日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究

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学校代码：１０巧５学号２０１３４２２１０７３：襄听Ｕ、考ＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ１－曰本血吸虫！備性与期专對射换系的研究，．．．ｓｏｎｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｅｔｗｅｅｎｔｈｅｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｓｔｃｓＳｔｕｄｉｅｐｉｉｂｇ？４ａｎｄａｔｈｏｅｎｃｔｏｆＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａａｏｎｉｃｕｍｉｉ；ｐｇｙｊｐ？？’片，研究生姓名黄文乔■—．．．■—．．指导教师姓名诸葛巧祥；．；巧’’；生物学．，．专业名称微＾’’＼．ｖ研究方向感染与免疫■，．．■■、？．？．卢／ｆ所在院部基础医学与生物科学学院＇ｎ．２０１６４月醉．女论文提交曰期年．马；皆＇＞ｉ 苏州大学学位论文独创性声朗本人郑重声明；所擢交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进巧研究工作巧取得的成果。除文中已经绽明引用的巧容外，本论文不當其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的巧料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中Ｗ明确方式赫明。本人承担本声明的法律责化。’论文從證盤名方：論弄呂觀ｉ必瓜斗 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究中文摘要中文摘要目的：血吸虫病是一种流行广泛、严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病。我国属于血吸虫病流行最严重的国家之一，主要流行日本血吸虫病。日本血吸虫的生活史比较复杂，在中间宿主（钉螺）体内进行无性生殖，在终宿主（哺乳动物）体内进行有性生殖。个体遗传学差异影响血吸虫的交配选择在终宿主体内已有研究，然而有关于血吸虫个体遗传学差异是否影响其对终宿主的致病性，尚罕有研究。因此本实验利用微卫星位点技术对日本血吸虫成虫DNA进行基因分型，进而分析日本血吸虫配对个体间的遗传差异性和杂合度差异，观察配对个体间的遗传学差异与其对终宿主致病性的关系。有助于深入了解血吸虫的致病性和传播特征，同时为进一步有效地控制血吸虫病流行提供新的思路。方法：室内单条毛蚴攻击感染钉螺所形成的感染性钉螺，经确定其逸出尾蚴的性别后，对相应感染性钉螺逸出的雌雄尾蚴进行随机配对，即以1只钉螺逸出的雌性尾蚴5条和另1只钉螺逸出的雄性尾蚴10条感染BALB/c小鼠，感染35d后收集血吸虫虫体、计数，计算肝重/体重/对成虫、脾重/体重/对成虫、平均每对成虫肝脏沉积虫卵数、平均每对成虫肠组织沉积虫卵数、肝脏虫卵孵化率和肝脏肉芽肿的平均直径。提取雌雄成虫的DNA，应用微卫星位点进行标记，进行多重PCR，扩增产物片段长度由上海生物工程（生工）有限公司检测。配对雌雄血吸虫个体的遗传相似性采用r系数估算，由软件SPAGeDI1.4得到；杂合度为虫体杂合位点数占虫体所有位点数的比例，计算配对雌雄血吸虫个体杂合度的差值（△H），即△H=雄虫杂合度―雌虫杂合度。结果：1.配对日本血吸虫个体间的遗传相似性与平均每对成虫肝脏沉积虫卵数（r=0.5016，P=0.0478）、平均每对成虫肠组织沉积虫卵数（r=0.7965，P=0.0002）、肝脏虫卵孵化率（r=0.5083，P=0.0444），呈正相关，关联均有统计学意义（P<0.05）；与肝重/体重/对成虫（r=0.1095，P=0.6865）、脾重/体重/对成虫（r=0.2653，P=0.3206）呈正相关，与肝脏肉芽肿的平均直径（r=－0.2727，P=0.3069）呈负相关，关联均无统计学意义（P>0.05）。I 中文摘要日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究2.配对日本血吸虫个体间的杂合度差值△H的不同，△H<0（雄虫杂合度小于雌虫）平均每对成虫肠组织沉积虫卵数和肝脏虫卵孵化率均显著高于（分别为P=0.0023、P=0.0102）△H=0（雌雄虫体杂合度相等）；△H>0（雄虫杂合度大于雌虫）平均每对成虫肠组织沉积虫卵数和肝脏虫卵孵化率，均显著高于（分别为P=0.0069、P=0.0161）△H=0；△H=0肝重/体重/对成虫和脾重/体重/对成虫均显著高于（分别为P=0.0164、P=0.0153）△H<0；△H=0肝重/体重/对成虫和脾重/体重/对成虫均显著高于（P=0.0040、P=0.0105）△H>0；△H=0、△H<0、△H>0在平均每对成虫肝脏沉积虫卵数和肝脏肉芽肿平均直径，均没有显著性差异（P>0.05）；病理指标在△H<0与△H>0之间均没有显著性差异（P>0.05）。结论：1.日本血吸虫对其终宿主的致病性与配对个体间遗传差异性有关，并且遗传差异性越大，其致病性越弱。可能是因为血吸虫的致病性和传播存在与基因相关的平衡作用，也可能与血吸虫在中间宿主和终宿主体内的增殖呈负相关有关。2.日本血吸虫配对个体间杂合度差异影响其在终宿主阶段的传播和致病性，杂合度有差异的雌雄虫体配对，在终宿主阶段的传播率较高，而杂合度相等的雌雄虫体配对，其致病性更强。3.对遗传差异性和杂合度差异的分析有助于深入了解日本血吸虫在终宿主阶段致病性和传播的特征，也有助于为进一步有效控制血吸虫病流行提供新的思路。关键词：日本血吸虫；微卫星；遗传差异性；杂合度；致病性；传播作者：黄文乔指导教师：诸葛洪祥教授II 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究英文摘要StudiesontherelationshipbetweenthegeneticcharacteristicsandpathogenicityofSchistosomajaponicumAbstractObjective:Schistosomiasisisaprevalentzoonoticparasiticdisease,whichisseverelyharmfultohumanhealth.China,asoneofthemostaffectedcountries,hasthemostprevailingepidemicdiseaseofschistosomiasisjaponica.Schistosomelifecycleiscomplex,asexualproliferationinthemiddlehost(snail),whilesexualreproductioninthedefinitivehost(mammal).Studiesconcernedaboutgeneticdissimilarityandheterozygosityofschistosomeindividualinfluencingitsmatechoiceinthedefinitivehost,hadbeenreported.However,whetherschistosomeindividualgeneticdifferencesinfluencetheirfinalhost’spathogenicity,yetrarelystudied.Therefore,thisstudyusemicrosatellitelocimarkersforS.japonicumDNAgenotyping,tocalculatethegeneticdissimilarityandheterozygositydifferencebetweenmatesandobservethemrelationshipwithpathogenicityofS.japonicuminthedefinitivehost.OurworkwillcontributetounderstandingthepathogenicityandepidemicofS.japonicumcharacteristics,aswellasprovidingnewideastocontrolschistosomiasis.Methods:Thesnailsinfectedwithsinglemiracidiaandthesexofcercariaesheddingfromthesnailswerepredeterminedbeforeinfectionofvertebratehosts.AgroupoftwoBALB/cmicewereindividuallyinfectedbyusing5femalecercariaesheddingfromonesnailand10malecercariaesheddingfromanothersnailrandomlypaired.Theexcessofmalescanensurethatallfemaleswouldhavebeenmated.Afterfiveweeks’infection,wefirstcollectedschistosomiasisindividualandcountedthenumber,thencalculatedliverweight/bodyweight/wormpairandspleenweight/bodyweight/wormpair,themeannumberofeggsperwormpairintheliverandintestinaltissue,thehatchingrateofdepositedeggsandtheaveragediameterofgranulomaintheliver.III 英文摘要日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究ExtractedDNAfrommaleandfemaleworms,multiplexPCRedbyapplyingmicrosatelliteloci,theamplifiedfragmentlengthproductwasdetectedbytheShanghaiBiologicalEngineering(Sangon)Limitedtesting.UsedsoftwareSPAGeDI1.4toestimatercoefficienttogetgenesimilarityforpairsofschitosomes.Heterozygositywascalculatedasthenumberofheterozygouslocidividedbythetotalnumberofloci.Wedefined△Hasthedifferenceinheterozygositybetweenthemaleandthefemaleworms,△H=maleheterozygosity―femaleheterozygosity.Results:1.TherewasasignificantcorrelationbetweenthegeneticsimilarityofS.japonicummatesandthemeannumberofeggsperwormpairintheliver(r=0.5016,P=0.0478)andthemeannumberofeggsperwormpairintheintestinaltissue(r=0.7965,P=0.0002)andthehatchingrateofdepositedeggsintheliver(r=0.5083,P=0.0444);therewasnocorrelationbetweenthegeneticsimilarityofmatesandliverweight/bodyweight/wormpair(r=0.1095,P=0.6865)andspleenweight/bodyweight/wormpair(r=0.2653,P=0.3206)andtheaveragediameterofgranulomaintheliver(r=－0.2727,P=0.3069).2.Theheterozygositydifferenceofmates(△H)influencedthepathogenicityofS.japonicuminthedefinitivehost.Themeannumberofeggsperwormpairintheintestinaltissueandthehatchingrateofdepositedeggsintheliverof△H<0(themaleheterozygositylessthanthefemale)weresignificantlyhigher(P=0.0023,P=0.0102,respectively)than△H=0(theheterozygosityofmateswereequal).Themeannumberofeggsperwormpairintheintestinaltissueandthehatchingrateofdepositedeggsintheliverof△H>0(themaleheterozygositymorethanthefemale)weresignificantlyhigher(P=0.0069,P=0.0161,respectively)than△H=0(theheterozygosityofmateswereequal).Liverweight/bodyweight/wormpairandspleenweight/bodyweight/wormpairof△H=0weresignificantlyhigher(P=0.0164,P=0.0153,respectively)than△H<0;Liverweight/bodyweight/wormpairandspleenweight/bodyweight/wormpairof△H=0weresignificantlyhigher(P=0.0040,P=0.0105,respectively)than△H>0;Themeannumberofeggsperwormpairintheliverandtheaveragediameterofgranulomaintheliverwerenosignificantdifference(P>0.05)amongthegroupsof△H<0,△IV 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究英文摘要H=0,△H>0;Buttheseallindicatorswerenosignificantdifferencebetween△H<0and△H>0(P>0.05).Conclusions：1.ThereiscorrelationbetweengeneticdissimilarityofmatesandpathogenicityofS.japonicuminthedefinitivehost,thegeneticdissimilarityisgreaterwhilethepathogenicityinthedefinitivehostisweaker;onepotentialexplanationforsuchnegativecorrelationmaybe“trade-offs”,atrade-offinpathogenicityandtransmission,negativecorrelationbetweenparasitereproductivesuccessindefinitiveandintermediatehostsmayalsoberelevant.2.EffectsonpathogenicityandtransmissioninthedefinitivehostinfectedwithheterozygositydifferenceoftheS.japonicummates.Comparetothemateswithequalheterozygosity,themateswithdifferentheterozygosityhashighertransmissioninthedefinitivehost.However,Themateswithequalheterozygosityhashigherpathogenicityinthedefinitivehost.3.AnalysisofgeneticdissimilarityandheterozygositydifferencehelpustounderstandthepathogenicityandtransmissioncharacteristicsofSchistosomajaponicuminthedefinitivehost,meanwhilecontributetoprovidingmoreeffectivenewideastocontrolschistosomiasis.Keywords:Schistosomajaponicum；Microsatellite；Geneticdissimilarity；Heterozygosity；Pathogenicity；TransmissionWrittenby:WenqiaoHuangSupervisedby:HongxiangZhugeV 目录引言..............................................................................................................................1第一部分日本血吸虫致病性与其配对个体间遗传差异性的关系..........................31.材料与方法................................................................................................................31.1材料.....................................................................................................................31.2仪器与试剂、材料............................................................................................41.3溶液配制.............................................................................................................51.4方法.....................................................................................................................62.结果..........................................................................................................................102.1日本血吸虫配对个体间遗传相似性...............................................................102.2日本血吸虫配对个体间的遗传相似性与各病理指标的关系.......................103.讨论..........................................................................................................................17第二部分日本血吸虫致病性与其配对个体间杂合度差异的关系........................201.材料与方法..............................................................................................................201.1材料...................................................................................................................201.2仪器与试剂、材料..........................................................................................211.3溶液配制...........................................................................................................221.4方法...................................................................................................................222.结果..........................................................................................................................242.1日本血吸虫配对个体间杂合度差值...............................................................242.2日本血吸虫配对个体间杂合度差值对各病理指标的影响...........................243.讨论..........................................................................................................................29主要结论........................................................................................................................31参考文献........................................................................................................................32综述............................................................................................................................38 寄生虫的遗传关系对宿主致病性的影响....................................................................38参考文献........................................................................................................................42附录............................................................................................................................46附录一：多重PCR反应体系.......................................................................................46附录二：多重PCR反应条件.......................................................................................47附录三：SPAGEDI软件简介.......................................................................................48中英文缩略词对照表....................................................................................................54攻读学位期间取得的科研成果....................................................................................55本课题所获的基金资助................................................................................................56致谢............................................................................................................................57 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究引言引言了解寄生虫致病性的进化有助于我们预测其对人类、畜牧业和野生动物种群[1-3]等的影响。血吸虫病是一种在全球范围内流行的人畜共患寄生虫疾病，它严重影响着人类的身体健康和国家、地区的经济发展，被世界卫生组织（WHO）列为10种被忽视的热带病之一。目前，全球共有78个国家和地区流行这种寄生虫疾病，[4]其中超过2亿人已受感染，近8亿人面临感染威胁。寄生于人体的血吸虫主要有三种：即流行于非洲北部的埃及血吸虫（Schistosomahaematobium）；流行于拉丁美洲及非洲中部的曼氏血吸虫（Schistosomamansoni）以及流行于亚洲的日本血吸[5]虫（Schistosomajaponicum）。此外，还有间插血吸虫（Schistosomaintercalatum）、湄公血吸虫（Schistosomamekongi）及马来血吸虫（Schistosomamalayensis）可以寄生人体，我国是日本血吸虫病流行的主要国家之一。日本血吸虫(S.japonicum)属于吸虫纲(ClassTrematoda)，复殖目(OrderDigenea)，裂体科(FamilySchistosomatidae)，裂体属(GenusSchistosoma)，日本[6]种(Speciesjaponicum)。日本血吸虫的生活史比较复杂，其生长、发育需要经历有性繁殖阶段（在终宿主哺乳动物体内）和无性繁殖阶段（在中间宿主钉螺体内）两个过程。成熟的尾蚴从钉螺体内逸出，浮游在水面，若遇到哺乳类动物等终宿主，从皮肤真皮层侵入后脱去尾部转变为童虫，移行寄生于肠系膜下静脉，发育成熟进行有性生殖。成虫雌雄合抱交配受精后产卵，虫卵在肠壁或肝脏内发育成熟。沉积于肠组织的虫卵，由于毛蚴分泌的溶细胞物质能透过卵壳，破坏血管壁，使其周围的肠粘膜发炎、坏死；加上肠蠕动、腹内压和血管内压的作用，致使坏[7]死组织向肠腔溃破，其中的虫卵随之进入肠腔内，随粪便排出体外。虫卵落入清水后，孵出毛蚴，如遇钉螺则侵入其体中，毛蚴在钉螺体内进行无性生殖，在螺体内先发育成母胞蚴，其生殖团形成许多子胞蚴，子胞蚴脱离母胞蚴后，体内胚团陆续分裂，分批形成尾蚴。日本血吸虫发育过程中的尾蚴、童虫、成虫及虫卵[8,9]均可引起终宿主病变，但以虫卵引起的致病性病变最严重，对机体危害也最大。[10]寄生虫感染宿主，在宿主体内的生长繁殖对其宿主造成的损伤称为致病性。[11-13]致病性的强弱与基因相关。在血吸虫的研究中，也发现存在对宿主的致病性[14,15]强弱不一致的现象，血吸虫在终宿主体内进行有性生殖，或许雌雄个体的基1 引言日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究因是造成这一现象的一个重要因素。在曼氏血吸虫配对选择的研究中发现，雄虫[16]的遗传学差异影响雌虫的配对选择。然而，血吸虫配对个体间遗传学差异对其[17,18][19-21]在终宿主体内的致病性的影响，尚罕有研究。由于地理隔离、终宿主差异、[22]实验室保种等因素的影响，血吸虫个体出现了不同程度的遗传变异，血吸虫配对个体间遗传学差异，可能影响其对终宿主的致病性和传播。[23]目前，日本血吸虫全基因组测序已提供了完整的DNA序列，并且已经筛选[24-26]鉴定出了高度多态的微卫星位点，大大降低了设计特异性引物的难度，且因其方法简便、DNA用量少、重复性高、稳定性好、多等位基因、共显性遗传等优[27][28-31]点，已开始应用于日本血吸虫遗传学的研究。微卫星(microsatellite)，由2~6个核苷酸的短串联重复片段构成，重复片段的重复次数在个体间呈高度多态性并且数量丰富。微卫星DNA多态性技术直接以微卫星为研究对象，根据其侧翼序[32]列在其两侧设计一对互补引物，进而对微卫星长度的多态性进行遗传分析。一般认为，微卫星DNA的多态性是由于复制修复过程中产生了链滑动或发生了错配，[33]从而导致一个或几个重复单位的插入或缺失，产生长度多态性。[34]本课题的前期研究，筛选和成功优化了7个微卫星位点，所以拟就以这7个微卫星位点对16对随机配对的日本血吸虫个体进行基因分型，估算配对雌雄个体间的遗传相似性和杂合度差值，探究日本血吸虫致病性与其遗传学特征的关系。2 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究第一部分第一部分日本血吸虫致病性与其配对个体间遗传差异性的关系[10]寄生虫在宿主体内生存和繁殖对宿主产生的损伤称为致病性，其致病性与[11-13]基因相关。在血吸虫致病性的研究中，也有发现其对终宿主致病性强弱不一[14,15]致的现象。日本血吸虫成虫是雌雄异体，雌虫生活在雄虫的抱雌沟内，在终宿主体内进行有性生殖。或许雌雄个体间的遗传差异性是造成这一现象的一个重[35,36]要因素。日本血吸虫病是重要的人类寄生虫病之一，主要流行于中国，菲律[37][38]宾，以及印度尼西亚的部分地区。日本血吸虫发育过程中的尾蚴、童虫、成虫及虫卵均可引起终宿主病变，但以虫卵引起的致病性病变最严重，对终宿主机[8,9]体危害也最大。在曼氏血吸虫研究中发现，雄虫遗传差异性会影响雌虫的配对[16]选择。然而，血吸虫配对个体间遗传差异性与其在终宿主体内的致病性是否有关，尚罕有研究。在日本血吸虫的基因组中已经筛选并鉴定出了高度多态的微卫[24-26][39,40]星位点，因为其呈共显性遗传、等位性等优点被广泛应用，因此本实验采用微卫星标记的方法对日本血吸虫进行基因分型，计算配对雌雄个体间的遗传相似性，观察终宿主平均每对成虫肝脏沉积虫卵数、平均每对成虫肠组织沉积虫卵数、肝脏虫卵孵化率、肝脏肉芽肿平均直径、肝重/体重/对成虫和脾重/体重/对成虫，分析这些病理指标与配对血吸虫个体间遗传差异性的关系。1.材料与方法1.1材料1.1.1单性感染性钉螺[41,42]源于本课题的前期研究，每只8周龄雌性ICR小鼠，感染约200条尾蚴，感染六周后，向感染小鼠的腹腔注射戊巴比妥钠处死，解剖获得小鼠肝脏后，将小鼠肝脏切碎，用0.85%的NaCl溶液洗，然后倒入装有脱氯新鲜自来水的长颈圆底烧瓶中，将烧瓶保持在室温25℃，白炽灯照射下，使毛蚴从卵中孵出。在体式显微镜下用微量吸管捕获单条毛蚴，转移至微孔板中，每孔一条毛蚴。然后将钉螺放入，每孔一只钉螺，保持2h后拿出。分别单独饲养于24孔细胞培养板内，每孔内垫有一小块潮湿海绵，上附一层潮湿草纸，每孔一螺，上面覆盖圆形网筛，以防钉螺逃出，在约25℃环境下饲养观察钉螺，挑出死亡的钉螺。感染120天后，3 第一部分日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究逸蚴分离感染性钉螺，获得单性血吸虫感染的钉螺。1.1.2实验动物ICR小鼠，雌性，8~10周龄，体重(30±2)g；BALB/c小鼠，雌性，8周龄，体重(20±2)g，由苏州大学医学部实验动物中心提供。所有实验动物均饲养于可控环境中，可自由获取食物和水。1.2仪器与试剂、材料1.2.1仪器FA2104S电子天平上海精工产品数字式移液器枪上海FinnpipetteThermoOlympusCX31显微镜Olympus产品SZX12解剖显微Olympus产品SMZ-B2连续变倍体视显微镜重庆奥特光学有限公司OlympusCKX41显微镜Olympus产品OlympusC-7070照相机Olympus产品高速离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司贝克曼低温离心机美国贝克曼库尔特有限公司CL21R小型冷冻高速离心机美国Thermo产品YQ-DSX-280A型压力蒸汽灭菌器上海中安医疗器械厂DW-25L262低温冰箱青岛海尔DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司SIMPLICLTYUV超纯水系统MILLIPORE产品SIM-F140AY65制冰机日本三洋产品DNYS8-VORTEX-5涡旋振荡器其林贝尔产品DK-S22恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司SW-CJ-2FD超净工作台苏净安泰公司ArktikPCR扩增仪美国Thermo产品BMJ-Ⅲ型病理组织包埋冷冻台常州市中威电子仪器有限公司BMJ-Ⅲ型包埋机常州市中威电子仪器有限公司PAY-Ⅲ型病理组织漂烘仪常州市中威电子仪器有限公司LEICARM2135切片机德国LEICA公司4 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究第一部分1.2.2主要试剂、材料氯化钠国药集团化学试剂有限公司二水合柠檬酸钠国药集团化学试剂有限公司氢氧化钾国药集团化学试剂有限公司磷酸二氢钠国药集团化学试剂有限公司二甲苯国药集团化学试剂有限公司无水乙醇国药集团化学试剂有限公司甲醛上海试剂四厂伊红上海化学试剂总厂产品苏木素上海化学试剂总厂产品氯仿国药集团化学试剂有限公司异戊醇国药集团化学试剂有限公司卢戈氏碘液济宁鲁化生产力促进中心软体动物组织DNA提取试剂盒（BufferMTL、ProteaseK、BufferMBL、BufferKB、RNaseA、DNAWashBuffer、ElutionBuffer、ezBindDNAColumns、2mlCollectionTubes）上海妙骏生物科技有限公司TaqPCRMasterMix试剂盒（2×TaqPCRMasterMix，Nuclease-freeddH2O，MgCl2）生工生物工程（上海）股份有限公司1.3溶液配制生理盐水：称取9g氯化钠，加1000ml双蒸水，配制成0.9%氯化钠溶液1L。4%KOH溶液：称取40g氢氧化钾，加双蒸水溶解。冷却后转移至1000ml容量瓶中，继续加双蒸水，配成4%氢氧化钾溶液1L。10%中性福尔马林固定液：甲醛100ml，磷酸二氢钠6.5g，加蒸馏水900ml，配成10%中性福尔马林固定液。哈瑞氏苏木素染液：先将1g苏木素溶于酒精中，另将钾明矾20g加温溶于200ml蒸馏水中，再与苏木素酒精加在一起，混合后煮沸，再加入0.5g氧化汞，用玻璃棒搅拌，液体变成深紫色时，用流水将烧杯迅速冷却，隔日过滤，室温放置。使用时加醋酸4ml，可增强其染色力。伊红酒精染液：将0.5g伊红溶于100ml80%的酒精中，室温放置。5 第一部分日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究1.4方法1.4.1感染小鼠1.4.1.1单性血吸虫感染将每只单性感染性钉螺置于24孔培养板中，每孔一只，加入新鲜去氯自来水至孔口5mm处，室温25℃白炽灯照射3-4h，尾蚴集中浮于液面。每孔尾蚴感染一只ICR小鼠，采用腹部贴片法感染ICR小鼠，即固定小鼠，剃除小鼠腹部皮毛，暴露小鼠腹部皮肤，用去氯水湿润腹部，将敷有约100条日本血吸虫尾蚴的盖玻片贴附于小鼠的腹壁上，停留20min，去除盖玻片，做好标记每只小鼠感染的尾蚴所对应的钉螺，下架归笼，常规饲养。感染四周后剖杀，根据血吸虫的性别，确定对应钉螺逸出尾蚴的性别,标记相应感染性钉螺。1.4.1.2配对血吸虫感染用上述血吸虫尾蚴性别确定的感染性钉螺所逸出的尾蚴，同样采用腹部贴片法感染，以雌性5条，雄性10条，按感染性钉螺（雌、雄尾蚴）随机配对感染BALB/c小鼠，做好标记每只小鼠感染的尾蚴所对应的钉螺，下架归笼，常规饲养。BALB/c小鼠随机分组，每组2只。1.4.2病理指标的检测BALB/c小鼠感染35d后，收集寄生于每只小鼠肠系膜静脉、肝门静脉的血吸虫虫体，在解剖镜下区分雌、雄虫，进行成虫计数，做好标记，分别置于含无水乙醇的1.5ml离心管中，放置-20℃冰箱内保存待用。称取小鼠体重，剖杀小鼠，摘取肝脏、脾脏，称重。部分左叶肝脏称重后和[43]整个肠组织分别置于10ml和20ml4%氢氧化钾溶液中37℃消化过夜。待组织充分消化后，混合均匀，用微量移液器分别取20µl的消化液滴在载玻片上（取前需震荡），在显微镜下计数虫卵，每份消化液样本计数3次，取平均值。剩下的左叶肝脏称重，研磨后移入脱氯新鲜自来水中，28℃白炽灯照射下孵化毛蚴。孵化开始后每2h收集1次含毛蚴水，共3次，加入数滴卢戈氏碘液后，[44]在显微镜下计数。1.4.3病理指标的计算记录每只BALB/c小鼠的体重、肝重、脾重，分别计算肝重/体重/对成虫和脾[15]重/体重/对成虫；记录肝脏和肠组织沉积虫卵量和毛蚴孵化数，取均值分别计算平均每克肝脏沉积虫卵数、平均每对成虫肝脏沉积虫卵数、平均每对成虫肠组织6 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究第一部分[45]沉积虫卵数、平均每克肝脏孵化毛蚴数及肝脏虫卵孵化率，计算公式如下：（1）平均每克肝脏沉积虫卵数=肝脏沉积虫卵数均值/肝脏重量(g)（2）平均每对成虫肝脏沉积虫卵数=(平均每克肝脏沉积虫卵数×总肝重(g))/成虫对数（3）平均每对成虫肠组织沉积虫卵数=肠组织沉积虫卵总数/成虫对数（4）平均每克肝脏孵化毛蚴数=肝脏孵化毛蚴数均值/肝脏重量(g)（5）肝脏虫卵孵化率（%）=平均每克肝脏孵化毛蚴数×总肝重(g)/肝脏沉积虫卵总数×100%1.4.4组织病理学检测取肝脏右叶组织块经生理盐水洗涤后，在10%中性福尔马林溶液中固定至少24h。（1）组织石蜡切片的制备A.将固定好的肝脏组织块修成厚度约2~3mm的组织样本，修好后放入包埋盒中，做好标记，微流水冲洗过夜。B.将待包埋的组织样本进行依次脱水，具体操作过程为：95%乙醇Ⅰ1h，95%乙醇Ⅱ1h，无水乙醇Ⅰ1h，无水乙醇Ⅱ1h，二甲苯透明20~40min，浸蜡至少40min，在55℃条件下进行。C.组织样本包埋后，置于冷冻台上固定，室温保存。D.轮转式切片机连续切片(≈5µm)，在预设温度55℃展片机水槽中展片，用洁净的粘附载玻片捞片，置切片架上室温干燥贴片。E.将组织切片放入烘箱60℃烤片30~60min。（2）HE染色操作步骤A.将切片脱蜡水化，步骤如下二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min，二甲苯Ⅲ5min，无水乙醇Ⅰ3min，无水乙醇Ⅱ3min，95%乙醇Ⅰ3min，95%乙醇Ⅱ3min，90%乙醇3min，85%乙醇3min，80%乙醇3min，70%乙醇3min，最后置于蒸馏水中。B.苏木素染液染色5min，流动自来水洗2min。C.用1%盐酸乙醇分化2s，流动自来水洗2min。D.55℃温水返蓝5min，流动自来水洗2min，蒸馏水洗1-2min。E.用1%伊红Y染液染色2min，蒸馏水洗2min。7 第一部分日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究F.梯度乙醇脱水：70%乙醇3min，80%乙醇3min，85%乙醇3min，90%乙醇3min，95%乙醇Ⅰ3min，95%乙醇Ⅱ3min，无水乙醇Ⅰ3min，无水乙醇Ⅱ3min。G.二甲苯透明20min，中性树胶封片，镜下观察。（3）肝脏肉芽肿平均直径的测量测定小鼠肝脏虫卵肉芽肿的平均直径，每张切片随机选6个视野拍照(×40倍)，通过图像分析软件(ImageJ-NIH，Bethesda)测量肉芽肿的直径(µm)。测[46]量的肉芽肿形状近似圆形，中心只有一个虫卵，且不与其他肉芽肿粘连。1.4.5微卫星分型和遗传学指标1.4.5.1血吸虫DNA提取（1）预准备A.将Elutionbuffer(每份样本0.5ml)加热到70℃。B.将恒温水浴锅温度设置为50℃。C.将每一瓶WashBuffer需用80ml乙醇(96~100%)稀释。（2）操作步骤A.取1.5ml离心管，将一条日本血吸虫成虫放入，充分研磨；B.向管中依次加入350µlBufferMTL、25µl蛋白酶K，在涡旋振荡器上混匀，然后放在50℃恒温水浴锅中水浴约30min使虫体完全溶解；C.向溶解液中加入350µl氯仿：异戊醇(24:1)，并涡旋振荡混匀。10,000×g离心5min，将上清液转移到新的1.5ml离心管中(避免接触中层白色物质)；D.在上清液中加入等体积BufferMBL，再加入5µlRNaseA，涡旋振荡15s后，在70℃水浴10min；E.加入与上清液等体积的无水乙醇(室温)，涡旋振荡15s以上混匀；F.将混合液转移到DNA柱子中，10,000×g离心1min(室温)，倒掉收集管中的废液；G.将DNA柱子放入一个新的收集管中，加入500µlBufferKB，10,000×g离心30s(室温)，倒掉收集管中的废液；H.将DNA柱子放入收集管中，加入650µlDNAWashBuffer，10,000×g离心1min(室温)，倒掉收集管中的废液；I.重复步骤(H)，倒掉收集管中的废液。将DNA柱子放到新的收集管中，13,000×g离心2min(室温)；J.将DNA柱子放到新的1.5ml离心管中，加入60µl提前预热的(60℃~70℃)8 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究第一部分ElutionBuffer(10mMTris-HCl，pH8.5)洗提DNA，将离心管在室温下静置2min，为将DNA从柱子上洗脱下来，10,000×g离心1min；K.重复步骤(J)，将收集到的DNA放入-20℃低温冰箱中保存待用。1.4.5.2多重PCR[34]采用卞超蓉等方法选取7个微卫星标记，Sjp4，Sjp18，Sjp22，Sjp42，Sjp58，Sjp60，Ts2，根据GenBank公布的基因序列，设计合成7对引物(表1)，并且对其正向引物进行TAMAR，HEX，FAM或ROX荧光标记，由上海生工有限公司合成。扩增反应体系为15µl(见附录一)，包括1×多重PCR混合液，7对引物，DNA样本，去RNA酶水(RNase-freewater)。多重PCR扩增条件(见附录二)。扩增产物片段长度由上海生工生物工程有限公司检测，经GeneMapper4.0软件确定等位基因。表1.日本血吸虫7对微卫星引物信息Table.1Descriptionof7microsatellitelociofSchistosomajaponicum位点引物序列Genbank登陆重复序列参考文献LocusPrimersequences号GenBankRepeatReferenceacc.nomotifSjp4F:TGAGCACAACTGTATATCCCAAAEU262607TAAYinMet[28]R:-TGGGCAGACATACCAGGTTCal.Sjp18F:TCCTTTATCTGGGCTGTAAAB604199TGAXiaoNet[27]R:TTTCAGCAGGATAACATGACGal.Sjp22F:CAAAGCCTAAACGTCATAGACAGAB604201TTAXiaoNet[27]R:CAACCACCGATAAGTAGAGTGGAal.Sjp42F:GCTGCAGCTTCTGTGTAGTAAAB604209TAAXiaoNet[27]R:GTCTTGCTCAGATCAGTTCGTal.Sjp58F:TCCCAGTACCAATGTAGATGTGAB604214AATXiaoNet[27]R:CTAATAAAGTCGTCAAGGAGCAal.Sjp60F:CGATTCATTCATAGCCTGACTAB604215TATXiaoNet[27]R:GAATCCCATCACAGATTAACGal.Ts2F:TTGTCAATAATTTCACTAGGTTCACAF244896GTShrivastava[26]R:AATTAATAATTCACAAGTAAAACATJetal.CTAAGT1.4.6遗传相似性系数的估算[47][48]遗传相似性采用r系数估算，采用软件SPAGeDI1.4得到。1.4.7统计分析采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理。相关分析采用Pearson相关，P<0.05为差异有统计学意义。9 第一部分日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究2.结果2.1日本血吸虫配对个体间遗传相似性总共有16对随机配对的雌雄虫体，遗传相似性系数r值(-0.317~0.531)，结果见表2。表2日本血吸虫配对个体间的遗传相似性Table.2GeneticsimilaritybetweenS.japonicummates遗传相似性(r)重复数GeneticsimilaritybetweenthefemaleandthemaleNumberofreplicates-0.3172-0.2132-0.2062-0.1352-0.1322-0.1272-0.0462-0.0312-0.02220.02020.02120.04320.05420.16120.50120.5312(注：r值越大，代表遗传差异性越小)2.2日本血吸虫配对个体间的遗传相似性与各病理指标的关系配对个体间的遗传相似性与平均每对成虫肝脏沉积虫卵数、平均每对成虫肠组织沉积虫卵数、肝脏虫卵孵化率呈正相关，关联均有统计学意义(P<0.05)；与肝重/体重/对成虫和脾重/体重/对成虫呈正相关，与肝脏肉芽肿的平均直径呈负相关，关联均无统计学意义(P>0.05)(结果见表3、图1.1—1.7)。10 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究第一部分表3日本血吸虫配对个体间的遗传相似性与各病理指标的相关性Table.3CorrelationbetweenGeneticsimilarityoftheS.japonicummatesandpathologicalparameters病理指标相关系数P值PathologicalparameterCorrelationcoefficientPvalue平均每对成虫肝脏沉积虫卵数No.oflivereggsperwormpair0.50160.0478(mean±S.D.)平均每对成虫肠组织沉积虫卵数No.ofguteggsperwormpair0.79650.0002(mean±S.D.)肝脏虫卵孵化率Hatchingrateoflivereggs0.50830.0444(mean±S.D.)肝重/体重/对成虫Liverweight/bodyweight/worm0.10950.6865pair(mean±S.D.)脾重/体重/对成虫Spleenweight/bodyweight/worm0.26530.3206pair(mean±S.D.)肝脏肉芽肿的平均直径Diameterofgranulomaintheliver-0.27270.3069(mean±S.D.)25000200001500010000Meannumberof5000livereggsperwormpair0-0.317-0.213-0.206-0.135-0.132-0.127-0.046-0.031-0.0220.0200.0210.0430.0540.1610.5010.531r图1.1配对个体间遗传相似性与平均每对成虫肝脏沉积虫卵数的关系（r为遗传相似性系数，r值越大，代表遗传差异性越小；不同颜色代表不同虫体的配对）Fig.1.1RelationshipbetweengeneticsimilarityoftheS.japonicummatesandmean11 第一部分日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究numberoflivereggsperwormpairinthedefinitivehost(rforgeneticsimilarity,thehighervalueofr,thesmallergeneticdissimilarityoftheS.japonicummates；eachcolourrepresentsadifferentpaired.)50000400003000020000Meannumberof10000guteggsperwormpair0-0.317-0.213-0.206-0.135-0.132-0.127-0.046-0.031-0.0220.0200.0210.0430.0540.1610.5010.531r图1.2配对个体间遗传相似性与平均每对成虫肠组织沉积虫卵数的关系（r为遗传相似性系数，r值越大，代表遗传差异性越小；不同颜色代表不同虫体的配对）Fig.1.2RelationshipbetweengeneticsimilarityoftheS.japonicummatesandmeannumberofguteggsperwormpairinthedefinitivehost(rforgeneticsimilarity,thehighervalueofr,thesmallergeneticdissimilarityoftheS.japonicummates；eachcolourrepresentsadifferentpaired.)1.00.80.60.4Hatching0.2rateoflivereggs(%)0.0-0.317-0.213-0.206-0.135-0.132-0.127-0.046-0.031-0.0220.0200.0210.0430.0540.1610.5010.531r图1.3配对个体间遗传相似性与肝脏虫卵孵化率的关系（r为遗传相似性系数，r值越大，代表遗传差异性越小；不同颜色代表不同虫体的配对）12 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究第一部分Fig.1.3RelationshipbetweengeneticsimilarityoftheS.japonicummatesandhatchingrateoflivereggsinthedefinitivehost(rforgeneticsimilarity,thehighervalueofr,thesmallergeneticdissimilarityoftheS.japonicummates；eachcolourrepresentsadifferentpaired.)ir0.08apt/m0.06hrigwowet/h0.04reigivLwe0.02ydob0.0073652761201341111103324322245603.3.2.2.1.1.1.0.0.0.0.0.0.0.1.5.5-0-0-0-0-0-0-0-0-00000000r图1.4配对个体间遗传相似性与肝重/体重/对成虫的关系（r为遗传相似性系数，r值越大，代表遗传差异性越小；不同颜色代表不同虫体的配对）Fig.1.4RelationshipbetweengeneticsimilarityoftheS.japonicummatesandliverweight/bodyweight/wormpairinthedefinitivehost(rforgeneticsimilarity,thehighervalueofr,thesmallergeneticdissimilarityoftheS.japonicummates；eachcolourrepresentsadifferentpaired.)13 第一部分日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究0.0200.0150.010Spleenweight/0.005bodyweight/wormpair0.000-0.317-0.213-0.206-0.135-0.132-0.127-0.046-0.031-0.0220.0200.0210.0430.0540.1610.5010.531r图1.5配对个体间遗传相似性与脾重/体重/对成虫的关系（r为遗传相似性系数，r值越大，代表遗传差异性越小；不同颜色代表不同虫体的配对）Fig.1.5RelationshipbetweengeneticsimilarityoftheS.japonicummatesandspleenweight/bodyweight/wormpairinthedefinitivehost(rforgeneticsimilarity,thehighervalueofr,thesmallergeneticdissimilarityoftheS.japonicummates；eachcolourrepresentsadifferentpaired.)800600400200Meandiameterofgranulomaintheliver(um)0-0.317-0.213-0.206-0.135-0.132-0.127-0.046-0.031-0.0220.0200.0210.0430.0540.1610.5010.531r图1.6配对个体间遗传相似性与肝脏肉芽肿平均直径的关系（r为遗传相似性系数，r值越大，代表遗传差异性越小；不同颜色代表不同虫体的配对）Fig.1.6RelationshipbetweengeneticsimilarityoftheS.japonicummatesandmean14 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究第一部分diameterofgranulomainthedefinitivehost(rforgeneticsimilarity,thehighervalueofr,thesmallergeneticdissimilarityoftheS.japonicummates；eachcolourrepresentsadifferentpaired.)-0.317-0.213-0.206-0.135-0.132-0.127-0.046-0.03115 第一部分日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究0.020-0.0220.0210.0430.0540.1610.5010.531100µm图1.7配对个体间遗传相似性对肝脏肉芽肿的影响（图中数值为遗传相似性系数r，r值越大，代表遗传差异性越小；×100）Fig.1.7EffectonthehepaticgranulomainthedefinitivehostinfectedwithdifferentsimilarityoftheS.japonicummates(thevalueonthefigureforgeneticsimilarityr,thehighervalueofr,thesmallergeneticdissimilarityoftheS.japonicummates;×100)16 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究第一部分3.讨论血吸虫病是一种严重危害人类健康的重大感染病，被世界卫生组织（WHO）列为10种被忽视的热带病之一。目前，全球共有78个国家和地区流行血吸虫病，[3]感染者超过2亿人，大约7亿人面临感染威胁。日本血吸虫是通过从中间宿主钉螺体内逸出尾蚴来感染终宿主，大约有46种哺乳动物可自然感染日本血吸虫而成[49][14,15]为其潜在传染源。有研究报道，血吸虫对其终宿主的致病性强弱不一致，血吸虫在终宿主体内进行有性生殖，或许雌雄成虫的基因是造成这一现象的一个重要因素。日本血吸虫的发育要经历虫卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴、童虫、成虫7个阶段。发育过程中的尾蚴、童虫及成虫、虫卵均可引起病变，但以虫卵引起的[8,9]致病性病变最严重，对终宿主机体危害也最大。日本血吸虫成虫寄生于肠系膜下静脉，成虫雌雄合抱交配受精后产卵，血吸虫虫卵随血流进入终末宿主肝、肠组织沉积，在组织中发育成熟，血吸虫虫卵分泌抗原物质，刺激宿主机体形成嗜酸性肉芽肿，从而导致病理损害，是血吸虫病最主要的致病机制。成熟虫卵释放可溶性虫卵抗原，致敏T细胞，使之释放淋巴因子引起以巨噬细胞、淋巴细胞、[50]成纤维细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等细胞聚集为特征的虫卵肉芽肿，会[51]引起肝脾肿大，对终宿主肝重和脾重产生影响，所以记录肝重/体重/对成虫和脾[15]重/体重/对成虫。虫卵沉积越多，则对终宿主组织免疫病理损害越严重。但沉积在宿主不同组织中的虫卵，其生物学和病理学的意义并不相同。沉积在肝组织的虫卵是宿主肝脏免疫病理损害以及血吸虫病肝纤维化的主要致病机制，因此肝组织中的虫卵沉积量可直接反映出对终宿主致病力的大小。而进入肠组织中的虫卵则与终宿主粪便中的虫卵排放量密切相关，即进入肠组织中的虫卵越多，随终宿主粪便排出体外的成熟虫卵数量越多，在一定程度上意味着该血吸虫的生殖能力越强，传播能力越强。因此，血吸虫虫卵在不同组织中的分布量，可客观反映不同遗传差异性的日本血吸虫配对个体对其终宿主致病力及其生殖力和传播力的强[15]弱。沉积虫卵孵化率能在一定程度上，直接反映繁殖的成功率或是传播率，因为血吸虫要完成从终宿主到中间宿主的传播，必须是血吸虫虫卵孵出毛蚴，毛蚴感染中间宿主钉螺，才能完成传播。在本实验中，用单条毛蚴感染钉螺后，其感染率较低，并且毛蚴感染钉螺后，毛蚴在宿主体内发育需要4个月以上。单性感染性钉螺所逸出尾蚴性别的确定需17 第一部分日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究要四周以上，确定其逸出尾蚴性别后，才能进行日本血吸虫雌雄尾蚴配对后感染BALB/c小鼠。感染35d后，对血吸虫终宿主小鼠病理指标进行观测，得出配对个体间遗传相似性分别与平均每对成虫肝脏沉积虫卵数、平均每对成虫肠组织沉积虫卵数、肝脏虫卵孵化率，呈显著正相关，即这些病理指标与配对雌雄成虫间遗传差异性呈显著负相关。实验结果表明日本血吸虫对其终宿主的致病性与配对个体间遗传差异性有关，并且雌雄虫体间遗传差异性越大，其致病性越弱。在影响[16]曼式血吸虫的配对选择中，SophieBeltran等的研究表明，曼氏血吸虫雄虫遗传差异性影响雌虫的配对选择，并且雌虫倾向于选择与其遗传差异性大的雄虫交配，可能原因是遗传差异性大的成虫交配会产生杂合度较大的后代。基因杂合度可能[52]决定寄生虫抵御宿主清除的能力，所以从进化的角度看，这样的子代应该更适应自然环境，所以会产生更多这样的子代。但是在本实验中，遗传差异性较大的雌雄虫体的结合对宿主的致病性是相对较弱的，在肝脏和肠组织中产生的虫卵数都较少，毛蚴的孵出率也较低，这样是不是相矛盾？寄生虫的致病性被认为是寄生虫利用宿主的资源进行生长繁殖，造成的损伤[1]是不可避免的结果，利用宿主的资源是寄生虫传播的先决条件，提高传播率，就会增加致病力。反过来，增加的致病力降低了宿主—寄生虫之间的关联和缩短了潜在寄生虫传播的时间。所以寄生虫将会在致病性和传播之间寻找一个最佳的平[53]衡(trade-offs)，从而最大限度地感染新的宿主。所以，遗传差异性较大的雌雄虫体的结合对宿主的致病性相对较弱，可能是因为血吸虫的致病性和传播存在与[1,54,55]基因相关的平衡作用(trade-offs)。寄生虫在宿主体内产生的病原体越多，会增加病原体的释放，但是同时增加了对宿主的损伤，使宿主的活力下降，减少[56]了与其他宿主接触的频率，进而降低了寄生虫的传播率。日本血吸虫成虫产生的虫卵是对终宿主最主要的致病性病变，虫卵主要沉积在肝脏和结肠肠壁组织，当虫卵的产生速度过快时，会增加血吸虫的传播率。但是，会使终宿主的肝脏和结肠壁聚集过多的虫卵，造成肝脏和肠壁的损伤严重，使终宿主的活力下降。在[57]日本血吸虫山丘流行区，野鼠作为主要的传染源，沟渠作为主要钉螺孳生环境[58]。若野鼠感染了日本血吸虫，雌雄成虫交配产生的虫卵过多，就会使野鼠的活力下降，就会减少其活动范围和活动频率，减少其到沟渠等钉螺孳生环境产生粪便，就会降低毛蚴孵出率，减少毛蚴接触钉螺的机率，从而使血吸虫的传播率降低。所以，可能日本血吸虫的致病性和传播存在与其配对个体间的遗传差异性相18 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究第一部分关的平衡作用。还有可能与血吸虫的生活史有关，日本血吸虫其生长，发育需要经历有性生殖和无性生殖两个过程。在终宿主体内进行有性生殖，有性生殖会产生新的基因[15]型，在中间宿主体内进行无性生殖，使这种基因型大量的增殖。C.M.Davies等研究发现曼氏血吸虫在终宿主和中间宿主体内的繁殖呈负相关，也就是终宿主毛蚴的孵出数量与中间宿主的尾蚴逸出数量呈负相关。这也许能解释日本血吸虫遗传差异性大的雌雄虫体的结合对终宿主致病性相对较弱，可能是因为生物体只有[54,59]有限的资源，在其生活史中需要分配两个宿主不同的功能，所以可能日本血吸虫遗传差异大的成虫交配产生的虫卵在终宿主阶段的数量较少，虫卵孵化率也较低，但是可能在中间宿主钉螺体内会有更高的繁殖率，逸出更多的尾蚴，使这种基因杂合度更大的血吸虫虫卵进行传播。这可能是血吸虫的一个重要的与基因相关的传播策略。这可能也是影响血吸虫防治的潜在因素。19 第二部分日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究第二部分日本血吸虫致病性与其配对个体间杂合度差异的关系[60]血吸虫的成虫雌雄异体，是单配偶制物种的最低分类级别，所以其子代的[61][62,63]基因是由配对的两个亲本所决定的，根据基因杂合性的假说，雌性个体会选择杂合度高的雄性个体配对，因为与杂合度高的雄性个体配对，其子代的平均杂合度高于与随意选择的雄性个体配对。杂合度影响雌性个体配对选择的研究多[64,65]在动物方面，在曼氏血吸虫的配对选择的研究中发现，基因杂合度不会影响[16]雌虫的配对选择，然而血吸虫配对个体间的杂合度对其终宿主的致病性是否会有影响，尚罕有研究。因此，本实验选用了日本血吸虫感染小鼠进行研究。日本血吸虫病是重要的人类寄生虫病之一，严重影响着人类的身体健康和国家、地区[23]的经济发展。目前，日本血吸虫全基因组测序已提供了完整DNA序列，并且已[24-26]经筛选并鉴定出了高度多态的微卫星位点(microsatellite)，这大大降低了设计特异性引物的难度，且因其方法简便、DNA用量少、重复性高、稳定性好、多等[27]位基因、共显性遗传等优点，被广泛应用。因此本实验采用微卫星标记的方法对日本血吸虫进行基因分型，计算配对雌雄成虫间的杂合度差值，观察终宿主平均每对成虫肝脏沉积虫卵数、平均每对成虫肠组织沉积虫卵数、肝脏虫卵孵化率、肝脏肉芽肿平均直径、肝重/体重/对成虫和脾重/体重/对成虫，探究日本血吸虫致病性与其配对个体间杂合度差异的关系。1.材料与方法1.1材料1.1.1单性感染性钉螺[41,42]源于本课题的前期研究，尾蚴感染小鼠，解剖收集肝虫卵，孵化毛蚴，毛蚴感染钉螺，每只钉螺只感染1条毛蚴，逸蚴分离感染性钉螺，获得单性血吸虫感染的钉螺。1.1.2实验动物ICR小鼠，雌性，8~10周龄，体重(30±2)g；BALB/c小鼠，雌性，8周龄，体重(20±2)g，由苏州大学医学部实验动物中心提供。所有实验动物均饲养于可控环境中，可自由获取食物水。20 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究第二部分1.2仪器与试剂、材料1.2.1仪器FA2104S电子天平上海精工产品数字式移液器枪上海FinnpipetteThermoOlympusCX31显微镜Olympus产品SZX12解剖显微Olympus产品SMZ-B2连续变倍体视显微镜重庆奥特光学有限公司OlympusCKX41显微镜Olympus产品OlympusC-7070照相机Olympus产品高速离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司贝克曼低温离心机美国贝克曼库尔特有限公司CL21R小型冷冻高速离心机美国Thermo产品YQ-DSX-280A型压力蒸汽灭菌器上海中安医疗器械厂DW-25L262低温冰箱青岛海尔DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司SIMPLICLTYUV超纯水系统MILLIPORE产品SIM-F140AY65制冰机日本三洋产品DNYS8-VORTEX-5涡旋振荡器其林贝尔产品DK-S22恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司SW-CJ-2FD超净工作台苏净安泰公司ArktikPCR扩增仪美国Thermo产品BMJ-Ⅲ型病理组织包埋冷冻台常州市中威电子仪器有限公司BMJ-Ⅲ型包埋机常州市中威电子仪器有限公司PAY-Ⅲ型病理组织漂烘仪常州市中威电子仪器有限公司LEICARM2135切片机德国LEICA公司1.2.2主要试剂氯化钠国药集团化学试剂有限公司二水合柠檬酸钠国药集团化学试剂有限公司氢氧化钾国药集团化学试剂有限公司磷酸二氢钠国药集团化学试剂有限公司二甲苯国药集团化学试剂有限公司无水乙醇国药集团化学试剂有限公司甲醛上海试剂四厂21 第二部分日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究伊红上海化学试剂总厂产品苏木素上海化学试剂总厂产品氯仿国药集团化学试剂有限公司异戊醇国药集团化学试剂有限公司卢戈氏碘液济宁鲁化生产力促进中心软体动物组织DNA提取试剂盒(BufferMTL、ProteaseK、BufferMBL、BufferKB、RNaseA、DNAWashBuffer、ElutionBuffer、ezBindDNAColumns、2mlCollectionTubes)上海妙骏生物科技有限公司TaqPCRMasterMix试剂盒(2×TaqPCRMasterMix，Nuclease-freeddH2O，MgCl2)生工生物工程(上海)股份有限公司1.3溶液配制同第一部分1.4方法1.4.1感染小鼠1.4.1.1单性血吸虫感染每只单性感染性钉螺置于24孔细胞培养板中，每孔一只，逸出尾蚴，采用腹部贴片法，每孔尾蚴感染一只ICR小鼠，每鼠感染尾蚴约100条。感染四周后剖杀，根据雌雄血吸虫的性别，确定对应钉螺逸出尾蚴的性别。1.4.1.2配对血吸虫感染用上述血吸虫尾蚴性别确定的感染性钉螺所逸出的尾蚴，同样采用腹部贴片法感染，以雌性5条，雄性10条，按感染性钉螺(雌、雄尾蚴)随机配对感染BALB/c小鼠，做好标记每只小鼠感染的尾蚴所对应的钉螺，下架归笼，常规饲养。感染小鼠随机分组，每组2只。1.4.2病理指标的检测BALB/c小鼠感染35d后，收集血吸虫虫体，在解剖镜下区分雌、雄虫，进行成虫计数，做好标记，分别置于无水乙醇中，放置-20℃保存待用。称取小鼠体重，剖杀小鼠，摘取肝脏、脾脏，称重。采用第一部分的方法，[43]将部分左叶肝脏称重后和整个肠组织分别消化，记录肝脏和肠组织中的沉积虫[44]卵数。剩下的左叶肝脏称重，同第一部分方法，孵化毛蚴，计数。22 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究第二部分1.4.3病理指标的计算记录每只BALB/c小鼠的体重、肝重、脾重，分别计算肝重/体重/对成虫和脾[15]重/体重/对成虫；记录肝脏和肠组织沉积虫卵量和毛蚴孵化数，取均值分别计算平均每克肝脏沉积虫卵数、平均每对成虫肝脏沉积虫卵数、平均每对成虫肠组织[45]沉积虫卵数、平均每克肝脏孵化毛蚴数及肝脏虫卵孵化率，计算公式，同第一部分。1.4.4组织病理学检测取肝脏组织右叶长、宽、高大小约为0.5cm组织块经生理盐水洗涤后，4℃固定于10%中性福尔马林中待用。（1）组织石蜡切片的制备方法同第一部分。（2）HE染色操作步骤方法同第一部分。（3）肝脏肉芽肿平均直径的测量方法同第一部分。1.4.5微卫星分型和遗传学指标1.4.5.1血吸虫DNA提取方法同第一部分。1.4.5.2多重PCR[34]采用卞超蓉等方法选取Sjp4，Sjp18，Sjp22，Sjp42，Sjp58，Sjp60，Ts2，设计合成7对引物(表1)，扩增反应体系为15µl(见附录一)。多重PCR扩增条件(见附录二)。扩增产物片段长度由上海生工生物工程有限公司检测，经GeneMapper4.0软件确定等位基因。1.4.6杂合度差值的计算[17]杂合度按照Beltran,S.等的方法计算，虫体杂合度为虫体杂合位点数占虫体总位点数的比例，配对雌、雄血吸虫个体杂合度的差值(△H)，即△H=雄虫杂合度–雌虫杂合度。1.4.7统计分析采用SPSS17.0统计软件分析数据做统计学处理，用t检验评价组间差异的统计学意义(*P<0.05，**P<0.01)。23 第二部分日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究2.结果2.1日本血吸虫配对个体间杂合度差值总共有16对雌雄虫体随机配对，杂合度差值△H(-0.43~+0.29)。按△H的大小分为三个组。△H<0，表示雄虫的杂合度小于雌虫；△H=0，表示雌雄虫体的杂合度相等；△H>0，表示雄虫的杂合度大于雌虫，结果见表4。表4日本血吸虫配对个体间的杂合度差值Table.4HeterozygositybetweenS.japonicummates范围均值重复数RangeMeanNumberofreplicates△H<0-0.2212△H=006△H>00.15142.2日本血吸虫配对个体间杂合度差值对各病理指标的影响配对个体间杂合度差值不同，各病理指标的结果(见表5、图2.1—2.7)，可以看出△H的不同，△H<0(雄虫杂合度小于雌虫)平均每对成虫肠组织沉积虫卵数和肝脏虫卵孵化率均显著高于(P=0.0023、P=0.0102)△H=0(雌雄虫体间杂合度相等)；△H>0(雄虫杂合度大于雌虫)平均每对成虫肠组织沉积虫卵数和肝脏虫卵孵化率，均显著高于(分别为P=0.0069、P=0.0161)△H=0组；△H=0肝重/体重/对成虫和脾重/体重/对成虫，均显著高于(分别为P=0.0164、P=0.0153)△H<0；△H=0组肝重/体重/对成虫和脾重/体重/对成虫，均显著高于(P=0.0040、P=0.0105)△H>0；△H=0分别与△H<0、△H>0在平均每对成虫肝脏沉积虫卵数和肝脏肉芽肿平均直径，均没有显著性差异(P>0.05)；病理指标在△H<0与△H>0之间均没有显著性差异(P>0.05)。24 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究第二部分表5配对个体间杂合度差值对终宿主各病理指标影响Table.5EffectsonpathologicalparametersinthedefinitivehostinfectedwithheterozygositydifferenceoftheS.japonicummates△H<0△H=0△H>0平均每对成虫肠组织沉积虫卵数No.ofguteggsperwormpair29878±9282**14713±595424231±6553**(mean±S.D.)肝脏虫卵孵化率(%)Hatchingrateoflivereggs0.41±0.23*0.11±0.120.32±0.17*(mean±S.D.)肝重/体重/对成虫Liverweight/bodyweight/worm0.021±0.008*0.038±0.0200.019±0.006**pair(mean±S.D.)脾重/体重/对成虫Spleenweight/bodyweight/worm0.004±0.002*0.008±0.0040.004±0.002*pair(mean±S.D.)平均每对成虫肝脏沉积虫卵数No.oflivereggsperwormpair4931±31996726±45695984±5017(mean±S.D.)肝脏肉芽肿平均直径(µm)Diameterofgranulomaintheliver486.98±80.59480.69±236.12478.69±62.76(mean±S.D.)*P<0.05VS△H=0(T.test)；**P<0.01VS△H=0(T.test)；40000**30000**2000010000Meannumberofguteggsperwormpair0<00>0△H图2.1配对个体间杂合度差值对每对成虫肠组织沉积虫卵数的影响Fig.2.1EffectsonmeannumberofguteggsperwormpairinthedefinitivehostinfectedwithheterozygositydifferenceoftheS.japonicummates(**P<0.01)25 第二部分日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究0.6**0.4Hatching0.2rateoflivereggs(%)0.0<00>0△H图2.2配对个体间杂合度差值对肝脏虫卵孵化率的影响Fig.2.2EffectsonhatchingrateoflivereggsinthedefinitivehostinfectedwithheterozygositydifferenceoftheS.japonicummates(*P<0.05)**0.05*0.040.030.02Liverweight/0.01bodyweight/wormpair0.00<00>0△H图2.3配对个体间杂合度差值对肝重/体重/对成虫的影响Fig.2.3Effectsonliverweight/bodyweight/wormpairinthedefinitivehostinfectedwithheterozygositydifferenceoftheS.japonicummates(*P<0.05；**P<0.01)26 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究第二部分0.015**0.0100.005Spleenweight/bodyweight/wormpair0.000<00>0△H图2.4配对个体间杂合度差值对脾重/体重/对成虫的影响Fig.2.4Effectsonspleenweight/bodyweight/wormpairinthedefinitivehostinfectedwithheterozygositydifferenceoftheS.japonicummates(*P<0.05)10000800060004000Meannumberof2000livereggsperwormpair0<00>0△H图2.5配对个体间杂合度差值对平均每对成虫肝脏沉积虫卵数的影响Fig.2.5EffectsonmeannumberoflivereggsperwormpairinthedefinitivehostinfectedwithheterozygositydifferenceoftheS.japonicummates27 第二部分日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究800600400200Meandiameterofgranulomaintheliver(um)0<00>0△H图2.6配对个体间杂合度差值对肝脏肉芽肿平均直径的影响Fig.2.6EffectsonmeandiameterofgranulomainthedefinitivehostinfectedwithheterozygositydifferenceoftheS.japonicummates△H<0△H=028 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究第二部分△H>0100µm图2.7配对个体间杂合度差值对肝脏肉芽肿的影响Fig.2.7EffectonthehepaticgranulomainthedefinitivehostinfectedwithheterozygositydifferenceoftheS.japonicummates(×100)3.讨论血吸虫病是一种严重危害人类健康的重大感染病，被世界卫生组织(WHO)列为10种被忽视的热带病之一。有研究报道，血吸虫对其终宿主的致病性强弱不[14,15]一致，血吸虫在终宿主体内进行有性生殖，或许雌雄成虫的基因是造成这一现象的一个重要因素。在本实验中，毛蚴在钉螺体内发育和单性感染性钉螺逸出尾蚴性别的确定，以及在终宿主体内发育，总共所需周期在六个月以上。在单性感染性钉螺逸出尾蚴的性别确定后，进行日本血吸虫的配对感染，感染35d后，剖杀小鼠，收集成虫进行微卫星标记检测，计算配对感染的雌雄日本血吸虫成虫的杂合度差值，观察宿主的病理现象与血吸虫配对个体间杂合度差异的关系，有助于进一步了解血吸虫的致病性及传播的进化。日本血吸虫成虫寄生于肠系膜下静脉，成虫雌雄合抱交配受精后产卵，血吸虫虫卵随血流进入终末宿主肝脏、肠组织沉积，在组织中发育成熟，虫卵沉积越多，则对终宿主组织免疫病理损害越严重。但沉积在宿主不同组织中的虫卵，其生物学和病理学的意义并不相同。在本实验中对血吸虫终宿主小鼠病理的几个方面的观测，可以看出△H<0(雄虫杂合度小于雌虫)、△H>0(雄虫杂合度大于雌虫)在平均每对成虫肠组织沉积虫卵数和肝脏虫卵孵化率均显著高于△H=0(雌雄虫体间杂合度相等)，但这几个指标在△H<0与△H>0之间没有显著性差异。因为进入肠组织中的虫卵与终宿主粪便中的虫卵排放量密切相关，即进入肠组织中的虫卵越多，随终宿主粪便29 第二部分日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究排出体外的成熟虫卵数量越多，在一定程度上意味着该血吸虫的生殖能力越强，传播能力越强。毛蚴的孵出率能在一定程度上，直接反映繁殖的成功率或是传播[17]率，因为血吸虫要完成从终宿主到中间宿主的传播，必须是血吸虫虫卵孵出毛蚴，毛蚴感染中间宿主钉螺。所以，杂合度有差异的雌雄虫体配对时，其传播率高于杂合度相等的成虫配对。在本实验中，△H=0在肝重/体重/对成虫和脾重/体重/对成虫，均显著高于△H<0、△H>0。因为血吸虫成熟虫卵会释放可溶性虫卵抗原，致敏T细胞，使之释放淋巴因子引起以巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细[50][51]胞等细胞聚集为特征的虫卵肉芽肿，会引起肝脾肿大，对终宿主肝重和脾重[15]产生影响。所以，杂合度相等的雌雄虫体配对，其致病性高于杂合度有差异的虫体配对。[62,63]根据基因杂合性的假说，在脊椎动物交配选择的研究中，雌性个体倾向[64,65]于选择杂合度大的雄性个体交配，因为会产生较大杂合度的后代。在自然环[66]境中，杂合度大的个体存活率更高。基因杂合度可能决定寄生虫抵御宿主清除[52]的能力。所以从进化的角度看，这样的子代应该更适应自然环境，会增加传播率，产生更多这样的子代。但是，在本实验中，病理指标在△H<0、△H>0之间均没有显著性的差异，即雌性血吸虫无论与比其杂合度大还是小的雄虫配对时，对终宿主阶段致病性和传播均没有影响。也就是说，雌虫与比其杂合度大的雄虫交配时，并没有产生更多的虫卵即子代。在猪个体基因杂合度对生长性状影响的研究中发现，并不是个体的杂合度越高其生长性状就越好，而是个体基因杂合度在[67]一定值时，其生长性状值最高，之后随着个体基因杂合度的增加而降低。血吸[60]虫的交配属于单配偶性，在终宿主体内进行有性生殖，所以其子代的基因是由[61]配对的两个亲本所决定的。有可能是因为杂合度有差异的雌雄虫体配对，产生的虫卵即子代，子代的杂合度在一定值时，其生长性状会最高。血吸虫配对虫体的杂合度差值在一定值时，可能会产生最高生长性状的虫卵。所以，病理指标在△H<0、△H>0之间均没有显著性的差异。但是，是否存在这样一个配对个体间杂合度的差值，还需进一步的实验探究。30 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究主要结论本实验对日本血吸虫致病性与其遗传学特征的关系进行了初步研究，主要有：1.本研究初步证明日本血吸虫对其终宿主的致病性与配对个体间遗传差异性有关，并且遗传差异性越大，其致病性越弱。可能是因为血吸虫的致病性和传播存在与基因相关的平衡作用，也可能与血吸虫在中间宿主和终宿主体内的增殖呈负相关有关。2.日本血吸虫配对个体间杂合度差异影响其在终宿主阶段的传播和致病性，杂合度有差异的雌雄虫体配对，在终宿主阶段的传播率较高，而杂合度相等的雌雄虫体配对，其致病性更强。3.遗传差异性和杂合度差值的分析可揭示血吸虫在终宿主阶段的致病性和传播特征，有助于深入了解日本血吸虫致病性和传播的特征，也为进一步有效控制血吸虫病流行提供新的思路。31 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综述日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究综述寄生虫的遗传关系对宿主致病性的影响大部分寄生虫的感染包括多种寄生虫株或者是不同寄生虫虫种的感染，这种多样性感染不仅在人类中存在，在自然界中也普遍存在，包括多种生物，如细菌、[1]植物和动物。感染的结果主要是寄生虫得到生存和繁殖，对其宿主产生致病性[2](寄生虫在宿主体内的生存和繁殖对宿主产生的损伤称为致病性)。研究发现，寄[3-5]生虫的致病性与基因相关，多样性感染意味着多种不同基因型寄生虫的感染，也就是寄生虫之间的遗传关系会变远，不同遗传关系的寄生虫在宿主体内的相互[1,6,7]作用会影响其对宿主致病性的强度。本文就寄生虫之间的遗传关系对其宿主致病性影响的研究作一综述。寄生虫之间的遗传关系，通过它们在宿主体内的相互作用影响其对宿主的致病强度，主要分为竞争和合作。一、大量的理论和流行病学模型预测，由于在宿主体内的竞争作用，混合感[1,8-11]染的寄生虫菌株(遗传关系远)，致病性较大的菌株有竞争优势，对宿主造成的损伤更严重。寄生虫之间的竞争作用，包括直接竞争、间接竞争、免疫介导竞争。1)、直接竞争寄生虫通过释放化学物质或机械损伤，直接抑制竞争对手的生长、繁殖和传播。最常见的是释放有毒的化合物，在细菌感染中尤为常见，细菌素作为竞争“武[12]器”是非常广泛的。有研究表明，多种大肠杆菌菌株能产生一种或多种大肠杆[13]菌素。在软琼脂基质，大肠杆菌释放大肠杆菌素，杀死周边敏感的细菌，在自[14]己周围形成抑制区域。在人类的上呼吸道感染中发现，肺炎链球菌会产生过氧[15]化氢(H2O2)，这种物质对其自身没有影响，但会使金黄色葡萄球菌裂解。不同的单一（遗传关系近）和混合（遗传关系远）病原体菌株发光杆菌和异发光杆菌接种于大蜡螟，混合病原体感染的宿主比单一病原体感染的宿主致病性弱，因为两菌株会释放细菌毒素相互杀死对方。由于病原体间的直接竞争作用，[16]减少宿主体内的病原体的数量，减轻了对宿主的致病性。38 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究综述所以可以认为遗传关系远的寄生虫之间的直接竞争会使其对宿主的致病性减弱。2)、间接竞争寄生虫致病性的进化的现代模式的基本原理之一，就是当宿主被多种基因型的寄生虫感染（遗传关系远）会使致病性增强，由于宿主的有限资源被利用造成[10,17-19]的悲剧（Tragedyofthecommons），这个理论非常普遍。不同基因型的寄生虫使宿主的致病性增强主要是由于在宿主体内相互竞争宿主的资源。相同物种的寄生虫株在大多数的情况下（异种寄生虫有时候也有）有[12]相同的生态位。最有代表性的例子，在多种疟原虫虫株混合感染的研究中发现，致病性强的虫株（即那些会引起更大的血红细胞损耗，能够达到更高的峰值密度[20,21]的虫株）比致病性弱的虫株更有竞争力，使宿主的损伤更为严重。在真菌的研究中也有相同的发现，花药黑粉菌是一种授粉媒介传播的真菌，它通过使受感染植物的子房受损，用其孢子代替花粉去雄。不同菌株的花药黑粉[22]菌会争夺空间和垄断被感染的植物。在多种菌株的花药黑粉菌混合感染的研究[2]中发现，混合感染会使宿主的去雄程度增高，恢复率降低，使宿主的致病性增强。在根虫瘟霉菌株感染菱纹背蛾的研究中发现，不同的根虫瘟霉菌株感染菱纹背蛾[23]时致病性强，产生的分生孢子比单一菌株感染时产生的多。在病毒的研究中，多个基因型的核型多角体病毒感染鳞翅目幼虫，对宿主的[24]致病性强，更容易杀死宿主，其复制产生的个体也多于单个基因型感染宿主。所以，可以认为遗传关系远的寄生虫之间的间接竞争会使其对宿主的致病性增强。3)、免疫介导的竞争寄生虫的不同种群或是不同虫株竞争逃避宿主的免疫反应，在非特异性免疫反应和交叉反应的免疫应答，不管是哪种寄生虫引起的免疫反应，这些不同的寄生虫都会成为靶点，所以如果寄生虫的数量多的会有竞争优势，具有逃脱宿主免[12]疫的优势。在单一和混合感染的有毒和无毒的疟原虫感染免疫缺陷和免疫活性小鼠的研究中发现，免疫介导的相互作用对无毒疟原虫虫株产生竞争性抑制，在免疫缺陷小鼠中无毒株的相对密度高，有毒株和无毒株混合感染免疫活性小鼠时，[25]有毒株的密度较高，有毒株逃避了免疫反应。多种菌株感染数量的增加，也就增加了抗原性表位数量，会刺激活化和增殖[26]更多免疫细胞系，这就意味着在放大对宿主资源的需求。HIV-1混合感染，会增39 综述日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究加病毒复制、病毒基因型的异质性和CD4T淋巴细胞丧失，导致免疫功能加速下[27]降，存活率降低，增加HIV-1的传播风险。调查研究发现，人感染HIV-1，多株感染会加速从血清型转换到临床艾滋病疾病进程（8-10年缩短为2-4年）。但产生的基本机制尚未知。最有可能的机制，增加的总病原体负荷，或通过更多的遗传[28]多样性提高免疫逃逸。另一个遗传关系远，增加对宿主的致病性的例子，与只感染疟原虫相比，疟原虫和丝虫共同感染BALB/c小鼠，小鼠会出现更加严重的贫血和体重下降。可能[29]丝虫的感染影响了宿主的免疫调节，从而削弱了对疟原虫的控制。在遗传关系远的寄生虫之间的免疫调节竞争，使宿主的致病性增强，但是也有部分遗传关系远的多种寄生虫感染引起宿主的免疫调节，使宿主的致病性减弱，如：不同的布氏锥虫虫株感染小鼠，宿主的存活率高于单一虫株的感染，竞争性[30]抑制可能是由化感干扰或竞争菌株特异性免疫应答介导的。二、合作与病原体之间的竞争相反，导致宿主的致病性强弱取决于病原体间的合作，[6,7,31]那么在混合感染中，致病性较弱的菌株就有优势。寄生虫之间的这种相互作[6,用或许能解释为什么会出现菌株多样性（菌株间遗传关系远）会出现低的致病性7,11,32,33]。在一般的情况下认为，遗传关系越远的寄生虫感染宿主（菌株的多样性[10,34,35]大），会增加对宿主资源的利用，导致其致病性越强，但是，如果寄生虫之间存在合作关系，那么遗传关系近的菌株就会更加有利于合作，也就是会加强对[6,36]宿主资源的利用，增强对宿主的致病力。[7]寄生虫生产一些物质，相当于可以共用的资源，非生产者也能利用。Turner[37]andChao的研究中发现，在丁香假单胞菌分别被低和高的多样的噬菌体感染，发现在高度的多样性（遗传关系远）感染中，对宿主的致病性较弱，因为噬菌体能产生一种复制酶，可以被所有的病毒粒子所利用，可以被视为一种公共资源，在多样性感染时突变体能够进化成不需要消耗能量就可以生产复制酶，而且具有选择的优势在与复制酶生产者的共同感染中，相反，在高亲缘关系的情况下，这种突变不会发生。另一个很好的例子，公共资源，铜绿假单胞菌生产的细胞外铁载体，铁载体的生产是需要消耗能量的，但同时在铁资源有限的情况下是很有益的。因此在野生型和突变型的铜绿假单胞菌混合感染中，突变型菌可以不需消耗能量就可以生40 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究综述[38]产铁载体，所以突变型菌在混合感染中有竞争优势，密度增加，与上述的体外实验结果一致，在病人的囊性纤维化的肺部发现了这种自然铁载体突变型的铜绿[39]假单胞菌存在。遗传关系在铜绿假单胞菌铁载体介导的合作和致病性之间的联系的研究中，在单个野生型铜绿假单胞菌的铁载体产生菌（合作者），同基因铁载体负突变菌，[40]分别感染或者是二者同时感染大蜡螟，在混合感染中，铁载体负突变的细菌数量的增长速度快，而单种菌株的感染，合作者以相反的模式生长。因此遗传关系[40]远的菌株感染更可能有利于铁载体负突变的演变。在先前的研究中，已经发现[41]含突变型的菌株的感染，导致宿主致病性比纯（合作者）的感染相对较弱。因此，遗传关系远的寄生虫在宿主体内的相互合作关系，会导致其对宿主致病性减弱。结语综上所述，寄生虫的遗传关系在宿主体内通过不同的相互作用会影响其对宿主的致病性。遗传关系远的寄生虫在宿主体内由于病原体间的直接竞争作用，减少宿主体内的病原体的数量，减轻对宿主的致病性；遗传关系远的寄生虫在宿主体内间接竞争会使其宿主的致病性增强，主要是由于在宿主体内相互竞争宿主的资源；在免疫介导的竞争中，多种菌株感染数量的增加（菌株间遗传关系远），也就增加了抗原性表位，会刺激活化和增殖更多的免疫细胞系，就会放大对宿主的资源需求，增强其对宿主的毒性，但是免疫反应的复杂性，也会存在遗传关系远的寄生虫降低宿主的致病性；寄生虫之间存在合作关系，那么遗传关系近的菌株就会更加有利于合作，就会加强对宿主资源的利用，增强对其宿主的致病性。寄生虫的致病性是非常复杂的，致病性不是单独由寄生虫自身决定的，而是由寄生[10,42-45]虫和宿主基因型之间的相互作用所决定的。除此之外，寄生虫周围的环境[46-48]也可能是影响其致病性的一个重要因素，所以要了解寄生虫的致病性需要我们进一步深入研究。41 综述日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究参考文献1.Alizon,S.,deRoode,J.C.,Michalakis,Y.,Multipleinfectionsandtheevolutionofvirulence.EcolLett,2013.16(4):p.556-567.2.Buono,L.,Lopez-Villavicencio,M.,Shykoff,J.A.,etal.,Influenceofmultipleinfectionandrelatednessonvirulence:diseasedynamicsinanexperimentalplantpopulationanditscastratingparasite.PLoSOne,2014.9(6):p.e98526.3.Ebert,D.,Herre,E.A.,Theevolutionofparasiticdiseases.ParasitolToday,1996.12(3):p.96-101.4.Read,A.F.,Theevolutionofvirulence.TrendsMicrobiol,1994.2(3):p.73-6.5.Bull,J.J.,Perspective-Virulence.Evolution,1994.48(5):p.1423-1437.6.Brown,S.P.,Hochberg,M.E.,Grenfell,B.T.,Doesmultipleinfectionselectforraisedvirulence?TrendsMicrobiol,2002.10(9):p.401-405.7.Buckling,A.,Brockhurst,M.A.,Kinselectionandtheevolutionofvirulence.Heredity(Edinb),2008.100(5):p.484-488.8.May,R.M.,Nowak,M.A.,Coinfectionandtheevolutionofparasitevirulence.ProcBiolSci,1995.261(1361):p.209-215.9.vanBaalen,M.,Sabelis,M.W.,Thescopeforvirulencemanagement:acommentonEwald'sviewontheevolutionofvirulence.TrendsMicrobiol,1995.3(11):p.414-416;discussion416-417.10.Frank,S.A.,Modelsofparasitevirulence.QRevBiol,1996.71(1):p.37-78.11.Read,A.F.,Taylor,L.H.,Theecologyofgeneticallydiverseinfections.Science,2001.292(5519):p.1099-1102.12.Mideo,N.,Parasiteadaptationstowithin-hostcompetition.TrendsParasitol,2009.25(6):p.261-268.13.Gordon,D.M.,O'Brien,C.L.,BacteriocindiversityandthefrequencyofmultiplebacteriocinproductioninEscherichiacoli.Microbiology,2006.152(Pt11):p.3239-3244.14.Chao,L.,Levin,B.R.,Structuredhabitatsandtheevolutionofanticompetitortoxinsinbacteria.ProcNatlAcadSciUSA,1981.78(10):p.6324-6328.42 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究综述15.Selva,L.,Viana,D.,Regev-Yochay,G.,etal.,Killingnichecompetitorsbyremote-controlbacteriophageinduction.ProcNatlAcadSciUSA,2009.106(4):p.1234-1238.16.Massey,R.C.,Buckling,A.,ffrench-Constant,R.,Interferencecompetitionandparasitevirulence.ProcBiolSci,2004.271(1541):p.785-788.17.vanBaalen,M.,Sabelis,M.W.,Thedynamicsofmultipleinfectionandtheevolutionofvirulence.AmericanNaturalist,1995.146(6):p.881-910.18.Mosquera,J.,Adler,F.R.,Evolutionofvirulence:aunifiedframeworkforcoinfectionandsuperinfection.JTheorBiol,1998.195(3):p.293-313.19.Gandon,S.,Jansen,V.A.,vanBaalen,M.,Hostlifehistoryandtheevolutionofparasitevirulence.Evolution,2001.55(5):p.1056-1062.20.Bell,A.S.,deRoode,J.C.,Sim,D.,etal.,Within-hostcompetitioningeneticallydiversemalariainfections:parasitevirulenceandcompetitivesuccess.Evolution,2006.60(7):p.1358-1371.21.deRoode,J.C.,Helinski,M.E.,Anwar,M.A.,etal.,Dynamicsofmultipleinfectionandwithin-hostcompetitioningeneticallydiversemalariainfections.AmNat,2005.166(5):p.531-542.22.Schafer,A.M.,Kemler,M.,Bauer,R.,etal.,TheillustratedlifecycleofMicrobotryumonthehostplantSilenelatifolia.Botany-Botanique,2010.88(10):p.875-885.23.Morales-Vidal,S.,Alatorre-Rosas,R.,Clark,S.J.,etal.,CompetitionbetweenisolatesofZoophthoraradicansco-infectingPlutellaxylostellapopulations.JournalofInvertebratePathology,2013.113(2):p.137-145.24.Hodgson,D.J.,Hitchman,R.B.,Vanbergen,A.J.,etal.,Hostecologydeterminestherelativefitnessofvirusgenotypesinmixed-genotypenucleopolyhedrovirusinfections.JEvolBiol,2004.17(5):p.1018-1025.25.Raberg,L.,deRoode,J.C.,Bell,A.S.,etal.,Theroleofimmune-mediatedapparentcompetitioningeneticallydiversemalariainfections.AmNat,2006.168(1):p.41-53.26.Balmer,O.,Tanner,M.,Prevalenceandimplicationsofmultiple-straininfections.43 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日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究综述39.DeVos,D.,DeChial,M.,Cochez,C.,etal.,StudyofpyoverdinetypeandproductionbyPseudomonasaeruginosaisolatedfromcysticfibrosispatients:prevalenceoftypeIIpyoverdineisolatesandaccumulationofpyoverdine-negativemutations.ArchMicrobiol,2001.175(5):p.384-388.40.Harrison,F.,Browning,L.E.,Vos,M.,etal.,CooperationandvirulenceinacutePseudomonasaeruginosainfections.BMCBiol,2006.4:p.21.41.Meyer,J.M.,Neely,A.,Stintzi,A.,etal.,PyoverdinisessentialforvirulenceofPseudomonasaeruginosa.InfectionandImmunity,1996.64(2):p.518-523.42.Mackinnon,M.J.,Gaffney,D.J.,Read,A.F.,Virulenceinrodentmalaria:hostgenotypebyparasitegenotypeinteractions.InfectGenetEvol,2002.1(4):p.287-296.43.deRoode,J.C.,Altizer,S.,Host-parasitegeneticinteractionsandvirulence-transmissionrelationshipsinnaturalpopulationsofmonarchbutterflies.Evolution,2010.64(2):p.502-514.44.Ebert,D.,Bull,J.J.,Challengingthetrade-offmodelfortheevolutionofvirulence:isvirulencemanagementfeasible?TrendsinMicrobiology,2003.11(1):p.15-20.45.Lambrechts,L.,Fellous,S.,Koella,J.C.,Coevolutionaryinteractionsbetweenhostandparasitegenotypes.TrendsinParasitology,2006.22(1):p.12-16.46.Bergelson,J.,Purrington,C.B.,Surveyingpatternsinthecostofresistanceinplants.AmericanNaturalist,1996.148(3):p.536-558.47.Ferguson,H.M.,Read,A.F.,Geneticandenvironmentaldeterminantsofmalariaparasitevirulenceinmosquitoes.ProceedingsoftheRoyalSocietyB-BiologicalSciences,2002.269(1497):p.1217-1224.48.Orlofske,S.A.,Jadin,R.C.,Johnson,P.T.J.,It'sapredator-eat-parasiteworld:howcharacteristicsofpredator,parasiteandenvironmentaffectconsumption.Oecologia,2015.178(2):p.537-547.45 附录日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究附录附录一：多重PCR反应体系Sjp18F:0.06µlR:0.06µlSjp22F:0.015µlR:0.015µlSjp58F:0.06µlR:0.06µlSjp42F:0.0375µlR:0.0375µlTs2F:0.0375µlR:0.0375µlSjp4F:0.015µlR:0.015µlSjp60F:0.03µlR:0.03µl多重PCR混合液7.5µlddH2O5.99µl样本DNA1µl总体积15µl46 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究附录附录二：多重PCR反应条件InitialPCRactionstep5min95℃3-stepcyclingDenaturation30s95℃Annealing90s57℃5cycleExtension30s72℃3-stepcyclingDenaturation30s95℃Annealing90s55℃5cycleExtension30s72℃3-stepcyclingDenaturation30s95℃Annealing90s53℃5cycleExtension30s72℃3-stepcyclingDenaturation30s95℃Annealing90s51℃5cycleExtension30s72℃3-stepcyclingDenaturation30s95℃Annealing90s50℃5cycleExtension30s72℃Finalextension10min68℃Lastforever10℃47 附录日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究附录三：SPAGeDi软件简介SPAGeDi（遗传多样性的空间格局分析）是主要为使用共显性标记（如：同工酶，RFLP，微卫星位点）基因型数据映射个体或群体的空间遗传结构表征的软件。通过适当的多种样本数据，两两比较，描述个体或群体间的遗传相关性或差异性的各种统计。SPAGeDi没有窗口功能。要启动该程序只需双击程序图标后输入数据文件的名称或拖动数据文件图标到程序窗口。一、SPAGeDi可以进行的统计学计算：（一）对于群体间两两比较的统计数据包括：FST衡量种群分化(Weir&Cockerham1984)GST相当于FST，但是估算具有不同的统计特性(Pons&Petit1996)RST基于等位基因大小FST模拟(Slatkin1995,estimatedasMichalakis&Excoffier1996)NSTFST模拟计算等位基因之间的遗传距离(Pons&Petit1996)Rho种群内相关系数允许在不同的倍体间的比较(Ronfortetal.1998)Gij平均种群间亲缘系数(Barbujani1987)NijGij模拟计算等位基因之间的遗传距离(OJHardy,unpubl)DsNei’s1978标准遗传距离2(δμ)基于等位基因大小Ds模拟（二）个体之间两两比较的统计数据包括：亲缘系数(Loiselleetal.1995,Ritland1996,Hardy2003,LeyandHardy2012)相关系数(Hardy&Vekemans1999,Lynch&Ritland1999,Queller&Goodnight1989,Wang2002,Lietal.1993,Hardy2003)Fraternity系数(Lynch&Ritland1999,Wang2002)Aij个体间Rousset距离(Rousset2000)Rij基于等位基因大小模拟的亲缘系数(I’inStreiffetal.1998)Nij基于等位基因遗传距离模拟的亲缘系数(OJHardy,unpubl)近交系数48 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究附录二、SPAGeDi的使用1、数据文件的建立单个数据文件必须包含所有的个体特征（名称，类别，空间坐标，基因型）。分析的结果被写入到一个单一的结果文件。数据和结果文件都是文本格式。数据文件可以和FSTAT、GENEPOP格式进行转换。1)、数据文件的格式数据文件需要是文本格式，可以先建立一个Excle表格然后另存为文本格式。2)、数据文件的结构（1）注释行：必须以//开头，可以在文件的任何位置输入。（2）数据的第一行：6个数字，分别排列如下个体的数目类别的数目（如果没有分类就为0）空间坐标的数字（卡迪尔坐标系统（0~3）或者是-2，代表纬度和经度）基因座的数目一个等位基因的数据个数染色体倍性（2代表二倍体，如果数据有多个倍体，写最大倍性）（3）数据的第二行，距离间隔距离间隔（n）对应于每个间隔，最大距离n注1：可替代地，可以输入一个间隔的期望值，在期望值之前需加一个负号；该程序然后定义在这样一种方式，最大距离间隔n以这个期望值成对近似比较每个距离间隔。注2：如果你不希望有距离间隔，输入0注3：如果你使用的纬度经度，距离间隔的单位必须是km（4）数据第三行：作为列标签的名称（最多15个字符长，无空格）：对个体的通用名称（例如，“Ind”）为类别的通用名称（例如，“cat”），只有当类别定义对于每个空间坐标的通用名称（例如，“X”，“Y”）每个基因座的名称（例如“Pgm”，“Est”，...）（5）第四行和及其后面几行：个体数据（每行代表一个个体的描述）49 附录日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究个体的名称（最多15个特征）类别（最多15个）的名称，只要类别定义坐标沿每个轴（最多10位数），或者经度纬度基因型每个位点注意：如果空间坐标的数目被设置为-2，纬度和经度必须是十进制度，使用负数表示南纬或西经。（6）最后一行：输入END（需大写）举例：这是以6个微卫星位点对228个个体进行基因分型。228个个体分为6个类别，没有空间坐标，但种群间距离被以矩阵的形式在文件的末尾给出，等位基因有3个数据，为二倍体，间隔距离的期望值是3。22860632-3indpopLoc1Loc2Loc3Loc4Loc5Loc6pop1-1pop1160150163163178176102102147139118114pop1-2pop1152152163163176176102102147139116116pop1-3pop1166158161153176174102102149137116116pop1-4pop1158158163163174168102098147147116112pop1-5pop1168164163153176166102102149141116112pop1-6pop1158158163153178176102098147147116114……pop6-16pop6150150163153174174102100145131122118pop6-17pop60163153174174102100145131122122pop6-18pop6150146163153174168102102145131122100pop6-19pop6172146163163168168102102141141118118pop6-20pop6150146163153174168102102141131118118ENDM6pop1pop2pop3pop4pop5pop6pop1pop20.3pop31.51.250 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究附录pop41.81.81.3pop50.60.51.72.3pop61.51.30.70.71.9END3)、使用方阵来表示任意成对的空间距离个体或群体之间的成对空间距离通常，使用空间坐标欧氏距离或经纬度。也可以使用方阵任意方式指定每个成对的距离，放在数据文件末尾。矩阵格式：第一行必须以字母M开始，最后一行必须以END结束。例如：M5pop1pop2pop3pop4pop5pop1010.31260pop210.30651898pop3126503454pop461834015pop509854150END纵队格式：第一行必须以字母C开始，最后一行必须以END结束。例如：C15pop1pop210.3pop1pop312pop1pop46pop1pop50pop2pop365pop2pop418pop2pop598pop3pop434pop3pop554pop4pop515END当统计是基于等位基因之间的遗传距离（例如NST，Nij），该程序要求包含等位基因之间的距离矩阵文件。后者可以放在数据文件的末尾或在另一个文件中，而且必须是对称方阵。等位基因之间的遗传距离矩阵：第一行：基因座名称后跟等位基因名称（编号）。下一行：等位基因名后跟等位基因间的遗传距离。例如：这是一个名为“Hapl”基因座的等位基因之间的距离矩阵。51 附录日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究H12341526718apl10652443326014223335103112242430221115421202132642122031702180END在个体水平的统计（亲缘关系系数、相关系数…）个体间遗传相似性，需要“参考等位基因频率”数据。参照等位基因频率矩阵：第一行：每个基因位点的名称，后跟等位基因的总数。下一行（每个等位基因）：连续位点的等位基因名称，后跟等位基因频率。例如：“Loc1”、“Loc2”，“Loc3”3个基因位点的参照等位基因频率的矩阵。Loc15Loc28Loc3310.31200.0120.6720.11220.04430.3230.051240.3530.0140.151300.13150.41320.101400.051420.071440.25END三、SPAGeDi的运行双击打开SPAGeDi的运行窗口，会出现下面这样的界面52 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究附录输入已建立的数据文件，就出现数据的基本信息，会提示输入结果文件名称，然后按回车键，会出现选择个体和种群的分析，按提示输入数字，如果选择的是个体分析的话，会出现下面这个界面，选择你所需要的统计分析的选项，得到所需的分析结果。53 中英文缩略词对照表日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究中英文缩略词对照表英文缩写词英文全称中文全称S.japonicumSchistosomajaponicum日本血吸虫S.mansoniSchistosomamansoni曼氏血吸虫S.haematobiumSchistosomahaematobium埃及血吸虫S.intercalatumSchistosomaintercalatum间插血吸虫S.mekongiSchistosomamekongi湄公血吸虫S.malayensisSchistosomamalayensis马来血吸虫WHOWorldHealthOrganization世界卫生组织DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应SSRSimpleSequanceRepeats简单重复序列HE染色hematoxylinandeosinstaining苏木素伊红染色ddH2Odoubledistilledwater双蒸水TrisTrihydroxymethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷54 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究攻读学位期间取得的科研成果攻读学位期间取得的科研成果1.Su-RongWang,Yuan-JianZhu,Qing-PengGe,Meng-JiaYang,Ji-LeiHuang,Wen-QiaoHuang,Hong-XiangZhuge,Da-BingLu.EffectofphotoperiodchangeonchronobiologyofcercarialemergenceofSchistosomajaponicumderivedfromhillyandmarshyregionsofChina.ExperimentalParasitology.2015,159:227-232.2.日本血吸虫配对个体间遗传学差异与其对终宿主致病性的关系.第一作者，2016年第三期，（已录用）3.小鼠尾静脉注射用固定装置.专利号：ZL201420734887.2，授权时间：2015-04-22，第一发明人4.血吸虫感染实验用鼠固定装置.专利号：ZL201420734503.7，授权时间：2015-04-22，第一发明人5.手持式小鼠灌胃用固定装置.专利号：ZL201420735162.5，授权时间：2015-05-27，第一发明人55 本课题所获的基金资助日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究本课题所获的基金资助国家自然科学基金(No.81273141)项目名称：野鼠作为日本血吸虫病传染源并形成与野鼠有关的血吸虫株的研究56 日本血吸虫致病性与其遗传学特征关系的研究致谢致谢研究生阶段的学习即将结束，在将近三年的学习生涯里，得到过许多老师和同学的关怀和无私帮助，在此谨向他们表示最衷心的感谢和最诚挚的谢意!首先，我要向我的导师诸葛洪祥教授致以衷心的感谢!他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。从课题的选择到完成，诸葛老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持。三年来，诸葛老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀。与此同时，我要感谢吕大兵教授，从确定论文的主题、内容、到整体的结构都给予了悉心的指导。在实验过程中，给予我指导和鼓励。在论文写作过程中，吕老师提出许多中肯的指导意见，才使我的论文得以顺利完成。在此，对吕老师表达我深深的谢意!其次，我还要感谢在一起愉快度过研究生生活的病原生物学的各位老师和同学，正是你们的帮助和支持，我才能克服一个个的困难和疑惑，直至本文的顺利完成。感谢周霞、许静等老师，感谢王素蓉师姐、仰梦佳师姐、康乃馨师姐、黄继磊师兄、朱远见师姐、以及杨英楠同学，他们在实验过程中给予的无私帮助，与他们在一起度过的日子将值得我怀念一生。在此，祝愿他们在以后的人生道路上一帆风顺!感谢王冬华、王海英、王晓博等同学，在学习上、生活上对我的热心帮助，谢谢你们给我研究生生活增添的快乐。感谢我的父母和家人，他们给予我无条件的爱与信任，让我始终觉得有坚强的后盾，使我在遇到困难和挫折时，不会轻言放弃，我深爱并感谢他们!感谢我的男友，谢谢你一路的陪伴和支持，愿我们的明天更加美好!再次感谢所有帮助过我的人，祝他们一生幸福、安康!黄文乔2015年4月于苏州大学57 苏州大学鑛ｈｉ硕±学位论文（学术学位）職缸ｍｍ！－筛：巧１襄視起：ｊ－．：義；ｉ’－；：－？，．；：責：．．？；：，纖，．？早．ｉｍｉｉｆｅｒ＇—Ｍ＾．ｉｉｗ—１山．．ｌｌｆｅｓｉｊＷ——ｉｆｃ？＊Ｈｍｈ｜…咖ｗ雖＂．。，苏州大学研究生院统一印制■ＨＩ