《猪繁殖与呼吸综合征病毒调控宿主应答的机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
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猪繁殖与呼吸综合征病毒调控宿主应答的机制研究ＴＨＥＭＥＣＨＡＮＩＳＭＯＦＨＯＳＴＲＥＳＰＯＮＳＥＳＲＥＧＵＬＡＴＥＤＢＹＰＯＲＣＩＮＥＲＥＰＲＯＤＵＣＴＩＶＥＡＮＤＲＥＳＰＩＲＡＴＯＲＹＳＹＮＤＲＯＭＥＶＩＲＵＳ博±后姓名杨華流动站一（级学科）名称中国农业科学院生物学专业（二级学科）名称微生物学研巧工作起始时间２０１４年７月１日研巧工作期满时间２０化年１１月３０日中国农业科学晓２０１６年１１月２ 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证一书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。博±后签名：时间：年月日辦关于论文使用授权的声明、：本人完全了解中国农业科学院有关保留使用学位论文的规定，即中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘、，允许论文被査阅和借阅，可Ｗ采用影印缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。博±后签名；时间：年月日合作导师签名年月日 内容摘要猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓＰＲＲＳＶｙ，）对世界养猪业造成巨大的经济损失，在世界范围内受到广泛关注。特别是窩致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＨＰ－ＰＲＲＳＶ）的出现，更加大了对养猪业的危害。目前，病毒仍在持续的进化一，ＰＲＲＳＶ难控制的原因之在于病毒的致病和免疫机理并不十分清楚。因此，难研发安全、有效的疫苗来对该病进行防控。病毒如何调控细胞内相关信号通路或利用自身编码蛋白来逃避机体免疫系统的识别和清除，从而有利于自身的感染和复制，成为近年来针对ＰＲＲＳＶ研究的热点。ＰＢＫ／Ａｋｔ信号通路是细胞内重要的信号转导通路，多种病毒感染过程中均能够活化该通路来有利于自身的复制和增殖。本研究将ＨＵＮ４－Ｆ１１２病毒在ＧＳＫ－３抑制剂持续存在的条件下进行传代１４代一后。ＳＶ，病毒滴度可恢复到与对照组致的水平对抑制剂耐受的ＰＲＲ突变株进行高通量全基因姐测序和序列对比发现，Ｎｓｐ２、Ｎｓｐｌ２、ＧＰ３和ＧＰ４蛋白中６个核昔酸的突变可导致病毒氨基酸的突变。借助反向遗传平台获得３株重组突变病毒，对重组病毒生物学特性分析发现，这６个氨基酸可能在病毒复制感染过程中发挥重要的作用。ＳＡＭＨＤ１作为最新发现的天然免疫限制性因子，具有三磯酸水解酶的活性，能够降解细胞内ｄＮＴＰ，阻止Ｉ型人免疫缺陷病毒－（ＨＩＶ１）的逆转录过程，抑制病毒在髓系细胞中的感染与复制。针ＳＡＭＨＤ１－对表达调控机制研究发现，ＴＬＲ３和ＲＩＧＩ／ＭＤＡ５通路参３ 与ＳＡＭＨＤｌ表达。二者下游ＴＲＩＰ和ＭＡＹＳ分子过表达能够上调ＳＡＭＨＤ１的表达，ＴＢＫ１活性在诱导ＳＡＭＨＤ１表达过程中发挥重要作用。深入分析发现，ＳＴＡＴ１的磯酸化不参与ＳＡＭＨＤ１的诱导表达，但只有活化形式的ＩＲＦ３能够上调ＳＡＭＨＤ１的表达。干扰ＩＲＦ３表达－ａ诱导ＳＡＭＨＤ后，ＩＦＮ１上调表达受到显著抑制；恢复ＩＲＦ３的表达，一ＳＡＭＨＤ１的诱导表达又恢复到与对照组ｉＲＦ３磯酸致的水平。抑帝ｊＩ－ａ和病毒感ＳＡＭＨＤ化入核后，ＩＦＮ染均无法诱导１的上调表达。ＣｈｉｐＳＡ一ｌ和ＥＭ实验进步分析发现，ＩＲＦ３能够直接结合到ＳＡＭＨＤ启－３－＋动子１１９区域诱导ＳＡＭＨＤ１的表达。本文的主要结论是：１－．ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ下游的ＧＳＫ３信号分子与病毒感染增殖密切相关。非结构蛋白Ｎｓｐ２上的Ｎ４０１Ｄ、Ｄ７９５Ｎ突变和Ｎｓｐｌ２上民１２１Ｗ突变影响病毒体外增殖能为；结构蛋白ＧＰ３上的Ｐ２０４Ｓ突变和ＧＰ４上的Ｆ５Ｌ、Ａ２２Ｖ的突变增强了病毒体外复制的能力，并增强病毒诱导Ａｋｔ活化的能力。２．天然免疫限制性因子ＳＡＭＨＤ１在ＰＲＲＳＶ感染过程参与机体的抗病毒作用，ＩＲＦ３的磯酸化入核对诱导ＳＡＭＨＤ１的上调表达具有至关重要的作用。－关键词：猪繁殖与巧吸综合征病奉，免疫逃逸ＳＫ３，ＳＡＭＨＤ１，ＩＲＦ３，Ｇ４ ＡｂｓｔｒａｃｔＰｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｉｒａｔｏｒｓｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓＰＲＲＳＶｐｙｙ（）ｏｓｅｓｓｉｎｉｆｉｃａｎｔｅｃｏｎｏｍｉｃｌｏｓｓｅｓｔｏｔｈｅｏｒｋｉｎｄｕｓｔｒａｎｄｉｓｃｕｒｒｅｎｔｌａｐｇｐｙｙｍａｏｒｃｏｎｃｅｒｎｆｏｒｔｈｅｓｗｉｎｅｉｎｄｕｓｔｒｗｏｒｌｄｗｉｄｅ．Ｅｓｅｃｉａｌｌａｎｏｕｔｂｒｅａｋｊｙｐ乂－ｏｆｈｉｈｌａｔｈｏｅｎｉｃＰＲＲＳＶＨＰＰＲＲＳＶｏｃｃｕｒｒｅｄｉｎＣｈｉｎａａｎｄｃａｕｓｅｄｇｙｐｇ（）ｄｉｓａｓｔｒｏｕｓｌｏｓｅｓｔ；ｏ化ｅｆａｒｍｅｒｓ．Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，ＰＲＲＳＶｉｓｓｕｓｔａｉｎｉｎｇｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｉｓｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙｄｉｆｉｃｕｌｔｔｏｃｏｎｔｒｏｌ，ｄｕｅｔｏ化ｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｓｉ打ａｃｏｍｐｌｅｘｍａｎｎｅｒ，ａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｓａｆｅａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｖａｃｃｉｎｅｆｏｒＰＲＲＳＶｈａｓｄｉｆｉｃｕｌｔｉｅｓ．Ｍｏｓｔｒｅｃｅｎｔｌ化ｅｙ，ｓｔｕｄｉｅｓｏｆＰＲＲＳＶａｒｅｆｏｃｕｓｏｎｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ化ａｔｈｏｗｔｈｅｖｉｒｕｓ１：０ｅｖａｄｅｔｈｅｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎａｎｄｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｈｏｓｔｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｒｅｐｏｎｓｅｓ．－ｋＰｈｏｓｈａｔｉｄｌｉｎｏｓｉｔ：ｏ＾３ｉｎａｓｅＰＩ３Ｋ／Ａｋｔｉｓａｎｉｍｏｒｔａｎｔｃｅｌｌｕｌａｒｐｙ（）ｐｐａｔｈｗａｙａｎｄｈａｓｂｅｅｎｓｈｏｗｎｔ：ｏａｒｔｉｃｉａｔｅｉｎｖａｒｉｏｕｓｒｅｌｉｃａｔｉｏｎｓｔｅｓｏｆ，ｐｐｐｐｍｕｌｔｉｌｅｖｉｒｕｓｅｓ．Ｔｏｓｅｌｅｃｔｔｈｅｍｕｔａｎｔｖｉｒｕｓｗｈｉｃｈｗａｓｃｏｎｆｅｒｒｅｄｔｈｅｄｒｕｐｇ－ｗａ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＧＳＫ３ｉｎｈ化ｉｔｏｒＸｓｕｓｅｄ化ｓｕｒｅｓｓ１；ｈｅＨｕＮ４Ｆｌ１２ｖｉｍｓ，ｐｐｒｅ－ｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＭＡＲＣ１４５ｆｏｒ１４ａｓｓａｅｓ．Ｔｈｅｎｃｏｍｌｅｔｅｅｎｏｍｅｏｆ化ｅｐｇｐｇ－ｓｅｌｅｃｔｅｄｍｕｔａｎｔｖｉｒｕｓｗｈｉｃｈｔｏｌｅｒａｔｅｄ！；〇化ｅＧＳＫ３ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＸｗａｓ－ｕｅｎｃｓｅｕｅｎｃｅｄｂｈｉｈｔｈｒｏｕｈｕｔｓｅｉｎ．ＣｏｍｌｅｔｅｅｎｏｍｅｓｅｕｅｎｃｅｑｙｇｇｐｑｇｐｇｑａｎａｌｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｓｉｘａｍｉｎｏａｃｉｄｓｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＮｓ２Ｎｓｌ２ＧＰ３ｙｐ，ｐ，ａｎｄＧＰ４ｗｅｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒ化ｅｖｉｒｕｓｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｂｙｒｅｖｅｒｓｅｇｅｎｅｔｉｃｔｅｃｈｎｉｕｅ．ｑＴｈｅｓｔｅｒｉｌｅａｌｐｈａｍｏｔｉｆａｎｄＨＤｄｏｍａｉｎ１巧ＡＭＨＤｌ）ｐｒｏｔｅｉｎｈａｓｂｅｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓａｎｏｖｅｌｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｉｔｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆａｃ化ｒ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｓａｙｔｒｉｈｏｓｐｈｏｈｄｒｏｌａｓｅｔｈａｔｄｅｌｅｔｅｓｃｅｌｌｓｏｆｄｅｏｘｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｔｒｉｈｏｓｈａｔｅｓｐｙｐｙｐｐｄＮＴＰｓｉｎｈ化ｉｔｓｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｃｏｍｌｅｍｅｎｔａｒＤＮＡｃＤＮＡｓｎｔｈｅｓｉｓａｎｄ（），ｐｙ（）ｙ－－ｂｌｏｃｋｓＨＩＶ１ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｍｙｅｌｏｉｄｌｉｎｅａｇｅｃｅｌｌｓ．ＴｈｅｕｎｄｅｒｌｉｎｇｙｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＳＡＭＨＤｌ仕ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄ化ａｔｉｎｄｕｃｉｎｇＳＡＭＨＤｌｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｓａｒｔｏｆａｎｅａｒｌｉｎｔｒｉｎｓｉｃｉｍｍｕｎｅｒｅｓｏｎｓｅｖｉａｐｙｐ－ＴＬＲ３ａｎｄＲＩＧＩ／ＭＤＡ５ａｏｎｉｓｔｓ化ａｔ山ｔｉｍａｔｅｌｉｎｄｕｃｅ出ｅｎｕｃｌｅａｒｇｙｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｏｆ化ｅｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｒｅｕｌａｔｉｏｎ拉ｃｔｏｒ３（ＩＲＦ３ｒｏ化ｉｎ．Ｆｕｒｔｈｅｒｇ）ｐｓｔｕｄｉｅｓｓｈｏｗｔｈａｔＩＲＰ３ｐｌａｓａｍａｏｒｒｏｌｅｉｎｕｒｅｕｌａｔｉｎｅｎｄｏｅｎｏｕｓｙｊｐｇｇｇ５ ＳＡＭＨＤｌｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｎａｍｅｃｈａｎｉｓｍｔｈａｔｉｓｉｎｄｅｅｎｄｅｎｔｏｆｔｈｅｃｌａｓｓｉｃａｌｐｐＩＦＮ－ｉ－ＳＴＡＴｆｎｄｕｃｅｄＪＡＫａｔｈｗａ．Ｂｏ化ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｐｙＩＲＦ３ｅｎｈａｎｃｅｄ化ｅＳＡＭＨＤｌｐｒｏｍｏｔｅｒ山ｃｉｆｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄａｃｔｉｖａｔｅｄ，ＩＲＦ３ｗａｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｆｏｒｕｐｒｅｕｌａｔｉｎＳＡＭＨＤｌｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｎａｔｙｐｅＩｇｇｐＩＦＮｃａｓｃａｄｅ．Ｗｅａｌｓｏ油ｏｗ化ａｔ化ｅＳＡＭＨＤｌｐｒｏｍｏｔｅｒｉｓａｄｉｒｅｃｔｔａｒｇｅｔｏｆＩＲＦ３ａｎｄａｎＩＲＦ３ｂｉｎｄｉｎｓｉｔｅｉｓｓｕｆｉｃｉｅｎｔｔｏｒｅｎｄｅｒｔｈｉｓｒｏｍｏｔｅｒｇｐｒｅｓｏｎｓｉｖｅｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏ打．ｐＳｏｌｕｔｉｏｎｓｒｅｓｅｎｔｅｄｉｎｔｈｉｓ化ｅｓｉｓｃａｎｂｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄａｓｆｂｌｌｏｗｓ：ｐ－－ＴｈｅａｃｖｅｓｓｅｎｔｉｉｔｙｏｆＧＳＫ３ｗａｓｔｉａｌｆｏｒ化ｅｖｉｍｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＶｉｍｓｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄｂｙｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＮｓｐ２（Ｎ４０１ＤａｎｄＤ７％ＮａｎｄｉｎＮｓ２Ｒ１２１ＷＶｉｒｕｓｒｅｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗａｓ）ｐ（）；ｐｐｅｎｈａｎｃｅｄｉｎｖｉｔｒｏｂｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＧＰ３Ｐ２０４ＳａｎｄＧＰ４Ｆ５Ｌａｎｄｙ（）（Ａ２２Ｖｔ；ｏｅ化ｅｒｗｉ化化ｅｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆＡｋｔｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎ．），ｇｐｐｙ－ＡｓａｎｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｉｔｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆａｄｏｒＳＡＭＨＤｌａｒｔｉｃｉａｔｅｓｉｎ化ｅｙ，ｐｐａｎｔｉｖｉｒａｌＫＳｏ打ｓｅｓｄｕｒｉｎＰＲＲ客Ｖｍｆｃｃｔｉｏｎ．ＴｈｅｈｏｓｈｏｒｌａｔｉｏｎａｎｄｐｇｐｐｙｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｏｆＩＲＦ３ｌａｓｖｉｔｉａｌｒｏｌｅｓｉｎｕｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｙｐｇｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓＳＡＭＨＤｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ，ｉｍｍｕｎｅ的ｃａｅＧＳＫ－３ＳＡＭＨＤｌＩＲＦ３ｐ，，，６ 目次第一章引言４１．１ＰＲＲＳＶ的基因组结构与复制机制５１．２ＰＲＲＳＶ编码蛋白与功能８１．２．１ＰＲＲＳＶ非结构蛋白及其功能８１．２．２ＰＲＲＳＶ结构蛋白及其功能１０１．３ＰＲＲＳＶ感染与宿主天然免疫１２－１．４ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＧＳＫ３１６信号通路１．４．１ＰＩ３Ｋ结构及其生物学功能１７１．４．２Ａｋｔ通路及其生物学功能１９１．４．３ＰＤＫ／Ａｋｔ通路与ＰＲＲＳＶ感染２１１．５天然免疫限制性因子ＳＡＭＨＤ１与病毒感染２２１．５．１ＳＡＭＨＤ１的结构与生物学特性２３１２ＳＡＭＨＤ．５．１功能与病毒感染２４１．６本研究目的和意义％第二章ＰＲＲＳＶ逃逸外界选择压力的研究２７２．１病毒和细胞２８２．１．１细胞和病毒２８２丄２抗体和试剂２８２丄３病毒感染和抑制剂处理２９２丄４抑制剂细胞毒性实验３０２丄５总ＲＮＡ的提取与ｃＤＮＡ的合成３０Ｉ ２丄６细胞裂解和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析３１－－２丄７ＨＵＮ４Ｆ１１２株ＧＳＫ３抑制剂突变株的筛选３２２．１．８重组突变病毒的构建与捶救巧２丄９重组突变病毒的搔救３４２丄１０重组捶救病毒的酶切鉴定３５２丄１１重组病毒间接免疫英光（ＩＦＡ）鉴定％２丄１２重组捶救病毒生物学特性分析３６２．２结果３７－３２．２．１ＧＳＩＣｉｎｈｉｂｉｔｏｒＸ对细胞活性的影响３７－２２２ＧＳＫ３的３７．．活性与ＰＲＲＳＶ的增殖密切相关－－ｉ２．２．３ＨＵＮ４Ｆ１１２株ＧＳＫ３抑蒂ｊ剂突变株的筛选巧２２４ｉ４１．．重组病毒ＧｅｎｏｍｃＭａｒｋｅｒ检测１２．２．５间接免疫焚光鉴定结果４２２．２．６重组捶救病毒生长特性分析４２２．２．７重组捶救病毒増强Ａｋｔ的磯酸化水平４３２．３讨论４５第Ｈ章ＳＡＭＨＤ１表达调控机制研究４９３．１材料与方法５１３丄１细胞和病毒５１３丄２质粒５１、抗体和试剂３丄３Ｒｅａ－ｔｍｅＰＣＲＨＤ１基因ｍＲＮＡ和细ｌｉ定量分析ＳＡＭ－ａ的表达胞ＩＦＮ５２３丄４细胞处理与转染５３３．１．５焚光素酶活性检测５４２ ３丄６ＲＮＡ干扰与回补实验５４３丄７间接免疫巧光实验５５３丄８染色质免疫共沉淀实验（ＣＷＰ）５５３丄９凝胶迁移电泳ＳＡ）５６（ＥＭ３丄１０统计学分析５６３．２结果；５６３－．２Ｃ．１ＭＡＲ１４５细胞和ＰＡＭ细胞中干扰素上调ＳＡＭＨＤ１的表达５６３－．２．２ＨＰＰＲＲＳＶ感染诱导ＰＡＭ细胞中ＳＡＭＨＤ１蛋白和ｍＲＮＡ水平上调５８３－．２．３ＴＬＲ３和ＲＩＣＩ通路参与上调ＳＡＭＨＤ１的表达．．．．５９３．２．４过表达ＴＲＩＦ和ＭＡＶＳ诱导ＳＡＭＨＤ１的表达？．６０３．２．５ＴＢＫ１的活化参与ＳＡＭＨＤ１的诱导表达６２３．２．６ＩＲＦ３在ＳＡＭＨＤ１转录翻译过程中发挥直接的调控作６４Ｓ３２Ｓ－．．６５．．７ＡＭＨＤ１上调表达不依赖于ＪＡＫＳＴＡＴ通路．．．３．２．８ＩＲＦ３的磯酸化和核转移活性对诱导ＳＡＭＨＤ１的上调表达至关重要６７３．２９ＲＦ３直ＳＡＭＨＤ１的启．活化的Ｉ接结合动子诱导ＳＡＭＨＤ１的上调表达６９３．３讨论７０第四章全文结论７４参考文献１５３ 第一章引言猪繁殖与呼吸综合征（Ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｉｒａｔｏｒｓｎｄｒｏｍｅ，ＰＲＲＳ）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒ｐｙｙ（Ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｉｒａｔｏｒｓｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ，ｐｙｙＰＲＲＳＶ）引起的，母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统症状为特征的一种急性、高度传染的病毒性传染病，对世界养猪业造成巨大的危害和经济损失（Ａｌｂｉｎａｌｏｄｅａｕｅｔａｌ．１９９１，１９９７；Ｂｉ；，Ｄｏｎｅｅｔａｌ．１９９６。、死，）其临床症状主要表现为怀孕母猪流产胎、木乃伊胎、；仔猪呼吸困难气喘或耳朵发维，出现关节炎、败血症等症状。该病１９８７年在美国首次出现，并在１９９０年在欧洲首次报道。１９９６年，首次证实ＰＲＲＳＶ在我国的存在，并造成仔猪死亡率升高和怀孕母猪的突然流产。然而，２００６年我国爆发高致病性猪繁殖与呼吸综合征，由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒巧ｉｇｈｌｙｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｐｏｒｃｉｎｅ－ｒｅｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｉｒａｔｏｒｓｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓＨＰＰＲＲＳＶｐｐｙｙ，弓Ｉ）一一起，被认为是北美洲型的种突变体，是对我国养猪业又次巨大打击Ｔｏｎｅｔａｌ．２００７Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，２００８。，（ｇ；）ＰＲＲＳＶ一猪繁殖与呼吸综合征病毒（）是种单股、正链具有囊膜的ＲＮＡ病毒，属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属的成员之一。与其同属的其它病毒还包括马动脉炎病毒４ 巧ｑｕｉｎｅＡｒｔｅｒｉｔｉｓｖｉｍｓ，ＥＡＶ、乳酸脱氧酶病毒（Ｌａｃｔａｔｅ）ｄｅｈｄｒｏｇｅｎａｓｅｅｌｅｖａｔｉｎｇｖｉｒｕｓ，ＬＶＤ、猴出血热病毒巧ｉｍｉａｎｙ）ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｆｅｖｅｒｖｉｍｓ，ＳＨＦＶＸＢｅｎｆｉｅｌｄｅｔａｌ．，１９９２）。ＰＲＲＳＶ－６０ｎｍ成熟病毒粒子呈卵圆形，直径５０，其核衣壳直径为３０－ｎｍ二Ｄｅａｅ３５，呈十面体对称ｔａｌ．２０００。根据其遗传特（，）异性和抗原的差异民－２３３２为，可分为Ｖ代表毒株的北美洲型和ＷＬｅｌｙｓｔａｄｖｉｒｕｓ（ＬＶ）为代表毒株的欧洲型，虽然二者具有相似的结构特性，能够引起相似的临床症状，但抗原性差异较大，两种亚型间的基因组存在较大差异（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｔａｌ．，１９９２；Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔｅｔａｌ．，１９９２；Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔｅｔａｌ．，１９９１）。目前，我国ＰＲＲＳＶ的流行毒株主要为北美洲型。ＰＲＲＳＶ感染可Ｗ使感染猪出现持续性的带毒和排毒，并引起机体免疫抑Ｉ。至ＰＲＲＳＶ审Ｊ，从而继发感染其他病原导致病情加重今为止，几乎在全世界所有养猪地区流行，对世界养猪业危害巨大，引起了广泛关注，同时也是当今研究的热点。１．１ＰＲＲＳＶ的基因组结构与复制机制ＰＲＲＳＶ基因组具’有５端帽子结构（Ｃａｐ）和非编码区’’’（５ＵＴＲ）Ｗ及３非编码区（３ＵＴＲ）和ｐｏｌｙ（Ａ）结构’Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｅｔａｌ．，１９９３），其中５ＵＴＲ包含调控病毒基因组（ｇ复制和亚基因组转录所必需的顺式调控因子，其末端还具有５ 一二级结构元件一个独立的，是段种间保守的转录调控序列－ＴｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎＲｅｕｌａｔｉｎＳｅｕｅｎｃｅＴＲＳ（ｐｇｇｑ），在病毒不连续性转，录过程起着关键性的调控作用。病毒基因组其全长约为１５ｋｂ，包含８个开放阅读框（ＯＲＦｓ）。随着研究的不断深入，’新的开放阅读框也不断彼发现。位于５端两个大的开放阅读框，分别为ＯＲＦｌａ和ＯＲＦ化，其大小占据了整个基因组长度的三分之二，主要编码病毒的ＲＮＡ聚合酶（ｐｐｌａ和ｌａ／ｂ），参与形成多聚复制转录酶复合体ｐｐ，启动病毒基因组复制及亚基因组的转录Ｔｈｉｅｌｅｔａｌ．１Ｗ３。ＯＲＦｌａ和化（，）－１２；ＮｓｌＮｓｌ２２蛋能够转录表达个非结构蛋白ｐｐ，其中Ｎｓｐ白具有高度变异的特点。开放阅读框〇ＲＦ２ａ，０ＲＦ２ｂ和ＯＲＦｓ３－７编码病毒的结构蛋白，其中ＯＲＦ７编码病毒的核衣壳蛋白（Ｎ）－，ＯＲＦ２６编码病毒的膜相关蛋白，分别为ＧＰ２ａ、ＧＰ化、ＧＰ３、ＧＰ４、ＧＰ５和Ｍ蛋白，其中只有ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４、ＧＰ５四种蛋白能够被糖基化Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｅｔａｌ．１９９３（ｇ，；ＳｎｉｄｅｒａｎｄＭｅｕｌｅｎｂｅｒ１９９８。ｊｇ最新研巧发现新的编码区，，）称为ＯＲＦ５ａ，其与ＯＲＦ５具有重叠的编码区，能够编码５１个氨基酸，对其功能研究也不断深入（Ｆｉｒｔｈｅｔａｌ．２０１１，；Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．２０１１。，）目前研究认为ＰＲＲＳＶ的复制机制与其他正链ＲＮＡ病毒相似。首先，病毒在受体介导的细胞内吞作用侵入细胞，６ 经过脱壳过程后，将基因组释放到细胞浆中起始病毒的复制；；过程。由于ＰＲＲＳＶ基因组为单股正链民ＮＡ，本身可Ｗ作为信使ＲＮＡ（ｍＲＮＡ），其借助于宿主细胞的核糖体，首先翻：译产生复制所必需的ＲＮＡ聚合酶，ＲＮＡ聚合酶病毒基因组ＲＮＡ为模板，合成双链ＲＮＡ，形成复制中间体，其中负链ＲＮＡ作为复制模板，复制形成病毒的正链ＲＮＡ，产生子代病毒的基因组，与翻译形成的病毒结构蛋白共同组装形成成熟的病毒粒子释放。但ＰＲＲＳＶ具有其独特的转录机制，５ＭＪＴＲ对病毒基因组复制、亚基因组的转录和蛋白质翻译过。在病毒基因姐转录的过程中程中，具有重要的调控作用，通过一种＂非常特殊的叫自连续性转录机制形成６个亚基因组ｍＲＮＡ’（ｓｇｍＲＮＡ）。形成的６个ｓｇｍＲＮＡｓ具有共同的３末端嵌套式结构ＲＦ２－ＯＲＦ７。ｓｍＲＮＡｓ中存在高度，其转录能够表达Ｏｇ保守的核巧酸基序（ＵＣＡＡＣＣ），这些基序与病毒基因姐’５ＴＴＴＲ的ｌｅａｄｅｒ序列相连，从而翻译靠近５末端的开放阅读框；然而，在成熟的病毒粒子中并不存在ｓｇｍＲＮＡｓ，这表明ＰＲＲＳＶ的包装信号可能主要集中在ＯＲＦ１。近年来研究表明，ｓｍＲＮＡｓ是多顺反子，但其在功能上是单顺反子。ｇＰＲＲＳＶ的复制与结构蛋白和非结构蛋白间具有密切的关一ｌ２００７系，其转录和翻译机制仍需要进步的阐明（Ｕｅｔａ．，；７ Ｌｉｅｔａｌ．２００９Ｌｕｅｔａｌ．２００６。，；，）ＧｅｎｏｍｅＲＮＡ＇５ＵＴＲ３ＵＴＲ／／／鸟－ｐｐｉａ（Ｔ，Ｔｊ＿＾ｙ？？－、ＲＦＳｐｐ１ａｎｓｐ２Ｎ！ｉ１１｜｜ｌ，＾－＞－ｐｐｌａｎｓｐ２ＴＦ２ＲＦＳ１（１臟ｐ带ｕＺＩ，浊ｐｐ：ｗ制呵Ｎｏｎｓｔｒｕｄｕ过化巧５３４５６｜８９１０１１１２巧巧Ｅｎｖｅｌｏｐｅ（ＧＰ２ａｎｄＥ）．ｓｇＲＮＡ２糸＾＾＾７Ｅｏｖ舶ｐｅＧＰＡｎ（３＇巧瞧３）Ｖ．ｈ９．ＬＩＥｎ免ｔｏｐｅ（ＧＰ４），Ａｎ巧ＲＮＭ？＾Ｓｔｎｃｔｒｉ＾＜ｎＩＥ阳白ｏｅ巧巧扣ｄＯ巧ａＡｓＲＮ化ｐｉｇ：？Ｊ‘＂ｊＡＭ撕ｉｔａｉｅ，＂．，ｎｓＲＮＡ６㈱，ｇ＾．２．Ｊｊ、Ｎ抵拾ｏａ自ｄＮｉｓＲＮＡ７＼ｃｐ｛）Ａｎｇ＾图．ＩＰＲＲＩＣ２０５ＩＳＶ基因组转录与翻译ａｅｓＭＡ１（ｐｐ，）１Ｐ民民ｌｉＫ２０１５巧．１．ＳＶｅｎｏｍｅｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓａｔｏｎａｅｓＭＡ复ｇ，，ｐ（ｐｐ）１．２．１ＰＲＲＳＶ非结构蛋白及其功能目前研究发现的ＰＲＲＳＶ非结构蛋白功能主要体现在病毒ＲＮＡ的合成Ｗ及参与病毒对宿主的免疫系统的调控过程中。ＰＲＲＳＶ两个主要的开放阅读框ＯＲＦｌａ和ＯＲＨｂ能够编码两个大的多聚蛋白ｐｐｌａ和ｐｐｌａｂ，ｐｐｌａｂ的表达是通过ＯＲＦｌａ和ＯＲＦ化之间的核糖体移码机制转录翻译产生ｄｅｎ（Ｂｏｏｎｅｔａｌ．，１９９１；Ｗｏｏｔｔｏｎｅｔａｌ．，２０００）。Ｐｐｌａ和ｐｐｌａｂ蛋白通过Ｎｓｌ蛋白的木瓜蛋白酶样半脫氨酸蛋白酶（ＰＣＰ）和Ｎｓ２ｐｐ８ 蛋白的３Ｃ样半腕氨酸蛋白酶（ＣＰ）化及Ｎｓｐ４蛋白的丝氨酸蛋白酶（ＳＰ）活性，经过蛋白水解作用产生１４个非结构ＳＰ３－Ｎｌ２ＰＣＰ蛋白。的切割活性能够切割产生Ｎｓｐｓｐ蛋白，活性切割产生Ｎｓｐｌａ和Ｎ巧ｉｐ蛋白，ＣＰ活性切割产生Ｎｓｐ２Ｆ一蛋白（ａｎｇａｎｄＳｎｉｊｄｅｒ，２０１０）。Ｎｓｐｌ蛋白是种多功能性的蛋白也是产生最早的一种非结构蛋白，它包含三个功能结构域，两个木瓜蛋白酶样半脱氨酸蛋白酶区域（ＰＣＰａ和ＰＣＰＰ）一个锋指结构ｍＲＮＡ的转录和病毒复制过程和，在病毒ｓｇ１６１３１．２０１１。序列分析表明１〇［包中发挥重要作用牌，），化９含Ｎ端的鲜指结构和ＰＣＰａ，而Ｎｓｌ包含ｐｐ则ＰＣＰ０１ｅｋｓｉｅｗｉｃｚｅｔａｌ．２００４Ｔｈｉｅｌｅｔａｌ．１９９３Ｔｉｍｓａｎｄｐ（，；，；ｊＳｎｉｄｅｒ２００３Ｔｉｍｓｅｔａｌ．２００１。虽然Ｎｓｌａ和Ｎｓｉ蛋白ｊ，；ｊ，）ｐｐｐ与木瓜蛋白酶具有较低的序列同源性，但ＥＡＶ，ＰＲＲＳＶ，ＬＤＶ和Ｓ册Ｖ中，其Ｎｓｐｌａ和Ｎｓｐｉｐ具有保守的木瓜蛋白酶样蛋白酶特异性的残基序列。Ｎｓｐｌａ和Ｎｓｐｌ通过Ｃ末端ｐ－－－－ＶａＰＣＰ区域，在ＣｙｓＡｌａＭｅｔｌ８（ＵＡｌａＡｓｐｌ和Ｔｒ－Ｔｒ－Ｇ－－ｌ２０３ＡｌａＧｌＬｓ切割位点游蛋白切ｐｙｙｉｙｙ，将其从下割分离（Ｓｕｎｅｔａｌ．，２００９；Ｘｕｅｅｔａｌ．，２０１０）ｎＮｓｐ２蛋白是病毒最大的非结构蛋白。Ｎｓ２，也是功能较复杂的蛋白ｐ蛋白中含有能够发生显著变异的脯氨酸富集区域，可对其进行碱基插入和突变，也是检测ＰＲＲＳＶ变异的重要区域，而其氨基９ 末端具有半脯氨酸蛋白酶活性。Ｎｓｐ２蛋白在病毒复制和调控病毒的先天性免疫方面具有重要作用巧ｕｎｅｔａｌ．２０１０。最，）Ｎｓ２蛋白可通过－２移码新硏究表明，ｐ机制产生新的蛋白，加深了对ＰＲＲＳＶ复制复杂性的认识Ｆａｎｅｔａｌ．２０１化。（ｇ，）其它蛋白的功能目前并不十分清楚，目前研巧表明，Ｎｓｐ４蛋白发挥丝氨酸蛋白酶活性，参与切割ｐｐｌａｂ蛋白；Ｎｓｐ９蛋白是一种ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶（ＲｄＲｐ），含有正链民ＮＡ病毒复制所特有的四个基序。ＮｓｐｌＯ蛋白具有ＡＴＰ酶和解旋酶的活性ｌｌ蛋白含有核糖核酸内切酶的功能域；Ｎｓｐ（Ｐｏｓｔｈｕｍａｅｔａｌ．，２００６）〇１２２ＰＲＲＳＶ．．结构蛋白及其功能组ＯＲＦ２ａ－ＰＲＲＳＶ基因，ＯＲＦ２ｂ，ＯＲＦ３ＯＲＦ７和ＯＲＦ５ａ编码７种结构蛋白；分别为糖蛋白ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４、ＧＰ５，小窠膜蛋白Ｅ，膜蛋白Ｍ和核衣壳蛋白Ｎ，Ｗ及新发现的ＯＲＦ５ａ蛋白。ＧＰ５和Ｍ蛋白可Ｗ形成二聚体，ＧＰ２、ＧＰ３、ＧＰ４Ｈ种蛋白是膜相关蛋白，能够通过二硫键彼此么间形成异源Ｈ聚体，在病毒侵入的过程中发挥重要作用Ｍａｒｄａｓｓｉｅｔ（ａ一ｌ．１９９６Ｗｉｓｓｉｎｋｅｔａｌ．，２００５。，；）窠膜蛋白ＧＰ５是种主要结构蛋白一，在结构蛋白中变异性最强，同时也是种高度糖基化的蛋白。研究发现其第１３位和１５１位氨基酸突变能够导１０ 致病毒毒力减弱（Ａｌｌｅｎｄｅｅｔａｌ．２０００。分析发现ＧＰ５蛋白第，）１１７－１３１位和１４９－１６３位氨基酸是两个重要的Ｔ细胞表位Ｖａｓｈｉｓｈｔｅｔａｌ．２００８。另外，ＧＰ５蛋白上含有至少两类中和（，）表位，最重要的表位位于胞外区，病毒诱导的机体中和抗体中也主要是针对ＧＰ５蛋白（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚｅｔａｌ．，２００１；Ｗｅｉｌａｎｄｅｔａ一ｌ．１９９９ｄＭ蛋白又称之为基质蛋白，是，）种非糖基化蛋白，也是病毒粒子组装过程中重要的结构蛋白，其氨基酸序列比较保守且具有很强的免疫原性。Ｎ蛋白是病毒的核衣壳蛋白一，在病毒感染细胞的过程中表达量最高的种蛋白，它能一够包录病毒的基因组ｌ．，是种非糖基化蛋白（Ｄｅａｅｔａ，２０００；分析发现，Ｎ蛋白中含有５个重要的抗原区域，其Ｃ）端对于维持构象表位必不可少（Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，１９９８；Ｒｏｄｒｉｇｕ的ｅｔａｌ．，１９９７；Ｗｏｏｔｔｏｎｅｔａｌ．，１９％）。Ｎ蛋白能够结合到病毒基因姐ＲＮＡ，在病毒组装的过程中，能够自身形成同源寡聚体，进而形成病毒的核衣壳（ＷｏｏｔｔｏｎａｎｄＹｏｏ，２００３；Ｙｏｏｅｔａｌ．，２００３）。ＰＲＲＳＶ感染细胞后，Ｎ蛋白在细胞核和核仁均有出现，其入核可能与其复制密切相关（Ｌｅｅｅｔａｌ．，２００６；Ｒｏｗｌａｎｄｅｔａｌ．，１９９９）。目前针对Ｅ蛋白功能研究较少，研究发现其存在于所有的动脉炎病毒粒子中一，是种具有疏水性但没有糖基化的小囊膜蛋白Ｗｕｅｔａｌ．２００１Ｗｕｅｔａｌ．（，；，２００５。ＰＲＲＳＶ的结构蛋白具有多种功能，也能够参与对宿）１１ 主先天性免疫反应的调控（Ｙｏｏｅｔａｌ．，２０１０）。１．３ＰＲＲＳＶ感染与宿主天然免疫ＰＲＲＳＶ感染的猪体内一，病毒能够通过种隐蔽性感染期而持续存在一，促使病毒保持在个低水平并持续复制。病毒引起的急性感染期持续３－４周，进而转变成持续感染。在持续感染期，机体并未出现病毒血症，病毒复制仅存在于淋己组织和其他免疫器官，如扁桃体和淋己结（Ｂｅｙｅｒｅｔａｌ．，２００化Ｒｏｗｌａｎｄｅｔａｌ．，２００３）。病毒从持续感染的猪体内排出，成为一一种重要的传染源Ｊｌ。，也是ＰＲＲＳＶ难ｙ清除的重要原因之病毒持续存在可能是由于机体较差的免疫反应，包括中和抗体产生延迟和先天性免疫反应的抑制。最近研巧发现，在ＰＲＲＳＶ感ＴＮＦ－ａ下调表达－１染的猪体内，，比０上调表达；ＰＲＲＳＶ感染的猪体内，尽管在感染的细胞中能够检测到大量的病毒ＲＮＡ产生－，但ＩＦＮａ表达水平很低。肺脏是ＰＲＲＳＶＩＦＮ－复制最活跃的部位，但ａ无法在感染猪的肺脏中检测ＩＰＲＲＳＶ感ＲＣ－寞Ｊ；在染ＭＡ１４５细胞和猪肺泡巨嗟细胞（ｐｏｒｃｉｎｅａｌｖｅｏｌａｒｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，ＰＡＭｓ）中，ＩＦＮ的产生也受ｉＭ到抑审ＪＢｕｄｄａｅｒｔｅｔａｌ．１９９８ｉｌｌｅｒｅｔａｌ．２００４ＶａｎＲｅｅ化ｅｔ（，；，；－ａｌ．１９９９。ＨＰＰＲＲＳＶ感染，）猪时，病毒迅速复制并稳定的持－续存在。ＲＮＡ芯片分析发现ＰＲＲＳＶ感染的细胞中，，册１２ 猪Ｉ型干扰素的产生受到抑制，因此宿主先天性免疫也受到抑制（Ｘｉａｏｅｔａｌ．２０１０。，）ＴＬ民３和ＴＬ民７受体对ＰＲＲＳＶ的感染至关重要。猪ＴＬＲ３受体在肾脏、十二指肠、脾脏、肝脏中高表达，而ＴＬＲ７在骨髓，小肠、脾脏、肝脏、肺脏、肠系膜琳己结、气管、胸腺一、肾脏和皮肤中出现定程度的表么且化民３的活化能够抑制ＰＲＲＳＶ病毒的复制巧ａｎｇｅｔａｌ．，２００８ａ；Ｓａｎｇｅｔａｌ．，２００８ｂ）。分析ＰＲＲＳＶ感染和ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）刺激的ＰＡＭ细胞、猪骨髓细胞来源的非成熟树突状细胞中ＴＬＲｓ的表达状况发现，在未刺激的细胞中，ＴＬＲ３、ＴＬＲ７和ＴＴＬＲ８在ＰＡＭ细胞表达量较高；在ＰＡＭ细胞中，Ｐｏｌ（Ｉ：Ｃ）刺激ＴＬＲ３的ｙ表达，而抑制ＴＬＲ７和ＴＬＲ８的表达。比较发现，ＰＲＲＳＶ在感染非成熟的树突状细胞６ｈ后，下调ＴＬＲ３、ＴＬＲ７和ＴＬＲ８的表达ｈ一，２４后又恢复基本水平，但ＴＬＲ７的表达直处于．２０１０。？１０１５￥感染的细胞下调的现象（〇１３１１峭６＊３１，受到，）ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）和ＬＰＳ的刺激后，ＴＸＲ４的表达未收到影响，化１１３的表达出现明显的下降，促进了病毒的复制Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，（２００９－。Ｐｏｌ（Ｉ：Ｃ）刺激ＭＡＲＣ１４５细胞后，能够通过上调）ｙ肌Ｔ３的表达来抑制ＰＲＲＳＶ的增殖Ｚｈａｎｅｔａｌ．２０１３。（ｇ，）ＰＲＲＳＶ感染活化ＮＦ－ｋＢ和ＡＰ－１信号通路ＩＲＦ３，但抑制的活性（Ｌｕｏｅｔａｌ．，２００８）。ＰＲＲＳＶ非结构蛋白能够抑制Ｉ型１３ 干扰素的产生，研究发现其４种非结构蛋白具有抑制的活性；Ｎｓｐｌ、Ｎｓｐ２、Ｎｓｐ４、Ｎｓｐｌｌ；Ｎｓｐｌ位于细胞浆和细胞Ｉ－启动子活性ｌｌ核，Ｎｓｐ蛋白能够强烈的抑制ＩＦＮＰ，Ｎｓｐ和Ｎｓｉ能够抑制ＩＲＦ３调节的Ｉ型干扰素的产生，Ｎｓｉｐｐｐｐ能够抑制ＩＲＦ３的磯酸化和核移位ｌ，Ｎｓｐ介导的抑制ＩＦＮ的产生是依赖于蛋白酶体系统降解细胞核内的ＣＢＰ蛋白，而并非Ｎｓｌ蛋白的ＰＣＰ活性ＦＮ启ｐ，进而抑制Ｉ动子的活化Ｋｉｍｅｔａｌ．２０１０。Ｎｓ２ＣＰ。（，）ｐ具有活性和解离活性解筒活性在ＩＳＧｓ和师－ｋＢ信号通路中发挥作用ＣＰ活性能够抑，制ＩＲＦ３的磯酸化和入核（Ｌｉｅｔａｌ．，２０１０）。Ｎｓｐｌｌ的表达主要－在细胞浆中，Ｎｓｐｌｌ蛋白参与抑制民ＩＧＩ信号通路。Ｎｓｐｌｌ一个ＮｅｎｄｏＵ区域蛋白含有，具有内切核糖核酸酶活性Ｎｅｄｉａ化ｏｖａｅｔａＲＦ３ＮＦ－（ｌ．，２００９）。Ｎｓｐｌｌ能够阻止Ｉ和ｋＢ的ＩＦＮ核移位，进而抑制的产生。在ＰＲＲＳＶ感染的细胞中，ＮｓｌｌＩＰＳ－１ＩＰ－１ｐ能够降解，Ｓ的下调表达导致下游信号通路的抑制－。Ｎｌｌ，进而抑制ＩＲＦ３和ＮＦｋＢ的活性ｓｐ的内切核－糖核酸酶活性能够降解１。ＩＰＳ的ｍＲＮＡ病毒感染宿主时，ＮＦ－ｋＢ信号通路的活化作为保护性的反应来抵抗病毒的感染，许多病毒感染能够抑制其活化来逃避宿主的先天性免￣－疫。但ＰＲＲＳＶ感染细胞３６ｈ４８ｈ，ＮＦｋＢ的活性明显上调，ＮＦ－ｋＢ的活化是剂量和复制依赖性的，灭活病毒无法上调１４ 争；－．ＮＦｋＢ的活性（ＬｅｅａｎｄＫｌｅ化ｏｅｋ啤２００５。ＰＲＲＳＶ感染Ｊ）‘（－－ｋＢ通路４ＭＡＲＣ１４５细胞迅速活化ＮＦ，而感染ＰＡＭ时在晚；期出现活化－。病毒感染活化ＮＦｋＢ通路，有利于自身的复蒂－１！Ｊ，调控宿主细胞的增殖和调ｔ，但阻止ＮＦｋＢ的活化并＊没有影响病毒的复制（ＬｅｅａｎｄＫｌｅｉｂｏｅｋｅｒ，２００５；Ｌｕｏｅｔａｌ．，２００８ＳＶＮ－）。ＰＲＲ蛋白刺激ＮＦｋＢ的活化，并且这种活化是：－．．剂量依赖性的，３０７３位氨基酸是活化所必须的，这个位置＇Ｖ包含核內定位信号和核仁定位信号，也是Ｎ蛋白同源二聚体形成的必要区域－Ｎ同源二聚体可能与ＮＦ－ｋＢ的，暗示Ｎ－活化有关。然而，其他研究发现，Ｎｓｌａ能够抑制ＮＦｋＢ的ｐ活化Ｓｏｎｔａｌ．２０１０。Ｎｓｌａ能够降低ＰＲＤＩＩ后动子焚光（ｇｅ，）ｐ素酶的活性－ｋＢ的入核，并且抑制ｉＫｆｉａ的憐酸化，导致ＮＦ受到抑制。Ｎｓｐ２蛋白通过ＯＵＴ区域抑制Ｉ型ＩＦＮ的产生，Ｆ－ｋＢ的活Ｌ并且能够下调Ｎ性ｉｅｔａｌ．，但其机制并不清楚（，２０１０）。Ｎｓｐ２蛋白能够干扰憐酸化ＩｋＢ的聚泛素化，导致ＩｋＢ－降解受到抑制，进而抑制ＮＦｋＢ的活化。ＰＲＲＳＶ感染对－ＮＦｋＢ信号通路的调控，还需要深入的研巧。ＰＲＲＳＶ感染不仅能够抑制ＩＦＮｓ的产生，而且能够抑制ＩＦＮｓ－ａ诱导的ＭＡＲＣ－１４５细胞中－ＳＴＡＴ的分泌。在ＩＦＮ，ＪＡＫ通路在感染后２４ｈ受到明显抑制１５和ＩＳＧ５６的ｍＲＮＡ，ＩＳＧ水平明显下调ｌ，ＩＳＧＦ３的核移位也受到抑制；Ｎｓｐｐ能够抑１５ ｉＳＴＡＴｌ的憐酸化ＩＳＧ巧Ｐａｅｌｅａｌ审ｊ和的核移位ｔｔ．２０１０。（，）Ｎｓｌａ能够与ＰＩＡＳｌ互作，导致Ｎｓｌａ的ＳＵＭＯ化，促使ｐｐＮｓｌａ入核。总么，在Ｐ艮民ＳＶ感染早期，Ｎｓｌ、Ｎｓ２和ｐｐｐＮｓｐｌｌ促进病毒基因的转录和病毒蛋白的翻译，抑制免疫反应和Ｉ型ＩＦＮ的产生及ＩＦＮ诱导通路的活化；病毒感染晚－ｋＢ的期，促进ＮＦ活化来促使病毒在宿主细胞中存活。－＇？－＇、－＇－＇２＊－．、＜ａ＊、、；Ｓ？Ｖ＞ｖ、■艺＊５３ｉ！；ＳＳｔＳ，ＳｆｌＳ，八？３又ｉ一．．吟，：兴化，－ＷＮ从以巧Ｖｉｒ出ｄＥｎｔｅｉｏｍｅＭｔｏｃｔ？ｗ？３ｒｉｏｎ了抑ｉ＾从：Ａｗｗ、、Ｉ？＜－／？ｖｓ＼ＩＰＳｌ醫ｒｎｍｍＬ２Ｊ＼种林＼ＡＲＮＡ＜Ｊｅｇｒ＊ｄ？ｔ，ｏ？Ｉ柳义、１Ｗ＂／！ＳＢＩＭ＊ｗｕＴＳｔａＭＡ＾ｐ；Ｗ一ｗ？Ｐ＾ｔＳＧ．广八＼、／ｎＮＭｉｒｔｏｎｏｒＩｆｆｉｌｌＩ／、《＊巧麵ＳＳＯ留ｐｆｅ＇Ｉ泌＂ｗｗｉｐｉ§辦是Ｉ＾＜＾Ｉ｛纷曲ｉｄｙｉｒＩ＼義括？说ＩＩ是丢＼去Ｉ＊ｗ＼Ｌ瓜＼賴；／—誦、￣議漏誦／Ｉｒ／／Ｌ．’．麵ｉｉｉＩＪ＾＂ｉ，｜＂…ｌ‘‘脚，，ｔ品ｕ品！霉一一Ｉ班以＿百礙｜麵＼ＷｍｍＬｉ？ｉＴＩ巧？，＊Ｓａｃｏｎｄｗａ？ｒｗｖ？ｗＹ图．２ＰＲＲＳＶ感染对Ｉ（Ｓｕｎｅｔａｌ．２０１２）１型干扰素调控途径，，＾Ｉ．ｔｔＩｉ化ｒｆｂＰ艮艮ＳＶ．ＳｕｎＹｅｔａｌ．２０１２）ｉ．１２Ｒｅｇｕｌａｉｏｎｏｆｅｎｅｒｏｎ（ｇｙｐｙ，，１ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ－／ＧＳＫ．４３信号通路ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号转导通路作为细胞内重要的信号转导１６ 通路，能够调控细胞内的多种生物学活动，包括细胞代谢、调亡、存活、增殖等，对细胞的调亡和存活具有重要的调节ｋ一作用。Ａｔ是受ＰＩ３Ｋ调节的个下游重要鞭分子，他们形一ＰＤＫＡｋ成个信号通路即／ｔ信号通路。Ａｋｔ在ＰＩ３Ｋ的调节下，能够调节多种下游蛋白分子的活性，进而调控细胞内的多种生理学反应。病毒感染的过程中，宿主的细胞存活与否对病毒增殖和存活至关重要，因此，病毒感染细胞后可能会利用胞内信号通路来调控细胞的生物学活动Ｗ创造合适的细胞内环境，便于进行充分复制。通过研究ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路介导的细胞存活与病毒感染的关系，期揭示病毒感染机理对于该病毒的防御策略的提出具有重要意义。１４．１ＰＵＫ．结构及其生物学功能Ｐ－－Ｉ３Ｋ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３ｋｉｎａｓｅ，磯脂醜肌醇３激酶）是憐脂激酶家族中的一个重要成员，按照其序列同源性及其对底物的偏向性和调节的方式差异，将在哺乳动物中已发现的八种ＰＢＫ分子，可分成Ｉ、ＩＩ和ＩＩＩ三类。ＰＩ３Ｋ家族不同的成员催化产生的分子各异一，但其结合下游分子的结构致，都能够结合含有特定脂类识别组件的蛋白质分子，进而转变为相应的效应或传导信号的分子。其中，最常见的成员一一是Ｉ类ＰＩ３Ｋ，它是由个ｐｌｌＯ催化亚单位和个ｐ８５调节１７ 亚单位组成的异源二聚体－，具有脂类激酶活性和丝氨酸苏氨酸蛋白激酶活性－３４５－二磯酸，其催化的产物是磯脂醜，，ｈｏｓｈｏｈａ－－ｔｉｄＵｎｏｓｉｔｏｌ３，４，５ｄｉｈｏｓｈａｔｅＰＩＰ，能够使（ｐｐｐｙｐｐ，＾位于细胞膜上的憐脂醜肌醇中肌醇环的３号位鋒基磯酸化，使其转变成为第二信使，活化下游通路分子：被激活的ＰＩ３Ｋ一可Ｗ进ＰＩＰ２产生－３４５－Ｈ憐酸（ＰＩＰ３）步催化磯脂酷肌醇，，，ＰＩＰ２和ＰＷ３作为细胞内重要的第二信使，它们能够激活下一ｒｏ系列蛋白激酶ｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＢ，ＰＫＢ游，如蛋白激酶Ｂ（ｐ），蛋白激酶ＣｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣ，ＰＫＣ和蛋白激酶Ａ（ｒｏｔｅｉｎ（ｐ）ｐｋ一ｉｎａｓｅＡ，ＰＢＫＰＫＡ，使信号通路活化系列的偉，产生生物学效应（Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．，２０１０；Ｖａｎｈａｅｓ纯ｒｏｅｃｋｅｔａｌ．，２０１０）。ＰＢＫ能被许多胞外信号，如细胞因子等激活。当细胞外配体信号与相应的受体结合后，受体被激活发生同源或异源寡聚化，或使ＲＴＫ（ｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ，受体酪氨酸激酶）自身酪氨酸残基磯酸化或者导致与受体偶联激酶的酪氨酸残基憐酸化，ＰＩ３Ｋ通过其调节亚基ｐ８５的Ｓｒｃ同源结构－ｈｏｍｏ域２巧ｒｃｌｏ２ＳＨ２识别和结合自身憐酸化的受体酪ｇｙ，）氨酸激酶Ｊａｎｕｓｋｉｎａｓｅ，或与细胞质中的活化的Ｓｒｃ和ＪＡＫ（，ｉｌ２０００ＪＡＫ）激酶等结合发生磯酸化而活化（Ｒｏｄｒｇｕｅｓｅｔａ．，）。ＲＴＫ能够间接通过激活Ｒａｓ激酶，结合并激活ｌｌＯ亚基导ｐ致ＰＩ３Ｋ激酶的活化。此外，ｐ８５亚基也能够通过族岛素受１８ 体亚单位１（ｉｎｓｕｌｉｎｒｅｃｅｔｏｒｓｕｂｓｔｒａｔｅ１ＩＲＳ１）和ｐ，膜岛素受体亚单位２（ｉｎｓｕｌｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｂｓｔｒａｔｅ２，ＥＲＳ２），间接与酪氨酸残基的磯酸化位点结合，ＰＩ３Ｋ激酶的活化是通过与相关受体间接结合实现，如膜岛素受体等能够强烈持久的激活ＰＩ３Ｋ激酶，而表皮生长因子受体的活化作用相对较弱，而且具有间断性。可见，不同受体对ＰＩ３Ｋ激酶激活的程度存ｌ在差异（Ｐａｃｏｌｄｅｔａ．２０００。ＰＩ３Ｋ的活化受到ＰＴＥＮ的调控，，）通过反向调节催化的ＰＩＰ２生成，抑制ＰＩ３Ｋ信号转导，进而抑制细胞的代谢活动；抑制ＰＴＥＮ的活性，促进ＰＢＫ／Ａｋｔ信号传导通路的活化（Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．，１９９１）。１４．２Ａｋｔ．通路及其生物学功能一种丝研究发现，Ａｋｔ是／苏氨酸蛋白激酶，由于其在功Ｃ的一些共同的特征能方面具有蛋白激酶Ａ和蛋白激酶，因此又被称为蛋白激酶Ｂ，它是多条信号通路的重要交叉蛋白，在真核细胞生物代谢调控网络中，发挥重要的调控作用（Ｍａｒｔｅｌｌｉｅｔａｌ．，２００６）。Ａｋｔ信号通路与多种疾病的发生发展密切相关巧ｅｌｌａｃｏｓａｅｔａｌ．２００５。近年来ｋｔ越来越受关注，，Ａ，）对其生物学功能的了解也不断加深。Ａｋｔ的磯酸化导致其发挥生物学活性，主要依靠ＰＩ３Ｋ对其调控，细胞内多种因子能够激活许ＰＩ３Ｋ促使Ａｋｔ发生鱗酸化，进而调控下游的大９１ 量信号分子的活性来调节细胞生长代谢等活动。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ信号转导通路在调控细胞调亡过程中具有重要的生物学功能，其调机制主要通过Ａｋｔ对下游调亡相关帮蛋白的调节实现（Ｃａｎｔｒｅｌｌ，２００１）。目前，研究发现Ａｋｔ调控调亡的主要机制表现为：活化的Ａｋｔ能够作用于多种促调亡蛋白分子－－，如Ｂｃｌ２家族成员的Ｂａｄ，ｃａｓｐａｓｅ９ｉ＾及葡萄３（ＧＳＫ－３）糖合成酶３，通常这些蛋白分子在鱗酸化状态时ｊｐ都处于失活状态，但被Ａｋｔ憐酸化后，对调亡因子的刺激作一用延迟．１Ｗ８。Ｂａｄ，抑制细胞调亡的发生（Ｅｖｅｓｅｔａｌ是第，）个被直接证实的ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号转导途径下游调节细胞调亡及存活的鞭基因，在活化状态下（非憐酸化状态），既能够激活Ｂｃｌ－２家族促调亡成员促进细胞的调亡，又能够通过直接地结合其他抗调亡因子而促进细胞的调在受到Ａｋｔ－２和－－憐酸化后，变为非活化状态，进而从Ｂｅｌ１４３３受体蛋白的复合物中解离出来，发挥抗细胞调亡的作用Ｙａｍａ化ｉ（ｇｕａｎｄＷａｎ２００－１Ｚｈｏｕｅｔａｌ．２０００。Ａｋｔ酸化Ｃａｓａｓｅ９ｇ，；，）能够磯ｐ一－２使之失去活性ａｓｅ，３，，并进步抑制其他调亡分子Ｃａｓｐ一ｌ６，８，１０，引起系列反应发挥抗细胞调亡作用（Ｃｈａｎｅｔａ．ｇ，－２００３。糖原合酶激酶３ＧＳＫ－３具有２种亚型３ａ和：ＧＳＫ）（）ＧＳＫ－－３。ＧＳＫ３在正常的情况下能够使糖原合酶磯酸化ＰＰ，使其失去活性－，导致糖原合成减少；而Ａｋｔ磯酸化ＧＳＫ巧２０ 后，抑制其活性，进而恢复糖原合成酶的活性，促进细胞摄取能量－３；可见，ＧＳＫＰ在细胞生长和血糖稳态调控中发挥重要作用（ＦｒａｍｅａｎｄＣｏｈｅｎ，２００１）。１．４．３ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路与ＰＲＲＳＶ感染ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路是细胞内重要的调控系统，参与多种生物学功能的执行。因此，研究ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ在病毒感染细胞过程中的作用，阐明病毒感染与ＰＤＫ／Ａｋｔ信号通路介导的细胞存活之间的关系，对于揭示病毒的感染机理具有积极的意义。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路参与多种病毒感染的过程，抑制该信号通路的活化一Ｙｕａｎｄ，对病毒的复制造成定的影响（Ａｌｗｉｎｅ，２００２）。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路的持续活化，参与病毒的致病过程（ＩｃｈａｓｏａｎｄＤｉｌｗｏｒｔｈ，２００１）。最近研究发现，ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路参与诱导ＩＳＧｓ的表达，这赋予了ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路更多的研究意义（ＥｚｅｌｌａｎｄＴｓｉｃｈｌｉｓ，２０１２。）ＰＲＲＳＶ感染过程中，也对ＰＢＫ／Ａｋｔ信号通路进行调控，促进自身的增適。在ＰＲＲＳＶ在感染单核细胞来源的巨晚细－ＤＣｓ胞（Ｍｏ）中，在感染后１．５ｈ和４ｈ活化ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路，但感染１２ｈ对该信号通路产生抑制作用（ＺｈａｎｇａｎｄＷａｎｇ，２０１０）。猪肺泡巨隨细胞是ＰＲＲＳＶ感染重要的帮细胞，２１ ＰＡＭ细胞为模型研巧；该信号通路对于揭示该病毒的复制机制和致病机理具有更重要的意义。研究发现，ＰＲＲＳＶ感ＲＣ－染ＭＡ１４５细胞过程中，在感染晚期激活该通路，并能够通过ＦｏｘＯｌ等分子介导病毒抗细胞调亡的作用；而ＰＲＲＳＹ感染ＰＡＭ细胞过程中，病毒感染５ｍｉｎ即可激活ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路Ｚｈｕｅｔａｌ．２０１３。病毒如何调控ＰＡＭ细（，）ｋ一胞中的相应分子来迅速活化ＰＤＫ／Ａｔ信号通路有待于进步的研究。１．５天然免疫限制性因子ＳＡＭＨＤ１与病毒感染在病毒感染的早期，先天性免疫反应发挥重要的抗病毒一道防线作用，是机体免疫防御的第，并能够诱导获得性免疫应答，巨唆细胞和树突状细胞在此过程中具有重要作用。目前研巧发现４种天然免疫限制性因子，其在病毒感染和增殖过程中发挥重要的抑制作用。ＴＲＩＭ５ａ，ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－（Ａ３Ｇ），Ｔｅ化ｅｒｉｎ（ＢＳＴ２）和ＳＡＭＨＤ１四种抗病毒限制因子，它们在病毒的脱壳、病毒复制过程中的基因组超变异、子代病毒的释放等方面发挥重要的限制作用ｌ．（Ｎｅｉｌｅｔａ，２００８；Ｓｈｅｅｈｙ巧ａｌ．，２００２；Ｓｔｒｅｍｌａｕｅｔａｌ．，２００４）。２２ １１ＳＡＭＨＤＩ．５．的结构与生物学特性ＳＡＭＨＤ１是最新发现的抗病毒限制性因子，其首先发一现于树突状细胞－，作为种ＩＦＮＹ诱导蛋白，其基因序列与鼠Ｍｉｌ基因具有高度同源性Ｌｉｅｔａｌ．２０００Ｌｉａｏｅｔａｌ，．（；，２００８。它包含ＳＡＭ和ＨＤ两个结构域，ＳＡＭ结构域在蛋）白与ＲＮＡ互作间发挥重要作用，而ＨＤ结构域具有两个高度保守的基序，其具有磯酸水解酶活性，介导ＳＡＭＨＤ１的一抗病毒作用（Ｒｉｃｅｅｔａｌ．２００９。ＳＡＭＨＤ１作为种核内定位，）蛋白，ＳＡＭＨＤ１基因发生突变后与人类疾病Ａ－Ｇｏｕｔｉ红ｅｓｄａｒｉｚ－ｉｃａｒｄｉｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＡＧＳ）密切先关巧ｍｎＮｕｎｅｚｅｔａｌ．２０１２Ｒａｍｅｓｈｅｔａｌ．２０１０Ｒｉｃｅｅｔａｌ．，２００９。目前，，；，；）ＳＡＭＨＤＩ的生物学特性还知之甚少，四聚体化对ＳＡＭＨＤＩ的生物学活性是必须的；ＳＡＭＨＤＩ的转录活性受到甲基化的调节（ｄｅＳｉｌｖａｅｔａｌ．，２０１３；Ｙａｎｅｔａｌ．，２０１３）。在某些细胞中，ＳＡＭＨＤＩ能够被Ｉ型干扰素诱导上调表达Ｃｈｅｎｅｔａｌ．（，２０１２ＣＤ４＋），但在树突状细胞、活化的Ｔ细胞、巨晚细胞、Ｔ淋己细胞中，Ｉ型干扰素无法诱导ＳＡＭＨＤＩ的上调表达；在单核细胞来源的巨處细胞中－１２和止－１８，忙能够诱导ＳＡＭＨＤＩ的上调表达（Ｐａｕｌｓｅｔａｌ．，２０１３）。内源性ＳＡＭＨＤＩ调控表达机制并不清楚（Ｃｒｉｂｉｅｒｅｔａｌ．２０１３ＳｔＧｅｌａｉｓｅｔａｌ．，；，２３ ２０１２。ＳＡＭＨＤｌ的限制活性受磯酸化调节，在增殖细胞中，）ＣｙｃｌｉｎＡ２／ＣＤＫｌ复合体能够与ＳＡＭＨＤ１相互作用，磯酸化ＳＡＭＨＤ１Ｔ５９２位氨基酸，导致ＳＡＭＨＤ１失去活性；而在増殖细胞中，并不存在ＣｙｃｌｉｎＡ２／ＣＤＫｌ复合体，ＳＡＭＨＤ１的活性并未被限制，能够发挥其生物学功能（Ｃｒｉｂｉｅｒｅｔａｌ．，２０１３Ｗｈｉｔｅｅｔａｌ．２０１３。；，）１２ＳＡＭＨＤｌ．５．功能与病毒感染－ＨＩＶ１病毒感染髓系细胞时，病毒进入细胞后无法正常复制，研究发现这些细胞内ＳＡＭＨＤｌ呈现高水平的表达，而在ＨＩＶ－１ｋａｔ细胞Ｔｌ细胞、易感的细胞（Ｔ细胞、Ｊｕ、ＳｕｐＵ９３７细胞）中表达量较低或者不表达ＳＡＭＨＤｌＬａｕｅｔｅｅｔ（ｇａ－ｌ．２０１１。ＳＡＭＨＤｌＨＩＶ１的感染明显增，）表达受到抑制后，强，因此推测ＳＡＭＨＤｌ在病毒感染的早期发挥抗病毒作用（Ｇｏｕｊｏｎｅｔａｌ．，２００７）。随后研究发现，ＳＡＭＨＤｌ能够抑制－曲Ｖ１病毒的逆转录过程。，进而对病毒复制产生抑制一ＳＡＭＨＤｌ分子构象研究发现，ＳＡＭＨＤｌ是种ｄＧＴＰ诱导的高效三磯酸盐水解酶，能够水解脱氧核巧Ｈ憐酸盐，产物为脱氧核巧和无机Ｈ磯酸盐，但对水解脱氧核昔和Ｈ磯酸亚基并没有水解作用，在病毒感染过程中ＳＡＭＨＤｌ水解细胞ＴＰ－内的ｄＮ，抑制ＨＩＶ１病毒的逆转录过程，抑制病毒的复２４ 制増殖（Ｇｏｌｄｓｔｏｎｅｅｔａｌ．２０１１。），病毒在不断进化过程中，利用自身编码蛋白来调控宿主的先天性免疫系统，从而有效逃避宿主的免疫防御，促进病。研究发现－２和毒的复制和感染，ｍｖ某些猴免疫缺陷病毒（ＳＩＶｓｍ／ｍａｃ）能够编码辅助蛋白Ｖｐｘ，招抗ＳＡＭＨＤ１的抗病毒作用，造成病毒对髓系细胞的有效感染；对其机制研究发孤Ｖｐｘ蛋白能够祀向降解ＳＡＭＨＤ１，利用宿主的泛素－蛋白酶体系统ｘ，Ｖｐ与宿主的Ｅ３泛素连接酶ＣＲＬ４ＤＣＡＦ１底物受体亚单位ＤＣＡＦ１蛋白结合，将ＳＡＭＨＤ１泛素化后降解，进而解除ＳＡＭＨＤ１对病毒感染的限制；这种限制性作用能够被泛素蛋白酶体抑制剂所解除Ｈｒｅｃｋａｅｔａｌ．２０１１Ｌａｕｅｔｅｅｔａｌ．２０１１。（；，）除逆转录病毒外，，ｇＳＡＭＨＤｌ也能抑制单纯疮疹病毒ＳＶ－１）（Ｈ在巨嗟细胞中的复制，在此过程中，ＳＡＭＨＤ１发挥其ｄＮＴＰ水解酶的活性，－抑制ＤＮＡ的复制１，从而抑制ＨＳＶ的増殖，其憐酸化活性并不影响病毒的増殖（Ｋｉｍｅｔａｌ．２０１３。ＳＡＭＨＤ１，）作为新发现的抗病毒因子，其抗病毒化制仍然在不断探索，是否有其他基因措抗ＳＡＭＨＤ１的抗病毒作用目前仍不清楚。病毒在不断的进化一，是否会出现定的变异，从而逃避ＳＡＭＨＤ１的抗病毒活性，仍需后续的实验证实。深入了解ＳＡＭＨＤ１的功能、调控机制及与其他疾病之间的关系，为研发新型２５ 抗病毒药物和揭示机体固有免疫新的机制，都具有深远的意义。１．６本研巧目的和意义目前，ＰＲＲＳＶ呈现出毒株的多样性与致病性的差异。病毒的基因组突变重组是ＰＲＲＳＶ逃逸宿主免疫识别与清一一除的重要特点之，也是新毒株产生的主要机制之。宿主天然免疫和特异性内在因素在加速病毒的变异与演化。深入理解ＰＲＲＳＶ变异与演化的本质及相关分子机制，对于进一步揭示ＰＲＲＳＶ的致病机制和提出新的抗病毒策略的提出具有积极的意义。ＳＡＭＨＤ１作为最新发现的天然免疫限制性因子，能够通过抑制ＰＲＲＳＶ基因组互补链ＲＮＡ（ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒＲＮＡｙ，ｃＲＮＡ）的合成，进而掉抗病毒的感染。而ＰＲＲＳＶ感染ＰＡＭ细胞过程中，能够显著上调ＳＡＭＨＤ１的表达。作为巨儀细胞嗜性的猪繁殖与呼吸综合征病毒，是否编码对抗ＳＡＭＨＤ１的蛋白及其相互作用机制如何，这些都是针对ＰＲＲＳＶ病毒感染的先天性免疫中亟待研巧；的问题。通过研究ＰＲＲＳＶ病毒感染与宿主限制性因子ＳＡＭＨＤ１么间的相互作用机制，期深入了解猪天然免疫系统在对抗ＰＲＲＳＶ一感染方面的作用，为进步进行抗病毒研究提供理论依据。２６ 第二章ＰＲＲＳＶ逃逸外界选择压力的研究猪繁殖与呼吸综合征Ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｉｒａｔｏｒｐｐｙｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＲＲＳ）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｎｄ一ａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｒｏｍｅｖｉｍｓ，ＰＲＲＳＶ）感染引起种急性、高度传ｙ染的病毒性传染病，对世界养猪业造成巨大的经济损失。然而，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＨＰ－ＰＲＲＳＶ）的出现，加大了对养猪业的危害一。ＰＲＲＳＶ难Ｗ控制的原因之在于病毒的致病和免疫机理并不十分清楚，因此，难研发安全、有效的疫苗来对该病进巧防控。一ＰＲＲＳＶ变异频繁、毒株多样，在感染过程中些宿主因素在加速病毒变异与演化。近年来，ＰＲＲＳＶ变种在不同地区出现，而这些变种可能是受不同外界因素筛选出的优势准种。这些因素多种多样，一其外界选择压是近年来广为关注的重要因素之。已有研究表明，Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒、新城疫病毒、Ｊ亚型禽白血病病毒等在外界选择压下均发生了有规律的基因变异并出现了抗原性的差异，进而能够逃避机体的限制作用成为优势准种。我们前期研巧发现，抑制细胞内糖原合酶激酶３ＳＫ－３（Ｇ）的縣酸化，能够显著抑制ＰＲＲＳＶ在ＭＡＲＣ－１４５细胞中的增殖ＳＫ－３。我们设想通过在外界选择压（Ｇ磯酸化抑制剂）下，对ＰＲＲＳＶ进行连续传代，找出重要的氨基酸突变位点。通过反向遗传技术找到与病毒感染复制、病毒毒力相关的重要氨基酸位点，试图揭示病毒复制与毒力演化的规律，为该病毒的预防和控制提供新的思路。２７ ２．１病毒和细胞２．１．１细胞和病毒ＭＡＲＣ－１４５细胞、ＢＨＫ－２１细胞由本实验室保存４周龄ＰＲＲＳＶ；抗原和抗体阴性仔猪，购买于上海市农业科学院。ＰＡＭ细胞的分离按照Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ等人（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔｅｔａｌ．，１９９１）介绍的方法进行。所有的动物实验均得到上海兽医研究所动物福利委员会认可，并按照其要求－进行操作。ＭＡＲＣ１４５细胞培养于含有１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基中－１６４０；ＰＡＭ细胞分离后，培养于含有１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ培°养基中；所有细胞均培养于含有５％Ｃ０２、温度为３７Ｃ的细胞培养箱中－ＰＲＲＳＶＨｕＮ４株及。高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＨＰ）－ＨＵＮ４－Ｆ－其致弱毒株１１２株滴定其ＴＣＩＤｓｏ后冻存于８０Ｃ备用。２．１．２抗体和试剂ｋ－／３（／）抗憐酸化Ａｔ（Ｓｅｒ４７３）、憐酸化ＧＳＫ３ａＳｅｒ２１９及其非磯（Ｃｅ－酸化兔单克隆抗体均购自ｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ公司；抗Ｐａｃｔｉｎ鼠单克隆抗ｍａ－Ａ体购自Ｓｉｇｌｄｒｉｃｈ公司；辣根过氧化物酶标记的抗鼠ＩｇＧ和兔ＩｇＧ－３抑ＳＫ－３－抗体购自Ｊａｃｋｓｏｎ公司；ＧＳＫ制剂Ｇｉｎｈ化ｉｔｏｒＸ：ＳＣ２２１６８９购自Ｓａｎｔａｃｍｚ公司，ＤＭＳＯ溶解，储存浓度为１０ｍＭ。－细胞培养用胎牛血清、ＤＭＥＭ培养基、０．２５％ＥＤＴＡ膜酶购自Ｇｉｂｃｏ公司；细胞培养平板、ＲＩＰＡ细胞裂解液、增强型ＥＣＬ发光试Ｔｈｅ＊剂盒购自ｒｍｏ巧８１１６１公司；硝酸纤维素膜购自Ｗｈａｔｍａｎ公司；牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、脱脂牛奶、蛋白酶抑制剂、ＰＭＳＦ购自２８ Ｓ－ｘ－ｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ公司。５蛋白上样缓冲液、曝光底片、ＷＳＴ１细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。ＲＮＡ提取试剂盒ＲＮｅａｓｍｉｎｉｋｉｔ购自Ｑｉａｅｎ公司；ＰｆＵＵｌｔｒａＩＩ化ｓｉｏｎＨＳＤＮＡｙｇｍｅ＾ＴＭＰｏｌｒａｓｅａｔａｒｉｔｒｓｔＳｔｒａｎｄｓｎｔｈｅｓｉｓｙ购自Ｓｔｉｇｅｎｅ公司；ＳｕｐｅｒＳｃｐｎｉＦｉｙｓｓ化ｍ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｅｎ公司；ＰＣ民产物胶回收试剂盒、质粒ＤＮＡ提ｙｇ、ＤＨ－５ａ感受态细胞、ＺｅｒｏＢａｃｋＦａｓＬ取试剂盒ｔｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ平末端连接试剂盒购自天根生物科技有限公司；ＰＲＲＳＶ抗体检测试剂盒购自ＩＤＥＸＸ公司。２丄３病毒感染和抑制剂处理ＰＡＭ细胞和ＭＡＲＣ－１４５－ｍｍ细胞培养平皿中细胞培养于６０，细－８０％４８ｈＯ胞密度约７０。细胞贴壁后，更换无血清培养基。后，５ＭＩＨｕＮ４株ＨＰ－ＰＲＲＳＶ病毒感染细胞，同时设置无病毒感染的细胞对照。病毒吸附１ｈ后，细胞用憐酸盐缓冲液（ＰＢＳ，ＰＨ７．４）漂洗两次后－ＰＲＲＳＶ感染细胞后，加入无血清ＤＭＥＭ培养基继续培养。ＨＰ不同时间点分别收取细胞样品进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。－１４－３ＭＡＲＣ５细胞首先用ＧＳＫ抑制剂预处理１ｈ后，不同感染剂量的ＰＲＲＳＶ感染１ｈ，吸附过程中加入抑制剂。吸附时间过后，用ＰＢＳ漂洗细胞２次，清除残余病毒粒子。加入新鲜的含有抑制剂的培养基继续培养至相应时间；含有相应浓度ＤＭＳＯ的ＤＭＥＭ培养基作为阴性对照。２９ ２丄４抑制剂细胞毒性实验ＳＴ－采用Ｗ１检测药物的细胞毒性，具体方法如下：１）细胞培养于９６孔板中，细胞长成单层后，弃去细胞培养液，ＰＢＳ漂洗细胞２次后，加入含有不同浓度药物的培养基，每孔１００＾ｉＬ，同时设置不加药物的细胞对照。每个药物浓度设置３个重复。２）细胞放入培养箱中继续培养至药物处理细胞所需的时间。—３）定时间后－１，每孔细胞中加入１０叫＾的ＷＳＴ溶液，继续培养２ｈ。４）培养结束后，９６孔板摇床轻微振荡１ｍｉｎ。＝５）ＯＤ４５０ｎｍ测定吸光度，计算细胞存活率（细胞的存活率药Ｘ物处理组吸光度／对照组细胞吸光度１００％）。２．１．５总ＲＮＡ的提取与ｃＤＮＡ的合成采用ＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔ按照说明书提取病毒总ＲＮＡ，ＲＮＡ提取后采用ＴｈｅｒｍｏＮａｎｏｄｒｏｐ浓度分析仪测定ＲＮＡ浓度，步骤如下；１）３００６００取件病毒原液，加入咕ＲＬＴ后，旋锅振荡充分裂解；２）样品中加入４３０ｉＬ无水乙醇，充分混匀；ｆ３７００、）｜ｉＬ样品加入离也柱中，１０，ＯＯＯｒ／ｍｉｎ，离也３０ｓ，弃掉废液；４、）离也柱中加入７００阵ｂｕｆｅｒＲＷ１，１０，０００ｒ／ｍｉｎ，离也３０Ｓ，弃掉废液；３０ ｆｅｒＲＰＥ＇５）离也柱中加入５００■ｌＬｂｕ，１０，０００ｒ／ｍｉｎ，离。３０ｓ，｜弃掉废液；６）重复步骤５；７）离也柱放回收集管中，１２，０００ｒ／ｍｉｎ，离也２ｍｉｎ；８１－ｒ）将离也柱放入新的．５ｍＬ收集管中３０ｉＬＲＮａｓｅｆｅｅ，加入｜ｗａｔｅｒ后，静置１ｍｉｎ后，１２，０００ｒ／ｍｉｎ，离也２ｍｉｎ，洗脱液为总ＲＮＡ。ＲＮＡ定量后，采用单链ｃＤＮＡ合成试剂盒民ｅｖｅｒｔＡｉｄ巧ｒｓｔＳｔｒａｎｄ°ｉ－ｃＤＮＡＳｎ化ｅｓｓＫｉｔ，合成ｃＤＮＡ８０Ｃ备ｙ，并保存于用。２．１．６细胞裂解和Ｗｅｓ化ｒｎｂｌｏｔ分析细胞裂解：细胞处理至相应时间后，进行细胞收集。首先，弃掉细胞培养上清，用预冷的ＰＢＳ轻轻漂洗细胞２次，每次充分吸弃残液。取适量加入蛋白酶抑制剂的ＲＩＰＡ细胞裂解液至细胞中，冰浴５ｍｉｎ；采用细胞刮将细胞从培养板中充分刮下１．５ｍＬ的离，并转移至必管中，充分满旋１５ｓ后，继续冰浴２０ｍｉｎ；１２，０００ｒ／ｍｉｎ离也１０ｍｉｎ后，弃掉沉淀，将上清转移至新的１．５ｍＬ离也管中。采用ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度后Ｘ，等量细胞上清中加入５蛋白’＇上样缓冲液－２０Ｃ，充分混匀后，沸水煮样１０ｍｉｎ后，样品保存至备用。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白凝－胶电泳：不同浓度的ＳＤＳＰＡＧＥ凝胶配制参照Ｔａｋａｒａ产品目录进行。待凝胶完全配制好后，每个蛋白样品定量后，２０ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝。鹏总蛋白上样，进行胶电泳调整电压至８０Ｖ进３１ 行电泳，待样品跑至分离胶时，调整电压至１２０Ｖ继续电泳直至漠龄蓝指示剂完全跑出胶面。ｂ－Ｗｅｓｔｅｒｎｌｏｔ：ＳＤＳＰＡ畑凝胶电泳结束后，将蛋白转印至硝酸纤维膜上进行ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。采用伯乐湿转电泳仪进行转印。转印前，将转印滤纸和ＮＣ膜完全浸入转印缓冲液中，并按照顺序将凝胶和ＮＣ膜放入转印夹并固定，将转印夹放入电泳槽内，加入适量的转印缓冲液进行转印。调整电压至１２０Ｖ，恒压电泳２ｈ后完成转印，整个过程中电泳槽始终处于冰浴的状态。转印完成后，ＮＣ膜采用含－２０的ＴＢＳ缓冲液订ＢＳＴ缓冲液）漂洗两次后有０．０５％吐温，放入含有５％的脱脂乳的ＴＢＳＴ缓冲液中，室温封闭Ｉｈ；封闭完毕后，用ＴＢ一ＳＴ缓冲液将ＮＣ膜上残余的脱脂现清洗干净后，进行抗僻育；将一抗按照一定稀释比例加入含有５％ＢＳＡ的ＴＢＳＴ缓冲液，并覆盖°Ｃ振日一至ＮＣ膜上，４荡赔育过夜，抗，ＮＣ膜用；次弃掉僻育的ＴＢＳＴ缓冲液漂洗—３次，每次５ｍｉｎ；抗漂洗完全后，加入适当比例稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温解育１ｈ；二抗赔育过后，ＮＣ膜用ＴＢＳＴ缓冲液漂洗３次，每次５ｍｉｎ；二抗漂洗完全后，进行ＥＣＬ显影。暗室中：１比，将ＥＣＬ发光液Ａ液和Ｂ液按照１例充分混合，并加至ＮＣ膜上，作用几分钟后，将ＮＣ膜放入曝光盒中进行曝光；曝光完毕后，将胶片放入显影液显影，待出现理想条带后，将胶片进行固定。２－－．１．７ＨＵＮ４Ｆ１１２袜ＧＳＫ３抑制剂突变株的筛选ＭＡＲＣ－１４５细胞培养于２４孔细胞培养板中，待细胞长至单层后，３２ －－１０浓度的ＧＳＫ３抑制剂预处理１ｈ后，ＨｕＮ４Ｆ１１２病毒感染１ｈ，一吸附过程中并加入抑制剂。吸附时间过后，用ＰＢＳ漂洗细胞２次，清除残余病毒粒子，之后加入新鲜的含有抑制剂的培养基继续培养４８ｈ；４８ｈ后，收集细胞及上清，反复冻融３次后，进行病毒滴定；滴定后的第一代病毒Ｗ同样的感染剂量、按照同样的方法再进行细胞传代；病毒传至第８代时，加大抑制剂剂量至２０ｌＭ继续传代至１４＾－－代。在传代过程中，不加ＧＳＫ３抑制剂的ＨＵＮ４Ｆ１１２作为对照同步进行传代。为排除细胞加入抑制剂后产生的某些因子会对病毒増殖产一４生影响，因此在每代病毒传代过程中，将细胞用抑制剂处理８ｈ后一，收集细胞和上清，冻融３次后，吸附于下代细胞，再按照抑制剂传代的方法进行病毒感染和病毒滴定。提取第０、６、１０、１４代筛选病毒的ＲＮＡ，进行高通量测序，分析病毒基因组突变规律。同时ｌｉｏ（ｄＴ）１８，利用Ｏｇ作为反转录引物，ＴＭ采用ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ皿ＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｓｙｓｔｅｍ获得病毒的ｃＤＮＡ；病毒ｃＤＮＡ作为模板，采用Ｚｈａｎｇ等人（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２０１１）建立方法中的６对扩增引物，ＰＣＲ扩增获得筛选毒株的全基因沮序列，ＰＣＲ扩增采用Ｐ化髙保真酶。将获得的６片段ＰＣＲ产物纯化后，连接至ＺｅｒｏＢａｃｋＢ－ｐ／ｌｕｎｔ载体，转化ＤＨ５ａ感受态细胞；ＰＣ民鉴定出阳性克隆一，送上海生工生物工程公司测序，进步分析鉴定病毒基因组突变规律。２．１．８重组突变病毒的构建与捶救－Ｆ１１２全长感染性戶ａｃＩｓｃ选取ＨＵＮ４克隆、ＭｅＩ、ｙｌＩ、，采用３３ 内切酶，将全长基因序列切割为Ｈ大片段，采用ｏｖｅｒｌａｐＰＣ民的方法，分别突变病毒基因组的核昔酸序列，再将突变的大片段连入全长感染性克隆获得重组感染性克隆质粒。全长重组质粒经测序最终获得嵌合病毒ｃＤＮＡ全长质粒。２丄９重組突变病毒的搔救利用全长质粒’３末端引入的Ｉ酶切位点，将构建好的全长ｃＤＮＡ质粒进行线性化，酶切体系如下；ＳｗａＩ２０ｉＬ＾ＮＥＢＢｕｆｆｅｒ３．１５０ｉＬ＾ＢＳＡ５Ｌｎ质粒ＤＮＡ２０｜ｉｇＨ２Ｏ补水至５００ｎＬ将漏合物置于°２５Ｃ水浴锅酶切过夜，酶切产物经胶回收纯化后，－２测定浓度后（ＴＣ保存备用。线性化ｃＤＮＡ体外转录：线性化全长ｃＤＮＡ进行体外转录按照ｍＭｅｓｓａｇｅＨｉｇｈＹｉｅｌｄＣａｐｐｅｄＲＮＡＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｋｉｔ体外转录试剂盒说明书进行，转录体系如下：３４ 线性化质粒模板ｕ；ｇＸＮＴＰ２／ＣＡＰ１０阵ＥｎｚｍｅＭｉｘ２ｊＬｙ｜Ｘ１０ｅａｃｔｉｏｎｆｆｅｒ２ｉＬＲＢｕ｜ＧＴＰ１曲Ｈ２０补水至２０咕°将混合物置于巧Ｃ作用１００ｍｉｎ。－２１细胞铺于６孔板内病毒搔救：转染前，ＢＨＫ，细胞密度７０％。二－Ｃ试剂说明书进行转染第天参照ＤＭＲＩ，具体步骤如下：－－ＭＥＭ的新离也管中加入１２含有１ｍＬ邸ｔｉｌＬＤＭＲＩＣ转染试＾剂。取２０ｌＬ的体外转录产物迅速加到上述离也管中，充，振荡泡匀＾－２１细胞中分混匀后立即加入到ＢＨＫ。细胞继续培养６小时换液，加°入含有２％血清的ＤＭＥＭ细胞维持液－８０Ｃ。转染２４ｈ后收集细胞，冻存。ＢＨＫ－２－１细胞收集后，转接ＭＡＲＣ１４５细胞中进行病毒的传代。‘－－将冻存于８０Ｃ的ＢＨＫ２１细胞冻酷后，４ｔ：、１２，ＯＯＯｒｐｍ／ｍｉｎ离也Ｃ－４５ｌＯｍｉｎ后，取上清接种至ＭＡＲ１细胞中，置于细胞培养箱中作用化后弃掉上清，加入含有２％血清的ＤＭＥＭ细胞维持液。接种４’－８０天后，观察细胞病变并收取细胞，Ｃ冻存。对捶救病毒在ＭＡＲＣ－１４５上进行病毒传代培养。２．１．１０重组择救病毒的酶切鉴定３５ ｕＮ４－Ｆ本实验室在构建Ｈｌ１２株感染性克隆时，在基因姐中引入一个Ｍｗ了Ｉ单酶切位点，作为鉴定捶救病毒的分子标记。病毒总ＲＮＡ提取后，参照ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｖｅｒｔＡｉｄＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ试剂盒的说明书合成病毒ｃＤＮＡ。该ｃＤＮＡ为模板ｙ，ＰＣＲ扩增重组病毒基因组片段。ＰＣ民产物经回收后，进行ＭｗＩ单酶切３ｈ。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定分析重组病。２．１．１１重组病毒间接免疫焚光（ＩＦＡ）鉴定－］＼４乂民（：１４５细胞培养于６孔板中，待其生长至９０％时，感染重组搔救病毒。病毒感染２４ｈ后，收集细胞进行ＩＦＡ检测。首先，４％中性甲酵固定细胞３０ｍ－ｉｎ，ＰＢＳ清洗３次后，用０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ１００室温通透°５ｍｉｎ，ＰＢＳ清洗３次后，细胞用１０％ＢＳＡ３７Ｃ封閉３０一ｍｉｎ，ＰＢＳ清洗３次后，蛋白单克隆抗体作为抗，１：２００稀释°Ｃ脾育１ＰＢＳ３次后－后，３７ｈ，清洗，ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ｌａｂｅｌｅｄｄｏｎｋｅｙ°－ｍｏｕ化ａｎｔｉＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ作为二抗，３７Ｃ赂育３０ｍｉｎ，ＰＢＳ清洗３次后，ＤＡＰＩ染色５ｍｉｎ，ＰＢＳ清洗３次后，将细胞置于倒置巧光显微镜下观察结果。同时设立未感染病毒的细胞作为阴性对照。２．１．１２重组撞救病毒生物学轉性分析ＭＡＲＣ－１４５细胞铺６孔板，细胞密度约９０％。重组捶救病毒Ｔａ〇－５〇测定后，按０．１ＭＯＩ的剂量感染ＭＡＲＣ１４５细胞和ＰＡＭ细胞，感染１ｈ后，弃掉感染液，ＰＢＳ洗涂两次，加入含有２％血清的ＤＭＥＭ培养基继续培养，分别在感染后１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ、６０３６ ｈ、７２ｈ、８４ｈ、９６ｈ收取细胞上清。对不同时间点的样品进行病毒ＴＣＩＤ测定－１４５细胞和ＰＡＭ细胞上的多步生长ｓｏ，并绘制病毒ＭＡＲＣ曲线。２．２结果２－．２．１ＧＳＫ３ｉｎｈ化ｉｔｏｒＸ对细胞活性的影响－１对不同浓度的抑制剂进行细胞毒性的测定采用ＷＳＴ，药物浓：２０ｉＭ２５ｉＭ。细胞活性检测发现度分别为＾，＾，高浓度的抑一，因此选取合适的抑制剂浓度为制剂对细胞活性产生定的影响：１０ｉＭ（图２．１）。｜Ｇ－ｉｒ注；３ｉｉｈ化ｉｔｏＸ■ＭＡＲＣ－１４５ｃｅｌｌｓＡ。曲１０２０２５Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｉＭ）｜－２１图．不同巧度Ｇ化３ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＸ对细胞活性的影响－Ｆ－ｉ２．１ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｆＧＳＫ３ｉｎｈｉｂｉｔｏＲＣ１４ｌｌｒｌｉｆｒｉｉｈｇ．ｏｒＸｏｎＭＡ５ｃｅｐｏｅａｔｏｎｗｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．２－．２．２ＧＳＫ３的活性与ＰＲＲＳＶ的増殖密切相关一ＧＳＫ－３作为Ａｋｔ下游重要的信号分子，是种广泛存在的丝氨酸３７ ／苏氨酸蛋白激酶，能够调节下游多种信号分子来调控细胞的生理活动，包括新陈代谢、细胞周期、増殖和分化等。目前已经证实多种小ＳＫ－分子化学药物能够有效的抑制Ｇ３的活性，包括Ｌｉ化ｉｕｍ、ＳＢ－２１６７６３、ＳＢ－４１５２８６、６ＢＩ０和６ＢＩ０ｄｅｒ等，６ＢＩ０和６ＢＩ０ｄｅｒ可－ｈｎ－抑制ＨＩＶ１的转录进而阻止Ｔａｔ诱导的神经毒性作用（ＫｅＨａｌｌｅｔａｌ．，２０１１ｋｈ－１。研究发现，Ｌｉｕｍ能有抑制扭Ｖ在ＰＢＭＣｓ和ＴＮＦ刺激的）Ｊ１２００８－３或．１细胞中的ｕｍａｒｅｔａｌ．ＧＳＫ复制（Ｋ，）；许可作为治疗ｎｅｕｒｏＡ２００７ＧＳＫ－３的重ＩＤＳ的鞭点（Ｄｅｗｈｕｒｓｔｅｔａｌ．）。基于要作用，，一－３的ＳＶ增殖过程中可能定作用我们推测ＧＳＫ抑制剂在ＰＲＲ具有。１０－３ＳＫ－３ＭＡＲＣ－ｘＭ浓度的ＧＳＫ抑制剂Ｇｉｎｈ化ｉｔｏｒＸ预处理１４５｜－Ｆ细胞１ｈ后，感染１ＭＯＩＨＵＮ４１１２病毒１ｈ，ＰＢＳ漂洗细胞去除残余病毒后，加入含有１０＾ｌＭ浓度的新鲜无血清ＤＭＥＭ培养基，维续培养至４８ｈ。病毒感染４８ｈ后收集细胞进行ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析并收集细胞和上清，反复冻融３次后，上清进行病毒滴度的测定。ＳＫ－－Ｆ１１２的增殖实验发现３抑制剂能够明显抑制ＨＵＮ４，，Ｇ并且－Ｆ这种抑制作用具有剂量依赖性；１ＭＯＩＨＵＮ４１１２感染细胞后，不同－３ＨＵＮ４－Ｆ１１２増殖的Ｍ、浓度的０化抑制剂抑制程度具有差异，１ｉ＾０－１扣４、２０的４浓度的抑制剂处理细胞分别导致病毒滴度下降０．４、ｉＧ－－－１．９和３．３ｌｏ（图２．２Ａ）。不同的病毒感染剂量ＧＳＫ３ｉｎｈ化ｉｔｏｒＸｇ，抑制病毒増殖的程度也不同－３抑制；２ＭＯＩ病毒感染后，ＧＳＫ剂导致病毒滴度出现明显下降－３抑；而１０ＭＯＩ病毒感染后，ＧＳＫ制剂则无－法有效抑制病毒的増殖（图２．２Ｂ）。同样Ｍ浓度的ＧＳＫ３抑，２０ｎ３８ ｗｕＮ４２－ｂ（制剂也能有明显抑制Ｈ株的增殖．，病毒滴度下降约２ｇ图２．２０〇ＡＢ＂ｊ国ｄｍｓｏ■ＤＭＳＯ！－ｍ．－－３》ＧＳＫｉｎｈｉｂｉｏｒｔＸ□６ＳＫ－Ｊ６３ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＸｇ＾ｓ＊■■麵ＨｉＩ１１１ｊｈＩＩＩｉＭＭ２０Ｍ２ＭＯＩｌＯＭＯＩ１０ｆｐｍＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｃＩ■ＤＭＳＯ－＞［！：ＧＳＫ３ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＸ■Ｚｌ．ｉ２０Ｍｍ－图２．２ＧＳＫ３ＩｎｈｉｂｉｔｏｒＸ抑制ＰＲＲＳＶ的増殖Ｆ２－ｒｉ．２ＩｔｉｏｎＧ３ｒｅｄｕｃｅｄＰ民民ＳＶｏｅｎｙｖｉｒｕｓｇ．ｎｈ化ｉｏｆＳＫｐｇｓＭ和２０抑制后－Ｗｅｋｍｂｌｏｔ分析发现，加入１０，ＧＳＫ３磯ｎ－酸化被显著抑制，进而促进了ＧＳＫ３蛋白的活性，并且随着抑制剂浓度的加大，蛋白礎酸化抑制程度更加明显，细胞内ＰＲＲＳＶＮ蛋白（的表达量也明显下降图２．３）２－－．２．３ＨＵＮ４Ｆ１１２株ＧＳＫ３抑制剂突变株的筛选－－Ａｋｔ下游信号分子ＧＳＫ３的抑制剂Ｇ化３ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ，能够显著－－抑制ＰＲＲＳＶ在ＭＡＲＣ１４５细胞中的复制。同时，我们在ＧＳＩＣ３抑制剂持续存在的条件下，，筛选对抑制剂耐受的突变病毒。结果发现当ＨＰ－Ｐ民ＲＳＶ细胞致弱病毒株（ＨＵＮ４－Ｆ１１２）在１０浓度的抑制３９ 剂条件下连续传代一８代后，病毒滴度出现定程度的上调趋势，并逐＇側幽隊備睡雌可、—曲麟解ｕ－－ＧＳＫ－３捆賴藝ｐ＇＂Ｋｉ＊阳顏＂ｍｍｍｒｎ－＞ｗ＞ｉ？ｍｍｍａｃ晒ｉ＂ｗＫｍｔｉｎｐｕ－Ｎ－２化－图．３ＧＳＫ３ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＸ抑制Ｇ３的踞酸化和ＰＲＲＳＶ増殖Ｆｉ２ＴｈｈｏｈｏｒｆＧＳＫ－；ｈｒｉｇ．．３ｅｓｌａｔｉｏｎｏ３ａｎｄ１ｅｏｌｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＰ民民ＳＶｗａｓｉｎｈａｂｉｔｅｄｐｐｙｐｂＧＳＫ－３ｉｎｈｙｉｂｉｔｏｒＸ－－ＨＵ．Ｎ４Ｆ１１２－ｍ－ＧＳＫ－Ｆ１１２■？Ｎ￡〇ｅｇａｔｉｖｅＣｏｎｔｒｏｌ—晏２－丄Ｑ一■Ｉ■Ｉ■■■１三３４５６７８９１０１１１２Ｕ１４Ｐａｓｓａ货ｇ－－图２．４ＨｕＮ４Ｆ１１２在ＧＳＩＣ３ｉｎｈ化ｉｔｏｒＸ抑制剂中传代病毒滴度－Ｆｉ２４Ｔｈｖｉ－．．ｅｒａｌｔｉｔｅｒｓｏｆＨｕＮ４Ｆｌ１２ａｓｓｅｄＧＳＫ３ｉｉｂｇｐ巧ｉｎｎｈｉｔｏｒＸ渐接近对照组的病毒滴度；第９代后，加大抑制剂的浓度到２０继续传代，病毒滴度开始时出现明显下降，但又逐渐上调，病毒在抑制剂中传代１４代后，病毒滴度离于未添加抑制剂的对照组的水平（图２＊＜０＊＊＜０－．４）（：．０５；．０）ｐ；ｐ１。将筛选到的Ｇ化３抑制剂耐受的ＰＲＲＳＶ突变株进行全基因高通量测序，并与对照组病毒基因组进行序列对比发现，抑制剂耐受病毒基因组中６个核昔酸的突变可导致病毒氨基酸的突变，分别发生于Ｎｓｌ２和ＧＰ３蛋白各发生ｐ１个氨基酸的突变，４０ 而Ｎｓ２和ＧＰ４分别发生２个氨基酸的突变。该结果暗示这６个氨基ｐ－酸可能在病毒复制过程中，单独或相互协调对ＧＳＫ３信号通路进行调节。氨基酸突变位点如下：ＶｉｒｕｓＧｅｎｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＡｍｉｎｏａｃｉｄＡ１２０１ＧＮ４０１ＤＳＰＧ２３８３ＡＤ７９５ＮＮｓｐｌ２Ｃ３６１ＴＲ１２１ＷＧ巧Ｃ６１０ＴＰ２０４ＳＧＳＫ－Ｆ１１２Ｔ１３ＣＦ５ＬＣ６５ＴＡ２２Ｖ２．２．４重组病毒ＧｅｎｏｍｉｃＭａｒｋｅｒ检测提取搔救病毒的ＲＮＡ，经反转录后，ＰＣ民扩增病毒基因组序列后，进行ＭｗＩ单酶切鉴定。琼脂糖凝胶电泳结果显示，病毒基因组片段出现两条带．５）。，证明重组病毒捶救成功（图２Ｍｌ１２３４５Ｍ２２６２５ｂｐ—？２５ＭｗＩ酶切图．捶救病毒基因组片段鉴定结果Ｆｉ２５ＴｈｅｄｖｕｄＭｌｕＩｇ．．ｅｎｏｍｅｏｆｒｅｓｃｕｅｉｒｓｉｅｓｔｅｄｂｇｇｙＭ－－３ｌ：ＤＬ１５０００Ｌ１：ＨｕＮ４Ｆｌ１２ａｒｅｎｔｖｉｒｕｓＬａｎ２：ｒＧＳＫＦｌ１２Ｌａｎｅ：，ａｎｅｅ；ｐ；；Ｆ２－ＮＬａｎ－－ＦｒＧ１１ｓＭｅ４：巧１１２ｓＭＬａｎｅ５出ＵＮ４１１２Ｍ２：ＤＬ２０００ｐ；ｐ：；；，４１ ２．２．５间接免疫巧光鉴定结果采用ＰＲＲＳＶＮ蛋白单克隆抗体对重组突变病毒进行ＩＦＡ检测，结果均出现特异的焚光．６）。，证明重组突变病毒捶救成功（图２－ＡｎＩＭｔｉＮＤＡＰｅｒｇｅｒＨｕＮ４－Ｆ１１２ｒＦ１１２＾ｓｐＭｒＧＳＫ－Ｆ１１２ｒＧＦｌＵ－ＮｓｐＭｆＳ＾ＳＳＳ图２．６重组突变病毒间接免疫巧光鉴定结果Ｆｉ２６ｆｉｉｒｉＩＦＡｇ．．Ｉｄｅｎｔｉｃａｔｏｎｏｆｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｒｕｓｅｓｂｙ２．２．６重组逐救病毒生长特性分析－重组病毒搔救后测定ＴＣＩＤｓｏ，在ＭＡＲＣ１４５细胞和ＰＡＭ细胞－中分析其生长特性。ＭＡＲＣ１４５细胞中多步生长曲线结果显示，重组－Ｆｒ－Ｍ生长曲线与亲代病毒ｒ－病毒ｒＧＳＫ１１２、Ｆ１１２ｓｐＨｕＮ４Ｆ１１２相比，－ＮｓＭ同亲代病毒相比没有太大的差异；但重组病毒ｒＧＦ１１２ｐ，病毒（－在感染的早期１２ｈ４８ｈ），病毒滴度出现了盈著的下降（图２．７Ａ）。－ｒ－Ｍ病毒滴度在复但在ＰＡＭ细胞中，重组病毒ｒＧＳＫＦ１１２和Ｆ１１２ｓｐ４２ 制前期（１２ｈ－４８ｈ）显著高于亲代病毒ｒＨｕＮ４－Ｆ１１２（图２．７Ｂ）ＡｒＨｕＮ４．８］Ｉ—－ｒＧＳＫＦ１１２吉７－胤－１１２ＮｓＭ５６－ｐ冬－ｒＦ１１２ｓＭ５－八ｐＨＮ４－１２－ｒｕＦ１§４＾＊ｔ３－＾§２－－１０１２２４；３６４８６０７２８４９６ｈｔｏｕｒｓ．ｉ．ｐＢＡ５－Ｅ１－？－ｕＮ４＾ｒＨｕＮ４－－＊書４ｒＨＦ１１２９－Ｆ１１２ｒＧＳＫ０－３ＧＦｉｉ－ｌＮｌＭｒ２ｓｐ…今…。哪＾２－１＇＇－＇．＇－三ＳＴ望化２Ｌｃ〇ｕ「ＩＩＩＩＩ１ＩｒＴ＞１２２４３６４８６０７２８４９６Ｈｏｕｒｓｐ．ｉ．图２．７重组突变病毒在不同细胞中的生长曲线－胞Ａ：ＭＡＲＣ１４５细；Ｂ：ＰＡＭ细胞Ｋｇ．２．７Ｇｒｏｗ化ｃｕｒｖｅｓｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｉｒｕｓｅｓｉｎｄｉｆｅｒｅｎｔｃｅｌｌｓＡＭＡＲ－１４５ｌｌＢＰＡＭｃｅｌ：Ｃｃｅｓ；ｌｓ；２．２．７重组挺救病毒增强Ａｋｔ的憐酸化水平Ｓｅｒ４７３位氨基酸的稱酸化状态体现了Ａｋｔ的活化程度。前期研究－证实，ＰＲＲＳＶ感染ＭＡＲＣ１４５细胞过程中，Ａｋｔ磯酸化在病毒感染ｍ－后的５ｉｎ１０ｍｉｎ出现了明显的上调，感染１ｈ后恢复到基本水平；到病毒感染一直持续至感１２ｈ后，Ａｋｔ磯酸化又出现了明显的上调并染后２４ｈ（Ｚｈｕｅｔａｌ．，２０１３）。是否重组突变病毒对该通路的调控出现４３ 了变化并不清楚．因此，我们首先检测了Ａｋｔ在重组ＰＲＲＳＶ感染过程中的活化程度－。ＨｕＮ４病毒感染ＭＡＲＣ１４５细胞后，不同时间点收取细胞样品－，进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测。结果发现ｒＧＳＫＦ１１２，重组病毒＊－－和ｉＦ１１２ｓＭ在感染ＭＡ民Ｃ１４５细胞过程中ｐ（１２ｈ和２４ｈ），与亲代－Ｆ１１２相比病毒ｒＨｕＮ４，能够显著增强Ａｋｔ的磯酸化（图２．８）。ＭＡＲＣ－１化细胞玄，／护参冷許式拿／／／＾／省／／／麵■＂亀ｍｒｎｍｒｎｒｎｍｍｍｍｍｍｍｍｒｎｍｍｍｍｐ＿Ａｋｔｍｍｍｍｍｍｍｍｍ各ｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｔｍｍｍｉ■■■■－ｍｒｎ■—＂ｉｉｈ？ｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｒｎ■ＰＩＴＩＴＯＲ？ｈｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍ—？ＨＭ？ｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍ１７１下ＯＲｗｍｍｍ＇ｍｍｍｍｍｍｍｍｍｍ－Ｇ－ｍｍｍｗｍｍｍｍｍｍｐＳＫ３ａ／６ｍｍ…――…ＲＳＶＭ＿＿—ｏｇｉｉｉｉ＾ＩＡ广１１ｎ一一ｗ？？？ＢＨＵＨ＾ｒ０．３０．９０．５０６０Ｔ０．．．８０．７０．２ｉ．６０７１．００．６１２ｈｐ丄２４ｈｐ丄２－图．８重巧突变病毒感染ＭＡＲＣ１４５细胞增强Ａｋｔ的踞酸化Ｆ－ｉｇ．２．８ＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆＡｋｔｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｉｎＭＡ民Ｃ１４５ｃｅｌｌｓｉｎｆｅｃ化ｄｂｙ化ｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｉｒｕｓｅｓ．ＰＡＭ细胞作为ＰＲＲＳＶ感染的帮细胞，探索病毒感染细胞过程中是否对ＰＢＫ／Ａｋｔ信号通路进行调控将更有意义。前期研究发现，－ＨＰＰＲＲＳＶ感染ＰＡＭ细胞的过－ｉｎ程中，在感染５ｍ３０ｍｉｎ后迅速激活ＰｔＩ３Ｋ／Ａｋ信号通路，但这种激活程度只是瞬时的，在感染４５ｍｉｎ４４ 后恢复至基本水平；且在感染后期，Ａｋｔ磯酸化并无出现上调的现象。因此，为了探索重组病毒感染ＰＡＭｓ后对Ａｋｔ磯酸化的影响，感染和未感染重组病毒的ＰＡＭ细胞，在感染后６ｈ和１２ｈ后收取细胞样品进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果发现，与之前研究结果不同的是，－重组突变病毒ｒＧＳＫＦ１１２和巧－１１２ｓＭ在感染ＰＡＭ细胞过程中ｐ，ＰＡＭ细胞在感染过程中．９）。，出现了ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路的活化（图２ＰＡＭ细胞省ｙ／／／冶ｙ舍／ＶＭＷＭＭＦ４ＭＢＭＭＨＶ一？－－－？－－一，？？—ｒ舍ｐＧＳＫ３ａ／３，，｜弓｜｜＊—－—■－—一——ｐｍＴＯＲｔｍ編ｍｍｍｍｍｍｍｍｒｎｍｍｍｍｍｍｍｍｒｎｍｇｐｗＢｉＢ＾ｍｉｍｍｍｍｍ．ｆＴｌＴＯＲ＾ｍｎｎｉ＾－ａｃｔ口ｉｎ０．２０．７０．３０．．．３１２０．２０．２０．５０．４０３１．２０．３６ｈ丄ｐ１２ｈｐ丄图２．９重组突变病毒感染ＰＡＭ细胞增强Ａｋｔ的槐酸化Ｆｉｇ．２．９ＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆＡｋｔｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｉｎＰＡＭｃｅｌｌｓｉｎｆｅｃｔｅｄｂ化ｅｙｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｉｍｓ的．２．３讨论细胞调亡和细胞存活对病毒的感染和复制具有重要的影响，许多４５ 病毒会通过ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路来调控细胞的存活Ｂｕｃｈｋｏｖｉｄｉｅｔａｌ．，（２００８ＤｕｎｎａｎｄＣｏｎｎｏｒ２０１２Ｗｅｉｅｔａｌ．２０１。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ，，信号通路在；；巧ＰＲＲＳＶ感染单核细胞来源的巨處细胞中，在感染早期出现明显活化，但后期又被抑制（ＺｈａｎｇａｎｄＷａｎｇ２０１０。ＰＤＫ／Ａｋｔ信号通路的活化，）状态在ＰＲＲ一ＳＶ感染的过程中并不是种普遍的现象。我们研究发现，ＰＲＲＳＶ感染ＭＡＲＣ－１４５细胞过程中，能够在感染早期和晚期分别激活ＰＤＫ／Ａｋｔ信号通路；然而在感染其祀细胞ＰＡＭ细胞时，则只在感－Ａｋ染早期５ｍｉｎ３０ｍｉｎ活化ＰＩ３Ｋ／ｔ通路，感染４５ｍｉｎ后，又恢复至基本水平ｔ。灭活病毒赔育细胞时，Ａｋ的明显磯酸化只出现在ＰＡＭ细胞中－１４５细，ＭＡＲＣ胞并没有出现明显的变化。ＰＲＲＳＶ感染巨暖一Ｃ－１４５细胞时细胞和ＭＡＲ，其侵入的机制具有定的差异（Ｄｅｌｍｅｅｔａｌ．，２０１０）。因此，我们推断ＰＲＲＳＶ感染ＰＡＭ过程中，其侵入过程与／ｔ通路的活化密切相关－ＰＩ３ＫＡｋ，而感染ＭＡＲＣ１４５细胞时，可能采取其他的活化途径，不同的侵入途径导致ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ活化的机制不同。－－我们推测ＰＲＲＳＶ在感染ＰＡＭ细胞、ＭＡＲＣ１４５细胞、ＭｏＤＣｓ细胞病毒调节Ｐ一过程中Ｉ３Ｋ／Ａｋｔ活化的机制具有，定的差异。多种病毒在感染宿主细胞的过程中，能够通过调节宿主的细胞内的相关信号通路来促进自身的有效感染，进而影响宿主细胞的生理和病理过程。因此，了解病毒感染过程中细胞内相关信号通路的变化，对于研究病毒的致病机理和制定新的抗病毒策略具有重要的意义。ＰＤＫ／Ａｋｔ信号通路在多种病毒的复制增殖的不同过程中具有重要的作用（ＤｕｎｎａｎｄＣｏｎｎｏｒ，２０１２，它能够调节埃博拉病毒侵入宿主）４６ 细胞的过程，控制沙粒病毒的出芽和调控不分节段的负链ＲＮＡ病毒基因组ＲＮＡ的合成（Ｓｕｎｅｔａｌ．２００８。多种促调亡蛋白的已经被证实，）ｋ－－为Ａｔ分子下游重要的鞭蛋白ｌ２家族的Ｂａｄ、ＧＳＫ３ａ／３、，包括Ｂｃ（ｍＴＯＲ和ＦｏｘＯｌ转录因子家族ＢｕｒｅｒｉｎａｎｄＫｏｓ２００２Ｃｒｏｓｓｅｔａｌ．（ｇｇｐ，；，２００３９９６＊１９９５Ｎａｋａｅｅｔａｌ．Ｚｈａｅｔａｌ．１ＺｈｏｕａｎｄＳｎｉｄｏ２００５。作为；；，；，），Ａｋ－－３ａ－ｔ下游重要的调控分子ＧＳＫ３具有２种亚型：ＧＳＫ和ＧＳＫ３０。ＧＳＫ－３在正常的情况下能够使糖原合酶磯酸化Ｐ，使其失去活性，导ｋｔＳＫ－３致糖原合成减少；而Ａ磯酸化ＧＰ后，抑制其活性，进而恢复糖原合成酶的活性－３在细胞生长，促进细胞摄取能量；可见，ＧＳＫＰ和血糖稳态调控中发挥重要作用（ＦｒａｍｅａｎｄＣｏｈｅｎ，２００１）。采用ＧＳＫ－３憐酸化抑制剂发现ＧＳＫ－３的，磯酸化收到明湿的抑制，促进－３的－了ＧＳＫ活化同时病毒的增殖也受到了明湿的影响。ＧＳＫ３抑制剂抑制ＰＲＲＳＶ增殖的作用具有剂量依赖性，但大剂量病毒感染后，ＧＳＫ－３抑帝ｉＳＫ－３的磯酸化对ｊ剂抑制病毒增殖的作用不明显，可见Ｇ于ＰＲＲＳＶ增殖是必须的－３抑制。在ＧＳＫ剂持续存在的条件下对ＨＵＮ４－Ｆ１１２持续传代发现２、Ｎｓｌ２、ＧＰ３、ＧＰ４蛋白上出现了，Ｎｓｐｐ氨基酸的突变。Ｎｓｐ２蛋白是ＰＲＲＳＶ中能够发最易变异的重要蛋白，具有半脱氨酸蛋白酶活性，同时，Ｎｓｐ２蛋白在病毒复制和调控病毒的先天性免疫方面具有重要作用巧ｕｎｅｔａｌ．２０１０。ＧＰ３和ＧＰ４蛋白，）是病毒的糖基化蛋白，在病毒入侵的过程中发挥重要作用Ｍａｒｄａｓｓｉｅｔ（ｌａ．１９９６Ｗｉｓｓｉｎｋｅｔａｌ．２００５Ｎｓ２能Ｉ２；型ＩＦＮ的产生，Ｎｓ，；，）ｐ够下调ｐ具有ＣＰ活性和解离活性ＩＳＧｓ和ＮＦ－ｋＢ信号通路中，其解离活性在４７ 发挥作用，ＣＰ活性能够抑制ＩＲＦ３的磯酸化和入核（Ｌｉｅｔａｌ．，２０１０）。Ｎｓｐｌ２蛋白的具体功能目前并不十分清楚。四种蛋白中氨基酸位点的突变是否增加了病毒的复制和侵入细胞及调控细胞内信号通路的一能力，需要进步的实验证实。因此，通过反向遗传技术，获得了３－－Ｍ－Ｍ－种重组病毒，ｒＧＳＫＦ１１２、ｒＧＦ１１２Ｎｓｐ和ｒｉＦ１１２ｓｐ。在ＭＡＲＣ１４５细胞中生长曲线分析发现－ＮｓＭ在，同其他突变病毒相比，ｒＧＦ１１２ｐ病毒复制的前期。而在ＰＡＭ细胞中，该重，滴度显著低于亲代病毒组病毒的増值能力与其他重组病毒差异较大。因此，我们推测Ｎｓｐ２一定的影响蛋白上的氨基酸突变对病毒的复制具有；结构蛋白ＧＰ３和ＧＰ４蛋白的突变对病毒的感染具有重要的作用。对Ａｋｔ憐酸化分－－Ｍ能够显著增强Ａｋ析发现，ｒＧＳＫＦ１１２和ｒＦ１１２ｓｐｔ的磯酸化，可见，结构蛋白中氨基酸的突变对病毒的复制、侵入ｙＡ及调控细胞内信号通路的能力占主导地位。－ＰＲＲＳＶ在感染细胞的过程中因此，该研究结果表明，ＨＰ，Ａｋｔ下游的ＧＳＫ－３信号分子与病毒感染增殖密切相关，并且可Ｗ作为预防ＰＲＲＳＶ感染的觀点。结构蛋白ＧＰ３和ＧＰ４中氨基酸的突变，对病毒的感染入侵具有重要的作用。通过研巧ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路介导的细胞存活与病毒感染之间的关系，对于该病毒的防控具有重要意义。４８ 第兰章ＳＡＭＨＤｌ表达调捏化制研究当病原侵入细胞后，细胞首先通过模式识别受体来识别非自身的病原相关分子模式，活化Ｉ型干扰素信号通路来发动抗病毒免疫反应Ｋｕｍａｒｅｔａｌ．２０１１Ｌａｚｅａｒｅｔａｌ．２０１３ＷｉｌｋｉｎｓａｎｄＧａｌｅ２０１０。ＴＬＲ（；；，），，－受体和ＲＩＧＩ样受体在识别病原分子模式中发挥重要作用，不同的受体识别不同的模式分子ＢｌａｓｉｕｓａｎｄＢｅｕｔｌｅｒ２０１０ＫａｗａｉａｎｄＡｋｉｒａＯ，；，２０１１；ＬｏｏａｎｄＧａｌｅ，２０１１；ＲａｍｏｓａｎｄＧａｌｅ，２０１１），进而通过不同的激酶活化下游的效应分子－Ｉ，如ＩＲＦ３、ＩＲＦ７和ＮＦｋＢ等诱导型ＩＦＮ的产生。ＩＦＮｓ在细胞受到感染时，能够阻止病毒的复制和扩散。然而，许多病毒在进化过程中能够逃避或者抑制宿主的免疫系统，来促进自身的有效感染（Ｂｅｕｒａｅｔａｌ．，２０１０；Ｇｒａｎｄｖａｕｘｅｔａｌ．，２００２；Ｌａｚｅａｒｅｔａｌ．，２０１３Ｌｕｏｅｔａｌ．２００８Ｐａｔｅｌｅｔａｌ．２０１０Ｓｃｈｏｉｎｓｅｔａｌ．２０１１。；；；，，ｇｇ，）ＳＡＭＨＤ－作为最新发现的天然限制性因子ｌ１，能够阻止ＨＩＶ病毒的感染。目前，ＳＡＭＨＤ１调控表达机制并不清楚Ｃｒｉｂｉｅｒｅｔａｌ．２０１３（，；ＳｔＧｅｌａｉｓｅｔａｌ．，２０口）。同样作为先天性免疫限制性因子的Ｔｅｔｈｅｒｉｎ，也能够被干扰素诱导上调表达。研究发现，在树突状细胞中其能够作－３为ＩＦＮ产生的负调控因子。过表达ＩＲＦ１、活化形式的ＩＲＦＷ及ＩＲＦ７均能够上调Ｔｅ化ｅｒｉｎ的表达。水泡性口炎病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞时能够直接上调Ｔｅｔｈｅｒｉｎ的表达，在此过程中，干扰素调节通路中的重要分子ＩＲＦ７发挥了重要作用。Ｔｅ化ｅｒｉｎ的表达上调是机体早期先天性免疫反应（Ｂｅｏｅｔａｌ．２０１２。ｇ，）４９ ＳＡＭＨＤｌ首先发现于树突状细胞，基因序列与鼠Ｍｉｌ基因具有Ｌｉｅｔａｌ．２０００Ｌｉａｏｅｔａｌ．２００８。研究发现高度同源性，在人某些细（，；，）胞中，ＳＡＭＨＤｌ能够被Ｉ型干扰素诱导上调表达（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，２０１巧，如Ｈ化ａ细胞、ＨＥＫ２ＷＴ细胞等。但在树突状细胞（ＤＣｓ）、活化的＋Ｔ细胞、巨晚细胞、ＣＤ４Ｔ淋己细胞中，Ｉ型干扰素无法诱导ＳＡＭＨＤ１＋的上调表达，并且在ＤＣｓ和ＣＤ４Ｔ淋巴细胞中过表达ＳＡＭＨＤ１，虽一然细胞内ｄＮＴＰ水平出现了定程度的下降－１，但无法抑制ＨＩＶ感染－ＳＧｅ－ｔｌａｉｓｅｔａｌ．２０１２。在单核细胞来源的巨晚细胞中，比１２和止１８（，）能够诱导ＳＡＭＨＤ１的上调表达，但其诱导机制并不清楚Ｐａｕｌｓｅｔａｌ．（，２０１３。是否干扰素相关通路同样能够调控ＳＡＭＨＤｌ的表达及其调控）机制如何。，目前仍不清楚ＳＡＭＨＤｌ能够在多种细胞中表达，但在髓系细胞中表达量最髙，且能够被Ｉ型干扰素诱导上调表达。前期实验中，本实验室扩增获得了猪ＳＡＭＨＤｌ的全基因序列并制备了其单克隆抗体，为后续实验奠一定的基础定；过表达猪ＳＡＭＨＤｌ和猴ＳＡＭＨＤｌ发现，其能够显－著抑制ＰＲＲＳＶ在ＭＡＲＣ１４５细胞中的増殖。因此，开展ＳＡＭＨＤｌ调控机制的研究，能够为后续抗病毒研巧提供前期的理论基础。－ＭＡＲＣ１４５细胞作为研究ＰＲＲＳＶ感染的有效工具细胞，ＰＡＭ细胞作为ＰＲＲＳＶ感染的主要範细胞，是否ＳＡＭＨＤｌ也是Ｉ型干扰素诱导蛋白及其调控机制目前并不清楚。因此，阐明ＳＡＭＨＤｌ的调控机制，对于进一步揭示病毒感染机理及其对先天性免疫通路的调控机制具有重要的意义。５０ ３．１材料与方法义１．１细胞和病毒人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ细胞、ＴＨＰ－１细胞、ＨＥＫ２９３细胞和ＨＥＫ２９３Ｔ细胞购自中国科学院上海细胞库－１ｍＬ；ＴＨＰ细胞在５０ｎｇ／的佛波醋（ＰＭＡ）中处理２４ｈ分化成为巨瞻细胞；新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｈｅｒｔｓ／３３株和ＬａＳｏ化株购自中国兽医药品监察所；其他细胞株和病毒株参照第二章２．１．１。３丄２质粒、抗体和试剂ｉ－－３７００７９５ＩＲＦ３ｓＲＮＡ及ｃｏｎｔｒｏｌｓｉＲＮＡＡ：ＳＣ、ＢＸ７抑制剂购自Ｓａｎｔａｕｚ公ＧＬ３－、－ｃｒ司；ｐＢａｓｉｃ英光素酶质粒ｐＲＬＴＫ焚光素酶质粒、－ｒＤｕａｌｌｕｃｉｆｅａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｒａｓｓａｙｓｙｓ１：ｅｍ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。人ＩＲＦ３矛口ＩＲＦ７基因真核表达质粒ＦＬＡＧ－ＩＲＦ３ＦＬＡＧ－ＩＲＦ７，ｐ和ｐ真核表达质粒ＩＲＦ３－５Ｄ质粒和－４６７由本实验室构建并保存。其突变体ＩＲＦ７Ａ２４７质粒构建参照Ｌｉｎ等人（Ｌｉｎｅｔａｌ．１９９９２０００，构建并保存；人，）ＳＡＭＨＤ１基因启动子及其突变体巧光素酶质粒参照ｄｅＳｉｌｖａ等人（ｄｅＳｉｌｖａｅｔａｌ．２〇。，Ｗ介绍的方法构建并保存－Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００转染试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｅｎ公司；ＸｔｒｅｍｅＧＥＮＥｇｓｉＲＮＡＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ艮ｅａｅｎｔ购自Ｒｏｃｈｅ公司。ＩＲＦ３单克隆抗体及其ｇ憐酸化抗体－Ｉ，ＴＲＩＦ多克隆抗体，ＲＩＧ相关通路抗体试剂盒，抗磯酸化ＳＴＡＴ１（Ｔｒ７０１）购自ＣｅｌｌＳｉｎａｌｉｎ公司；ＩＲＦ３多克隆抗体购自ｙｇｇＡｃｔｉｖｅＭｏｔｉｆ公司，并用于Ｃｈｉｐ实验；ＦＬＡＧ标签抗体，ＨＡ标签抗５１ 体－ａｃｎ抗体Ｓｉｌ５Ｍ１，３ｔｉ购自ｍａ公司；鼠源猪ＳＡＭＨＤ单克隆抗体（ｇ株由本实验室制备并保存；鼠源抗ＮＤＶＮＰ蛋白抗体由上海兽医研究所下伊研究员馈赠；ＵｎｉｖｅｒｓａｌｔｙｐｅＩｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ和ｏｒｃｉｎｅｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｐｍｍａ－－ａｌｈａｌｉａｎ购自ＰＢＬ公司。人源和猪源ＴＮＦａ和Ｌ６购自ｐ（ｍａ）－ｎｄｅｄ－Ｒ＆Ｄ公司；ＳｉｎｇｌｅｓｔｒａＲＮＡＤｏｕｂｌｅＲｉｈｔｓｓＲＮＡＤ民、ｓｓＲＮＡｇ（）４１－－、Ｐｏｌ（ＲＩＧＤＡ５Ｌｉ、ＰｌＣＴＬＲ３ｌｉｙＵ：Ｃ）Ｉ／Ｍｇａｎｄ）ｏｙＵ：）（ｇａｎｄ）’’－和５ｔｒｉｈｏｓｈａｔｅｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ５ｄｓＲＮＡ，购自ｐｐ（ｐｐｐ）Ｉｎｖｖｏ－ｎｉｅｎ公司。ＮＥＰＥＲＮｕｃｌｅａｒａｎｄＣｔｏｌａｓｍｉｃＥｘｔｒａｃｔｉｏＲｅａｅｎｔｓｇｙｐｇ，ＰｉｅｒｃｅＡｇａｒｏｓｅＣｈｉｐＫｉｔ和Ｌｉｇｈ怡ｈｉｆｔＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＥＭＳＡＫｉｔ购自ＴｈｅｒｍｏＦｈａ－－－ｈｅｍｘｒｉｓｈｅｒ公司；ＩＦＮａｌｐＩＦＮＡＲＩＮｌ购自ＭｅｄＣＥｐｅｓｓ公司。其他抗体和试剂具体参照第二章２丄２。３－－．１．３ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ定量分析ＳＡＭＨＤ１基因ｍＲＮＡ和细胞ＩＦＮａ的表达－－ＨｅＬａ细胞，ＨＥＫ２９３细胞，ＴＨＰ１ｃｅｌｌｓ细胞，ＭＡＲＣ１４５细胞和ＰＡＭｓ细胞在－ＩＦＮａ或者病毒感染后收取细胞，分离提取细胞总－ＲＮＡ－。反转录获得细胞总ｃＤＮＡ后，民ｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ分析细胞内相应ｍＲＮＡ的表达量。根据猪ＳＡＭＨＤ１基因序列（ＧｅｎｂａｎｋＩＤｎｏ，ＫＪ４７３４８５）和绿猴属ＳＡＭＨＤｌ基因序列（ＧｅｎｂａｎｋＩＤｎｏ，ＪＱ２３１１３７）设计扩增ＳＡＭＨＤｌ巧光定量引物，见表３．１。采用Ｃｏｍａｒａｔ－ｐｉｖｅＤｅｌｔａｄｅｌｔａＣｔ法定量ＳＡＭＨＤ１的ｍＲＮＡ表达量。ＰＡＭ－ｌ细胞中ＩＦＮａ的表达采用ＰｒｏｃａｒｔａＰｅｘＭｕｌｔｉｌｅｘＩｍｍｕｎｏａｓｓａｓ方法ｐｙ５２ 测定。表３．１ＳＡＭＨＤｌｍＲＮＡ巧光定量检测引物Ｔａｂ－化ｄｌｅ３．１ＴｈｅｒｉｍｅｒｓｆｏｒｔｈｅｒｅａｌｔｉｍｅＰＣ民Ｕｉｎ化ｅｐ’－３引物名称序列（５〇扩増长度ＭＳＡＭＨＤ－ｑｌｆｏｒｗａｒｄＣＡＣＡＣＴＣＧＣＡＡＣＴＣＴＴＴＡＣＡＣＣ１３４ｂｐＭＳＡＭＨＤ－ｌｒｅｖｅｒｓｅＣＧＡＴＡＣＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣｑｑＭｂｅｔａ－ｆｏｒｗａｒｄＧＡＧＣＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴ１８７ｂｐ＾ｑＭｂｅｔａ－ｒｅｖｅｒｓｅＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＴＴＧＧＡＡＧＡＧＡＧＣＣＰＳＡＭＨＤ－ｑｌｆｏｒｗａｒｄＴＧＧＣＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣ１２５ｂｐ＾ＰＳＡＭＨＤ－ＴＣＡＣＡＧＡＣＡＣＧＧＧＣＧＡＡＴｑｌｒｅｖｅｒｓｅＣｑＰｂｅ化－ｆｏｒｗａｒｄＣＣＧＣＡＣＣＡＣＴＧＧＣＡＴＴＧＴＣ２０８ｂｐＰｂｅｔａ－ｒｅｖｅｒｑｓｅＣＴＣＣＴＴＧＡＴＧＴＣＣＣＧＣＡＣＧＭ－ｎｅ；ＭＡＲＣ１４５细胞；Ｐ：Ｐｏｒｃｉ３丄４细胞处理与转染ＨｅＬａ细胞－－、ＨＥＫ２Ｗ细胞、ＴＨＰ１细胞、ＭＡ民Ｃ１４５细胞和ＰＡＭ细胞培养于６０－ｍｍ培养皿中，细胞密度为８０％。次日细胞贴壁后，ＰＡＭ细胞中加入ｐｏｒｃｉｎｅｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎａｌｐｈａ（ｍａｍｍａｌｉａｎ），同时Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ－ｔｅＩｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ加入其他细胞，浓度均为１，０００Ｕ／ｍＬ。ＩＦＮａ处理ｙｐ细胞后６ｈ、１２ｈ和２４ｈ分别收取细胞，同时每个时间点收取未加干－扰素的细胞对照。其他细胞因子作为对照，ＴＮＦａ浓度为ｌＯＯｎ／ｍＬ，ｇ－６浓５０比度为ｎ／ｍＬ加入细胞中１２ｈ后收集细胞。ｇ，处理°ＢＸ７９５抑制剂ＤＭＳＯ溶解，终浓度１０ｍＭ，４Ｃ保存。ＨｅＬａ５－ＸＸ细胞和ＭＡＲＣ１４５培养于６孔板中，细胞密度分别为５ｌｏ和３５－１〇。２ＭＢＸ７９５预处理细胞２ｈ后，加入１，ＯＯＯＵ／ｍＬＩＦＮａ刺激Ｈ细胞１２ｈ或５ＭＯＩＮＤＶ感染细胞１２ｈ。１２ｈ后，收取细胞进行ｗｅｓｔｅｒｎ５３ －ａ刺激或ＮＤＶ感染细胞过程中ｂｌｏｔ分析。ＩＦＮ，均加入２浓度的ＢＸ７９５抑制剂。ＨｅＬａ细胞、ＨＥＫ２ＷＴ细胞－１４、ＭＡＲＣ５细胞和ＰＡＭ细胞培养０％－８０％。待细胞贴壁后于６孔板中，细胞密度约为７，进行细胞转－－、ｓｓＲＮＡ染。ＳｉｎｌｅｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡＤｏｕｂｌｅＲｉｈｔｓｓＲＮＡＤ民４１、Ｐｏｌｇｇ（）ｙ’－Ｃ（－ＤＡ５Ｌｉ、ｌＩＣ（３ｌｉａｎｄ５ｑ：）ＲＩＧＩ／Ｍｇａｎｄ）ｐｏｙ（：）ＴＬＲｇ）和’ｔｒｉｈｏｓｈａｔｅｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ５－ｄｓＲＮＡ２ｉ加入（ｐｐｐ），各ｐｐ｜ｇ－ＭＥＭ细胞培养基进行转染Ｏｔｉ。采用ｌｉｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００转染试剂ｐｐ，具体方法参照说明书进行。转染２４ｈ后，收取细胞进行巧光定量和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。对于浊民ＮＡ转染－１４５，ＭＡＲＣ和ＨＥＫ２９３细胞铺于６孔板中，细胞密度约为７０％。次日，采用ＦｕＧＥＮＥ转染试剂转染总量４ｇ的ＳＴＡＴ１ｓｈＲＮＡ或者油ＲＮＡｃｏｎｔｒｏｌ，具体方法参照说明书进行。转染４８ｈ后入浓度为５０－／ｉ１５０ｍＬ的Ｚｅｏｃｎ进行筛选３天，细胞中加＾ｇ直到单细胞克隆的形成。３丄５巧光案酶活性检測４ＸＨｅＬａ细胞培养于２４孔板中，细胞密度５１〇。细胞贴壁后进ＧＬ３－ＳＡＭＨＤ－行转染。相关质粒、Ｐ１启动子质粒和Ｐ化ＴＫ内参质粒按照５：５：１的比例进行转染。细胞转染２４ｈ后，收取细胞进行焚光素酶活性检测。３．１．６ＲＮＡ干扰与回补实验５４ ５ＨＸｅＬａ细胞培养于６孔板中，细胞密度５ｌＯ。５０ｎＭＩＲＦ３干扰－ＲＮＡ（ｓｉ民ＮＡ）及其ｃｏｎｔｒｏｌＲＮＡ，采用ＸｔｒｅｍｅＧＥＮＥｓｉＲＮＡＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ转染细胞。ＩＲＦ３干扰回补实验：ＩＲＦ３ｓｉＲＮＡ转染细胞４８ｈ后，采用ＦｕＧＥＮＥＨＤ－－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ转染ｐＦＬＡＧＩＲＦ３质粒，ｐＦＬＡＧＩＲＦ３转染３６１１１０００１１／－０１２１１６５６拟１１１６１〇＊后，，１１止１１刺激细胞，收取细胞进行＼￥１分析。３丄７间接免疫巧光实验ＨｅＬａ细胞铺在细胞飞片上，细胞密度约为７０％。次日，转染质－５Ｄ粒ＩＲＦ３，ＩＲＦ７和ＩＲＦ７Ａ２４７＾６７，同时空质粒转染和未转染细胞作为对照。转染４８后，细胞用ＰＢＳ洗涂两次后，采用４％中性甲酵－室温固定细胞１５ｍｉｎｏＰＢＳ洗緣细胞３次后，采用０．５％的ＴｒｉｔｏｎＸ１００°处理细胞１０ｍｉｎ。细胞洗緣后，细胞在３％的ＢＳＡ中３７Ｃ封闭３０ｍｉｎ。细胞飞ＰＢＳ３ＦＬＡＧ抗体按１：１０００稀释后，片在中洗涂次后，，°加入到细胞中，３７Ｃ解育１ｈ。细胞在ＰＢＳ中洗络３次后，加入巧二‘光抗，３７Ｃ僻育３０ｍｉｎ后，加入ＤＡＰＩ处理细胞５ｍｉｎ后，细胞采用ＰＢＳ洗涂３次。巧光封闭液封闭后，在激光巧聚焦显微镜下观察焚光。３．１．８染色质免疫共沉淀实验Ｃｈｉｐ）（ＨｅＬａ细胞在干扰素处理细胞１２ｈ后，收取细胞用于Ｃｈｉｐ分析。未刺激细胞作为阴性对照。具体操作参照说明书进行。５５ ３丄９凝胶迁移电泳（ＥＭＳＡ）ＰｏｌＩＣ／ＩＲＦ３－５Ｄ质２ｙ（：）浓度为２惦ｍＬ或者粒鹏转染ＨｅＬａ细胞，＇２４ｈ后－－＋提取细胞核内蛋白。５端生物素标记的探针（３１１９和＋６９－＋１１９）用于ＥＭＳＡ实验，具体参照试剂盒说明书进行。３．１．１０统计学分析ｗｏ－所有结果均进行３次独立的重复实验。ｔｗａｙＡＮＯＶＡｔ：ｅｓｔｓ或’Ｓｔ－ｔｅｓｔ＜者Ｓｔｕｄｅｎｔ用于统计学分析，差异显著标记为／？化０５。３．２结果３－．２．１ＭＡＲＣ１４５细胞和ＰＡＭ细胞中素上调ＳＡＭＨＤ１的表达ＳＡＭＨＤ１的表达受委。Ｉ型干扰素的调控。在人源原代细胞，如＋Ｔ淋己细胞和巨旌细胞等细胞中－树突状细胞、ＣＤ４，ＩＦＮａ无法诱导ＳＡＭＨＤ１的表达，其机制并不清楚（ＳｔＧｅｌａｉｓｅｔａｌ．，２０１２）。但在ＨＥＫ２９３Ｔ和ＨｅＬａ细胞中－，ＩＦＮａ能够显著上调ＳＡＭＨＤｌ的表达。为了探索ＳＡＭＨＤ－１受ＩＦＮａ的的上调表达是否也在其他细胞中出－ａ处理不同细胞并在不同时间段ＳＡＭＨＤ１的变化现，采用ＩＦＮ检测，－－结果发现ＩＦＮａ处理ＭＡ民Ｃ１４５细胞和ＰＡＭ细胞后，同时ＳＡＭＨＤ１ｍＲＮＡ和蛋白水平均出现了明显的上调趋势，并随着处理时间的延长一，ＳＡＭＨＤ１蛋白表达量出现逐渐上调的趋势。与预期结果致，ＳＴＡＴ１蛋白的憐酸化出现了明显的上调，从而确定ＳＡＭＨＤ１在ＭＡＲＣ－４５１细胞和ＰＡＭ细胞中能够受到Ｉ型干扰素的调控表达。同５６ －时－，采用促炎性细胞因子比６和ＴＮＦａ处理ＨｅＬａ细胞，朋Ｋ２９３细胞－１４，ＭＡＲＣ５细胞和ＰＡＭ细胞发现ＳＡＭＨＤ１在，这些细胞中的表达并不受这些细胞因子的调控（图３．１）。巧Ａ６ｈ１２ｈ２４ｈ１Ｂ口Ｍｏｃｋ．＋－４．＋３．Ｓ￣ｓ．■！ＦＮ々汹ｍｕｔａｔｅｄ妻Ｉ１ｍｉ？■ｉ＊？＊？－？■？ｗｗｎｔｎｏｘ＇ｔｗＨｗｗｗ■２占ｊｍｍ＊ｗｗｗｗｅａＭＷ’畫Ｓ－ＨｅＬａｃｅｌｌｓＩ１Ｔｖｆ７０１工ＩＰＳＴＡＴ妄￡．？■……－．２Ｈ＊８Ｃ？ｔｎ、…瞧？Ｐｉｕｗ？贈？ＩＩ＂…Ｓ■戸■＊Ｉ＿￣＇￣〇］｜？「函广■〇Ｊ〇．；５Ｔ２＜６ｈＩ２ｈ２４ｈｗＨｏｉｆｓＤＯＳ！ｓｉｔｎｕ姑ＨｏｎＣＤＩ□Ｍｏｃｋ产Ｃｈ《Ｆ＂的师化化１２ｈ２４ｈ■■ｉＮ＜３１？菱气１－＋－＊ｔＦＮａ＋…二—…―………■琴．．。．，《ＣＡ■Ｏ－ＳＡＭＨ０１細ｍｍｍｍｎｍ，ｍｍｍｍｍｍ４ｍｍｍ＞ｍｒｎｍｍ］—２．－ＳＴＡＴ１Ｔ７０１＾Ｐ—＾：ＨＥＫ２９３ｌｙｒｃｅｌｓＩ占■■１＊舊Ｓｎ画Ｐ．ａｃｔｉｎ晒■ＩＩｎｌ。圓ＩＩｉ６ｈｍ２４ｈ０．４０．８０，３０．６０．４１Ｉ．０ＭＨｏｕｒｓｐｏｓｔｓｉｔｍｔｉａ＾ｏｎＥＦＩ§Ｗ６ｈ１２ｈ２４ｈｉ—＂〇？，口Ｍｏｃｋｏ－．？ｃ．？．？■■ＩＦＮ々ｓｔｉｍｔｅｔｅｄＩＦＮｏ下ｔ蹇巧’—？－—ｉ＊Ｍ？０－ＳＡＭＨＤ＃Ｉ１！ＩＩ｜…ｉＰ－ＳＴＡＴ１Ｔｙｆ７〇１ｍｍｍｍ—ｗｗＭＡＲ。巧说化｜１？国＾＾－ｍｍ？．Ｊ＝Ｂ＿＿ｒｉｊＨ＿口ａｃｉｎｍｍｍｍｍｍｍ■■＝ｊＬｉ＝Ｊｔ＾ｍｍｍ—Ｑ〇Ｘ６ｈ饼２４ｈｉ三１－Ｈｏ－４０．７．．１０．ｉｆｌｆｉｊｓｔｉｔｉＴｉｎ００３１．４１０斋［ｏｓＨ汹ｏＧ？Ｈ６ｈ１２ｈ２４ｈｇ？‘．＿ＱＭｏｃｋ．－－－＇ｌＦＮａ＋＊＋ＩＦＮＣｉ如ｍｅｄ章＾■Ｕ＾ｃ化了－？顧Ｓ－＊品Ｉｉ。ＳＡＭＨＤＩ咖Ｓ＇ＳＴＡＴＴ７０化ｐＩｙｒ，－ＰＡＭ—…，—ｍｍｍｍ——一猜，ｃｅｌｓ化…０－ａ如ｎ＾Ｉ—！ＩＩ自６化２１４ｈ么書０．１１．４０．１２０．２１．８占ＨｏｕｒｓｐｏｓｔＳｉｔｍＵａｔＫ＞ｎＨＥＫ２９３Ｈ＜ＬａＭＡＲＣ－１４ＡＭｓＩ５Ｐ／方／／才／／若令＾／＾＿／｜「———■？一一？＂。－ＳＡＭＨＤ？＊一？Ｗ１ｉ２．９３．１３．０４．２４．１３．９０．５０．５０．６０．８０．７０乂围３－．１ＩＦＮｏｔ诱导人源、猴源和猪源细胞中ＳＡＭＨＤｌ的表达Ｆｉｇ．３．１ＴｙｐｅＩｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓＳＡＭＨＤｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｕｍａｎ，ｍｏｎｋｅｙ，ａｎｄｐｏｒｃｉｎｅ．５７ ３－ｍＲＮＡ．２．２ＨＰＰＲＲＳＶ感染诱导ＰＡＭ细胞中ＳＡＭＨＤｌ蛋白和水平上调前期试验发现－ＰＲＲＳＶ，过表达ＳＡＭＨＤｌ蛋白能够显著抑制ＨＰ在ＭＡＲＣ－１４５细ＳＶ感染过程中ＳＡＭＨＤｌ如胞中的增殖。但ＰＲＲ，何发挥自身功能来抑制病毒感染并不清楚。我们首先检测ＰＲＲＳＶ感ＳＡＭＨＤｌ的表达水平变化－染过程中。５ＭＯＩＰＲＲＳＶ感染ＭＡＲＣ１４５，细胞，并于不同的时间点收取细胞样品，采用羡光定量检测ＳＡＭＨＤｌｍＲＮＡ含量和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＳＡＭＨＤｌ蛋白水平。结果发现，ＲＣ－ｍＮＲＡＰＲＲＳＶ在感染ＭＡ１４５细胞过程中，ＳＡＭＨＤｌ水平和蛋白水平并没有出现明显的变化，但在感染后期ＳＡＭＨＤｌ蛋白水平出一现了定程度的下降（图３．２）。而ＨｕＮ４株感染ＰＡＭ细胞过程中能够明显上调ＳＡＭＨＤｌｍＲＮＡ和蛋白表达水平，特别是在病毒感染的－＊＊＜后期出现了显著上调（１２ｈ２４ｈ）（：７０．０１）。但灭活病毒并不／能导致ＰＡＭ细胞中一ＳＡＭＨＤｌ的上调表达。作为种免疫抑制病毒，ＰＲＲＳＶ感染后显著抑制宿主细胞内Ｉ型ＩＦＮ的产生。之前结果发现，Ｉ型干扰素也能够上调ＳＡＭＨＤ－ａ的干扰ｌ的表达。为了消除ＩＦＮ，一ＰＲＲＳＶ感染过程中Ｎ－我们进步分析了ＩＦａ的表达。结果发现，－ＰＲＲＳＶ感染ＰＡＭ细胞的过程中，ＩＦＮａ的表达的表达受到显著抑制。－－－－另外ｌｈａＩＦＮＡＲＩＮ１ａ的受体，，采用ＩＦＮａｐ抑制ＩＦＮ作用结果发现ＰＲＲＳＶ感染ＰＡＭ细胞诱导ＳＡＭＨＤｌ的表达并未受到影响（图３．２）。这些结果表明，ＰＲＲＳＶ感染ＰＡＭ细胞能够诱导ＳＡＭＨＤｌ的上调表达与ＭＡＲＣ－１４５细胞不同；Ｉ型干扰素在ＰＲＲＳＶ诱导５８ ＳＡＭＨＤｌ的表达过程中并非主要因素。ＡＣＤ＂ｈ＇ｉ．ｐＩ舶ｉＰＡＭ．□瞧編－＋？－＋－ｌｉｔ酬瞩ＶｎＮＳ□觀．．．■－￡■■ＨＰＰＭＶｉ急；＊ｕｎｎｎｎ…Ｈ忡孤助？，．５＾…：，…ＬＣ１厶，—律＞麵輔＊＊卿々．（ＩＳＡＭＨＤ１１ｒＩ？．．｜Ｉ｜ＩｉｌｌＰ「Ｉ０－？■ａｉｍｍｗｍ？；峰ａｃ？（Ｉｉｎ賽ｐ＾｜Ｉｉｉ《帘村《ｇ１１ｉＩＩＭ｜ｉＩｌｌＪ〇〇、《釋／０３０３。８４＇０’３ＭＭ０（Ｗ０Ｍ４０Ｍ．９序矿麥ｆＨｏｕ．穿伴ｒｓｉｐ化孤．ｐｉ目．．Ｍｉ２ｈ６ｈ８ｈ巧ｈ化ｈ２〇ｈ２４ｈＥ■ｈｐ－ｉ．Ｃｈｉ６ｈＨ．？？．．．＋．？，＋？＋ｕＮ４＋陶柳知巧ＡｆＷＩ＾誇轉？綱？《＊．一？一一麵０＊一－ＳＡＭＨＤ１ＨＰＰＲＲＳＶ？？＋＋．．！｜二二：；：二：；．；；：－－…■■－－－￣，＿：ＰＡＭ￣—ｃｅｌｓｒＴ；ｉ；；；＾ｎ一—一一一一ｗ一獅Ｍ一—一．！０ＳＡＭＨＤ１！叫０．１．０，０．８０．５０．７．９０６Ｕ１６０．７１．０．６１．０．４１．３００－ｍｒｎｍｍｍｍｍｍａＶＮ—ＰＲＲＳ＂＂￣＂＂＇＊ＳＡＭＨ？？？？？誇一一？？義一，！Ｔ３Ｄ１？？？！？？＾．Ｍｎ＝＝ｉ＝＝ｍ－ａｒｃ１４５＾［４ｃｌｓ的＊？？一？■—．０２ＯｉＯｉｉ０，９０．９０．９，．Ｏ．Ｂ０．６，．．０９１００．９０．８０．７７０９１０１３１．２１．３．００８３－图．２ＰＲＲＳＶ感染ＭＡ民Ｃ１４５细胞和ＰＡＭ细胞ＳＡＭＨＤｌ表达差异Ｆｉ２－ｇ．３．ＣｈａｎｇｅｓｉｎＳＡＭＨＤｌｅｒｅｓｓｉｏｎｉｎｏｒｃｉｎｅｍａｃｒｏｈａｅｓａｎｄＭＡＲＣ１４５邱ｐｐｇｃｅｌｌｓｉｎｆｅｃｔｅｄｗ地ＰＲＲＳＶ－３．２．３ＴＬＲ３和ＲＩ通路参与上调ＳＡＭＨＤｌ的表达ＩＧ之前的研巧结果发现，ＰＲＲＳＶ感染ＰＡＭ细胞上调ＳＡＭＨＤｌ的－ａ的参与－表达无需ＩＦＮ，但无法诱导ＭＡＲＣ１４５细胞中ＳＡＭＨＤｌ上调表达。因此，我们推测天然免疫通路参与ＳＡＭＨＤｌ的诱导表达。ＴＬＲ受体和Ｒ－ＩＧＩ样受体能够诱导Ｉ型干扰素的产生，在抗病毒固有免疫系统中具有重要的作用。ＴＬＲｓ能够识别不同的分子模式，包括ＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ和ｄｓＲＮＡ等（Ａｋｉｒａｅｔａｌ．，２００６；Ｍｏｇｅｎｓｅｎ，２００９）。’－－民ＩＧＩ／ＭＤＡ５會長够识另ｉｊ病毒ｄｓ民ＮＡ和含有５ｐｐｐｄｓ民ＮＡＨｏｍｕｎｅｔ（呂５９ ａｌ．２００６。因此ＳＡＭＨＤｌ的诱，为了研究导表达机制，我们采用ＴＬＲ，）－受体和ＲＩＧＩ样受体的不同刺激物转染细胞，检测ＳＡＭＨＤ１表达的变化化Ｃ）能够诱导ＴＬＲ３和ＲＩＧ－Ｉ／ＭＤＡ５。Ｐｏｌｙ信号通路的活化，Ｉ。Ｗｅｓｔｅｍｂ而ｓｓＲＮＡＤ民能够被ＴＬＲ７／８识另Ｊｌｏｔ结果显示，刺激物转ｅＬａＭＡＲＣ－染Ｈ细胞，１４５细胞和ＰＡＭ细胞２４ｈ后，ｐｏｌｙＯ；Ｃ）’－ｄｓ民ＮＡ能够明显上调ＳＡＭＨＤｌ的表达和５ｐｐｐ；但ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）和’５－ｄｓＲＮＡ转染ＨＥＫ２９３细胞后１ｐｐｐ，ＳＡＭＨＤ表达只出现轻微的上调。ｓｓＲＮＡＤ民和ＳＳＲＮＡ４１转染后，ＳＡＭＨＤｌ表达均没有发生明显一变化（图３．３）。因此我们推测ＳＡＭＨＤｌ的上调表达是细胞的种早期天然免疫反应ＴＬＲ３、ＲＩＧ－Ｉ／ＭＤＡ５通路参与了ＳＡＭＨＤｌ的诱导，表达。３．２．４过表达ＴＲＩＦ和ＭＡＶＳ诱导ＳＡＭＨＤｌ的表达ＴＬＲ３在受到ｄｓＲＮＡ刺激后，会召集下游蛋白ＴＲＩＦ，而ＲＫＭ／ＭＤＡ５会与ＭＡＶＳ相互作用，进而引起机体天然免疫信号的活一３－ｌ化。为了进步探索ＴＬＲ和ＲＩＧＩ／ＭＤＡ５受体在上调ＳＡＭＨＤ表达的作用－－ＴＲＩＦ，ＨｅＬａ细胞，ＨＥＫ２９３细胞，ＭＡＲＣ１４５细胞转染ＨＡ－ＭＡＶＳ质粒和ＦＬＡＧ。ＨＡ和ＦＬＡＧ标签抗体及蛋白特异性抗体用来检测目的蛋白的表达。结果发现，过表达ＴＲＩＦ、ＭＡＶＳ在Ｈ种细胞－中均能够上调ＳＡＭＨＤｌ的表达（图３．４）。可见，ＴＬＲ３和ＲＩＧＩ／ＭＤＡ５分别通过ＴＲＩＦ和ＭＡＶＳ上调ＳＡＭＨＤｌ的表达。６０ ＡＨｅｔａｃｅｌｓ蹇Ｑ冷兴勞＂ｆ；ｉ．聲冷；ｊＢＢ－１４Ｍ１Ｈ？ＶＭＭ．ｊｓｗｗｗｗ章ｊ．。ＳＡＭＨＤＳ圓国１臺０－￣汝ｂ、口—３Ｃ＂ｎ《。卢＾―必分／Ｖ次０．３０９１００４０３々卢沪户．参备：六＾ＲＭ５－ＭＤＡＩ／５ＴＬＲ８ＴＬＲ３ｎ这ｎＵＫ８Ｈ巨Ｋ２的说Ｉｔｅ皆赛｝｜ＩＩＩ—姜雙１鑽ｒｎｍｍＳＳ０－ＳＡＭＨＤ１，．圓圓圓－Ｘａｃｔｉｎｐ．＾ｍｒｎｍ＾ｍｍｍｍｍｍｍ＾ｉ＾ｍ＾ｍｍｍｍｍ￣￣－－－－－＇￣巧＊嗔声＾ｏｉ１Ｊ００，５０．６ａ９＞今《令．矣＾令－ＭＤＡ５ＴＬ泉宗Ｒ巧Ｉ／Ｒ８ＴＬＲ３、卢Ｖ於々ＥＦ瞧。４５巧化Ｉｉｉｉ；｜掌＊：＂雜■？■？？。■？－§囊ｉＨｉ０ＳＡＭＨＤ１§嚇＊＝＝…—香ｆ：山ｉｌｎｈｂ３姊。？■■■？？■？？■■■■？■■＾？５０山—￣ＪＶＬＪ｜Ｕ｜ＬｊＩＰＬｊｉｐ＞护■？＾―＂０．１＂品誦卓兰互與４每－Ａ與ＲＩＧＩ／ＭＤ化ＴＬＲ８ＴＬＲ３弁々ＰＡＭｃｅ冷ＧｌｓＨＳ兴、沒閑：方為｜自一。棚ＨＤ厂Ｉ＾ＩＩ■Ｉ■＾．ｉ〇口－ａｃｔｉｎＩｗ每００．６０．２００１．５－ＭＤＡＲＩＧＩ５ＴＬＲ８ＴＬＲ３／夺户图３－．３ＴＬＲ３和民１ＧＩ／ＭＤＡ５通路参与上调ＳＡＭＨＤ１的表达Ｆ－ｉＴＬ民３民ＩＧＩ／．３．３ａｎｄＭＤＡ５ｏｎｉｓｔｓｕｒｅｌａ化ＳＡＭＨＤ１ｅｘｒｅｓｓｇ巧ｐｇｕｐｉｏｎ．６１ ３．２．５ＴＢＫｌ的活化参与ＳＡＭＨＤｌ的诱导表达化Ｒ３和民－ＩＧＩ／ＭＤＡ５受体分子在受到病毒相关蛋白和民ＮＡ的刺－激后，化民３受体通过活化其下游分子Ｔ民ＩＦ，民ＩＧＩ／ＭＤＡ５活化下－ｒ游分子ＭＡＶＳ（也称ＩＰＳ１、Ｃａｄｉｆ或ＶＩＳＡ），活化下游共同的效ｋＢ－ｅ应分子ＴＢＫ１和Ｉ激酶ＧＫＫ，进而活化转录因子化巧和）ＮＦ－ｋＢｎｅｔａ，诱导Ｉ型ＩＦＮ的产生Ｋａｗａｉｅｔａｌ．２００５Ｍｅｌａｌ．２００５（，；ｙ，；Ｓｅ化ｅｔａｌ．２００５Ｘｕｅｔａｌ．２００５。因此ＢＫｌ，Ｔ在抗病毒先天性免疫中，；，）冶方多身參寧ｉ／／／／＾ａ－ＦＬＡＧＩａ－ＨＡａ－ＶＳＭＭＷＭＡｔＭｍ。－了ＲＩＦｍｍｍｍｍｍｍｍｍ衡構＿＿Ｉ…Ｍｉｌ誦口了ＢＫｉ—ＩＩ—ＭｉｍＰ＊Ｌ？ｊ４－ＭｎＰＱ４ＩＯｆ＼，ＢＰ…－ＪＨｅＬａ说巧５難順ａ－ｗ＾＂ｍＳＡＭＨＤ１－ｐａｃｔｉｎ？ＨＩＶ？■？■？０．３０６０７１．２１．３一。－－了１ｐＢＫａ－ＴＢＫｉｍｉｍｍｍｍｍＨＥＫ２９３ｃｅｌｌｓ０－ＳＡＭＨＤ１－ａｃｎｐｔｉ０．４０．３０．３Ｏ．Ｂ０．９￣Ｑ－－ＴＢＫＰ１—ＰＭ｜￣ＩＩ。－了ＢＫ１ＩＭＭＭａｍｍＩ＃ｌｋｍＭＡＲＣ－１化ｃｅｌｌｓＱ－ＳＡＭＨＤｍ１ＭｍＲｒａ．ｉｔ＾ｔＭｋｉＭＭｉＭＩＤ－ａｃｔｎｍｍｍｇｉｍｍｍｍｍｍ０．９０．９１．０３．５２．８６２ ＴＲＩＰ图３．４和ＭＡＶＳ参与上调ＳＡＭＨＤｌ的表达Ｆｉｇ．３．４ＴＲＩＰａｎｄＭＡＶＳｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｉｎ也ｅｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＳＡＭＨＤ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ发挥重要作用。ＳＡＭＨＤｌ的表达需要ＴＲＩＰ和ＭＡＶＳ分子的参与，因此我们推测其下游ＴＢＫ１在ＳＡＭＨＤｌ的表达方面具有重要作用。ＴＢＫ１的活性受磯酸化调节Ｓｅｒｌ７２，，其位受到磯酸化后导致ＴＢＫ１迅速活化，进而磯酸化下游ＩＲＦ３分子ＭｃＣｏｅｔａｌ．２００８。，（ｙ，）实验发现ＴＢＫ一１质粒转染能够明显上调ＳＡＭＨＤｌ的表达。为了进步验证ＴＢＫ１在ＳＡＭＨＤｌ表达过程中的重要作用，我们利用ＳＡＭＨＤｌ启动子焚光素酶实验来检测ＴＢＫ１的诱导作用。结果发现，ＴＢＫ１能够显著上调ＳＡＭＨＤｌ启动子的活性（图３．５）。可见，ＴＢＫ１的Ｓｅｒｌ７２鱗酸化活性在诱导ＳＡＭＨＤｌ表达方面具有重要作用。ＨｅＬａｃｅｌｌｓ．ＳＡＭＨＤ－金／文１ＬＵＣ、＇，－ＩＩｍａＦＬＡＧＩＢＭＩＭＵＱ－－ＴＢＫ１ＩＩＰ０＊＾——＾＾淆麵啤曲喊）這１腑喻、—ＴＲｉ＾ｉ心ｉｍｉｉ幽ｍＵＩＤｆ＼Ｉ！曜圓ｆｙ句ＰＵＢＵ４乂、如＝／ｎ一－—次户０－ＳＡＭＨＤ１—、—分■ｏｓ－２４ｈｔｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｏｎａｃｉｎ［Ｊｔｐ０．０５１．１０．５ＭＡＲＣ－１化ｃｅｌｌｓｃｅＨＥＫ２９３ｌｓｌ＆如全多会／＜／＾／／／ｏ＇ｌａｇ——ａ－ＦＬＡＧｍｍｍ口Ｋ节巧１－－＂ａＴＢＫＩ卿麵囑ｐ０－ＴＢＫ１．ｉｇｎｎｍｕｇｇｉｉｉｇｉｇ曰＾。－ＳＡＭＨＤ１－ａＳＡＭＨＤＩ－ａｎ口州－ａｃｔ—…４ＨＨＨＰ？Ｍｎｉ＾ｐｉｎ０－２０．２０．８０，２０．２０．９６３ 图３．５ＴＢＫｌ活化参与上调ＳＡＭＨＤｌ的表达Ｆｉｇ．３．５ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＴＢＫ１ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｓｉｎ也ｅｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＳＡＭＨＤ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ３．２．６ＩＲＦ３在ＳＡＭＨＤｌ转录翻译过程中发挥直接的调控作用前期实验发现，ＴＢＫ１在ＳＡＭＨＤ１的诱导表达过程中发挥重要的调节作用１３和。ＴＢＫ诱导Ｉ型ＩＦＮ的产生需要依靠其下游分子ＩＲＦＩＲＦ７的憐酸化。ＩＲＦ３或ＩＲＦ７是否参与调控ＳＡＭＨＤｌ的表达并不清楚。非活化的ＩＲＦ３蛋白位于细胞浆中，过表达的ＩＲＦ３蛋白，其无法自身磯酸化－５Ｄ突变３９６巧８，无法入核发挥作用。ＩＲＦ３，将其第，，４０２，４０４和４０５位氨基酸突变为能够自身磯酸化的天冬氨酸，导致表达的ＩＲＦ３能够自身憐酸化入核，诱导干扰素的产生（Ｂｅｇｏｅｔａｌ．，２０１２Ｌｉｎｅｔａｌ．１９９９。与ＩＲＦ３不同，过表达ＩＲＦ７能够刺激干扰素的；，）一产生Ａ２４７－４６７是，而其缺失突变ＩＲＦ７种持续性的活化形式，相对－５Ｄ－于ＩＲＦ３、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７，ＩＲＦ７Ａ２４７４６７能够强烈刺激干扰素的产生Ｌｉｎｅｔａｌ．２０００。因此，为了分析ＩＲＦ３和ＩＲＦ７在ＳＡＭＨＤｌ表达（，）－调控过程中的作用，ＨｅＬａ细胞、ＭＡＲＣ１４５细胞和ＨＥＫ２９３细胞转－５Ｄ－染ＩＲＦ３、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ７Ａ２４７４６７，进而分析ＳＡＭＨＤｌ的表－达。ＩＦＡ结果显示，ＦＬＡＧＩＲＦ３只分布于细胞浆内。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分－￣ＡＭＨＤ析结果显示，ＩＲＦ３５Ｄ、ＩＲＦ７、ＩＲＦ７ａ２４７４６７能够上调Ｓｌ的－４６７上表达，ＩＲＦ７Ａ２４７调表达最为明显ＩＲＦ３，而过表达诱导一ｌ３。ＳＡＭＨＤ的上调表达作用不明显．６），这与预期结果致（图为一进步验证ＩＲＦ３或是ＩＲＦ７直接参与调控ＳＡＭＨＤｌ表达，通过ＳＡＭＨＤｌ启动子焚光素酶活性检测发现－，转染ＩＲＦ３和ＩＲＦ３５Ｄ后，６４ 焚光素酶活性明显上调。同时，干扰ＲＮＡ抑制ＩＲＦ３和ＩＲＦ７的表达－发现，只有抑制ＩＲＦ３的表达，ＩＦＮａ诱导ＳＡＭＨＤ１的上调表达受到显著抑制。恢复ＩＲＦ３的表达，ＳＡＭＨＤ１的诱导表达恢复到与对照组一致的水平。可见ＩＲＦ３和ＩＲＦ７能够诱导ＳＡＭＤＨ１的表达上调，，但Ｉ民Ｆ３发挥直接调控的作用。＼谁沿射Ｗ。巧ｃｅｓｆ巧鲜辨ｆｉ／／／／／／／／／／／／／／／／／／Ｖ／／／－．－￣￣———￣＾￣：；：＇：＇立二：？＾＾：：？－；：＂：：．：＇■■ｉ囚回田！地试班＾＾；細？騰麵典師獅醫Ｗ，一一祖看靈細ＤＡＰｉｍｍ－Ｉ？麵每感赫ｉＷｉｌ娜腾麵麟ｉｗｉｉｗｉｌｉｆｔ腳ＷＭ禱輔暖柳Ｅ畴Ｉ肌ＪＭ雜Ｉ圆肪国ＢＨＨＨＨＨＨＨＨＢｉＪｆｌＨＨＩＨＩＨＨＢ＇ｒｒｚ：：；：；：＾：：：＾：；；Ｉｍｍｒｎｍｍｕｒｎｉｍｍｍ■Ｗ＼０Ｕ．Ｓｏｉ５９．３０，巧Ｏ１，．ＳＪＵ０．３狂７Ｑ．ＳＵｏ．ａ瓦４Ｗｒｃ１．２ｉ０ｐ＿ＳｆＷｃｒＭｏｄ＾ａｓ？ＳＡＭＨＯ＾＾ｏＫｒｔｆｃ？ｎ＾ＴＷｓｉ｜ｙ－＾？＊＊＊齡親．．．．￣ＺＸｓｆｌ．＊，＊．＊？？ＩＩＡ画……＇￣＊麵職＾４＾．？－？ｆ３幽７＾１１｜ｉ■。氣’＇麵藝■＂姻。贈神賴扇奇烏节，＇—￣￣．一／／／／—＾柳一。．卿—一／—、旁０９Ｖ００．，——：，ｗ０ＭｅＭ－Ｂｗ０ｗ４．１ｆ＾ｋｎ２ｆｔＭｔｉｆｉｉＢＫ〇ｐ１０１０１．１１ｉ）图３．６ＩＲＦｓ在诱导ＳＡＭＨＤｌ表达和启动子活性中的作用Ｆｉｇ．３．６ＥｆｅｃｔｏｆＩＲＦｒｏ化ｉｎｓｏｎＳＡＭＨＤｌｅｘｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｒｏｍｏ化ｒｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｐｐｐ－３．２．７ＳＡＭＨＤｌ上调表达不依赖于ＪＡＫＳＴＡＴ通路干扰素结合到其受体后－ＳＴＡＴ信，激活ＪＡＫ号通路，进而诱导干扰素刺激因子的表达。前期实验发现，干扰素上调ＳＡＭＨＤｌ表达的６５ 同时，ＳＴＡＴｌ的憐酸化也出现了显著的上调。因此，我们推测ＳＴＡＴｌ在ＳＡＭＨＤ一１的诱导表达过程中也具有定的作用。为了探索ＳＴＡＴ１＆片ｆ说化ＭＡＲＣ－１４５ｃｅｉｓ声７７／／／／／／／．ａ．＋＋＋參公少ＩＦＭ＊户户户－—……鳴…麵參每參與《妥令。ＳＴＡＴ１Ｉ？ｇｊｆｔ］ＩＩ＾ｉＩＷｔ／—ＨＩ麵圓琴－ＳＡＭＨＤ－－ＩＰａｉｆａＳＴＡＴ１ｐ—ＨＥＫ２Ｗｃｅｌｓ＾胃胃胃ＩＩＷｌ－＂－■ＱＳＡＨＤ＾？一…曜巧巧１ｇＳｅＭ？…ｐｒ３９６ｔＷｔＩＩ，｜Ｂ＾－＂＂＂＇－Ｗｉｉ＂？＂ＩＱｌＩＩｉａｃｔｉｎ＾ｎＩＲＦ３＜ＭｍｌｔｓＫｍｐＰｕｐ［［［一１…—■０．２０．９０．８０９及３Ｓ３－－曰ＰＳＴＡＴ１１—ｍｒｎｍｍ—＾＾＂？：－？Ｋ＾ＶｒＩｉａＳＴＡＴ１？ＰＦｐ…’．’”’’ａ－ＰＲＲＳＶ：：ｍｍＮｉＨ＞ｈ￣￣——」—Ｉａ－－ＳＴＡ—＇Ｔ１ＴｒｐＭＡＲＣ－４５１ｃｅＨｓ－ｍｍ￥Ｕｌｉｌ＾Ｍｉ＾ａＮＤＶＮＰ｜ｊ－…ｍｍｍｍｍｍｍｍＩａＳＡＭＨＤ１尹ｍｍＮｅｔ…一一？与ｐ—ａ｜伽＾．１７００２０７．１．７．２０．３１．６０乂〇３〇怎〇；〇怎／／／／／／／￣？＊—－ａ－ＳＴＡＴ—？Ｉ＂■—ａ－－ＳＴＡＴＩｐ’．－—．：：＝：；ＨＥＫｐ２９３ｃｅＨｓ叫＊＊－＊酵’０－ＳＡＭＨＤ＾？＇＊？龜ｍｉｍｍ１－ａｃｔｉｎＰ０６０．４０４０．４０－ＳＴＡＴ１？ＨＥＫ２９３Ｔｃｅｌｓ！ａ－ＳＡＭＨＤ１三三护ａｃｔｉｎ—？？ｊ００８．９０．８０８图３．７ＳＡＭＨＤｌ上调表达不依赖于ＳＴＡＴｌ的谈酸化活性Ｆｉｇ．３．７ＵｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＳＡＭＨＤｌｉｓｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｆＳＴＡＴｌａｃｔｉｖｉｔｙ在ＳＡＭＨＤｌ表达过程中的作用，ＩＭＯＩ感染剂量的ＰＲＲＳＶ和ＮＤＶ感染ＭＡＲＣ－１４５细胞和ＰＡＭ细胞。１６ｈ后收取细胞，进行ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ６６ －分析。结果发现，ＮＤＶ感染ＭＡＲＣ１４５细胞后，ＳＴＡＴｌ的磯酸化和ＳＡＭＨＤ１的表达均出现了显著的上调，但ＰＲＲＳＶ感染没有引起二者的变化。但在ＰＡＭ细胞中，ＰＲＲＳＶ和ＮＤＶ感染均能诱导ＳＡＭＨＤ１的表达上调。只有ＮＤＶ感染ＰＡＭ细胞过程中ＳＴＡＴ１的磯酸化出现显著的增强一。为了进步确定ＳＴＡＴ１在ＳＡＭＨＤ１上调表达过程中的作用ＲＣ－１４５ＥＫ２９３细胞ＳＴＡＴ１的，ＭＡ细胞和Ｈ干扰表达，进而分－ａ刺激ＳＡＭＨＤ１的表达变化析ＩＦＮ后。结果发现，干扰ＳＴＡＴ１表达后－ａ，尽管ＳＴＡＴ１的表达和磯酸化水平均受到了显著抑制，但ＩＦＮ诱导的ＳＡＭＨＤ１的上调表达未收到明显的抑制。同时，过表达ＳＴＡＴｌ．７）。这些结果表明也未影响ＳＡＭＨＤ１的表达（图３，ＳＴＡＴｌ的磯酸化并不参与诱导ＳＡＭＨＤ１的上调表达。义２．８ＩＲＦ３的縣酸化和核转移活性对诱导ＳＡＭＨＤ１的上调表达至关重要ＰＲＲＳＶ是一种免疫抑制性病毒，病毒感染后抑制Ｉ型干扰素的产－生巧ａｔｅｌｅｔａｌ．２０１０Ｗａｎｅｔａｌ．２０１３，但其感染后能够活化ＦｋＢＮ，；ｇ，）Ｐ－和Ａ１信号通路，抑制ＩＲＦ３的磯酸化入核Ｆａｎｅｔａｌ．２０１２ａＬｅｅａｎｄ（ｇ，；Ｋｌｅ化ｏｅｋｅｒ，２００５；Ｌｕｏｅｔａｌ．，２０１１）。ＮＤＶ感染过程中能够通过促进憐酸化ＩＲＦ３入核，强烈诱导Ｉ型ＩＦＮ的产生。因此，我们利用ＰＲＲＳＶＣ－５ＳＡＭＨＤ和ＮＤＶ感染ＭＡＲ１４细胞来分析１表达和调控机制。－ＳＴＡＴ通路不参ＳＡＭＨＤ前期研巧发现，ＪＡＫ与１的表达上调，但ＳＡＭＨＤ一３ＩＲＦ３在１的诱导表达中发挥直接作用。为了进步分析ＩＲＦ的磯酸化入核对ＳＡＭＨＤ１的表达影响，１ＭＯＩＰＲＲＳＶ和ＮＤＶ感染６７ ＭＡＲＣ－１４５细胞和ＰＡＭ细胞１６ｈ，收取细胞进行ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果发现，ＮＤＶ感染的细胞中显著上调ＳＡＭＨＤｌ的表达，同时ＩＲＦ３ＭＡＲＣ－１４日ｃｅｌｌｓＬａＳｏｔａＨｅｒｔｓ／３３－－牛＋－ＢＸ巧５－＋＋ＮＤＶｍｍ綱瞧－－ｍ。下ＢＫ１ｐ－ｉＢＭｇｉｍＫｕｍｍｍｍ口ＴＢＫ１？ＩｊＩＢＨ－－＾＾秘霉ａＩＲＦＳＩ一麵麵｜喔？｜｜、ｍｍｍ窜－非…：－—ｒｎ脚ａ－ＳＡＭＨＤ１＊—＊＊＇＊—＊口－ＮＤＶＮＰ１１＿麵｜幽晒ｉ—＾ｍａｍｍ—ａｃｉＰｔｎ１００．１０．１０．１０．７０．２０．２０．２．ＰＡＭｓｃｅｌｌｓ８ｈ１２ｈ１６ｈ２０ｈ２４ｈ＿￣￣＿￣￣一—＿￣—一Ｂｘ７９５ＴｒＴｒｒ：＾ｒ■＋ｒ＋ｒ－－ＨＰＰＲＲＳＶ－中＋＋＋－＋＋－＋牛－＋牛曰－－ＴＢＫｍｍｍｍｍｍｍｍｍ１Ｓｅｒ１７２ＷｍＰｉｗ？ｕ一＊６ａ？ｔｏ＾．曲占一，Ｑ－了？—？？＊＊ＢｍＫＫ１ＭＭ難西ＷＨｍ（ＢＨｉｉＭＷＷＷ偏一－－－？？＊ａｐＩＲＦ３Ｓｅｒ３９６—Ｗ？？誦讀痛－■Ｆ３曰旧＊？動。：槪．恥．，ｇ啡－啡ｔＡＫ９脅－ＳＡＭＨＤ１Ｑ一＇＊ｔ３３ｃｉｎＷ＾ＷＷＨＨｉｒＭＭｔｍＭＰ０．３０．３０．７．．．０．１０．１０．２０．１０．１０．４０．２０．２０．５０３０３０８图３．８ＩＲＦ３的碟酸化入核对ＳＡＭＨＤｌ诱导表达至关重要＾Ｆｉｇ．３．８ＰｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎａｎｄｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｏｆＩ民Ｆ３ｌａｓｉｍｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｉｎｐｙｐｎｄｕｒｅｓｓＡＭＨＤｌｉｅ化ｌｅｅｘｐｉｏｎｏｆＳ６８ 出现了明显的磯酸化；ＰＲＲＳＶ只在感染ＰＡＭ细胞过程中上调ＳＡＭＨＤ一１和ＩＲＦ３的磯酸化。此外，我们采用ＢＸ７％进步抑制ＩＲＦ３的磯酸化入核－１４５，来分析ＳＡＭＨＤ１的诱导表达。ＭＡＲＣ细胞和ＰＡＭ＞５预处理２ｈ后细胞采用ＢＸ７５，５ＭＯＩ的ＰＲＲＳＶ或者１ＭＯＩ的ＮＤＶ感染细胞，并在不同时间段收取细胞分析ＳＡＭＨＤ１的表达。整个感染过程中，均加入抑制剂。结果显示，ＢＸ７９５显著抑制ＰＲＲＳＶ和ＮＤＶ感染诱导的ＩＲＦ３磯酸化，同时ＳＡＭＨＤ１的表达也受到明显抑制（图３．８）。３．２．９活化的ＩＲＦ３直接结合ＳＡＭＨＤ１的启动子诱导ＳＡＭＨＤ１的上调表法ＩＲＦ３在受到上游信号活化后磯酸化入核，结合到干扰素效应元件的启动子区域，诱导Ｉ型干扰素反应。前期实验发现，ＩＲＦ３能够诱导一ＳＡＭＨＤ１启动子的活性，并上调ＳＡＭＨＤ１的表达。为了进步分析ＩＲＦ３与ＳＡＭＨＤ１启动子的结合区域，ＳＡＭＨＤ１启动子及其缺失突变序列克隆到巧光素酶载体中－５Ｄ共ＨｅＬａ细胞，与ＩＲＦ３转染，－３－＋分析启动子的巧光素酶活性。结果发现，ＳＡＭＨＤ１启动子１１９区域缺失后一，启动子的巧光素酶活性收到显著抑制。Ｃｈｉｐ实验也进－ｒｏｔｅ步证实了焚光素酶的实验结果。ＥＭＳＡ实验结果显示，ＤＮＡｐｉｎ－３－＋＋６９－＋复合体只出现在与１１９探针婿育的核蛋白混合物中，１１９探针僻育的复合物中没有出现一。因此，这些结果进步证实，诱导ＳＡＭＨＤＩ的表达是通过ＩＲＦ３ＩＳＡＭＨＤ１的启动活化后，结合寞Ｊ子区域来实现的（图３．９）。６９ Ａ■昨ＬＡＧ－识巧－５ＤＢ□ＥｍｐｔｙｖｅｃｔｏｒｏｒｍａｌＲａｂｂｉｔＩＧ己Ｎｇ－ＩＲＦ３Ａｎｔｉｂｏｄ■－＇－－■－１０８２－ｙ［—－－１？？Ｎ械巧０２＊－６８－＋－１２０２飞？－屬１’＋２Ｑ２．下－２８－？１０２ｌｌｌＭＩＩＩＩＩＭＭＭＷ－＂ＭＭＭｉｌｉｌ占品占一Ｍｉ吝占－－－８１－＾２０２－＾ｓ圓。？＞＂１■－顆－＝—苦Ｉ＾＾１－＋２Ｑ２ｒ９ＥＳｉ＾ｉｉ．ｉ￡§Ｉ＋－２’魄巧０■＊＂９－＾０２－￣ｏ？＾Ｉｎ■ｎｉｉｉｂ．０１２３４５６７８９１０公分ＳＡＭＨＤ１ｐｒｏｍｏｔｅｒｓｌｕｃｉｆｅｒａｓｅａｃｂｖｉｔｙ＾ｙＦｏｌｄ（）旧－ＣＦ３５ＤＰｏｌｙｌ：Ｃｎ（）＇—＿＿。，＂？＾ＬＬＵ－Ｐｏｌｉ：ＣＩＲＦ３５Ｄｙ（）－３－＋９＋＋＋＋＋－＋１１ｒｏｂｅ＋６９１１ｂｅｐ９ｐｒｏ＋＋十＋＋Ｎｕｃ．＋＋＋＋ｌｅａｒｅｘｔｒａｃｔＮｕｃ．ｌｅａｒｅｘｔｒａｃｔ＋＋＋＋－＋－＋＋６９－牛－－－ＵｎＵｎ＋ｌａｂｅｌｅｄ１１９ｒｏｂｅ－－＋ｌａｂｅｌｅｄ３１１９ｐｒｏｂｅｐ．牛—ＤＮＡ－ｒｏ＊ｐｔｅｉｎｃｏｍｌｅｘｉｐ：動？、Ｉ讀Ｈ難伊＿磯ｐ…Ｋ響彎彎Ｋ，＾ｙｉＭＭｌｉｌｒＡ，Ｍ一Ｆｂｅ一Ｆｒｅｅｒｏｂｅｒｅｅｐｒｏｐ图３．９化Ｆ３结合ＳＡＭＨＤｌ启动子区域分析Ｆ－ｉＩｔｉｃａｔｃｓａｃｔｅｅｍｅｎｔｓｏｎｓｉｂｌｅｏｒＡＭＨＤ１ｒｏｔｅｒｇ．３．９ｄｅｎｉｆｉｏｎｏｆｉｉｎｇｌｒｅｓｐｆＳｐｍｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎｂｙａｃｔｉｖａ化ｄＩ民Ｆ３３．３讨论＋ＣＤ４Ｔ淋己细胞、单核细胞来源的树突状细胞（ＭＤＤＣｓ）、休眠＋－的ＣＤ４Ｔ淋己细胞、单核细胞和巨隨细胞中，ＩＦＮａ无法诱导ＳＡＭＨＤ－１蛋白的上调表达，但在ＩＦＮａ处理的ＤＣｓ细胞中，ＳＡＭＨＤ１一－ｍＲＮＡ水平在处理后６ｈ１２ｈ出现了定程度的上调（ＳｔＧｅｌａｉｓｅｔａｌ．，２０１２。此外，在外周血单核细胞中，ＴＬＲ９的刺激物能够上调）７０ ＳＡＭＨＤｌｍＲＮＡ水平（Ｂｕｉｔｅｎｄｉｊｋｅｔａｌ．，２０１４）。然而，ｍＲＮＡ的水平増加并不能代表蛋白水平的变化－ａ。本实验中，我们分析了ＩＦＮ诱导－其他不同细胞系中ＳＡＭＨＤ１表达的状况。与之前研究相似ＦＮａ，Ｉ也能够诱导ＭＡＲＣ－１４５细胞中ＳＡＭＨＤｌ的上调表达。但与人巨唆细胞不同的是－ａ能够显著上ＳＡＭＨＤ１的表达。，在ＰＡＭ细胞中，ＩＦＮ调ＰＲＲＳＶ对ＩＦＮｓ极其敏感ＩＦＮ－ａ能ＰＲＲＳＶ研究发现，，够显著抑制在ＰＡＭ细胞中的增殖（Ａ化ｉｎａｅｔａｌ．１９９８ＢａｕｔｉｓｔａａｎｄＭｏｌｉｔｏｒ，１９９９，；；Ｏｖｅ一ｒｅｎｄｅｔａｌ．２００７民ｏｗｌａｎｄｅｔａｌ．２００１。ＳＡＭＨＤｌ作为种Ｈ磯酸，；），水解酶，能够降解细胞内的ｄＮＴＰ水平，进而抑制逆转录病毒ｃＤＮＡ链的合成，从而抑制病毒复制（Ｆｒａｎｚｏｌｉｎｅｔａｌ．，２０１３；Ｇｏｌｄｓｉｍｅｅｔａｌ．，２０１１）。因此，ＳＡＭＨＤｌ可能在干扰素抑制ＰＲＲＳＶ感染ＰＡＭ细胞过一ＳＡＭＨＤ程中发挥定的作用ｌ。Ｉ型ＩＦＮ调节的转录表达机制目前－－－并不清楚。正１２和ＥＬ１８刺激巨睡细胞后１型，能够明显阻止ＨＩＶ的有效感染，其且巨隨细胞受到刺激后，ＳＡＭＨＤｌｍＲＮＡ水平和蛋白水平均出现了一定程度的上调，ＳＡＭＨＤｌ的诱导表达并不依赖于ＩＦＮ－Ｐａｕｌｓｅｔａｌ．２０Ｂ，结Ｙ（，）果暗示存在潜在的其他机制调控ＳＡＭＨＤｌ的表达。ＲＲ－模式识别受体包括ＴＬ受体、ＩＧＩ样受体和ＮＯＤ样受体，当模式识别受体受到病原相关分子模式刺激后一系列的信号级联，引起反应，诱导不同细胞因子的表达，从而消除感染（ＴａｋｅｕｃｈｉａｎｄＡｋｉｒａ，２０１０）。ＤＮＡ或ＲＮＡ病原被胞浆内的ＴＬＲｓ和ＲＬＲｓ识别，诱导Ｉ型干扰素的产生（Ｇｉｔｌｉｎｅｔａｌ．２００６。ＳＡＭＨＤｌ的上调表达是否，）为探索７１ 为细胞对病原感染的早期免疫反应ＴＬＲｓ和ＲＩＧ－Ｉ样受体的激活剂，ＰＡＭ细胞和ＭＡＲＣ－－转染１４５细胞。结果发现，只有ＴＬＲ３和民ＩＧＩ受体激活剂能够引起ＳＡＭＨＤ１的上调表达。胞浆内ＴＬ民３识别ｐｏｌｙ－化ＣＲＮＡＰＡＭ后ｉ且能够），而ｄｓ转染，能够被ＲＩＧＩ／ＭＤＡ５识另ｊ，下调ＴＬＲ７和ＴＬＲ８的表达（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕｅｔａｌ．，２００１；Ｃｈａｕｎｇ巧ａｌ．，２０１０）。因此，ＳＡＭＨＤｌ的上调表达为早期的固有免疫反应，且ＴＬＲ３和ＲＩＧ－Ｉ／ＭＤＡ５通路参与ＳＡＭＨＤ１的表达调节。ＴＬＲ３和ＲＩＧ－Ｉ／ＭＤＡ５参与ＳＡＭＨＤ１的上调表达，其诱导ＩＦＮｓ的产生需要下游重要的分子ＴＢＫ１的参与。为了探索模式识别受体活化后，如何调控ＳＡＭＨＤ１的表达，我们采用ＴＢＫ１及其憐酸化功能缺失突变体ＴＢＫ１Ｓ１７２Ａ转染ＨｅＬａ细胞，分析ＳＡＭＨＤ１的表达状。实验发现ＴＢＫ１ＳＡＭＨＤ１蛋白况，转染后，表达及其启动子巧光素酶活性均显著増加，而其憐酸化功能缺失突变体转染后，ＳＡＭＨＤ１的表达和启动子英光素酶活性显著下降。可见，ＴＢＫ１在诱导ＳＡＭＨＤ１上调表达方面具有重要作用。ＴＢＫ１活化后直接通过磯酸化下游转录因子（ＩＲＦ３和ＩＲＦ７）的磯酸化和二聚体的形成，从而入核诱导Ｉ型ＩＦＮ的产生（ＫａｗａｉａｎｄＡｋｉｒａ，２０１０。但无活性的ＩＲＦ３表达后，由于其不能入核，因此不能诱导）ＳＡＭＨＤ１的上调表达，但能够促进ＳＡＭＨＤ１启动子巧光素酶的活性。只有活化形式的ＩＲＦ３表达促进ＳＡＭＨＤ１的表达和启动子巧光素酶的活性。ＩＲＦ７虽然能够促进ＳＡＭＨＤ１的显著表达，但其诱导启动子巧光素酶活性的能力较弱。因此我们推断，ＩＲＦ３在诱导ＳＡＭＨＤ１７２ 表达方面具有直接的作用。通过后续ＩＲＦ３ＲＮＡ干扰实验发现，ＩＲＦ３一－ａ诱导ＳＡＭＨＤ表达下降后，ＩＦＮ１的表达量下降ＲＦ３；进步抑制Ｉ－ａ处理的ＭＡＲＣ－憐酸化入核后，ＩＦＮ１４５细胞和ＨｅＬａ中及ＮＤＶ感染ＭＡＲＣ－１４５细胞中，ＳＡＭＨＤ１上调表达被明虽抑制。因此，ＩＲＦ３的磯酸化入核在上调ＳＡＭＨＤ１表达方面具有重要作用。了解ＳＡＭＨＤ１表达调控机制，对了解病原感染的早期致病机理和防控策略的提出，具有深远的意义。７３ 第四章全文结论１ＰＩ３ＫＡｋｔ下游的ＧＳＫ－．／３信号分子与病毒感染増殖密切相关。非结构蛋白Ｎｓｐ２上的Ｎ４０１Ｄ、Ｄ７９５Ｎ突变和Ｎｓｐｌ２上民１２１Ｗ突变影响病毒体外增殖能力；结构蛋白ＧＰ３上的Ｐ２０４Ｓ突变和ＧＰ４上的Ｆ５Ｌ、Ａ２２Ｖ的突变增强了病毒体外复制的能力，并增强病毒诱导Ａｋｔ活化的能力。２．天然免疫限制性因子ＳＡＭＨＤ１在ＰＲＲＳＶ感染过程参与机体的抗病毒作用，ＩＲＦ３的憐酸化入核对诱导ＳＡＭＨＤ１的上调表达具有至关重要的作用。７４ 参考文献１ＡｋｉｒａＳＵｅｍａｔｓｕＳＴａｋｅｉ０２００６．Ｐａ化ｏｅｎＫｃｏｎｉｔｉｏ打ａｎｄｉｎｎａｔ：ｅｉｍｍｕｎｉｔ．Ｃｅｌｌ１２４：．ｕｃｈ，，，ｇｇｙ７８３－８０１．２．Ａ化ｉｎａＥ，１９９７．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｌ：ｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＰＲＲＳ）：ａ凸－ｏｖｅｒｖｉｅｗＶｔｉｉｉｌ５５３０９３６．．ｅｅｒｎａｒｙｍｃｒｏｂｏｏ：１ｇｙ－３．ＡｌｂｉｎａＥＣａｔＣＣｈａｒｌｅＢ１９９８．ＩｎｔｅｒｆｅｒａｌｈａｒｅｓｏｎｓｅｔｏｓｗｉｎｅａｒｔｅｒｉｖｉｍｓＰｏＡＶ化ｅ，ｒｒａ，ｙ，ｏｎｐｉｐ（），－ｏｒｃｉｎｅｒｅｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｉｒａ化ｒｓｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ．Ｊ虹ｔｅｒｆｅｒｏ打Ｃｔｏｋｉｎｅ民ｅｓ１８：４８５４９０．ｐｐｐｙｙｙ４－ｌｌｌｔＣｄ浊ｉｔｏｖｌ２００１ｉｉｄｌｔｄｅｄＲｄ．ＡｅｘｏｏｕｏｕＬＨｏＡＭｅｅｔａ．．ＲｅｃｏｎｔｏｎｏｆｏｕｂｅｓｒａｎＮＡａｎｐ，，氏，ｇ－－－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆ．ＮＦｋａｐｐａＢｂｙｏｌｌｌｉｋｅｒｅｃｅｔｏｒ３．Ｎａｔｕｒｅ４１３：７３２７３８Ｔｐ５．．ｔ．Ａｌｌｅ打ｄｅ民ＩＣｕｔｉｓｈＧＦＬａｅｒｅｉｄＷｅｔａｌ２０００Ｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅｅ打ｏｍｅｏｆｏｒｃｉｎｅｒｅｒｏｄｕｃｉｖｅ，，ｇ，，ｇｐｐａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｒｅｓｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒｔｈｅａｔｅｎｕａｔｉｏｎｈｅｎｏｔｅ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙｙｐｐｙｐ－１４５１１４９１１６１．：６ｉＭｏｌｉｉｉ．ＢａｕｔｓｔａＥＭｔｏｒＴＷ１９９９．ＩＦＮａｍｍａｎｈ化Ｕｓｏｒｃｎｅｒｅｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｉｒａｔｏｒ，，ｇｐｐｐｙ－ｓｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓｒｅｌｉｃａｔｉｏ打ｉｎｍａｃｒｏｈａｅｓ．ＡｒｃｈＶｉｒｏｌ１４４：１１９１１２００．ｙｐｐｇ－７：ｒｅ．ＢｅｏＭＧＭｅｒｃｉ巧ＪＣｏｈｅｎ￡Ａ２０１２．Ｖｉｒｕｓａｃｔｉｖａｔｅｄｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｒｅｕｌａｔｏｒ拉ｃｔｏｒ７ｕｕｌａｔｅｓｇ，，ｇｙｐｇ－ｉｏｎｏｆ化ｅｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｒｅｕ；ｉｉｌｉ．ｌｅｘｒｅ巧ｇｌａ１ｅｄＢＳＴ２ｇｅｎｅｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｅ）口ｓｎａｎＪｏｕｒｎａｐｇｇ－ｏｆｉｒｏｌｏ８６３１３３５２７．ｖｇｙ：５８．．ＢｅｌｌａｃｏｓａＡＫｕｍａｒＣＣＤｉＣｒｉｓｔｏｆａｎｏＡｅｔａｌ２００５．ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＡＫＴｋｉｎａｓｅｓｉ打ｃａｎｃｅｒ：，，，，－ｉｔｖａ打ｃｅｈ９４ｉｍｐｌｃａｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ化ｒｇｅｔｉ打ｇ．Ａｄｓｉｎｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃ：２９８６．９．ＢｅｎｆｉｅｌｄＤｌｓｏｎＥｌｌｉｓＪＥｔｌ．１９９２．ＣｈａｉｚａｔｉｏｆｓｗｉｎｅｉｎｆｅｒｉｌｉｔａｎｄＡ，Ｎｅ，Ｃｏｎ，ｅａｒａｃｔｅｒｎｏｔ，ｙ－ｖｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｎｄｒｏｍｅＳＩＲＳｖｉｒｕｓｉｓｏｌａ化ＡＴＣＣＶＲ２３３２．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｔｅｒｉｎａｒｄｉａｎｏｓｔｉｃｙ（）（）ｙｇｉｎｖｅｓｔｉａｔｉｏｎ：ｏｆｉｃｉａｌｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｏｆ出ｅＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒＬａｂｏｒａｔｏｒｇｐｙｙＤ－ｉａｎｏｓｔｉｃｉａｎｓ４：１２７１３３ｇ，Ｉｎｃ．１０．ｖｅａｎｄ．ＢｅｕｒａＬＫＳａｒｋａＳＮＫｗｏｎＢｅｔａｌ．２０１０Ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｒｏｄｕｃｔｉｒｅｓｉｒａｔｏｒｓｎｄｒｏｍｅ，ｒ，，，ｐｐｙｙｖｉｍｓｎｏ打ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏ化ｉｎ１ｂｅｔａｍｏｄｕｌａｋｓｈｏｓｔｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｂｙａｉＵａｇｏ打ｉｚｉｎｇＩＲＦ３ａｃ－ｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ８４：１５７４１５８４．＊１１．ＢｅｅｒＪＦｉｃｈｔｎ巧ＤＳｃｈｉｍｎｅｉｅｒＨｅｔａｌ．２０００ｉｖｉｒ．Ｐｏｒｃｉｎｅｒｅｒｏｄｕｃｔｅａｎｄｉｅｓｒａｔｏｒｓｎｄｏｍｅｙ，，，，ｐｐｙｙｉｒｕｓＰＲＲＳＶｋｉｅｔｉｃｓｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｌｈａｔｉｏｒａｎｓａｎｄｌｕｎ．Ｊｏｌｅｔｅｒｉｎａｒｉｃｉｎｅ．ｖ（）：ｎｙｍｐｃｇｇｕｒｎａｏｆｖｙｍｅｄ－ＢＩ打ｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓａｎｄｖｅｔｅｒｉｒｕｂｌｉｃｈｅａｌｔｈ４７．：９２５，打ａｙｐＵｏｄＳａｕｖ＇，ａｌｉｄｕｉｉｔｄ１２．ＢｅａｕＲＤｅａＳｅａｕ民Ａｅｔａ．１９９１．Ｐｏｒｃｎｅｒｅｒｏｃｔｖｅａｎｄｒｅｓｒａｏｒｓｒｏｍｅ，，ｇ，，ｐｐｙｙｎ＊－ｉｎｕｅｂｅｃＴｈＶｔｅｉ１２９１０２１０３Ｑ．ｅｅｒｎａｒｙｉｅｃｏｒｄ：．－－．Ｂｌａｓｉｕｓ．１３ＡＬＢｅｕｔｌ舟Ｂ２０１０？Ｉｎ任ａｃｅｌｌｕｌ扣化Ｈｌｉｋｅｒｅｃｅｔｏｒｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔ３２：３０５３１５，，ｐｙ－１目ｄａ－ＭＨＤｌ４．ｒａｎｒｉｚＮｕｎｅｚＡＶａｌｌｅＣａ如ｓｏＪＣＷｈｉ化ＴＥｅｔａｌ．２０１２．ＲｏｌｅｏｆＳＡｎｕｃｌｅａｒ，，，，－ｌｏｃａｉｚａｔｉｏｉｉｃｔｉｏｎｏｆＨＩＶ１ａｎｄＳＦＶＲｅｔｒｏｉｌ９：４９ｌｎｎｒｅｓｔｒｍａｃ．ｖｒｏｏｇｙ．．Ｂｕｃｈｋｏｖ．１５ｉｃｈＮＪＹｕＹＺａｍｉｅｒｉＣＡｅｔａｌ．２００８ＴｈｅＴＯＲｒｉｄａｆｆａｉｒｓｏｆｖｉｒｕｓｅｓ：ｅｆｆｅｃｔｓｏｆ，，ｐ，，－－ｍａｍｍａｌｉａｎＤＮＡｖｉｒｕｓｅｓｏｎｔｈｅＰＩ３ＫｋｔｉｎａｌｌｉｎａｔｈｗａＮｉｓ．ＡｍＴＯＲｓｇｇｐｙ．ａｔｕｒｅｒｅｖｅｗＭ－ｉｃｒｏｂｉｏｌｏ６２６６２７５．：ｇｙｄａｅｖｉｖｏｉｉｉ化１６．ＢｕｄｒｔＷＶａｎＲｅｅ出ＫＰｅ打ｓａｅｒｔＭ１９９８．ＩｎａｎｄｉｎｖｔｒｏｎｔｅｒｆｅｒｏｎＩＦＮｓｔｕｄｉｅｓｗ，，，（）化＾ｅｏｒｃｉｎｅｒｅｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｉｉａ化ｒｓｎｄｒｏｍｅｖｉｍｓＰＲＲＳＶｄｖａｎｃｅｉｎｅｘｒｉｍｔａｌｐｐｐｙｙ）．Ａｓｅｅｎ（ｐ－ｍｅｄｉｃｉｎｅａｎｄｂｉｏｌｏ４４０．ｇｙ：４６１４６７－．Ｂｕｉｔｅｎｄ．１７ｉｋＭＥｔｅｒｈａｓＳＫＨｏｗｅｌｌＡＬ２０１４ＴｏｌｌＬｉｋＲｅｃｅｔｏｒＡｏｎｉｓｔｓＡｒｅＰｏｔｅｎｔｊ，ｓｚ，，ｅｐｇｈ化－ＩｎｉｔｏｒｓｏｆＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃＶｉｒｕｓＴｅ１ＲｅｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＰｅｒｉｈｅｒａｌＢｌｏｏｄｙｙｐｐｐＭｏｎｏｎｕｃｌｅａｒＣｅｌｌｓ．ＡＩＤＳｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｈｕｍａｎｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．１８．ｉ．ＢｕｒｅｒｉｎＢＭＫｏｓＧＪ２００２．Ｃｅｌｌｃｃｌｅａｎｄｄｅａ化ｃｏｎｔｒｏｌ：ｌｏｎｌｉｖｅＦｏｒｋｈｅａｄｓＴｒｅｎｄｓｎｇｇ，ｐ，ｙｇｂ－ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅｓ２７：３５２３６０．ｈ＂ａｎｔｌ．ｌｖｔ／也ｗｉｌｌｃｌｅ１９．ＣＦＬｅｅＪＴＮａｖｏｌａｎｉｃＰＭｅａ．２００３虹ｖｏｅｍｅｎｏｆＰ巧ＫＡｋｔａａｎｃｅｃｇ，，，，ｐｙｙｒｏｒｅｓｓｉｏｎａｏＵ）ｓｉｓａｎｄｎｅｏｌａ巧ｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ａｔｅｔｆｏｒｃａｎｃｅｒｃｈｅｍｏｔｈｅｒａ．ｐｇ，ｐｐ，ｐａｒｇｐｙ－Ｌｅｕｋｅｍ：．ｉａ１７５９０６０３２０－．ＣｈａｕｎＨＣＣｈｅｎＣＷＨｓｉｅｈＢＬｅｔａｌ２０１０ＴｏｌｌＵｋ民Ｕｉｉｉｎｅｇ．．ｅｅｃｅ）ｒｅｘｒｅｓｓｏ打ｓｎｏｒｃ，，，，ｐｐｐ７５ 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