Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究

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分类号论文编号密级二穿ｆＳ六？硕士学位论文Ｆａｓｕｄｉｌ阻断ＲＯＣＫ１刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究ＴｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＦａｓｕｄｉｌｉｎｈｉｂｉｔｓＲＯＣＫ１ｉｎｄｕｃｅｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＨｓｓｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄｍｕｓｃｌｅｗａｓｔｉｎｇｉｎｃｈｒｏｎｉｃｋｉｄｎｅｄｉｓｅａｓｅｙ研究生姓名：郭织运学号：２０１４１２４０一指导教师：许静副教授第二军医大学第附属医院学科、专业：内科学（肾病）：专业学位学位类型答辩日期：２０１７年４月二〇一七年Ｈ■月 第工苹医太孝硕士学位论文Ｆａｓｕｄｉｌ阻断ＲＯＣＫ１刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究ＴｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＦａｓｕｄｉｌｉｎｈｉｂｉｔｓＲＯＣＫ１ｉｎｄｕｃｅｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｆｉｓｓｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄｍｕｓｃｌｅｗａｓｔｉｎｇｉｎｃｈｒｏｎｉｃｋｉｄｎｅｙｄｉｓｅａｓｅ研宄生姓名：郭织运指导教师：许静副教授专业名称：内科学（肾病）培养单位：第二军医大学附属长海医院＾二〇一＾＾年ｉ一月 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经一献发表或撰写过的研究成果。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：ｉｆ曰期：年丨１月ｑ日学位论文版权使用授权声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文全文或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》、《中国优秀博硕士学位复论文全文数据库》等数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：１日期：２〇ｎ年＂月叼曰曰期年日＂月 目录摘要............................................................................................................-1-Abstract........................................................................................................-3-缩略词表......................................................................................................-5-前言............................................................................................................-7-课题设计...................................................................................................-9-一、体内实验........................................................................................-9-二、体外实验......................................................................................-10-三、统计学处理...................................................................................-11-实验装置与方法.....................................................................................-12-一、实验仪器与耗材..........................................................................-12-二、实验试剂......................................................................................-13-三、实验方法......................................................................................-13-实验结果.................................................................................................-18-一、慢性肾脏病（CKD）导致肌肉萎缩.........................................-18-二、慢性肾脏病（CKD）激活ROCK1,导致线粒体裂变增加，促进肌肉萎缩的发生..................................................................................-20-三、Fasudil阻断ROCK1过表达所致细胞呼吸异常，改善CKD所致肌肉萎缩的发生..................................................................................-24-分析与讨论.............................................................................................-26-结论.........................................................................................................-31-参考文献.................................................................................................-32-综述慢性肾脏病与线粒体功能异常......................................................-35-在读期间发表论文情况............................................................................-45-致谢........................................................................................................-46- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究摘要研究目的明确慢性肾脏病（CKD）时ROCK1的激活是否刺激线粒体裂变增加，并参与慢性肾脏病肌肉萎缩的发生和发展；研究方法体内动物实验：雄性，C57BL／6J小鼠，40只，按照实验处理方法的不同分成4组:假手术组（WT组），CKD组，假手术+Fasudil组（WF组），CKD+Fasudil组（CF组）；其中，WT组行肾脏包膜剥离术，CKD组行5/6肾脏切除术，1月后，两组老鼠行尾静脉取血，测血清尿素氮（BUN）及血清肌酐（Cr）水平，筛选CKD成模老鼠；将WT组和CKD组老鼠，随机分成上述四组，配对饲养；其中WT组和CKD组老鼠，行腹腔注射生理盐水（3次／周，持续8周），高蛋白饲料喂养；WF和CF组老鼠，腹腔注射Fasudil（30mg/kg/次，3次／周，持续8周），高蛋白饲料喂养。每周测量老鼠体重。实验结束后，按照实验目的和操作步骤，收取老鼠腓肠肌、胫骨前肌等下肢肌，用于免疫荧光染色及蛋白免疫应迹（WesternBlot）或Realtime-PCR，检测ROCK1、MuRF1等目标分子的表达情况，从而明确Fasudil能否逆转CKD所致肌肉萎缩及线粒体裂变相关蛋白的增加。体外细胞实验：体外培养C2C12成肌细胞，2%马血清诱导细胞分化成熟，腺病毒载体ROCK1刺激细胞过表达ROCK1，对照组给予腺病毒载体GFP（绿色荧光蛋白），，按照给予刺激的不同，实验分成四组：1）Ad-GFP组，给予腺病毒载体-GFP(AAV-GFP，5nmol／l)；2）Ad-ROCK1组，给予腺病毒载体-ROCK1(AAV-ROCK1,5nmol／l);3)Ad-GFPF组，在给予GFP的前提条件下，给予Fasudil(10umol/l)刺激；4）Ad-ROCK1F组，在给予AAV-ROCK1前提下，给予Fasudil(10umol/l)刺激。各组病毒刺激持续48小时。通过细胞能量代谢分析仪（Seahorse）评估C2C12成肌细胞在不同刺激条件下时，细胞呼吸过程中耗氧量及产酸率的改变情况；通过染色，证实ROCK1过表达对C2C12成肌细胞线粒体形态和功能的影响；检测各组肌萎缩相关蛋白及线粒体裂变相关基因的表达的变化情况。研究结果体内实验中，与WT组相比，CKD组老鼠，ROCK1表达增加，肌肉横截面积减少肌纤维分布左移，同时电镜下观察发现，CKD组老鼠线粒体裂变增加；CF组-1- 第二军医大学硕士学位论文与CKD组相比，给予Fasudil腹腔注射老鼠，CKD所致肌肉横截面积减少不明显，肌纤维分布右移，肌萎缩相关蛋白MuRF及线粒体裂变相关蛋白p-Drp1表达减少。体外实验中，Seahorse检测线粒体应激变化时，Ad-ROCK组较GFP组细胞基础呼吸、最大呼吸、额外呼吸增加，给予FCCP刺激后，细胞呼吸的耗氧量及产酸率也明显增加；细胞线粒体染色观察到，Ad-ROCK组细胞线粒体裂变增加，表现为碎片化，线粒体裂变蛋白p-Drp1表达增加，而且活性氧的的释放增加；给予Fasudil刺激后，能明显改善ROCK1过表达所导致的p-Drp1,MuRF1、Atrogin1的增加，纠正细胞呼吸异常。研究结论慢性肾脏病时，激活ROCK1，刺激线粒体裂变增加，增加活性氧释放，并增加细胞耗氧量和产酸率，影响蛋白的合成和降解速率，参与肌肉萎缩的发生；Fasudil作为ROCK1的抑制剂，能够在一定程度上阻断ROCK1通过激活p-Drp1所引起的线粒体裂变增加，从而阻断由此继发的一系列不良影响，并最终实现改善肌肉肌肉萎缩的目的，为临床防治慢性肾脏病肌肉萎缩提供新的思路及方法。关键词慢性肾脏病，肌肉萎缩，线粒体裂变，ROCK1，Fasudil-2- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究AbstractObjectiveToconfirmwhetherROCK1stimulatesmitochondrialfission,leadingtotheprogressionofmusclewastinginchronickidneydisease;MethodInvitro：Male,C57BL/6Jmice,40，weredividedinto4groupsaccordingtothedifferenttreatment:shamoperationgroup(WTgroup),CKDgroup,sham+Fasudilgroup(WFgroup),CKD+Fasudilgroup(CFgroup)；ThemiceinWTgroupwithrenalcapsulestripping，themiceinCKDgroupwith5/6nephrectomy,afteronemonth,taketailvenousblood,testserumureanitrogen(BUN)andserumcreatinine(Cr)toselectthesucceeedCKDmodelmice;ThemiceinWTandCKDgroupswererandomlydividedintotheabovefourgroups.TheWTandCKDgroupmicewereinjectedintraperitoneallywithnormalsaline(3timesperweekfor8weeks).WFandCFgroupsmicewereintraperitonealinjectionofFasudil(30mg/kg/time,3times/week,sustained8weeks),highproteinfeed.Measuretheweightofmiceeveryweek.Aftertheendoftheexperiment,thelowerlimbmusclessuchasgastrocnemiusandtibialisanteriormusclewerecollectedaccordingtothepurposeandprocedureoftheexperiment.ThesamplesweretreatedwithimmunofluorescencestainingandWesternBlotorRealtime-PCRtodetectthetargetmoleculessuchasROCK1andMuRF1ExpressiontoclarifywhetherFasudilcanreversetheincreaseinCKD-inducedmuscleatrophyandmitochondrialfissure-relatedproteins.Invitrocellculture:C2C12myoblastswereculturedinvitro,2%horseseruminducedcelldifferentiationandmaturation.AdenovirusvectorROCK1stimulatedcelloverexpressionofROCK1.AdenovirusvectorGFP(greenfluorescentprotein)wasadministeredinthecontrolgroup.Accordingtothedifferentstimulidividedintofourgroups:1)Ad-GFPgroup,withAAV-GFP,5nmol/;2)Ad-ROCKgroupwithAAV-ROCK1,5nmol/;3)Ad-GFPFgroups,withAAV-GFP5nmolandFasudil10umol/l);4)Ad-ROCK1Fgroup,withAAV-ROCK15nmolandFasudil10umol/l.Eachgroupofvirusstimulatedfor48hours.ThechangesofoxygenconsumptionandacidproductionrateofC2C12myoblastsunderdifferentstimulationconditionswereevaluatedbythecellularenergymetabolismanalyzer(Seahorse).TheexpressionofROCK1overexpressiononC2C12myoblastmitochondrialmorphologywasconfirmedby-3- 第二军医大学硕士学位论文staining.Evaluatethemitochondrialfission-relatedgeneexpressionineachgroup.ResultsComparedwithWTgroup,CKDgroupincreasedtheexpressionofROCK1,themusclecross-sectionalareadecreasedmusclefiberdistribution,andelectronmicroscopyshowedthatthemitochondrialfissionincreasedinCKDgroup.Fasudilintraperitonealinjectionofmice,CKD-inducedmusclecross-sectionalareadecreasedsignificantly,musclefiberdistributionrightshift,muscleatrophy-relatedproteinMuRF1andmitochondrialfission-relatedproteinp-Drp1expressiondecreased.Invitroexperiments,Seahorsetestmitochondrialstresschanges,Ad-ROCK1groupthanAd-GFPgroupofcellsbasalbreathing,maximumbreathing,extractbreathingincreased,aftergivenFCCPstimulation,cellrespirationoxygenconsumptionandacidityalsoincreased;CellsmitochondrialstainingshowedthatthemitochondrialfissionincreasedinAd-ROCKgroup,andtheexpressionofmitochondrialfissionproteinp-Drp1increased,andthereleaseofreactiveoxygenspeciesincreased.AfterFasudilstimulation,theexpressionofROCK1overexpressionwassignificantlyimprovedP-Drp1,MuRF1,Atrogin1decreasedcorrectcellrespirationabnormalities.ConclusionCKDcanactivateROCK1,stimulatemitochondrialfission,increasedcellularoxygenconsumption,whichmediatestheoccurrenceofmuscleatrophy;FasudilasaninhibitorofROCK1,canblockROCK1tosomeextentthroughtheactivationofp-Drp1inducedmitochondrialfission,andeventuallyreachthepurposeofimprovingmuscleatrophy.KEYWORDSChronickidneydisease,musclewasting,mitochondriafission,ROCK1,Fasudil-4- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究缩略词表英文缩写英文名称中文名称CKDChronickidneydisease慢性肾脏病ESRDEnd-Stage-Renal-Disease终末期肾脏病HDHemodialysis血液透析PDPeritonealDialysis腹膜透析GFRGlomerularfiltrationrate肾小球滤过率CRFChronicRenalFailure慢性肾衰竭IGF-1Insulin-likegrowthfactor-1胰岛素样生长因子-1UPSubiquitinproteasomesystem泛素蛋白酶系统Il-6Interleukin白介素-6ROSReactiveoxygenspecies活性氧DNDiabeticNephropathy糖尿病肾病Drp1Dynamin-relatedprotein-1线粒体动力相关蛋白-1p-Drp1Phosphorylated-Dynamin-relatedprotein-1磷酸化-线粒体动力相关蛋白-1ROCK1Rho-associatedcoiledcoilproteinkinase1Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶-1GASGastrocnemius腓肠肌QQuadriceps股四头肌TATibialisanterior胫骨前肌SOLSoleus比目鱼肌EDLExtensordigitorumlongus趾长伸肌MuRF1E3ubiquitinligasemuscleringfinger-1E3泛素连接酶指环肌蛋白-1proteinMAFbxMusclewastingF-box肌肉萎缩F-boxFis1Fissionprotein1裂变蛋白1Mfn1Mitofusion1线粒体聚变（融合）蛋白1Mfn2Mitofusion2线粒体聚变（融合）蛋白2OCROxygenConsumptionRate耗氧量ECARExtracellularAcidificationRate产酸量OligoOligomycin寡霉素FCCPCarbonylcyanide-4(trifluoromethoxy)-5- 第二军医大学硕士学位论文phenylhydrazone羰基-氰-对-三氟甲氧基Antimycin抗霉素ATPAdenosinetriphosphate三磷酸腺苷DMSODimethylsulfoxide二甲基亚枫-6- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究前言近年来，随着经济的发展，社会水平的提高，人均寿命在不断延长，一定程度上增加了社会老龄人口数，同时也增加了慢性病发病人口基数；加上环境的污染，社会竞争压力大，网络信息化的高速发展，许多年轻人养成了很多不好的生活习惯，在一定程度上，成为了某些疾病的潜在患病人群。肾脏病多为临床慢性病，且具有发病隐匿，病程长，伴发于其他疾病的特点，日常症状不能引起患者的重视，一旦发病多进展为慢性肾脏病（Chronickidneydisease，CKD）或终末期肾脏病（End-stage-Renal-Disease，ESRD），甚至尿毒症期，只能依靠血液透析（Hemodialysis,HD）或腹膜透析（PeritonealDialysis,PD）及肾脏移植维持治疗，很大程度上增加了社会的健康经济负担，严重影响患者的生活治量。目前全球慢性肾脏肾脏病（CKD）的发病率大约在8-16%[1]，并且发病率还在不断上升，因此，提高人们对慢性肾脏病（CKD）的认识刻不容缓。2002年，美国肾脏病基金委员会（KDIGO）推出指南，并将慢性肾脏病（CKD）定义为：各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍（肾脏损害病史大于3个月），包括肾小球滤过率（Glomerularfiltrationrate，GFR）正常和不正常的病理损伤、血液或尿液成分异常，及影像学检查异常，或不明原因GFR下降（<60ml/min·1.73m2）超过3个月[2]，呼吁大家重视慢性肾脏病（CKD）。糖尿病和高血压是所有发达国家和许多发展中国家慢性肾脏病（CKD）的主要原因,但肾小球肾炎和原因不明,多见于亚洲和撒哈拉以南的非洲国家[1,2]。慢性肾脏病（CKD）患者如不能早起采取干预措施，将会逐步进展为慢性肾衰竭（ChronicRenalFailure，CRF），可伴有难以控制的高血压、严重心衰、难治性高钾血症、酸碱平衡紊乱、消化道出血、贫血、矿物质和骨代谢异常、甲状旁腺功能亢进和中枢神经系统障碍等一系列并发症[3]。肌肉萎缩（Musclewasting）或肌肉质量减少是慢性肾脏病（CKD）患者晚期比较严重的合并症，因为肌肉萎缩不仅导致患者行动不便，生活方式转变，同时也降低生活质量，增加慢性肾脏病（CKD）患者的发病率及病死率。研究证实，慢性肾脏病（CKD）患者晚期，50-70%的患者可出现不同程度的肌肉质量的减少，主要是蛋白的丢失[4]，严重影响了该类患者的临床治愈率。因此，采取有效的干预措施，延缓甚至是防止肌肉萎缩的发生，是慢性肾脏病（CKD）临床防治的重中之重。既然慢性肾脏病（CKD）患者死亡率的增加与肌肉萎缩明显相关，那么针对这些相关性，可以提出两个问题：首先，这类患者肌肉中蛋白质丢失的原因是什么，其次如何才能阻止蛋白的丢失。各相关研究证实，慢性肾脏病（CKD）患者肌肉萎-7- 第二军医大学硕士学位论文缩的发生，是多种复杂机制共同参与的结果，主要包括损伤胰岛素／胰岛素样生长因子-（IInsulin-likegrowthfactor-I,IGF-1）这一细胞内促进蛋白合成的重要信号通路，并刺激ATP-依赖的泛素蛋白酶系统（ATP-dependentubiquitinproteasomesystem，UPS）蛋白降解的信号通路[4-6]；慢性肾脏病（CKD）时体内多是酸中毒状态，联合体内糖皮质激素分泌增加，共同刺激体内蛋白降解的酶系统激活；同时，白介素-6（IL-6）等多种炎症因子的激活，造成机体高代谢，加上慢性肾脏病（CKD）患者不能完全吸收所摄入的蛋白质，体内必需氨基酸量不足，动用储存的肌肉蛋白，长期病变下，患者肌肉蛋白被大量消耗，肌肉质量减少，最终导致了严重的肌肉萎缩的发生[7,8]。目前，临床上用于检测肌肉萎缩的标志性蛋白，主要为E3泛素连接酶指环肌蛋白-1（E3ubiquitinligasemuscleringfinger-1protein，MuRF1）和肌肉萎缩F-box（MAFbx，又名Atrogin-1）[9]，虽然对肌肉萎缩已经进行了大量的研究，但目前仍然没有确定控制骨骼肌萎缩的分子机制、涉及的信号转导通路和目前有效可以防止，衰减或逆转肌肉萎缩的治疗方法。而且，虽然对慢性肾脏病（CKD）导致肌肉萎缩的传统机制有了一定程度上的了解，但目前并没有较好的干预措施，因此，想要攻克慢性肾脏病（CKD）肌肉萎缩这一难题，就需要不断探索新的机制。值得注意的是，UPS在激活机体蛋白水解酶系统时，需要消耗大量能量的；线粒体作为机体半自主细胞器，是机体细胞所需能量的主要来源。线粒体是双层膜结构的动力性细胞器，它的形状、数量及细胞内的分布都反应了机体代谢的状态。生理状态下，线粒体为棒状样结构，但可以进行裂变（Fission）和聚变（Fusion）[10]。线粒体的Fission是指一个线粒体变成两个线粒体，并且外膜完全分离；线粒体的Fusion是指两相邻线粒体靠近，两外膜逐渐融合，内膜最后融合，并最终变成一个线粒体的过程。线粒体的Fission和Fusion是线粒体抵抗外界刺激的手段，两者之间存在稳定的平衡关系，一旦两者平衡被打破，就会导致线粒体功能紊乱[10,11]。而且，有研究已经证实，线粒体动力学异常，导致线粒体功紊乱，并且在糖尿病、肿瘤等消耗性疾病的发生发展中得到证实。在给予炎症、高糖刺激时，过量线粒体的Fission可导致体内活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）的大量释放和细胞坏死，此时，作为维持线粒体Fission的重要蛋白-线粒体动力相关蛋白-1（Dynamin-rerelatedprotein-1，Drp1）表达上调[12,13]，但具体机制尚不清楚。目前已有多个参与线粒体裂变和聚变的蛋白得到大家的证实及认可，这些蛋白大多是线粒体功能特异性蛋白。Drp1在线粒体裂变过程中，发挥关键作用。线粒体裂变蛋白1（Fissionprotein1,Fis1）定位于线粒体双层膜的外膜,当线粒体裂变时，可以招募Drp1。Drp1组装到Fis1蛋白的周围，形成可收缩的膜结构，从而诱导线粒体裂变的发生[14]。参与线粒体聚变融合过程的，主要为线粒体外膜上的线粒体聚-8- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究变蛋白1和2（Mitofusinprotein1，2，Mfn1，Mfn2）[15]。Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶-1（Rho-associatedcoiledcoilformingproteinkinase1，ROCK1）是RhoA激酶的下游活性调节分子，在应力纤维的形成，ROS的产生，细胞坏死方面发挥重要作用[16,17]。有研究证实，高糖诱导ROCK1激活，参与足细胞和肾小管上皮细胞中线粒体的裂变[11]，并参与糖尿病鼠蛋白尿的发生发展，而且通过给予ROCK1的抑制剂-法舒地尔（Fasudil）可以改善糖尿病肾病（DiabeticNephropathy，DN）老鼠蛋白尿的发生情况，且检测该DN老鼠的ROS明显减低，具体机制，目前并没有详细的报道。法舒地尔（Fasudil）是ROCK1的非选择性抑制剂，目前临床上主要用于改善心脑血管，并没有应用于改善肌肉萎缩[16]。因此，明确Fasudil对肌肉萎缩是否有效，可为临床提供新的治疗靶点，为改善慢性肾脏病（CKD）肌肉萎缩的发生发展提供方法。我们课题组前期的实验证实，慢性肾脏病（CKD）中，ROCK1激活后参与肌肉萎缩的发生[18]，但并没有探究其具体机制。为了解决这一问题，本课题研究旨在明确，ROCK1激活后，通过介导线粒体Fission异常，导致线粒体功能紊乱，ROS释放增加，并最终参与肌肉萎缩。本研究证实，ROCK1在慢性肾脏病（CKD）中激活后，刺激Drp1高表达，介导线粒体Fission增加，线粒体功能紊乱，ROS释放增加，蛋白合成减少，最终导致肌肉萎缩，Fasudil作为ROCK1的抑制剂，能够明显改善慢性肾脏病（CKD）肌肉萎缩的发生。课题设计一、体内实验（一）实验动物雄性C57BL／6J小鼠40只，9周龄，20-25克；实验造模前，给予普通饲料喂养，造模后给予高蛋白饲料喂养；实验所用小鼠均购买自美国JacksonLaboratory，并饲养于美国BaylorCollegeofMedicine（贝勒医学院）。所有动物实验的操作，均按照严格的操作步骤进行，并通过贝勒医学院动物伦理委员会审核。（二）实验流程1.动物模型建立及实验分组C57BL／6J小鼠，给予普通饲料喂养1周后，分为2组：1）假手术组（WT组）20只，进行肾脏包膜剥除术，2）CKD组20只，行肾脏部分切除术，两组老鼠随机分配，普通饲料配对饲养；1月后，分成4组:1）假手术组（WT组）8只，腹腔注射生理盐水，3次／周，持续8周，高蛋白饲料喂养；2）假手术+Fasudil组（WF组）8只，腹-9- 第二军医大学硕士学位论文腔注射Fasudil（Selleckchem货号s1573）30mg/kg/次，3次／周，持续8周，高蛋白饲料喂养；3）CKD组8只，腹腔注射生理盐水，3次／周，持续8周，高蛋白饲料喂养；4）CKD+Fasudil组（CF组）8只，腹腔注射Fasudil（30mg/kg/次，3次／周，持续8周，高蛋白饲料喂养。实验过程中，每两周测量一次老鼠体重。2.标本留取（1）血尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）测定WT组和CKD组老鼠在手术后1月，用10％水合氯醛腹腔注射后麻醉小鼠，尾静脉取血，离心（4℃，3500rpm，10min）后取上清，使用UreaAssay试剂盒(USA,abcam,ab83362)测定血清BUN和Creatinine试剂盒(酶法)（DiazymeLaboratories）测定血清Cr；给予Fasudil处理老鼠8周后，用10％水合氯醛，腹腔注射后麻醉小鼠，采用眼球取血，再次测定血清BUN和Cr。（2）心脏灌注处死实验动物4组小鼠按照实验处理8周后，用10％水合氯醛，腹腔注射后麻醉小鼠，先由上腹部切口，打开胸腔，在右心耳处，剪一小口，于心尖处插入心脏灌注针，运行心脏灌注泵，泵内为生理盐水。观察实验鼠肝脏变白，停止灌注。（3）收集实验鼠肌肉标本实验鼠心脏灌注结束后，取腓肠肌（Gastrocnemius，GAS），股四头肌（Quadriceps，Q），放于液氮中，之后转入-80度冰箱保存；使用OCT包埋胫骨前肌（Tibialisanterior，TA）（保持生理长度下）、比目鱼肌（Soleus，SOL）、趾长伸肌（Extensordigitorumlongus,EDL），制备冰冻切片，用于组织染色。用游标卡尺测量小鼠胫骨长度。（三）观察指标1.体重：每两周使用电子秤，称量小鼠体重，评估实验结果。2.胫骨长度：实验最后收集标本时，用游标卡尺测量小鼠胫骨长度。3.生物化学指标：用UreaAssay试剂盒及Creatinine试剂盒(酶法)分别测定血清BUN和Cr。4.肌肉横截面积测量：冰冻切片，免疫荧光染色，评估实验各组肌肉萎缩情况。5.Westernblot检测：肌肉ROCK1,MuRF1,Atrogin1，Drp1，p-Drp1等的表达；6.Real-timeqPCR检测：肌肉ROCK1,MuRF1,Atrogin1，Drp1，Fis1等mRNA的表达；-10- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究二、体外实验（一）细胞培养体外实验所用细胞为C2C12成肌细胞，该细胞在添加有10%胎牛血清(FetalBovineSerum,FBS,Gibco，US,ThermoFisher，货号1082147)，盘尼西林（200单位／ml），链霉素（50ug／ml，LifeTechnologies）的DMEM(Hyclone，logan，UT)中分裂增殖；当C2C12成肌细胞生长密度达到90%时，更换为添加有2%马血清(Horseserum，HS，Bibco，NewZealand.ThermoFisher，货号26050088)，盘尼西林（200单位／ml），链霉素（50ug／ml，LifeTechnologies）的DMEM(Hyclone，logan，UT)诱导细胞分化成熟为肌小管细胞。每隔2-3天更换一次培养基。实验所用细胞购买自ATCC（AmericantypeCulturecollection）细胞库。（二）病毒感染细胞分组分化成熟的C2C12肌细胞给予不同腺病毒载体刺激，1）Ad-GFP组，给予腺病毒载体-GFP(AAV-GFP，5nmol／l)；2）Ad-ROCK1组，给予腺病毒载体-ROCK1(AAV-ROCK1,5nmol／l);3)Ad-GFPF组，在给予GFP的前提条件下，给予Fasudil(10umol/l)刺激；4）Ad-ROCK1F组，在给予AAV-ROCK1前提下，给予Fasudil(10umol/l)刺激。各组病毒刺激持续48小时。通过细胞能量代谢分析仪（Seahorse）评估C2C12成肌细胞在不同刺激条件下时，细胞呼吸过程中耗氧量及产酸率的改变情况；通过染色，证实ROCK1过表达对C2C12成肌细胞线粒体形态和功能的影响；检测各组肌萎缩相关蛋白及线粒体裂变相关基因的表达的变化情况。各组病毒均刺激细胞48小时。实验所用AAV-ROCK1,AAV-GFP由美国Dr.jiangchang实验室提供。（三）观察指标1.细胞呼吸能量代谢分析（Seahorse）：实验细胞按照实验目的给予不同刺激后，检测细胞在不同刺激条件时线粒体应激的变化，从而明确ROCK1过表达后引起细胞基础呼吸、最大呼吸、额外呼吸及ATP产生量的多少。2.Westernblot检测：检测C2C12细胞ROCK1,MURF1,Atrogin1，Drp1的表达；3.PCR-Array检测：检测C2C12细胞给予ROCK1刺激后，引起线粒体Fission和Funion相关蛋白的改变；4.Real-timeqPCR检测：验证PCR-Array检测到线粒体Fission和Funion相关蛋白mRNA的表达；-11- 第二军医大学硕士学位论文三、统计学处理实验所得数据均以均数±标准差（±S）表示，结果用SPSSl8.0统计软件进行分析。两组间比较采用t检验，多组样本比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。实验装置与方法一、实验仪器与耗材PCR扩增系统（CFX96Touch™荧光定量PCR）（美国Bio-Rad公司）PCR热循环仪（美国Bio-Rad公司）96孔PCR反应板（美国Bio-Rad公司）96孔PCR反应板覆盖膜（美国Bio-Rad公司）逆转录8排管及盖子（美国Bio-Rad公司）电泳仪、电泳槽、电转膜装置（美国Bio-Rad公司）SeahorseXFe24Analyzer(美国Agilenttechnologies)ABl04-N型电子秤(美国Mettler-Toledo公司)透射电镜（日本日立公司）旋涡振荡器（美国scientificIndustdustries）化学发光分析仪扫描成像（美国Bio-Rad公司）游标卡尺（美国艾.麦斯科公司）Westernblot曝光膜（美国ThermFisher公司，货号：34088）Westernblot发光液（美国ThermFisher公司，货号：32106）硝酸纤维素膜（NC膜，美国ThermFisher公司）滤纸（美国ThermFisher公司，货号3030-6189）细胞培养6孔板，12孔板，培养皿（美国ThermFisher公司）Seahorse24孔细胞培养板（美国Agilenttechnologies）.Seahorse24孔细胞校准板（美国Agilenttechnologies）SeahorseXF培养基（美国Agilenttechnologies1.5ml离心管（美国VWR公司，货号MCT-150-C-S）Eppendorf移液器（德国艾本德公司）0.5-10ul、20-200ul、100-1000ul移液器滴头（美国ThermFisher公司）手套（美国Cobalt公司，货号N191）ImageJ软件（美国）Adobephotoshop（美国Adobe公司）Graphpadprsism7（美国公司）SPSS18.0统计软件（美国IBM公司）-12- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究二、实验试剂胎牛血清(美国，Gibco公司，货号1082147)，盘尼西林、链霉素（LifeTechnologies）DMEM(美国Hyclone公司)马血清(新西兰ThermoFisher公司，货号26050088)WB胶、RunningBuffer、transferbufferBlockingbuffer(美国Bio-Rad)磷酸化P-Drp1兔抗体(Ser616)（美国CST公司，货号3455）DRP1(D6C7)兔抗体（美国CST公司，货号8570）β-Actin兔抗体（美国CST公司，货号8570）GAPDH(14C10)兔抗体（美国CST公司，货号2118）Dystrofin、DAPI荧光抗体（美国Sancruze公司）辣根过氧化物酶标记（HRP）-兔、鼠二抗（美国CST公司）细胞氧化应激检测试剂盒(美国Abcam公司，货号ab186029).线粒体应激试剂盒（美国Agilenttechnologies）线粒体Mitotacter、SOXRed染色试剂盒（美国ThermFisher公司）逆转录cDNASuperMix（美国QuantaBioSciences，货号95048-100）WB蛋白Marker（美国Bio-Rad公司，货号61-0373）RT-PCRSYBR®GreenSuperMix（美国QuantaBioSciences公司，货号95054500）RIPA裂解液、TRIzol®试剂（美国G-bioscience公司）胰酶（美国cellgro公司）氯仿、异丙醇、无水乙醇等（美国ACS公司）三、实验方法（一）肾脏部分切除术1.麻醉：给予C57BL／6小鼠10%的水合氯醛（50mg／kg）腹腔注射麻醉；2.备皮：剔除右肾周围皮毛，酒精消毒，逐层切开分离肌肉，暴露视野；3.肾切除术：用弯镊取出右侧肾脏，立即用血管钳夹住肾盂处，阻断肾动脉入肾的血流；以肾脏大弯中点为基准，用组织剪剪除肾脏上1/3及下1/3，面积大约70%左右；之后用棉棒蘸取Vetbond组织胶（3M,st，Paul，MN）在肾脏切面止血，松开血管钳，观察止血情况是否完全，待完全止血后，将肾脏送回腹腔（防止强行归位造成出血）；4.关腹：对合肌肉层缝合，消毒切口周围，之后用订皮机关闭腹腔，将老鼠-13- 第二军医大学硕士学位论文放在电毯上保暖，老鼠清醒后放回饲养笼内。一周之后，切除老鼠左侧肾脏（具体步骤不详细说明），致此，老鼠切除5/6肾脏，完成肾脏部分切除术，建立CKD模型。（二）线粒体应激（Mito-stress）seahorse检测1.细胞种板：将C2C12细胞用胰酶消化后，按每细胞数目孔2.3-2.5万个，均匀种到seahorse细胞培养板，所用培养基为10%FBS。2.诱导细胞分化：镜下观察C2C12细胞生长密度达90%后，更换seahorse细胞培养板中培养基为2%HS。3.刺激：镜下观察C2C12细胞拉条成熟后，给Ad-GFP,Ad-ROCK1,Ad-GFP+Fasudil，Ad-ROCK1+Fasudil分别刺激48小时。4.检测准备：根据实验分组，细胞刺激48小时后进行上机测量，在测量的前一天，添加1ml的Seahorse探头校准液到Seahorse测量板中进行水化，放于37℃，无二氧化碳的温箱中过夜。3）洗细胞及加各种药物刺激：按照进行Mito-Stress(线粒体应激)测定的目的，使用相应的培养基洗细胞后加入上机检测所需要的培养基，之后放于37℃，无二氧化碳的温箱中45-60分钟；根据实验目的，在Seahorse测量板的A孔中加入Oligomycin（寡霉素，是线粒体电子呼吸链中复合体V-ATP合酶的抑制剂，可导致细胞氧耗量的减低），B孔中加入FCCP（Carbonylcyanide-4（trifluoromethoxy）phenylhydrazone，线粒体呼吸链解耦连剂，作用于线粒体内膜，去除线粒体内外膜之间的质子势能，造成细胞耗氧量增加），C孔中加入Antimycin（抗霉素A，是线粒体电子呼吸链中复合体III的抑制剂，可引起细胞耗氧量的减低）。5.上机检测：将Seahorse测量板放在XF24的Seahorse测量机上校准后，放入处理好的细胞培养板，设定程序为Mito-Stress，进行相应的步骤。收集实验结果，在seahorse分析软件上分析数据，并进行统计分析。（三）肌肉冰切片组织学检测1.肌肉组织冰冻切片制备步骤（1）速冻组织后包埋：实验处理结束，收集动物肌肉标本时，将SOL、EDL铺平后放于软塑料盖内（直径2cm），加OCT包埋剂浸没组织，然后将小盒缓慢平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时保持小盒原位浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。分离EDL后，使用细长塑料薄片插入TAyu与胫骨之间，将胫骨完整取下，保持TA生理长度，用镊子夹住胫骨一端，放入液氮的小杯内，当无气化声音时取出，放入OCT中，迅速放回液氮中，完全凝固后取出。将制作好的标本放置-80℃冰箱保存。-14- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究（2）切片：-80℃冰箱取出制作好的标本放入干冰中，转移至恒冷切片机内。所切冰冻切片厚度为4-8mm。（3）保存：冰冻切片吹干后，储存在-80℃冰箱冰箱内。2.肌肉组织冰冻切片免疫荧光染色（Immunoflurescence，IF）步骤（1）固定：取出保存的冰冻切片，室温放置30分钟后，放入入4℃丙酮中固定10分钟。（2）冲洗：在PBS中洗5分钟×3次。（3）内源性过氧化物酶的阻断：用3%过氧化氢孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。（4）冲洗：在PBS中洗5分钟×3次。(5)封闭：使用封闭液室温封闭20分钟。（6）一抗：甩掉封闭液，勿洗，滴加1:300稀释的Dystrofin4℃过夜。（7）冲洗：甩掉一抗，在PBS中洗5分钟×3次。（8）二抗：按1:500稀释荧光二抗，室温孵育30分钟。（9）冲洗：甩掉二抗，在PBS中洗5分钟×3次。（10）封片：将含有DAPI抗体的封闭液滴到切片上，盖上盖玻片，镜下观察。（四）线粒体Mito-Tracter，Mito-soxRed染色1.试剂溶解：按照说明书，加入DMSO溶解试剂，取适当量，加入到DMSO中，最终Mito-Tracter浓度为500nmol／l，Mito-soxRed为5umol／l。2.染色：替换原来12孔板中的细胞培养基，使用PBS冲洗一遍后，加入混有Mito-Tracter，Mito-soxRed染料的DMEM,放回37℃温箱中，15分钟左右取出。3.冲洗：替换掉混有Mito-Tracter，Mito-soxRed染料的DMEM，使用PBS洗2分钟×3次，避光操作4.封片：将含有DAPI抗体的封闭液滴到切片上，盖上盖玻片，镜下观察。（五）Westernblot（蛋白免疫印记）检测肌肉及细胞中内肌肉ROCK1,MuRF1,Atrogin1，Drp1等的表达；1.肌肉组织总蛋白的提取:(1)称重：取25-30mg肌肉组织称重后放入平底玻璃管中；(2)研磨：按1:15加入RIPA裂解液于平底玻璃管中，使用匀浆器匀浆1-2分钟；(3)离心：在4℃，离心机13600rpm条件下，离心15分钟；将上清液转移到-15- 第二军医大学硕士学位论文新的离心管中；（4）加入巯基乙醇及6xloadingbuffer；（5）99℃煮5分钟后，置于-20℃保存。2.SDS－PAGE电泳（1）取出所买10％分离胶，4%浓缩胶，用清水漂洗一遍；（2）上样：拔出梳子后，用自来水冲洗每个梳孔，将所提蛋白及蛋白Marker加到梳孔中；（3）电泳：先以电压100V跑电泳15分钟，使蛋白跑到浓缩胶和分离胶交界,调整电压为150v，直至蛋白跑出分离胶下缘；（4）转膜:恒定100v电压，转膜90分钟；（5）封闭:取出NC膜，加上购买的成品封闭液，室温摇床上封闭30分钟；（6）加一抗:使用封闭液稀释抗体:抗ROCK1(1:1000)、抗MuRF1(1:500)、抗Atrogin1(1:1000)、抗Drp1（1:1000），抗p-Drp1（1:1000），4℃孵育过夜；（7）洗膜:去掉一抗，使用TBST溶液，在摇床上洗5分钟×3次；（8）加二抗:HRP标记的羊抗兔IgG(1:2000稀释),室温孵育1小时，HRP标记的羊抗鼠IgG（1:5000）稀释，室温孵育1小时；（9）洗膜:去掉二抗，使用TBST溶液，在摇床上洗5分钟×3次；(10)显色:将显色试剂盒中的A和B两种试剂等体积混合,滴加于NC膜上,反应1分钟后,于暗室内，使用化学发光分析仪扫描成像。(11)分析:用imageJ软件对Westernblot的条带进行定量分析。细胞蛋白仅是最初开始提蛋白时，使用2xLoadingbuffer直接提取，99℃煮5分钟后，置于-20℃保存；之后的WB的步骤与组织相同。（六）Realtime-qPCR检测肌肉及细胞中内肌肉ROCK1,MuRF1,Atrogin1，Drp1等的表达1.使用Trizol提取肌肉组织总RNA取25-30mg肌肉组织放于离心管中，在平底玻璃管中加入1mL的Trizol液；之后将离心管中的肌肉组织快速倒入平底玻璃管，使用匀浆机匀浆45秒，立即放于冰上，孵育15分钟；之后加入200μL氯仿，盖紧离心管，用震荡器剧烈摇荡离心管至管内液体成淡粉色，冰上放置10分钟。之后4℃，13600rpm/min,离心15分钟；取上清400ul于新的离心管中，加入600μL的异丙醇，震荡器剧烈摇荡离心管混合均匀，4℃静置1小时，之后行4℃，13600rpm/min,离心15分钟。弃去上清液，-16- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究加入1000ul75%的无水乙醇（750μL无水乙醇+250μLDEPC水）漂洗，行4℃，13600rpm/min,离心5分钟；弃上清，再加入1000ul75%的无水乙醇，漂洗沉淀，行4℃，13600rpm/min,离心5分钟；弃上清，室温干燥10分钟至沉淀透明；加入大约50-60ulDEPC水溶解RNA，大约10分钟，至RNA完全溶解肉眼不可见。溶解后，测RNA浓度，之后按照浓度进行下游实验，剩余可放置于-80℃冰箱保存。2.逆转录反应体系：20ul，所加入的总RNA（x）=700ng／实际所测浓度;cDNASuperMix4x：4ul；总RNA(x)：xul无酶水：16-xul反应程序：25℃5分钟，42℃30分钟，55℃5分钟，4℃5分钟。3.Real-timeqPCR扩增将逆转录好的cDNA稀释10倍后，用于Real-timeqPCR扩增所用引物如下:ROCK1PrimerF5'-GATGACCGGTATCTCTACATGG-3'PrimerR5'-GTCCAGACTTATCCAGCAGCA-3'（198bp）Atrogin-1PrimerF5'-GAGGCAGATTCGCAAGCGTTTGAT-3'PrimerR5'-TCCAGGAGAGAATGTGGCAGTGTT-3'（165bp）MuRF1PrimerF5'-AGTGTCCATGTCTGGAGGTCGTTT-3'PrimerR5'-ACTGGAGCACTCCTGCTTGTAGAT-3'（178bp）Drp1PrimerF5'-AGAGCTCAGTGCTGGAAAGC-3'PrimerR5'-GGTGTCTTGAGTTTTTCCATGT-3'（168bp）Fis1PrimerF5'-GGTGGTCAGGAACCAACAAC-3'PrimerR5'-CCTCACAATCTCGCTGTTCTC-3'（198bp）MffPrimerF5'-CTCTGGCACTGAAAACACCA-3'-17- 第二军医大学硕士学位论文PrimerR5'-GCGAACAGCATTTTCACTCA-3'（157bp）GAPDHPrimerF5'-ATCACTGCCACCCAGAAG-3'PrimerR5'-TCCACGACGGACACATTG-3'（191bps）实验过程中，将PrimerF和PrimerR各取10ul加到80ul无酶水中混匀使用；扩增反应体系如下：SYBRGreenMix：5μL引物混合物：1μL无酶水：3μLcDNA模板：2μL总体积：10μL反应程序：95℃10分钟；（95℃15秒，60℃45秒）×40个循环；95℃15秒，60℃1分钟；，95℃15秒，60℃15秒。将所的数据采用EXCEL及Graphpadprsism7分析。实验结果一、慢性肾脏病（CKD）导致肌肉萎缩（一）CKD组老鼠体重、肌肉重量、肌纤维横截面积分布与WT组老鼠存在明显差异1.CKD组老鼠体重较WT组老鼠体重明显下降，肌肉重量减少（1）本研究通过5/6肾脏切除术，构建CKD模型，并且通过给予高蛋白饮食促进CKD成模型，手术1月后，检测两组BUN、Cr水平（表1），根据表中结果可知:CKD组老鼠，血BUN、Cr较假手术组（WT组）明显升高，差异具有统计学意义（p<0.01）；表1.CKD组和WT组BUN和Cr比较-18- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究（表中所示数据为均数±标准差，**P<0.01vsWT组，n=16）（2）本研究在实验过程中，称量两组老鼠体重。CKD组老鼠，在实行5/6肾脏切除术初期，与WT组相比，体重增长无明显差异；CKD持续时间越久，老鼠体重的增长逐渐成下降的趋势（图1A）；实验结束，收集老鼠肌肉称重，CKD组SOL、EDL、TA、GAS均较WT组重量减轻，各肌肉重量的减少，差异均有统计学意义。AB图1.CKD组与WT组体重及肌肉重量变化A:CKD组与WT组两组体重增长变化趋势；B：CKD组肌肉重量较WT组明显减少,差异具有统计学意义；（*P<0.05或**p<0.01vsWT组，n=8）。2.CKD组与WT组相比，肌纤维横截面积明显左移实验结束后，收取两组TA包埋后切冰冻切片，行Dystrofin免疫荧光染色，CKD组纤维横截面积较WT组明显变小（图2.A），肌纤维横截面积分布图中（图2.B），CKD组肌纤维横街面积大多分布于1000-1400（μm2）范围内，较WT组的1200-1600（μm2）范围，明显左移。AB图2.CKD组与WT组肌纤维横截面积比较A：Dystrofin免疫荧光染色示两组肌纤维横截面积大小；B：根据A图中肌纤维横截面积的大小，绘制的肌纤维横截面积分布图。3.CKD组老鼠肌肉萎缩相关蛋白表达明显增加Westernblot检测两组老鼠GAS中ROCK1以及肌萎缩相关蛋白MuRF1、-19- 第二军医大学硕士学位论文Atrogin1的表达，结果如（图3.A）示：CKD组老鼠ROCK1蛋白表达增加,130kd的活性片段被激活，同时MuRF1、Atrogin1的蛋白及mRNA表达也明显增加(图3.A，B)。AB图3.CKD组与WT组GAS中肌萎缩相关蛋白表达A：Westernblot示，CKD组ROCK1、MuRF1、Atrogin1蛋白表达水平增加，两组定量比较，差异具有统计学意义；B:CKD组MuRF1、Atrogin1mRNA表达增加，与WT组相比，差异具有统计学意义。（*P<0.05或**p<0.01vsWT组）。二、慢性肾脏病（CKD）激活ROCK1,导致线粒体裂变增加，促进肌肉萎缩的发生（一）CKD导致线粒体裂变异常1.CKD鼠线粒体裂变增加，Drp1表达增加电镜下观察，CKD组老鼠SOL中线粒体裂变增加，线粒体形态变小（图4.A）;Westernblot检测，线粒体裂变相关蛋白P-Drp1的表达增加（图4.B）。A-20- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究B图4CKD鼠线粒体裂变增加A:电镜下观察，CKD组鼠SOL中线粒体数目增加；B：Westernblot示：CKD组p-Drp1蛋白表达明显增加，两组蛋白定量比较，差异具有统计学意义（*P<0.05或**p<0.01vsWT组）。(二)ROCK1激活，增加线粒体裂变，影响细胞呼吸1.ROCK1激活，细胞中线粒体碎片化明显增加体外培养C2C12细胞，采用腺病毒过表达ROCK1，行Mito-tracter染色，显微镜下观察，ROCK1过表达组（Ad-ROCK1）较对照组（Ad-GFP）细胞中线粒体碎片化明显增加（图5）；图5.Mito-tracter染色示：ROCK1激活，线粒体数目增加，碎片化明显；2.ROCK1激活，线粒体裂变相关蛋白表达增加通过线粒体Assay分析，ROCK1过表达后，线粒体裂变相关蛋白Drp1mRNA表达增加，大约为1.75倍（图6.A）差异具有统计学意义;经过普通RT-qPCR验证，证明ROCK1过表达后，线粒体裂变相关蛋白Drp1mRNA表达增加（图6.B）。-21- 第二军医大学硕士学位论文AB图6.ROCK1激活，线粒体裂变相关蛋白Drp1表达增加A:线粒体array分析，ROCK1激活后Drp1mRNA表达增加；B：RT-qPCR证实，ROCK1过表达后Drp1mRNA表达增加，差异具有统计学意义（*P<0.05或**p<0.01vsAd-GFP组）。3.ROCK1激活，增加细胞呼吸，增加产酸量Seahorse分析结果表明，ROCK1过表达后，增加细胞基础呼吸，进行线粒体应激刺激时，ROCK1过表达组的耗氧量增加，OCR升高（图7.A,C），并且检测到细胞产酸量增加，ECAR增加（图7.B）；在线粒体应激刺激过程中，ROCK1促进细胞ATP的产生（图7.D），以上改变均有统计学意义。ABCD图7.ROCK1过表达，影响细胞呼吸A：Seahorse-线粒体应激实验：实验进行过程中，在不同的时间点，分别给予Oligomycin、-22- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究FCCP、Antimycin这些线粒体呼吸链解偶联剂或去膜电势能的药物，在一定程度上反应，ROCK1增加细胞呼吸，增加线粒体用氧量；B：Seahorse-线粒体应激实验过程中检测产酸量；C、D:根据A所示结果，分析细胞呼吸的能力大小及分析ATP产生多少及细胞呼吸形式（*P<0.05或**p<0.01vsAd-GFP组）。其中，图C、D中基础呼吸、最大呼吸、额外呼吸、质子泄漏、ATP释放量，非线粒体呼吸的计算方法如下图所示。(本图应用自Seahorse官网)http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf)Seahorse数据图看图指导：首先是耗氧量（OCR）的测定，在加oligo之前显示的数值，代表的是细胞的基础耗氧量，可认为是基础呼吸，主要包括线粒体氧化磷酸化及质子漏出所消耗的氧-即质子经线粒体膜上呼吸链传递，形成一侧高电势，趋使一部分质子回流，通过ATP合酶形成ATP，将势能转化为ATP中的能量。一部分通过线粒体膜但是只是发生氧化，势能转化为热量，但是没有用于合成ATP。Oligo是ATP合酶抑制剂，加入此药后，OCR减少代表的是机体用于ATP合成的耗氧量，间接显示此时细胞的ATP产量。FCCP是一种解偶联剂，作为一种质子载体使得大量质子回流，大量耗氧，但是这种质子回流不能形成ATP，FCCP后耗氧的增加，代表线粒体的最大耗氧能力，间接显示最大的呼吸能力，而其与基础呼吸的高值，代表呼吸潜力。最后加入是抗霉素，作为呼吸链抑制剂，完全阻止线粒体耗氧。产酸量（ECAR）测定：基础值代表的是细胞的非糖酵解产酸值，加入oligo后，氧化磷酸化被抑制，此时细胞完全靠糖酵解供氧，此时产酸增加，增加值代表细胞的还具有的糖酵解能力即潜力，总的数值代表细胞的最大糖酵解能力。-23- 第二军医大学硕士学位论文（三）ROCK1过表达，线粒体氧化应激激活，ROS产生增加C2C12细胞给予腺病毒载体-ROCK1过表达刺激后，ROS产生增加（图8.A）;Mito-Soxred染色结果表明，ROCK1过表达后，线粒体ROS产生增加（图8.B）。AB图8.ROCK1过表达，刺激细胞ROS的产生A：ROS试剂盒检测：ROCK1过表达后，可引起与H202(5μmol／l)刺激后引起ROS升高相类似的结果；B：Mito-Soxred染色所示：ROCK1过表达后，线粒体体ROS产生增加（因为Mito-Soxred是专门染产生ROS的线粒体）（**p<0.01vsAd-GFP组）。三、Fasudil阻断ROCK1过表达所致细胞呼吸异常，改善CKD所致肌肉萎缩的发生(一)Fasuidl阻逆ROCK1过表达所致细胞呼吸异常Seahorse检测，线粒体在给予Oligo、FCCP、antimycin后，呈现应激，结果所示，Fasudil能够改善ROCK1过表达所致的细胞基础呼吸增加，线粒体高耗氧量的状况（图9），并且Ad-GFP组给予Fasudil刺激后，对细胞呼吸功能影响不明显；-24- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究图9.Fasudil阻逆ROCK1过表达所致细胞呼吸异常Seahorse-线粒体应激检测表明，Fasudil降低ROCK1过表达所引起的细胞高耗氧量，并不影响细胞基础呼吸。(二)Fasudil下调ROCK1引起的Drp1表达ROCK1过表达的C2C12的细胞，给予Fasudil刺激，Westernblot结果显示：Fasudil干预ROCK1过表达组的p-Drp1的蛋白表达减少，行蛋白定量分析，差异具有统计学意义（p<0.05）；Fasudil干预Ad-GFP组与Ad-GFP组相比，两组差异不具有统计学意义（p>0.05）（图11）。图10.Fasudil下调ROCK1引起的p-Drp1表达Westernblot示：Fasudil抑制ROCK1的同时能下调p-Drp1的表达，差异具有统计学意义；Fasudil对对照组影响较小，差异不具有统计学意义（*p<0.05vsAd-ROCK1+F组，**p<0.01vsAd-GFP组）。-25- 第二军医大学硕士学位论文（三）Fasudil抑制ROCK1表达，降低肌肉萎缩相关蛋白的表达，改善CKD老鼠肌肉萎缩情况Westernblot结果示：Fasudil抑制ROCK1活性，同时减少肌萎缩相关蛋白MuRF1、Atrogin1的表达（图11.A）；Fasudil能够改善CKD鼠肌纤维横截面积减少及肌纤维横截面积左移的情况（图11.B）.AB图11.Fasudil改善CKD时ROCK1激活参与的肌肉萎缩Awesternblot示：Fasudil抑制ROCK1活性片段的激活，同时减少肌萎缩相关蛋白MuRF1、Atrogin1的表达；B：TA冰冻切片，行dystrofin免疫荧光染色，镜下可见，Fasudil能够改善CKD鼠肌纤维横截面积减少及肌纤维横截面积的左移。分析与讨论众所周知，近几十年来，慢性肾脏病（CKD）及其合并症（代谢性酸中毒，糖皮质激素产生增多，再加上炎症以及胰岛素／IGF-1信号通路的损伤）能够刺激肌肉蛋白的丢失，增加CKD的发病率及死亡率[18]。目前，关于肌肉蛋白丢失的关注点，主要在于多种生物化学因素及信号通路异常所导致的肌肉萎缩。例如，肌肉特异性表达的E3泛素激酶，Atrogin-1/MAFbx，MuRF-1等增加已经与UPS激活蛋白酶水解系统相联系。此外，肌肉中胰岛素／IGF-1信号通路的缺失，已被认为是导致肌肉蛋白丢失的主要机制[16]。虽然，目前关于CKD肌肉萎缩的机制有了一定-26- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究的研究，但仍没有哪种机制被应用于临床，真正解决肌肉萎缩这一难题。前期培养C2C12细胞过程中，我们发现给予不同浓度的胎牛血清培养细胞，细胞的生长状态完全不一样。但并不是在越高浓度的血清中培养的细胞的生长就一定好，相反的，一定浓度范围内，较高浓度的血清培养的细胞一开始生长旺盛，到后期状态比较差；这是因为，细胞疯长后，消耗大量氧气及营养物质,产生许多酸性代谢产物，影响自身及邻近细胞生长。这给了我们实验最初的设想：是否在CKD病变进展过程中，也存在影响肌肉细胞呼吸的重要因素？线粒体是细胞呼吸供应能量的主要细胞器，是否能成为解决问题的关键呢？有趣的是，我们检索Pubmed发现，目前线粒体能量代谢异常，已证实参与糖尿病、肿瘤等其他恶病质的病变进展[11]，Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶-1（Rho-associatedcoiledcoilformingproteinkinase1，ROCK1）是RhoA激酶的下游活性调节分子，在应力纤维的形成，ROS的产生，细胞坏死方面发挥重要作用。有研究证实，高糖诱导ROCK1激活，参与足细胞和肾小管上皮细胞中线粒体的裂变，并参与糖尿病鼠蛋白尿的发生发展，而且通过给予ROCK1的抑制剂-法舒地尔（Fasudil），在一定程度上，可以改善糖尿病肾病（DiabeticNephropathy，DN）老鼠蛋白尿的发生情况；而且本实验前期研究中也发现，慢性肾脏病（CKD）可激活ROCK1，参与肌肉萎缩的发生和发展[18]，但具体的机制，当时并没有搞清楚，至此，我们提出实验假设:CKD时激活ROCK1,通过影响线粒体的功能，介导肌肉萎缩的发生和发展。为模拟体内CKD疾病环境，我们通过5/6肾脏部分切除术，构建CKD疾病模型[18]。通过尾静脉取血后检测BUN和Cr（表1）可知，CKD组小鼠BUN和Cr较假手术组（WT组）明显增加，差异具有统计学意义（p<0.01），证明CKD模型构建成功。临床观察，患有CKD的青少年及幼龄儿童患者，一旦出现蛋白消耗增加，消瘦乏力等表现，将严重影响患儿的生长及发育。同样的，本实验研究也发现，CKD组老鼠在实行5/6肾脏部分切除术的早期，其体重的增长与对照组没用明显的差异（图1.A），但随着病变进展，CKD组老鼠，体重的增长幅度越来越小，到最后为不增长，甚至持续下降，直至最后消瘦，呈现为恶病质状态。收集标本时观察到，两组老鼠肌肉重量存在明显差异(图1.B)。MuRF1和Atrogin1是目前公认的肌肉萎缩的标志性蛋白，在本研究中，CKD组与WT组比较，MuRF1和Atrogin1蛋白的表达增加（图3）。实验中，电镜下观察到CKD组鼠的SOL中的线粒体数目较WT组相对较多，但是体积偏小（图4）。线粒体作为机体唯一的半自助细胞器，拥有能够自身合成的遗传物质，其大小、数目，形态均是受严格控制的[10,11]。线粒体的裂变是指一个线粒体变成两个线粒体，并且外膜完全分离；线粒体的聚变是指两相邻线粒体靠近，两外膜逐渐融合，内膜最后融合，并最终变成一个线粒体的过程。-27- 第二军医大学硕士学位论文线粒体的裂变和聚变是线粒体抵抗外界刺激的手段，两者之间存在稳定的平衡关系，一旦两者平衡被打破，就会导致线粒体功能紊乱。但线粒体自身可以通过裂变和聚变来抵抗外界各种有害刺激，避免坏死或凋亡的发生。有研究已经证实，线粒体动力学异常或线粒体裂变和聚变失衡，导致线粒体功紊乱，并且已证实参与糖尿病、肿瘤等消耗性疾病的发生发展。既往研究表明，在给予炎症因子、高糖刺激时，过量线粒体的裂变，可导致体内活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）的大量释放，诱发细胞坏死和凋亡的发生和发展，此时，通过Westernblot检测发现，作为维持线粒体裂变重要蛋白-线粒体动力相关蛋白-1（Dynamin-rerelatedprotein-1，Drp1）的表达上调，但具体机制尚不清楚。目前已有多个参与线粒体裂变和聚变的蛋白得到大家的证实及认可，这些蛋白大多是线粒体功能特异性蛋白。主要包括参与线粒体裂变相关的Drp1，Fis1。Fis1本身定位于线粒体双层膜的外膜，当在线粒体裂变发生时，可以招募Drp1围绕其四周。等Drp1组装到Fis1蛋白的周围，形成可收缩的膜结构，从而诱导线粒体裂变的发生。而参与线粒体聚变融合过程的，主要为线Mfn1和Mfn2。为了明确，是否CKD时确实存在线粒体裂变以及ROCK1是否参与线粒体裂变激活的过程，线粒体裂变发生后对机体或细胞有何的影响，本研究在体外培养C2C12成肌细胞来验证实验设想。体外培养C2C12成肌细胞，并给予腺病毒载体-ROCK1刺激C2C12细胞，通过Mito-Tracter染色，证实C2C12成肌细胞在ROCK1过表达的情况下，细胞中线粒体数量增多，呈现碎片化趋势（图5）。随后，我们进行线粒体array分析（使用96孔板，同时检测线粒体相关蛋白的表达），实验结果示，ROCK1过表达后，对线粒体裂变所需相关蛋白的影响，可导致线粒体Drp1的mRNA增加（图6），为进一步明确实验证据，进一步通过普通RT-qPCR验证及westernblot检测证实,ROCK1过表达时，线粒体动力蛋白Drp1表达增加。Drp1、Fis1两者作为线粒体裂变相关的重要蛋白分子，尤其是Drp1这是线粒体裂变的关键分子，一旦某些有害刺激，导致该Drp1表达增加或磷酸化活性升高，可触发线粒体的大量裂变，这既是一种抵抗不良损伤刺激的生存方式，也在一定程度上会产生有害影响。线粒体作为机体半自主产能的细胞器，经过一系列氧化磷酸化及电子呼吸链传递电子，同时引起质子运转形成高电势，最终在电势能等驱动下，一部分质子回流，通过ATP合酶形成ATP，将势能转化为ATP中的能量。一部分通过线粒体膜,但是只是发生氧化，势能转化为热量，没有合成ATP。当线粒体裂变增加后，可在一定程度上，虽然增加线粒体双层膜的有效使用面积，扩大与氧气接触面，增加耗氧量，但在一定程度上，也会增加产酸率，导致细胞生存环境PH值减低，不利于细胞的生长和分裂增殖。而且，线粒体裂变在增加线粒体与氧气接触-28- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究面积的同时，也会增加质子经线粒体膜的回流，增加产热，缩短细胞的生存寿命。Seahorse是目前实验研究过程中，检测活细胞能量代谢的一项新兴技术，可动态检测活细胞对氧气的消耗及产酸。线粒体应激实验是通过在不同的时间点给予寡霉素，FCCP，抗霉素，用以检测细胞在进行不同处理后，对给予影响线粒体氧化呼吸链的药物的反应能力，从而来判断该细胞呼吸的差异，检测不同刺激条件下，线粒体的反应能力。本实验研究过程中，通过2%马血清诱导C2C12成肌细胞拉条成熟后，给以ROCK1病毒感染，实现细胞中ROCK1的过表达，再利用Seahorse的Mito-Stress分析来证实ROCK1对细胞呼吸的影响。正如实验结果所示：与对照组相比，ROCK1过表达后，增加C2C12成肌细胞的基础呼吸，加入寡霉素后，增加ATP的产生；给予FCCP后，提高细胞的最大呼吸能力，同时也增加了细胞的额外呼吸能力；最后给予抗霉素，并未引起非线粒体呼吸的改变（图7.A、C、D）.实验过程中，我们还发现，在给予FCCP时，Ad-ROCK1组氧耗量明显增加，同时伴有产酸量也明显增加（图7.A、B）。FCCP的作用主要是在线粒体内膜打洞，从而导致线粒体内外两层膜之间的堆积大量质子内流，消耗大量氧气，产生一定量的ATP及热量；结合ROCK1过表达后，线粒体裂变增加的现象，可以认为ROCK1诱导线粒体裂变，增加耗氧量，一定程度上增加ATP的生成量，同时也会导致产酸量的明显增加，有毒物质释放增加；这种高强度过量耗氧，对细胞来说是很严重的负荷；在一定程度上，增加了细胞做功量，最终导致细胞死亡。实验最后在电子显微镜下观察发现，ROCK1过表达的细胞，在进行Seahorse检测后，出现大量死亡的情况。因此可认为，ROCK1过表达后，诱发线粒体裂变，干扰细胞呼吸进程，释放有害物质，影响细胞的生存。在明确线粒体裂变可影响细胞呼吸外，本实验研究继续探究，线粒体裂变增加是否会触发线粒体内其它机制的异常。考虑到机体内ROS的产生主要在线粒体，加上进行线粒体array分析时发现，氧化应激相关的基因表达明显升高，本实验进一步探究ROCK1过表达细胞在引起线粒体裂变后，ROS的释放是否会有明显改变。实验研究过程中发现，用ROCK1病毒感染刺激细胞后，与阳性对照组引起ROS释放的结果相似，也引起ROS的释放量增加（图8A））；而且通过线粒体ROS特异性的Mito-soxRed染色发现，ROCK1病毒感染的细胞线粒体ROS的释放信号较对照组明显增强（图8B）。综上，我们认为，ROCK1激活后诱导线粒体裂变，干扰细胞呼吸，增加耗氧量及产酸量；同时，损伤线粒体，并且导致线粒体释放大量ROS，影响细胞本身的生命活动。既然ROCK1可诱发线粒体裂变异常，影响细胞呼吸及增加ROS释放，在一定程度上损伤细胞，因此，本实验研究进一步致力于探究ROCK1的抑制剂是否能够-29- 第二军医大学硕士学位论文阻断ROCK1激活后给细胞造成的各种不良后果。Fasudil是ROCK1的非选择性抑制剂，可在一定程度上阻断ROCK1的功能，目前临床上主要用于改善心脑血管循环。Fasudil已被证明能抑制心肌细胞凋亡引起的缺血/再灌注损伤，可以抑制糖尿病肾病时，体内高糖对心脏矩阵重构的影响[16]。因此，明确Fasudil对ROCK1激活后对细胞呼吸干扰及线粒体形态及功能的作用，将会给临床应对慢性肾脏病ROCK1激活所引起的一系列不良后果提供新的治疗方法和思路。本实验研究过长中发现，在给予Fasudil刺激后首先能够阻断ROCK1过表达对细胞呼吸的影响作用，降低细胞耗氧量（图9）及产酸量（结果未示）；同时Fasudil还可以阻断ROCK1对p-Drp1的激活（图10），从而实现阻断线粒体裂变所需关键蛋白的表达，从源头阻断线粒体的裂变；Fasudil能在抑制ROCK1活性同时减低肌萎缩相关蛋白MuRF1、Atrogin1的表达；而且，本实验研究，通过CKD动物模型的建立，在体内验证以上各种体外实验的结果。本研究结果证实，Fasduil干预的CKD老鼠，肌纤维横截面积有一定程度的增加，且肌纤维面积分布图向右移（图9），体内线粒体裂变蛋白的表达下降（结果未示）。因此可认为，Fasudil通过阻断CKD时激活ROCK1后所引起的一系列细胞呼吸代谢异常及细胞凋亡坏死，在一定程度上能够延缓CKD导致的肌肉萎缩的病变进展。流行病学调查研究发现，50-70%的CKD患者均有不同程度的肌肉萎缩或肌肉质量的减少，这类患者病变进展迅速，与不伴有肌肉萎缩的患者相比，更快进展为尿毒症期，最终需要依靠HD或PD，甚至是肾移植等替代治疗的方法来维持生命，在一定程度上严重增加了患者及社会经济、健康负担，同时也影响患者的生活质量和CKD的预后[19,20]。因为大多数肾脏病的发病都具有，发病隐匿，病理类型复杂，病变进展快慢不一的特点，许多就诊的CKD患者许多已经出现轻微的肢体消瘦、无力等肌肉萎缩的表现，加之患者不能规律饮食，摄入蛋白量不足或过量，以及合并伴发一些难治性高血压，恶性心衰，糖尿病肾病等合并症或伴发病，因错过早期干预治疗的最佳时期，这类患者临床预后效果非常差[5]。因此，发现肾脏病症状应尽早就医，是早期预防肌肉萎缩的发生的第一步。目前临床上关于CKD所致肌肉萎缩的防治措施主要有：适当运动，纠正代谢性酸中毒及难治性贫血，提倡优质低蛋白饮食，改善不良饮食习惯等[8,21,22]。但这些措施最终只是对CKD肌肉萎缩的一种补充治疗的措施，不能从根本上解决肌肉萎缩的病变进展。本实验研究，从慢性肾脏病时肌肉萎缩的病变机制出发，致力于明确肌肉萎缩发生和发展的原因。我们实验研究过程中所提出的的Fasudil改善肌肉萎缩，直接可以作为肌肉萎缩治疗的药物，为临床防治CKD肌肉萎缩发生提供了一种可能。而且Fasudil作为血管扩张剂，在神经科，心血管科等已经有了一定程度的使用[23]，这也为Fasduil能够成-30- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究功用于临床，改善CKD肌肉萎缩的进程中前进了一步。当然，实验中也有许多不足和欠缺的地方，比如未能通过阻断线粒体裂变来定量证实动物或细胞中蛋白合成下降和降解增加，未能在给予Fasudil刺激后检测蛋白合成和降解相关的信号通路的改变情况。希望继续本项目实验研究，将涉及到的具体机制弄清楚。本研究创新性提出并证实，当慢性肾脏病发生时，肌肉组织中ROCK1的表达明显增加；ROCK1激活后，影响细胞呼吸，增加细胞呼吸过程中的耗氧量及产酸量；并且ROCK1激活后通过诱导线粒体裂变增加，进而导致线粒体功能异常，细胞ROS释放增加，影响肌肉蛋白的合成，增加肌肉蛋白的降解，导致体内储存蛋白的减少，肌肉萎缩的发生。同时，针对本研究所提出的假说，可以根据Fasudi作为ROCK1的抑制剂，通过阻断ROCK1表达，改善ROCK1激活后所引起的细胞能量代谢异常，细胞呼吸耗氧量及产酸量异常，以及调节线粒体功能，维持线粒体形态，减少ROS释放，阻止体内氧化应激激活，促进体内蛋白合成减少，维持蛋白合成和降解平衡，从而实现临床防治慢性肾脏病肌肉萎缩，也为解决CKD导致肌肉萎缩这一难治性严重的并发症的带来了希望。结论肌肉萎缩是慢性肾脏病（CKD）严重的并发症，一定程度上增加CKDd额发病率和死亡率，严重影响患者的生活质量及疾病的预后，并给社会带来巨大经济和健康负担。实验证实，CKD时ROCK1表达增加，通过激活p-Drp1，诱导线粒体裂变增加；Seahorse分析，ROCK1过表达可以扰乱细胞呼吸平衡，具体表现为：增加细胞基础呼吸，提高线粒体对氧的消耗，加大细胞最大呼吸能力，但在一定程度增加酸的产生，形成高代谢的消耗状态；同时线粒体功能紊乱，ROS大量产生，蛋白合成受抑制。Fasudil作为ROCK1的抑制剂，可在一定程度上该善ROCK1激活所导致的线粒体裂变增加，并延缓ROCK1所导致的肌肉萎缩的进展，但关于ROCK1是如何激活Drp1的仍然需要进一步进行探讨和证明。但Fasudil是目前已经在临床上应用的药物，明确该机制，能够真正解决慢性肾脏病难治性肌肉萎缩，严重影响患者生活质量，影响生存率的困境。本实验证实了慢性肾脏病时ROCK1激活，通过诱导线粒体裂变，导致线粒体ROS产生增加，蛋白合成代谢受损，蛋白降解增加，导致储存蛋白的大量消耗，并最终导致肌肉萎缩发生及发展，Fasudil能够阻断ROCK1诱导线粒体功能异常所导致的肌肉萎缩的发生。-31- 第二军医大学硕士学位论文参考文献1.AndrewSLevey,J.C.,chronickidneydisease.Lancet,2012(379):p.165–80.2.Levey,A.S.,etal.,Definitionandclassificationofchronickidneydisease:apositionstatementfromKidneyDisease:ImprovingGlobalOutcomes(KDIGO).KidneyInt,2005.67(6):p.2089-100.3.Part4.DefinitionandClassificationofStagesofChronicKidneyDisease.AmericanJournalofKidneyDiseases5,2002.39(2):p.s46-s75.4.Workeneh,B.T.andW.E.Mitch,Reviewofmusclewastingassociatedwithchronickidneydisease.AmJClinNutr,2010.91(4):p.1128S-1132S.5.Yokoi,H.andM.Yanagita,Decreaseofmusclevolumeinchronickidneydisease:theroleofmitochondriainskeletalmuscle.KidneyInt,2014.85(6):p.1258-60.6.Wang,X.H.andW.E.Mitch,Mechanismsofmusclewastinginchronickidneydisease.NatRevNephrol,2014.10(9):p.504-16.7.JuanJesusCarrero,P.S.,LilianCuppari,T.AlpIkizler,KamyarKalantar-Zadeh,GeorgeKaysen,WilliamE.Mitch,S.RussPrice,ChristophWanner,AngelaY.M,EtiologyoftheProtein-EnergyWastingSyndromeinChronicKidneyDisease-AConsensusStatementFromtheInternationalSocietyofRenalNutritionandMetabolism(ISRNM).JournalofRenalNutrition,2013.23(2):p.77-90.8.Ikizler,T.A.,etal.,Preventionandtreatmentofproteinenergywastinginchronickidneydiseasepatients:aconsensusstatementbytheInternationalSocietyofRenalNutritionandMetabolism.KidneyInt,2013.84(6):p.1096-107.9.Romanello,V.,etal.,Mitochondrialfissionandremodellingcontributestomuscleatrophy.EMBOJ,2010.29(10):p.1774-85.10.Wang,W.,etal.,MitochondrialfissiontriggeredbyhyperglycemiaismediatedbyROCK1activationinpodocytesandendothelialcells.CellMetab,2012.15(2):p.186-200.11.Romanello,V.andM.Sandri,MitochondrialQualityControlandMuscleMassMaintenance.FrontPhysiol,2015.6:p.422.12.Otera,H.,N.Ishihara,andK.Mihara,Newinsightsintothefunctionandregulationofmitochondrialfission.BiochimBiophysActa,2013.1833(5):p.1256-68.13.Gao,H.,etal.,Rho-Kinaseinhibitorfasudilsuppresseshighglucose-inducedH9c2cellapoptosisthroughactivationofautophagy.CardiovascTher,2016.34(5):p.352-9.-32- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究14.Qian-YiLu,W.C.,LiLu,ZhiZheng,XunXu,ROCK1signalingpathwayinhyperglycemia-inducedmicrovascularendothelialdysfunctionindiabeticretinopathy.IntJClinExpPathol,2014.7(10):p.7268-7277.15.Peng,H.,etal.,CKDStimulatesMuscleProteinLossViaRho-associatedProteinKinase1Activation.JAmSocNephrol,2016.27(2):p.509-19.16.MasanoriTamaki,K.M.,ShuWakino,MasanoriMitsuishi,KoichiHayashi1andHiroshiItoh,Chronickidneydiseasereducesmusclemitochondriaandexerciseenduranceanditsexacerbationbydietaryproteinthroughinactivationofpyruvatedehydrogenase.KidneyInternational,2013(85):p.1330-1339.17.VivekanandJha,G.G.-G.,KunitoshiIseki,ZuoLi,SaraladeviNaicker,BrettPlattner,RajivSaran,AngelaYee-MoonWang,Chih-WeiYang,Chronickidneydisease-globaldimensionandperspectives.Lancet,2013(382):p.260-72.18.Sandsmark,D.K.,etal.,Proteinuria,butNoteGFR,PredictsStrokeRiskinChronicKidneyDisease:ChronicRenalInsufficiencyCohortStudy.Stroke,2015.46(8):p.2075-80.19.KirstinElgass,J.P.,MichaelT.Ryan,CatherineS.Palme,Recentadvancesintotheunderstandingofmitochondrialfission.BiochimicaetBiophysicaActa,2013(1833):p.150-161.20.Decleves,A.E.andK.Sharma,Noveltargetsofantifibroticandanti-inflammatorytreatmentinCKD.NatRevNephrol,2014.10(5):p.257-67.21.Hagmann,H.andP.T.Brinkkoetter,ROSandoxidativestressinCKDpatients:isitthemitochondriathatkeepsCKDpatientsinbed?NephrolDialTransplant,2015.30(6):p.867-8.22.Granata,S.,etal.,Mitochondria:anewtherapeutictargetinchronickidneydisease.NutrMetab(Lond),2015.12:p.49.23.SimonaGranata,A.D.G.,PaolaTomei,AntonioLupoandGianluigiZaza,Mitochondriaanewtherapeutictargetinchronickidneydisease.Granataetal.Nutrition&Metabolism,2015.12(49).24.Szeto,H.H.,etal.,MitochondriaProtectionafterAcuteIschemiaPreventsProlongedUpregulationofIL-1betaandIL-18andArrestsCKD.JAmSocNephrol,2016.25.Aparicio-Trejo,O.E.,etal.,Curcuminpreventsmitochondrialdynamicsdisturbancesinearly5/6nephrectomy:Relationtooxidativestressandmitochondrialbioenergetics.Biofactors,2016.26.Thomas,S.S.andW.E.Mitch,Mechanismsstimulatingmusclewastinginchronickidneydisease:therolesoftheubiquitin-proteasomesystemandmyostatin.ClinExpNephrol,2013.17(2):p.174-82.-33- 第二军医大学硕士学位论文27.Tamaki,M.,etal.,Chronickidneydiseasereducesmusclemitochondriaandexerciseenduranceanditsexacerbationbydietaryproteinthroughinactivationofpyruvatedehydrogenase.KidneyInt,2014.85(6):p.1330-9.28.Stangenberg,S.,etal.,Fetalprogrammingofchronickidneydisease:theroleofmaternalsmoking,mitochondrialdysfunction,andepigeneticmodfification.AmJPhysiolRenalPhysiol,2015.308(11):p.F1189-96.29.Tin,A.,etal.,AssociationbetweenMitochondrialDNACopyNumberinPeripheralBloodandIncidentCKDintheAtherosclerosisRiskinCommunitiesStudy.JAmSocNephrol,2016.27(8):p.2467-73.-34- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究综述慢性肾脏病与线粒体功能异常摘要线粒体作为机体内的多功能、半自主细胞器，是机体能量供应的主要来源。慢性肾脏病的高发病率，已经不能用传统发病机制解释，而线粒体功能异常，在某种程度上可以解释慢性肾脏病病变进展的原因。慢性肾脏病时，线粒体DNA（mtDNA）拷贝数的减少，线粒体膜势能的下降，造成线粒体释放大量活性氧，加重CKD病变进展，并进一步影响心血管疾病的发生和发展。同时，慢性肾脏病时，线粒体功能失调引发的异常代谢信号通路，前馈到细胞核促进肌萎缩的活化运动，另一方面，通过激活线粒体能量代谢和线粒体自噬改善线粒体功能。线粒体出现裂变和聚变失去平衡的状态，更进一步使得机体活性氧大量释放，影响体内蛋白质的合成，增加蛋白质的降解，促进肌肉萎缩及其他慢性肾脏病变的合并症的发生和发展。关键词慢性肾脏病，线粒体异常，氧化应激，线粒体动力学异常，肌肉萎缩慢性肾脏病（CKD）作为近年来的高发性疾病，全球发病率已达到8-16%[1,3],而且患病人口数还在不断增长中；肌肉萎缩作为慢性肾脏病（CKD）严重并发症，一定程度上增加慢性肾脏病（CKD）的发病率和死亡率，严重影响患者的生活质量预后。因此探究CKD的发病机制，以及导致CKD患者肌肉萎缩的原因，已成为临床防治CKD的首要任务。近年来，一系列研究都表明线粒体功能异常参与CKD的病变进展，但并没有完整的共识，因此，全面理解CKD与线粒体功能异常的相关性，能够及早采取干预措施，延缓CKD病变进展。线粒体是机体内的多功能细胞器，其主要功能是为细胞提供能量，同时也是机体活性氧（reactiveoxy-genspecies，ROS）的主要来源，参与包括坏死在内的多种细胞应激反应[24]。目前已知的与CKD病变及并发症进展相关的线粒体功能异常主要包括以下几点：线粒体诱导氧化应激可成为CKD治疗的新靶点线粒体在机体内主要通过氧化磷酸化系统，经电子呼吸链传递电子和质子，并最终产生能量，释放二氧化碳和水[25]。电子具体经过电子呼吸链上的5个复合体进行传递，但同时，在电子传递过程中，会有部分质子的泄漏，并最终转变成为超氧-35- 第二军医大学硕士学位论文游离基或活性氧（ROS），成为体内ROS的主要来源[26]。ROS产生增加后，可启动机体氧化应激的发生及进展，并且参与CKD病变进展。最近有研究表明，线粒体DNA（mtDNA）拷贝数的减少，线粒体膜势能的下降及ATP的产生降低参与了CKD的病变进展[24]。线粒体复合体IV在CKD患者中明显减少，这可以在一定程度上导致ATP的减少及加速氧化应激的发生，因为这些功能紊乱的细胞器，能够释放大量ROS，有趣的是，ROS可以通过激活NLRP3，进而导致CKD时的微炎症状态[27]。这种线粒体诱导NLRP3激活炎症的模式，在许多蛋白尿相关的损伤中有报道[15,26]。有几种机制在炎症NLRP3激活的基础已经被证实，包括离子通道门控，溶酶体破裂，和过量的活性氧的产生。通过增加ROS的产生对NLRP3激活的概念被广泛接受，认为NLRP3炎症小体可能是改变通用传感器。此外，线粒体作为细胞活性氧产生的主要来源，在对CKD病变进展方面的作用也需要被探讨，并且除外疾病本身刺激诱导线粒体ROS生成其合并症，如缺氧，细胞膜损伤，代谢率增加等，也在一定程度上影响ROS产生。线粒体功能障碍和动脉粥样硬化之间的具有相关性，已经被证实；这也在一定程度上提示线粒体功能受损，也可能导致心血管疾病发病的原因，而CKD作为心血管疾病的高危因素，两者之间可能是合并促进心血管疾病发展，也可能为线粒体异常加重CKD病变进展，进一步影响心血管疾病的发生和发展；同样的CKD患者的尿素氮等有害废物可以激活体内ROS产生增加，两者双向作用，共同导致CKD的病变进展。一项探究采用12个月的运动和生活方式干预对透析前慢性肾脏病（CKD）患者血浆氧化应激标志物的实验证实：在标准治疗和生活方式干预下，实验两组患者血浆氧化应激标志物谷胱甘肽过氧化物酶化无显著性差异，但高生活质量评估组可造成氧化应激标志物谷胱甘肽过氧化物酶的下降。这在一定程度强调好的生活方式对改善CKD中氧化应激有重要作用。有慢性肾脏病（CKD）的人患心脏病和过早死亡的风险很高。尽管造成心脏病原因有许多，但体内细胞中氧交换不足造成的损害（氧化应激）被认为是一个主要问题。CKD患者常有氧化应激的证据，这与肾脏疾病进展率呈正相关。erer评估目前的证据，以评估如何抗氧化治疗影响CKD患者的结果。总体而言，我们发现，抗氧化剂治疗并没有减少CKD患者的心脏疾病或死亡的风险，但这可能会有所不同，取决于CKD阶段。有一些证据表明，透析的人可能会受益于抗氧化治疗，这些疗法可以减少肾脏疾病恶化的风险。然而，这些结果是基于非常有限的证据，需要进一步的研究，以确认是否抗氧化治疗可能有利于CKD患者。结合常规治疗和适当的生活方式，靶向线粒体衍生的氧化应激，可预防和延缓-36- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究CKD的进展，减少严重的全身并发症的发展。然而，尽管这些药物的抗氧化性能是众所周知的，其使用在临床肾脏病仅部分研究。因此，线粒体将有希望成为未来各种肾损害比较有价值的治疗靶点，通过靶向作用于线粒体来源的氧化应激，将能够延缓CKD病变进展，减少各种系统性并发症的发生。目前有效的线粒体靶目标及抗氧化物主要包括：内源性及食物来源的抗氧化物；天然植物提取的抗氧化物；有抗氧化效用的商品药；线粒体靶向的分子。线粒体功能异常与CKD肌肉萎缩肌肉萎缩（Musclewasting）或肌肉质量减少是慢性肾脏病（CKD）患者晚期比较严重的合并症，因为肌肉萎缩不仅导致患者行动不便，生活方式转变，同时也降低生活质量，增加慢性肾脏病（CKD）患者的发病率及病死率。研究证实，慢性肾脏病（CKD）患者晚期，50-70%的患者可出现不同程度的肌肉质量的减少，主要是蛋白的丢失[3]，严重影响了该类患者的临床治愈率。因此，采取有效的干预措施，延缓甚至是防止肌肉萎缩的发生，是慢性肾脏病（CKD）临床防治的重中之重。CKD肌肉萎缩的原因，常常被归因于营养不良。在大多数患者中，这是一个错误的诊断，而错误的诊断往往会使的患者理所应当的认为营养不良就需要外源性摄入补充大量蛋白质，但是使用过多的蛋白质会导致机体内部尿素氮等有毒物质的剧集，加重肾损伤，促进病变进展，并最终导致尿毒症的发生。相反，各种复杂的机制，刺激骨骼肌的损失，炎症激活的介质进一步刺激ATP-依赖的泛素-蛋白酶体系统（UPS）活性增加，体内蛋白酶水解活性增加，导致大量肌肉蛋白的分解，体内必需氨基酸减少，外源性摄入或补充不足，进一步导致机体启动体内储存蛋白，造成肌肉萎缩的发生和进展。目前已确定的参与肌肉蛋白分解的因子包括炎症、代谢性酸中毒、血管紧张素II、各种神经和激素导致胰岛素/胰岛素样生长因子I缺失，造成细胞内信号转导过程受到损伤[4]。胰岛素/IGF-I信号通路异常，激活肌肉蛋白在UPS和Caspase-3蛋白酶降解，使肌肉蛋白的COM丛结构为UPS提供基质。在肌肉蛋白的裂解过程中，caspase-3蛋白分子中分子量为14kD的肌动蛋白片段在肌肉中不溶，因此可以通过鉴定此片段，用于识别肌肉分解代谢的存在，它可成为过度肌肉萎缩的标志，从而能早期发现肌肉萎缩。在肌肉中激活caspase-3的另一个后果是刺激蛋白酶体的活性，从而增加肌肉蛋白的降解。阻断肌肉消耗的治疗策略包括纠正代谢性酸中毒，它可以抑制CKD患者的肌肉蛋白损失，而这些患者不接受透析治疗。纠正酸中毒也改善CKD的骨代谢，因此应该是一个治疗的目标。运动训练是一个潜在的有益的方法，但需要更多的信息来优化运动方案。更换试验睾酮赤字可以提高人的肌肉，但剂量和副作用在女性没有充分的测试[8]。因此说，CKD中各种传统-37- 第二军医大学硕士学位论文的解释以近乎不能达到临床完全治愈的目的，还需进一步的探索新的机制。虽然胰岛素抵抗发生在CKD的早期，但CKD作为一种高消耗的疾病状态，对线粒体的含量、形态和功能都有很大的影响。线粒体网络的变化影响活性氧（ROS）的产生，在肌肉功能中起重要作用[12]。此外，线粒体功能失调引发的代谢信号通路中，前馈到细胞核促进肌萎缩的活化运动，另一方面，通过激活线粒体能量代谢和线粒体自噬改善线粒体功能[28]。骨骼肌线粒体异常可能的解释为，CKD患者线粒体酶活性降低，如柠檬酸合酶，CKD患者骨骼肌运动后磷酸肌酸恢复时间延长等[12]。线粒体作为生产能量和控制信号级联的关键细胞器，通过线粒体裂变及聚变机械调节它们的形态和亚细胞定位。而在肌肉中，线粒体在一个有序的肌原纤维和子膜线粒体[27]。CKD肌肉萎缩是一种遗传上的控制过程，涉及自噬溶酶体激活泛素蛋白酶体系统一系列问题。有实验证明，CKD时，线粒体通过自噬系统被删除后，线粒体网络的变化主要发生在萎缩的肌肉[12]。裂变的机械表达本身已经成为成年动物的肌肉萎缩的原因，主要是通过触发细胞器功能障碍和AMPK的活化。CKD时，线粒体依赖性肌萎缩，需要激活AMPK；通过抑制AMPK的恢复，从而实现改变线粒体肌肉的大小目的。目前已知导致CKD肌肉萎缩的机制主要是启动ATP酶依赖的泛素蛋白酶系统（UPS），从而活化体内蛋白没水解系统，将蛋白大量降解；同时损伤蛋白合成最重要的胰岛素／IGF-1信号通路[6]。无论是蛋白的合成，还是蛋白的降解，都是依靠ATP提供能量。线粒体作为主要能量供应来源，一旦能量供应在蛋白合成和降解方面不能达成平衡，供给蛋白降解所用能量增加，导致肌肉萎缩的发生。为确定在CKD时线粒体功能异常引起的骨骼肌异常的潜在作用，已进行的一些研究。但研究发现，CKD患者与健康人相比，骨骼肌线粒体功能似乎没有明显受损，仅趋向于降低三羧酸循环中柠檬酸合成酶以及抑制线粒体复合物III和IV的活性。柠檬酸合成酶的活性经常被用作评估细胞氧化能力的指标[13]。早先的研究已经在CKD患者中发现，包括非氧化合成ATP依赖性和降低线粒体容量恢复在肌肉能量代谢中明显异常。此前报道，运动训练（游泳训练）可以防止在3／4肾切除大鼠柠檬酸合成酶活性下降。同样，跑轮运动减弱CKD大鼠空调效果，保持骨骼肌氧化能力稳定。因此，虽然人类研究的结果是不确定的，动物研究的结果表明，肌肉的氧化能力在CKD动物受损，通过调节氧化系统，可以改善运动，改善肌肉萎缩。有研究发现，在CKD小鼠研究，12周行5／6肾切除术后，线粒体呼吸能力显著降低。这进一步证实了在以前的研究中观察到的氧化能力受损，线粒体功能异常部分参加。为了确定潜在的机制，实验人员，对动物中观察到的氧化能力受损者，-38- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究进行测量电子传递链的五种复合物的活性。发现线粒体复合物IV的活性和复合物IV亚基IV蛋白量在CKD动物骨骼肌与假手术组相比，明显减少[29]。虽然差异没有达到统计学意义，但说明一个趋势，减少活动和蛋白质量，这与减少线粒体呼吸能力是一致的。复合物IV的活性和蛋白量的减少可能是部分负责，但在CKD中氧化能力受损严重。此外，实验发现比较CKD动物与假手术组中复合物I和III活性；这两者异常，可能会导致骨骼肌中ROS的产生和氧化应激的增加[30]。氧化应激已被提议作为骨骼和肌肉减少肌肉萎缩的主要调停者。增加氧化压力可以促进分解代谢因子编码基因的表达，激活细胞凋亡途径从而促进骨骼肌萎缩。此外，长时间暴露于较高水平的氧化剂降低线粒体膜的完整性，并使骨骼肌线粒体功能障碍导致线粒体氧化能力下降[5]。氧化应激增加对CKD动物骨骼肌的影响包括减少特定肌力，改变肌功能和肌肉疲劳。孔蛋白是线粒体外膜蛋白质的主要组成部分，因此其密度在整个组织可作为线粒体的质量指标[26]。在目前的研究中发现了一个显着减少在骨骼肌蛋白/肌动蛋白比值在CKD动物与正常对照组比较。这一发现指出，CKD诱导骨骼肌线粒体消耗。这种现象，在与以往的对比研究中证实，显示，CKD动物骨骼肌柠檬酸合成酶活性降低，有助于减少能源生产和氧化能力。在CKD的骨骼肌线粒体质量的下降，可能是由于减少了复制的线粒体减少体力活动驱动的破坏增加，氧化应激和其他不明因素。研究指出CKD的动物表现为：39%的线粒体呼吸作用明显减少；18%的线粒体复合物I和III酶活性显著增加，这是ROS的主要来源；线粒体复合物IV的活性和复合物IV亚基IV蛋白减少；组织蛋白/β肌动蛋白比值减低，说明骨骼肌线粒体质量显著下降[31]。慢性肾脏病患者（CKD）在疾病的早期阶段会出现运动耐力的损伤，这一损害的关键的医学问题在于CKD患者降低体力活动严重影响较非CKD患者预后较的影响更大。身体活动与肾脏预后及死亡率密切相关，是CKD患者心血管事件的独立风险，如高血压和糖尿病高冲击。因此，维护身体机能被认为是CKD患者终身护理的一个重要因素。运动物理性能受许多因素包括心血管功能、营养因素，肌肉，和线粒体的调节。增强肌肉的退化，导致肌肉萎缩被认为是一种在CKD患者身体性能下降的主要原因。而通过诱导caspase-3活化的泛素–蛋白酶体系统（UPS）已被证明是影响CKD诱发肌肉萎缩的一个关键事件。然而，CKD的肌肉功能还没有被仔细研究，特别是在骨骼肌线粒体性质的变化，这是物理性能的一个重要因素，尚未阐明。运动耐力是维持一定工作量的能力，并由维持其所必需的ATP的产生所决定。持续运动降低了能源，碳水化合物和脂肪酸的可用性，因此，它变得难以维持恒定的ATP生产。有丰富的线粒体细胞从基底相同数量的燃料通过有氧呼吸，才能有效-39- 第二军医大学硕士学位论文地生成ATP的，耐力运动是受骨骼肌线粒体数量影响的又一重要因素。运动耐力和ATP生产丙酮酸脱氢酶（PDH）活性是负责开关无氧碳水化合物的代谢活性，从而促进酸的产生。PDH有效抑制厌氧ATP生产丙酮酸转化为乳酸，会导致肌肉疲劳和极限运动耐力。膳食蛋白质可在一定程度上增加老年人肌肉体积，高蛋白饮食可能是有用的在提高CKD患者疾病风险的可能，虽然它会损害肾功能，但膳食蛋白对CKD患者的物理性能的影响没有评估的细节。目前，为了改善CKD患者的物理性能的主要途径是轻度运动训练抑制肌肉蛋白和纠正酸血症的作用。考虑到慢性肾脏病（CKD）患者常见的肌肉萎缩是与不良临床结果的紧密相关性，尤其是接受维持性透析治疗的个体。多种因素会影响CKD患者的营养和代谢状况，需要结合治疗，以防止或逆转蛋白质和能量消耗。这些措施包括优化的膳食营养摄入，如代谢性酸中毒、代谢紊乱治疗全身炎症和激素不足，与处方优化的透析方案。患者在口服摄入三餐不能维持足够的营养状况、营养补充、口服、肠内或肠外营养，被证明是有效的补充蛋白质和能量存储[8]。在临床实践中，口服营养补充剂的优点包括有效性、安全性和依从性。合成代谢的策略，如合成代谢类固醇，生长激素和运动，结合营养补充或单独，已被证明是改善蛋白质存储和代表潜在的额外的方法治疗的皮尤。食欲兴奋剂，抗炎干预，和新的同化剂是新兴的新疗法。线粒体裂变和聚变异常与CKD线粒体作为机体动力性细胞器，具有线粒体的生物合成，裂变，融合和线粒体自噬维持线粒体和细胞功能的特性。线粒体的生物发生是由多种转录因子如过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ，雌激素相关受体和核呼吸因子共同参与。线粒体是双层膜结构的动力性细胞器，它的形状、数量及细胞内的分布都反应了机体代谢的状态。生理状态下，线粒体为棒状样结构，但可以进行裂变和聚变[3]。线粒体的裂变是指一个线粒体变成两个线粒体，并且外膜完全分离；线粒体的聚变是指两相邻线粒体靠近，两外膜逐渐融合，内膜最后融合，并最终变成一个线粒体的过程。线粒体的裂变和聚变是线粒体抵抗外界刺激的手段，两者之间存在稳定的平衡关系，一旦两者平衡被打破，就会导致线粒体功能紊乱[10,11]。而且，有研究已经证实，线粒体动力学异常，导致线粒体功紊乱，并且在糖尿病、肿瘤等消耗性疾病的发生发展中得到证实。目前已有多个参与线粒体裂变和聚变的蛋白得到大家的证实及认可，这些蛋白大多是线粒体功能特异性蛋白。Drp1在线粒体裂变过程中，发挥关键作用。但关于线粒体动力学形态异常，目前越来越成为研究的热点。线粒体是一种不断融合和分裂的动态细胞器。这些相反的过程共同工作，以维持线粒体的形状，大小和数量和它们的生理功能。一些大分子在介导哺乳动物线粒体融合与分裂已经被发现，但潜在的分子细胞机制只是部分地解-40- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究开。特别是，涉及线粒体分裂的字符需要澄清。通过使线粒体含量之间的混合、融合和裂变为保持均匀和健康人群中线粒体。线粒体动力学已被链接到多个线粒体功能，包括线粒体DNA的稳定性，呼吸能力，细胞凋亡，细胞应激反应，而线粒体自噬。因为这些重要的功能，线粒体融合与分裂是必不可少的哺乳动物，甚至线粒体动力学轻度缺陷基因与疾病的相关性。更好地理解这些过程可能最终会导致人类健康的改善。目前的研究表明，线粒体的形态、分布和功能是由线粒体分裂与融合的平衡调节维持，以及这些过程之间的平衡扰动是细胞或器官功能障碍和异常的线粒体分布相关。线粒体融合异常诱导线粒体从管状形态分裂成碎片；相反，扰动线粒体分裂的结果，在相邻的线粒体融合。Drp1作为动力蛋白家族的一个成员，启动Drp1有效地影响细胞的生存和凋亡的哺乳动物线粒体裂变过程的中介。Drp1依赖线粒体的分裂是一个复杂的过程，细胞和器官的动态，调节包括发育、凋亡，急性器官损伤和各种疾病。只有澄清了这种关键蛋白在体内和体外的调控机制，它将为防止线粒体分裂导致CKD病变进展相关的病理过程和难治性疾病的重要作用[32]。有研究指出，在5/6肾脏部分切除术模型中，出现线粒体动力学异常。在分离的线粒体中，5/6肾脏部分切除术诱导过氧化氢产生增加，并且复合物I和V的活性降低，抗氧化酶活性降低。此外，5/6肾脏部分切除术后，导致线粒体裂变和聚变异常；另外，研究发现，姜黄素能够防止5/6肾脏部分切除术后肾功能障碍，改善肾血流量，并增加总抗氧化能力。此外，肾小球及近曲小管通过耦合型一氧化氮合酶，减低5/6肾脏部分切除诱导产生的超氧阴离子（NOS）和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NOX）有关[15,26]。定位在细胞质的线粒体裂变，Drp1被招募后发生的裂变。结合Drp1的锚受体（s）和随后的形成功能复合体是必不可少的线粒体裂变为初始过程。虽然一些蛋白质已经确定为Drp1受体在哺乳动物的聚集中所起到的关键作用，但它们的角色和重要性相对线粒体裂变是在不清楚。调节线粒体裂变是由翻译后修改（Drp1，包括S-亚硝基化，磷酸化，SUMO（小泛素样修饰），泛素化，及与糖基化反应。CKD，神经退行性疾病，肥胖，糖尿病等疾病可造成缺陷调节线粒体的形态[13]。最近，线粒体相关药物的开发兴趣已经向线粒体核糖动力学，如线粒体融合，分裂，和线粒体自噬发展[33]。线粒体分裂抑制TOR-1（mdivi-1），抑制线粒体分裂的选择性抑制装配和GTPase活性酵母和哺乳动物细胞中的Drp1。较小和较短的线粒体和线粒体裂变机制增加，观察小鼠的遗传性肥胖和饮食诱导的肥胖，与线粒体分裂的关系。虽然短期急性抑制裂变过程是有益的，长期的抑制作用可能与抑制平滑肌细胞细胞增殖和诱导肿瘤细胞死亡的类似[29]。-41- 第二军医大学硕士学位论文慢性肾脏病（CKD）的患病率和发病率在世界范围内不断上升。新的治疗方法是迫切需要的，这不仅是防止或延缓CKD的发病也是应对尿毒症的负面影响的措施。到目前为止，CKD患者遭受众多的医疗条件尿毒症包括血管疾病相关的功能、代谢和/或内分泌系统、高血压、皮质醇增多症，降低免疫功能，以及肌肉和骨骼肌功能受损异常疲劳[24]。运动不耐受反过来又进一步促进久坐不动的生活方式经常出现在CKD患者的恶性循环的体力活动和肌肉损失。受损的骨骼肌功能最近被识别称为死亡的CKD患者的一个独立预测因素，而有氧运动训练有利于CKD。肌肉萎缩是慢性肾脏病（CKD）严重的并发症，能在一定程度上增加CKD额发病率和死亡率，严重影响患者的生活质量及疾病的预后，并给社会带来巨大经济和健康负担肌肉萎缩发生后，严重影响患者的生存率及生活质量；氧化应激参与慢性肾脏病各种并发症的重要过程，在一定程度上加速慢性肾脏病病变进展；而线粒体功能异常，参与慢性肾脏病时氧化应激的发生以及肌肉萎缩的发生情况，可认为也是导致慢性肾脏病病程进展的关键所在。因此，进一步明确线粒体功能异常在慢性肾脏病病变过程中的作用，需要所有科研人员的努力探索。参考文献1.AndrewSLevey,J.C.,chronickidneydisease.Lancet,2012(379):p.165–80.2.Levey,A.S.,etal.,Definitionandclassificationofchronickidneydisease:apositionstatementfromKidneyDisease:ImprovingGlobalOutcomes(KDIGO).KidneyInt,2005.67(6):p.2089-100.3.Part4.DefinitionandClassificationofStagesofChronicKidneyDisease.AmericanJournalofKidneyDiseases5,2002.39(2):p.s46-s75.4.Workeneh,B.T.andW.E.Mitch,Reviewofmusclewastingassociatedwithchronickidneydisease.AmJClinNutr,2010.91(4):p.1128S-1132S.5.Yokoi,H.andM.Yanagita,Decreaseofmusclevolumeinchronickidneydisease:theroleofmitochondriainskeletalmuscle.KidneyInt,2014.85(6):p.1258-60.6.Wang,X.H.andW.E.Mitch,Mechanismsofmusclewastinginchronickidneydisease.NatRevNephrol,2014.10(9):p.504-16.7.JuanJesusCarrero,P.S.,LilianCuppari,T.AlpIkizler,KamyarKalantar-Zadeh,GeorgeKaysen,WilliamE.Mitch,S.RussPrice,ChristophWanner,AngelaY.M,EtiologyoftheProtein-EnergyWastingSyndromeinChronicKidneyDisease-AConsensusStatementFromtheInternationalSocietyofRenalNutritionandMetabolism(ISRNM).JournalofRenalNutrition,2013.23(2):p.77-90.-42- 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Ｆａｓｕｄｉ丨阻断ＲＯＣＫ１刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究在读期间发表论文情况１、郭织运，张杰，董睿Ｒ０ＣＫ，许静，法舒地尔阻断１触发Ｃ２Ｃ１２成肌细胞呼吸功能异常介导的肌萎缩二．第军医大学学报，２０１７年６月第３８卷第６期．２、郭织运，许静．ＣＩＮ８５介导足细胞内吞参与糖尿病肾病病变进展．第二军医大学学报（在投）．３１ＺｈｉｕｎＧｕｏＪｉｎＸｕ．ｅｔｌ．Ｃｏｌｏｌｙ，ｇｎＰａｓａＰａｒｔｉｎｔｈｅＡｃｔｖａｔＯｘｉｄｙｉｉｏｎｏｆａｔｉｖｅＳｔｒｅｓｓｉｎＲａｔｓｗｉｔｈＣｈｒｏｎｉｃＲｅｎａｌＦａｉｌｕｒｅＢｔｅ．ＭＣＧａｓｔｒｏｅｎｒｏｌｏＳｕｂｍｓｓｇｙｉｉｏｎ．（）－４５－ 第二军医大学硕士学位论文致谢时光飞逝，转眼间三年的研究生生涯即将画上句点。回首过去的三年，有收获也有遗憾，有努力后获得丰收硕果的欣慰，也有平凡中阅览人情事故的成长，虽有千言万语，一时间却又不知道如何去诉说，平复激动的心情，回忆过去的点滴。首先，请允许我怀着激动无比的心情，带上崇高的敬意，对我的导师许静副教授，说声感谢。感谢您三年来如慈母般对我的呵护和关心，您像我的母亲一样，细心关照一位来自农村的普通学子。二十多岁的年纪，没有出过校门，对社会不是很了解，但是研究生生活，其实已经和社会生活一样，各种人际交流都需要我们自己去学习。是您用正直的态度和视角，教导一名学生如何辨别事情的对错，告诉学生如何才能少走弯路，告诉我要对人谦和，对事情认真进取，不到最后一刻绝不放弃。知对错是受用一辈子的知识，这是任何人都抢不走的财富。您做到了，不只在科研、临床业务上教导学生，也做到了从人生道路上，指引一名懵懂的学子如何正确的走在医学的康庄大道上。感谢您让我有机会可以来到美国学习科研，有机会能够系统的学习各种最新的科研技术和实验理论。远在美国，您也没有放松对我学习上的指导，是您的谆谆教诲，才让我在这边不会感到孤独和想要放弃。每当我遇到疑难困惑的时候，您总是给予无私的帮助，您那份严谨治学的精神、宽以待人的态度早就深深地烙在学生的心里，激励着我不断向前，就是有再大的风浪，也要坚持到底。作为一名临床医生，您对待病人永远是摆出倾听的态度，您从不会对病人着急，总是从病人的方面考虑问题，设身处地为病人考虑。您用您精湛的临床技术，加上崇高的医德，照亮许多患者的疾病之路，是您带给他们对生活的信心。您用您的言传身教，指导一名医学生如何成为一名正的医生。无论从学术科研、临床技能还是教学，您都是一名合格的导师，是值得人尊敬的导师。其次，感谢肾内科郭志勇主任，感谢主任对我学习上的帮助和支持，您用您博学的知识，指导我们研究生要懂得进取和拼搏，也让我们研究生之间相互帮助，凝聚大家在一起工作的能量。感谢肾内科董睿、边琪、吴灏、赖学莉、吴海洋、张欢、张优、李璐、李双喜、孙婧等医生在平日工作中的指导，感谢何薇、边晓璐、张陵艳秘书对我的关心和支持，感谢马文杰硕士、王欢硕士、丁涛硕士在我科研和学习上给予的无私的帮助。特别感谢张杰硕士对我研究生在读期间的所提供的一切帮助，作为同一级的硕士同学，让我感受到了如兄长般的帮助和关心，感谢。还要特别感谢我的美国导师胡兆永教授对我的科研的指导和帮助，帮助我从一名一无所知的科研菜鸟，成长为一名可以独立做实验的后起之秀。感谢您对我实验的包容和宽容，感谢您对我生活上的关心和指导，让孤身一人在美的我，感受到了-46- Fasudil阻断ROCK1刺激线粒体裂变所介导的慢性肾脏病肌肉萎缩的研究来自同胞的关心。最后，感谢一直在背后默默支持我学习的爸爸、妈妈，是您们给予我可以在外学习的经济支持，感谢您们对我的各种包容和支持，您们一直用对的观点和态度，教导我成长，感谢。同时也要让我不能经常回家向您们说声对不起。感谢我的嫂子和哥哥替我分担家庭重担，替我照顾父母。最后，对曾经关心过我、帮助过我的所有人致以最诚挚的感谢。此致敬礼！-47-