒子电镜图Fig.1-1ElectronmicrographsofPDCoVPDCoV是有囊膜单股正链RNA病毒，其基因组全长约为25.4kb[14]，编码15个成熟的非结构蛋白、4个结构蛋白和3个辅助蛋白[15,16]，具有5’端帽子、3’端Poly（A）尾巴结构，在已知冠状病毒中其基因组最小[16]。PDCoV的基因组主要包含5’非翻译区（UTR）、ORF1a、ORF1b、表面纤突蛋白（Spike,S）、囊膜蛋白（Envelope,E）、膜蛋白（Membrane,M）、非结构蛋白6（Nsp6）、核蛋白（Nucleocapsid,N）非结构蛋白7（Nsp7）和3’-UTR[17]。最近，也有文献报道在Nsp7中又新发现一个蛋白Nsp7a[18]（图1-2）。其中，ORF1a和ORF1b占编码两个重叠复制多聚蛋白的基因组的三分之二，编码两个病毒复制酶多聚蛋白pp1a和pplab[11]，它们被蛋白酶水解切割成15个成熟的非结构蛋白（Nsps），其中，主要是与病毒复制转录有关的蛋白酶包括Nsp3（木瓜蛋白酶，PLpro）、Nsp5（糜蛋白酶，3CLpro）、Nsp12（RNA依赖的RNA聚合酶，RdRp）、Nsp13（解旋酶，Hel）以及其它功能未知的蛋白。对于15个成熟的非结构蛋白，其中主要不包含Nsp1，与γ冠状病毒一相似，δ冠状病毒的第一个非结构蛋白是从Nsp2开始的。病毒3’端1/3的基因组编码4个结构蛋白，主要包括表面纤突蛋白（S）、囊膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）（如图1-3），其中S，E，M和N基因分别位于编码S，E，M和N蛋白的下游[19]。S糖蛋白主要包含结构域S1和S2，Sl区主要包含了病毒主要中和表位，S2结构域是S蛋白最保守的部分，稳定于膜上，通过形成成熟的蛋白来介导病毒和细胞膜间的融合，从而使S蛋白发挥与特异性宿主细胞受体结合的重要作用[20]。E蛋白和M蛋白主要与病毒包膜的形成和释放相关跨膜蛋白有关，E蛋白在病毒包膜粒子以及冠状病毒病毒样颗粒的形成起着重要的作用[21]。而病毒3 甘肃农业大学2018届硕士学位论文颗粒的装配与M蛋白的一级结构域是密不可分的[22]。N蛋白主要在病毒复制的初期产生，在病毒复制和发病机制中发挥重要的作用[23]。辅助蛋白NS6主要位于基因组中结构蛋白M和N之间[24]，在冠状病毒复制的早期阶段发挥作用，可以激活细胞自噬[25]。而NS7主要位于N基因内的另一ORF中，编码200个氨基酸[26]。预测的辅助蛋白质广泛分布于整个冠状病毒的基因组中并且具有物种特异性。先前有研究表明，冠状病毒中所含有的辅助蛋白虽然对于体外病毒复制是非必需的，但是冠状病毒中辅助蛋白的存在对于病毒的致病机制和体内的免疫调节相关联[27,28]。两个辅助基因即Nsp6和Nsp7分别位于N基因的上游和一段。Nsp7a由具有非规范转录调控序列的单独的亚基因组mRNA编码，但其作用并不清楚。图1-2PDCoV的基因组结构Fig.1-2ThegenomicstructureofPDCoV图1-3冠状病毒结构Fig.1-3CoronavirusStructure1.3猪δ冠状病毒的流行病学从2004年SARS爆发以来，通过对不同物种的研究，人们从中发现了许多新的冠状病毒，主要包括鸟类、哺乳类以及人类[29]。δ冠状病毒最早是在20074 甘肃农业大学2018届硕士学位论文年香港学者Dong等通过利用病毒宏基因组学的方法从活动物市场上的中国白鼬獾和野生亚洲豹猫直肠拭子中检测到新的冠状病毒[11]，由于其氨基酸的同源性与其它冠状病毒相比较低，所以认为该病毒是一种新的病毒。2009年，香港学者Woo等又鉴定了三种禽源的新型冠状病毒，通过序列比对及进化树分析显示亲缘关系比较近，因此推测在其它鸟类和哺乳动物体内可能也存在着这类新型的冠状病毒，只是未被发现[30]。2012年，在中国香港Woo等学者进行大规模流行病学调查时，从收集的猪直肠拭子样本中首次发现该病毒[9]，对其基因组进行了全基因组测序，发现该病毒与δ冠状病毒属的成员在同一分支，因此PDCoV被我国香港学者首次报道，但并未分离到该病毒，也未对其进行大规模的流行病学调查[11]，总之，PDCoV于2012年在香港首先确定。在2014年2月，该病在美国俄亥俄州暴发[31]，同时猪δ冠状病毒被首次成功分离，通过用该病毒进行动物实验，证明了PDCoV对仔猪的致病性较强，也因此成为了研究δ冠状病毒的良好模型。同年，我国的部分养猪场出现了一种以1月龄仔猪脱水、腹泻、部分呕吐等临床症状为特征的疾病，给养猪业造成了巨大的经济损失。由于其临床症状与猪轮状病毒(PRoV)、TGEV、PEDV感染极其相似，所以被误诊为PEDV、TGEV、PRoV或者是三者的混合感染，但是后来的研究证实，该病是由于是感染了新的δ冠状病毒引起。随后，PDCoV在北美，墨西哥，韩国，泰国，越南，老挝和中国部分省份（如图1-4）也相继被发现。图1-4PDCoV感染的世界地图用不同的颜色标注PDCoV感染的不同国家。Fig.1-4WorldmapofPDCoVinfectionDifferentcolorsmarkPDCoVinfectionindifferentcountries.在中国，该病毒也广泛存在（如图1-5）并不断被报道，在2012年在中国香港首次发现；而在2012年下半年在中国西部四川省收集的27份来自腹泻仔猪的粪便样本中检测到该病毒[32]。2015年，在黑龙江省通过使用rPDCoV-N-5 甘肃农业大学2018届硕士学位论文ELISA方法分析现场样品（n=319）表明11.59％的样品对抗PDCoV的抗体呈阳性。这些数据表明，PDCoV在我国东北黑龙江省的猪群中存在，但流行率较低[33]；为了研究中国南部PDCoV的流行情况，对中国南部的哺乳仔猪进行检测，整体发病率约为1.28％（5/390），发现所有PDCoV阳性样本均来自2015年。尽管检测率低，PDCoV出现在中国南部的每个省/地区。此外，PDCoVs的S和N基因序列的系统发育分析显示，目前中国南部的流行PDCoVs与其他中国株PDCoVs的关系比美国，韩国和泰国报道的更为密切[34]；在2016年一篇文章中提到，在广东省从哺乳仔猪和腹泻母猪获得252份粪便和肠道样本进行常见肠道病毒的调查，发现PDCoV的阳性率为21.8％[35]。在2017年，收集并检测了来自河北、河南、山东、广东和陕西省的56个粪便和肠样品，PDCoV检测呈阳性[36]。最近的一篇文章中提到，2016年7月至2017年5月间从我国青藏高原周围三个不同省份收集了189藏猪腹泻样本，采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法检测收集的样品中PDCoV的存在情况，结果显示藏猪中PDCoV的感染率为3.70％（7/189）[37]。尽管对于该病的研究最近取得了不少的进展，但对于主要猪生产运营的华南（包括海南省，广西自治区）的PDCoV流行病学和患病率研究相对较少，需要我们进一步研究。图1-5PDCoV感染中国的地图红色表示我国已有PDCoV感染的省份，浅色省区表示未感染或者未见报道。Fig.1-5PDCoVinfectioninChinamapTheredcolorinthefigureindicatesthattheprovincehasbeeninfectedwithPDCoV,andthelight-coloredpartindicatesthatitisnotinfectedorreported.1.4猪δ冠状病毒的临床症状6 甘肃农业大学2018届硕士学位论文在临床上PDCoV感染的临床症状与猪流行性腹泻（PED）和猪传染性胃肠炎（TGE）等的临床症状极相似[38]，难以区分，与后两者相比，PDCoV的临床症状略显轻微。许多研究表明，一半以上的猪冠状病毒（包括PDCoV）具有肠道致病性，主要是引起猪的急性水样腹泻、脱水和呕吐（如图1-6A，1-6B），导致全球养猪行业的巨大的经济损失[39]。PDCoV是猪的一种肠道疾病病原[40]。仔猪感染PDCoV后，会出现突发、严重、持续的水样腹泻，皮肤上会看到有明显的粪便沾染，在48h到72h会出现呕吐等现象；尽管发病猪出现水样腹泻、脱水和食欲下降等[41]，但其食欲并没有受到太大的影响，且体温正常，也没有出现任何呼吸道症状如咳嗽和流涕。仔猪一旦感染，会出现发病突然、传播迅速，一般持续腹泻3～4d，有的会因脱水死亡，其病死率大概在30%～40%，有时可高达100%[42]。因此，对于不同年龄段的猪来说，都是一个极大的威胁。B图1-6临床症状A:水样腹泻、脱水B:呕吐物、水样粪便Fig.1-6ClinicalsymptomsA:Waterydiarrhea,dehydrationB:Vomit,waterystoolPDCoV感染除了与PED和TGE类似的腹泻症状外，还可引起感染猪的肺炎[43]。其病理学变化特征在于肠壁薄而透明（近空肠至结肠）和肠腔内大量黄色液体积聚，胃内充满了凝乳（如图1-7A），其他内脏正常。与正常肠组织（图1-7C）相比，组织学病变包括急性弥漫性严重萎缩性肠炎以及盲肠和结肠中浅表上皮细胞的轻度空泡化（如图1-7B）[44]。在过去的研究中，有学者通过用PDCoV编码蛋白M、N、S的多肽来免疫家兔，并用免疫了的家兔的血清作为一抗，来建立PDCoV免疫组织化学（ICH）方法[11]，并且他们通过利用这种方法分析了PDCoV对猪不同组织的感染情况，结果表明PDCoV的阳性信号主要集中在回肠、空肠中端以及末端部分，这一结果说明病毒对回肠、空肠中端以及末端部分最为敏感。同时在美国也有类似的文献报道，在他们研究的PDCoV毒株OH-FD22[45]和OH-FD100，通过运用绒毛长度与隐窝平均空肠比值7 甘肃农业大学2018届硕士学位论文的变化发现PDCoV具有肠道致病性，并且能剧烈感染整个肠道。然而，感染的主要部位是在空肠和回肠[41,46]。以往的研究为PDCoV在动物机体的研究以及诊断方面奠定了基础。图1-7剖检及病理组织学变化A:肠壁变薄、透明和肠腔中大量黄色液体的积聚，肚子里充满了凝乳。其他内脏出现正常。B：急性弥漫性严重萎缩性肠炎以及浅表上皮细胞的轻度空泡化。C：正常肠组织。Fig.1-7NecropsyandhistopathologicalchangesA:Wallthinandtransparent，andaccumulationoflargeamountsofyellowfluidintheintestinallumen.Thestomachwasfilledwithcurdledmilk.Otherinternalorgansappearednormal.B：Histologiclesionsincludedacutediffuse,severeatrophicenteritisandmildvacuolationofsuperficialepithelialcells.C：Normalintestinaltissue.1.5猪δ冠状病毒的诊断方法与防控在临床上，PDCoV、TGEV和PEDV及其它的猪肠道冠状病毒感染疾病的临床症状极其相似并且经常存在混合感染。通过对猪采用视、触、叩、听、嗅的物理诊断方法，甚至采用一些器械进行辅助检查，对于相似临床症状的疾病依然很难鉴别。为了便于对猪的此类腹泻病毒鉴别诊断，通常情况下只有借助实验室检测手段加以鉴别诊断并确诊。目前，对于此类疫病，实验室诊断方法主要包括病原学诊断和血清学的诊断方法[47]。其中，病原学诊断方法主要包括逆转录-聚合酶链式反应、原位杂交技术、环等温扩增、电子显微镜技术、免疫荧光染色和免疫组织化学等[48]。血清学诊断方法主要包括病毒中和实验、琼脂扩散实验、间接免疫荧光技术以及酶联免疫吸附实验等[49]。在病原学诊断方法中，逆转录-聚合酶链式反应（Ploymerasechainrection,PCR）、荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）、巢式RT-PCR（nRT-PCR）以及多重PCR（DuplexPCR）方法等各种PCR的方法。其中对于PDCoV的诊断与检测来说，在病原学诊断方法中，目前主要PCR方面居多，主要是国内学者Song建立的巢式RT-PCR，通过该方法检测了采自江西省的356份样品[41]；Sinha[50]8 甘肃农业大学2018届硕士学位论文采用Real-timeRT-PCR的方法检测了采自美国猪场中的样品；Nagai,M[51].采用四重PCR来检测PDCoV。虽然PCR的方法在检测方面应用相对较多，特异性和敏感性较高，但是所需专用的仪器设备难以普及，特别是在条件有限的牧场。除此之外，有些学者在其它方面也对其进行过研究，Chen[52]等人建立了该病毒的免疫组化的方法，分析了PDCoV感染猪不同的组织之后，其最主要的病变在空肠的中末端及回肠部分；Jung[53]等通过利用原位杂交技术对该病毒的致病性进行过相关的研究；但这些方法并不能对该病进行快速方便的诊断[54]；Tang[55]等人建立了环等温扩增技术来检测PDCoV，虽然此项技术的操作简便，在实地环境可以使用，并且具有一步可以完成的优点，但是与ELISA相比较，在临床检测时对于临床样品的处理比较麻烦，需要操作人员会提取核酸，对于屠宰场等部分人员并不适用。在血清学诊断方法中，目前主要采用ELISA的检测方法。美国学者SevenLawson[56]等人建立了猪δ冠状病毒N蛋白的间接ELISA的检测方法，对大量的血清样品进行了检测。美国学者AnilThachil[57]等建立了猪δ冠状病毒S1蛋白的间接ELISA的检测方法，对2010年至2014年的血清样品进行了大量检测。在我国，Su[33]等人通过建立猪δ冠状病毒N蛋白的间接ELISA的检测方法，对黑龙江省的血清样品进行检测，发现在黑龙江的流行率较低。Luo[58]等人通过建立了猪δ冠状病毒M蛋白的间接ELISA的检测方法，对我国河北省的样品进行了检测，目前来看，在河北省的流行率也较低。虽然通过国内外研究来看该病在美国广泛流行，但从目前已有数据来看，该病在我国的流行率较低。但是，我们不能因此放松警惕，截至目前为止，还没有针对PDCoV有效的疫苗或诊断试剂，因此，需要我们进一步开发，从而监测和控制PDCoV在我国的流行趋势。1.6ELISA检测方法自从Engvall和Perlman（瑞典，1971）首次报道建立酶联免疫吸附实验（ELISA）以来[59-61]，由于酶联免疫吸附实验(ELISA)技术具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用。目前，酶联免疫吸附检测技术广泛应用于科研、检验检疫、疾病诊断、环境监测等领域。与血清学诊断方法相比，ELISA的操作方法简便，并且快速安9 甘肃农业大学2018届硕士学位论文全，同时价格低廉，可更好的适应于现场大规模样品的快速检测。而在病原学诊断方法当中，ELISA广泛应用于猪冠状病毒的抗体检测。在所有的ELISA检测方法中，通过上述对其优缺点的比较，以及在TGEV和PEDV的结构蛋白方面都有多种检测病毒的间接ELISA方法的建立，且已有检测PEDV的商品化试剂盒。但由于PDCoV是近年新发病毒，研究人员对其做的调查相对较少，并且市场上并没有与其有关的商品化试剂盒，因此，对于PDCoV-N蛋白建立一种间接ELISA的方法可以为PDCoV的诊断提供一种有用的工具。1.7研究的目的与意义本研究旨在通过利用表达纯化的PDCoV-N蛋白建立一种检测PDCoV抗体的间接ELISA检测方法，从而为调查PDCoV在我国的发病及流行状况提供一种可靠的血清学检测与诊断方法。10 甘肃农业大学2018届硕士学位论文第二章PDCoV-N基因的克隆及其编码蛋白的原核表达与纯化引言目前，PDCoV已在中国、美国、加拿大、和泰国等[62]国家流行，在我国也呈逐渐蔓延趋势。该病毒于2012年在中国香港由Woo等学者进行大规模流行病学调查时从收集的猪拭子样本中首次发现该病毒[9]。近年来，PDCoV已经对养猪业造成巨大的经济损失。然而由于PDCoV为新发病原，其研究尚不深入，同时缺乏有效的诊断和检测工具。因此，建立一种高效、可靠的检测PDCoV感染的方法迫在眉睫。PDCoV的N蛋白具有高度保守性，并且具有良好的反应性，是作为建立诊断方法的优质候选蛋白。因此，本实验采用原核表达系统表达PDCoV的N蛋白并经镍柱亲和层析纯化，为建立间接ELISA检测方法的提供良好的物质基础。2.1实验材料2.1.1毒株及血清本实验所用扩增PDCoVN基因源于PDCoVBN-23株，该毒株来自重庆市巴南区23号猪场腹泻样本，经实验室检测、分离、测序最终确定为PDCoV。优化条件所用的阳性血清样品来自定西西泰猪场发生大量腹泻的猪，经Western-blot验证为阳性。阴性血清来自6头健康未饮用母乳的新生仔猪。2.1.2主要试剂表2-1主要试剂Table2-1Mainreagents主要试剂试剂公司TRIzolTaKaRaPrimeSTAR、dNTPMixture、5ｘTaKaRaPrimerSTARBufferRecombinantRNasinInhibitorTaKaRa11 甘肃农业大学2018届硕士学位论文M-MLVRTM-MLV5×ReactionPROMEGABufferRandomPrimerTRANSTrans2KDNAMarkerTRANS6×LoadingBufferTRANSEBInvitrogenIPTGMDBioAmp+MDBioK+MDBioEcoRI、XholI、FlyCutBufferThermoFisher脱脂乳BD透析袋MD34SolarBioSDSVETEGImidazoleSolarBio蔗糖恒兴硫酸镍天津市光复科技发展有限公司蛋白MarkerInvitrogen2.1.3试剂盒表2-2实验所需试剂盒Table2-2Kitsrequiredfortheexperiment试剂盒公司胶回收试剂盒Invitrogen纯化试剂盒OMEGA提质粒试剂盒OMEGABCA蛋白定量分析试剂盒Pierce2.1.4主要仪器和设备表2-3实验所需仪器Table2-3Equipmentrequiredfortheexperiment仪器名称仪器公司12 甘肃农业大学2018届硕士学位论文PCR仪（580BR08262）BIO-RAD单人双面净化工作台（SW-CJ-1F）苏州净化设备有限公司常温离心机(5424)EppendorfAG电热恒温水浴锅（DK-8D）上海-恒科技有限公司全自动凝胶成像分析系统BIO-RAD稳压稳流型电泳仪（DYY-6C）北京市六一仪器厂旋涡混合器（QL-861）海门市其林贝尔仪器制造有限公司立式压力蒸汽灭菌器LDZM-40KCS上海申安医疗器械厂微波炉（P70D20NIP-G5(WO)）广东市微波炉生活电器制造有限公司蛋白电泳槽BIO-RAD2.1.5蛋白纯化溶液的配制8×BindingBuffer：4M氯化钠，160mMTris-HCl，40mM咪唑，PH=7.9；8×WashBuffer：4M氯化钠，480mMTris-HCl，160mM咪唑，PH=7.9；4×EluteBuffer：2M氯化钠，80mMTris-HCl，4M咪唑，PH=7.9；4×StripBuffer：2M氯化钠，400mMEDTA，80mMTris-HCl，PH=7.9；8×ChargeBuffer：400mM硫酸镍。2.2实验方法2.2.1PDCoV-N基因扩增2.2.1.1引物合成引物以GenBank上公布的PDCoV/Swine/Taiwan36的N基因（登录号KY586149.1）序列为参考序列，且根据pET-30a（+）克隆载体的特点，利用Primer5.0软件进行设计，由金唯智公司合成。扩增产物的片段大小为1044bp，并将其命名为PDCoV-N。引物序列为：上游引物：N-pET-30a-EcoRI-F:CCGGAATTCATGGCCGCACCAGTAGTC下游引物：N-pET-30a-XhoI-R:CCGCTCGAGACGCTGCTGATTCCTGCTT，在上、下游引物5端分别加入一个酶切位点（引物中下划线部分）EcoRI和XhoI，并加入4个保护性碱基。2.2.1.2病毒RNA的提取（1）取感染PDCoV的肠组织，在液氮中磨碎，分别用500μLPBS稀释，加入1mLTRIzol，充分匀浆。13 甘肃农业大学2018届硕士学位论文（2）将研磨好的组织匀浆转移到2mL的离心管中，上下颠倒混匀，室温静置10min。（3）12000rpm，4℃离心5min。（4）缓慢吸取上清液1mL，并移入新的1.5mL的离心管中（切勿吸取沉淀），放置室温，静置10min。（5）加氯仿200μL，同样颠倒混匀，静置10min，用12000rpm，4℃离心10min。（6）将上层透明的液体（内含RNA）吸出600μL左右移至一个新的离心管中，加等量的异丙醇，用两个反应板夹住颠倒混匀，静置10min，12000rpm，4℃离心10min。（7）弃掉上清，缓慢加入75％的冰乙醇1mL，12000rpm、4℃、离心10min。（8）弃掉上清，空离2min。（9）用10μL移液器将上清轻轻吸出打掉，晾干，加20μL的DEPC水，－20℃保存。2.2.1.3RT-PCR扩增PDCoVN基因根据M-MLVReverseTranscriptase反转录试剂盒说明：按照表2-4的反转录体系，先加模板、随机引物、水，70℃水浴5min，冰浴10min，再将剩余的试剂加入，37℃水浴两小时。表2-4反转录体系Table2-4ReverseTranscriptionSystem50μL的体系M-MLV5×ReactionBuffer10μLdNTP（10mM）4μLRNA酶抑制剂RecombinantRNasinInhibitor1μLM-MLVRT1μL随机引物2μL模板RNA3μLddH2O29μL按照表2-5配制PCR扩增体系：14 甘肃农业大学2018届硕士学位论文表2-5PCR体系Table2-5PCRSystem25μL的体系样品cDNA1μL上、下游引物各1μLdNTP2μLPrimeSTAR1μL5×PrimeSTARBuffer5μLddH2O14μL根据表2-6中的参数设置PCR反应的反应条件进行PCR扩增：表2-6PCR反应参数Table2-6PCRreactionparameters引物预变性变性退火延伸循环数延伸PDCoV-N95℃5min95℃30s58℃30s72℃60s3572℃10min设置35个循环，上述反应结束后取5μLPCR产物加入1μL的5×loadingBuffer混匀，用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶中含1g琼脂糖，100mL1×TAE，凝胶中含0.5μg/mL溴化乙锭，电泳缓冲液为1×TAE，电泳完毕后于紫外凝胶成像系统观察。对于片段大小鉴定合适的送到金唯智生物科技有限公司测序。2.2.2克隆载体rPDCoV-N的构建2.2.2.1胶回收在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳后，将目的条带按照大小切下，用TaKaRa凝胶回收试剂盒回收PCR产物：（1）首先打开55℃水浴锅备用，将切下的胶加入2mL的离心管里，在含有回收胶的离心管里加入500μL的BindingBuffer(XP2)。（2）在55℃水浴锅中溶解，将等量的吸附柱摆好，将离心管中溶解后的胶加入吸附柱，10000g离心1min。（3）加700μL的SPWWashBuffer(加100mL的酒精)，洗两次，10000g，离心1min。（4）弃掉废液，13000g，空离，2min（准备好热激水）。（5）将过滤上层的吸附柱放在1.5mL的离心管上，加30μL的灭菌双蒸水洗脱，静置2min，13000g，空离，2min。15 甘肃农业大学2018届硕士学位论文（6）去除离心管，测浓度，备用。2.2.2.2PCR产物与pET-30a（+）的连接表2-7连pET-30a（+）反应体系Table2-7LigationReactionSystem10μL的体系目的片段5.5μLpET-30a3μLT4连接酶0.5μLBuffer1μL按照上述体系加样，25℃，水浴30min。2.2.2.3连接产物的转化取连接产物10μL加入到DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，置于冰浴30min，用42℃水浴热激30s，立即置于冰上2min，加500μLLB培养基，在37℃摇床振荡培养1h，2500r，离心2min，弃掉部分上清，保留150μL左右，吹吸混匀，取全部的菌液匀涂布在含卡那霉素（100μg/mL）的固体LB培养基平板中，用玻璃棒均匀涂开，在37℃培养箱中放置，过夜培养。2.2.2.4重组质粒rPDCoV-N的提取挑取单个菌落于含卡那霉素（100μg/mL）的LB液体中37℃，振荡培养(8h~16h)。按照OMEGA公司的PlasmidMiniKitⅠ试剂盒说明：（1）将菌液装到2mL的离心管中，分3次离心，12000g，1min。（2）弃掉上清，加250μL的SollutionI，用漩涡振荡器剧烈振荡，使菌体充分悬浮。（3）再加250μLSollutionII，盖严管盖，轻轻颠倒混匀4~6次，静置小于2min。（4）再加350μLSollutionIII，盖严管盖，立即颠倒混匀6~8次，使之充分混合，离心，12000g，10min。（5）将上清倒入摆好的带有蓝色滤芯的吸附柱中，离心10000g，15s。（6）弃掉滤液，加HBCBuffer500μL，1000g，离心15s。（7）弃掉滤液，加700μL含无水乙醇WashBuffer，10000g，离心15s。（8）弃滤液，重复操作一次，13000g，空离2min。（9）将蓝色吸附柱放到1.5mL的离心管上，加30~50μL60℃左右的的热16 甘肃农业大学2018届硕士学位论文激水于蓝色吸附柱的滤芯上，静置2min，13000g，离心2min。（10）弃掉蓝色滤芯，4℃保存。2.2.2.5菌液PCR方法鉴定阳性克隆在20mL的摇菌瓶中加入5mL的LB/K+的培养基中，挑取单克隆于LB/K+的培养基中，37℃培养8小时，取1μL菌液作为模板进行菌液PCR。PDCoV-N片段在1000bp左右为阳性克隆。2.2.2.6重组质粒双酶切鉴定按照如表2-8体系加入之后，放入37℃水浴锅30min，若出现两条带，且有一条与目的条带大小一致的条带，则酶切鉴定成功。表2-8重组质粒双酶切鉴定体系Table2-8RecombinantPlasmidDoubleEnzymeIdentificationSystem10μL体系试剂体积EcoRI0.5μLXhoI0.5μLFlyCutBuffer1μLrPDCoV-N5μLH2O3μL2.2.3重组质粒rPDCoV-N在大肠杆菌中的表达将鉴定正确的重组质粒rPDCoV-N转化感受态细胞BL21，转化菌液涂布的含有50μg/mL卡那抗性的LB固体平板，于37℃培养箱内培养12h直至单菌落出现，而后通过IPTG诱导表达蛋白。鉴定是上清表达或者包涵体表达的效果最优：（1）挑取单菌落，加入到10mL含50μg/mLKan的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养至OD600nm约为0.4。（2）在培养物中加入IPTG至终浓度为500nM，37℃继续培养6h。（3）8000rpm/min离心10min。（4）弃上清，沉淀悬浮于400μLPBS中。（5）超声15min，超3s、停2s。（6）6000g，4℃，离心15min。17 甘肃农业大学2018届硕士学位论文（7）分别取上清和沉淀100μL，加入25μL5×SDSPAGELoadingBuffer，混匀后置于沸水中煮10min，进行SDS-PAGE。2.2.4Westernblotting分析（1）将SDS-PAGE蛋白条带转印到用甲醇固定好的PVDF膜上，用TBST洗3次，每次5min；（2）用5%的脱脂乳室温封闭2h，再用PBST洗膜3次，每次5min；（3）室温孵育His（鼠抗）标签的单抗（1∶5000稀释）2h，再用TBST洗膜4次，每次10min；（4）用HRP标记的二抗（羊抗鼠抗体），室温孵育孵育1h；再用TBST漂洗3次，每次5min；（5）用ECL显色液显色并用化学发光成像仪获取影像。2.2.5PDCoV-N蛋白表达条件的优化2.2.5.1优化诱导温度4瓶6ml菌液，IPTG终浓度为500nM，分别在20℃，25℃，30℃，37℃四个温度下诱导8h。2.2.5.2优化IPTG诱导浓度4瓶6ml菌液，IPTG诱导终浓度分别为100nM，300nM，500nM和700nM在25℃诱导8h。2.2.5.3优化诱导时间IPTG终浓度为500nM，分别在25℃下诱导4h，5h，6h，7h，8h，9h。2.2.6PDCoVN蛋白纯化（1）活化N蛋白菌液，进行大量摇菌（比例1:100）。37℃2h30min后加IPTG使终浓度为300nM，在20℃条件下开始诱导6h。（2）将菌液分装两瓶离心，8000rpm离心10min，将沉淀用50mLPBS重悬，分别在分装两个50mL离心管进行超声。（3）超声3s停3s，连续超声25min。（4）5000g离心15min，将上清和包涵体分离，上清可先放4℃或者-70℃冻存。包涵体视情况每管加3mL6M尿素PBS重悬，冰浴1h，分2mL离心管4℃离心16000g30min。（5）结合树脂18 甘肃农业大学2018届硕士学位论文将离心后的上清经0.45μm滤膜过滤，树脂处理。吸取2mL树脂于柱中，加6倍体积的1×BindingBuffer活化树脂。将过滤后样品吸取部分于柱中，与树脂吹打混匀移至50mL离心管中。放至滚轴混合器上，室温结合4h。（6）纯化1）将结合的树脂样品转移至镍柱中，1.5ml离心管接取原液；2）加10倍柱体积1×BindingBuffer，收样；3）加10倍柱体积1×WashBuffer，洗3次，收样；4）加10倍柱体积1×EluteBuffer，室温静置15min，收样；5）加10倍柱体积1×EluteBuffer，室温静置15min，收样；再生树脂1）加2倍柱体积1×StripBuffer，室温静置10min收样；2）用5倍体积去离子水清洗；3）用3倍体积2%SDS清洗；4）用1倍体积25%无水乙醇清洗；5）用1倍体积50%无水乙醇清洗；6）用1倍体积75%无水乙醇清洗；7）用5倍体积100%无水乙醇清洗；8）用1倍体积75%无水乙醇清洗；9）用1倍体积50%无水乙醇清洗；10）用1倍体积25%无水乙醇清洗；11）用1倍体积去离子水清洗；12）用5倍体积100mMEDTA,pH8.0溶液清洗；13）用10倍体积去离子水清洗；14）用5倍体积100mMNiSO4再生，静置30min，洗脱，加入20%无水乙醇4℃保存。(7)PDCoV-N蛋白浓缩并SDS-PAGE1）把透析袋剪成适当长度的一小段（10-20cm）；2）在含有2%(W/V)碳酸氢钠和1mmol/LEDTA(pH=8.0)的1L溶液中将透析袋煮沸10分钟；。3）用蒸馏水彻底清洗透析袋；19 甘肃农业大学2018届硕士学位论文4）放在1L的含有1mmol/LEDTA(pH=8.0)的溶液中将之煮沸10分钟；5）冷却后，取部分用，将剩余透析袋存放于4度，确保透析袋完全浸没在储存的溶液内。从此时起取用透析袋是必须戴手套；6）用前用水检验透析袋是否漏液，在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净；7）将纯化好的蛋白装入透析袋，两端用夹子夹好，在透析袋表层和底层铺一层蔗糖，4℃过夜浓缩；8）将浓缩好的PDCoV-N蛋白用10%的SDS-PAGE胶进行验证。2.3.实验结果2.3.1PDCoV-N基因扩增结果采用设计的上下游引物，以提取该病毒的RNA经反转录得到的cDNA为模板扩增PDCoV-N基因，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪下可见与预测大小相同、条带单一、清晰的目的条带，结果见图2-1。由此可见，本实验成功获得了PDCoV-N基因。2000bp1000bp目的条带图2-1PDCoV-N基因扩增结果Fig.2-1GeneamplificationofPDCoV-N2.3.2rPDCoV-N重组表达载体的构建与鉴定将所扩增获得的目的片段酶切后与同样处理的pET-30a(+)载体连接，连接产物转化至DH5感受态细胞，37℃培养过夜后，取1μL菌液作为模板采用载体PET-30a(+)通用引物进行菌液PCR鉴定，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪下可见与预测大小相同目的条带，结果见图2-2。提取阳性菌株质粒，将其用XhoI、EcoRI在37℃水浴锅中酶切30min，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶成像仪下可见与预测大小相同目的条带，结果见图2-3。由此可见，本实验成功获得了rPDCoV-N重组质粒。20 甘肃农业大学2018届硕士学位论文2000bp1000bp目的条带图2-2菌液PCR鉴定结果Fig.2-2IdentificationofbacterialliquidPCR2000bp1000bp图2-3双酶切鉴定结果Fig.2-3Identificationbyenzymedigestion2.3.3目的蛋白表达及Western-blot鉴定将阳性rPDCoV-N重组质粒转化至BL21表达菌株，IPTG诱导表达后超声破碎仪处理样品，然后将产物进行SDS-PAGE电泳，随后将蛋白条带转印到用甲醇固定好的PVDF膜上采用His单抗进行Western-blot分析。经化学发光检测结果表明，在50KDa处出现目的条带，且重组蛋白主要以可溶性表达为主（图2-4）。由此可见，重组rPDCoV-N质粒可成功诱导表达PDCoVN蛋白。图2-4Westernblotting鉴定结果Fig.2-4Westernblottingidentification21 甘肃农业大学2018届硕士学位论文2.3.4目的蛋白表达条件的优化重组质粒确定表达后，先后优化PDCoV-N蛋白诱导温度、IPTG诱导浓度、IPTG诱导时间。结果表明，在IPTG诱导浓度为300nM、诱导时间为8h条件下，PDCoV-N蛋白诱导温度在20℃蛋白表达量最高，见下图2-5；在20℃诱导8h条件下，最佳IPTG诱导浓度为300nM，见下图2-6；当采用300mMIPTG浓度在20℃条件诱导时，最佳诱导时间为6h，见下图2-7。图2-5PDCoV-N蛋白诱导温度Fig.2-5PDCoV-Nproteininductiontemperature图2-6IPTG诱导浓度Fig.2-6InducedconcentrationofIPTG22 甘肃农业大学2018届硕士学位论文图2-7IPTG诱导时间Fig.2-7InducedtimeofIPTG上述结果表明，本实验获得的PDCoV最优表达条件为20℃、300mMIPTG诱导6h。2.3.5PDCoV-N蛋白纯化采用上述最佳表达条件大量诱导表达PDCOVN蛋白，超声处理样品后，将上清过滤后采用镍柱亲和层析方法根据说明书操作，纯化重组目的蛋白，取7μL纯化产物进行SDS-PAGE分析，结果显示，纯化后的重组蛋白纯度较高（图2-8）。70KDa55KDa目的条带图2-8PDCoV-N蛋白纯化结果Fig.2-8ProteinpurificationofPDCoV-N2.4讨论PDCoV是近年来新发的一种病毒，于2012年首先报道从我国香港在2009年的收集的猪直肠拭子中鉴定出来，并且与健康的野生动物中鉴定的禽和亚洲豹δ冠状病毒有关[63]，可引起所有年龄段猪的肠道感染。与PEDV[21,64]相比，PDCoV在感染相关的流行病学、病毒发病机制和临床症状等方面仍缺乏详实数据。因此，自2014年2月在美国首次报告猪以来，PDCoV迅速扩散到美国的23 甘肃农业大学2018届硕士学位论文其他州以及加拿大，近年来，在中国和韩国的猪群中报道了PDCoV，并对养猪业造成重大经济损失。为了能建立检测PDCoV的检测方法，本研究构建了rPDCoV-N重组质粒，用感受态细胞BL21进行转化，挑菌扩大培养后验证其表达，继续对N蛋白纯化的诱导温度分别在20℃，25℃，30℃，37℃四个温度下诱导8h，IPTG诱导浓度分别为100nM，300nM，500nM和700nM，在25℃诱导8h以及选取不同的诱导时间进行优化，SDS-PAGE凝胶电泳显示，通过优化后的目标蛋白表达量高，纯化效果较好。在实验过程中，我们采用了克隆的方法在E.coli中表达，使外源蛋白的表达水平升高。但也存在问题，E.coli的自身成分也会对表达的蛋白造成一定的污染，对于E.coli来说，是猪身上经常带的一种病原菌，因此，猪体内与E.coli有关的抗体就会是使检测的结果可能出现假阳性。但是如果应用高纯度的蛋白，就会提高实验的特异性，因此在整个实验的过程中就需要对蛋白进行纯化，需要对蛋白纯化的各个条件进行优化，将优化好的蛋白作为本实验的抗原。本实验在使用Ni-NTA亲和层析纯化的过程中，获得了高纯度的目的蛋白，但也可能存在大肠杆菌菌体蛋白对实验污染的情况。所以本实验在纯化包被抗原方面还需要做进一步的改进，以提高该方法的准确度，用于后续实验。2.5小结本研究从猪δ冠状病毒上克隆获得了PDCoVN蛋白全基因，构建了重组表达质粒rPDCoV-N载体，在对rPDCoV-N蛋白表达条件优化的基础上，采用Ni柱亲和层析获得了大量高纯度PDCoVN蛋白，可用作ELISA的包被抗原。24 甘肃农业大学2018届硕士学位论文第三章PDCoV-N蛋白的间接ELISA检测方法的建立引言PDCoV是一种近年来新发现的引起仔猪腹泻的重要病原体，而核衣壳（N）蛋白在PDCoV具有较强的抗原性和高度保守性，因此可利用PDCoVN蛋白作为包被抗原建立ELISA检测方法。而在间接ELISA检测方法建立过程中，抗原包被浓度、封闭时间及温度、一抗、二抗浓度及作用时间、底物作用时间及显色时间等诸多因素影响着ELISA方法的敏感性和准确性。在本部分研究中，本实验初步建立了检测PDCoV抗体的间接ELSA方法，并在此基础上优化了上述反应条件。该ELISA检测方法可进一步用于大规模PDCoV的流行病学监测，并为PDCoV在我国的流行病学调查提供了一种可靠、实用的检测、诊断方法。3.1材料3.1.1试剂ELSIA包被抗原在第二章制备。PDCoV-N的单抗由中国农业科学院兰州兽医研究所动物免疫遗传学培育团队制备。BCA蛋白浓度测定试剂盒从北京索莱宝生物科技有限公司购买。PDCoV标准阴、阳性血清由中国农业科学院兰州兽医研究所动物免疫遗传学培育团队保存。HRP-GoatAnti-PorcineIgG购自于Abcam生物公司。BovineSerumAlbumin（BSA）从翊圣生物公司购买。TMB单组分显色液从北京索莱宝生物科技有限公司购买。3.1.2溶液配制包被液：0.1M碳酸钠，0.2%叠氮化钠，PH=9.6洗液：0.15M氯化钠，0.05%吐温2025 甘肃农业大学2018届硕士学位论文封闭液：2.5%BSA抗体稀释液：0.15M氯化钠，0.01MEDTA，0.05MTris-HCl，0.05%吐温20，0.1%BSA终止液：2N浓硫酸。3.1.3仪器ELISA酶标板购自于Corning公司。酶标仪从BIO-RAD公司购买。3.2方法3.2.1包被抗原有效性验证将纯化的PDCoV-N的蛋白用实验室已有的PDCoV-N的单抗用Western-blot验证该目的蛋白是否可作为包被抗原，若能出现一条与目的蛋白大小相同的条带，则该蛋白可作为包被抗原。3.2.2包被抗原蛋白浓度的测定（1）标准液的配制：将标准品分别配制成2mg/mL、1.5mg/mL、1mg/mL、0.75mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.025mg/mL。（2）工作液的配制：根据BCA蛋白定量分析试剂盒配制混合液，将50体积BCAReagent与1体积CuReagent混合即为WR工作试剂，呈嫩绿色；（3）将25μl标准品及待测样本分别与200μLWR工作溶液混合，加入96孔板中，2个重复。（4）37oC反应30min，测定565nm（可在450-590nm之间）光密度（OD）值。（5）绘制标准曲线。X轴为各标准管对应的OD565nm值，Y轴为BSA标准蛋白浓度。用Excel拟合曲线并计算蛋白浓度。3.2.3间接ELISA方法的初步建立3.2.3.1ELISA的实验步骤优化前所有初始条件如下：（1）将纯化的蛋白按照适当浓度溶于包被液中，作为包被的抗原。（2）将抗原按照每孔100ng/100μl加入ELISA板中进行4℃过夜包被。26 甘肃农业大学2018届硕士学位论文（3）将包被结束的ELISA板取出，倒掉板内液体，并拍空，用PBST洗3次，每次5min，用5%的脱脂乳按照200μl/孔4℃过夜封闭。（4）将封闭结束的ELISA板取出，倒掉板内液体，并拍空，用PBST洗3次，每次5min，用1:100的浓度按照100μl/孔的一抗（待检样品）37℃孵育1h。（5）将孵育一抗结束的ELISA板取出，倒掉板内液体，并拍空，用PBST洗4次，每次5min，用1:5000的浓度按照100μl/孔的二抗37℃孵育1h。（6）将孵育二抗结束的ELISA板取出，倒掉板内液体，并拍空，用PBST洗4次，每次5min，加入显色液，显色5min。3.2.3.2ELISA条件的优化3.2.3.2.1抗原包被量的确定将重组蛋白每孔的包被量为1.56ng、3.125ng、6.25ng、12.5ng、25ng、50ng、100ng、200ng分别进行包被，剩余步骤与3.2.3.1中相同。实验结果以P/N值为衡量标准，P/N值越大，效果越佳。以实验室PDCoV的单抗（OD450nm值2.0）为阳性对照，新生仔猪（用Western-blot验证未感染PDCoV）的血清（OD450nm值小于0.2）为阴性对照。3.2.3.2.2抗原包被温度及时间的确定用上述优化好的条件下，将浓缩后的重组蛋白的包被温度及时间设为4℃过夜、4℃2h、4℃1h、室温过夜、室温2h、室温1h、37℃过夜、37℃2h、37℃1h分别进行包被，剩余步骤与3.2.3.1中相同。实验结果以P/N值为衡量标准，P/N值越大，效果越佳。以实验室PDCoV的单抗（OD450nm值2.0）为阳性对照，新生仔猪（用Western-blot验证未感染PDCoV）的血清（OD450nm值小于0.2）为阴性对照。3.2.3.2.3封闭剂的选择用上述优化好的条件下，将浓缩后的重组蛋白的封闭剂用0.2%的明胶、0.4%的明胶、2.5%的脱脂乳、5%的脱脂乳、2.5%的BSA、5%的BSA分别进行封闭，剩余步骤与3.2.3.1中相同。实验结果以P/N值为衡量标准，P/N值越大，效果越佳。以实验室PDCoV的单抗（OD450nm值2.0）为阳性对照，新生仔猪（用Western-blot验证未感染PDCoV）的血清（OD450nm值小于0.2）为阴性对照。3.2.3.2.4封闭时间的确定27 甘肃农业大学2018届硕士学位论文用上述优化好的条件下，将浓缩后的重组蛋白的封闭时间设为4℃过夜、室温过夜、37℃1h分别进行封闭，剩余步骤与3.2.3.1中相同。实验结果以P/N值为衡量标准，P/N值越大，效果越佳。以实验室PDCoV的单抗（OD450nm值2.0）为阳性对照，新生仔猪（用Western-blot验证未感染PDCoV）的血清（OD450nm值小于0.2）为阴性对照。3.2.3.2.5一抗稀释度的确定用上述优化好的条件下，将阳性血清和阴性血清的稀释度按照1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800进行稀释，剩余步骤与3.2.3.1中相同。实验结果以P/N值为衡量标准，P/N值越大，效果越佳。以实验室PDCoV的单抗（OD450nm值2.0）为阳性对照，新生仔猪（用Western-blot验证未感染PDCoV）的血清（OD450nm值小于0.2）为阴性对照。3.2.3.2.6一抗时间的确定用上述优化好的条件下，将阳性血清和阴性血清的孵育时间按照37℃0.5h、37℃1h、37℃1.5h、37℃2h分别进行孵育，剩余步骤与3.2.3.1中相同。实验结果以P/N值为衡量标准，P/N值越大，效果越佳。以实验室PDCoV的单抗（OD450nm值2.0）为阳性对照，新生仔猪（用Western-blot验证未感染PDCoV）的血清（OD450nm值小于0.2）为阴性对照。3.2.3.2.7二抗浓度的确定用上述优化好的条件下，通过使用羊抗猪的二抗按照说明书的建议进行稀释，具体为1:1250、1:2500、1:5000、1:10000进行稀释，剩余步骤与3.2.3.1中相同。实验结果以P/N值为衡量标准，P/N值越大，效果越佳。以实验室PDCoV的单抗（OD450nm值2.0）为阳性对照，新生仔猪（用Western-blot验证未感染PDCoV）的血清（OD450nm值小于0.2）为阴性对照。3.2.3.2.8二抗孵育时间的确定用上述优化好的条件下，二抗通过使用羊抗猪的二抗说明书的建议进行孵育，具体为37℃0.5h、37℃1h、37℃1.5h、37℃2h分别进行孵育，剩余步骤与3.2.3.1中相同。实验结果以P/N值为衡量标准，P/N值越大，效果越佳。以实验室PDCoV的单抗（OD450nm值2.0）为阳性对照，新生仔猪（用Western-blot验证未感染PDCoV）的血清（OD450nm值小于0.2）为阴性对照。3.2.3.2.9显色时间的确定28 甘肃农业大学2018届硕士学位论文用上述优化好的条件下，将显色时间分别设为1min，3min，5min，7min。实验结果以P/N值为衡量标准，P/N值越大，效果越佳。以实验室PDCoV的单抗（OD450nm值2.0）为阳性对照，新生仔猪（用Western-blot验证未感染PDCoV）的血清（OD450nm值小于0.2）为阴性对照。3.3实验结果3.3.1包被抗原的制备3.3.1.1包被抗原的验证结果采用第二章中表达纯化的蛋白进行SDS-PAGE，随后转印纸PVDF膜利用本实验室制备的PDCoV-N单抗为一抗、HRP标记的羊抗鼠二抗进行Wester-blot检测，结果显示，第二章制备的PDCoVN蛋白与本实验室制备的单抗具有较好的反应原性，在50.4KDa处有目的条带出现（图3-1）。由此可见，该蛋白可作为建立ELISA方法的包被抗原。图3-1用PDCoV-N的单抗验证结果Fig.3-1ResultsofthemonoclonalantibodywithPDCoV-N3.3.1.2蛋白浓度测定结果将上述纯化后的重组蛋白采用BCA法测定其蛋白浓度，以BSA为标准品制备标准曲线，其标准曲线如图3-2所示，将样品吸光光度值采用经标准曲线所得浓度计算公式，算得纯化后的目标蛋白浓度约为400ng/μl，可见第二章制备的重组蛋白浓度较高，可用于建立ELISA方法。29 甘肃农业大学2018届硕士学位论文图3-2蛋白浓度测定标准曲线Fig.3-2Proteinconcentrationdeterminationstandardcurve3.3.2ELISA条件优化的结果采用纯化的重组N蛋白为包被抗原，PDCoV感染的阳性猪血清为一抗，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗猪IgG为二抗初步建立间接ELISA检测方法。随后对抗原包被浓度、包被温度、封闭液浓度及封闭时间、一抗稀释度及孵育时间、二抗稀释度及孵育时间、显色时间等条件进行摸索。其结果分别如下：3.3.2.1抗原包被量的确定将重组蛋白以每孔1.56ng、3.125ng、6.25ng、12.5ng、25ng、50ng、100ng、200ng分别进行4℃过夜包被，采用5%脱脂乳于4℃过夜封闭，一抗1:100稀释、于37℃孵育1h，二抗1:5000稀释、于37℃孵育1h，TMB显色5min后终止显色，上机测定。由P/N比值可知，最佳抗原包被量为100ng/孔（图3-2）。3.3.2.2抗原最佳包被温度及时间的确定将重组蛋白以100ng/孔分别进行4℃过夜、4℃2h、4℃1h、室温过夜、室温2h、室温1h、37℃过夜、37℃2h、37℃1h包被，采用5%脱脂乳于4℃过夜封闭，一抗1:100稀释、于37℃孵育1h，二抗1:5000稀释、于37℃孵育1h，TMB显色5min后终止显色，上机测定。由P/N比值可知，抗原最佳包被温度及时间4℃1h（图3-3）。3.3.2.3最佳封闭剂的确定将重组蛋白以100ng/孔进行4℃1h包被，分别采用0.2%的明胶、0.4%的明胶、2.5%的脱脂乳、5%的脱脂乳、2.5%的BSA、5%的BSA进行4℃过夜封闭，一抗1:100稀释、于37℃孵育1h，二抗1:5000稀释、于37℃孵育1h，30 甘肃农业大学2018届硕士学位论文TMB显色5min后终止显色，上机测定。由P/N比值可知，最佳封闭剂为2.5%的BSA（图3-4）。3.3.2.4最佳封闭时间的确定将重组蛋白以100ng/孔进行4℃1h包被，用2.5%的BSA分别在4℃过夜、室温过夜、37℃1h分别进行封闭，一抗1:100稀释、于37℃孵育1h，二抗1:5000稀释、于37℃孵育1h，TMB显色5min后终止显色，上机测定。由P/N比值可知，最佳封闭时间为37℃1h（图3-5）。3.3.2.5一抗稀释度的确定将重组蛋白以100ng/孔进行4℃1h包被，用2.5%的BSA封闭37℃1h，将阳性血清和阴性血清的稀释度按照1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800进行稀释，在37℃孵育1h，二抗1:5000稀释、于37℃孵育1h，TMB显色5min后终止显色，上机测定。由P/N比值可知，一抗的最佳稀释度为1:25（图3-6）。3.3.2.6一抗时间的确定将重组蛋白以100ng/孔进行4℃1h包被，用2.5%的BSA封闭37℃1h，将阳性血清和阴性血清的稀释度按照1:25稀释，分别在37℃0.5h、37℃1h、37℃1.5h、37℃2h分别进行孵育，二抗1:5000稀释、于37℃孵育1h，TMB显色5min后终止显色，上机测定。由P/N比值可知，一抗的最佳孵育时间为37℃1.5h（图3-7）。3.3.2.7二抗浓度的确定将重组蛋白以100ng/孔进行4℃1h包被，用2.5%的BSA封闭37℃1h，将阳性血清和阴性血清的稀释度按照1:25稀释并在37℃孵育1.5h，通过使用羊抗猪的二抗按照说明书的建议进行稀释，具体为1:1250、1:2500、1:5000、1:10000进行稀释，于37℃孵育1h，TMB显色5min后终止显色，上机测定。由P/N比值可知，二抗的最佳浓度为1:5000（图3-8）。3.3.2.8二抗孵育时间的确定将重组蛋白以100ng/孔进行4℃1h包被，用2.5%的BSA封闭37℃1h，将阳性血清和阴性血清的稀释度按照1:25稀释并在37℃孵育1.5h，二抗1:5000稀释分别在37℃0.5h、37℃1h、37℃1.5h、37℃2h进行孵育，TMB显色531 甘肃农业大学2018届硕士学位论文min后终止显色，上机测定。由P/N比值可知，二抗的最佳孵育时间为37℃1.5h（图3-9）。3.3.2.9显色时间的确定将重组蛋白以100ng/孔进行4℃1h包被，用2.5%的BSA封闭37℃1h，将阳性血清和阴性血清的稀释度按照1:25稀释并在37℃孵育1.5h，二抗1:5000稀释、于37℃1.5h进行孵育，将显色时间分别设为1min，3min，5min，7min后终止显色，上机测定。由P/N比值可知，最佳显色时间为5min（图3-10）。图3-2抗原包被量Fig.3-2Antigencoatingamount图3-3抗原的包被温度及时间图3-4封闭液的种类Fig.3-3AntigencoatingtemperatureandtimeFig.3-4Blockingbuffertype32 甘肃农业大学2018届硕士学位论文图3-5封闭温度图3-6一抗最佳稀释度Fig.3-5BlockingtemperatureFig.3-6Thedilutionofsamples图3-7一抗孵育时间图3-8二抗稀释度Fig.3-7TestsampleincubationtimeFig.3-8Dilutionofsecondaryantibody图3-9二抗的孵育时间图3-10显色时间Fig.3-9SecondaryantibodyincubationtimeFig.3-10Developingtime综上所述，最终获得的最优反应条件分别如下：PDCoV-N最佳抗原包被量为100ng/孔，抗原的最佳包被温度及时间为4℃1h；用2.5%BSA在37℃1h33 甘肃农业大学2018届硕士学位论文封闭最佳；一抗的最佳稀释度为1:25，最佳孵育时间为1.5h；二抗最佳稀释浓度为1:5000，最佳孵育时间为1.5h；最佳显色时间为5min。3.4讨论PDCoV爆发后，病毒可引起某些地方性感染并且会持续存在，到目前为止，市面上还没有具体的治疗方法或有效的商品化疫苗[65]，因此，要想很好地控制疫情，就必须要阻止带毒猪进入猪场，对猪场内做好全面严格的消毒措施[66]。对于PDCoV的诊断来说，不能只依靠病理组织学病变和基本的临床症状。由于PDCoV的临床症状与其他的猪的腹泻病相似，因此，在实验室进行鉴别诊断十分必要，近年来，许多技术已被用于PDCoV检测，其主要包括免疫组化技术、PT-PCR技术、免疫荧光技术及酶联免疫吸附实验（ELISA）等。目前来说，这些方法都存在一定的缺陷，PT-PCR方法是针对病原的检测，虽然其灵敏度相对较高，但是容易出现假阳性或假阴性的结果，并且需要精密的仪器和相关的生物试剂，因此很难进行临床推广。同样的，其他的诊断方法也存在类似缺陷。相比较之下，ELISA方法具有操作简单、灵敏度高、成本低等优点，越来越多地应用于临床猪场的检测，但是目前并没有成品化的试剂盒，因此建立一种ELISA的检测方法是非常必要且十分紧迫。因此，本研究通过纯化PDCoV的N蛋白来初步建立一种ELISA的检测方法。一部分研究人员采用S蛋白作为包被抗原[57]，越来越多的报道表明，S蛋白在冠状病毒成员中具有高度的变异性[58,67,68]。因此，与S蛋白相比，rPDCoV-N作为诊断抗原具有高度的保守性，而且在病毒复制的初期产生，具有潜在的应用价值。在建立ELISA检测方法的过程中，所用的抗原纯度的高低会直接关系到ELISA实验的特异性和敏感性，会有某些非抗原物质与真正的抗原竞争有限的载体表面位置，从而减少抗原有效的吸附率。在PDCoV重组的N蛋白为包被抗原来建立PDCoV抗体间接ELISA方法中，其中，在优化ELISA的条件时，所用的临床样品均为用Western-blot鉴定过阴阳性的血清，因此，可以采取P/N值来进行最佳条件的判定，在判定的过程中，由于会出现P/N值结果很高的现象，主要是因为在实验过程中我们所采取的猪的阴性血清为未饮用母乳的新生小猪的血清，其OD值可达到0.05左右，而阳性血清OD值在2左右，因此会出现P/N值的结果很高。而对于优化的条34 甘肃农业大学2018届硕士学位论文件，包被时间和温度会直接影响所包被的抗原是否会发生降解，从而会影响结合效率，而在实验过程中的非特异性是影响ELISA方法成败的关键因素。当酶标板用不同的封闭液进行封闭后，测定的OD值会存在不同程度的差异，因此，需要通过实验对封闭液及封闭时间进行确定，从而减少非特异性吸附。本研究通过实验表明，在2.5%BSA，37℃1h能够发挥比较好封闭效果。在间接ELISA中，ELISA实验的特异性和敏感性会受到待检样品稀释倍数高低的影响，因此通过实验优化待检样品的最佳稀释倍数，可降低非特异性反应，甚至做到不影响实验的结果。本研究实验结果表明，阴阳性标准血清1:25稀释，在37℃温箱孵育1h，阴性标准血清的OD值最低，阳性标准血清的OD值最大，从而使两者比值达到最大。在ELISA实验的反应过程中，抗原包被、封闭、一抗、二抗、底物作用时间及显色时间的变化也会直接影响阴阳性血清的OD值，因而通过以上各步骤作用时间进行优化都可以适当降低ELISA的非特异性。本研究经各反应条件优化，确定最佳抗原包被量为100ng/孔，抗原的最佳包被时间为4℃1h，用2.5%BSA在37℃1h封闭最佳，待检血清最佳稀释度为1:25，待检血清最佳孵育时间为1.5h，二抗最佳稀释浓度为1:5000，二抗的最佳孵育时间为1.5h，当吸光度为450nm时，最佳显色时间为5min。综上所述，本研究所初步建立的检测方法可进一步用于大规模PDCoV的流行病学监测，并为PDCoV在我国的流行病学调查提供了一种可靠、实用的检测、诊断方法。3.5小结利用纯化的PDCoV-N蛋白作为包被抗原，初步建立了一种检测PDCoV抗体的间接ELISA检测方法，并成功获得了该间接ELISA检测方法的最佳反应条件，为进一步组装商品化诊断试剂盒奠定了基础。35 甘肃农业大学2018届硕士学位论文结论1.本研究从猪δ冠状病毒上克隆获得了PDCoVN蛋白全基因，构建了重组表达质粒rPDCoV-N载体，在对rPDCoV-N蛋白表达条件优化的基础上，采用Ni柱亲和层析获得了大量高纯度PDCoVN蛋白，可用作ELISA的包被抗原。2.利用纯化的PDCoV-N3蛋白作为包被抗原，初步建立了一种检测PDCoV抗体的间接ELISA检测方法，并成功获得了该间接ELISA检测方法的最佳反应条件，为进一步组装商品化诊断试剂盒奠定了基础。36 甘肃农业大学2018届硕士学位论文参考文献1.孙淑芳,等.冠状病毒概述.中国动物检疫,2013(06):p.68-71.2.Gorbalenya,A.E.,etal.,Nidovirales:evolvingthelargestRNAvirusgenome.VirusRes,2006.117(1):p.17-37.3.Luo,J.,etal.,Porcinedeltacoronavirus(PDCoV)infectionsuppressesRIG-I-mediatedinterferon-betaproduction.Virology,2016.495:p.10-7.4.Trudeau,M.P.,etal.,Environmentalpersistenceofporcinecoronavirusesinfeedandfeedingredients.PLoSOne,2017.12(5):p.e0178094.5.李文平,冠状病毒研究进展[J].中国兽药杂志,2003(06):p.31-35.6.Flewett,T.H.,etal.,Thediagnosticgapindiarrhoealaetiology.CibaFoundSymp,1987.128:p.238-49.7.Adams,M.J.andE.B.Carstens,RatificationvoteontaxonomicproposalstotheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses(2012).ArchVirol,2012.157(7):p.1411-22.8.Dong,B.Q.,etal.,DetectionofanovelandhighlydivergentcoronavirusfromasianleopardcatsandChineseferretbadgersinSouthernChina.JVirol,2007.81(13):p.6920-6.9.Woo,P.C.,etal.,DiscoveryofsevennovelMammalianandaviancoronavirusesinthegenusdeltacoronavirussupportsbatcoronavirusesasthegenesourceofalphacoronavirusandbetacoronavirusandaviancoronavirusesasthegenesourceofgammacoronavirusanddeltacoronavirus.JVirol,2012.86(7):p.3995-4008.10.Woo,P.C.,etal.,Coronavirusgenomicsandbioinformaticsanalysis.Viruses,2010.2(8):p.1804-20.11.方谱县,等.猪δ冠状病毒的研究进展[J].病毒学报,2016(02):p.243-248.12.Madapong,A.,etal.,CompleteGenomeSequenceofPorcineDeltacoronavirusIsolatedinThailandin2015.GenomeAnnounc,2016.4(3).13.苏明俊,猪δ冠状病毒重组N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与评价[D].2017,黑龙江八一农垦大学.14.Saeng-Chuto,K.,etal.,DifferentLineageofPorcineDeltacoronavirusinThailand,VietnamandLaoPDRin2015.TransboundEmergDis,2017.64(1):p.3-10.15.Li,G.,etal.,Full-LengthGenomeSequenceofPorcineDeltacoronavirusStrainUSA/IA/2014/8734.GenomeAnnounc,2014.2(2).16.Marthaler,D.,etal.,Rapiddetection,completegenomesequencing,andphylogeneticanalysisofporcinedeltacoronavirus.EmergInfectDis,2014.20(8):p.1347-50.37 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甘肃农业大学2018届硕士学位论文60.Han,Z.,etal.,DevelopmentofCompetitiveEnzyme-LinkedImmunosorbentAssaysforAntibodyDetectionBasedonBluetongueVirusMonoclonalAntibodies.ViralImmunol,2017.61.Pang,B.,etal.,Developmentofalow-costpaper-basedELISAmethodforrapidEscherichiacoliO157:H7detection.AnalBiochem,2017.62.Zhang,J.,Porcinedeltacoronavirus:Overviewofinfectiondynamics,diagnosticmethods,prevalenceandgeneticevolution.VirusRes,2016.226:p.71-84.63.Hu,H.,etal.,IsolationandcharacterizationofporcinedeltacoronavirusfrompigswithdiarrheaintheUnitedStates.JClinMicrobiol,2015.53(5):p.1537-48.64.Song,D.andB.Park,Porcineepidemicdiarrhoeavirus:acomprehensivereviewofmolecularepidemiology,diagnosis,andvaccines.VirusGenes,2012.44(2):p.167-75.65.Cottingim,K.M.,etal.,Feedadditivesdecreasesurvivalofdeltacoronavirusinnurserypigdiets.PorcineHealthManag,2017.3:p.5.66.Le,V.P.,etal.,AnovelstrainofporcinedeltacoronavirusinVietnam.ArchVirol,2017.67.Fang,P.,etal.,[ResearchAdvancesinthePorcineDeltacoronavirus].BingDuXueBao,2016.32(2):p.243-8.68.Homwong,N.,etal.,CharacterizationandevolutionofporcinedeltacoronavirusintheUnitedStates.PrevVetMed,2016.123:p.168-174.41 甘肃农业大学2018届硕士学位论文致谢本论文是在家畜疫病病原生物学国家重点实验、中国农业科学院兰州兽医研究所动物免疫遗传学培育团队完成。两年的硕士学习时间转瞬即逝，即使再俗，也很容易让人想到光阴似箭，日月如梭，回顾两年的点点滴滴，不禁让自己百感交集，内心会有万般思绪，过往的种种依然能够历历在目。在论文即将完成之际，以下对帮助过我的老师、师兄、师姐及同学表示感谢。感谢我的导师，甘肃农业大学樊江峰老师和中国农业科学院兰州兽医研究所的刘光亮老师，导师不仅给予了我学习上教导，在生活中也给予了无微不至的关怀。导师高效严谨的工作作风、积极向上并且豁达的人生态度以及时刻挂在嘴边的诚信，给我树立了良好的榜样。从论文的选题到论文的开题一直到论文的写作的指导，经由您悉心的点拨，常常让我有茅塞顿开的感觉，借助论文完成之际，发自肺腑的对导师说一句，老师，您辛苦了。感谢您这两年的栽培以及对我的关心和帮助，我的每一点进步都与您息息相关。您丰富的专业知识和精益求精的工作作风给我树立了崇高的榜样！感谢张宸语师兄，是我的实验过程中的启蒙老师，无论在学习或是生活上都给予我极大鼓励和帮助，感谢刘果、张娜师姐、金丽师妹和各位同学在我整个实验过程中给予的帮助，让我在大量的实践锻炼磨练了我的性格，更提高了我分析问题和解决问题的能力。感谢所有在我人生整个成长道路上给予我鼓励、帮助和支持的人们，是你们的鼓励和帮助，让我敢于不断地探索和前进，在此我也衷心的向所有关心过我的人表示感谢！42 甘肃农业大学2018届硕士学位论文个人简介姓名：刘岳性别：女出生日期：1993年10月19日籍贯：山东省潍坊市高密市井沟镇城后最后学历学位：兽医硕士2012年9月一2016年6月青岛农业大学动物科技学院2016年9月一2018年6月甘肃农业大学动物医学院毕业院校：甘肃农业大学43 甘肃农业大学2018届硕士学位论文导师简介一、基本情况樊江峰，博士，男，汉族，1980年3月生，甘肃静宁人。2001年毕业于甘肃农业大学动物医学院，获学士学位；2004年7月硕士毕业于甘肃农业大学动物医学院临床兽医学专业，获农学硕士学位，并留校参加工作。2012年6月博士毕业于甘肃农业大学动物医学院动物医学工程专业，获农学博士学位。现为甘肃农业大学动物医学院副教授，硕士研究生导师。二、教学情况承担本科生《兽医产科学》、《特种经济动物学》的教学工作。三、科研情况研究方向：家畜生殖生理，动物胚胎工程。科研项目：1.Fas/FasL系统在牦牛妊娠维持中的作用研究（甘肃省青年基金，1208RJYA081，主持人，已结题）2.牦牛体外受精胚胎植入前细胞凋亡及其分子机理的研究（甘肃农业大学创新基金，GAU-CX1036，主持人，已结题）3.甘南高寒牧区藏羊冷季补饲及健康养殖技术研究（甘南州畜牧科学研究所横向课题，主持人，在研）4.基于卵泡发育精确监测与调控的牦牛人工授精技术研究及应用（甘肃省农业科技创新课题，GNCX-2014-30，主持人，在研）5.高寒牧区牦牛人工授精技术优化及组织模式研究（甘肃省财政厅高校基本科研业务费，主持人，在研）6．白牦牛体外受精和胚胎移植技术的研究（甘肃省生物技术专项，参加人，已鉴定）7．应用胚胎工程技术快速扩繁白牦牛的研究（甘肃省科技攻关项目，参加人，已鉴定）8．牦牛胎盘组织细胞凋亡的分子机理及其与流产关系的研究（国家自然科学基金，参加人，已结题）44 甘肃农业大学2018届硕士学位论文9．黄河重要水源补给区（玛曲）高寒牧区畜牧业经济模式转型研究与示范（国家科技支撑计划项目，参加人，已验收）四．代表性论文：[1]TheexpressionofFas/FasLandapoptosisinyakplacentomes.AnimReprodSci，2011,128(10)(第一作者，SCIⅡ区)[2]兽医产科学理论课教学改革浅析，农业与技术，2012,32(5)(第一作者)[3]天祝白牦牛超排过程中卵泡闭锁的初步研究.安徽农业科学（2008、7）（第一作者）[4]特种经济动物生产学教学体会.甘肃农大学报（专辑）（2004）（第一作者）[5]TheExpressionofEpidermalGrowthFactor(EGF)anditsReceptor(EGFR)DuringPost-NatalTestesDevelopmentintheYak.ReprodDomAnim,doi:10.1111/rda.12416.[6]天祝白牦牛胚胎移植试验研究.中国科学（C辑），(2007、1)[7]SuccessfulembryotransferinTianzhuwhiteyakusingstandardprotocol，SciChinaCLifeSci.2007,50(5):655-9.(SCI)[8]运用B超观察白牦牛超数排卵期卵巢的变化.甘肃农业大学学报（2008、6）[9]小尾寒羊人工授精影响因素的研究.中国草食动物（2006、3）[10]牦牛妊娠期卵巢卵泡及黄体的形体学观察.甘肃农业大学学报（2006、2）[11]绵羊卵巢卵母细胞体外成熟培养的研究.甘肃农业大学学报（2005、10）45 甘肃农业大学2018届硕士学位论文导师简介刘光亮，男，1975年6月生，博士，研究员，博士生导师，中国农业科学院“青年英才计划”入选者，现任兰州兽医研究所动物免疫遗传学培育团队首席科学家，中国农业科学院兰州兽医研究所学术委员会委员、学位委员会委员。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所博士毕业，先后任美国路易斯安那州立大学健康科学中心和美国石溪大学博士后研究员。美国病毒学会（AmericanSocietyofVirology,ASV）全职会员；受邀担任美国科学基金委（NationalScienceFoundation，NSF）2016年博士生科研奖学金项目（GraduateResearchFellowshipProgram，GRFP)评审专家；现担任《中国预防兽医学报》、ScientificReports、Vaccine、JournalofClinicalMicrobiology、VirusGenes、TrialsinVaccinology、ClinicalVaccineImmunology等多家国内外著名学术期刊特邀审稿专家；曾担任2013年国际牙科学术研讨会微生物与免疫专场大会主席。主要从事动物病毒免疫学研究工作。主要工作内容为动物病毒性腹泻快速诊断、防控策略以及黏膜免疫发生机制，目前主持各级别科研项目6项，已发表研究论文37篇，其中SCI论文15篇，其中，h-index论文8篇，被引用近400次。申报国家发明专利2项，已获批1项；以副主编身份参编《兽医免疫学实验指南》一书；其研究论文《MHCI四聚体技术原位检测特异性CTL》被第十四届中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨第十三届中国病理生理学会动物病理生理专业委员会评为青年优秀论文。46 甘肃农业大学2018届硕士学位论文47