猪伪狂犬病的流行病学调查及防治

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河南农业大学专业硕士学位论文题目猪伪狂犬病的流行病学调查及防治学位申请人姓名伏鹏导师姓名王新卫专业学位类别发病机理及防控领域预防兽医学研究方向动物疾病流行机理及防控中国郑州2016年6月 分类号密级河南农业大学专业硕士学位论文论文题目：猪伪狂犬病的流行病学调查及防治英文题目：TheEpidemiologicalinvestigationandpreventionofswinepseudorabies学位申请人：伏鹏导师：王新卫学位类别：兽医硕士领域：预防兽医学研究方向：动物传染病发病机理及防制论文提交学位授予日期：日期： 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书—丽巧「ｎ义题目猪化巧犬摘的流巧摘学调查及防治类别肖医硕十一预防兽匿学删ＩＩ難［認Ｉ巧如雨：ｉ保密，解瓷时间年月Ｒ独创性声明？本人呈巧论文是在导师巧诗Ｋ进打的硏究Ｉ：作及取得研究成果，除了丈中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，义中不包介耽他人己经巧表或撰写过的研究成果，也不包括为获得河南农业大学或巧他教巧机构的学位或证书而使用过的材－ＩＩ料，同工作的指导教师对此进行了审定。与我Ｉ］志对本研究所做的任何贡献。均已在论文中做了明确的说明，并衷巧了谢意特此声明。研究生签名巧帅黎名：＜衣记中円期：Ｗ占年《月円Ｈ期ｔＪ１么２Ｊ１：学位论文使用授权及知识产权归属承诺？？本人完全了解河南农业大学关于保巧、化用学位论文的规定，即学尘必须按照学校耍求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校巧权保巧提交论文的印刷本和电子版本，、缩印或巧描等，并提供目录检索和阅览服务可Ｗ采用影印复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学用不Ｎ方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。？ｇ本人完全了解《河南农业大学知识产权保护办法》的有关规定，在毕业离一研工，巧河南农业大学后，就在校期间从事的作发表的所有论文名科第署单、，试验材料、数据的专利等识产权归而农为河而农业原始申报知均河化大学业学化巧则，承巧巧应的法任。火所律责－－。，注；保密立在解密后适学位论巧于本授权书不巧＞：：学院领研名译签來ｈ究化签导师签名良：抑ＨＨ円期约脾月期巧円円期知 致谢本文是在王新卫副教授的悉心指导和亲切关怀下完成的。两年来，导师在我选题，开题及试验过程中为我指点迷津，帮助我开拓思路；在生活中给予我无微不至的关怀，爱生如子。在恩师王新卫老师的辛勤培养和谆谆教诲下，我完成了我的毕业论文，不仅开拓了我对科学的认识，而且恩师一丝不苟的作风，严谨求实的态度，踏踏实实的精神，教会了我对工作的态度，更教会了我受益终生的做人之道。在此，特向恩师致以最崇高的敬意和最衷心的感谢！本试验是在河南农业大学牧医工程学院疫病监测中心完成的。在试验完成论文撰写期间得到王川庆、赵军、陈陆、杨霞、常洪涛、刘红英、姚慧霞、李永涛、杜季梅等老师的悉心指导和帮助，在此谨致以最衷心的感谢！同时感谢师兄高冬生、王永生、周峰、郭占达、郭天准、敬文献；师姐郑鹿平、黄慧敏、张美玲、马文昭、张玉娟、李晓静、刘金玲、韩莎莎、卢彩景；同窗王艳、崔丹丹、王晓雪、李红杰、李双双、张真真、杨利；师弟王新港、王傲杰、王继洋、石昂；师妹王贝贝、万文妍、刘延珂等。疫病监测中心工作人员赵月、刘丽华、、赵小利等老师以及我的室友们在工作和生活中带给我的快乐和动力，在论文完成期间的无私奉献和帮助!1 目录摘要..................................................................................................................................................1文献综述...........................................................................................................................................61猪伪狂犬病概述...........................................................................................................................62PR病原学......................................................................................................................................62.1分类地位............................................................................................................................62.2病毒的基本特征................................................................................................................62.3分子生物学........................................................................................................................73流行病学研究进展.......................................................................................................................93.1PR国外流行动态...............................................................................................................93.2PR国内流行动态...............................................................................................................94PR诊断........................................................................................................................................104.1病原检测...........................................................................................................................104.2血清学检测......................................................................................................................115PR的防制....................................................................................................................................125.1国外对PR的防控............................................................................................................125.2国内对PR的防控............................................................................................................12试验一河南省部分地区猪场PR野毒感染情况描述性分析....................................................141材料与方法.................................................................................................................................141.1材料..................................................................................................................................141.2方法..................................................................................................................................152结果............................................................................................................................................162.1河南省2015年猪群PR野毒抗体结果..........................................................................163讨论.............................................................................................................................................203.1河南省规模化猪场猪群感染PRV野毒感染形式依然严重.........................................203.2不同地区PRV野毒感染差异较大。.............................................................................213.3不同规模猪场PRV野毒感染严重，其中小规模血清阳性率最高.............................213.4各阶段猪群PRV野毒感染阳性率不同，公猪PRV野毒阳性率最高.......................213.5当前河南省PR感染严重，应采取有效措施加以防控................................................22试验二河南省部分地区2015年猪场PRV野毒株gE基因进化分析.....................................231材料与方法.................................................................................................................................241.1材料...................................................................................................................................241.2方法..................................................................................................................................242结果............................................................................................................................................272.1核苷酸序列分析..............................................................................................................272.2氨基酸序列分析..............................................................................................................343讨论............................................................................................................................................37试验三中国猪伪狂犬病毒的流行病学分析.................................................................................391材料与方法.................................................................................................................................391.1材料..................................................................................................................................391.2方法..................................................................................................................................392结果............................................................................................................................................422 2.1我国各地区2005年-2015年规模化猪场PR野毒抗体分析........................................422.2我国部分地区2005年-2015年PR野毒gE基因遗传进化分析.................................493讨论.............................................................................................................................................503.1我国猪群2005年-2015年感染PRV野毒情况.............................................................503.2河南省2005年-2015年感染PRV野毒情况不断变化................................................503.3我国不同阶段猪群2005年-2015年感染PRV野毒情况存在差异.............................513.4我国不同地区猪群2005年-2015年感染PRV野毒情况不容乐观.............................513.5我国2005年-2015年感染PRV野毒gE基因进化情况...............................................513.6流行原因分析...................................................................................................................51试验四规模化猪场PR的防控研究及应用................................................................................531材料与方法.................................................................................................................................531.1材料..................................................................................................................................531.2方法..................................................................................................................................532结果............................................................................................................................................542.1防控前后PR野毒病原阳性率变化...............................................................................542.2防控前后不同阶段猪群野毒抗体阳性率比较..............................................................542.3种猪生产成绩比较..........................................................................................................553讨论............................................................................................................................................55全文小结.........................................................................................................................................56Abstract...........................................................................................................................................56参考文献：.....................................................................................................................................573 摘要猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒引起的一种多动物急性传染病，临床上以妊娠母猪早期流产、死胎、木乃伊及呼吸系统临诊症状为特征，严重危害养猪生产。猪群感染后常引起严重的经济损失。2011年底来，该病在我国一些猪场不断发生和流行，导致母猪大量流产、新生仔猪发生神经症状并大批死亡，造成重大经济损失。为全面了解河南省部分地区猪伪狂犬病的流行情况，本研究从血清流行病学、病原流行病学以及分子流行病学等方面对该病在我省的流行情况进行了分析，并依据流行病学研究的结果提出相应的防控措施，同时应用于实践，为该病的有效防控提供参考。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）对2015年1月~2015年12月间河南省近部分地区337个猪场的3711份送检血清样品进行PRVgE抗体检测，结果显示：337个猪场中有293个为PRV野毒阳性场，总阳性率为86.89%；其中豫东、豫西、豫南、豫北、豫中五个地区的猪场阳性率分别为81.25%、79.31%、79.31%、85.71%、97.14%；小规模、中等规模和大规模猪场的阳性率分别为85.45%、90.90%和87.10%；3711份血清样品的总阳性率为60.3%，其中母猪、公猪、商品猪的血清样品阳性率分别为60.1%、72.6%、57.09%；结果表明：河南省PRV野毒感染比较严重，尤其是豫北、豫中地区；不同生产阶段的猪群PRV野毒感染情况均较严重，尤其是种公猪群。85%、5.26%、15%、5.6%；结果表明：猪场的野毒感染情况随着月份的变化有一定差异。为了解河南部分地区2011年以来猪伪狂犬病毒(PRV)流行株的现状、分子生物学特征和遗传演化规律，本试验收集了河南部分地区的9株PRV分离株，并对其gE基因进行遗传变异分析。结果表明:9株PRV分离株的gE基因与其他参考毒株相应序列具有相对严格的保守性，这些毒株之间的核苷酸之间和与其他参考株核苷酸序列同源性分别为99.7%-100%和99.1%-99.9%。氨基酸多序列比对发现，9株PRV分离株氨基酸同源性达到100%，与参考株氨基酸同源性在98.1%-99.6%，在1个位点发生了独特性的氨基酸突变，即第2位氨基酸(同ZM-（Henan2013）和Yangshan(Korea-1996)株)由K突变为F，这是国内首次发现gE基因在该位置发生氨基酸突变的毒株。这些新的氨基酸突变与PRV致病性及其与生物学特性的关系有待进一步研究。在本研究中，对我国2005年-2015年近十一年的猪伪狂犬血清流行病学资料进行汇总分析及gE基因变异情况研究，结果显示十一年中涉及的3732个猪场中有2189个为阳性场，阳性率为58.65%，共有272144份血清，其中79754份阳性，血清阳性率为29.31%。对各阶段猪群野调查得知经产母猪、后备母猪、商品猪、种公猪、哺乳仔猪、保育猪的平均阳性率分别为29.66%、20.79%、20.62%、32.99%、23.38%、21.83%。各地的调查结果显示4 中南地区、东北地区、华北地区、华东地区、西北地区、西南地区、河南地区规模化猪场PR野毒阳性率平均为22.23%、27.74%、34.53%、26.93%、24.89%、23.89%、34.85%。本研究对2005年-2015年我国伪狂犬病的发病情况有一定程度的了解，对本病的研究提供一线临床数据。本研究通过流行病学提示的相关风险因素：购入种猪无检疫、消毒不严格、无全进全出、未免疫含PR6种以上猪病、没有驱鸟、灭鼠措施，提出猪场加强饲养管理，做好生物安全措施，严格执行常规免疫，做好重要疫病防控、定期检测、隔离病猪、淘汰阳性种猪的控制PR策略。防控结果显示本研究的防控方案具有非常实用的价值，为PR的有效防控提供了借鉴。关键词：河南省；猪伪狂犬病；血清学调查；gE基因；风险因素5 文献综述1猪伪狂犬病概述猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）引起的一种可感染多种动物的传染病，在世界各地均有报道该病的暴发，是严重威胁养猪业的主要疫病之一。PRV的易感宿主种类较多，其中有如猪、牛、羊等经济类动物，犬、猫等宠物、[1-3]浣熊、水貂、狐等野生动物，也可感染除人外的一些灵长类动物，如恒河猴、狨猴等,但[4-5]猪为唯一一种能够成为潜伏携带者的动物，也是该病毒的贮存宿主。PRV感染猪和携带[6]病毒的鼠类为PR重要的传染来源。PRV感染导致种猪的生产性能下降，如公猪的不育，[7-9]妊娠母猪的流产、产死胎和木乃伊胎，给养猪业造成重大经济损失。PR于1813年首次在美国牛群中发生，1902年被匈牙利科学家Aujeszky认定为一种独特的病。目前，本病呈世界分布。为防控该病，自20世纪90年代以来，北美和许多欧洲国[10-11]家大规模使用gE缺失疫苗区别免疫动物和野毒感染动物并淘汰阳性动物消灭了该病。然而，对于第三世界国家如中国以及猪群密度高的一些国家或地区，猪PR仍是动物疫病中[12-13]最严重的疾病之一，如我国以及猪群密度高的一些国家或地区。在中国，刘永纯等在[14-15]1947年首次分离到PRV，并随后在牛和猪群中相继发现该病毒。到目前为止该病在中国广泛流行。为了控制PR，我国大规模推广使用基因缺失疫苗（Bartha-K61）对猪进行免疫接种，一度使猪群PR得到有效控制。然而，自2011年年底以来，我国各地暴发了猪伪[16-19]狂犬病，其中很多地区免疫过Bartha-K61疫苗，疫病影响我国多个省、市、地区，给[20]养猪业带来了巨大的经济损失。也有证据显示在我国经典Bartha-K61疫苗对于伪狂犬野[21-25]毒感染还不能提供完整的保护力。进一步的流行毒株的全基因序列分析揭示，当前分离的流行株与之前分离株包括Bartha-K61在内，其病毒蛋白基因出现了很大的变异，如病毒[26-28]蛋白碱基的替换、嵌入和缺失，野毒的感染无疑又给我国伪狂犬病的防控增添了现实的困难。2PR病原学2.1分类地位PRV为疱疹病毒科，疱疹病毒亚科α-疱疹病毒属成员。从分类学上称为猪Ⅰ型疱疹病毒（SuidherpesvirusI），由于1902年Aujeszky证明该病由病毒引起，因此该病又称Aujeszky[29][30]disease，该病毒为甲型疱疹病毒亚科，水痘病毒属，它具有疱疹病毒所共有的特征。人I型单纯疱疹病毒、马立克氏病病毒（MDV）等同属于α-疱疹病毒。2.2病毒的基本特征PRV具有与其他疱疹病毒粒子一样的大小和结构，完整的病毒粒子呈圆形，粒子直径约为150-180nm，主要囊膜、衣壳和核心三部分组成。内部核心区的基因组为线性双链DNA；核衣壳包裹起核酸，对其呈现一定的保护作用；囊膜构成病毒和细胞蛋白组成的中间层，囊6 膜为糖蛋白，有些形成突出于囊膜表面或放射状的纤突，基因编码特性分析，疱疹病毒基因[36]组由A-F的六类组成。PRV的基因组同水痘疱疹病毒一样被分在第四类，两个独特的区[37]域具有独特性，长区序列（UL）和短区序列(US)，并且US在内部重复出现。目前已掌握PRV整个基因组的序列和基因编码信息，大量的实验数据像地图一样地清晰的展现出了[38]伪狂犬病毒的组织结构。反向重组可能会产生与短区相反方向的两种不同的变异基因结构。虽然两种同分异构体都有感染性，并且在感染后产生的分子克隆数量也相当，但往往只[39]有一种被检测到。PRV的70种不同的基因功能已经明确，有两种说法关于基因编码IE180和Us1，因为他们位于内部重复序列（IRS）和末端重复序列（TRS）。Us3由于主要和次要形式显示不[40]同的功能而被当做是独立基因。疱疹病毒甲亚科的伪狂犬病毒有一种或多种相关的同系物。总的来说，基因的名称来源于他们在独特的长区序列（UL）和独特的短区序列（US）的位置，符合I型疱疹病毒的特点。伪狂犬病毒基因组和其他I型疱疹病毒有很大的共性，[41-43]除了在UL区域一个很大的内部反演定位在UL46和UL26.5之间。PRV的基因开放阅读框（ORF1），ORF1.2和UL3.5在其他I型疱疹病毒中没有被发现。PRV基因组上存在三[44]个复制起点，分别是UL区的OriL及IR区的两个OriS。2.3分子生物学2.3.1转录相关结构[45]同许多相关的I型疱疹病毒比较，伪狂犬病毒的转录特性是稳定的。许多相同基因构[46-48]成3'端的终止区域。这些发现的被拼接在疱疹病毒中的基因多是早期基因或是延迟表达基因。伪狂犬病毒包含两个已知的拼接记录即（US1）和大的延迟记录（LLT），一个假[49-50]定的拼接记录（UL15），并且包含所有疱疹病毒的三种同系物。许多核心转录元素预计将在基因之间共享，这些特征便于在基因的高密度和有限的基因序列中找到相关的疱疹病毒，如伪狂犬病病毒。因此，PRV包含很多短基因的重复元素，这些元素位于会聚的转录本中，并且阻止基因向着相反的方向进行转录。2.3.2核心基因疱疹病毒基因组中有40个相对保守的基因，这些“核心基因”编码执行部分疱疹病毒复制基本步骤的相关蛋白，满足包括DNA复制、病毒组装等的相关功能，并且有共同的感染细胞途径。对哺乳动物和鸟类的体内的病毒基因组遗传进化进行分析，其中有约40个核心[51]基因来源于同一个古老的病毒。虽然很多疱疹病毒的核心基因都具有保守性，但一些只分享相对基因组位置和蛋白质功能。同其他疱疹病毒一样，所有的病毒核心基因主要集中在UL区。2.3.3衣壳蛋白PRV主要衣壳蛋白（MCP或VPS）被UL19进行初步定位，并组装成162个呈二十面[52]体的衣壳结构。UL19的结构安排和序列在所有的疱疹病毒中都相对保守，由此产生一个[53]直径大约为125nm的衣壳。病毒的六邻体有UL16（VP5）的六个分子和UL35（VP26）7 的六个分子，这些六邻体形成病毒衣壳的边缘和面，然而12个片段构成病毒的顶点。这些六邻体和片段被三螺旋体以三个为一个单位连接起来即UL38(VP19C)、UL18(VP23)、[54-56]UL18(VP23)的异三聚体。十一个片通是UL19(VP5)的五聚体，然而第十二个顶点是一[57]个是由UL6的12个分子组成圆柱形门户。因此，每一个成熟的衣壳含有955分子UL19（VPS），900分子UL35（VP26），640分子UL18（VP23），320分子UL38（VP19C），和12分子UL6（门户蛋白）。门环形通道允许一个拷贝的病毒核酸将基因组包装成预制的[58]外壳。2.3.4外膜蛋白[59]囊膜层是在衣壳粒和包膜之间，常见于成熟的疱疹病毒粒子。尽管多数疱疹病毒的核心表现一定的保守性，但一些只分享相对基因组位置和蛋白质功能。类似于其他疱疹病毒，在UL区存在病毒的核心基因。至少十四种蛋白是来源于病毒，外膜层镶嵌着细胞的肌动蛋白。外膜蛋白在病毒入侵和病毒粒子形态形成方面起着重要的作用。随着包膜蛋白随着衣壳和宿主细胞的摄入协助，病毒包膜与质膜融合，使得病毒进入细胞。这一系列事件发生在任何病毒蛋白合成之前。另外一种具有类似于I型疱疹病毒编码同系物的一种UL41基因编码[60]的蛋白，具有RNase活性并且降低宿主mRNA的活性。2.3.5病毒的包膜蛋白及其功能病毒疱疹病毒糖蛋白在病毒自身包膜和几乎所有易感的细胞的包膜膜中被发现。这些膜蛋白在病毒的入侵、释放和细胞与细胞间的信息传递过程中发挥重要作用，并起着调节免疫应答，促进合胞体的形成的作用。伪狂犬基因编码16种膜蛋白，其中有11种有N-修饰或[61]O-连接的糖蛋白，分别是gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gL、gK、gM和gN。gB是病毒的主要免疫原性成分，它是疱疹病毒科所有蛋白中最保守的，在病毒感染过程[62]中起着非常重要的作用，是病毒自然感染和在上皮细胞之间扩散所必需的，病毒从感染神经元中释放并不需要gB蛋白，但该蛋白是病毒感染扩散所必需的。gC基因位于基因组的UL区，编码479个氨基酸，可以作为T淋巴细胞的靶蛋白。该蛋白并非病毒感染所必需的糖蛋白，但在诱导免疫保护中起到重要作用。此外，gB、gC也是淋巴因子激活的自然杀伤细胞的识别对象。gD蛋白是病毒粒子的重要组成成分，是主要的中和抗原，可与细胞受体结合改变病毒粒子与细胞的结合状态。在病毒粒子感染细胞过程中，该蛋白与肿瘤坏死因子和免疫球蛋白表面的受体结合，相互作用后激发膜融合机制，促进感染细胞质膜与病毒囊膜的融合，另外，gD蛋白在病毒复制过程中也起着关键的作用。gE蛋白具有典型的膜蛋白特征。基因位于US区，由577个氨基酸组成，前接gI基因，后连11K基因。PRV的gE与gI以非共价键结合形式形成复合体。gE是PRV从视网膜、嗅觉上皮细胞、三叉神经节侵入中枢神经组织所必需的。gE对PRV体内毒力表达、侵袭神经和沿着神经传递起着决定性的作用。几乎所有PRV野毒株均能表达gE糖蛋白，因此gE基因在PRV的野毒与疫苗株的鉴别诊断中具有重要意义。8 gH是疱疹病毒中同源性仅次于gB的保守蛋白，它与gL以异源二聚体的形式存在。该[63]蛋白是病毒和细胞融合的必需蛋白，对病毒在神经系统的传播也起着重要的介导作用。3流行病学研究进展3.1PR国外流行动态伪狂犬病最早发生于1813年美国的牛群中，主要表现为“奇痒”，直到1902年，匈牙利科学家Aujeszky首次报道此病，因此，该病被命名为奥耶斯基病（Aujeszky’sdisease）。美国、英国、德国、法国、日本等50多个国家和地区均有该病发生的报道。联邦政府所做的一份血清学调查表明，在1974-1984年间，PR在美国感染率由0.56%增加到8.78%，发病率[64]增加了15倍。英国1953年首次报道本病，1971年以后，猪开始出现严重临床症状，此后，爆发的[65]次数和严重程度逐渐上升，1983年爆发的次数为443次。希腊于1952年首先报道牛的PR，随后报道发生于绵羊、山羊和水貂，猪的伪狂犬病于1977年首次报道，1978年被确诊，数据显示PR感染范围不断扩大。丹麦最早在1931年的牛群中报道PR，1964年有报道猪发生此病。直至20世纪70年代，PR并未造成严重的经济损失。只有在在牛群中散发，猪则只发生于仔猪，出现临床症状和死亡。然而自1978年以后，PR严重爆发的次数越来越多。PR早期在法国呈散发，在1968年以前总共只有19次发生;1968年以后临床上PR发生[66]急剧上升，而且许多地区均报道发生PR,1983年整个法国有344次。原民主德国20世纪60年代末期PR开始流行，20世纪70年代早期猪群的发病率增长[67]了近一倍。但自1966年后采取根除计划后猪群PR的感染率明显下降。[68]瑞典1965年首次报道PR，感染病例逐年增加，1965-1990年前15年内仅有40例，后10年内有160例。1989年的一份年度调查表明当年的猪群感染率为5%，猪只的阳性率为28%。1977年前西德仅零星出现PR，但之后感染病例数急剧上升，仅1987年一年的病例多[69]达1968次，该病主要发生于德国猪群饲养集中的北部和西北部，育肥猪也受到影响。3.2PR国内流行动态在中国，PRV感染首先由刘永纯等在1947年猫中分离得到，之后再随后在牛和猪证明[70-71]有该病毒的存在。在20世纪80年代早期，已确定有18个地区（14个省，1个直辖市和3个自治区的中国）的动物存在PRV感染。虽然牛，绵羊，山羊，猫，狗和貂也有感染，但主要发病动物是猪。自上世纪八十年代后期以来，PR的发生率上升，并且在全国范围内[72]蔓延，这与中国的养殖量、养殖密度的增长有关。此外，田间的潜伏感染也是猪群高比[73]例感染PRV的主要原因。在发病期，猪群仔猪发病率和死亡率为70-100%。为了控制猪伪狂犬病在中国的发病和流行，中国在1979年引进了Bartha-K61株疫苗，并对其安全性和[74]功效进行评价。自20世纪80年代后期以来，Bartha-K61株疫苗在中国的应用，使得PR9 [75-76]得到良好的控制。注射过疫苗的猪场，新生仔的感染率和死亡率都低于10%。然而，PR并未完全被净化根除，在2005年前后所有的地区，一直是地方性或零星出现。PR根除[77-80]战略的疫苗接种未能完善实施，法规的疏漏和生物安全措施的不够严格，使得PR疫情变得严重。更值得注意的是，自2011年底以来，病毒变异已经出现，许多免疫过bartha-k6l疫苗的猪场发病。根据最近的一份报告显示，中国23个地区的80.1%调查农场遭受感染PRV的变异株的影响。此外，被调查的213个猪场中有58.2%的猪场PR总体感染率或gE抗体阳[81]性率从很低于20%增加至超过50%，这说明我国的猪群受到野毒PRV严重感染。变异伪狂犬病感染造成的对猪生产造成重大的经济影响。在河南省仅一个猪群，就有2600新生仔[82]猪和200头母猪死于该变异PRV感染，造成了至少一百万元人民币的直接经济损失。绵羊和猪的疫苗接种攻毒试验表明传统的狂犬病疫苗对中国当前流行的变异毒株不能[83-87]提供完整保护。当前分离的变异株全基因组分析显示了，病毒基因组出现了变异，包括[88-91]替换、插入或删除发生在大多数病毒蛋白。强调目前在我国野毒感染导致的PR仍继续流行和发生，严重影响我国动物生产，尤其是生猪生产。4PR诊断准确、敏感的诊断方法是PR的防控和净化过程中不可缺少的一部分。早在1980年以前诊断方法主要是病毒分离、病毒中和实验以及易感动物的攻毒试验。自20世纪90年代以来，酶联免疫吸附试验（ELISA），聚合酶链反应（Polymerasechainreaction,PCR）和实时定量PCR被广泛应用PR的快速诊断。目前几种市售的进口或国产酶联免疫吸附试剂盒，已经在国内得到了认可并广泛使用。PCR病原检测和gB/gEELISA抗体检测是国内大多数实验室采用的诊断方法。gB抗体检测用于评定疫苗免疫后的抗体水平，gE抗体检测用于区分疫苗接种和野毒感染。实时定量PCR、病毒分离只在一些专业化的实验室用来做更加明确的诊断。其他的检测方法，如实时聚合酶链反应和循环等温扩增等已在中国开发应用于[92-96]PRV野毒株与疫苗株的区分检测，但仅仅在某些实验室使用。应指出的是，不同的检测尚没有统一的标准，这也导致了不同的诊断结果，不利于疾病净化与防控。4.1病原检测PRV的分离鉴定是经典的实验室方法，也是诊断伪狂犬病的可靠方法。但该方法费时费力，不能满足于实际生产。病毒分离时最常采集病猪的脑(以中脑和脑桥为主)、扁桃体、肾和脾等组织，咽拭子、阴道拭子等均可用于病毒的分离，PRV检出率最高的是三叉神经节，其检出率为100%。PRV病原的分子诊断方法主要有：酶切图谱分析(RFP)、原位杂交技术、常规PCR、鉴别PCR、定量PCR、核酸探针技术等,临床常用的PRV病原检测方法主要是常规PCR技术。4.1.1PCR技术[97]Belak等率先建立了检测PRV的PCR方法，该技术具有快速、敏感性高等特点，能同时检测大批量的样品，并且能进行活体检测，适合于临诊诊断。但是PCR的特异性与多10 种因素有关，受多方面影响。如引物设计不合理，则会增加非特异性反应，干扰实验结果。4.1.2荧光抗体染色免疫荧光技术(FA)是一种用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。取脑或扁桃体作压片或冰冻切片，用荧光抗[98]体检查，常可于神经节细胞内测到病毒。Stewart等曾应用FA对PRV病原做过对比试验获得了良好的效果，验证了该技术的实用性。该方法是诊断猪伪狂犬病快速而敏捷的方法，但特异性较差，不适用于大量样品的检测。4.2血清学检测猪感染常不表现出典型的临床症状，因此诊断常采用血清学方法。血清学方法是目前广泛用于PR诊断的方法。常用的血清学方法有：中和试验、乳胶凝集试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光试验（IFA）等。近年来开发出了与疫苗配套、快速敏感、可区分野毒感染抗体和疫苗抗体的ELISA检测试剂盒（gE-ELISA），在该病的根除计划中显示出了较大的优势。针对缺失的糖蛋白建立的鉴别诊断方法有：gE-ELISA、gG-ELISA、gC-ELISA以及gE-LAT、gG-LAT等。4.2.1中和试验中和试验(NeutralizationTest)又称为微量血清中和试验是检测病毒的经典方法，它以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。中和抗体一般用于测定动物体内中和抗体的存在及效价。近年来应用微量培养板上培养单层细胞来进行微量中和试验，该方法特异性很强，结果易判断，适于进行大量试验。但该方法由于操作较为繁琐、敏感性低、工作量较大，给临床应用带来了一定的困难。4.2.2ELISA抗体检测酶联免疫吸附试验（ELISA）是当前应用最为广泛的一种免疫血清学测定方法，适用于实验室大批样品检查、产地检疫、流行病学调查和无本病健康猪群的建立。蒋玉雯等建立[99]了检测伪狂犬病病毒抗体的ELISA方法。包括间接法、双抗夹心法和竞争法。该方法具有简便、快速、敏感性高、特异性强等优点，可大批量检测样品，被OIE作为诊断猪伪狂犬病病毒首选的血清学方法。4.2.3乳胶凝集试验胶乳凝集试验先用乳胶包被抗原，利用抗原抗体特异性结合性质，与相应血清发生反应，能够在几分钟之内确定是否有PRV感染。现今可以合成具有各种特性，如彩色、荧光和磁性等胶乳，使之适应多种用途，试验方法也由传统的定性或半定量玻片试验发展成为更为灵敏而精确的微板凝集、导管凝集和膜过滤斑纹等试验，能够应用粒子计数和浊度测定等定量试验方法进行精确的检测，在定量测定时使用了自动计数器、分光光度计、光散射测定仪等仪器，从而使得这项技术突破了传统凝集试验手工操作，主观判断的局限，具有现代特色。该方法操作简单，不需要特殊的设备要求，较适合于基层兽医防疫工作者和规模化养殖11 场临床兽医使用。5PR的防制5.1国外对PR的防控过去几十年，常规疫苗的广泛使用PR得到一定的控制，但没有完全控制住该病的流行。随着基因缺失疫苗及其相应的鉴别诊断方法的不断发展，世界上一些受PR影响的国家实施了该病的根除计划，并已取得了显著成效，目前英国、丹麦荷兰等国家基本实现猪伪狂犬病[100]的净化。美国1989年开始启动为期10年的全国性净化计划(斯特劳等，2000)，并已于2004年实现计划目标。然而对第三世界国家，PR的净化仍很遥远。5.2国内对PR的防控在中国PR已被列为2012-2020年中长期动物疾病预防和控制程序中着重考虑的猪病之一。该计划自2012年开始实施。该计划的任务之一是在2020年底在猪群中消除PR，但一个强制性的疫苗接种政策到目前为止尚未进行。早在中国自20世纪90年代初，大规模接种[101]常规疫苗、基因缺失活疫苗（Bartha-K61株或其衍生物）被用于PR的防控。Bartha-K61株在猪肾细胞、鸡胚和鸡胚成纤维细胞上连续传代后，导致病毒毒性和感染性减弱。该疫苗已被证明是安全和有效的，这些措施已经发挥了关键作用，PR的控制虽然接种导致降低PR[102-104]的发生和减少经济损失。在过去的几十年中，PR在中国的大部分地区存在区域流行性。为了很好地控制PR，一些大型的农场已经在科学家和政府部门的指导下实施PRV根除计划。自2000以来，一些地区或猪场借助gE基因缺失疫苗、强烈的安全意识和有效的生物安全措施，已经将PRV净化。对于大多数农民来说，更多的关注应该是预防接种而不是生物安全措施。由于自愿接种政策，中国的疫苗接种是不完全的，特别是在偏远乡村和家庭农场。除了Bartha-K61株，各种抵抗PR的基因工程疫苗被研发，包括基因缺失疫苗。[105-108]疫苗研究也是防控PR的重要一环。目前已经多种新型疫苗的研究报道，脱氧核[109-112][113][114]苷酸疫苗、亚单位疫苗、活病毒载体疫苗、gE/gI/TK基因缺失疫苗2003年颁[115-116]布的第一个动物基因疫苗（SA215株）。TK/GG基因缺失PR疫苗HB-98株在2006获得许可证书，该疫苗被认为PR爆发急救最合适的疫苗。这两个许可的疫苗已经在畜牧领[117-118]域使用。最近的研究表明，传统的Bartha-K61疫苗对当前中国猪群中的流行株不能提[119-123]供完整的保护力。目前可用的HB-98株或基因缺失三联疫苗SA215株是否可以提供有效的保护尚不清楚。为了有效控制有新的变异株引起的感染很多疫苗以当前流行株进行研制，其中gE/gI缺失疫苗以天津株PRV为代表，gE/gI/TK缺失疫苗以河南1201株PRV为代表，而灭活的gE/gI/TK[124-127]缺失疫苗以ZJOL株为代表。据报道，这些疫苗对于PRV毒株的感染起到一定的保护作用，但这些候选疫苗的安全性和有效性仍有待进一步研究。无论如何，这些新型有效的疫苗给我国PR的净化和防控提供一种手段。PR的鉴别诊断，安全、有效的疫苗免疫方法对于PR的控制和根除是非常重要的。考12 虑到当前新变PRV在中国猪群中PR感染日益恶化的局势，一个首要任务就是寻找一种更加安全和针对当前流行株有效的疫苗。此外，PRV可以建立持续感染和隐藏在急性感染后的三叉神经节内。因此，迫切需要发展更为敏感和方便的方法来识别和清除潜在的PRV。除疫苗接种外，净化PR必须与包括病毒学、血清学监测、严格的生物安全程序的综合措施一起进行。与此同时，国家对PR的广泛深入的监视是必要的。这要求新的快速鉴别与监测方法。考虑到当前新变PRV在中国猪群中PR感染日益恶化的局势，一个重要的任务就是发展更为敏感和方便的方法识别潜在的PRV。此外关于病毒在猪以外的其他动物上的流行病学的知道的很少。应进一步研究PRV在这些动物身上的实际感染情况，尤其是野生动物。我们也应该学习、了解更多已经消灭病毒的其他国家的经验。虽然国家控制动物疾病[128]的中长期计划育种计划中已将PR列为优先控制并净化的疾病。但在全民范围内推广该计划实际实施或者执行，可能存在不足。如养殖户的积极性和认识等因素会影响净化和防控效果。我国PR净化仍然任重道远。13 试验一河南省部分地区猪场PR野毒感染情况描述性分析我省是养猪大省，养猪业是我国农业的重要组成部分。然而猪群疫病问题一直是养猪业发展的主要瓶颈。这种情况伴随着养殖质量不同的现代化、规模化、集约化养猪和农户养猪的现象使得猪群疫病更为复杂，影响也越来越大，其中猪伪狂犬病就是例子。虽然近年来基因缺失疫苗的广泛应用和诊断技术的不断完善，猪伪狂犬病得到一定的控制。但猪群受其他疾病的干扰、养殖环境的不断变化、疫苗质量的层次不齐等因素的影响，部分猪场常常发生伪狂犬病，给养殖户带来严重经济损失。据报道近三年来仅在我国河南、湖北等地就继续发生和流行，个别省份较为严重，不同省份猪场发病率较高，损失严重。然而，河南省猪群中伪狂犬病流行状况如何不甚清楚，探明河南省该病的最近的流行病学本底对于疾病的控制具有实际意义。为此对河南地区2015年PR的流行情况进行全面的调查，阐明2015年间PR在我省的流行情况，为风险因素分析提供依据，也为制定科学的防治方案，降低PR对养猪业造成的经济损失提供参考性资料。1材料与方法1.1材料1.1.1待检血清2015年1月至2015年12月送检于河南农业大学动物疫病检测诊断中心的河南地区337个猪场的共计3711份血清，包括豫东地区的39个猪场、豫西地区的35个猪场、豫南地区的70个猪场、豫北地区的152个猪场、豫中地区的42个猪场；小规模猪场（基础母猪群＜200头）197个、中等规模猪场（200头≤基础母猪群＜500头）66个、大规模化猪场（基础母猪群≥500头）74个；其中母猪血清3226份、公猪血清161份、商品猪血清324份。1.1.2病料来源2015年1月至12月送检于河南农业大学动物疫病检测诊断中心的河南地区64个疑似发病猪场的127份病料样品，采集部位主要是发病猪的脑、三叉神经、扁桃体、淋巴结、脾脏和肺脏。1.1.3器材YXJ-2台式高速离心机（国华仪器）；96孔酶标检测仪（BioRadModel680）；不同量程的微量移液器、超净台、组织捣碎机、PCR仪、高速冷冻离心机均为Thermo公司产品；AlphaInnotech凝胶成像仪是美国Alpha公司产品；DYC3113型电泳槽由北京六一仪器厂生产。1.1.4试剂PRVgE抗体检测诊断试剂盒购自于美国IDEXX公司（特异性98%、敏感性99.8%）；组织裂解液、蛋白酶K、Tris平衡酚购自北京索莱宝科技有限公司；2×TaqMasterMixPlus购自Vazyme公司；BM2000DNAMarker购自北京Biomed公司；EB荧光染色剂、琼脂糖购自天根生化科技(北京)有限公司，异戊醇、氯仿、无水乙醇等试剂均为国产分析纯产品。14 琼脂糖凝胶电泳缓冲液100mL20×TBE，1900mL蒸馏水混匀配制而成1%琼脂糖凝胶100mL0.5×TBE凝胶电泳缓冲液加入lg琼脂糖，微波热加热溶解，加入5-10µL核酸凝胶电泳荧光染料（EB）。1.2方法1.2.1血清学检测采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测待检血清中的PRVgE抗体，所有试剂在使用前一律恢复至18-26℃，试剂应该旋转或颠倒混匀。具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行如下：1、分别将100ul样品稀释液加入每个检测孔和对照孔。2、分别将100ul的阳性对照和阴性对照加入相应的对照孔中，注意不同的对照的吸头要更换。3、分别将100ul的被检样品稀释液加入到剩下的检测孔中，注意不同的对照的吸头要更换。4轻弹微量反应板或用振荡器震荡，将反应反应板中的溶液混匀。5、在18-26℃孵育60min（±4min）或过夜孵育（16-20h）。无论选择哪种孵育方式，都要将微量反应板用封条或于温箱中室温孵育，避免液体挥发。6、用300ul左右的洗涤液洗涤每个板孔3-5次。每次洗涤后，甩去每个板中的液体，在最后一次甩掉后，在洗水材料上用力扣板，吸去剩余的液体。在加入下一个试剂前，避免孔壁变干。7、在每孔中加入100ul酶标抗体，用封条封闭反应板或置于湿盒中在18-26℃下孵育30min8、重复步棸69、每个反应板中加入100ul的底物溶液N.12,并于避光18-26℃条件下放置10min(加完第一孔即可计时)。10、在第十分钟时每个反应板中加入100ul的终止液N.3终止反应，加终止液的步棸同步棸9，与底物加入的顺序相同。11、在450nm处测定样本以及对照的吸光度值，也可用双波长（450nm或650nm）测定样本以及对照的吸光度值，空气调零。12、计算样本和对照的平均吸光度值。结果判定方法如下：阴性对照的平均值A（630nm）减去阳性对照的平均值A（630nm）必须大于或等于0.300，试验方能有效。如果试验无效，试验操作可能有误，试验应重做，并应详细阅读说明书。首先通过计算每个样品的S/N值，判定其gE抗体的有无。（1）如果S/N值低于或者等于0.60，样品应判为PRVgE抗体阳性。（2）如果S/N值大于0.60但小于或者等于0.70，样品应重测。如果试验结果不变，间15 隔一定时间后重新采样、检测。（3）如果S/N值大于0.70，样品判为PRVgE抗体阴性。2结果2.1河南省2015年猪群PR野毒抗体结果2.1.1各地区猪场PRV野毒感染情况从表1-3及图1-1可知，337个猪场中有292个为阳性场，群阳性率为86.64%（95%CI82.5,90.1），个体水平的血清学阳性率为60.03%(95%CI58.7,61.9)。河南省五个地区（豫东、豫西、豫南、豫北、豫中）猪场PR野毒群体阳性率分别为82.05%(95%CI66.5,92.5)、80.00%(95%CI63.1,91.6)、80.00%(95%CI68.7,88.6)、91.44%(95%CI85.8,95.4)、88.10%95%CI74.4,96)，个体水平的血清学阳性率分别为57.14%(95%CI51.5,62.7)、59.70%(95%CI50.9,59.7)、51.53%(95%CI49.4,56.5)、61.46%(95%CI59.1,63.8)、77.94%(95%CI75.5,83.9)，上述结果显示河南各地区猪群在群体和个体水平上的PRV野毒感染情况。可见不同地区猪群的PR感染情况有差异，其中豫北地区、豫中地区的猪场阳性率最高，相应的区域内血清阳性率也最严重，这与豫北地区、豫中地区的养殖密度较大有很大关系。这些事实不但说明在整体上我省PR具有很高的感染率，PR疫情严重，也反映了防控PR的措施并不是很理想成功，简言之，防控策略存在较大漏洞。16 表1-3河南省部分地区不同地区猪场PRV猪场野毒感染情况Table1-3ThedetectableresultofPRwildvirusantibodyofdifferentregionsinpartsofHenanprovince检测猪场检测样品DetectedpigfarmsDetectedsamples地区样品数/猪场/个阳性场/个阳性率/%阳性数/份阳性率/%Area份PigfarmPositivePositivePositivePostiveSamplenumbernumberratenumberratenumber豫东82.05(95%CI57.14(95%CIEastern393231518066.5,92.5)51.5,62.7)Henan豫西80.00(95%CI59.70(95%CIWestern352851528563.1,91.6)50.9,59.7)Henan豫南80.00(95%CI51.53(95%CISouth705678941868.7,88.6)49.4,56.5)Henan豫北91.44(95%CI61.46(95%CINorth1521391718105685.8,95.4)59.1,63.8)Henan豫中88.10(95%CI77.94(95%CICentral423737429974.4,96)75.5,83.9)Henan总计86.64(95%CI60.3(95%CI33729237112238Total82.5,90.1)58.7,61.9)图1-1河南省部分地区不同地区猪场PRV猪场野毒感染情况Figure1-1.ThedetectableresultofPRwildvirusantibodyofdifferentregionsinpartsofHenanprovince17 2.2.2不同规模猪场PRV野毒感染情况从表1-4可知，小规模猪场（母猪《100头）、中等规模猪场(100头<母猪3500头)和大规模猪场（母猪》300头）猪场阳性率分别为85.45%（95%CI79.5,89.9）、90.90%（95%CI81.3,96.6）和87.10%（95%CI76.5,93.3）。个体水平上的血清学阳性率分别为65.77%(95%CI63.2,68.3)、61.30%(95%CI58.0,64.6)。研究结果显示各种规模猪场的PR野毒感染阳性率均较高。PR阳性率高暗示疫情严重，同样也表明当前的防控措施并不成功。表1-4不同规模猪场PRV野毒感染情况Table1-4ThedetectableresultofPRwildvirusinfectionofdifferentscales检测猪场检测样品DetectedpigfarmsDetectedsamples猪场规模猪场/个阳性场/样品数/阳性数/Different阳性率/%阳性率/%Pig个份份scalePositivePostivefarmPositiveSamplePositiverateratenumbernumbernumbernumber小规模19716885.45%（95%CI135589165.77%(95%CISmall-scale79.5,89.9）63.2,68.3)中等规模666090.90%（95%CI87953961.30%(95%CIMedium-scale81.3,96.6）58.0,64.6)大规模746487.10%（95%CI147780854.71%Large-scale76.5,93.3）总计33729286.64%(95%CI3711223860.3%(95%CITotal82.5,90.1)58.7,61.9)图1-2河南省部分地区不同规模猪场PRV野毒感染情况Figure1-2.ThedetectableresultofPRwildvirusinfectionofdifferentscale18 2.2.3不同猪群PRV野毒感染情况从表1-5可知，3711血清样品的总阳性率为60.3%(95%CI58.7,61.9)。其中母猪、公猪和商品猪的个体水平上的阳性率分别为60.0%（95%CI58.3,61.7）、72.6%(95%CI65.4,78.6)、57.09%(95%CI52.0,62.2)。由调查结果可知，不同猪群均存在PRV野毒感染情况，疫情严重，呈流行态势。表1-5不同阶段猪群PRV野毒血清感染情况Table1-5ThedetectableresultofswinePRVvirusseruminfection各阶段的猪样品总数/个阳性数/个阳性率/％DifferentstagesPigfarmsnumberPositivefarmsnumberPositiverate母猪3145188760.095%CI58.3,61.7）Sows公猪18813672.6(95%CI65.4,78.6)Boars商品猪37821657.09(95%CI52.0,62.2)Commericalpigs总计3711223860.3(95%CI58.7,61.9)Total图1-3河南省部分地区不同阶段猪群PRV野毒血清感染情况Figure1-3.ThedetectableresultofswinePRVvirusseruminfectionofHenanProvince2.2.4不同季节猪群PRV野毒感染情况从表1-6可知，不同月份猪群PRV野毒感染情况有差异。其中1-3月份、4-6月份、7-919 月份、10-12月份个体水平的血清阳性率53.27%(95%CI50.0,56.6)、68.1%(95%CI64.8,71.4)、63.5%(95%CI60.4,66.5)、46.7%(95%CI43.7,49.8)；猪群阳性率分别是91.89%(95%CI83.2,97)、89.13%(95%CI80.7,94.6)、86.3%(95%CI77.5,92.4)、75.94%(95%CI64.6,84.7)。表1-6河南省部分地区不同月份猪群PRV野毒血清感染情况Table1-6ThedetectableresultofPRwildvirusantibodyofdifferenttimeinpartsofHenanprovinceProvince检测样品检测猪场DetectedsamplesDetectedpigfarms地区样品数/阳性数/阳性场/阳性率/%猪场/个阳性率/%Area份份个PostivePigfarmPositiveSamplePositivePositiveratenumberratenumbernumbernumber1-3月89147553.27(95%CI746891.89(95%CIFromJan.50.0,56.6)83.2,97)toMar.4-6月78253368.1(95%CI918189.13(95%CIFromApr.64.8,71.4)80.7,94.6)toJun.7-9月100063563.5(95%CI948186.3(95%CIFromJul.60.4,66.5)77.5,92.4)toAug.10-12月103848546.7(95%CI785975.94(95%CIFromOct.43.7,49.8)64.6,84.7)toDec.总计3711223860.3(95%CI33729286.64(95%CITotal58.7,61.9)82.5,90.1)3讨论3.1河南省规模化猪场猪群感染PRV野毒感染形式依然严重本研究通过对河南省2015年1月-12月337个猪场送检的3711份血清样品进行PRVgE野毒抗体检测，发现其中292个为PRV野毒阳性场，猪场总阳性率为86.64%；其中2238份血清样品为阳性，血清总阳性率为60.3%，调查结果显示河南省猪群感染PRV野毒情况依然较为严重。由于检测的血清多为发病场送检的样品，样本量的选择受到一定的影响，所得检测结果未能全面反映PRV野毒感染的真实情况，实际猪场阳性率和血清阳性率应低于本实验所获数据。[130]党占国等于2012-2015年对河南省规模化猪场进行PRV野毒抗体检测，发现猪场阳性率在这四年中不断升高,2015年1月-8月河南省血清阳性率为70.24%（347/464）；常洪[131]涛等于2011年1月至2013年5月统计的河南省部分地区PRVgE抗体血清阳性率38.47%（6463/16800）,猪场阳性率为68.06%（603/886）。本研究结果显示的猪场阳性率及血清阳20 性率均明显高于以上研究。[132]解伟涛等利用gE-ELISA方法,对2013年来自河南省不同区域不同规模347个猪场的13275份血清样本进行检测，结果显示阳性猪场占83.6%（290/347），与本研究的结果相仿；但其统计的血清样本PRVgE野毒抗体阳性率31.3%（4150/13275）低于本研究血清总阳性率60.3%的结果，结果的差异可能是由于采样的区域分布、时间分布等因素有关，但数据分析表明近几年我省的猪场PR感染情况严重。3.2不同地区PRV野毒感染差异较大。本研究结果显示2015年豫东、豫西、豫南、豫北、豫中五个地区的猪场阳性率分别为81.25%、79.31%、82.75%、85.71%、82.25%，血清阳性率分别为71.08%、59.70%、51.53%、55.21%、77.94%，豫北猪场阳性率最高为85.71%，豫西猪场阳性率最低为79.31%，豫中地区的血清阳性率最高为77.94%；豫南地区的血清阳性率最低为51.53%，猪场阳性率和血清阳性率存在一定差异，这可能与不同地区不同猪场的饲养方式、管理水平、猪群健康状态、生物安全措施等有较大关系。相对来说，豫北地区、豫中地区养殖相对集中、猪场多为小规模场，豫南、豫西地区养殖密度不是太密度、养殖环境相对较好。由实验调查数据可知，豫北地区、豫中地区在PR的防控方面需要面临较大的压力，需要引起足够重视。3.3不同规模猪场PRV野毒感染严重，其中小规模血清阳性率最高本研究结果显示河南省2015年送检的小规模、中等规模和大规模的阳性率分别为猪场阳性率分别为85.45%、90.90%和87.10%。血清阳性率分别为65.77%、61.30%、50.00%，猪场阳性率均在85%以上，感染相当严重，猪场阳性率中等规模场最高为90.90%，提示中等规模的猪场PRV的感染压力较大，均高于小规模猪场和大规模猪场，另一方面这可能与送检的血清样本有关，中等规模猪场多是发病后来检测，而大规模猪场多是常规检测有关。血清阳性率是小规模猪场阳性率最高、大规模猪场最低，这与大规模化猪场的生物安全措施、猪群基础免疫、饲养管理相对完善有关。3.4各阶段猪群PRV野毒感染阳性率不同，公猪PRV野毒阳性率最高本研究结果显示各同阶段猪群PRV野毒感染严重且有一定差异，其中母猪、公猪、商品猪的血清样品阳性率分别为60.0%、72.6%、57.09%。公猪阳性率最高为72.7%，提示公猪带毒现象十分普遍，应引起养猪场高度警惕，随着人工授精技术的不断应用，公猪的影响力也在不断加大，一旦发现公猪PRV野毒阳性应立刻淘汰，避免通过公猪精液垂直传播；母猪阳性率仅次于公猪，这与公猪有很大关系，对于PRV野毒阳性母猪应尽可能减少与其他阴性猪的接触或予以淘汰处理，因为感染的母猪就是一个PRV传染源。后备猪的阳性率为57.09%，PRV野毒抗体阳性后备猪是不能作种用的，随着养殖规模的不段扩大，这显然对猪场的PR净化和控制工作是不利的；阳性种猪场务必采取针对性措施，自行培育出阴性后备猪。21 3.5当前河南省PR感染严重，应采取有效措施加以防控本研究调查数据显示当前河南省PR感染严重，防控形势严峻，务必采取综合措施。严格执行常规免疫、定期检测、隔离病猪、淘汰阳性种猪的各个过程。尤其是对阳性公猪予以淘汰处理；此外加强饲养管理，做好生物安全措施，做好重要疫病(猪瘟、猪繁殖障碍和呼吸综合征、猪圆环病毒病等)的免疫接种工作，确保PR得到有效的防控。22 试验二河南省部分地区2015年猪场PRV野毒株gE基因进化分析摘要:为了解河南部分地区2011年以来猪伪狂犬病毒(PRV)流行株的现状、分子生物学特征和遗传演化规律，木试验收集了河南部分地区的9株PRV分离株，并对其gE基因进行遗传变异分析。结果表明:9株PRV分离株的gE基因与其他参考毒株相应序列具有相对严格的保守性，这些毒株之间的核葺酸之间和与其他参考株核苷酸序列同源性分别为99.7%-100%和99.1%-99.9%。氨基酸多序列比对发现，9株PRV分离株氨基酸同源性达到100%，与参考株氨基酸同源性在98.1%-99.6%，在1个位点发生了独特性的氨基酸突变，即第2位氨基酸(同ZM-（Henan2013）和Yangshan(Korea-1996)株)由K突变为F，这是国内首次报道gE基因在该位置发生氨基酸突变的毒株。这些新的氨基酸突变与PRV致病性及其与生物学特性的关系有待进一步研究。关键词:猪伪狂犬病毒;gE基因;突变伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus,PRV)引起的家畜和多种野生动物的一种急性传染病，临床上以新生仔猪的腹泻及神经症状，妊娠母猪繁殖障碍、流产、死胎及呼吸[133]道症状，成年猪隐性感染，长期带毒排毒为特征。PRV属于疤疹病毒科、a-疱疹病毒亚科，基因组为双链DNA，全长约150kb，基因组UC:含量最高达7300，至少含有70个基[134]因，编码约100种蛋白质。成熟PRV由四部分构成:病毒囊膜(envelope)、衣壳(capid)、[135]间质(tegument)以及与核蛋白相结合的基因组DNA。[136]我国自1947年首次从猫体分离到PRV以来，己有20多个省市报道发生了该病。在[137]生产实践中，PR在的流行范围很广，给养猪业带来很大挑战。猪是伪狂犬病病毒的自然宿主，该病对养猪业危害极大，可导致妊娠母猪流产、死胎及产木乃伊胎；初生仔猪出现[138-139]运动失调、麻痹、衰竭、死亡等典型症状，发病仔猪的病死率可高达100%。[140]对于PRV的防控，各国采取了针对性策略，PR根除计划实施的近二十年来，活疫苗应用最为广泛，2011年底，我国大面积发了猪伪狂犬病疫情，导致大量的妊娠母猪发生[141-145]流产、死胎、产木乃伊胎，新生仔猪大量死亡，给养殖户造成了巨大的经济损失。疫苗研制通常选用是缺失TK、gE、gC或gG的毒株，因为这些基因是PRV的非必需基因，同时又是重要的毒力基因，这些基因的缺失既不影响PRV的免疫力，又能显著降低病毒毒力和减少排毒。如gE蛋白的氨基酸序列中第125位的撷氨酸和第126位的半肤氨酸对病毒的生物学功能有重要的影响。缺失它们能降低病毒的毒力嗜神经性，但不影响免疫原,并且[146]产生的弱毒株相对于缺失整个gE株来说产生的病毒蚀斑更小，对鼠的毒力更低。gE基因是PRV的一个主要毒力基因，也是世界动物卫生组织所规定基因缺失疫苗的缺失基因[147]。随着PRVBartha-K61基因缺失疫苗株在我国的广泛应用，PR得到了有效的的控制。但23 继2011年底我国大面积暴发PR流行之后，我国多省份按照正常程序接种过PRVBartha-K61疫苗的规模化猪场继续有猪伪狂犬病的发生和流行，并且感染情况呈逐渐严重的趋势，主要表现为猪群gE抗体阳性率显著升高，发病母猪群妊娠中、后期流产、仔猪神经症状和高死亡率等典型伪狂犬病症状。已有研究表明，与以前的流行株相比，新流行株的抗原性已发生[148-152]变异，同时在不同地区分离出了PRV变异株。本研究通过对河南部分地区PRV野毒阳性猪场的阳性病料进行gE基因扩增、克隆和遗传进化分析，与国内外参考毒株的核苷酸及推导氨基酸序列进行比较，构建遗传进化树，推测流行毒株的来源及亲缘关系，为猪伪狂犬病的防控提供理论指导。1材料与方法1.1材料1.1.1病料来源病料从2015年间不同猪场送检的病料中选取PRV野毒病原检测为阳性的病料9份，分别来自6个不同地区（濮阳、信阳、驻马店、南阳、周口、安阳），采集部位主要是发病猪的脑、三叉神经、扁桃体、淋巴结、脾脏和肺脏。1.1.2器材YXJ-2台式高速离心机（国华仪器）；96孔酶标检测仪（BioRadModel680）；超净台、组织捣碎机、PCR仪、高速冷冻离心机均为Thermo公司产品；AlphaInnotech凝胶成像仪是美国Alpha公司产品；DYC3113型电泳槽由北京六一仪器厂生产。1.1.3试剂PRVgE抗体检测诊断试剂盒购自于美国IDEXX公司；组织裂解液、蛋白酶K、Tris平衡酚购自北京索莱宝科技有限公司；2×TaqMasterMixPlus购自Vazyme公司；BM2000DNAMarker购自北京Biomed公司；EB荧光染色剂、琼脂糖购自天根生化科技(北京)有限公司，异戊醇、氯仿、无水乙醇等试剂均为国产分析纯产品。琼脂糖凝胶电泳缓冲液100mL20×TBE，1900mL蒸馏水混匀配制而成1%琼脂糖凝胶100mL0.5×TBE凝胶电泳缓冲液加入lg琼脂糖，微波热加热溶解，加入5-10µL核酸凝胶电泳荧光染料（EB）。1.2方法1.2.1引物设计及合成[153]参考余秋颖等用于疑似病料中PRVgE基因检测的引物gE-F/gE-R，其中的参考序列为Kaplan全基因序列（GenBank登录号JQ809328），引物序列见表1-1，由上海生工生物工程有限公司合成。24 表1-1PCR引物Table1-1PrimersforPCR引物引物序列(5’-3’)目的基因产物长度参考文献PrimerSequence(5’-3’)TargetedgeneLengthofproductgE-FTTGGATCCCTTTCCGCCGAGACGACCCgE802bp[153]gE-RCGGAAGCTTCGCGGGTGGTAGATGCAG1.2.2病料总DNA提取按照常规酚/氯仿抽提法进行，具体步骤如下：在无菌操作台上用剪刀剪去病料组织的脂肪、肌腱，按1：5加入PBS液，用研磨器无菌研磨，反复冻融2~3次，然后4℃12000rpm/min离心5min。（1）取病料上清350µL，加入等量预热的组织裂解液，再加15µL蛋白酶K（至终浓度为100mg/µL），混匀，56℃水浴2h。（2）加入700µLTris平衡酚，上下颠倒5~10min，4℃12000rpm/min离心10min。（3）取上清700µL，重复步骤（2）一次。（4）取上清700µL，加入350µLTris平衡酚，再加入350µL氯仿异戊醇（24：1），上下混匀5-10min，然后4℃12000rpm/min离心10min。（5）重复步骤（4）一遍，重复时取上清。（6）取上清700µL，加入氯仿异戊醇（24：1）700µL，上下混匀5-10min，然后4℃12000rpm/min离心10min。（7）取上清700µL，加入700µL氯仿，上下混匀5-10min，然后4℃12000rpm/min离心10min。（8）取上清约400µL加2.5倍体积（1000µL）的预冷的无水乙醇，加1/10体积（40µL）的NaAC（3mol/L），混匀，-20℃保存2h。（9）4℃12000rpm/min离心30min。（10）弃上清，加1000µL预冷的75%乙醇，4℃离心12000rpm/min离心10min。（11）重复步骤（10），弃上清，12000rpm/min瞬时离心，自然干燥后，加40µL-20℃保存的1×TE（PH7.5）缓冲液，溶解20min，-20℃保存。同时取阳性病毒液做阳性对照，取蒸馏水做阴性对照。1.2.3PCR扩增25 PCR体系为50µL，反应体系如表1-2：表1-2PCR反应体系Table1-2ComponentsofPCRsystemComponentVolumeDNA5μl2xGCBufferI25gE-F1(10µM)1.25μlgE-R1(10µM)1.25μlAddddH2Oupto50μlPCR扩增条件：95℃5min95℃30s67℃30s32cycles72℃45s72℃10min1.2.4琼脂糖凝胶电泳取PCR产物5µL于1%的TAE琼脂糖凝胶中跑电泳，在紫外凝胶成像系统中鉴定、拍照。1.2.5目的片段的胶回收将50µLPCR产物进行琼脂糖电泳。1.2.6产物的克隆及测序PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段连接至pMD18-T载体，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，经筛选后挑取单个菌落进行PCR鉴定，并将阳性菌液送上海生工生物有限公司测序，每个样本进行两次重复。1.2.7gE基因序列的比对及遗传进化分析用DNAMAN中的MegAlign对所克隆gE基因与参考毒株（见表2-3）的gE基因序列进行比对及同源性分析，同时绘制进化树。26 表2-3用于序列比对毒株和遗传进化分析的PRV参考毒株Table2-3PRVreferencestrainsforsequencealignmentandanalysisofgeneticevolution毒株(Isolates)登录号(Accessionnumber)分离地及时间(Originanddate)BeckerJF797219USA,1967YangsanAY249861Korea,1996LAAY173124Shandong,2002P-PrVFJ176390Malaysia,2008Guizhou-DYJX417716Guizhou,2012NYKF130883Henan,2012HB-BDKC415026Hebei,2012HB-HDKC415027Hebei,2013JYKF017615Henan,2013CLW2014-1KM079613Hebei,2014SCKM676290Shanghai,2015LxB6GQ926932Haerbin,2009KF017332Henan,2013QXYZMKF130881Henan,2013P-prvFJ176390Malaysia,2008Guizhou-DYJX417716Guizhou,20122结果2.1核苷酸序列分析2.1.1gE基因序列的PCR扩增用gE-F/gE-R引物对选取的9份PRV阳性病料的总DNA进行PCR扩增，均扩增出802bp左右的特异性条带，如图2-1，与预期结果一致。27 图2-1gE802bpPCR检测电泳图Fig.2-1PCRamplificationofgE802bpgeneM:BM2000DNAMarker；1:阳性对照（PRV病毒液）2：阴性对照；3-10:8份PRV野毒为阳性的样品LaneM:BM2000DNAMarker,Line1:thepositivecontrol(PRV),Line2thenativecontrol3-10:eightPRwildviruspositivesamples2.1.2gE基因序列分析gE基因全长1787bp，包含1740bp的ORF，编码579个氨基酸，所测9株PRV河南省毒株为部分gE基因，长均为802bp，这些分离毒株之间的核苷酸之间和与其他参考株核苷酸序列同源性分别为99.7%-100%和99.1%-99.9%。核苷酸序列比较在第四位均有碱基T的插入。图2-2河南流行毒株与参考毒株的核苷酸序列比对Fig2-2.comparisonofnucleotidesequenceofepidemicstrainandreferencestraininHenan28 29 30 31 32 图2-3河南流行毒株与参考毒株的核苷酸序列比对Fig2-3.comparisonofnucleotidesequenceofepidemicstrainandreferencestraininHenan2.1.3gE基因的遗传进化分析gE基因核苷酸序列的遗传进化分析显示，9份样品中扩增的gE基因与Yangshan株位于同一进化分支上，且与13年分离的参考株ZM河南分离株高度同源,其中H-GY和H-AY又位于同一独立小分支，与国内分离株HB/HD、Guizhou-DY、NY、JY位于同一大分支上，亲缘性较近。所有中国分离株与马来西亚P-PRV株又处于同一大分支上，形成一个亚洲毒株进化群。但与ZGHN、ZGGZ、HNJZ位于不同的分支上，亲缘性较远。33 图2-49株分离株和参考毒株gE基因核苷酸序列的遗传进化分析Fig2-4.GeneticevolutionanalysisofgEgeneof9isolatesandreferencestrain2.2氨基酸序列分析2.2.1gE氨基酸序列分析通过在NCBI上进行序列结果比对，数据显示9个序列均为PRV的gE基因，gE基因全长1787bp，包含1740bp的ORF，编码579个氨基酸，实验截取部分基因，基因长度为802bp左右。氨基酸多序列比对发现，分离株与参考株的氨基酸序列比较差异不大，9株PRV分离株氨基酸同源性达到100%，与参考株氨基酸同源性在98.1%-99.6%。分离株氨基酸在第二位突变为氨基酸F，与ZM（Henna-2013）株和Yangshan(Korea-1996株)高度一致。34 图2-5河南流行毒株与参考毒株的氨基酸序列比对Fig2-5.comparisonoftheaminoacidsequencesoftheepidemicstrainsandthereferencestrainsinHenan35 图2-6河南流行毒株与参考毒株的氨基酸序列比对Fig2-6.comparisonoftheaminoacidsequencesoftheepidemicstrainsandthereferencestrainsinHenan36 2.2.2gE氨基酸进化树分析图2-79株分离株和参考毒株gE基因氨基酸序列的遗传进化分析Fig2-7Geneticevolutionanalysisoftheaminoacidsequencesof9isolatesandreferencestrainsofgEgenegE基因氨基酸遗传进化分析显示，9份样品中扩增的gE基因与Yangshan株和ZM位于同一进化分支上，且高度同源,与国内分离株HB/HD、Guizhou-DY、NY、JY位于同一大分支上，亲缘性较近。所有中国分离株与马来西亚P-PRV株、Becker株、ZGGZ株、ZGHN株、HNJZ位于不同的分支上，亲缘性较远。3讨论PR是对养猪业危害巨大的传染病之一，曾于本世纪初在中国大面积暴发疫情，给养猪业造成巨大的经济损失，近年来随着基因工程缺失疫苗广泛投入使用，野毒感染监测技术的不断完善，使得PRV的感染率和危害在随后很长一段时间内显著降低。但2011年底PR在我国多数省份暴发流行，2012年～2015年在全国多省份按照正常程序接种过疫苗的规模化猪场继续发生和流行，并且野毒感染呈逐渐严重的趋势。PRV野毒感染率的大幅度提高，首先应考虑病毒的主要毒力基因是否发生变异。gE蛋白属于典型的Ⅰ型跨膜蛋白，是PRV的主要毒力因子，可促进细胞融合，在介导细胞的感染融合、病毒在细胞间的扩散、病毒粒子的释放及病毒的嗜神经性等方面发挥着重要作用。如Knitas等于1995年报道PRV的gE缺失株不能侵入猪神经系统的第二级神经细胞，不能37 侵入第三级神经细胞。笔者通过对9份病料流行野毒的PRVgE基因的遗传进化分析也表明河南省当前流行的野毒株与参考毒株的核苷酸同源性很高，推导的氨基酸序列发生变异的区域相对较少。仅有第二位氨基酸的变异，表明其毒力未出现明显变异。但PRV的毒力由多种基因协同控制，因此针对其他毒力基因的研究仍需进一步开展。38 试验三中国猪伪狂犬病毒的流行病学分析近年来我国的生猪存出栏数及猪肉产量稳居世界第一，成为世界第一养猪大国，然而猪群疫病问题一直困扰着我国养猪业的发展。其中，猪伪狂犬病就是威胁养猪业的一个重要因[329]素，PR的发生和流行也使猪病更加复杂化。伪狂犬病毒感染猪的主要临床症状是引起妊娠早期母猪流产、产死胎和木乃伊胎；哺乳仔猪感染后可引起神经症状，最终死亡，死亡率几乎高达100%。我国最早是1947年刘永纯从猫体内分离到PRV，随后陆续有该病零星发生的报道。继2011年伪狂犬病在华北地区再度流行之后，近四、五年来在河南、湖北、江西、江苏等地继续发生和流行，造成大量妊娠母猪流产、死胎等繁殖障碍以及新生仔猪的大量死亡，给我国养猪业造成巨大损失。目前，PR的防控难题主要存在以下几个方面。第一方面，当前对PRV致病机理的研究尚不够深入，缺乏更进一步的认识。第二方面，全长基因组信息的欠缺，PRV基因组GC含量高达73%，其中gE基因是PRV的一种糖蛋白基因，位于US8区，G+C含量为75%，有98%的gE基因密码子的第二位是G或C，这也是gE基因组扩增极其困难的原因。第四方面，疫苗质量、猪群免疫力等问题导致的疫苗免疫失败。最后，遗传变异因素导致其病毒毒力增强。在本研究中，我们对我国2005年-2015年近十一年的猪伪狂犬血清流行性学进行统计汇总及gE基因变异情况研究，并进行文献汇总数据分析，确定在中国不同地区的猪种群猪伪狂犬的的发病情况及gE基因的进化分析，为猪伪狂犬病的有效防控提供指导。1材料与方法1.1材料1.1.1血清数据检索在NCBI数据库和中国知网、万方数据库中检索中、英文出版的2005年至2015年，关于猪伪狂犬病血清学流行病学研究的文章。中文文献的检索是基于关键词“猪伪狂犬病”，“血清”，“基因”“PRV”“gE”而搜索NCBI数据库中的文献时附加词“中国”。所得的文章被检测多于十份用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定的样品。选定的文章的参考文献列表进行进一步筛选，以确保所有相关的研究纳入。对收集的猪伪狂犬病毒的血清样品检测结果（测试数目和阳性数）进行记录。1.1.2基因进化数据检索猪伪狂犬病毒野毒感染数据，随着时间、地理位置进行分组、全面展示近十年来猪伪狂犬病毒的野毒感染情况。在NCBI搜索过去10年在中国获得的猪伪狂犬病毒gE全基因的进化信息并对其进行系统发育分析。1.2方法1.2.1数据分析选定的研究是根据地理位置和样品的采集时间及血清学数据分组进行多层次的逻辑回39 归使用SAS9.1版软件分析。对于遗传序列运用DNASTAR等相关软件分析1.2.2血清数据搜集2005年-2015年间发表在中国知网上关于PR野毒血清阳性率的调查文献，其中215篇论文被鉴定为中国猪伪狂犬病的血清学研究、流行病学研究的文章，初步筛选177篇[154-330]具有有效数据的论文，样本量的研究范围从41到13275个样品共272144份血清。血清学数据主要包含三个直辖市和中国大陆的15个省。各市/省进一步分组成六个行政区域（东北、华北、华东中国、中国南方、中国中部和西北部）。各地区的血清抗体阳性情况如下各表。1.2.3gE全基因进化数据近十年GenBank数据库里有关PRV全基因组的序列信息很少本研究在NCBI上搜索获得225株gE基因相关信息，通过进一步筛选选出76株具有代表性的gE基因信息，运用DNASTAR等相关软件分析对76株gE基因进行进化分析。其中Yangsan株，Becker株，Ea株，P-PrV株为参照毒株外，其他均为我国流行野毒的gE基因序列。表3-1用于序列比对毒株和遗传进化分析的PRV参考毒株Table3-1PRVisolatesusedforsequencealignmentandphylogeneticanalysis毒株登录号分离地及时间(Isolates)(Accessionnumber)(Originanddate)YangsanAY249861SouthKorea2003BeckerAY368490USA2003EaAF171937China1999JZKP318115China2014WZKR119070China2014BPKP318116China2012WYKF130884China2013YYKF130885China2013LXB6GQ926932China2010HNJZEU561349China2008SHAF207700China199900V72FJ605132Belgium2000BJ/BDKF017275China2013XiangAKJ463839China2014HB-HDKC415027China2013Guizhou-DYJX417716China2012JYKF017615China2013QXXKF017332China2013QXYKF017331China2013SCKM676290China2015xccgKF360836China2013P-PrVFJ176390Malaysia,2008GDSHEF552427China2007ZKKF130886China201240 NYKF130883China2012LGXKF042384China2012ZMD-1KF360834China2012HeNLY2KR909128China2013AHBZKF360829China2012HNQXKF010502China2012QXXFO17332China2013QBAKF017333China2013KaplanJF797218.1Germany1959SMXKM523549China2014GYKF042383China2012ZJNBKF010504China2012HNXXKF010501China2012MZ1KF130881China2012QXXKF017332China2013ZMKF130887China2013XCCGKF360836China2012PK-15KT329439China2012SXJCKF360832China2011SDHZ2012KF360831China2012HBCX2013KF360830China2013CLW2014-1KM079613China201420130620KF311112China2013GD-FSKT936476China2014HN-HKKT936475China2008HN-DZKT936474China2014GD-JMKT936473China2015GD-QYKT936472China2010GD-YFKT936470China2015GX-NLKT936469China2007GX-GLKT936471China2013GDWHKT936468China2015TaiAnSD2013KM983048China2013HN-CZKT936465China2013HJ-ZZKT936464China2010HuNXT2012KF010503China2012HNQX2012KF010502China2012HNHB2012KF010500China20121AY173125SChina2011GD-1-2013KR051962China2013HeNXY-2014KR909113China2014GD-HZKJ634681China2014GD-1-2013KR051962China2013GD-GZ2KT936467China201341 MZ2KF130882China2012M5KF130880China2012NYKF130883China20122结果2.1我国各地区2005年-2015年规模化猪场PR野毒抗体分析2.1.1我国不同地区猪场PRV野毒血清学情况从表3-2及图3-1可知，3732个猪场中有2189个阳性场，猪群阳性率为58.65%；共有272144份血清，其中79754份阳性，个体血清阳性率为29.31%。从11年的猪场阳性率、血清阳性率变化可以看出，在2012年之后我国猪伪狂犬的感染情况不断加重，并且呈每年上升趋势。这可能与12年我国大量从国外引种有一定的关系，并且来随着我国养殖业的不断发展，猪病越来越复杂，混合感染情况加剧。表3-2中国部分地区2005年-2015年PRV猪场野毒感染情况Table3-2ThedetectableresultofPRwildvirusantibodyin2005-2015ofdifferentregionsinpartsofChina检测样品检测猪场DetectedsamplesDetectedpigfarms地区样品数/份猪场/个猪场/个猪场/个阳性场/份阳性率/%AreaSamplePigfarmPigfarmPigfarmPositivePostivenumbernumbernumbernumbernumberrate2005年10297373136.23634876.192006年12966347926.83986061.222007年27223513819.0337420955.882008年29230519117.7652634966.352009年13644388628.4831214847.442010年20216375418.5632714444.042011年25134739029.4034817249.432012年333121054431.6557535060.872013年454881464232.1988657564.902014年370031504040.6419211358.852015年17631695939.47312167.74总计2721447975429.313732218958.6542 图3-1中国部分地区2005年-2015年PRV猪场野毒感染情况Figure3-1.ThedetectableresultofPRwildvirusantibodyin2005-2015ofdifferentregionsinpartsofChina2.1.2河南省2005年-2015年不同规模猪场PRV野毒感染情况从表3-2及图3-2可知，2173个猪场中有1192个为阳性场，猪群阳性率为54.86%；共有90846份血清，其中31660份阳性，血清阳性率为34.85%。从11年的猪场阳性率、血清阳性率变化可以看出，我省伪狂犬的感染情况相当严重，且在2012年之后我国猪伪狂犬的感染情况不断加重，并且呈每年上升趋势，这与我国猪伪狂犬的感染情况一致。表3-2河南省部分地区2005年-2015年PRV猪场野毒感染情况Table3-2ThedetectableresultofPRwildvirusantibodyin2005-2015ofdifferentregionsofHenanprovince检测样品检测猪场DetectedsamplesDetectedpigfarms地区样品数/份阳性数/份阳性率/%猪场/个阳性场/个阳性率/%AreaSamplePositivePostivePigfarmPositivePostivenumbernumberratenumbernumberrate2005年69017024.64634876.192006年137045633.28986061.222007年6579170725.94191473.682008年6830140320.541027472.542009年5893126321.4331214847.442010年401450512.5832714444.042011年8002327829.4034817249.432012年13735537939.1657535060.872013年18645606531.1725113252.582014年19269798641.44472961.702015年5819344859.25312167.74总计908463166034.852173119254.8643 图3-3河南省部分地区2005年-2015年PRV猪场野毒感染情况Figure3-3.ThedetectableresultofPRwildvirusantibodyin2005-2015ofdifferentregionsofHenanprovince2.1.3我国不同阶段猪群2005年-2015年PRV野毒感染情况从表3-3、3-4、3-5和图3-3可知，经产母猪、后备母猪、商品猪、种公猪、哺乳仔猪、保育猪的平均阳性率分别为29.66%、20.79%、20.62%、32.99%、23.38%、21.83%。其中种公猪的阳性率最高为32.99%。后备母猪和商品猪的阳性率最小。由此可见，不同阶段的猪群伪狂犬野毒的感染率有差异。表3-3中国部分地区2005年-2015年不同阶段猪群PRV野毒感染情况Table3-3ThedetectableresultofPRwildvirusantibodyin2005-2015ofdifferentstagesofChina经产母猪后备母猪DetectedsamplesDetectedpigfarms地区样品数/份阳性数/份阳性率/%样品数/份阳性数/份阳性率/%AreaSamplePositivePostiveSamplePositivePostivenumbernumberratenumbernumberrate2005年143755738.765159.82006年143821615.02216167.552007年239476832.08701115.712008年4677128027.3786013816.052009年228456921.915893126321.432010年7978342042.87124616644.042011年256029011.338002327829.402012年11604218618.84260643216.582013年4686204843.71139056140.342014年204174636.551865630.112015年109043539.912354117.45总计421891251529.666860142620.7944 表3-4中国部分地区不同阶段猪群PRV野毒感染情况Table3-4ThedetectableresultofPRwildvirusantibodyin2005-2015ofdifferentstagesofChina商品猪种公猪DetectedsamplesDetectedpigfarms地区样品数/份阳性数/份阳性率/%样品数/份阳性数/份阳性率/%AreaSamplePositivePostiveSamplePositivePostivenumbernumberratenumbernumberrate2005年93115917.0849916533.072006年68616323.761263426.982007年86116519.161734626.592008年18831497.4178722428.462009年1081847.7776516020.912010年399078419.6589521323.802011年145131221.5028213949.292012年260252820.29187547625.392013年279188731.78182195252.282014年63828544.672142210.282015年4847214.88845059.52总计17398358820.627521248132.99表3-5中国部分地区不同阶段猪群PRV野毒感染情况Table3-5ThedetectableresultofPRwildvirusantibodyin2005-2015ofdifferentstagesofChina哺乳仔猪保育仔猪DetectedsamplesDetectedpigfarms地区样品数/份阳性数/份阳性率/%样品数/份阳性数/份阳性率/%AreaSamplePositivePostiveSamplePositivePostivenumbernumberratenumbernumberrate2005年85522626.43119924320.272006年85516819.6569240858.962007年2284017.543615816.072008年4118219.9571612817.882009年76018924.877158111.332010年125836428.94175135120.052011年87111413.09138921515.482012年109318316.74335841414.122013年240153322.20246672929.562014年2547429.1383928433.852015年37821657.092087837.50总计9364218923.3813794298921.8345 图3-4中国部分地区不同阶段猪群PRV野毒感染情况Figure3-4.ThedetectableresultofPRwildvirusinfectionofdifferentscaleinpartsofChina2.1.4我国不同地区猪群PRV野毒感染情况从表3-6、3-7、3-8和图3-4可知，中南地区（湖北、湖南、广东、广西、海南）、东北地区（吉林、辽宁、哈尔滨）、华北地区（北京、天津、河北、山西、内蒙）、华东地区（上海、江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东）、西北地区（陕西、甘肃、青海、宁夏、新疆）、西南地区（重庆、四川、贵州、云南、西藏）、河南地区规模化猪场PR野毒阳性率平均为22.23%、27.74%、34.53%、26.93%、24.89%、23.89%、34.85%其中河南的PR野毒阳性率最高为34.85%，中南地区的PR野毒阳性率最低为22.23%。46 表3-62005-2015年我国不同地区猪群PRV野毒血清感染情况Table3-6ThedetectableresultofPRwildvirusantibodyin2005-2015ofdifferentregionsofChina中南地区东北地区DetectedsamplesDetectedpigfarms地区样品数/份阳性数/份阳性率/%样品数/份阳性数/份阳性率/%AreaSamplePositivePostiveSamplePositivePostivenumbernumberratenumbernumberrate2005年365593625.6110297373136.232006年278549217.67735739.932007年27052589.54179927315.182008年489159812.23174821812.472009年2338141960.6931416452.232010年6579147322.3920216375418.562011年284145516.02508696118.902012年155829218.741237897.202013年4543121926.83454881464232.192014年107520619.16421330.952015年10243.92158264340.65总计33072735222.23885442456127.74表3-72005-2015年我国不同地区猪群PRV野毒血清感染情况Table3-7ThedetectableresultofPRwildvirusantibodyin2005-2015ofdifferentregionsofChina华北地区华东地区DetectedsamplesDetectedpigfarms地区样品数/份阳性数/份阳性率/%样品数/份阳性数/份阳性率/%AreaSamplePositivePostiveSamplePositivePostivenumbernumberratenumbernumberrate2005年10297373136.234828127426.282006年312152116.704626171337.032007年334098029.34736197313.222008年246463525.7811437198717.372009年32529390.15320757717.992010年26852689.994557132128.992011年121672159.29261281737.792012年166183950.5112188314525.802013年2110118756.269697321333.132014年2766108239.128473317037.412015年158264340.657826249231.84总计315671090034.53768122068226.9347 表3-82005-2015年我国不同地区猪群PRV野毒血清感染情况Table3-8ThedetectableresultofPRwildvirusantibodyin2005-2015ofdifferentregionsofChina西北地区西南地区DetectedsamplesDetectedpigfarms地区样品数/份阳性数/份阳性率/%样品数/份阳性数/份阳性率/%AreaSamplePositivePostiveSamplePositivePostivenumbernumberratenumbernumberrate2005年10297373136.23110435131.792006年137045633.2832922468.092007年27223513819.03171718110.542008年29230519117.7680916019.782009年776354.5179113517.072010年511631.3724812269.112011年173748327.8157028950.72012年333121054431.65140869649.432013年12381118.97173040023.122014年2798138849.6093317218.442015年214833315.501543925.33总计1101802742624.8912026287323.89图3-52005-2015年我国不同地区猪群PRV野毒血清感染情况Figure3-5.ThedetectableresultofPRwildvirusantibodyin2005-2015ofdifferentregionsofChina48 2.2我国部分地区2005年-2015年PR野毒gE基因遗传进化分析将从GenBank收录的66株毒株gE全基因序列运用DNAStar软件，进行gE基因序列分析（图3-6），本试验所有毒株的同源性介于92.5%~100%。利用软件MEGA5.0中的Boot-strappedNeigh-bor-Joining绘制PRVgE全基因进化树（图3-7），从PRVgE全基因进化树可以看出，2005年-2015年分离得到的60株分离株以及经典的Ea（AF158090）株、P-prv（Malaysia）株、Yangsa(southKorea-2003)株等经典分离离株存在较近的亲缘关系，处于较近的分支上，与Becker株、Belgium株亲缘性较远。图3-62005-2015年我国不同地区猪群PRV野毒株gE基因氨基酸序列分析Figure3-6TheanalysisofpigPRVwildstrainsofaminoacidsequenceofgEgeneduring2005-2015indifferentregionsofChina49 图3-7.2005-2015年我国不同地区猪群PRV野毒株gE基因进化树分析Figure3-7.ThedetectableresultofPRphylogenetictreeanalysisin2005-2015ofdifferentregionsofChina3讨论3.1我国猪群2005年-2015年感染PRV野毒情况从表3-1及图3-1可知，我国在过去的11年终猪场平均阳性率为58.65%，血清平均阳性率为29.31%。从11年的猪场阳性率、血清阳性率变化可以看出，在12年之前我国对PR的防控具有一定的成效，尤其是在gE缺失疫苗的应用使得PR的感染病率有了很大的降低，但在2012年之后我国猪伪狂犬的感染情况不断加重，并且呈每年上升趋势，这可能与我国的养猪业不断发展，从国外大批量引种有关，应严格控制引种环节。3.2河南省2005年-2015年感染PRV野毒情况不断变化从表3-2及图3-2可知，河南省2005年-2015年猪场平均阳性率为54.86%，低于全国的猪场阳性率58.64%，但血清平均阳性率为34.85%，高于全国29.31%的血清阳性率。从11年的猪场阳性率、血清阳性率变化可以看出，我省伪狂犬的感染的情况相当严重，且在2012年之后我国猪伪狂犬的感染情况不断加重，并且呈每年上升趋势，这与我国猪伪狂犬的感染情况一致，数据显示我省在PR防控方面依然面临着很大的压力。50 3.3我国不同阶段猪群2005年-2015年感染PRV野毒情况存在差异从表3-3、3-4、3-5和图3-3可知，经产母猪、后备母猪、商品猪、种公猪、哺乳仔猪、保育猪2005年-2015年的平均阳性率分别为29.66%、20.79%、20.62%、32.99%、23.38%、21.83%。其中种公猪的阳性率最高为32.99%。后备母猪和商品猪的阳性率最小，由此可见，不同阶段的猪群伪狂犬野毒的感染率有差异。各阶段猪群的感染情况与全国PR的感染情况相一致，针对经产母猪和种公猪高感染的情况，应加强对种猪的检测，严格淘汰感染种猪，减少病毒通过生殖道传播疾病的机会。3.4我国不同地区猪群2005年-2015年感染PRV野毒情况不容乐观从表3-6、3-7、3-8和图3-4可知，中南地区、东北地区、华北地区、华东地区、西北地区、西南地区、河南地区规模化猪场PR野毒阳性率平均为22.23%、27.74%、34.53%、26.93%、24.89%、23.89%、34.85%其中河南的PR野毒阳性率最高为34.85%，中南地区的PR野毒阳性率最低为22.23%。这可能与河南地处内陆地区的养殖密度相对较大有关，中南地区属沿海地区，家禽养殖所占比重较大，而养猪业发展相对缓慢。针对本试验数据合理控制猪场分布密度、饲养密度对该病的防控起到一定的促进作用。3.5我国2005年-2015年感染PRV野毒gE基因进化情况PRV基因组大小约150Kb，G+C含量高达73%，具有复杂的二级结构和高级结构，从本试验调查结果可以看出我国2005年-2015年感染的PR野毒株同源性介于99.4%~99.8%，而与其他国内外参考株的同源性介于92.6%~100%。数据显示gE基因具有较高的保守性，为疫苗的研制提供了一定的理论指导，对PR的有效防控奠定了一定理论基础。3.6流行原因分析尽管有像Bartha-K61株这样的基因缺失疫苗在中国大部分地区的广泛应用，PR仍在我国的很多地区呈区域流行。PR之所以得不到有效防控主要有以下几方面原因：3.6.1混合感染随着养猪生产的不断集约化，猪群感染不只一种病原是非常常见的。据报道PRV能够和很多种病原共同感染，如：猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒、猪支原体、弓形虫、放线枯草芽孢杆菌、链球菌等，使病情比较复杂。3.6.2疫苗免疫失败在这一领域，疫苗免疫失败或不能提供完整的保护力往往由于疫苗的质量差（抗原不足的原，或由于冷链的问题）；病毒被灭活，不合理的免疫计划（不正确的免疫接种时间，时间间隔，免疫剂量和免疫途径）；受PR母源抗体的干扰；其他疫苗联合用药（如PRRSV疫苗）；其他疾病、药物等的影响。PR疫苗免疫效果受蓝耳病或猪瘟活疫苗的影响已经被证明。在大多数的地区或猪场，几乎没有接种过包括PR在内的任何疾病疫苗，导致疫苗接种的覆盖面不够全面。3.6.3薄弱的生物安全在中国，养猪场尤其是中、小型养猪场对生物安全关注很少，这也导致PR的控制和净51 化比较困难，很难根除。许多养猪户更倾向于依赖疫苗免疫，非防疫疾病的卫生措施和不定期监控来驱除PRV载体。一些养殖户会很快把其他农场引进的猪和他们自己的猪混合在一起，没有任何隔离和监视，这无形中大大增加了感染PRV的机率。相当多的小型养猪场是“开放”的，没有消毒的进出通道，外出没有严格限制，没有养殖环境的日常消毒，人员，游客和车辆等的消毒。在一些猪场，被感染或死亡的猪没有被烧毁或埋葬，而是直接转移到市场，导致疾病在中国的广泛蔓延。3.6.4持续性感染目前，几乎没有地区性或全国性的PR根除方案在中国应用实施。一般说来，感染PRV并且存活下来的猪处在潜伏感染状态。如果被感染猪只没有被筛选，并从猪群中移除，他们将散播病毒，导致易感猪的感染和持久在猪群中存在。事实上，由于养殖成本和防控技术的限制，许多养殖户很少或从不做血清学或病毒学监测，gE抗体阳性的猪只在猪群中持续存在。3.6.5PRV流行病学信息掌握不充分在过去的几十年里对PR没有进行全面的流行病学研究。因此，有必要加强PR流行病学的调查研究。另一方面，在中国很少有关于野猪种群PR流行病学的资料。应着重考虑野生猪群的潜在病毒储存及其分布的影响，采取区域和国家层面对野生种群的PRV感染情况进行检测了解是迫切需要的。3.6.6PR前景展望PR的鉴别诊断，安全、有效的疫苗免疫方法对于PR的控制和根除是非常重要的。考虑到当前新变PRV在中国猪群中PR感染日益恶化的局势，一个首要任务就是寻找一种更加安全和针对当前流行株有效的疫苗。此外，PRV可以建立持续感染和隐藏在急性感染后的三叉神经节内。因此，迫切需要发展更为敏感和方便的方法来识别和清除潜在的PRV。一个国家强制接种疫苗必须与包括病毒学、血清学监测、严格的生物安全程序的综合措施一起进行。同时，国家对PR的广泛而深入的监督是必要的。关于病毒在猪以外的其他动物上的流行病学的知道的很少。应努力确定PRV在这些动物身上的实际感染情况，尤其是野生动物。我们应该学习、了解更多已经消灭病毒的其他国家的经验。在中国，一些科学家呼吁国家采取根除计划，中国政府在国家控制动物疾病的中长期计划育种计划中已将PR列为优先控制并净化的疾病。从gE基因缺失疫苗和gE抗体检测试剂盒的临床应用，在中国根除PR是很有可能的。52 试验四规模化猪场PR的防控研究及应用猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)引起的一种急性传染病，已成为危害养猪业的重要疫病之一。成年猪多不表现表典型的临床症状，而产房哺乳仔猪的发病率和死亡率较高，感染母猪多表现流产、产死胎、返情等；新生仔猪发病初期表现为拉稀、呕吐、神经症状等；种公猪主要表现为生殖器官出现问题，不会生育。猪只一旦感染终身带毒，很难根除。自我国首次年首次报道以来，随着养猪业集约化、规模化的发展，PR已在我国的多个省份暴发，给我省养猪业造成巨大经济损失。免疫预防接种仍然是目前防控该病的主要手段，疫苗免疫可以刺激机体产生针对PRV病毒的免疫应答阻止病毒的复制，但是鉴于病毒的PRV具有高度潜伏感染特性，可引起持续性感染，这给PR的净化带来很大的困难。本试验通过借鉴国内外对PR有效防控经验及成果，结合我省现阶段的猪病防控条件和理论技术，探索出一套符合我省实际情况且行之有效的猪场伪狂犬病控制方案，为PR的有效防控提供实践指导。1材料与方法1.1材料在河南的濮阳、焦作、南阳、驻马店、鹤壁分别选择一母猪群在300-500头之间的PR野毒感染严重场进行PR综合防控措并对相应数据进行对比分析，这五个猪场分别用各地市的首字母P、J、N、Z、H为代表。1.2方法根据这五个规模化的实际发病情况，结合实验室血清PRVgE抗体感染情况和产房仔猪成活率，对实验猪场采取了PR的综合防控措施，然后回访其实际防控效果。具体方案如下：1.2.1坚持自繁自养自繁自养是控制包括PR在内各种传染病的有效措施之一，如果需要引进种猪，应严格遵守种猪引进制度，坚决抵制阳性种猪的进入。在引种前应严格检疫，并在引种后做好隔离与消毒工作。经检测是PRV病毒阴性的猪只才能转入生产群。1.2.2完善疫苗免疫大量临床实践表明，免疫接种是预防PR最有效的方法之一。对于PR的疫苗免疫普通弱毒苗、灭活苗和基因缺失苗已广泛用。但弱毒活疫苗存在返祖或基因重组变强的可能，因此，对于PR阴性猪场,当有PR感染风险需免疫时，首推基因缺失灭活苗。基因缺失灭活苗有两大突出优势：一是病毒已经灭活，相对安全，二是便于区分疫苗免疫与野毒感染，具有较好的临床指示作用。猪病防控是一个整体，各种疾病之间相互影响，PR的有效防控，与猪病的良好基础免疫有很大关系，因此需兼顾其他病的免疫防控。例如，猪瘟依然是威胁养猪业的“头号大敌”，猪瘟的有效免疫是猪场稳定的基石；蓝耳病、圆环、猪支原体肺炎等免疫抑制性疾病势必会影响伪狂犬疫苗的效果，所以猪场的基础免疫显得尤为重要。53 1.2.3坚决淘汰阳性种猪定期对猪群进行筛查，对种猪群尤其是种公猪定期抽血化验，种猪场建议一年做两次检测，种公猪全部检测，种母猪抽查比例在10%-20%之间。通过检测，获得猪群野毒感染信息。野毒阳性的带毒猪要坚决淘汰处理，阴性的猪只方可继续作为种用。如阳性种公猪禁止用以采精或配种使用。阳性母猪一时无法淘汰的，也要予以严格隔离，预防阳性猪作为传染源传播疾病。1.2.4加强猪群的饲养管理良好的饲养管理猪群保持健康成长的重要环节，如实行早期(21日龄)断奶，按照猪群生长的不同环节对猪群进行分点饲养，并尽可能做到全进全出，防止疾病在不同阶段进行传播；猪群进行定期消毒，消毒药物交替、轮番使用，防止耐药菌的产生；猪群定期驱虫，减少寄生虫病对猪群的危害；对疑似发病猪只采取隔离措施，控制病毒的传播。1.2.5严格控制生物安全加强生物安全管理是保证猪场正常生产的必要环节，完善的生物安全措施减少疾病暴发的可能性，同时可以在猪场发病时尽可能地减少损失。如对发病圈舍严格隔离、消毒可以减少发病感染范围；其他动物携带大量的致病菌，如蚊虫易携带乙脑病毒，狗易携带狂犬病毒等，因此应做好驱蚊、灭鼠工作，同时禁止在猪场内饲养狗猫等其他宠物或家禽。定期严格消毒，首选2%的氢氧化钠(苛性钠)溶液或酚消毒剂；及时清理粪便，避免经粪口感染途径感染其他病原菌；对往来猪场的人员、车辆严格隔离、消毒避免外界病原入侵猪场。1.2.6综合防控措施实施效果评价指标从猪场野毒检出率、各阶段gE野毒抗体阳性率、母猪生产性能（包括流产比例、产死胎比例、返情率、平均窝产仔数、产房成活率）方面做记录，并比较。2结果2.1防控前后PR野毒病原阳性率变化经过实施为期两年的综合防控措施，五家猪场防控前后PR抗原阳性率对比结果详见表4-1，结果表明各地代表猪场PR野毒病原阳性率明显下降。表4-1五家猪场防控前后PR抗原阳性率Table4-1TheantigenpositiverateofPRVinfivefarmsafterprevention病原阳性率猪场防控前防控后P23%0J27%2%N40%5%Z30%2%H35%3%2.2防控前后不同阶段猪群野毒抗体阳性率比较通过为期一年的综合防控措施试验，不同阶段猪群野毒抗体阳性率变化结果如表4-2。结果表明防控后这五家猪场的种公猪、育肥猪、后备种猪经产、母猪gE抗体阳性率显著下54 降。表4-2五家猪场防控前后各阶段gE野毒抗体阳性率Table4-2ThegEantibodypositiverateofdifferentagepigsinfivefarmsafterprevention公猪母猪育肥猪后备猪猪场防控前防控后防控前防控后防控前防控后防控前防控后P85%079%33%76%21%91%23%J78%083%45%81%14%82%16%N90%077%27%85%12%74%13%Z98%0100%65%89%19%87%21%H74%085%57%76%16%93%28%2.3种猪生产成绩比较经过实施为期两年的综合防控措施的实施，种猪部分生产性能指标变化对比结果详见表4-3。结果表明这五个猪场的母猪流产比例、产死胎比例、返情率均大幅下降，平均窝产仔数、产房成活率均明显提高。表4-3五家猪场防控前后母猪生产性能指标对比结果Table4-3Theproductionperformanceofsowsinfivepigfarmsafterpreventation流产比例(%)产死胎比例(%)返情率(%)平均窝产仔数产房成活率(%)猪场防控前防控后防控前防控后防控前防控后防控前防控后防控前防控后P501023239.710.287.595.4J811132429.610.484.697.5N708136410.111.189.396.3Z1221534149.610.083.095.7H1021323539.510.181.598.13讨论本试验是在河南省五个地区的感染PR野毒的代表猪场，通过对综合防控方案实施前后的，猪场PR抗原阳性率均大大降低，但仍存在部分阳性。野毒感染种公猪被淘汰，保证猪场的母猪配种的精液来源为PRV阴性，引进的阴性种公猪继续保持阴性，后备母猪阳性率逐渐降低，育肥猪野毒抗体阳性率也在逐渐降低，实践证明猪群仔猪阳性率随着母猪群阳性率的降低而降低；母猪各项生产指标不断上升，母猪产仔率、仔猪成活率等都有所提升。实验结果证实提出的控制措施科学合理，能有效降低PR在猪群中的流行率，为防控PR提供可行方案与借鉴。然而，PR防控是一项系统工程，虽然实验结果显示PR的感染情况得到有效控制，但远未达到理想的净化PR水平，这可能与我省整体流行率高有关，流行率高导致大环境的污染，作为猪场局部小环境，虽然采取了有效措施，但人员、饲料、车辆等流行如野生动物的往来可能影响控制效果。也应看到，PR对成年猪影响并不大，而且病毒可以潜伏性存在，这也给PR的发生与传播提供机会，影响实际防控效果。此外，本研究的回访时间仅仅2年，防控措施的持续执行以及效果评估需进一步追踪。尽管如此，笔者提供的防控策略为净化和防控PR积累了经验。55 全文小结1.2015年1月1日-2015年12月31日河南省部分地区猪场PRV野毒抗体检测显示，猪场阳性率高达86.64%，血清样品总阳性率为60.3%；PRV野毒病原阳性率为10.63%。说明，目前我省规模化猪场有比较严重的PR野毒感染情况，PR的防控仍面临着较大压力。2.通过对当前流行PRV野毒的gE部分基因的遗传进化分析，发现当前流行PRV野毒gE基因的核苷酸序列，氨基酸序列未发生明显变异。3.通过对全国各地区2005-2015年近11年的PR野毒抗体检测数据和遗传进化分离，了解近11年PR在我国的流行情况，详细介绍了各个省份PR的感染情况，并分析感染原因，为PR的有效防控提供一定的理论指导。4.根据我国PR的基本情况，借鉴国内外防控经验制定一套针对我国实际情况的控制、净化方案，分析措施采取前后的数据变化，为PR的临床防控提供实践经验。56 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AbstractEpidemiologicalanalysisandpreventionofswinepseudorabiesPseudorabiesvirus(PRV,PR)isanacuteinfectiousdiseasecausedbyporcinepseudorabiesvirus(PRVvirus(PRV),cancauseavarietyofanimaldisease,theclinicalpregnantsowearlyabortion,stillbirth,mummyandrespiratorysystemproclinicsymptomscharacteristic,thepigisPRVinfectionsourcesandnaturalreservoirhost.Afterinfection,theclinicalfeaturesoffever,neurologicalsymptomsandhighmortality,respiratorysymptomsinlargeandmediumpigswereshown.Bytheendof2011,ourcountrysomeofthepigcontinuedoutbreakandepidemicofswinepseudorabies,leadingtoneurologicalsymptomsoccurredinlargenumbersofsowsmiscarriage,newbornpigletsdyinginlargenumbers,causingmajoreconomiclosses.InordertofullyunderstandtheepidemicsituationofswinepseudorabiesinpartsofHenanProvince,thisstudyfromtheserumepidemiologyandpathogenepidemiologystudyandmolecularepidemiologyofthediseaseepidemicsituationofourprovinceintheinvestigationandanalysis,andstatisticalanalysisofpseudorabies,popularallkindsofriskfactorsandtheeffectivepreventionandcontrolofthediseaseprovideclinicalguidance.Byenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)in3711samplesofserumsamplesfrom337pigfarmsinJanuary2015~2015yearinDecemberinHenanProvinceinsomeareasweredetected,PRVgEantibodyshowedthat337pigfarmsin293PRVwildviruspositive,thetotalpositiveratewas86.89%;thepositiverateofpigfarmfiveintheEast,WesternandsouthernHenan,Henan,Henanwere81.25%,79.31%,79.31%,85.71%,97.14%;thepositiverateofsmallandmediumscaleandlarge-scalepigfarmswere85.45%,90.90%and87.10%;3711serumsamplesofthetotalpositiveratewas60.3%,thepositiverateofserumsamplesofsows,boars,pigswere60.1%,72.6%,57.09%;theresultsshowedthat:HenanprovincePRVwildvirusinfectionismoreserious,especiallyintheareaofHenan,Henan;pigPRVvirusinfectionindifferentstagesofproductionareSeriously,especiallythegroupofboars.BythemethodofPCRinJanuary20152015toDecember2004inHenanProvince72suspectedinfectedpiginspectionof141tissuediseasematerialfordetectionofPRV72 pathogen.Theresultsshowedthat:141sampleshave15samplesforPRVvirulentpathogenpositive,thetotalpositiveratewas10.63%;ofwhich1-3months,betweenAprilandJune,JulytoSeptember,10-12monthfarmsdetectionratewas25%,by10.5%,15.79%,10.7%,sampledetectionrateof17.85%,5.26%,15%and5.6%,respectively.Resultsshowthat:pigfarmsinthewildvirusinfectionwiththechangeinthehavesomedifferences.InordertounderstandthepartofHenanProvincesince2011statusofporcinepseudorabiesvirus(PRV)epidemicstrainsandmolecularbiologicalcharacteristicsandgeneticevolution,thisexperimentcollectedpartsofHenan9strainsofPRVisolates,andgeneticvariationanalysisofthegEgene.Theresultsshowedthat9strainsofthegEGeneofPRVisolatesandotherreferencestrainscorrespondingsequencehasrelativelystrictconservative.Betweenthesestrainsbetweennuclearthatchacidandotherreferencestrainsofnucleotidesequencehomologyrespectively99.7%-100%and99.1%-99.9%.Multipleaminoacidsequencealignmentshowedthat9strainsofPRVseparationplantaminoacidhomologyis100%withreferencestrainsofaminoacidsequenceofin98.1%-99.6%.Inonelocusoccurstheuniqueaminoacidmutations,namelythetwoaminoacids(withZMHenan2013andYangshan(Korea-1996)strainsof)byKmutationforf.ThisisreportedforthefirsttimeinChinaGEgeneinthepositionoccurredaminoacidmutationstrains.TherelationshipbetweenthesenovelaminoacidmutationsandPRVpathogenicityandtheirbiologicalcharacteristicsneedtobefurtherstudied.Inthisstudy,weinChinain2005and2015nearlyelevenyearsofpigpseudorabiesserumepidemiclearningstatisticalsummaryandGegenevariationsofthatsurveydatashowedthatintheyear3732relatestothepigfarmshave2189positivefield,thepositiverateof58.65%.Atotalof272144sera,which79754positiveandserumpositiveratewas29.31%.Thestagesofpigsbywildinvestigationthatsows,gilts,commercialpigs,boars,piglets,weanlingpigaveragepositiverate29.66%,20.79%,20.62%,32.99%,23.38%,21.83%respectively.ThroughouttheinvestigationresultsshowthatChinaandSouthAfrica,inthenortheast,NorthChina,EastChina,northwest,southwest,HenanareascalepigfarmPRwildviruspositiverateaveraged22.23%and27.74,34.53%and73 26.3%,24.89%,23.89%and34.85%.Thisstudyhasacertaindegreeofunderstandingoftheincidenceof-2015inChinain2005,andprovidesguidancefortheeffectivepreventionandcontrolofswinepseudorabies.Thisstudypromptedbyepidemiologicalriskfactorsassociatedwithacquiringswinewithoutquarantine,disinfectionisnotstrict,allinfull,withoutimmunizationwithPRmorethan6kindsofswinediseases,nobird,rodentcontrolmeasuresproposedfarmstrengtheningfeedingmanagementandgoodbiosecuritymeasures,strictimplementationofroutineimmunization,aswellasimportantdiseasepreventionandcontrol,regulardetectionandisolationofinfectedpigs,outofcontrolandPRstrategyofpositivepigs.Preventionandcontrolresultsshowthatthepreventionandcontrolprogramofthisstudyhasaverypracticalvalue,andprovidesareferencefortheeffectivepreventionandcontrolofPR.Keywords:Henanprovince;swinepseudorabies;serologicalsurvey;gEgene;riskfactor74