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分类号学号南玄复羞犬每硕士学位论文猪流行性腹泻病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响高君恺指导教师杨倩教授专业名称基础兽医学研究方向黏膜免疫答辩日期二一三年六月 EFFECTSOFPORCINEEPIDEMICDIARRHEAVIRUSINFLUENCEDTHEMICROFILAMENTCYTOSKELETONANDTHETIGHTJUNCTIONSByGaoJunkaiSupervisor:Prof.YangQianADissertationSubmittedtoNanjiangAgriculturalUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsForMasterDegreeofAgronomyCompletedinApril,2013CommencementinJune,2013 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研宄工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者(需亲笔)签名：高卷年么月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密□,在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保蜜请在以上方框内打“十)学位论文作者(需亲笔)签名：高名感年〈月《曰年月曰 目录目录本文部分缩写的中英文对照引言第一篇文献综述第一章猪流行性腹泻病毒的研究进展胃鮮流行病学病理变化培感染受体飾防治措施灭活疫苗弱毒疫苗基因工程疫苗其他免疫措施参考文第二章病毒对细胞微丝骨架和紧密连接的影响微丝骨架微丝的结构肌动蛋白结合蛋白紧密连接跨膜蛋白胞质蛋白微丝在病毒生命周期中的作用微丝与病毒入胞病毒复制和组装病毒释放与传播 硕士论文猪流行性腹泻病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响参考滅第二篇试验研究‘第三章猪流行性腹泻病毒感染细胞的病理变化材料和方法病毒禾口细胞主要试剂主要设备试验方病毒的培养与滴定病毒的形态观察猪流行性腹泻病毒对感染复数的摸索以及染色观察猪流行性腹泻病毒在细胞中的增殖情况电镜观察细胞感染猪流行性腹泻病毒的超微结构变化统计学处理结果与分析猪流行性腹泻病毒电镜负染猪流行性腹泻病毒感染细胞猪流行性腹泻病毒在中的增殖曲线猪流行性腹泻病毒对细胞的微绒毛的影响猪流行性腹泻病毒对细胞内部结构的影响讨论与小结参考：献第四章猪流行性腹泻病毒对紧密连接的影响浦糖法病毒禾口细胞主要试剂主要设备主要溶液配制试验方法细胞培养猪流行写病毒感染细鹏膜电阻的测定肠上皮细胞旁路瓶纖猪流行毒对细蛋白纖的影响 目录统计学处理结果与分析细胞跨膜电阻的变化猪流行髓湾病毒对肠上皮细胞的细胞旁賴银的影响猪流行性腹汚病毒对细胞连接蛋白表达的影响讨论与小结参考文第五章猪流行性腹泻病毒与微丝骨架的相互作用试验材料病毒和细胞主要试剂主要设备主要溶液配制试验方法细胞培养猪流行性腹泻病毒对细胞微丝的影响微丝稳定剂对猪流行性腹泻病毒滴度的影响细胞松弛素对猪流行性腹泻病毒的影响统计学处理结果与分析猪流行性腹泻病毒对细胞微丝的影响微丝稳定剂和细胞松弛素对病毐入侵、复制与释放的影响讨论与小结参考纖 中文摘要猪流行性腹泻病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响摘要微丝是支撑细胞的蛋白纤维网架系统,在细胞迁移、胞内物质运输等细胞活动中起必不可少的作用。病毒作为严格的胞内寄生者,为了创造有利于自身入侵、复制和释放的环境,进化了多种与宿主细胞骨架相互作用的机制,从而达到顺利入侵、准确到达复制位点进行高效复制、以及快速、远距离传播的目的。而细胞微丝被干扰后,细胞内病毒的活动也会受到明显抑制。广义上的微丝骨架也包括紧密连接蛋白部分。猪流行性腹泻是一种急性、接触性、高度传染性消化道疾病,近年来给养猪业带来巨大经济损失。本文以猪小肠上皮细胞系为试验对象,首次研究猪流行性腹泻病毒(与宿主细胞微丝骨架之间的相互作用,以及其对紧密连接的影响。填补猪流行性腹泻感染机理方面的研究空白,为日后进行猪流行性腹泻病毒的深入研究提供一定基础。猪流行性腹泻病毒感染细胞的病理变化本试验以细胞扩繁、为的试验材料,摸索合适的感染复数感染细胞。以蔗糖密度梯度离心方法浓缩纯化病毒,电镜负染观察病毒形态。见大量散在的、形态完整的病毒粒子,病毒粒子形态呈圆形、椭圆形、肾形和多边形。以染色观察感染的细胞,发现细胞肿胀变圆、折光性加强,细胞内出现很多小空泡；伴随空泡增多、逐渐合并形成大空泡,肿胀的细胞脱落、形成空隙；最终大量脱落的细胞碎片漂浮于细胞瓶中。方法检测的增殖情况,在感染后开始大量迅速增殖,达到最高峰,随后病毒量逐步下降。电镜观察细胞感染的超微结构变化,通过扫描电镜观察可见细胞微绒毛大量脱落消失、微绒毛顶端膨大变圆、可见数根融合形成蘑菇样膨大。透射电镜结果显示微绒毛内部微丝束消失、细胞内部微丝束紊乱、线粒体空泡化严重,细胞核膜与病毒接触部分出现溶解,未接触部分核膜界限清晰。结果说明,病毒可以在细胞上复制增殖,出现典型的空泡状病变,同时引起微绒毛脱落与细胞内部微丝骨架的紊乱。提示能够引起细胞内部微丝骨架的改变。猪流行性腹泻病毒对紧密连接的影响本试验主要从细胞跨膜电阻的测定、肠上皮细胞旁路转运试验来研究对肠上皮细胞屏障的影响,间接反映紧密连接完整性；随后通过检测细胞紧密连接蛋白表 硕士论文猪流行性腹泻病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响达量来直接反映紧密连接的改变情况。感染细胞的跨膜电阻值在感染后有短暂的上升,下降,直到电阻值再度高于正常对照组值。肠上皮细胞的细胞旁通道转运试验显示,随着感染时间的延长,熒光渗透性标记分子在细胞旁路转运量不断加大,转运率也逐渐增高。以检测对细胞紧密连接蛋白表达量的影响,发现紧密连接蛋白(、和和粘附连接蛋白(的表达发生了不同程度的变化。和这两种蛋白的表达量下调显著。到了,除了的表达量基本正常外,其余三种蛋白的表达量均下降到了正常表达量的左右。结果提示,的感染对紧密连接蛋白的表达量影响较小,而结合对微丝的影响极为显著,我们推测,可能并不依赖紧密连接蛋白作为入侵受体,而是病毒引起微丝骨架的重组,诱发近微丝环的收缩,从而导致紧密连接蛋白的变动。猪流行性腹泻病毒与微丝骨架的相互作用本试验主要探讨猪流行性腹泻病毒在感染过程中与微丝骨架之间的关系。以染色法对感染后的细胞进行观察后发现,微丝骨架感染后发生有规律的变化,我们人为地将微丝的变化划分为五个不同时期：解聚一期环膜期解聚二期环核期凋亡期。解聚一期,微丝开始解聚,微丝在细胞内呈现绿色雾状；环膜期,部分微丝束开始恢复,在细胞膜下形成围绕细胞的环状高亮微丝束；解聚二期,微丝再次开始发生解聚,肌动蛋白弥散分布；环核期,微丝在细胞核附近堆积形成散乱的斑块,部分细胞在细胞膜下有一图微丝形成的亮环,细胞间界限模糊；凋亡期,细胞大部分凋亡,脱落,残存的细胞微丝聚集浓染,为典型的凋亡细胞染色特征。以微丝稳定剂(和细胞松弛素改变细胞微丝的状态,通过检测细胞内病毒的来反映病毒的侵染情况。和都能够干扰入侵、复制和释放,影响复制和释放的效果更为显著(。结果提示,在感染宿主细胞的过程中,病毒能够影响微丝的分布,改变的数量,同时微丝对病毒有反作用,影响病毒的入侵、复制与释放。关键词：猪流行性腹泻病毒；猪小肠上皮细胞系；微丝骨架；紧密连接蛋白 ABSTRACTEFFECTSOFPORCINEEPIDEMICDIARRHEAVIRUSINFLUENCEDTHEMICROFILAMENTCYTOSKELETONANDTHETIGHTJUNCTIONSABSTRACTMicrofilament,astheskeletoninhostcell,playsanessentialroleintheintracellularmaterialtransport,cellmigration,,,,, 硕士论文猪流行性腹泻病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响,,, ABSTRACTJasplakinolide(Jas)andcytochalasinD(CytoD),whichareabletopromoteactinpolymerizationandinducedestabilizationoftheactinfilamentrespectively,wereappliedtotestifywhetheractinskeletoninterferePEDVinfection.ProgenyvirusparticleswerenotablydecreasebyCytoDandJasinvirusinvasion,proliferationandandrelease,whilethesuppressionofCytoDduringvirusproliferationandreleasewassignificant(P<0.01).ThesefindingssuggestthatPEDVinterferedmicrofilamentcytoskeletonandtheamountofF-actin, 本文部分缩写的中英文对照本文部分缩写的中英文对照猪流行性腹写病毒猪流行性腹湾猪小肠上皮细胞系扫描电镜透射电镜细胞跨膜电阻细胞旁路转运率微丝稳定剂细胞松她素柯萨奇腺病毒受体连接點附分子微丝结合蛋白综合症蛋作用蛋白细胞分裂周期蛋白胞内成熟病毒细胞内具被膜病毒隧道样纳米管 引言引言猪流行性腹湾是猪的急性、接触性、高度传染性的肠道病毒病,主要特征为引起感染猪的呕吐、水样腹汚及严重脱水。猪流行性腹汚病毒对幼年猪感染率高达日龄以下仔猪感染后死亡率达。在全球都造成极大的经济损失,虽然猪流行性腹浑病毒在我国年代才出现首次流行,但已给我国养猪业造成了巨大的危害。主要入侵勒细胞是小肠上皮细胞,病毒能在小肠域毛中复制。感染仔猪的小肠续毛萎缩、形状由立方形变成矮柱状,微续毛大量脱落。而细胞系是未吃初乳的乳猪空肠上皮中段细胞永生化细胞系,能够模拟仔猪肠道环境,在跨肠上皮的离子转运、肠道细胞增殖试验、以及细菌和病毒如何影响肠道环境的研究中都广泛应用,是仔猪肠道研究的理想细胞模型。细胞骨架是位于细胞的胞质内、用于支撑细胞的蛋白纤维网架系统,包括微管、中等纤维以及微丝,其中微丝在所有真核细胞中普遍存在且高度保守,而且在有丝分裂、细胞迁移、形成细胞突触、胞内物质运输等活动中有着必不可少的作用。广义上的微丝骨架也包括紧密连接蛋白部分。紧密连接的膜内部分与肌动蛋白丝和肌球蛋白组成的近连接环结构直接相连。近连接环能够控制细胞膜的收缩,肌球蛋白的收缩可以对紧密连接膜内部分产生离心性的牵引,进而调节紧密连接的渗透性。紧密连接位于上皮细胞间连接的最顶部,具有封闭细胞间隙、阻止管腔上皮层内外物质自由进出的功能,它也是上皮细胞选择性通透作用的物质基础。在细胞内微丝并不是固定不变的,而是不断地动态组装和解聚,来行使其功能。而许多病毒能够利用了微丝的动态组装以及在细胞内行使的功能来帮助自己在细胞内完成复制周期。从病毒的吸附入侵、运输到指定位点开始复制组装、将组装完成的成熟子代病毒运输到胞外进行传播,这一系列过程中都有微丝的协助和参与。而目前发现几种紧密连接的蛋白如、、柯萨奇腺病毒受体禾口连接黏附分子均可作为病毒的受体。通过结合和破坏这些紧密连接蛋白病毒就可达到入侵上皮的目的。小肠上皮细胞中的微丝骨架在营养物质的吸收和生理代谢中均发挥重要的作用,猪流行性腹宵病毒入侵机体的勒细胞主要是小肠上皮,因此研究猪流行性腹湾病毒与小肠上皮微丝骨架之间的相互作用具有较重要的意义,研究结果将为研究猪流行性腹 硕士论文猪流行性腹宵病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响海的感染机制提供更丰富的理论基础。 文献综述第一章猪流行性腹汚病毒的研究进展第一篇文献综述第一章猪流行性腹丨写病毒的研究进展猪流行性腹丨写是猪的急性、接触性、高度传染性的肠道病毒病,主要特征为引起感染猪只的呕吐、水样腹湾、脱水。仅发生于猪,各年龄的猪均能感染发病。对幼年猪感染率高达,日龄以下仔猪感染后死亡率高达。对周龄以下哺乳仔猪的感染力较弱,寒冷季节高发,潜伏期一般为。虽然猪流行性腹湾和同科的猪传染性胃肠炎都能引起症状相似的仔猪腹湾,临床上难以辨别,但在最近一份中国南部地区爆发仔猪腹丨写检验报告显示,流行性腹湾病毒的阳性率显著高于胃肠炎(,每年在养猪业造成的极大的经济损失。病原学猪流行性腹湾病毒依据国际病毒分类委员会,颁布的病毒分类,属于巢状病毒目冠病毒科,冠状病毒属〗。年的第八次报告定义为猪流行性腹湾病毒种’。年冠状病毒属开始划分亚科,划归到冠状病毒亚科,猪流行性腹湾病毒种。电镜负染病毒观察发现,病毒粒子具有囊膜,镜下形态多样,以球形为主,病毒粒子的平均直径(包括纤突)范围在之间,大多数病毒粒子的直径为。病毒粒子的中央为不透明高密度电子云,外缘为顶端膨大的花瓣样纤突,纤突长约,从核心向四周呈放射状分布。病毒基因组为单股正链,具有个幵放阅读框(,编码四个结构蛋白基因,纤突糖蛋白(、膜糖蛋白(、核衣壳蛋白(、小膜蛋白(三个非结构蛋白,复制酶、和。基因组的编码顺序为’复制酶】。细胞培养的在放置即失活,但时能保持病毒活性。培养基的为时,能在°下保持活性；而在°下欲保持病毒活性所需要的环境值在之间仅有一种血清型,虽然各地分离到的基因型却有差异不具有血凝特性。经排泄物传播是的主要传播途径,甚至可能是唯一的传播途 硕士论文猪流行性腹湾病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响径。类便样品病毒检出率高达,而乳汁样品的阳性率仅在〗。流行病学在全球都造成极大的危害,虽然是年才在英国首先发现病例的,但目前在许多亚洲国家已造成日益严重的经济损失。亚洲地区的呈地方性流行趋势。年在中国首次出现感染流行,年泰国出现的大流行,越南则是在年爆发。韩国、中国、日本、菲律宾、泰国,这些国家深受影响,对新生仔猪具有高致病率、高致死率的特征。欧洲发生的猪流行性腹湾与亚洲爆发的猪流行性腹湾相比较,欧洲流行的造成仔猪的感染较温和,引起仔猪的死亡率较低。在年中国南方爆发的大流行中,逾十多个省、过百万仔猪因此死亡’。检测报告中所有采样猪场均存在阳性猪,粪样中的检出率达到,而乳汁中检出率为仔猪感染后出现轻微出血、胃中有未消化的凝乳块,肠道粘膜萎缩,肠道内含有泡沫样液体,肠壁变薄。我们关注中国目前流行的毒株亲缘性,它可以通过基因组中的辅助基因—幵放阅读框来比对研究,与病毒的毒力有关。在传代细胞系上连续培养代致弱了,其基因逐渐发生突变,最终致弱株与原始毒株相比有两处缺失,七处突变,推测这些可能是与病毒毒力密切相关的重要位点。通过比对中国目前发现的株野毒株和疫苗株的全长基因,根据基因的系统发育树关系,中国野毒株和参考株被分为个群。中国野毒株除外和韩国毒株有着密切的亲缘关系,而与疫苗株的遗传关系不同。然而,和疫苗株的亲缘关系近,它可能是从疫苗株演化而来。病理变化猪流行性腹湾病毒主要在小肠线毛中复制。感染猪的肠道内充满黄色水样内容物,有时还含有未消化凝乳块,肠壁变薄变透明,肠系膜淋巴结有时肿大。通过显微镜观察,小肠内微线毛萎缩,萎缩的肠续毛上皮细胞常含有大量空泡,形状由立方形变成矮柱状,刷状缘模糊不清。纸毛高度与隐窝深度比显著下降,微续毛大量脱落,。仔猪肠道纸毛萎缩,肠统毛顶部有些细胞变形、细胞核固缩。黏膜固有层有大量淋巴细胞、嗜酸性细胞和中性粒细胞浸润,有时可见充血和水肿。空肠和回肠病变最严重,盲肠和结肠除了浅表肠细胞空泡化外物明显病变上皮细胞脱落最早发生于腹湾后。 文献综述第一章猪流行性腹丨写病毒的研究进展等对日龄仔猪接种株,发现接毒后即可见感染细胞,达到感染高峰。线毛长度与隐窝深度比由正常的缩小为,用的株对仔猪进行攻毒,第一天病毒释放量便达到峰值,释放量约在个拷贝,随后病毒拷贝数逐日下降。以仅造成感染而不致死剂量的株对仔猪进行攻毒,发现天后排毒量达到峰值。细胞培养自从分离得到以后,人们尝试着不同的细胞来实现它的体外扩繁,但都没有成功。直到将接种细胞时,首次使用加入胰酶的培养基进行培养,才使得感染细胞产生病变,终于攻克了这一难题。目前体外分离、培养已普遍采用这一经典方法,其原理可能是胰酶对的纤突糖蛋白具有切割作用,在病毒感染细胞时加入胰酶,能够加强病毒对细胞的感染力。此后,在胎猪肠组织原代单层细胞培养、仔猪膀胱原代上皮细胞和、等传代细胞系上也都已经成功培养以感染胎猪肠组织原代单层细胞为例,细胞病变效应(明显,感染细胞肿胀变圆,折光性增强,产生空泡和合胞体,感染后期细胞脱落形成大量空斑。在单层细胞培养物的电镜切片中,可以观察到球形或近球形的病毒粒子,左右,未成熟的病毒呈周围电子密度大、中间密度小的圆形,而成束的病毒粒子的核心密度均一深染。在培养细胞中,病毒粒子多为单独存在,而在回归感染仔猪肠道上皮细胞内,可见几个或十几个聚集在一起,并有膜包裹,形成大小不等的病毒包涵体。有时可见病毒出芽。感染受体病毒感染发生的首要条件便是病毒粒子表面的纤突糖蛋白能与特异性受体结合,易感动物的肠道表面存在有大量病毒特异性受体物质,幼龄动物比成年动物对病毒感染更为敏感,是由于幼年动物粘膜表面的受体更加丰富。是猪上旳冠状病毒感染细胞受体,称为猪氨基肽酶受体(,大小约为。在仔猪小肠组织中表达量非常丰富,并且主要分布于小肠续毛的刷状缘。有报道称在感染细胞培养体系中添加会明显提高病毒滴度。目前发现和的感染都需要的参与。冠状病毒感染的细胞受体有着种属特异性,感染人冠状病毒的细胞需要而猪冠状病毒只感染有着受体的猪。通过 硕士论文猪流行性腹丨写病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响免疫共沉淀的方法,验证了与高度亲和结合的是病毒蛋白上的受体结合区(口；。细胞为犬肾脏细胞,在细胞系中不能增殖,但细胞转染表达后,可以感染。而病毒感染与的浓度有着密切的关系。并不能感染细胞,但却能够在上大量增殖,研究发现这是由于细胞表面的表达量非常少,如果将在细胞上过表达,可以实现对细胞的感染；并且表达程度越高,病毒的感染效率也越高因此,可以推断的密度在的感染过程中起关键作用。的鼠单链单抗菌体展示库已建立,这将为研究在以及其他利用受体入侵的病毒的机制研究提供技术支持。诊断本病在临床症状方面与猪传染性胃肠炎无显著差别,只是病死率比猪传染性胃肠炎稍低,在猪群中的传播速度也缓慢些。可利用电子显微镜作病原学诊断,观察到病料或病料培养物当中的典型冠状病毒病毒样粒子,但无法做出准确判断,一来不易观察到病毒粒子,二来容易与猪传染性胃肠炎病毒混淆,还需要结合血清学诊断,才能做出病原学诊断。免疫焚光和免疫组化也是特异性较高的检测方法,敏感、快速、可靠,但仅适用于急性腹汚期内,尤其是发病后内扑杀的患病仔猪小肠切片的检测。的方法检测病料中的抗原和血样中的特异性抗体,适用于检测大量样本,在临床检验中广为应用。方法的建立以及新兴环介导逆转录等温扩增技术在上的运用都为快速高效检测流行性腹湾病毒带来新的方法。防治措施在欧洲造成的经济损失并不如亚洲严重,所以的疫苗研发和生产应用主要集中在亚洲地区。灭活疫苗疫苗发展前期,组织灭活苗和细胞灭活苗使用的比较多,主要优点在于安全、不存在散毒的风险,疫苗抗原含量高、能在仔猪体内产生持久的免疫力,而且易于运输和保持。我国研制的灭活疫苗釆用猪后海穴免疫接种,除激活体液免疫和细胞免疫外,还能激活肠道局部點膜免疫,所以与常规途径接种灭活疫苗免疫相比,具有更好的免疫效果。不过灭活苗注射剂量大、而且后海穴注射对兽医免疫人员操作技能 文献综述第一章猪流行性腹湾病毒的研究进展要求高,难以推广。弱毒疫苗研究发现在细胞上连续传代能被致弱,这为弱毒苗的发展奠定了基础。日本年研发的株弱毒疫苗对的预防有一定效果,但免疫母猪后,不能保证母猪分泌的乳汁中含有足够的抗体,使仔猪获得的母源抗体保护力。传代代致弱的株口服疫苗证实比肌肉注射灭活疫苗更加有效,并且在仔猪上进行连续代毒力返强试验,结果证明其依然安全。怀孕母猪口服接种弱毒株,仔猪感染的死亡率大为下降,该毒株在韩国年已被注册专利并用作商品化口服疫苗,菲律宾也在年开始推广使用。口服弱毒苗克服了肌肉注射灭活疫苗的单次免疫剂量大,免疫期短,需要加强免疫并且容易造成局部反应的缺点,并且口服后能有效刺激动物肠道點膜免疫系统产生特异性免疫反应。不过口服弱毒苗的免疫力主要取决于给予的剂量,低剂量免疫弱毒苗后仅有的猪获得免疫力,而口服剂量加大倍后免疫保护力能够提高到。另一个缺点是弱毒苗免疫后的猪群存在散毒情况。免疫后散毒量是衡量弱毒苗免疫保护力的指标之一。即使疫苗已被众多国家列为商品化疫苗,但接种后的仔猪仍存在散毒的概率。血清抗体效价越高,仔猪腹湾的程度越低、持续时间越短、散毒周期也越短。理想的疫苗应该能完全阻断的散毒。而减毒活疫苗的缺点在于需要较高剂量的弱毒,容易造成的散毒,而且存在一定的返强风险,中国已检测到新的基因型(与疫苗株间的很近的亲缘关系,因此,活疫苗有可能加剧感染的势态。基因工程疫苗基因工程疫苗的出现为疫苗的开发开辟了新思路。目前已有报道的是转基因植物、重组活载体疫苗和疫苗等。转入蛋白的烟草植物,免疫小鼠可以产生免疫抵抗力；而给猪词喂转基因胡萝卜、莴苣,动物体内能诱导产生特异性中和抗体。植物疫苗可以规模量产,生产成本低,运输储存很方便,植物载体比微生物载体更能保证抗原蛋白的免疫原性,不需要疫苗接种设备和技术人员,植物细胞壁抵御胃肠道酸环境和蛋白酶的干扰,能在小肠中逐渐释放抗原,但转基因植物表达抗原效率低,而且不能确保动物吃下足够产生保护力的免疫剂量,而且植物疫苗的生物安全性也令人担忧。将重组沙门氏菌和重组腺病毒作为活载体,构建的疫苗能够有效的针对病毒的局部黏膜免疫应答和全身免疫反应；重组蛋白和蛋白的干酪乳杆菌, 硕士论文猪流行性腹浑病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响小鼠和猪口服后不产生病毒的中和抗体,但能产生高水平黏膜和非中和抗体的全身免疫反应,,疫苗的设计仍待改进。活载体疫苗免疫效力高、成本较低、但其生物安全性、遗传稳定性尚待验证,选择合适的活载体很关键,而且真正理想的重组疫苗不应含有抗性蹄选基因,国际上获准商品化的重组载体疫苗寥寥无几。共表达基因和的疫苗的接种小鼠后能产生较强的细胞免疫和体液免疫水平。疫苗免疫效力高,注射一次能产生长期免疫力,不过其安全性仍待商榷,而且疫苗长期在体内表达可能会引起机体的免疫耐受也是疫苗的不足之处。在不断发展新型疫苗的基础上,人们也在研究如何能更好的提升疫苗免疫效果。常规方法是借助佐剂,或是在基因工程苗构建时共表达细胞因子,还有一种新的策略是将疫苗设计成紀向到抗原递呈细胞(,特别是树突状细胞或者细胞,从而能够更加有效的递呈抗原,提升疫苗免疫效果。等构建的水稻基因工程疫苗,表达基因的中和表位,同时融合表达细胞靴向多肽。饲喂小鼠后在血清及粪便中检测特异性抗体,词喂细胞祀向的水稻实验组比词喂单纯的水稻对照组抗体水平显著上升,而脾脏特异性抗体分泌细胞)的数量比对照组升高了三倍,的数量比对照组升高了八倍；派尔氏斑处的数量相比对照组提升了倍。试验证明小鼠口服转基因祀向细胞的水稻疫苗后,激发了更好的點膜免疫和系统免疫水平。其他免疫措施除了常规疫苗免疫保护外,还有其他的预防性免疫措施,如给仔猪服用抗的鸡卵黄免疫球蛋白和牛初乳,也能提高感染仔猪存活率。重组大肠杆菌细胞表达的鼠单链单抗体外试验能阻止感染勒细胞可能作为预防感染的候选药物。而给仔猪词料中添加表皮生长因子(,它能刺激肠道隐窝上皮细胞增殖、修复小肠绒毛的损伤,可以促进感染造成的仔猪萎缩性肠炎的康复。已被证实可以改善病毒性萎缩性肠炎的症状,但过于昂贵并且的安全性仍存在争执。在抗感染过程中体液免疫和细胞免疫都非常重要,而由于具有肠道亲嗜性,局部肠點膜免疫系统也发挥着不可替代的作用。由于肠道局部免疫反应的高峰比全身性免疫出现的早,周期短,不少研究学者将目光转向點膜免疫,希望能借此控制。肠道对免疫反应部位主要位于空肠下段、回肠和回盲口。等利用酶联免疫斑点技术找到了猪感染后,點膜相关淋巴组织和全身淋巴组织中能分泌共同特异性抗体的细胞。目前我们了解的关于如何诱发机体产生點膜免疫的机制 文献综述第一章猪流行性腹宵病毒的研究进展还很有限,如何更好的利用黏膜免疫来防控值得投入更多的研究。 文献综述第一章猪流行性腹丨写病毒的研究进展参考文献,’,,,,,,,,,,”,,,,,,—陈建飞,王承宝,时洪艳猪流行性腹丨写病毒的分子流行病学研究中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会中国黑龙江哈尔滨,, 文献综述第一章猪流行性腹汚病毐的研究进展’,,宣华,邢德坤,王殿,应用猪胎肠单层细胞培养猪流行性腹丨写病毒的研究兽医大学学报,,,,’,,,,,,,’’,,, 硕上论文猪流行性腹写病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响,,’,,,,,’, 文献综述第二章病毒对细胞微丝骨架和紧密连接的影响第二章病毒对细胞微丝骨架和紧密连接的影响微丝骨架细胞骨架(是位于胞质内、支撑细胞的蛋白纤维网架系统。目前发现组成细胞骨架的成分主要有以下三种：微管(、中等纤维以及微丝其中微丝在所有真核细胞中普遍存在且高度保守,在细胞迁移、肌肉收缩、形成细胞突触、有丝分裂、胞内物质运输等活动中有着必不可少的作用。微丝的结构微丝,因其直径仅有,又称为细丝。在细胞内微丝并不是固定不变的,而是不断地动态组装和解聚,来行使其功能。微丝依据其聚合状态可分为两种形式：纤维状多聚肌动蛋白(和球形肌动蛋白单体(。由两股线性排列的肌动蛋白单体螺旋扭转构成,单体的方向决定了微丝的正负极性。微丝动态组装分为三个过程：首先是成核过程(,形成起始复合物,聚合过程开始；在快速延长阶段,快速地从短纤维的两端添加上去,正端增长速度较负端快；到达稳定期时,微丝的解聚和聚合呈动态平衡。细胞内部的微丝网络包括应力纤维与皮质肌动蛋白网络。由大量平行排列的微丝形成的微丝束称为应力纤维,常横贯于细胞长轴。而肌动蛋白以网状微丝形式分布于细胞膜下,称为皮质骨架或皮质肌动蛋白网络。在细胞膜周缘,微丝纤维还构成细胞的微绒毛、伪足小体、片状伪足(、丝状伪足(及膜皱褶(等膜性结构的内芯。以微线毛的内芯为例,肌动蛋白丝束在其中束状排列,肌动蛋白丝之间由许多微域毛蛋白(和丝束蛋白(组成的横桥相连。微线毛侧面质膜有侧臂含有和韩调蛋白与肌动蛋白丝束相连,从而将肌动蛋白丝束固定。肌动蛋白结合蛋白微丝骨架是由肌动蛋白组装的多聚体和微丝结合蛋白组成。大约有多种,可以特异地与各种类型的肌动蛋白结合或分离,在微丝骨架肌动蛋白的折叠聚合交联成核现象及微丝运动中起主要的调节作用。 硕士论文猪流行性腹海病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响成核成核是微丝纤维组装的第一步,数个先组装成多聚体,然后其它单体继续添加形成长纤维分子。成核相关蛋白复合体在体内和体外都可以促进肌动蛋白的核化。能启动肌动纤维丝分支的聚合化,形成肌动蛋白网架。就自身而言,其刺激聚合的能力很弱,但与多聚诱导因子如家族和作用蛋白,相互作用后刺激聚合的能力增强,微丝分支迅速延长。板状伪足中微丝聚合也是复合物介导的,可在数秒内组装新的微丝。而目前研究发现病毒能够利用。形成素(启动肌动蛋白单体聚合,帮助微丝成核与延伸。细胞伪足的形成与密切相关。家族同源蛋白和综合症蛋白都能调节伪足部位的微丝聚合,活性在细胞膜皱边处募集,伪足形成,随后反向调节,若缺失,反馈环则不起作用,由募集代替功能微丝的组装、去组装及稳定一旦成核,单体肌动蛋白迅速组装到正端,形成长链微丝。封帽蛋白、丐结合微丝蛋白(和张力蛋白(等给微丝负端加上帽,能减少激动蛋白单体的去组装,使得微丝能迅速增长；如果给正端加上帽,阻止单体的结合,阻断微丝组装,从而控制微丝的长度。而还具有切割微丝的功能。肌动蛋白解聚因子(和丝切蛋白(则有着让微丝解聚的能力。结合促使从微丝的负端脱落,微丝作用蛋白可以协助解聚微丝、及在正端加帽,抑制微丝的增长。原肌球蛋白(能稳定微丝、对抗切割作用和的解聚作用。原肌球蛋白和伴肌动蛋白被认为是能决定微丝长度的标杆。单体聚合蛋白中家族、双解丝蛋白(可以结合,帮助单体从微丝上脱落；、细胞粘着蛋白(促进获能成为并运送到微丝正端或结合,推动下一轮聚合作用。除了能直接结合到上的之外,还有一些能够通过信号通路途径影响微丝骨架,促使其重排。血管扩张刺激磷蛋白(和粘着斑蛋白(等富含多聚脯氨酸亚基的蛋白可以结合等微丝结合蛋白,随后微丝幵始聚合；含有区的微丝结合蛋白招募粘着复合物(如皮层肌动蛋白在膜转运过程中起作用。 文献综述第二章病毒对细胞微丝骨架和紧密连接的影响肌动蛋白单体库并非所有肌动蛋白单体都参与微丝的组装,细胞内约为可溶性肌动蛋白单体,它们结合单体隐蔽蛋白(构成隐蔽的肌动蛋白库,当组装需要时,被释放出来。胸腺肽(与结合可阻止肌动蛋白结合到微丝的正端或负端。微丝功能的发挥依赖于微丝与肌动蛋白单体库之间的动态平衡,这种动态平衡受单体浓度和微丝结合蛋白等因素的影响。微丝高级结构的形成微丝交联成网络,然后在细胞内发挥作用’】。交联蛋白(具有两个或两个以上同肌动蛋白结合的位点,能够使两个或多个肌动蛋白纤维产生交联,使细胞内的肌动蛋白纤维形成网络结构。有些交联蛋白是杆状的,能够弯曲,由这种交联蛋白形成的网络结构具有相当的弹性,因而能够抵抗机械压力,比如丝束蛋白横向连接相邻微丝,交联成三围网状结构。而有些交联蛋白(束捆蛋白和是球状的,能够促使肌动蛋白成束排列,如微纸毛及其衍生物中的肌动蛋白束就是靠交联的,主要在丝状伪足中交联肌动蛋白束。与微丝信号转导通路中家族与骨架相关膜受体相关成员调节也影响细胞骨架的改变。调节诸如聚合、胞间连接装配、细胞极性、细胞迁移和膜转运在内的数个细胞进程。超过种成员调节细胞骨架动力。其中最重要的几个成员：,与应力纤维形成相关；,诱导膜皱裙和板状伪足形成；细胞分裂周期蛋白调节突出丝状伪足的形成】。目前发现许多病毒,能编码一些基因产物,利用并劫持细胞微丝骨架,特别是经由信号系统来影响相关肌动蛋白结合蛋白尤为常见。微丝常用药物在研究微丝的功能时,常常利用一些药物促进微丝的聚合或对微丝进行解聚,来创造出微丝稳定或紊乱的状态,从而保证能在特定环境下研究微丝对病毒的影响。常用的微丝解聚剂包括：、：和能和肌动蛋白单体结合形成的混合物,降低自由的数量,从而抑制结合到微丝上去,达到微丝解聚的目的。、细胞松驰素：、、、的作用机制是, 硕士论文猪流行性腹海病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响覆盖于肌动蛋白的末端,阻止其快速延长,使细胞内肌动蛋白聚合受阻；促进短微丝的成核与多聚。、能够结合,使胞质中自由数量下降,并且能够切割,此外能抑制肌球蛋白的活性。作用细胞之后,用鬼笔环肽染色发现,含量急剧下降,说明其微丝解聚作用十分明显。而常见的微丝稳定剂有：、鬼笔环肽)：它的作用于细胞松池素的作用正好相反,只与结合,而不与结合。它与聚合的微丝结合后,抑制微丝的解体,因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。其焚光标记物是鉴定的重要试剂。、：与结合,有利于微丝的组装过程,促进微丝聚合；处理剂量过大或时间过长,会阻碍细胞内部的皮质肌动蛋白和应力纤维的组装,有细胞毒性作用。紧密连接紧密连接亦称闭锁小带或结合小带,是相邻细胞以细胞膜外层局部融合方式形成的连接装置。跨膜蛋白直接相连形成拉链状的封闭索,紧密连接位于上皮细胞间连接的最顶部,具有封闭细胞间隙、阻止管腔上皮层内外物质自由进出的功能,它也是上皮细胞选择性通透作用的物质基础。紧密连接通过胞质衔接蛋白与微丝相连,结构上可分为跨膜蛋白,和和胞质蛋白、、。相邻细胞间的跨膜蛋白的胞外部分互相作用,形成细胞间隙,而胞内部分则是与胞质支架蛋白、直接结合,在通过与肌动蛋白丝和肌球蛋白组成的近连接环(结构直接相连,近连接环与胞内肌动蛋白骨架结合,形成稳定的连接系统。细胞内微丝骨架的变动直接影响近连接环,因此近连接环能够控制细胞膜的收缩,从而肌球蛋白的收缩可以对紧密连接膜内部分产生离心性的牵引,调节紧密连接的渗透性】。广义上的微丝骨架也包括紧密连接蛋白部分。目前发现几种紧密连接的蛋白如、、和均可作为病毒的受体。通过结合和破坏这些紧密连接蛋白病毒就可达到入侵上皮的目的。跨膜蛋白是分子量为的跨膜蛋白,四次跨膜形成两个胞外环状结构,由甘 文献综述第二章病毒对细胞微丝骨架和紧密连接的影响氨酸和酪氨酸组成的第二个胞外环形结构(被称为,大小为可能是决定的含量、定位以及紧密连接屏障完整性的关键,而仅含有酪氨酸的胞外环的作用则未见报道。其氨基端(和梭基端均位于细胞内,接基端直接与相连,连接部为一个大小为的疏水基团。的大小约为之间,目前已知的有种,同样具有两个胞外环和两个胞楽尾端。的两个胞外环调节细胞连接处的选择渗透性,第一个胞外环大小为,决定细胞间的跨上皮电阻和细胞外电荷的选择性,第二个胞外环则是细菌毒素的受体。目前研究发现不同在紧密连接屏障中起到的作用不一样,不同的细胞表达紧密连接的种类不同,如有,,等多种结合方式。将异源的引入以的细胞,会造成跨膜电阻的大幅降低,提示不同的结合方式影响了紧密连接屏障的完整性。主要分布与皮肤、脑、神经系统和内脏组织中,不同的成员表达分布具有一定的组织特异性,被认为是在不同物种间普遍存在的,受发育的影响,在成年动物体内不表达,和存在于肾脏中,主要存在于内皮细胞,而、和共同存在于肠组织中。胞质蛋白胞质蛋白是紧密连接胞内支持结构的基础,是第一个被证实的紧密连接附着蛋白,主要包括三个亚型(、和,其中的分子量大小约为在多种上皮细胞和内皮细胞均有表达。与的梭基端直接相连,伺和的梭基部分结合,连接韩點蛋白到肌动蛋白骨架,还和连接粘附分子(蛋白作用,在细胞间紧密连接中起到枢纽作用。此外,还发现是跨膜蛋白和胞内肌动蛋白相连的桥梁,是细胞微丝骨架与紧密连接相关联的关键节点。微丝在病毒生命周期中的作用病毒颗粒感染细胞的可能过程大致分为以下几个步骤、病毒颗粒通过细胞膜进入细胞(囊膜病毒通过与细胞膜融合或者胞吞作用进入)；、病毒颗粒从细胞外周区域逆向运输至细胞核周区域；、大部分病毒颗粒可以入核并在其中组装逸出,而病毒一般在胞质中完成复制组装过程；、病毒衣壳或衣壳元件顺向运 硕士论文猪流行性腹湾病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响送至核周,、从细胞膜出芽逸出。这一系列过程均与微丝骨架有着密切的联系。微丝与病毒入胞病毒吸附至祀细胞表面是其感染细胞的第一步,随后病毒可直接穿入细胞质膜,或者以胞吞囊泡转运的方式进入细胞。而许多病毒的入侵过程依赖于微丝,例如腺病毒(、人类免疫缺陷病毒、牛痘病毒(等等。病毒依靠微丝的方式不尽相同,阿根廷出血热病毒入侵早期,仅胞质微丝紊乱、细胞膜周缘微丝保持完整。当用微丝解聚剂减少可溶性肌动蛋白单体含量时,病毒早期感染受抑制,而微丝稳定剂处理细胞后对病毒的入侵没有影响。腺病毒二型和￡病毒的情况与之相似。微丝稳定存在时,对病毒入侵的影响也不大。但在人类多瘤病毒(上,对感染却无影响,反而能减少病毒入侵量。微丝与病毒诱导的受体族病毒粒子在细胞表面移动找寻入侵位点,病毒粒子的粘附能诱导接触部位富集受体簇包括和。受体成簇是一个依赖微丝的过程,信号通路和微丝重排蛋白、都参与其中病毒囊膜介导的融合现象激活通路,信号通路的下游蛋白是复合物和酪胺酸激酶(,触发介导的微丝聚合、和在此过程中发挥作用,最后病毒壳体成功进入。抑制其中任何一环,都能阻碍病毒的进入。微丝与病毒冲浪现象有些病毒感染细胞后,在极化上皮细胞上可见致密微续毛样结构,非极化上皮可见伪足样结构。这是由于病毒劫持宿主的皮质下微丝骨架,动员,激活成员,促进肌动蛋白丝快速形成丝状伪足样结构或绒毛样结构,使得病毒可以以冲浪的方式进入细胞。目前研究发现型单纯疱瘆病毒只乂、鼠白血病病毒(、禽白血病病毒(、人免疫缺陷病毒(、水泡性口炎病毒(、人乳头状瘤病毒(、牛痘病毒(、病毒’、人疱疫病毒型(都会在侵袭宿主细胞过程发生冲浪现象。囊膜病毒的融合入侵是以细胞表面受体共受体结合,病毒移动到特异性入侵位点,启动病毒囊膜糖蛋白的融合机制的过程。的病毒糖蛋白首先与细胞表面的硫酸肝素糖蛋白受体接触,结合硫酸肝素糖蛋白吸附开始,激活和 文献综述第二章病毒对细胞微丝骨架和紧密连接的影响信号通路,从而调控伪足下的微丝骨架,以“冲浪”的方式进入细胞。。胞吞方式入胞的病毒向入侵位点发起的“冲浪”是皮质肌动蛋白上或丝状伪足基底部连接微丝的肌球蛋白马达介导的。微丝骨架的运动将病毒细胞受体复合物运送到具有高度胞吞活性的位点。目前,细胞和病毒之间的这类作用的机制大部分仍处于未知。细胞表面磷脂酰丝氛酸是牛痘病毒关键冲浪因子,随后诱发胞吞。病毒运输到丝状伪足的基底部,磷脂酰丝氨酸激活丝氨酸苏氨酸蛋白激酶和信号通路,病毒被吞唾入细胞质膜形成的小泡。微丝重排在上述过程中起到重要作用。在和抑制剂处理祀细胞后,“冲浪”现象被抑制,病毒在细胞表面的吸附受阻,病毒感染性下降。人乳头瘤病毒上也观察到病毒冲浪的现象,病毒接触诱导细胞产生长指状突触(,然后借助从细胞外缘一冲而下的动力进入细胞内部感染。微丝与病毒的内吞病毒的内吞是研究与争论的热点。目前研究已发现存在利用网格蛋白(、小窝蛋白、脂阀、、、或依赖的胞吞途径、巨胞饮途径以及吞暖途径等多种形式的胞吞。除了依赖的胞吞机制还没弄清夕卜,其他胞吞胞吞均需要利用微丝骨架来完成胞吞过程。病毒内吞现象广泛存在,通常是依赖微丝的内吞或者是能刺激微丝的内吞。网格蛋白介导的内吞由禾等因子调节微丝可能在网格蛋白内陷小体(的形成过程中起作用,抑制和活性,能阻止顶体的形成。借助钼复制电子显微镜和电子断层扫描技术】,观察哺乳动物细胞网格蛋白内陷小体相连的肌动蛋白斑,发现其中布满短而致密的树突样微丝分支。病毒入侵结合受体激活形成过程,激活成核促进因子及使之在周围蓄积,随后激活,微丝迅速成核延长形成树突样微丝网络,微丝正端不断挤压细胞膜边缘的网格蛋白被膜,促进其内陷、收缩成为内吞小泡。在不断缩小的小泡颈部微丝最终形成彗尾结构,在小泡陷入胞膜内部后,继续输送小泡至细胞内的特定部位。小窝蛋白的配体是微丝交联蛋白。猿猴空泡病毒是第一个被发现通过小窝蛋白介导的内吞途径进入细胞的,病毒吸附至小窝蛋白后,触发一系列信号转导,诱发小窝内陷、内吞小泡颈口的收缩与封闭以及内吞泡的形成。皮质肌动蛋白瞬时解聚,募集到小窝蛋白处,在那里发生微丝重组形成放射状肌动蛋白多聚体,被磷酸化的酪氨酸激酶招募至小窝颈部,微丝将小窝蛋白内吞泡进口不断收缩,最终脱离细胞质膜形成胞质内囊泡。病毒粒子刺激相关信号通路,作用于微丝,诱发细胞膜边缘波动,细胞膜上形成 硕士论文猪流行性腹汚病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响大泡包裹病毒颗粒,随后巨胞饮泡内化进入细胞,病毒或核衣壳得以释放进入胞质。这一过程称为巨胞饮。正常状态下,巨胞饮是生长因子介导的,依赖微丝的短暂过程,活化的微丝相关蛋白与微丝使细胞膜皱褶波动,形成板状伪足、圆杯形膜延展、以及泡状结构,这些结构富含动态微丝结构,微丝在其中不断聚合、分解,和在此过程中“制造”出微丝聚合位点。细胞能通过巨胞饮方式非特异性吞入大量液体、溶质和颗粒。病毒结合受体酪氨酸激酶(,激活通路,引发、、三个平行信号通路和的活性’,从而共同调节膜皱褶形成、巨胞饮闭合以及膜转运过程。与微丝的方向和聚合有关,在早期内吞小体形成中与特异性结合蛋白)在圆杯形膜延展部位共定位,作用形成皱褶相关微丝交联。在内吞膜转运、细胞膜重构、和膜弯曲中起作用,将反复募集到细胞膜部位,协助介导的细胞边缘波动和巨胞饮。成熟的以剌激产生瞬时质膜泡的方式入侵,病毒入侵时,微丝及微丝相关蛋白迅速填充质膜泡,随后向旁边内化囊泡。刺激依赖的巨胞饮途径,当聚合受阻时,病毒的入侵会受到影响。此外,,、呼肠孤病毒以及等病毒也都能够依赖巨胞饮的方式入胞。很多病毒不仅仅利用一种方式入胞,可能同时采用几种形式。例如腺病毒、风疫病毒,主要是借由网格蛋依赖的胞吞作用入胞,也会诱导细胞膜边缘波动、利用巨胞饮辅助入胞,“。柯萨奇病毒的入侵需要巨胞饮、内化和小窝蛋白这几种途径。多种方式入侵宿主细胞,是病毒在进化过程中的成功尝试。微丝与病毒的融合过程病毒除了经由胞吞途径入胞,有些病毒能直接通过与宿主细胞膜融合的方式直接进入胞内。但这过程中微丝的作用目前了解的还不多。副點病毒科的人呼吸道合胞体病毒(以及人副流感病毒三型,能编码吸附糖蛋白和融合糖蛋白,这两种蛋白都与融合相关。病毒通过蛋白吸附到细胞上,而蛋白介导病毒与细胞膜融合,病毒基因组转运,以及合胞体的形成。蛋白的活性与和的表达呈正相关,而的表达则是起到相反的作用；蛋白的活性受微丝网络和调控。处理后能减少病毒的入侵量和合胞体形成,提示微丝在这两个进程中都起着一定作用。微丝与病毒利用紧密连接蛋白的入侵丙型肝炎病毒(能利用紧密连接蛋白和入侵肝上皮细胞目前发现在内皮细胞上也是入侵的共受体。病毒通过紧密连 文献综述第二章病毒对细胞微丝骨架和紧密连接的影响接感染上皮细胞比较常见,,呼肠孤病毒表面蛋白结合紀细胞的连接點附蛋白分子(受体端区域,随后内化进入宿主细胞。轮状病毒的纤突由和两个亚基构成,合称。胰酶切割片段,随后结合到、和,病毒能破坏紧密连接屏障的完整性。轮状病毒的毒素在细胞上也能破坏紧密连接,它甚至能在细胞形成单层前,阻止定位到细胞膜上,。腺病毒型和型的内化与逃逸借助破坏上皮屏障完整性,是在上皮细胞间的紧密连接蛋白上,位置隐蔽,可以有效隐藏胞外病毒粒子。为结合病毒首先结合到细胞顶面的糖憐脂酰肌醇(锚定的补体衰变加速因子(上,激活酪氨酸蛋白激酶,从而激活活性,促进微丝骨架重排。结合的病毒粒子从侧面移动至紧密连接部位以结合。纤维蛋白区是腺病毒伸出的最远端蛋白,正是它与细胞的胞外部分区端进行结合,的结合比更具亲和力,这让病毒能够破坏紧密连接,变化的同时细胞单层电阻也下降,暗示病毒能够破坏细胞紧密连接屏障。柯萨奇病毒和腺病毒入侵的细胞受体相同,也借助完成内化。病毒最开始接触上皮细胞顶面衰变加速因子(,随后激活激酶、激酶以及激酶,激活通路诱发微丝重排,使病毒能移至紧密连接处,与作用,以小窝蛋白内化的机制入胞,起到辅助的作用。病毒复制和组装病毒的成功复制需要病毒的每个蛋白以及核酸被协调地生产、加工和组装,从而产生能感染新细胞的子代病毒。在子代病毒赖以复制和装配的细胞区域中,细胞骨架起着重要的作用。像无囊膜病毒中的脊髓灰质炎病毒是,其入侵和运输至复制中心都依赖于微丝及微丝网络。虽然有些作用机制及影响目前仍不完全清楚,比如许多囊膜病毒含有细胞微丝,但我们不知道,这种微丝是否只是意外残留在病毒内而已,还是在病毒颗粒中能行使其功能。微丝与病毒复制人副流感病毒三型(和人呼吸道合胞病毒(的复制需要微丝的参与,也有观点认为微丝在呼吸道合胞病毒释放过程中更为重要。体外改造的复制时需要微丝,增强的表达能增强的复制。等通过共聚焦显微镜观察发现,仙台病毒在感染上皮细胞时,相比较于正常细胞微丝骨架的有序束状排列,感染病毒后细胞的断裂、表现出深染的微丝小点或斑块,病毒利 硕士论文猪流行性腹病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响用微丝的重排来增强在细胞内的复制。而犬瘟热病毒的基质蛋白与微丝无联系,但其复制却对微丝解聚敏感,细胞里,扰乱胞质中微丝,而细胞皮质下肌动蛋白网保持完整,但则是完全破坏整个细胞内的肌动蛋白丝,在此情况下,能特异性的阻止犬癌热蛋白的表达,而的作用却很微弱。己证明流感病毒的蛋白与肌动蛋白丝相关联,而细胞内的单体肌动蛋白和可能有利于病毒复制和负链的组装,可能在其中充当转录因子或起到稳定核酸的作用,但目前机制尚不清楚,感染细胞过程中,虽然微丝解聚剂并没有明显的影响细胞内和核内的早期反转录产物的产生,但明显抑制早期反转录产物的完整反转录过程,证明微丝聚合状态有利于提高病毒的反转录效率,】。许多病毒在其子代病毒释放时均发现含有微丝样物质,包括麻疫病毒聰腺炎病毒、仙台病毒等。在非洲猪瘟病毒的细胞扩繁子代病毒中发现含有能编码微丝样结构的基因。这印证了微丝确实参与到病毒的复制和组装过程中,但微丝样物质为什么会进入病毒内,在其中起到什么功能,目前还不清楚。微丝与病毒的胞内定向运动病毒进入细胞后,如何保证在粘调胞质以及密布的细胞骨架中准确运送到复制位点呢？病毒又是如何被运送到组装部位,以及出芽的位点的呢？例如最大的牛痘病毒达到,单纯靠扩散很难实现该目标,而且在细胞内以随机扩散方式运送病毒过于盲目,充分利用细胞自己的物质递送系统成为病毒的利器。目前认为微丝骨架在病毒基因组及病毒蛋白的胞装内运输中起祀向作用。微丝在感染早期步骤,从进入到入核,都有着重要作用。病毒通过依赖微丝的吞途径入胞后,憐酸化复合物与微丝结合,被运送入核。当使用轻链激酶抑制剂来抑制肌动蛋白丝上肌球蛋白的运动能力时,的核定位能力减弱,感染能力下降现象。感染病毒的细胞中,微丝对病毒的最终组装和出芽可能也有所影响。组装一般发生于细胞膜上,被组装,并向着细胞膜出芽裹上囊膜。微丝网络启动了和相互作用。而感染细胞后释放的病毒检测出了少量微丝与微丝结合蛋白、’。微丝解聚因子扰乱后,病毒的囊膜和衣壳蛋白无法抵达细胞膜,在胞菜中分布形成聚合物。电镜下,细胞表面看不见病毒粒子,胞楽中有大量致密溶酶体样囊泡,说明并不阻断病毒蛋白的合成,而是扰乱其运输。而扰乱胞质内微丝后,病毒粒子释放量下降了。微丝参与病毒的核组装及释放的过程,疱瘆病毒科成员(如和的病毒衣壳于细胞核组装,随后衣壳顺着细胞内核膜移动至细胞核出口。温度、叠氮 文献综述第二章病毒对细胞微丝骨架和紧密连接的影响钠引起的水解(抑制)、以及造成的微丝解聚都能影响核内衣壳的运动。和感染招募核动蛋白丝,引起核肌球蛋白积聚,这可能是病毒运动、从核内释放所必须的。此外感染后,用和处理,主要出现了细胞核大小改变,染色质边缘化现象。目前核内肌动蛋白丝形成机制尚未清楚,但可能涉及到病毒激酶的微丝调节活性。肌动蛋白丝在细胞核内出现,是疱瘆病毒与其他核内复制的病毒(如杆状病毒)感染都有的一种现象。从核内释放,组装完全的病毒需要靠肌球蛋白马达,肌球蛋白可能与病毒粒子囊泡的胞内运输过程相关,或者通过调节皮质肌动蛋白网络,来促进胞内病毒运送至细胞膜释放。苜猜银纹夜蛾多核衣壳核型多角体病毒(属于杆状病毒家族,感染早期,诱导肌动蛋白聚合形成肌动蛋白尾,随后肌动蛋白尾做螺旋状运动,将病毒核衣壳送入细胞核进行复制。微丝解聚剂抑制核衣壳的运动性及病毒基因的表达,这暗示核衣壳的运动需要微丝呈聚合状态。早期基因表达幵始后,一部分核衣壳与微丝共定位与细胞表面纤突,而突变株的共定位现象大量减少。是病毒成核促进因子,能与复合物相互作用,从而影响微丝核化以及新的微丝蛋白形成〖,。因此可利用微丝推动进入细胞核,在启动早期基因表达后能将病毒输送到细胞表面,作者推断微丝还能推动病毒到达临近细胞。病毒释放与传播新组装的病毒粒子欲从细胞表面释放,将会遇到之前入侵时所遭遇的许多困难,包括需要越过细胞膜下的皮质肌动蛋白网络,跨越漫长的胞外空间距离,到达新的宿主细胞。大量证据证明在许多病毒的成功释放和传播过程中微丝的参与必不可少。微丝与病毒释放在鼠乳房肿瘤病毒上首先发现了病毒逃逸与微丝骨架之间存在联系。乳房肿瘤上皮细胞上观察到病毒从长微续毛末端释放病毒颗粒,随后对释放部位进行免疫金染色,证实微丝与病毒颗粒存在相互作用。对于其他反转录病毒(包括在内),在最后一步组装和释放过程中是否与微丝骨架相互作用呢？以扰乱微丝,能显著阻栏轮状病毒的出芽,能减少病毒传播率高达。微丝稳定剂和解聚剂都能极显著的抑制呼吸道合胞病毒的释放,病毒释放到上清中的含量降低了倍。可抑制麻疫病毒和仙台病毒的释放。这都暗示在病毒组装和释放过程中需要不断形成新的肌动蛋白丝,微丝聚合受阻,会大大降低病毒的产生率和释放率。微丝形成的彗尾和病毒长距离传播 硕士论文猪流行性腹宵病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响肌动蛋白尾输送病毒粒子是痘病毒感染的标志,甚至不需要细胞内出现子代病毒蛋白便能判定痘病毒的感染。当胞内成熟病毒(被高尔基体外侧网络的膜池(赋予囊膜成为细胞内具被膜病毒(,后,能募集肌动蛋白尾,结合至肌动蛋白尾顶端,利用微丝聚合的力量,以螺旋推进的方式抵达细胞质膜,并抵达临近细胞牛痘病毒(感染在胞内病毒组装和运输需要微丝的配合,病毒蛋白能结合,影响微丝应力纤维来为自己的组装和运输服务,而有效传播和释放也需要微管和微丝的动力。缺失或者突变株病毒不能结合,致使大量病毒粒子在细胞质膜下积聚。在病毒缺失蛋白的情况下,只有当或介导细胞内皮质肌动蛋白分解,扰乱微丝网络后,病毒才得以移动至细胞周缘,印证了是通过重组皮质肌动蛋白网络,让病毒得以穿过细胞质膜。而在引起的片状伪足运动及体内病毒传播中也需要。感染细胞后引起微丝骨架上的改变,是为了让病毒更好的传播扩散。诱发的微丝彗尾结构可以快速推进胞内病毒,到达远离感染细胞的地方。是公认的痘病毒诱导的微丝聚合相关蛋白,以酪氨酸磷酸化方式募集受体分子蛋白,作用蛋白(和,在感染过程中,、、和这四种调节成核功能的因子,都快速变化,其中改变能控制来调节微丝的聚合速度,从而改变病毒在胞内运动的速度。肌动蛋白尾和烛斑快速增长之间的联系直接说明细胞间传播的进程。在单层细胞上,的胞间传播十分迅速,甚至短于病毒的一个复制周期。有趣的现象是,当已经感染的细胞,能够利用肌动蛋白丝,抵制病毒的重复感染,感染的细胞膜上表达病毒囊膜蛋白,再有别的病毒粒子接触细胞时,被募集,从而通过肌动蛋白尾聚合作用,将新的病毒拒于细胞之外。通过这种方式,在单个复制周期中病毒感染传播距离并不局限于批邻细胞,能传播到更远处,快速形成多个噬斑。雅巴样疾病病毒是痘病毒科的另一成员,病毒的蛋白能引发短链肌动蛋白尾,机理同募集蛋白类似。此外,大型胞装复制类病毒(如蛙虹彩病毒,也被发现有微丝彗尾的现象。病毒出芽逆转录病毒的有效传播需要易感细胞间彼此接触,病毒随机释放至胞外的感染方式效率过低。目前新发现一种细胞通讯方式,險道样纳米管,具有细长微丝结构,可以融合两个或多个细胞,相连细胞的内部物质可以直接交换。先后在细胞、巨唾细胞、大鼠肾细胞、树突细胞等发现该结构的存在。 文献综述第二章病毒对细胞微丝骨架和紧密连接的影响正常的巨唾细胞培养物中很少,而感染的巨噬细胞单层在病毒复制过程中出现大量临时增多的长短不一的,推测能够利用作为感染及未感染细胞之间传播病毒的桥梁。蛋白在细胞形成中起作用,调节和活性来影响肌动蛋白丝,过碟酸化调节活性能导致失活,阻止微丝重排。突变蛋白会抑制和,从而抑制病毒对微丝的调节。还能控制膜边缘波、细胞运动。感染的细胞中,感染细胞表面病毒囊膜蛋白与受体相互作用,使感染细胞间伸出长的,像桥一样搭在未感染细胞表面并与细胞膜融合,成熟病毒粒子的组装将在该处完成,完成组装的病毒能顺着流的方向直接感染祀细胞,与病毒“冲浪”的方式相似。可以得出结论,病毒诱导的有助于病毒颗粒出芽和传播其他病毒在培养细胞上远距离传毒也会诱发。病毒外膜蛋白在感染细胞中积聚,这些延伸与相邻细胞融合,实现相邻细胞间病毒传播,暗示可能募集这些延伸结构来感染临近细胞。通过病毒激酶诱导的产生,活性可能激活磷酸化的和,直接调节微丝激酶信号通路。在诱导的形成中必不可少,在应力纤维解聚过程中必不可少。轮状病毒也能诱导丝状伪足样延伸来传播病毒。轮状病毒诱导细胞产生长微丝状突触,通过免疫共沉淀发现纤突糖蛋白与微丝能共定位于极化细胞顶面。表达诱导微丝束重排,与处理的效果一样。此外,利用微丝踏车现象促进病毒从极化上皮顶面释放来调节极化上皮感染病毒的传播。所以和这两种病毒蛋白可能协同改变微丝结构促进定向长距离病毒粒子传播。轮状病毒传播丝状伪足形成的必要性尚未研究透彻。病毒通过紧密连接传播病毒胞间传播可通过跨紧密连接的方式传播来感染健康细胞。能跨胞间紧密连接传播,结合等紧密连接复合物穿梭受体,病毒上的促进病毒接触胞间连接,病毒感染后,邻人上皮细胞紧密连接蛋白与共定位增加,单个不形成紧密连接的细胞中并未发现病毒在侧面聚积现象。细胞崩解某些情况下病毒通过摧毁感染细胞来释放子代病毒,病毒感染真核细胞后细胞崩解机制了解甚少,其中了解最多的是腺病毒体外感染。腺病毒早期区蛋白 硕士论文猪流行性腹再病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响表达后在细胞膜与细胞骨架处积累,与激酶家族及作用,触发依赖细胞的凋亡通路。与作用,下调信号,激活激酶信号通路,导致微丝骨架重排和细胞中产生大量小泡。特别是通过、和的信号通路,触发新生微丝聚合,促进肌动蛋白肌球蛋白网络的装配,将内涵体累积到微丝组装部位,细胞膜转运机制受损,最终引起非程序性细胞凋亡。小结微丝在微生物到真核细胞中普遍存在,它们不仅构成细胞的基础结构,也在许多细胞功能上起重要的作用。目前为止,许多关于病毒的研究都发现病毒与微丝骨架之间存在相互作用。病毒的基因组并不编码微丝或者肌球蛋白等相关元件,至于有些子代病毒中残存有微丝样物质,目前认为是微丝参与病毒复制过程中留下的(还不清楚这些同源物与细胞内微丝骨架的功能是否一致)。因此认为,感染细胞中微丝结构的变化是因为病毒蛋白激活细胞信号通路的影响或者直接募集重组微丝所致,这也被许多研究病毒蛋白与微丝相互作用得出的结论证实。了解病毒感染细胞中微丝骨架的重要作用以及病毒如何利用微丝,能让我们更加深入地了解病毒入侵、复制和释放等过程,为治愈病毒类疾病提供思路。目前已经有利用病毒与微丝骨架之间的相互作用来进行有效的抗病毒治疗。小分子物质,是一种信号通路抑制剂,已证实能阻碍感染宫颈癌细胞的代谢,可以发展成为新型抗癌转移药物。利用干扰和传统小分子抑制剂来抗病毒毋庸置疑将为抗病毒战役揭开新的篇章。 文献综述第二章病毒对细胞微丝骨架和紧密连接的影响参考文献’,,,,,,,,’,’,,,,,,,,,,,,,,,,, 硕士论文猪流行性腹湾病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响,,,,’,,,,,,’,,,,,,,,,,,, 文献综述第二章病毒对细胞微丝骨架和紧密连接的影响,,’,,,,,’,,,,,,,,,,’,,,, 硕士论文猪流行性腹湾病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响,,,’,,,’,,,,,,,,,,,,’,,,,’,,,,, 文献综述第二章病毒对细胞微丝骨架和紧密连接的影响,,,,’’,,,,,,,,,,,,,,,,, 硕士论文猪流行性腹湾病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响,,,,,,,,,,,,,,,,,,,’,,,,,,,,,,,, 文献综述第二章病毒对细胞微丝骨架和紧密连接的影响,,,,,,’, 试验研究第三章猪流行性腹‘；写病毒感染〗细胞的病理变化第二篇试验研究第三章猪流行性腹丨写病毒感染细胞的病理变化猪流行性腹湾病毒(主要侵染猪的小肠,导致病猪体内小肠域毛上皮空泡样变性,微绒毛萎缩。是胎猪小肠绒毛上皮细胞空肠中段的永生化细胞系,能够模拟仔猪肠道环境,本研究拟以为模型,应用光学显微镜和电子显微镜对感染后肠道上皮细胞的病变进行观察和研究,并应用对病毒在细胞内增殖情况进行分析,为之后的试验奠定基础。材料和方法病毒和细胞细胞非洲绿猴肾细胞)由江苏省农科院馈赠,用含有小牛血清的°,培养。细胞(,猪小肠上皮细胞系),用含有胎牛血清的,。培养。株使用细胞扩繁。在吸附和培养过程中加入的胰酶以帮助病毒感染细胞。主要试剂、、和新生小牛血清均购自公司,、、反转录试剂盒购自公司。主要设备恒温细胞培养箱(光学显微镜、倒置显微镜(超净工作台(苏州净化设备总厂)；细胞培养板(倒置焚光显微镜(；蛋白电泳仪(台式高速低温离心机、移液枪(扩增仪(宝生物(大连)公司)；扫描型电子显微镜、型透射电子显微镜(；电子天平(。试验方法 硕士论文猪流行性腹宵病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响病毒的培养与滴定培养细胞,细胞单层长至时,弃去培养基,用灭菌洗潘一次,接种,并加入胰酶以助病毒吸附,吸附时间,期间每隔翻转一次,随后弃去病毒液,以含有；、无血清的培养基进行培养,°培养箱中培养小时,待细胞病变(明显后收毒,反复冻融次、离心取上清液,置保存备用。用无血清的培养基十倍倍比稀释病毒,接种孔板上培养细胞,每孔对应加入病毒稀释液,做个重复孔,接毒后后读数,根据的方法对病毒滴度进行计算,最终获得株的。病毒的形态观察病毒的浓缩：将病毒液低速离心(°,后,取上清,以滤膜去除细胞碎片。然后超高速离心,使病毒沉淀,弃去上清。适量°过夜溶解,第二天重悬。病毒的纯化：首先采用、、三个浓度梯度的鹿糖溶液对病毒液进行密度梯度离心(°,,可见超离管中间部位的白色条带,收集后以溶解,(°,,超速离心,弃上清后,以适量的溶解。电镜观察：病毒悬液经磷鹤酸负染后直接进行电镜观察。猪流行性腹丨写病毒对感染复数的摸索以及染色观察细胞生长在含有灭活(°的胎牛血清和双抗(青、链霉素浓度均为的细胞培养液中,°,培养。待细胞融合至单层后,弃去培养基,用灭菌洗漆一次,然后接种不同剂量的、、、并加入胰酶以助病毒吸附,吸附时间,期间每隔翻转一次,随后弃去病毒液,加入无血清的培养基维持,°培养箱中培养,持续观察不同接毒量下细胞病变情况,选出合适的病毒感染剂量以下试验分为正常对照组、感染组。正常对照组：不作任何处理。感染组：细胞单层培养至融合,加入,及胰酶帮助病毒吸附,°,条件下吸附期间每隔翻转一次,吸附 试验研究第三章猪流行性腹湾病毒感染〗细胞的病理变化结束后弃去病毒液,以加入双抗、胰酶、不含血清的培养基,°,继续维持培养。染色：细胞接种于每孔预先放置细胞爬片孔细胞培养板中。以上述方法感染细胞后,将细胞爬片以针头挑出,经过染色,观察感染细胞的形态学变化。猪流行性腹丨写病毒在细胞中的增殖情况总的提取：细胞接种孔板,按方法感染后,按、、、、时间点收集样品。将细胞分别用洗一次,加入的,水平放置片刻,然后用移液枪吹打细胞使其脱落,将裂解下来的细胞悬液移至管中,用移液枪反复吹吸至裂解液中无明显沉淀,室温下静置。向其中加入氯仿,剧烈震荡至溶液充分乳化,室温静置。°离心后,吸取上清液移至另一新的管中,并加入等体积的异丙醇。上下颠倒充分混勾后,静置。°离心。小心弃去上清,以乙醇,轻轻颠倒洗漆,°离心后弃去乙醇。室温干燥沉淀加水溶解沉淀,即获得总样品,可立即使用或置保存备用。的合成：采用反转录试剂盒将得到的产物反转成,操作步骤如下：用紫外分光光度计测定浓度,根据试剂盒要求加入在管中加入相应体积的,补至反转录体系。°,°,即得到样品,可直接使用或置保存备用实时劳光定量按下列组分配制美光定量反应体系,。内参基因及目的基因各设三管平行。焚光定量反应条件为：°预变性,。°共个循环。 硕士论文猪流行性腹湾病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响引物名称方向序列,,长度(序号电镜观察细胞感染猪流行性腹丨写病毒的超微结构变化扫描电镜观察孔板预置细胞爬片后,接种细胞,待细胞长到融合时进行扫描电镜(观察。按方法感染后,向细胞孔中加入含戊二酸的在°固定以上；漂洗次,每次依次以、、、、的乙醇梯度脱水各次,每次然后以无水乙醇重复脱水次,每次再用叔丁醇置换三次,每次置换将样品放入冷冻干燥仪内进行干燥,干燥后的标本粘到样品台上,用离子溅射仪给样品镀金膜,最后在型扫描电子显微镜下观察,拍照。透射电镜观察细胞接种细胞瓶,待细胞长到融合时进行透射电镜(观察。按方法感染后,以细胞刮刀刮下细胞,重悬,离心,弃去上清。向细胞沉淀块中加入含戊二醛的在°固定以上；漂洗次,每次用的锇酸固定后,清洗次,每次依次以、、、的乙醇梯度脱水各次,每次然后以无水乙醇重复脱水次,每次再用丙酮置换三次,每次置换最后一次用两酮置换将样品放入盛有包埋剂的包埋板中,、条件下聚合各将包埋块修成梯形,放到超薄切片机上制作的超薄切片,贴于铜网上；醋酸铀染色,流水清洗,梓檬酸铅染色流水清洗,最后在日立型透射电子显微镜下观察,拍照。统计学处理采用分析软件(对试验数据进行单因素方差分析,统计 试验研究第三章猪流行性腹湾病毒感染细胞的病理变化结果以平均数士标准误(±表示。结果与分析猪流行性腹污病毒电镜负染细胞扩繁的病毒纯化后,在透射电镜下可见大量散在的、形态完整的病毒粒子。病毒粒子形态呈圆形、椭圆形、肾形和多边形。圆形病毒粒子大小约在之间,病毒表面有囊膜和纤突,纤突长约病毒粒子中心为一团浓染的拟核区域,大小约在左右(图。■叛壤痴讀猶謂图病毒粒子电镜负染结果猪流行性腹丨写病毒感染细胞毒株在细胞上培养所得的为。以感染,后细胞肿胀变圆、细胞内出现很多小空泡后,细胞内空泡增多、逐渐合并形成大空泡(后肿胀的细胞脱落、形成空隙,脱落的细胞碎片漂浮于细胞瓶中,感染可形成合胞体。本试验选用作为感染浓度。结果见图。 硕士论文猪流行性腹海病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响等零：…：讀、,晨‘‘‘、麵摹：論‘■“肩、：■‘？：邊,、‘：：“：：—、■舊他…声■■■▲勢图感染丨细胞(,；；；；；猪流行性腹丨写病毒在中的増殖曲线单层细胞感染后,在、、、、、分别收集细胞,提取,反转录获得,以此为模板进行焚光定量,与内参比较分析后,以病毒感染时病毒含量定义为,得出不同时间病毒在细胞的增殖倍数,结果见图。由图可知,病毒感染后就可以检测到病毒,但病毒量相对较低；随后开始逐步上升,在感染后病毒开始大量迅速增殖,达到最高峰,以后、病毒量逐步下降。 试验研究第三章猪流行性腹湾病毒感染〗细胞的病理变化图在细胞中增殖规律猪流行性腹渴病毒对细胞的微绒毛的影响主要感染仔猪肠道,病猪小肠可明显观察到微绒毛萎缩、脱落,肠续毛上皮细胞形状由立方形变成矮柱状。为了观察小肠上皮细胞受的影响情况,本研究应用扫描电镜观察了感染过程中细胞单层及微纸毛的变化。结果显示：正常细胞可见完整的细长指状的微纟戎毛附着于整个细胞表面、新生细胞较多(图、、。感染后,可见相邻细胞间界限模糊甚至消失,部分细胞出现拉丝现象,细胞微绒毛大量脱落消失(图。微绒毛变短,排列杂乱,部分微线毛顶端膨大变圆,基部较细,可见数根顶端融合形成蘑燕样膨大,有些微续毛与细胞分泌物或碎片點连成团块状(图。新生上皮细胞较少,细胞表面大部分微续毛细长,排列整齐,但也出现部分微续毛顶端膨大呈蘑燕样的结构(图。 硕士论文猪流行性腹再病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响图感染丨细胞的扫描电镜观察。、、为正常细胞、、、为感染的细胞,,猪流行性腹丨写病毒对细胞内部结构的影响扫描电镜只能观察病毒对细胞的表面形态的影响,而想要了解病毒对细胞内部亚显微结构的影响只能依靠透射电镜。透射电镜结果显示：正常细胞细胞表面可见细长指状的微线毛、微绒毛内部含有排列整齐的微丝束,细胞膜下方终末网平行于细胞膜(图。感染后,可见细胞微续毛变短、靠近细胞的基部较细,顶端呈不规则空泡状膨大,微绒毛内部微丝消失,终末网斎乱无序(图。线粒体空泡化,呈现型、型线粒体；细胞内部出现大量泡状膜结构,有的内部含有颗粒状物质,有的为空泡；未见典型高尔基体和内质网结构(图 试验研究第三章猪流行性腹写病毒感染细胞的病理变化。观察到大量在细胞内膜性结构区被组装成具有囊膜的完整病毒粒子(图。细胞的内外核膜间的核周隙扩张成泡状,核向内四陷,部分细胞的核周隙内出现正常细胞以外的物质,分为有以囊泡包裹或无囊膜包裹,可能为糖原或者病毒(图。部分细胞内病毒出现在细胞核膜处,与病毒接触的细胞核出现溶解现象,而未接触部分核膜界限清晰(图。德！感：？謂零驟聽〒：鼻轉伽：層：、■為图感染细胞的透射电镜观察。为正常细胞、、、、为感染的细胞, 硕士论文猪流行性腹浑病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响讨论与小结猪流行性腹湾病毒经口和鼻感染仔猪后,直接进入小肠。病毒在小肠和结肠绒毛上皮细胞胞装中进行复制。大量复制的病毒造成肠绒毛萎缩,导致肠道吸收表面积的减少,营养物质吸收障碍,从而引起腹湾。细胞是未吃初乳的乳猪空肠上皮中段细胞的永生化细胞系。能表达上皮细胞标志性物质,诸如紧密连接受体、一氧化氮合酶)、脂肪酸结合蛋白、纤毛蛋白、粘蛋白等。它分泌的免疫分子如白介素、肿瘤坏死因子)、猪防御素、胞外粘附分子、粒细胞巨■细胞集落刺激因子)的种类,以及表达样受体的类型和作用都有了一定的研究。细胞能很好的模拟人和猪的肠道生理环境,在跨肠上皮的离子转运、肠道细胞增殖试验、以及细菌和病毒如何影响肠道环境的研究中都成为理想的细胞模型。本试验证实了细胞对敏感,病毒能在细胞中迅速增殖。到达复制高峰后,由于病毒对上皮细胞损伤严重,损伤细胞不断脱落,新生细胞减少,细胞是病毒赖以增殖的“工厂”,总体表现为细胞产生病毒量下降,这与实际感染中病猪的排毒量变化情况相符可以从扫描电镜和透射电镜图中看出病毒对细胞的微绒毛损伤严重,微绩毛中的微丝结构消失,失去内部支撑和定型的骨架,大量指状的微续毛可能因此松她呈空泡状或蘑薛状,也有可能是因为细胞在病毒作用下发生水肿引起,或者是两者共同作用的结果。微续毛的空泡化状导致上皮吸收表面积的减少,必将严重影响上皮细胞的功能。普遍认为冠状病毒是在宿主细胞的细胞质中的双层膜性囊泡(中进行复制,病毒直接以基因组为翻译模板,表达聚合酶,从而合成病毒基因组和结构蛋白的,随后在宿主细胞内质网处装配,并在高尔基体膜室腔内完成衣壳的组装,形成新的病毒粒子,随后被分泌至细胞外,完成其生命周期。透射电镜观察发现能诱发线粒体肿胀、内质网和高尔基体结构消失,但出现大量不明膜性结构,可能为内质网和高尔基体肿胀形成。内质网能够合成分泌蛋白质,高尔基体能对蛋白质进行修饰加工,并将蛋白质运送到特定部位或胞外,病毒的合成与组装依赖这两种细胞器。等报道过病毒复制时会出现的膜性囊泡的结构与本试验观察的很相似,病毒能够改造内质网,形成内部是网状的囊泡结构,从而有利于病毒亚基和双链的复制,同时帮助病毒躲避宿主细胞的抗病毒反应’。线粒体为细胞的活动提供能量,参与细胞凋亡、自噻和细胞坏死等程序性细胞死 试验研究第三章猪流行性腹湾病毒感染细胞的病理变化亡,与抗感染免疫特别是固有免疫信号转导系统关系密切。固有免疫系统是机体抵御病原体的重要方向,能有效广泛地阻止病原体的入侵并抑制其复制。感染后,通过损伤线粒体嵴结构,导致线粒体空泡化,可能是病毒旨在阻止细胞本身对病毒入侵的应答机制。而本试验首次发现病毒粒子能够引起核周隙的肿胀以及出现在双层核膜附近诱发核膜溶解。这与吕茂杰等通过免疫焚光发现病毒的成分能够出现在细胞核内相互印证。能够出现在细胞核附近,引起细胞核膜的溶解,那么存在病毒能进入细胞核的可能性,病毒能否入核,为何引起核膜溶解,如果能入核,目的是什么,核膜肿胀与溶解是否与病毒入核或出核的过程相关,具体机理尚未清楚,仍待未来进一步研究。 硕士论文猪流行性腹写病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响：,, 试验研究第三章猪流行性腹湾病毒感染丨细胞的病理变化参考文献,,,,,,,,,,,吕茂杰,陈建飞,时洪艳,猪流行性腹湾病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析微生物学报 试验研究第四章猪流行性腹湾病毒对紧密连接的影响第四章猪流行性腹丨写病毒对紧密连接的影响肠上皮细胞屏障是肠粘膜屏障中最重要的一道屏障,也是病原菌侵入动物机体的门户。而肠上皮细胞屏障包括紧密连接、粘附连接、缝隙连接以及桥粒等。其中紧密连接与维持肠上皮细胞极性、通透性屏障、营养物质吸收、微生物侵入的关系最为密切。目前发现丙型肝炎病毒能够利用紧密连接蛋白和入侵肝上皮细胞；轮状病毒的亚基能够结合、和,通过细胞紧密连接屏障的完整性入侵机体；而柯萨奇病毒和腺病毒都能够通过结合紧密连接蛋白处的,从而内化进入细胞。猪流行性腹渴主要在肠道上皮中复制增殖,并且造成肠道渗透性腹湾,本章通过测定细胞跨膜电阻、细胞旁路转运试验和的方法,对是否会破坏肠道上皮屏障的完整性,对于紧密连接蛋白有没有影响进行重点研究。材料和方法病毒和细胞细胞系,毒株主要试剂购自美国公司；购自美国公司；裂解液(强)、抗突光淬灭封片液购自碧云天生物技术研究所；法蛋白定量试剂盒购自美国公司；丙烯酷胺(和甲叉双丙烯酰胺(购自美国公司；蛋白购自加拿大公司；膜购自内参、标记的羊抗鼠购自美国化学发光底物购自美国。、、胎牛血清、胰蛋白酶购自公司；牛血清白蛋白(购自南京生兴生物技术公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔购自武汉博士德生物工程有限公司；主要设备细胞跨膜电阻仪(,丨立式细胞培养皿(蛋白 硕士论文猪流行性腹馬病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响电泳仪,蛋白电泳槽和转印槽(；多功能成像系统；恒温细胞培养箱(倒置显微镜(超净工作台(苏州净化设备总厂)；细胞培养板(多功能酶标仪(低温离心机(电子天平(公司)；计(上海雷磁仪器厂)主要溶液配制缓冲液：,力口定容至。转移缓冲液：甘氨酸,甲醇,加定容至。脱脂奶粉：脱脂奶粉,加缓冲液定容至。：,；力口至。试验方法细胞培养细胞生长在含有灭活(°,的胎牛血清和双抗(青、链霉素浓度均为的细胞培养液中,°,培养。细胞跨膜电阻测定和肠上皮细胞通透性试验所用细胞接种于悬挂式细胞培养小室孔径)中,用电阻仪检测细胞跨膜电阻达到以上时进行试验；所用细胞接种于细胞培养瓶,待细胞长成单层后进行试验。猪流行性腹丨写病毒感染细胞跨膜电阻的测定测定细胞跨膜电阻(,时,将电极长端置于细胞单层的基底部(装膜侧),短端置于细胞单层的顶部(肠腔侧),用电阻仪测得实际电阻值。按以下公式计算：—为实测电阻值,丨为测定空白(未生长细胞)臉的电阻值, 试验研究第四章猪流行性腹汚病毒对紧密连接的影响为测得细胞单层的电阻值,为膜面积。当细胞跨膜电阻达到以上时,根据相关报道,认为此时细胞已经融合成单层,可以用于相关试验。用不含血清和抗生素的培养基将细胞润洗一次。试验分为正常对照组、感染组。正常对照组：不作任何处理。感染组：细胞单层加入及胰酶帮助病毒吸附,°,条件下吸附,期间每隔翻转一次,吸附结束后弃去病毒液。以加入双抗、胰酶、不含血清的培养基,°,继续维持培养。分别于病毒感染后、、、、、、、、、、、、检测并记录细胞跨膜电阻。肠上皮细胞旁路转运试验当细胞跨膜电阻达到以上时,认为细胞单层在膜上己经融合,可以进行细胞旁路转运试验(。将焚光标记的避光溶解于溶液中,浓度为。按分组情况进行接种病毒,待病毒吸附后,随即用充分润洗含有的小室,在膜的顶部(肠腔侧)加入溶于的,放入接受孔(膜的基底部,模拟衆膜侧,含内进行透过试验。°,条件下每孵育,将小室移到新的接受孔中。取透过、、时接受孔中的,加入不透光的黑色酶标板中,测定焚光强度(。的吸收和激发波长分别为和。肠上皮细胞通透性改变率处理组正常对照组猪流行性腹渴病毒对细胞连接蛋白表达的影响细胞总蛋白的提取试验分组设计同。细胞处理后,用预冷润洗细胞两次；细胞培养瓶中加入裂解液(每裂解液加入,冰上静置 硕士论文猪流行性腹馬病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响收集裂解产物,超声破碎,每次,次,每次间隔,置于冰上冷却。将均衆液转移至冷的离心管中,于°,离心丨,取上清为全蛋白提取物；分装保存于,避免反复冻融。总蛋白浓度测定法测定蛋白浓度：制作标准曲线：按照说明书要求准备标准品,稀释成、、、、、、、、浓度备用。根据样品数量,按体积试剂加体积试剂配制适量工作液,在振荡器上充分混勻；向孔酶标板加入标准品和工作液将酶标板放在振荡器上充分振荡,°避光放置,然后在酶标仪中读板测定条件下吸光度值。将读取到的蛋白含量(为横坐标,吸光值为纵坐标)值作图,绘出标准曲线。检测待检样品：稀释待测蛋白样品至合适浓度,向孔酶标板中加入样品稀释液以及工作液,在振荡仪上充分混勻,将混勻后的酶标板在°避光放置分钟,以标准曲线号管做参比,后在酶标仪中读板测定条件下吸光度值,记录吸光值。读取样品浓度：根据所测样品的吸光值,在上述制作的标准曲线上查得相应的蛋白含量,并除以样品稀释液总体积(,乘以样品稀释倍数,即可得到样品实际浓度(。细胞紧密连接蛋白的表达根据测得的总蛋白浓度,适当稀释蛋白样品。取蛋白样品,混入上样缓冲液,振荡均勻后煮沸,进行凝胶电泳,电泳条件为浓缩胶电压,分离胶电压电泳结束后小心将蛋白转印至事先预湿的膜上,以的电压运行；膜用润洗次,每次室温下封闭加入细胞紧密连接蛋白抗体浓度为,°过夜孵育；洗次,每次加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔羊抗鼠抗体浓度为室温孵育润洗次,每次发光液显色。以作为内参校正,应用图像分析系统进行灰度分析。细胞连接蛋白表达量细胞连接蛋白灰度灰度。 试验研究第四章猪流行性腹湾病毒对紧密连接的影响统计学处理采用分析软件(对试验数据进行单因素方差分析,统计结果以平均数±标准误(±表示。结果与分析细胞跨膜电阻的变化正常细胞接种于在小室培养大约天左右,跨膜电阻值能达到：,此时根据实际试验结果以及相关文献记载,认为细胞在小室上已融合形成单层,细胞间紧密连接充分表达,并且随后数天电阻值能一直在—以上稳定,适宜进行试验。结果见图。感染后,细胞单层电阻值早期有所上升,随后迅速降低到之后,电阻逐渐回复到以上,但比同一时期对照组的电阻值高一些。结果见图。§卜‘‘‘‘‘‘‘‘图细胞的跨膜电阻值注：图中数据均以平均值±标准误表示,与对照组相比士 硕士论文猪流行性腹海病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响—：—■■■■■图感染细胞的跨膜电阻值变化注：图中数据均以平均值±标准误表示,与对照组相比猪流行性腹渴病毒对肠上皮细胞的细胞旁通道转运的影响以小室接种细胞,待其长至单层,能够模拟仔猪肠道环境。通常作为细胞旁路转运试验(的突光渗透性标记分子,由于其亲水特性,只能专一的从细胞旁路转运。在病毒感染时段内,突光分子转运率最低,而在以及时段内,的转运率逐渐升高(。,焚光分子转运率最高,实际转运量与对照组转运量的比值最大(。结果见图。 试验研究第四章猪流行性腹湾病毒对紧密连接的影响①图感染细胞后对劳光标记分子的细胞旁路转运率的影响注：图中数据均以平均值±标准误表示。与对照组相比,小写字母表示差异显著(土,猪流行性膨写病毒对细胞连接蛋白表达的影响通过试验我们发现,在感染细胞后,紧密连接蛋白、和和粘附连接蛋白(的表达发生了不同程度的变化。在感染过程中有所下降,相对于对照组,感染组的表达量在先略上升(±,时表达量开始下降(士,到时,下降到±。、则是在感染后下降,时的表达量分别为±、±到表达量为±、±到时,分别下降至±、±。而在感染过程中基本未发生变动,从±±、±。仅在时下降的幅度相较于正常对照组,差异显著(,除此之外,感染后、、这三个时间点,四种蛋白间变动均不显著(图中以字母表示)。而从各蛋白在、、之间表达量的变化看,和这两种蛋白的表达量下调显著(图中以表示)。时的表达量与和时的表达量相比有显著下降。而和的与相比下调显著。的表达量基本未变动。而到了,除了基本正常外,其余三种蛋白的表达量均下降到了正常表达量的左右。 硕士论文猪流行性腹渴病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响哪乂■——,■、■■耳■—图对细胞连接蛋白、、和的影响注：图中数据均以平均值±标准误表示。与对照组相比,小写字母、表示差异显著(,大写字母表示差异极显著(土尸讨论与小结位于相邻细胞近腔侧面顶部的紧密连接在上皮细胞极性的产生和维持中起着关键性作用丨。紧密连接为多种蛋白相互作用形成的复合结构,可分为跨膜蛋白和胞质蛋白。跨膜蛋白有、、连接粘附分子等,胞质蛋白是紧密连接支持结构的基础包括、等。紧密连接的形成还依赖于粘附连接的完整性,粘附连接的重要结构是。体外试验中,细胞跨膜电阻(和细胞旁通道转运试验(通常是 试验研究第四章猪流行性腹湾病毒对紧密连接的影响用于反映紧密连接完整性的重要指标,〗。紧密连接是上皮细胞离子和大分子物质跨细胞旁路转运的主要通道,一旦肠上皮细胞紧密连接发生变异、减少或缺失,肠上皮细胞间隙通透性就会增加,病原菌有可能趁隙而入【。许多病毒感染的共同特征就是因紧密连接功能障碍。例如在轮状病毒感染过程中,跨膜电阻值下降,同时的表达量下降、沿细胞边缘的分布不完整,、的表达量虽未发生变化,但分布位置发生改变,从细胞膜边缘处向内部弥散。紧密连接膜内部分与肌动蛋白丝和肌球蛋白组成的近连接环(直接相连,。近连接环能够控制细胞膜的收缩,肌球蛋白的收缩可以对紧密连接膜内部分产生离心性的牵引,进而调节紧密连接的渗透性】。这间接说明如果影响紧密连接可以控制细胞旁渗透途径,而干扰近连接环部位的微丝后,会干扰细胞旁屏障。通过妈调蛋白活化肌球蛋白轻链激酶,肝细胞的近连接肌动蛋白收缩,细胞旁通透性增强。本试验主要研究了构成紧密连接的四种蛋白、、和的变化,胞质蛋白和从结构上可分为胞外环和胞内环部分,相邻上皮细胞间的胞外环能相互作用形成紧密连接闭锁；而胞内环能与胞质蛋白直接结合,再与肌动蛋白骨架相连,从而形成稳定的细胞间连接蛋白可以聚合成线状原纤维,而蛋白仅能形成短线状片断,被认为是形成紧密连接的重要结构,仅通过基因表达,就可以获得紧密连接的重建,而仅起辅助作用。也是跨膜蛋白,通过和连环蛋白(,结合从而与肌动蛋白骨架发生作用。感染细胞、后,细胞跨膜电阻升高,胞间连接蛋白表达量略有上升,我们认为这是在病毒入侵的应激剌激下,细胞内部的启动修复机制导致的。是形成紧密连接的重要结构,仅表达基因,就可以获得紧密连接的重建因此表达量的改变主要决定了细胞跨膜电阻的变动。在病毒破坏胞间连接蛋白这与丙型肝炎病毒感染后的表达量变化趋势是一致的,跨膜电阻也随之下降,低于正常值。感染过程中胞质蛋白表达量下调、细胞旁路转运率逐渐增加,可能是由于病毒能够影响细胞的微丝,以及感染后时微丝严重紊乱、时在细胞膜下形成高亮微丝环的这个变动过程有关(见第三章扫描电镜、透射电镜结果以及第五章微丝免疫荧光染色结果),病毒在细胞内进行大量的复制组装,病毒指挥微丝不断向细胞内复制组装位点运送病毒,胞内连接蛋白被微丝的离心力不断牵弓丨,致使上皮屏障完整性受到破坏。这一过程中跨膜蛋白表达量的下降解释了细胞旁 硕士论文猪流行性腹宵病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响通透性增强这一现象。感染后后,检测到的细胞电阻相较于正常细胞稍高,此时可能与处于大量外排,微丝向外运送组装完成的病毒粒子,微丝不断组装的方向与之前相反所致。在感染的细胞跨膜电阻值一直高于正常对照组,这与培养板上感染后细胞调亡的情况不一致,我们分析,由于细胞在悬挂式培养小室中生长,能够分化为成熟的单层上皮、可以模拟正常猪肠道屏障环境有关在培养板上培养的细胞可能不支持细胞的完全分化成熟,细胞比较年轻。感染需要丰富的,,我们推测不同分化程度的细胞猪氨基肽酶受体)表达量不同,对的易感程度不一样,引起上皮的病变损伤程度也不同,这可能是培养小室中感染情况与培养板上的感染情况存在一定的差别的原因。由于的感染对紧密连接蛋白的表达量影响较小,而结合对微丝的影响极为显著,我们推测,并不像丙型肝炎病毒或者柯萨奇病毒那样依赖紧密连接蛋白作为入侵受体,,可能是病毒引起微丝骨架的重组,诱发近微丝环的收缩,从而导致紧密连接蛋白的轻微变动,可能会像感染一样,虽然对于紧密连接蛋白的表达量没有影响,但在紧密连接蛋白的分布上变动较大。我们的试验曾尝试通过免疫焚光观察病毒感染后紧密连接蛋白的分布情况,由于缺少猪源紧密连接蛋白的特异性抗体,出现大量非特异性焚光干扰,待以后有合适的抗体,再进行进一步的研究。 试验研究第四章猪流行性腹浑病毒对紧密连接的影响：, 试验研究第四章猪流行性腹湾病毒对紧密连接的影响参考文献,,,,’,,,,,’,,,, 试验研究第四章猪流行性腹？写病毒对紧密连接的影响,,,, 试验研究第五章访流行性腹湾病毒与微丝骨架的相互作用第五章猪流行性腹丨写病毒与微丝骨架的相互作用微丝是所有真核细胞共同具有的保守性的细胞成分,在细胞当中起到骨架的作用,并与细胞内部的物质运输、细胞的运动息息相关。病原菌通常利用细胞骨架,尤其是微丝,作为入侵宿主细胞的跳板。在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎链球菌等常见细菌以及人类免疫缺陷病毒、腺病毒、泡疫病毒等许多病毒的研究中,发现在病原菌入侵、复制和释放的过程中,病原菌与宿主细胞的微丝骨架有着密不可分的联系。结合第三章,通过扫描电镜和投射电镜发现,感染后,小肠上皮细胞的微绒毛以及内部的微丝成分出现了紊乱和消失的现象,本章深入研究了感染后,细胞内部微丝骨架的变化情况；以及在微丝稳定剂或微丝紊乱剂处理后,对的入侵、复制以及释放的影响。应用对病毒在细胞内增殖情进行分析,为之后的试验奠定基础。试验材料病毒和细胞细胞(猪小肠上皮细胞系),用含有胎牛血清的,。,培养。株使用细胞扩繁。在吸附和培养过程中加入的胰酶以帮助病毒感染细胞。主要试剂异硫氰酸荧光素鬼笔环肽(购自公司；微丝稳定剂(,购自细胞松驰素购自公司主要设备恒温细胞培养箱(倒置显微镜(超净工作台(苏州净化设备总厂)；细胞培养板(多功能酶标仪(主要溶液配制 硕士论文猪流行性腹写病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响鬼笔环肽：以充分溶解,配成的存液,于避光保存备用。：以无水乙醇充分溶解,配成存液,于°避光保存备用。：以充分溶解,配成？液,于避光保存备用。试验方法细胞培养细胞生长在含有灭活(°,的胎牛血清和双抗(青、链霉素浓度均为的细胞培养液中,°培养。染色所用细胞接种于每孔预先放置细胞爬片孔细胞培养板中,待细胞融合至单层后进行试验。和试验所用细胞接种于孔板和孔细胞培养板中,待细胞融合至单层后进行试验。猪流行性腹丨写病毒对细胞微丝的影响试验分为正常对照组、感染组。正常对照组：不作任何处理。感染组：细胞单层培养至融合,力口入,及胰酶帮助病毒吸附,。条件下吸附,期间每隔翻转一次,吸附结束后弃去病毒液,以加入双抗、胰酶、不含血清的培养基,°,继续维持培养。各处理组于°、培养箱培养作用、、、、、、、、、后,漂洗次,每次,甲酸固定漂洗次,每次,加入作用漂洗次,每次加入置湿盒,避光作用漂洗次,每次抗突光淬灭封片液封片,倒置焚光显微镜下观察并采集图片。微丝稳定剂对猪流行性腹丨写病毒滴度的影响 试验研究第五章猪流行性腹宵病毒与微丝骨架的相互作用蹄选剂量浓度孔细胞培养板上细胞长成后,以无血清的培养基清洗一遍,随后以含有不同浓度的微丝稳定剂、、、叫培养基处理细胞,°、培养箱内培养后,加入轻轻震荡均匀,置°、培养箱避光孵育。除去培养基,加入二甲基亚砜(放于摇床上震荡充分溶解结晶体。在酶标仪上以波长处读取吸光度值。对照孔以无血清培养基,加入同等剂量的处理细胞,其余操作同上。每组设个平行孔。细胞存活率％处理组值对照组值。检测药物干扰率分组情况：、对入侵过程的影响：首先以药物作用细胞单层弃去药物,加入说￡乂及§胰酶帮助病毒吸附,。,条件下吸附,期间每隔翻转一次,吸附结束后弃去病毒液。以空培养基冲洗,将未侵入细胞的病毒洗去。收取感染细胞。、对复制及释放过程的影响：细胞单层加入及胰酶帮助病毒吸附,。,条件下吸附,期间每隔翻转一次,吸附结束后弃去病毒液。随即以药物处理,待收取感染细胞以及培养基中释放的病毒。、对释放过程的影响：细胞单层加入及胰酶帮助病毒吸附,°,条件下吸附,期间每隔翻转一次,吸附结束后弃去病毒液。接毒后以药物处理,待,收取培养基中释放的病毒。病毒的培养和收获：孔细胞培养板上细胞长成后,以无血清的培养基清洗一遍,随后以含有的的培养基处理细胞。弃去培养基,以上述分组处理细胞。病毒吸附后弃去病毒液,用润洗次,加入含有胰酶、无血清的培养基,置于,反复冻融三次,充分释放病毒。保存备用病毒的滴定：检测孔细胞培养板上细胞长成后,以无血清的培养基清洗一遍。将收集的病毒做连续十倍倍比稀释,稀释液为含有丄胰酶、无血清的培养基。每个稀释度取加入孔细胞培养板中,每孔做个重复,并设空白细胞培养对 硕士论文猪流行性腹湾病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响照。置°培养箱中。计算：逐日观察并记录细胞病变孔数。按两氏法计算病毒的。距离比例二(高于病变率的百分数高于病变率的百分数低于病变率的百分数)距离比例稀释度对数之间的差高于病变率的稀释度的对数细胞松她素对猪流行性腹丨写病毒的影响蹄选剂量浓度孔细胞培养板上细胞长成后,以无血清的培养基清洗一遍,随后在孔板中加入含有不同浓度的细胞松她素、、、培养基处理细胞,°、培养箱内培养后,加入,轻轻震荡均勻,置°、培养箱避光孵育。除去培养基,加入二甲基亚砜放于摇床上震荡,充分溶解结晶体。在酶标仪上以波长处读取吸光度值。对照孔以无血清培养基,加入同等剂量的处理细胞,其余操作同上。每组设个平行孔。细胞存活率％处理组值对照组值。检测药物干扰率病毒的培养和收获：孔细胞培养板上细胞长成后,以无血清的培养基清洗一遍,随后以含有的的培养基处理细胞。弃去培养基,以的试验分组处理细胞。病毒吸附后弃去病毒液,用润洗次,加入含有胰酶、无血清的培养基,置于反复冻融三次,充分释放病毒。保存备用病毒的滴定：检测孔细胞培养板上细胞长成后,以无血清的培养基清洗一遍。将收集的病毒做连续十倍倍比稀释,稀释液为含有胰酶、无血清的培养基。每个稀释度取加入孔细胞培养板中,每孔做个重复,并设空白细胞培养对照。置°培养箱中。 试验研究第五章猪流行性腹宵病毒与微丝骨架的相互作用计算：逐日观察并记录细胞病变孔数。按两氏法计算病毒的。距离比例高于病变率的百分数高于病变率的百分数低于病变率的百分数)距离比例稀释度对数之间的差高于病变率的稀释度的对数统计学处理采用分析软件(,对试验数据进行单因素方差分析,统计结果以平均数±标准误(±表示。结果与分析猪流行性腹丨写病毒对细胞微丝的影响以染色法进行正常细胞的微丝着染突光显微镜下观察,发现：细胞呈多边形,细胞间界限清楚,胞菜内着染成绿色的微丝骨架基本呈束状平行排列,排列整齐,清晰。而感染组在病毒吸附完成后,细胞的微丝部分解聚,细胞核附近微丝亮度较大,其余部分微丝的亮度变暗。我们人为地将微丝的变化划分为五个不同时期：解聚一期(,环膜期,解聚二期(,环核期(,调亡期,各时期微丝的特征如下,结果见图以及模式图。解聚一期,从解聚程度进一步增大,细胞内形成一些短聚集的斑点；到时,微丝已不见束状平行排列,突光显微镜下观察微丝在细胞内呈现绿色雾状,斑点在微丝雾中不易观察到。环膜期时,部分微丝束开始恢复,主要在细胞膜下形成围绕细胞的环状高亮微丝束。细胞内部微丝亮度较暗,但也能观察到部分长微丝束恢复,但排列不规则。解聚二期时,微丝再次开始发生解聚,肌动蛋白弥散分布。环核期间,时微丝凝聚成斑点,荧光显微镜可见微丝在细胞核附近堆积形成散乱的斑块,部分细胞在细胞膜下有一圈微丝形成的亮环,细胞间界限模糊。随着感染时间的延长,部分细胞微丝斑点极性分布于细胞核周围,肌动蛋白逐渐解离作用大于聚合作用,细胞内的荧光亮度上调,此时基本未见细胞膜下的微丝聚集。 硕士论文猪流行性腹再病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响是调亡期,细胞大部分调亡,脱落,残存的细胞微丝聚集浓染,为典型的洞亡细胞染色特征。圓圜图感染后细胞微丝的变化(染色) 试验研究第五章猪流行性腹海病毒与微丝骨架的相互作用參藝參感染后细胞微丝的变化模式图、正常对照组微丝；、解聚一期(、环膜期(、解聚二期(、环核期(、)周亡期微丝稳定剂和细胞松她素对病毒入侵、复制与释放的影响以微丝稳定剂(或细胞松她素(预作用细胞,随后接种病毒,吸附后,通过检测细胞内病毒的来反映病毒的入侵率。结果发现和对病毒入侵率的下调不显著,细胞松他素使微丝处于解聚状态,对病毒入侵率影响更大。结果见图。而病毒入侵细胞后,随即在培养基中加入微丝稳定剂或细胞松弛素,持续作用到,来检测药物在病毒复制和释放过程中的影响。结果显示,与正常感染组±的病毒滴度相比,处理组的病毒滴度下降到±处理组的病毒滴度则是下降到了±。结果见图。病毒感染后持续使微丝稳定或紊乱至,药物在病毒释放过程中的作用可通过检测培养液中病毒的,以反映药物影响病毒释放的程度。发现加入或的试验组相较于正常感染组的病毒滴度下降情况均差异显著。正常感染组病毒滴度为±,处理组病毒滴度下降为±,而处理组的病 硕士论文猪流行性腹丨写病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响毒滴度下降幅度最大,为±。结果见图。■—■■——。仰—图、和对入侵的影响；、和对复制和释放的影响；、和对释放的影响注：图中数据均以平均值±标准误表示。与对照组相比,小写字母表示差异显著(大写字母表示差异极显著(土,讨论与小结微丝是细胞的骨架结构,支撑细胞的形态,在应答胞外环境信号、调节细胞物质运输、细胞运动与分化中具有重要作用。正常上皮细胞的微绩毛和细胞内部的微丝有序排列,当其聚合和解离的速度基本平衡时,微丝骨架处于动态稳定状态以维持细胞的形态和功能。在某些生理和病理条件下,肌动蛋白多聚体(和肌动蛋白单体(的比例迅速变化或者分布部位改变,以适应生理功能的需要或者参与疾病的发生、发展。病毒是一类专职营胞内寄生的感染性病原体,作为一个完全寄生体,病毒善于利用宿主细胞内的各种结构进行自我复制、装配和运输。微丝作为细胞内固有结构,病毒从入侵幵始便遇到微丝,如何在错综复杂的微丝骨架中顺利到达复制部位,组装完 试验研究第五章猪流行性腹丨写病毒与微丝骨架的相互作用成的病毒粒子同样需要穿过微丝网络出胞。病毒在数千万年的进化过程中,发展出了一套利用微丝的策略。水泡性口炎病毒利用网格蛋白介导的微丝辅助的胞吞方式进入；南美蓝对奸浓核病毒的编码蛋白顺着微丝的方向朝细胞核移动,而并不改变胞内微丝的形态通过单分子追踪显示,埃博拉病毒蛋白在细胞内组装和逸出时,与微丝具有共定位现象,等认为是埃博拉病毒利用微丝在细胞内进行运动。牛痘病毒出胞后,利用蛋白募集网格蛋白和微丝,以聚合形成肌动蛋白尾,将病毒运送到新的易感细胞附近超高分辨率光学显微镜清楚的拍摄到牛痕病毒利用不断朝着细胞膜方向聚合的驱动力运送病毒粒子到达宿主细胞膜。病毒进入细胞后,会输送到复制位点,进行大量复制,一般病毒会在进入到复制时期,幵始病毒的释放,每种病毒的具体时间点并不一致。。目前尚未有对在肠上皮细胞中的增殖周期的研究,第三章研究在细胞内动态含量为到达高峰,随后产生量与排出量的差值逐渐下降。感染细胞后,微丝的消融和聚集反复出现,在,微丝在细胞膜下形成较粗的车轮状,而细胞内部微丝亮度浅,可能与病毒不断从细胞外周进入到细胞内部的活动相关。随后微丝逐渐聚集在细胞核周围形成小火山口状。目前普遍认为冠状病毒属成员是在细胞胞质内复制增殖的。但随着蛋白组学和突光标记技术的发展,越来越多的试验证明冠状病毒的蛋白成分出现在宿主细胞的细胞核或者核仁中。冠状病毒的核衣壳蛋白的区域主要定位细胞核,区域主要定位到核仁,区域定位到细胞质、细胞核和核仁。而的蛋白经等证实,能够分布于细胞质或者细胞核的核仁结构中。吕茂杰等通过猪流行性腹湾病毒核衣壳蛋白与感染细胞核憐蛋白的共定位分析发现,的蛋白与细胞核磷蛋白发生共定位。本试验中微丝斑块在细胞核周围聚集,第三章试验透射电镜中观察到的细胞核周围出现病毒粒子的现象,推断是否与病毒粒子在细胞核周围聚集有关。微丝在细胞核堆积在时达到高峰,透射电镜中病毒的细胞核膜已经出现逐渐消融的现象。到斑点状聚集的微丝散布于细胞质中,细胞核的成像在有些细胞上已不清楚。时,细胞已经调亡,细胞内部的微丝皱缩成团,均质高亮,有别于病毒感染细胞内部的斑点状聚集的微丝。病毒感染细胞后对微丝有影响,那么微丝能否影响病毒呢？我们试图用微丝药物改变正常细胞微丝的状态,例如阻止肌动蛋白聚合,能够促进微丝聚合,虽然两者的作用不一样,但都降低了与相互转化的自由程度,破坏了微丝原有的聚合、解聚之间的动态平衡。病毒的入侵、复制和释放可能会受到影响。 硕士论文猪流行性腹汚病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响登革热病毒入侵、复制、释放过程中,加入和能显著降低病毒释放到胞外的量,随着药物剂量的增大和处理时间的延长,降低的幅度越大】。不同病毒受药物的影响不一样,处理后对犬瘟热蛋白的表达影响很小,而非洲猪瘟病毒的感染率降低了,同时抑制非洲猪瘟病毒的早起和晚期病毒蛋白合成以及病毒形态；病毒的不同时期受药物的影响也不一样,感染过程中,对胞内和核内早期反转录产物干扰小,但明显抑制早期反转录产物的完整反转录过程。和对均有一定抑制作用,而对的入侵、复制和释放过程的抑制作用更明显。促进微丝聚合的药物和阻止微丝聚合的药物均能抑制感染。既然感染细胞之后,微丝处于聚合或者微丝处于解聚状态都能够影响病毒,那么病毒可能感染细胞诱发微丝解聚后,并不是单纯为到达复制位点而清除微丝网络,在感染过程中,可能激发信号通路,重新聚合短的形成某些特殊结构来辅助病毒的内吞、细胞内运动,或者出芽。痘病毒属牛痘病毒和杆状病毒科的苜蒂银纹夜蛾多核型多角体病毒通过诱导肌动蛋白聚合的力量,不断推动病毒在细胞内运动,牛痘病毒的肌动蛋白尾在出胞过程中观察到,而苜蒂银纹夜蛾多核型多角体病毒是在进入细胞核复制的过程中出现。我们推测可能编码某些蛋白具有促进微丝成核的功能,促进迅速聚合成,而宿主细胞内部某种防御机制,迅速为加上帽,终止其延伸,所以细胞内会有短的堆积。在聚合过程中,为病毒的入侵、复制和释放提供动力或别的帮助。人为促进微丝聚合或阻止微丝聚合,都会打乱病毒对微丝的控制,能从多个环节抑制病毒的感染。所以,病毒的增殖过程一定程度上依赖和之间能够迅速转换。但干扰微丝并不能完全阻断的感染,这暗示,感染过程中可能还有细胞内别的环节参与调控。 试验研究第五章猪流行性腹湾病毒与微丝骨架的相互作用：,,,,,, 试验研究第五章猪流行性腹湾病毒与微丝骨架的相互作用参考文献,,,,,””,,陈建飞,王承宝,时洪艳,猪流行性腹湾病毒的分子流行病学研究中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会中国黑龙江哈尔滨,’ 硕士论文猪流行性腹宵病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响,,,,,宣华,邢德坤,王殿瀛,应用猪胎肠单层细胞培养猪流行性腹湾病毒的研究兽医大学学报,,,’,,,’’,,’’,,丁 试验研究第五章猪流行性腹湾病毒与微丝骨架的相互作用,,,’,,,,,,,,,,,,,,,,,,,’ 硕士论文猪流行性腹湾病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响,,,,,’,,,,,’’,,,’,,,,,,, 试验研究第五章猪流行性腹浑病毒与微丝骨架的相互作用,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,’’,,, 硕士论文猪流行性腹泻病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响,,,,,,,’,,’,,,,’,,,丁, 试验研究第五章猪流行性腹泻病毒与微丝骨架的相互作用’,,”,,’,,,,,,,’,,”, 硕士论文猪流行性腹泻病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响,,,丁,’,,,’,’,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, 试验研究第五章猪流行性腹泻病毒与微丝骨架的相互作用,,,,,,,”,‘,”,,,,,,,,,,,,”, 硕士论文猪流行性腹泻病毒对细胞微丝骨架及紧密连接的影响,,”,,,,,,吕茂杰,陈建飞,时洪艳,猪流行性腹泻病奇核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋內的共定位分析微生物学报,’,’’,,,,, 试验研究第五章猪流行性腹泻病毐与微丝骨架的相互■作用,,。,—,,,,,—,”, 全文结论全文结论通过扫描电镜、透射电镜以及微丝荧光染色结果显示猪流行性腹泻病毒的感染能破坏细胞的微丝骨架。感染后影响紧密连接蛋白与微丝,紧密连接表达量有所下调,同时引起微丝骨架的解聚和重排。微丝状态的改变(稳定状态或者解聚状态,对病毒的复制和释放有明显抑制作用。在复制和释放过程中微丝骨架起重要的作用。 致谢致谢时光如淙淙溪水,日夜不停的流逝。三年的研究生求学生涯即将结束,站在毕业的门槛上,回首往昔,从刚接触科研时的懵懂无知到熟练掌握,从曾经的轻狂少年步向成熟理智,这三年是一份宝贵经历,它给我带来太多的感动、感悟和成长。值此毕业论文完成之际,我谨向所有关心、支持、帮助我的师长,同门、亲友呈上我最诚挚的感谢与最美好的祝愿。首先,衷心感谢我的恩师杨倩教授在学习、科研及生活上给我的谆谆教诲、精心培养和悉心关怀。您严谨的治学精神,深厚广博的学术造诣,孜孜不倦的幵拓进取精神,宽广的胸怀都深深感染着我,您的言传身教、无微不至的关怀,让我在求学和生活上都收获良多。在您的悉心指导和大力支持下我的硕士学习和科研课题才得以顺利完成。您在做人、做事、做学问上给学生树立了学习的榜样！感谢庾庆华老师给我的悉心指导和热忱帮助,您深厚的科研功底、缜密开阔的思维和幵朗的性格都深深影响着我。诚挚感谢李鹏成、邢鹏、林建、张强、康海泓、叶小兰、邓军、李云峰、李正平、田琦、付佳、朱立麒、阴银燕、秦涛、王雪平、胡唯伟、刘浩飞、梁金逢、杨燕、许静、高琪、闫梦菲、牟春晓等师兄弟姐妹们给予的热心帮助。特别感谢王志胜师兄和赵珊珊师姐对我的无私帮助！感谢我所有的朋友们和家人对我学业的理解和支持,你们是我前进的最大动力！
