人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析

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.分类号：R764.43密级：公开研究生学位论文论文题目（中文）人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析Molecularetiologicalstudyofcochlearimplant论文题目（外文）patientsandanalysisofcochlearmalformationdistributionincochlearimplantpatients研究生姓名王建朝学科、专业临床医学·耳鼻咽喉科研究方向耳聋的防治学位级别硕士导师姓名、职称郭玉芬教授论文工作起止年月2016年7月至2018年1月论文提交日期2018年3月论文答辩日期2018年5月学位授予日期2018年6月校址：甘肃省兰州市 人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析摘要目的：对非综合征型听力损失人工耳蜗植入患者表型进行流行病学统计分析和分子病因学研究，初步探讨四种基因在非综合征型听力损失人工耳蜗植入患者中的分布情况及热点突变。通过影像学特征分析，了解内耳畸形在极重度听力损失耳蜗植入患者中耳蜗畸形的分布情况，结合基因突变检测结果探讨耳蜗畸形与耳聋基因突变之间的相关性。方法：本课题选取2012-2015年兰州大学第二医院耳鼻喉科398例非综合征型双侧极重度听力损失的耳蜗植入患者作为研究对象。在获得家长或患者本人书面知情同意后，抽取患者外周静脉血5～10m1，提取基因组DNA。用SNPscan法进行GJB2、GJB3、SLC26A4基因及线粒体DNA(MitochondialDNA,mtDNA)突变位点m.1555A>G、m.1494C>T和m.1095T>C检测。参照国际上最新的分类标准[1]，回顾性分析样本的影像学资料，并与基因检测结果进行相关性分析。结果：1.398例非综合征型听力损失耳蜗植入患者中，共有男性207人，女性191人，男女比例为1：0.92。其中，汉族334人，回族43人，藏族10人，东乡族10人。有听力损失家族史者50例，占12.56%（50/398）。语前聋患者358例，占89.95%（358/398），语前聋患者平均植入年龄为5.00±3.28岁。2.患者中共有108例检测到GJB2基因突变，占27.13%（108/398）。其中纯合突变36例，复合杂合突变39例，单杂合突变携带39例。最常见的突变位点为c.235delC、c.109G>A以及c.299_300delAT。等位基因频率分别是12.31%、3.38%和3.89%。检出GJB2基因突变的基因型共23种，其中以[c.235delC]/[c.235delC]、[c.109G>A]以及[c.235delC]/[c.299_300delAT]三种最为常见，分别占28.70%（31/108）、23.15%（25/108）和15.74%（17/108），占到所有基因型的67.59%（73/108）。3.本研究有8位患者检出GJB3基因突变，占2.01%（8/398），8例均为单杂合突变。其中7例为c.580G>A杂合突变和1例为c.538C>T杂合突变，二者等位基因的频率为0.88%和0.13%。4.本研究有83例患者携带SLC26A4基因突变，占20.85%（83/398）。其中III 纯合突变23例，复合杂合突变40例，单杂合突变携带20例。其中最常见的致病位点为c.919-2A>G、c.2168A>G和c.1229C>T，三个位点的等位基因频率为9.17%、2.26%和0.75%。检出SLC26A4基因突变的基因型共41种，其中最常见的6种基因型为[c.919-2A>G]/[c.919-2A>G]、[c.919-2A>G]、[c.919-2A>G]/[c.2168A>G]、[c.1174A>T]/[c.2168A>G]、[c.1489G>A]、[c.919-2A>G]/[c.1229C>T]，分别占24.10%（20/83）、9.64%（8/83）、8.43%（7/83）、3.61%（3/83）、3.61%（3/83）、3.61%（3/83），占所有基因型的53.01%。5.本研究的患者中共有9位患者检出线粒体基因均质性突变，占2.26%，检出的位点为m.1555A>G和m.1095T>C。其中检测出m.1555A>G突变者5例，m.1095T>C突变者4例。6.398例耳蜗植入患者中共有199例患者未检测出GJB2、GJB3、SLC26A4基因突变及m.1555A>G、m.1494C>T和m.1095T>C基因突变，占样本总数的50%。7.398例耳蜗植入患者中有内耳畸形者共137例，畸形发生率为34.42%（137/398），其中累及双耳132例，占96.35%（132/137）；累及单侧5例，占3.64%（5/137），受累耳共269耳；剩余双侧均未累及者261例，占65.58%（261/398）。涉及的内耳畸形种类包含：单纯前庭导水管扩大者155耳，占57.62%（155/269）；前庭及半规管畸形者11耳，占4.89%（11/269）；内听道狭窄2耳，占0.74%（2/269）；内听道扩大5耳，占1.86%（5/269）；耳蜗畸形96耳，占35.68%（96/269）。耳蜗畸形包括耳蜗未发育3耳，3.13%（3/96）；耳蜗发育不全II型2耳，占2.08%（2/96）；耳蜗发育不全III型4耳，占4.17%（4/96）；不完全分隔I型9耳，占9.38%（9/96）；不完全分隔II型73耳，占76.04%（73/96）；不完全分隔III型5耳，占5.21%（5/96）。上述畸形中伴有前庭导水管扩大有222耳，占82.52（222/269）。8.将患者分为无畸形组和患有畸形组，在无畸形组261例患者中共有86例患者检出GJB2基因突变，检出率32.95%（86/261），等位基因频率为26.82%；有内耳畸形组137例者中共有21例患者检出GJB2基因突变，检出率15.33%（21/137），等位基因频率为12.41%。将患者分为GJB2基因单等位基因突变组、双等位基因突变组、4种基因检测均为阴性组。三组的内耳畸形发生率分别为20.00%（8/40）、19.11%（13/68）、21.60%（43/199），相互之间无统计学差异。9.按照是否伴有前庭导水管扩大进行分组，其中无内耳畸形组SLC26A4突变等位基因频率为1.15%，EVA相关组SLC26A4突变等位基因频率为59.91%，二者存在统计学差异（p<0.05）；其他内耳畸形不伴有前庭导水管扩大组SLC26A4突变等位基因频率为2.50%，与EVA相关组相比有统计学差异（p<0.05）；IV SLC26A4双等位基因突变者共63例，前庭导水管扩大的发生率为100%。10.不伴有前庭导水管扩大的内耳畸形组与无内耳畸形组SLC26A4的等位基因频率分别为3.13%和1.15%，二者无统计学差异（p＞0.05）。而不伴有前庭导水管扩大的内耳畸形组SLC26A4的等位基因频率（3.13%）与前庭导水管相关性畸形组SLC26A4的等位基因频率（59.10%），二者具有统计学差异（p＜0.05）。结论：1.在398例非综合征型双侧极重度听力损失的耳蜗植入患者中，检测出GJB2基因突变携带者108例，占27.13%（108/398）；GJB3基因突变携带者8例，占2.01%（8/398）；SLC26A4基因突变携带者共83例，占20.85%（83/398）；线粒体m.1555A>G、和m.1095T>C基因突变携带者共9例，占2.26%（9/398），共占总样本数的50%。2.GJB2基因双等位基因突变者共75例，SLC26A4基因双等位基因突变者63例，m.1555A>G及m.1095T>C突变患者共9例。因此分子学病因明确者共147例，占36.94%（147/398）。分子病因学不明确者251例，占63.06%（251/398）。3.398例耳蜗植入患者中有内耳畸形者共137例，畸形发生率为33.79%（137/398），其中累及双耳132例，占98.54%（132/137）；累及单侧5例，占3.64%（5/137），受累耳共269耳；剩余双侧均未累及者261例，占65.58%（261/398）。涉及的内耳畸形种类包含：单纯前庭导水管扩大者155耳，占57.62%（155/269）；前庭及半规管畸形者11耳，占4.89%（11/269）；内听道狭窄2耳，占0.74%（2/269）；内听道扩大5耳，占1.86%（5/269）；耳蜗畸形96耳，占35.68%（96/269）。耳蜗畸形中包括耳蜗未发育3耳，3.13%（3/96）；耳蜗发育不全II型2耳，占2.08%（2/96）；耳蜗发育不全III型4耳，占4.17%（4/96）；不完全分隔I型9耳，占9.38%（9/96）；不完全分隔II型73耳，占76.04%（73/96）；不完全分隔III型5耳，占5.21%（5/96）。上述畸形中伴有前庭导水管扩大有222耳，占82.52（222/269）。4.GJB2基因突变并非内耳畸形的重要因素5.SLC26A4基因突变是前庭导水管相关畸形和不完全分隔II型最主要的分子学病因。6.非前庭导水管相关性畸形与SLC16A4基因突变无明显相关性。关键词：耳蜗植入，极重度听力损失，基因检测，GJB2基因，GJB3基V 因，SLC26A4基因、m.1555A>G、m.1494C>T和m.1095T>CVI MolecularetiologicalstudyofcochlearimplantpatientsandanalysisofcochlearmalformationdistributionincochlearimplantpatientsAbstractObjective:Tostudythemolecularepidemiologyofcochlearimplantrecipientswithnonsyndromichearingloss,andtoinvestigatethedistributionandhotspotmutationofthefourgenesincochlearimplantpatientswithnon-syndromichearingloss.Tostudythemolecularepidemiologyofcochlearimplantrecipientswithnonsyndromichearingloss,andtoinvestigatethedistributionandhotspotmutationofthefourgenesincochlearimplantpatientswithnon-syndromichearingloss.Methods:Atotalof398cochlearimplantrecipientsfromtheDepartmentofENTofLanzhouUniversitySecondHospitalfrom2012to2015wereincludedinthisstudy.Afterobtaininginformedconsentfromallpatientsortheirparents,5–10mlperipheralvenousbloodofallpatientswasdrawntoextractgenomicDNA.SNPscanmethodwasusedtoscreenforGJB2gene,GJB3gene,SLC26A4geneandm.DNA1555A>G,m.DNA1494C>Tandm.DNA1095T>Cmutations.Withreferencetothelatestinternationalclassificationstandards[1],retrospectiveanalysisofthesample'simagingdataandcorrelationanalysiswithgeneticresultswerecarriedout.Results:1.The398cochlearimplantrecipients(n=398)withnonsyndromichearingimpairmentwerecomposedof207maleand191female,withamaletofemaleratioof1:0.92.Amongthem,334wereHan,43wereHui,10wereTibetanand10wereDongxiangnationality.Therewere50caseshadafamilyhistoryofdeafnessand358wereprelingualdeafness(averageage:5.00±3.28yearsold),accountingfor12.56%ofallcases(50/398)and89.95%(358/398)respectively.2.Inthe398patients108wereprovencarryingGJB2genemutations,accountingfor27.13%ofallcases(108/398).Thedetectedmutationscomposedof39heterozygous,39compoundheterozygous,and36homozygousmutations.AndtheVII threemostcommonpathogenicmutationswerec.235delC,c.109G>Aandc.299_300delAT.Theallelefrequencieswere12.31%,3.38%,and3.89%,respectively.Atotalof23genotypesofGJB2genewerefound,amongthem,[c.235delC]/[235delC],[c.109G>A]and[c.235delC]/[c.299_300delAT]werethethreemostcommontypes,accountingfor28.70%(31/108),23.15%(25/108)and15.74%(17/108)respectively.Theyaccountedfor67.59%(73/108)ofallgenotypes.3.EightoftheincludedpatientsinthestudycarriedGJB3mutations,whichwereallheterozygous,accountingfor2.01%ofallcases(8/398).Amongthem,sevenwerec.580G>Aandonewasc.538C>Tmutation,andtheallelefrequencieswere0.88%and0.13%,respectively.4.Atotalof83caseswithSLC26A4genemutationswerefoundinthe398casesofcochlearimplantation,accountingfor20.85%ofallcases(83/398).Therewere20heterozygous,23homozygousand40compoundheterozygousmutations.Thethreemostcommonmutationswerec.919-2A>G,c.2168A>Gandc.1229C>Twithallelefrequenciesof9.17%,2.25%and0.75%,respectively.Amongthe41detectedgenotypesofSLC26A4gene,themostfivecommonwere[c.919-2A>G]/[c.919-2A>G],[c.919-2A>G]/[c.2168A>G],[c.1174A>T]/[c.2168A>G],[c.1489G>A]and[c.919-2A>G]/[c.1229C>T].whichaccountedfor24.10%(20/83),9.64%(8/83),8.43%（7/83）,3.61%(3/83)and3.61%(3/83)，respectively.Thefivegenotypesaccountedfor53.01%ofallgenotypes.5.Amongthe398cochlearimplantrecipientsenrolledinthisstudy,ninepatientswereshowntohavem.1555A>Gorm.1095T>Cmutation,accountingfor2.26%ofallcases.m.1555A>Gandm.1095T>Cwerefoundinfiveandfourcases,respectively.6.NomutationoftheGJB2,GJB3andSLC26A4geneorm.1555A>G,m.1494C>Tandm.1095T>Cwasfoundin199patientsofthe398cochlearimplantsrecipients,accountingfor50%ofthetotalcases.7.Amongthe398cochlearimplantpatients,therewere137casesofinnerearmalformationwiththerateof34.42%(137/398).Therewere132bilateralcaseswiththerateof96.35%（132/137）,and5unilateralcaseswiththerateof3.64%（5/137）.269earswereinvolved,155earsweresufferedwithenlargedvestibularaqueductwiththerateof57.62%（155/269）.11earsweresufferedwithVestibularandsemicirculardeformitywiththerateof4.89%（11/269）.2earsweresufferedwithinternalauditorycanalstenosiswiththerateof0.74%（2/269）.5earsweresufferedwithInternalauditorycanalexpansionwiththerateof1.86%（5/269）.Therewere96earsofcochlearVIII malformationwiththerateof35.68%（96/269）.CochleardysplasiatypeIIwasfoundin2earswiththerateof2.08%（2/96）,therateoftypeIIIcochleardysplasiawas4.17%（4/96）.TherateoftypeIincompleteseparationwas38%（9/96）,therateoftypeIIincompleteseparationwas76.04%（73/96）,therateoftypeIIIincompleteseparationwas5.21%（5/96）.222earsweresufferedwithenlargedvestibularaqueductaccountingfor82.52%（222/269）.8.Patientsweredividedintonodeformitygroupanddeformitygroup,thedetectionrate(32.95%)andallelefrequency(26.82%)oftheGJB2geneinthenon-deformitiesgroupwereallhigherthanthoseinthedeformitygroup(15.33%,12.41%).Theincidencesofinnerearmalformationsinsingleallelemutationgroup,biallelicmutationgroup,andnegativegroupofGJB2geneare20.00%(8/40),19.11%(13/68)and21.60%(43/199),respectively.Therewasnostatisticaldifferencebetweenthethreegroups.9.Groupedaccordingtowhetherthereisvestibularaqueductenlargement,thefrequencyofSLC26A4mutationallelewas1.15%inthegroupwithoutinnerearmalformation,andthefrequencyofSLC26A4mutationalleleinEVAgroupwas59.91%,andtheyhadastatisticallysignificantdifference(p<0.05);ThefrequencyofSLC26A4mutationalleleininnerearmalformationswithoutthevestibularaqueductenlargementgroupwas2.50%,whichwasstatisticallydifferentfromtheEVA-relatedgroup(p<0.05).AndtheSLC26A4genecompoundheterozygousmutationorhomozygousmutationin63cases,thecorrespondingcaseswerevestibularaqueductrelatedpatients,theconsistencywas100%.10.TheallelefrequenciesofSLC26A4withnovestibularaqueduct(3.13%)andnoobviousinnerearmalformation(1.15%)werecompared，andtherewasnosignificantstatisticaldifference.Comparedthevestibularaqueduct(3.13%)andthevestibularaqueductrelatedmalformation(59.10%),whichhadastatisticaldifference.Conclusion:1.Amongthe398cochlearimplantrecipientswithnonsyndromicseverehearingloss,108caseshadGJB2genemutation,accountingfor27.13%(108/398);8caseshadGJB3genemutation,accountingfor2.01%(8/398);83caseshadSLC26A4genemutation,accountingfor20.85%(83/398),andmutationsinthemitochondrialm.1555A>Gorm.1095T>Cmutationswerefoundin9cases,accountingfor2.26%(9/398).Atotalof50%ofthetotalcases.2.Atotalof147casesofmolecularetiologywereidentified,accountingfor36.94%IX (147/398).Indetail,75caseswithGJB2biallelicalleles,63caseswithSLC26A4biallelicalleles,and9caseswithm.1555A>Gorm.1095T>Cmutationweredetected.However,themolecularetiologyoftheremaining251cases,accountingfor63.06%（251/398）ofthetotalcasesremainedunclear.3.Theincidenceofinternalearmalformationinthepatientswithnon-syndromicprofoundsensorineuraldeafnesswasabout33.79%.Themostcommontypewasenlargedvestibularaqueductwiththerateof57.62%（155/269）.TheincompletedivisionoftheIItypeisthesecondarytype,withtherateof35.68%（96/269）.4.MutationofGJB2geneisnotanimportantfactorofinnerearmalformation.5.MutationofSLC26A4geneisthemainpathogenicfactorofvestibularaqueductassociatedmalformationandincompletesegregation(typeII).6.SLC26A4genemutationwasnotassociatedwithnon-vestibularaqueductassociatedmalformation.Keywords:cochlearimplantation,profoundhearingimpairment,genedetection,GJB2gene,GJB3gene,SLC26A4gene,m.1555A>G、m.1494C>Tandm.1095T>C.X 英文缩略词表缩写英文全称中文全称ABRauditorybrainstemresponse听性脑干反应AmAnaminoglycosideantibiotic氨基糖甙类抗生素ASSRauditorysteady-stateresponse听觉稳态诱发反应bpbasepair碱基对CCytosine胞嘧啶CIConservationIndex保守指数CICochlearimplantation耳蜗植入CXconnexins缝隙连接蛋白DPOAEdistortionproductotoacousticemission畸变产物耳声发射DVDDeafnessVariationDatabase听力损失突变数据库EVAenlargedvestibularaqueduct前庭水管扩大GGuanine鸟嘌呤GJBGapjunctionbetaBeta缝隙连接蛋白HRCThigh-resolutioncomputedtomography高分辨率CTLVASlargevestibularaqueductsyndrome大前庭水管综合征MRImagneticresonanceimaging核磁共振成像m.mitochondrialDNA线粒体DNANSHLnon-syndromehearingloss非综合征型听力损失PTApuretoneaudiometry纯音听阈SLC26A4Solutecarrierfamily26,member4溶质转运蛋白家族26成员4TThymine胸腺嘧啶VAvestibularaqueduct前庭水管XI 目录摘要............................................................IIIAbstract........................................................VII第一章前言......................................................1第二章材料与方法................................................42.1研究对象....................................................42.1.1纳入标准..............................................42.1.2排除标准..............................................42.2资料采集及临床检测..........................................42.2.1病史资料采集..........................................42.2.2血样的采集............................................62.2.3遗传方式分析..........................................62.2.4影像学检查............................................72.3实验材料....................................................92.4实验方法...................................................102.4.1提取基因组DNA（参考试剂盒操作说明）.................102.4.2DNA浓度检测.........................................112.4.3DNA样品GJB2、SLC26A4及m.基因常见突变位点进行检测...112.5统计学分析.................................................12第三章结果......................................................133.1病例资料分析...............................................133.1.1男女比例及语前聋患者植入年龄分布.....................133.2民族分布及家族史...........................................143.3基因检测结果...............................................143.3.1GJB2基因突变检测结果................................143.3.2GJB3基因突变检测结果................................16 3.3.3SLC26A4基因突变检测结果.............................163.4内耳畸形的分布情况.........................................203.4.1耳蜗畸形.............................................213.4.2前庭及半规管畸形.....................................243.4.3内听道畸形...........................................253.5耳蜗畸形与GJB2、SLC26A4基因、线粒体基因的相关性...........263.5.1GJB2基因突变与耳蜗畸形..............................263.5.2SLC26A4基因突变与耳蜗畸形...........................27第四章讨论......................................................294.1临床特征分析...............................................294.2GJB2基因检测的结果分析....................................294.3SLC26A4基因检测的结果分析.................................314.4m.1555A>G、m.1494C>T和m.1095T>C基因检测的结果分析........324.5GJB3基因检查结果分析......................................324.6耳蜗植入患者常见听力损失基因检查结果分析...................334.7影像学结果分析.............................................344.8基因检测与畸形相关性分析...................................364.8.1GJB2基因与内耳畸形..................................364.8.2前庭导水管相关性畸形与SLC16A4基因突变...............364.8.3非前庭导水管相关性畸形与SLC16A4基因突变.............37参考文献.........................................................39 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析第一章前言语言是人与人之间交流的重要工具，拥有敏锐的听力则是语言形成的前提。因此正常的听力对人类的交流沟通与日常生活至关重要，而听力损伤严重影响着人们的工作、学习和生活。遗传性听力损失对于一个家庭乃至社会来讲都是沉重的打击和负担，因此对遗传性听力损失病因学的研究变得十分重要。我们把不伴有其他系统异常的遗传性听力损失称作非综合征型听力损失（Non-syndromichearingloss，NSHL）。目前研究确定能够导致非综合征型听力损失的基因共有103个。其中常染色体隐性遗传的有64个，常染色体显性遗传的有35个，X-连锁遗传的有4个（HereditaryHearinglossHomepage：http://hereditaryhearingloss.org/）。数据显示GJB2基因、SLC26A4基因和m.DNA听力损失相关基因突变是导致非综合征性听力损失最常见的分子学病因[2-4]。在我国，听力损失患者的分子病因学检测中GJB2基因、SLC26A4基因和m.DNA听力损失相关基因的检出率则高达30%-50%[5-6]。正因如此，对这三个基因的检测也成为了遗传听力损失分子病因学检测的首选组合。1994年，Guilford等在两个近亲结合的家系中首次定位了第一个常染色体隐性遗传性非综合征型耳聋基因座（DFNB1）。1997年GuilfordP等[7]发现了GJB2基因，该基因位于染色体13q11-12，包含2个外显子，序列长度为4804bp。该基因只有一个转录本，是编码缝隙连接蛋白家族成员之一。GJB2基因所编码的是β-2型缝隙连接蛋白称为缝隙连接蛋白26(Cx26)[8]。研究表明：Cx26在人类的内耳毛细胞中广泛表达[9]，在GJB2基因突变的小鼠中早期即观察到Corti器退化，螺旋神经节神经元密度变小[10]。Kikuchi等[11]研究发现Cx26是毛细胞维持钾离子平衡的重要因素，当Cx26受损时，一方面细胞间信息交流受到影响[12-13],从而影响毛细胞的功能；另一方面螺旋器中钾离子外排受损，破坏了钾离子的胞内外平衡，无法维持膜电位并形成电势差。因此，当声音传至内耳时，内淋巴的震动不能够使得毛细胞去极化，形成电信号向中枢传递，进而引起感音神经性听力损失[14-15]。专家推测，Cx26对内耳毛细胞的存活乃至耳蜗的功能起到决定性的作用，Cx26变化引起耳蜗的一系列功能发生障碍[16]。GJB3基因位于染色体1p34.3，包含2个外显子，序列长度为5526bp，该基因有两个转录本（UniversityofCaliforniaSantaCruzhttp://genome.ucsc.edu/index.html）。夏家辉等[17]在1998年首次报道了两例具有常染色体显性遗传特性的，高频听力下降的携带有GJB3基因突变的患者。后证实GJB3基因所编码的蛋白为缝隙连接蛋白31即Cx31。同样为缝隙连接蛋白家族成员之一。突变可引起非综合征型听力障碍，遗传方式可表现为常染色体显性或隐性[18]遗传。在小鼠的耳蜗和听神经中可以发现GJB3基因的表达[19]，其致病机制可能与GJB2相似，突变后可能影响到电压门控通道，从而破坏离子平衡，进而造成听力损失，但目前研究发现的1 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析GJB3基因能够导致听力损失的位点还较少（NationaCenterforBiotechnologyInformation：https://www.ncbi.nlm.nih.gov）。1996年，Griffith等[20]发现大前庭水管综合征（largevestibularaqueductsyndrome，LVAS）具有遗传倾向。3年后，Abe和Usami等[21-22]发现大前庭水管综合征的发生与位于7号染色体的SLC26A4基因突变有关。该SLC26A4基因位于染色体7q22.3，包含21个外显子，开放阅读框长度为2343bp。其编码的蛋白质（Pendrin）由780个氨基酸组成，为硫酸盐转运蛋白的同源蛋白，是一种有12个跨膜区的跨膜蛋白，在内淋巴管、内淋巴囊、椭圆囊和球囊斑相连非感觉上皮、外沟的外侧壁以及甲状腺等处广泛表达，介导氯离子的转运，同样也是调节内淋巴离子平衡，维持膜电位的重要成员[23]，当SLC26A4基因发生突变，Pendrin蛋白就不再跨膜，而是堆积在细胞质膜内，从而使细胞不能够正常的转运氯离子，离子平衡无法维持，从而造成感音神经性听力损失。人工耳蜗植入（cochlearimplant，CI）是目前极重度听力损失患者重建或恢复听觉系统、与外界建立交流的最佳选择。人工耳蜗植入术对于患者的身体条件有着一定的要求，因此这个人群则成为了一个有着很多相同或相似特点的特殊人群，也是遗传性听力损失的重灾区。所以对该人群进行不断深入的研究,一方面有助于了解和预测疾病的发生发展过程，给予更早更有效的干预，使患者获得最佳的疗效；另一方面对先证者及其家属进行基因筛查，在不远的将来还可以进行生育指导，从而做到疾病的预防。本研究对398例非综合征型极重度听力障碍的耳蜗植入患者进行了GJB2、GJB3基因、SLC26A4基因突变及线粒体基因组m.1555A>G、m.1494C>T和m.1095T>C的基因检测，统计这4种基因在该人群中的检出率，基因型的分布情况以及热点突变，初步了解这一人群中最常见的听力损失致病基因的分布情况，为进一步治疗与干预奠定了基础。对于听障儿童，应早发现，早诊断，早治疗。但并非所有极重度听力损失患者耳蜗植入的效果都一致，对于耳蜗植入患者而言，听觉恢复的水平常常受到多方面因素的影响。主要分为两大类，一是器质性病变的情况，如是否存在解剖异常（例如听神经纤细、内耳畸形等）；二是周围因素，例如患者家属的依从性，对患儿康复的重视程度，经济情况，当地医院相应配备的康复机构等。因此在行耳蜗植入术前一定要详细客观的评估患者。除了要完善听力学检查外，影像学评估也是必不可少的。随着影像学的不断发展，高分辨CT不仅能够发现新类型的畸形，也是诊断内耳畸形的“金标准”[24]。因此完善影像学资料，从而了解患者是否符合手术的条件以及是否患有畸形，能够对患者进行有效的术前评估，并能预测术中可能发生的情况。根据2003年中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会制定的《人工耳蜗植入工作指南》[25]，内耳严重畸形如Micheal畸形、无耳蜗畸形等，听神经缺如等，为耳蜗植入的绝对禁忌症。而内听道狭窄则为耳蜗植入的相对禁忌症。2 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析正确判别内耳畸形对于耳蜗植入而言，无论是对于电极的选择还是手术的安全性都非常重要。Sennaroglu2010[1]标准将耳蜗的畸形划分的更为细致，共有4大类（1）耳蜗未发育；（2）共同腔畸形；（3）耳蜗发育不全：耳蜗的大小小于正常耳蜗，有三型：I型.芽状耳蜗（bud-likecochlea）；II型.囊状耳蜗发育不全（cystichypoplasticcochlea；III型.蜗管小于两圈（cochleawithlessthantwoturns）;（4）不完全分隔分为三型：I型.囊性耳蜗前庭畸形；II型.基底轴蜗轴存在；III型.耳蜗分隔及蜗轴发育不全。CT的优势在于骨成像，相比之下MRI的优势在于软组织、血管、神经等富含水的组织成像。对于内耳而言，可以进行弥散加权水成像，对内外淋巴、前庭、膜半规管、前庭导水管进行重建，可以更加直观的了解上述结构。研究表明，在NSHL患者中20-30%患有颞骨畸形[26]，既是听力损失患者的CT表现，也是听力损失的解剖学病因。SLC26A4基因一直以来都认为与前庭导水管扩大或不完全分隔II型有关。但是近几年GJB2基因突变与畸形的相关性有争议。以往研究表明GJB2基因突变主要累及膜迷路，不造成骨性畸形[27]。然而Propst等则认为GJB2基因突变的患者，在没有SLC26A4基因的干扰下，至少有一种内耳解剖结构异常。此后陆续也有报道GJB2纯合或复合杂合患者伴有蜗轴不对称和前庭导水管扩大[28-29]。针对上述问题，本课题组进行了相关探讨。此次收集了398例非综合征型耳蜗植入患者的影像学资料，参照Sennaroglu2010分类标准[1]，对检测结果进行分类和整理。探讨甘肃省非综合征型听力损失耳蜗植入患者的内耳畸形的发生率及分布情况。按照是否伴有内耳畸形，将患者分为两大组，分别讨论基因突变与内耳畸形的相关性并与已有研究进行比较，探讨内耳畸形在极重度听力损失患者中的分布情况，为今后相关研究奠定基础。3 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析第二章材料与方法2.1研究对象本研究选取2012年至2015年兰州大学第二医院耳鼻喉科NSHL耳蜗植入患者共398例作为研究对象。根据2013年由中华医学会耳鼻咽喉科学分会制定的《人工耳蜗植入工作指南》[24]，并结合甘肃本地患者的特点制定了纳入与排除标准，具体如下。2.1.1纳入标准1．患者为双侧极重度感音神经性听力损失；2．详细询问病史，病史采集标准相同；3．智力测试、性格测试均未见明显异常；4．患者为非综合型听力损失。2.1.2排除标准1、有其他非遗传因素所致的双侧极重度感音神经性听力损失明确的原因(如脑膜炎、双侧胆脂瘤等)；2、患有影响术后言语康复的疾病(如智力障碍、自闭症者等)；3、外耳、中耳畸形引起的传导性听力下降；4、高分辨CT诊断为不具有耳蜗植入条件的患者（如双侧耳蜗未发育、双侧耳蜗骨化患者等）；5、已经明确为综合征型听力损失(如waardenburg综合征，BOR综合征等)。2.2资料采集及临床检测2.2.1病史资料采集1.问卷调查调查问卷均由掌握一定遗传性听力损失知识与技术的专业人员进行，采用一对一问答方式，保证病史资料真实有效。问卷内容如下：（1）身份信息：性别、姓名、年龄、籍贯等；（2）基本情况：是否进行过新生儿听力筛查，是否通过。若未做新生儿筛查，发现听力障碍具体的时间；是否有母婴高危因素，如孕期感染风疹病毒、是否发生过宫内窘迫，产后是否发生黄疸等；是否患过脑膜炎、受过严重外伤；是否有耳毒性药物服用史，如庆大霉素等；是否有过噪声史；父母是否为近亲结合等；（3）听力情况：若为非先天性听力障碍，听力下降是否为波动性，是否有语言4 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析基础；是否曾佩戴助听装置；佩戴的时长以及语言建立的情况；（4）是否有除听力障碍之外的其他系统疾病；（5）是否有家族史。2.体格检查（1）检查患者生理、病理反射是否如常；（2）儿童发育、智力是否如常；（3）检查皮肤是否有牛奶咖啡斑、是否有额白发、是否有虹膜异色，是否患有唇腭裂，是否有白内障及深度近视或夜盲；（4）观察是否有鳃裂囊肿或鳃裂瘘。3.专科检查（1）耳廓形态是否正常，是否为杯状耳、招风耳等；双侧耳廓是否对称；是否有副耳廓及耳前瘘管；（2）外耳道内分泌物是否正常，是否有流脓或感染的征象；是否通畅，若为闭锁或狭窄，应结合颞骨CT了解为骨性闭锁还是膜性闭锁；（3）鼓膜是否完整，鼓膜形态、颜色是否正常，鼓起镜检查鼓膜的活动是否正常。4.听力学检查（1）仪器及作用①使用丹麦麦迪森公司生产的Madsen622型纯音听阈测试仪对五岁以上并能够理解与配合的患者进行仪纯音听阈测听；对于2.5岁-5岁使用国际听力行为测听仪进行听声放物行为测听；对于6月-2.5岁使用国际听力行为测听仪进行视觉强化行为测听；对于0-6月的患儿通过观察其对声音的反应以确定听力损失的程度与类型。②使用丹麦麦迪森公司生产的Madsen901型中耳分析仪对患者进行声导抗测试：检测中耳腔的容积，咽鼓管功能，间接反映听骨链情况，鼓膜弹性及镫骨肌反射。③使用美国智听公司所生产的SmartEP3X听觉电反应测听仪为患者测试测试听性脑干反应（auditorybrainstemresponse，ABR）：判断听力损失的性质，反映听力障碍发生的部位，以及是否能够引出耳蜗微音电位（auralmicrophonics，CM）。④使用美国智听公司所生产的SmartEP3X听觉电反应测听仪为患者测试测试听觉稳态诱发电位（auditorysteady-stateevokedresponse,ASSR）：反映听力损失的程度，评估极重度听力损失患者的残余听力情况。⑤使用美国智听公司生产的SmartOAE型耳声发射仪测试为患者测试畸变产物耳声发射（distortionproductotoacousticemission,DPOAE）：反映外毛细胞受损与否。5 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析（2）测听执行标准表2-1测听执行标准标准名称代号相应的国际标准测听方法GB/T16403-1996ISO8253.1等效阈声压级零级标准GB/T4854.8ISO389-8声场测听国家标准GB/T16296ISO8253.2（3）听力损失分级所有患者参照1980年WHO听力诊断标准，平均听阈为0.5、1、2kHz这三个频率的平均值来计算。表2-2WHO（1980）听力损失分级0.5kHz、1kHz、2kHz、分级的平均阈级26-40dBHL轻度听力损失41-55dBHL中度听力损失56-70dBHL中重度听力损失71-90dBHL重度听力损失3.听力损失类型(1)传导性聋：声音传入内耳之前，发生因传导障碍所致的听力损失称为传导性听力损失。听力表现为气导听阈下降，而骨导听阈往往正常或近似正常。标准为：骨导听阈正常或接近正常，气导听阈下降，且气骨导差大于10dBHL。(2)感音神经性聋：因耳蜗、听神经、中枢系统受损所致的听力损失称为感音神经性聋。听力表现为气骨导听阈均下降，且气骨导间距<10dBHL。(3)混合性聋：是指传导和感音同时存在障碍时所致的听力损失，表现为气骨导听阈均下降，且气骨导差>10dBHL。2.2.2血样的采集向同时满足纳入标准和排除标准的患者及监护人告知研究的内容和目的等基本内容，并签署知情同意书。抽取所有患者及有遗传价值的直系亲属或家族中的其他患者的外周静脉血5～10m1，ACD-EDTA抗凝，冻存管保存，4℃运送，避免震荡、溶血，-20℃冷柜保存。2.2.3遗传方式分析根据各种遗传方式的特点，结合患者家系图中所表现出的遗传特征，确定其遗传特征。目前已知的遗传方式有：1.常染色体显性遗传；2.常染色体隐性遗传；3.X-连锁隐性遗传；4.X-连锁显性遗传；5.母系遗传。其遗传特征[59]如下：1.常染色体显性遗传的特征[30]6 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析(1)由于致病基因位于常染色体上，因而致病基因的遗传与性别无关；(2)患者双亲中必有一个为患者；(3)患者的子代有1/2的发病可能(4)可以看到连续传递的现象。2.常染色体隐性遗传的特征[30](1)致病基因位于常染色体上，因而致病基因的遗传与性别无关；；(2)患者的双亲表型往往正常，但都是致病基因的携带者；(3)患者的同胞中约1/4的发病风险，患者表型正常的同胞中2/3的可能为携带者，患者的子女一般不发病，但肯定是携带者；(4)系谱中患者的分布往往是散发的，通常看不到连续传递的现象。3.X-连锁隐性遗传的特征[30](1)男性患者远多于女性患者；(2)男性患者的双亲都无病，其致病基因来自携带者母亲；(3)可见交叉遗传现象，即“父传女，母传子”的遗传现象；(4)由于男患者的子女都是正常的，所以代与代之间可见明显的不连续，即隔代遗传现象。4.X-连锁显性遗传特征[30](1)人群中女性患者多于男性；(2)患者双亲中一方患病；(3)由于交叉遗传，男性患者的女儿全部患病，儿子全部正常；(4)可看到连续传递。5.Y-连锁遗传特征[30](1)随Y染色体在上下代之间进行传递；(2)所有患者均为男性。6.线粒体遗传的特征[30](1)母系遗传：即母亲将mtDNA传递给儿子和女儿，但只有女儿能将mtDNA传递给下一代。(2)纯质和杂质：不同组织中杂质水平的比例和发生率各不相同，而且随着年龄增长杂质的发生率增高。对于听力损失来说，线粒体基因突变与氨基糖苷类抗生素所致的听力损失及老年性听力损失有关。按照遗传规则进行判断，但不能够排除不完全显性、共显性遗传、延迟显性、不规则显性遗传等其他社会人伦因素，因此还要结合基因检测的结果进行判断。2.2.4影像学检查主要包括高分辨率CT（high-resolutioncomputedtomography,HRCT），头颅核磁7 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析（包括头颅平扫及耳蜗水成像）。颞骨高分辨螺旋CT资料主要来源于兰州大学第二医院放射科，部分来源于患者外带高分辨螺旋CT片(包括北京同仁医院、西京医院、兰州陆军总医院等)1．HRCT为每个耳蜗植入患者从诊断到手术的常规检查，了解患者外、中、内耳的解剖情况。扫描时，患者呈仰卧位，前正中线与台面中线重合，听眶线与台面平行，固定头部。扫描范围为自外耳道下方起向上直到颞骨岩锥完全显示。仔细阅片，包括内耳的解剖结构是否完整；耳蜗的大小、周数、分隔、内听道的宽窄是否处于正常范围内；是否伴有前庭导水管扩大；前庭和耳蜗的形态是否正常；解剖结构是否完整；半规管和蜗管是否透亮，有无毛玻璃样改变；面神经的位置和形态是否正常。预估手术路径上会出现的解剖结构，并根据耳蜗的转数选择最适合患者电极。请两位具有一定经验的耳科学医生双盲阅片后给出CT报告。2．Sennaroglu2010年耳蜗畸形的分类（1）耳蜗未发育：患者耳蜗、前庭、前庭水管和耳蜗导水管缺如。（2）共同腔畸形：耳蜗与前庭成圆形或卵圆形难以区分,前庭导水管扩大与共同腔相通。（3）耳蜗发育不全:耳蜗的大小小于正常耳蜗I型：芽状耳蜗(bud-likecochlea)，耳蜗从内听道芽状萌出，耳蜗严重畸形,无蜗轴及分隔。II型：囊状耳蜗发育不全(cystichypoplasticcochlea)，蜗轴和间隔缺如，耳蜗较小，但其外部形态正常。同时伴有前庭导水管扩大，易发生镫井喷及电极植入内听道。III型：蜗管小于两圈(cochleawithlessthantwoturns)，耳蜗转数小于两圈但形态基本正常，常伴有前庭及半规管发育不全。（4）不完全分隔I型：囊性耳蜗前庭畸形，蜗轴完全缺如，前庭常常呈囊状扩张。几乎不伴有前庭导水管扩大，耳蜗常位于内听道正常位置的外侧部,大小如常。II型：基底轴蜗轴存在，蜗轴仅在基底轴存在，常伴有前庭导水管扩大，耳蜗大小如常III型：耳蜗分隔及蜗轴发育不全，耳蜗分隔及蜗轴存在但不完整。耳蜗常在内听道底，大小如常。3．CT的优势在于骨成像，MRI的优势在于软组织、血管、神经等富含水的组织成像。对于内耳而言，可以进行弥散加权水成像。对内外淋巴、前庭、膜半规管、前庭导水管进行重建，可以更加直观的了解上述结构，必要时对患者的MRI结果进行复核。8 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析2.3实验材料仪器及试剂见表2-3、2-4、2-5表2-3仪器实验仪器规格/型号生产商微量加样枪0.2/2.5/10/20ul德国排枪8道（0.5-10ul）德国低温离心机5417C/R德国乙醇500ml上海生工96孔板6810R德国小型离心机Biofuge德国续表2-3仪器分光密度仪分光密度仪分光密度仪制冰机SIM-F140日本水浴锅HW.SY21-KP4北京-20℃冰箱BCD-197T美菱-80℃超低温冰箱FORMA700SERIESThermo超净工作台BBS-V800西安离心管1.5ml上海生工异丙醇500ml上海生工表2-4试剂试剂名称规格/型号生产商BufferTBP40ml上海生工BufferDigestion10ml上海生工BufferPR4ml上海生工ProteinaseK12ml上海生工TEBuffer(pH8.0)50ml上海生工PBS缓冲液500ml实验室自配9 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析表2-5血液基因组DNA快速抽提试剂盒试剂名称规格/型号生产商50PREPS上海生工组分B518223-005050次上海生工BufferPR4ml上海生工ProteinaseK1.2ml上海生工TEBuffer(pH8.0)50ml上海生工影像学资料398例患者除部分来源于患者外带高分辨螺旋CT片(包括北京同仁医院、西京医院、兰州陆军总医院等)外，其余患者逐一在兰州大学第二医院进行高分辨CT检查。2.4实验方法2.4.1提取基因组DNA（参考试剂盒操作说明）1样品处理：取300μl抗凝全血加入600μlBufferTBP，充分混匀，室温放置1min至红细胞完全裂解，此时液体为透明红色。2.8,000rpm，离心1min，弃上清。用500µlTEBuffer重悬沉淀，8,000rpm，离心1min，小心弃上清，在干净的吸水纸上倒置几秒钟，吸弃残液。可再用TEBuffer洗涤一次至沉淀为白色。3.加入180µlBufferDigestion和20µlProteinaseK溶液，震荡混匀。56°C水浴15~30min至细胞完全裂解3.如需得到无RNA的DNA，可在水浴后加入20µl的RNaseA（10mg/ml），混匀后室温放置2~5min。水浴过程中，每10min颠倒混匀一次，可促进细胞裂解。混合液澄清透明为裂解完全。如溶液未变澄清，说明细胞裂解不彻底，应适当延长水浴时间，否则将可能降低DNA的得率或导致提取的DNA不纯。4.加入60µlBufferPR，充分颠倒混匀，-20°C冰箱放置5min。5.室温10,000rpm离心5min，将上清（约200µl）转移到新的1.5ml离心管中。6.加入等体积的异丙醇，颠倒5~8次使之充分混匀，室温放置2~3min。室温10,000rpm离心5min，弃上清。7.加入1ml75%乙醇，颠倒漂洗1~3min，10,000rpm离心2min，弃上清。ü漂洗时一定要使沉淀悬浮起来。8.重复步骤7一次。9.开盖室温倒置5~10min至残留的乙醇完全挥发。10 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析10.得到的DNA用50μlTEBuffer溶解。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20°C保存2.4.2DNA浓度检测1.空白对照：1ulTEBuffer滴到镜头作为对照2.上样检查：1ul上述DNA提取液进行检查。记录A260/280比值及样品DNA浓度，2.4.3DNA样品GJB2、SLC26A4及m.基因常见突变位点进行检测将DNA样品在上海天昊生物科技有限公司进行检测，操作流程为：1.取1ul是先提取的样本DNA与1%agarose试剂混合并进行电泳，从而进行质量检测并估计浓度；2.配制反应预混合液预混合液共有两种分别为预混合液A和预混合液B。预混合液体系如下表（表2-7、2-7），将配置好的预混合液A和预混合液B各10ul加入96孔板。表2-6预混合液A体系成分1×4×DNAlysisBuffer1.25ulProbeMixⅠorⅡ1ulDNA稀释液2.75ulDNA样本5ul表2-7预混合液B体系成分1×Ligase0.5ul10×LigaseBuffer2ulddH2O7.5ul3.将96孔板3500rpm离心1分钟，离心后放入PCR仪，运行程序为：98℃2min，5Cyclesx(95℃30s，60℃for3h)，94℃2min，72℃forever；4.配制PCR混合液：PCR混合液体系如下表（表2-7）11 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析表2-8PCR混合液体系构成成分1×PrimerMix1ul2×PCRMasterMix10ulddH2O8ulLigationProduct1ul5.取19ulPCR混合液加入96孔板中，再取步骤3产物1ul加入对应孔位，3500rpm离心1min后放入PCR仪中，程序运行为：95℃for2mins，5x(94℃20s，65℃-1℃/cycle40s，72℃1.5min)，27x(94℃20s，60℃40s，72℃1.5min)，68℃1hr，4℃forever；6.取1μl步骤5的产物，稀释20倍加入8.9μlHi-Di、0.1μlLiz500SIZESTANDARD混匀，95ºC变性5min后上ABI3130XL测序仪；7.用GeneMapper4.0分析。2.4.4试验对象进行颞骨CT检测本部分检测在兰州大学附属二院影像科进行双盲检测。2.5统计学分析采用SPSS22.0软件对398例NSHL耳蜗植入患者的听力损失常见基因GJB2、GJB3、SLC26A4、m.DNA检出率、等位基因频率以及突变热点等进行统计学分析。GJB2基因、GJB3基因、m.DNA基因等实验数据组间比较，采用卡方检验；SLC26A4基因实验数据多组间的比较，采用SNK-q检验，以p<0.05具有统计学意义。12 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析第三章结果3.1病例资料分析3.1.1男女比例及语前聋患者植入年龄分布符合本研究标准的398例耳蜗植入患者中，男性207人，女性191人，男女比例为1:0.92（图3-1）。年龄最小者1岁，年龄最大者29岁，平均年龄为8岁，其中男性平均年龄8.27岁，女性平均年龄7.99岁。3.1.2临床病因学1.语前聋患者资料分析398例耳蜗植入患者，语前聋患者共有358例，语前聋患者植入年龄最小为11月，最大为14岁，平均植入年龄为5.00±3.28（n=358）岁。语前聋患者中有男性186人，女性172人，男女比例为1:0.92。植入年龄分布及各组性别构成比见表3-1及图3-1。表3-1358例语前聋患者植入年龄及性别分布年龄分布例数百分比男/女结构比（%）≤3岁14640.7882/641.284-5岁10930.4547/630.756-7岁4412.2922/221.008-9岁164.467/90.78≥10岁4312.0128/161.75合计358100.00186/1721.08例807060504030201000246810121416岁图3-1358例语前聋患者植入年龄分布情况2.语后聋患者资料分析样本中语后聋患者共40例，占10.55%，平均发病年龄为3.48岁，其中有明确13 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析用药史者2人，占语后聋患者的5%；有高热后听力下降者16人，占语后聋患者的40%；无明显诱因者22人，占语后聋患者55%。3.2民族分布及家族史398例患者中有汉族334人，占83.91%，回族43人，占10.80%，藏族10人，占2.51%，东乡族10人，占2.51%。有听力损失家族史者50例，占12.56%。3.3基因检测结果3.3.1GJB2基因突变检测结果1.GJB2基因突变频率本研究中选取398例耳蜗植入患者进行GJB2基因国内突变频率较高的位点（共24个）检测，其中共有108例患者检测出GJB2基因突变，检出率为27.13%（108/398）。单杂合突变携带39例，复合杂合突变33例，纯合突变36例。其中最常见的突变位点为c.235delC、c.109G>A以及c.299_300delAT。其等位基因频率分别是12.31%、3.38%以及3.89%（详见表3-2）。而c.134G>A、c.164C>A、c.176_191del、c.230G>A、c.232G>A、c.283G>A、c.358_360delGAG、c.416G>A、c.598G>A这些位点在本研究的样本中未检测到。2.GJB2基因所选位点致病性描述在DVD（DeafnessVariationDatabase，DVD）数据库及NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI）数据库查询对所选位点致病性描述，认为两者皆描述为致病则该位点突变可以认为是该患者的分子学病因，若两数据库结果不统一则查阅对应文献以确定其致病性，本研究中选取的GJB2基因除c.109G>A突变外均为致病位点（具体见表3-2）。3.保守性分析：保守指数（TheConservationIndex，CI）是指人类氨基酸残基其与他物种利用ClustalOmega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)进行比较与分析并计算突变位点在所选取的物种中对应位置为同一氨基酸所占的百分比。从NCBI中选取8种动物的GJB2基因序列，将人类GJB2基因突变位点所对应的序列与其他7种脊椎动物的序列进行物种间分析，进而计算突变位点的保守指数。这8个物种包括：人（Homosapiens)、黑猩猩（Pantroglodytes）、猕猴（Rhesusmonkey）、阿拉斯加雪橇犬（Canislupusfamiliaris）、牛（Bostaurus）小家鼠（Musmusculus）、大白鼠（Rattusnorvegicus）（详见表3-2）。14 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析表3-2GJB2基因热点突变相关数据突变位点氨基端改变CdbSNPID等位DVDNCBII基因率%g.20398370--0.12—20523823delc.-3201G>A-rs80338940.37PathogenicPathogenic—0c.9G>Ap.(Trp3*)rs11103340.12PathogenicLikely101pathogenicc.35delGp.(Gly12Valfs*rs39812380.12PathogenicPathogenic—2)14c.35dupGp.(Val13Cysfs）rs39812380.25PathogenicPathogenic—14Likelypathogenicc.109G>Ap.(Val37Ile)rs72474223.39PathogenicConflicting4interpretations1ofpath-ogenicityc.139G>Tp.(Glu47*)rs10489430.25PathogenicPathogenic198c.235delCp.(Leu79Cysfs*rs803389412.30PathogenicPathogenic—3)3c.257C>Gp.(Thr86Arg)10.25Pathogenicc.299_300delATp.(His100Argfsrs11103323.89PathogenicPathogenic1*14)04c.313_326delp.(Lys105Glyfsrs11103320.12Pathogenic—*5)53c.427C>Tp.(Arg143Trp)rs80338940.12PathogenicPathogenic18c.439G>Ap.(Glu147Lys)rs76717850.12PathogenicPathogenic/Li108kelypathogenicc.508_511dupAAp.(Ala171Glufsrs77352810.50PathogenicPathogenic/LiCG*40)—25kelypathogenicc.560_605dupp.(Cys202*)—0.12-4.GJB2基因突变基因型分布本研究检出GJB2基因突变的基因型共23种，其中以[c.235delC/235delC]、[c.109G>A]以及[c.235delC/c.299_300delAT]三种最为常见，分别占28.70%（31/108）、23.15%（25/108）以及15.74%（17/108）。这三种基因型共占所有基因型的67.59%（73/108）。15 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析表3-3GJB2基因突变基因型分布基因型类型个体数所占百分比[c.9G>A]10.93[c.35delG]/[c.109G>A]10.93[c.35dupG]10.93[c.35dupG]/[c.235delC]10.93[c.109G>A]2523.15[c.109G>A]/[c.235delC]10.93[c.139G>T]/[c.235delC]10.93[c.139G>T]/[c.313_326del]10.93[c.235delC]/[c.235delC]3128.70[c.235delC]87.41[c.235delC]/[c.257C>G]10.93[c.235delC]/[c.299_300delAT]1715.74[c.235delC]/[c.439G>A]10.93[c.235delC]/[c.508_511]21.85[c.235delC]/[c.560_605dup]10.93[c.257C>G]/[c.299_300delAT]10.93[c.299_300delAT]/[c.299_300delAT]54.63[c.299_300delAT]21.85[c.299_300delAT]/[c.508_511dupAACG]10.93[c.427C>T]10.93[c.508_511dup]10.93[c.-3201G>A]/[c.235delC]32.78[g.20398370-20523823del]10.933.3.2GJB3基因突变检测结果1.GJB3基因突变频率及基因型本研究中的398例耳蜗植入患者中共有8位患者检出GJB3基因突变，占2.01%。其中c.538C>T仅有1例杂合突变，等位基因频率为0.13%；c.580G>A共7例杂合突变，等位基因的频率为0.88%。基因型也为两种即c.538C>Tc.580G>A杂合突变（详见表3-4）。另选取的c.547G>A位点在本研究的样本中未检测到。表3-4GJB3基因热点突变相关数据突变位点氨基酸改变CIdbSNPID等位基DVDNCBI因频率c.538C>Tp.(Arg180*)1rs743153190,12UnknownConflictingsignificanceinterpretationsofpathogenicityc.580G>Ap.(Ala194Thr)1rs1173856060.87Benign*Conflictinginterpretationsofpathogenicity2.GJB3基因所选位点致病性描述在DVD及NCBI数据库查询对所选位点致病性描述，目前两个数据库中均认为本研究中阳性结果的两个位点不能够导致听力损失，因此不能够作为其分子学病因（具体见表3-4）。3.3.3SLC26A4基因突变检测结果1.SLC26A4基因突变频率16 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析本研究中选取398例耳蜗植入患者进行SLC26A4基因国内热点突变位点（共60个）检测，其中共有83例患者检测出SLC26A4基因突变，检出率为20.85%。其中纯合突变23例，复合杂合突变40例，单杂合突变携带20例。其中最常见的致病位点为c.919-2A>G、c.2168A>G及c.1229C>T，等位基因频率分别是9.17%、2.26%及0.8%（详见表3-5）。其余位点在本研究的样本中未检测到。2.SLC26A4基因所选位点致病性描述具体见表3-53.保守性分析详见表3-5表3-5SLC264基因热点突变致病性描述及保守性分析突变位点氨基酸改变dbSNPIDCIAF%DVDNCBIc.235C>Tp.(Arg79*)rs7862045810.920.13PathogenicLikelypathogenicc.249G>Ap.(Trp83*)rs10575166581.000.13PathogenicPathogenicc.589G>Ap.(Gly197Ars1110333801.000.13PathogenicLikelyrg)pathogenicc.754T>Cp.(Ser252Pr-1.000.38Pathogenic-o)c.916dupGp.(Val306Glrs1057516303-0.13PathogenicLikelyyfs*24)pathogenicc.919-2A>-rs111033313-9.17PathogenicPathogenicG/Likelypathogenicc.1174A>Tp.(Asn392Trs2015628551.000.88PathogenicPathogenicyr)c.1225C>Tp.(Arg409Crs1479526201.000.25PathogenicLikelyys)pathogenicc.1226G>Ap.(Arg409Hrs1110333051.000.13Pathogenic-is)c.1229C>Tp.(Thr410Mrs1110332201.000.75PathogenicPathogenicet)c.1262A>Cp.(Gln421Pr-1.000.13Pathogenic-o)c.1334T>Gp.(Leu445Trrs1110333071.000.13PathogenicPathogenicp)17 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析续表3-5SLC264基因热点突变致病性描述及保守性分析c.1489G>Ap.(Gly497Srs1110333081.000.63PathogenicPathogenicer)/Likelypathogenicc.1517T>Gp.(Leu506Ars27122050.830.50PathogenicUncertainrg)significancec.1614+1G-rs111033312-0.25PathogenicPathogenic>Ac.1692dupp.(Cys565M--0.13--Aetfs*9)c.1707+5G-rs192366176-0.63PathogenicPathogenic>Ac.1975G>Cp.(Val659Lers2004552030.660.13PathogenicPathogenicu)/Likelypathogenicc.2027T>Ap.(Leu676Grs1110333180.910.75PathogenicPathogenicln)/Likelypathogenicc.2162C>Tp.(Thr721Mrs1219083630.970.75PathogenicPathogenicet)/Likelypathogenicc.2168A>Gp.(His723Arrs1219083621.002.26PathogenicPathogenicg)/Likelypathogenic4.SLC26A4基因突变基因型分布本研究检出SLC26A4基因突变的基因型共41种，其中最常见的六种基因型为[c.919-2A>G]/[c.919-2A>G]、[c.919-2A>G]、[c.919-2A>G]/[c.2168A>G]、[c.1174A>T]/[c.2168A>G]、[c.1489G>A]、[c.919-2A>G]/[c.1229C>T]，分别占24.10%（20/83）、9.64%（8/83）、8.43%（7/83）、3.61%（3/83）、3.61%（3/83）、3.61%（3/83），占所有基因型的53.01%。（详见表3-6）。18 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析表3-6SLC26A4基因突变基因型分布基因型类型个体数所占百分比[c.1174A>T]11.20[c.1174A>T]/[c.2168A>G]33.61[c.1174A>T]/[c.1174A>T]11.20[c.1225C>T]/[c.1229C>T]11.20[c.1225C>T]/[c.2168A>G]11.20[c.1229C>T]11.20[c.1229C>T]/[c.2168A>G]11.20[c.1262A>C]11.20[c.1489G>A]33.61[c.1489G>A]/[c.2027T>A]11.20[c.1517T>G]11.20[c.1517T>G]/[c.2162C>T]11.20[c.1707+5G>A]22.41[c.1707+5G>A]/[c.2027T>A]11.20[c.1707+5G>A]/[c.2168A>G]11.20[c.2027T>A]/[c.2162C>T]11.20[c.2027T>A]/[c.2168A>G]22.41[c.2162C>T]11.20[c.2162C>T]/[c.2162C>T]11.20[c.2168A>G]11.20[c.249G>A]/[c.2168A>G]11.20[c.754T>C]11.20[c.754T>C]/[c.754T>C]11.20[c.916dupG]/[c.2168A>G]11.20[c.919-2A>G]89.64[c.919-2A>G]/[c.235C>T]11.20[c.919-2A>G]/[c.589G>A]11.20[c.919-2A>G]/[c.1614+1G>A]22.41[c.919-2A>G]/[c.1174A>T]11.20[c.919-2A>G]/[c.1226G>A]11.20[c.919-2A>G]/[c.1229C>T]33.61[c.919-2A>G]/[c.1334T>G]11.20[c.919-2A>G]/[c.1489G>A]11.20[c.919-2A>G]/[c.1517T>G]22.4119 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析表3-6SLC26A4基因突变基因型分布[c.919-2A>G]/[c.1692dupA]11.20[c.919-2A>G]/[c.1707+5G>A]11.20[c.919-2A>G]/[c.1975G>C]11.20[c.919-2A>G]/[c.2027T>A]11.20[c.919-2A>G]/[c.2162C>T]11.20[c.919-2A>G]/[c.2168A>G]78.43[c.919-2A>G]/[c.919-2A>G]2024.105.本研究中的398例耳蜗植入患者中共有9位患者检出线粒体基因突变，占2.26%，检出的位点为m.1555A>G和m.1095T>C。其中检测出m.1555A>G突变者5例，m.1095T>C突变者4例。6.本研究中GJB2基因双等位基因突变者共75例，SLC26A4基因双等位基因突变者63例，m.1555A>G及m.1095T>C突变患者共9例，其中m.1555A>G突变者5例患者均有氨基糖苷类药物用药史。因此分子学病因明确者共147例，占36.94%（147/398）。分子病因学不明确者251例，占63.06%（251/398）。3.4内耳畸形的分布情况本研究选取的398例NSHL耳蜗植入患者，根据Sennaroglu[3]2010分类标准,398例耳蜗植入患者高分辨率螺旋CT的结果（详见表3-7）：内耳畸形者共137例（269耳，5耳未见明显异常），内耳畸形的发生率为33.79%（137/398）。累及双侧132例，占98.54%（132/137）；累及单侧5例，占3.64%（5/137），受累耳共269耳；双侧均未累积者261例，占65.58%（261/398）。其中单纯前庭导水管扩大者155耳，占57.62%（155/269）；前庭及半规管畸形者22耳，占8.18%（22/269）；内听道狭窄3耳，占1.12%（3/269）；内听道扩大5耳，占1.86%（5/269）；耳蜗畸形96耳，占35.68%（96/269）。耳蜗畸形中包括耳蜗未发育3耳，占3.13%（3/96）；耳蜗发育不全II型2耳，占2.08%（2/96）；耳蜗发育不全III型4耳，占4.16%（4/96）；不完全分隔I型9耳，占9.38%（9/96）；不完全分隔II型73耳，占76.04%（73/96）；不完全分隔III型5耳，占5.21%（5/96）。上述畸形中伴有前庭导水管扩大有222耳，占82.52%（222/269）。20 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析表3-7137例（269耳）畸形分布情况类型例数/耳数耳数所占百分比前庭导水管扩大117/22282.52%前庭及半规管畸形14/228.17%耳蜗畸形57/9635.68%内听道畸形5/82.97%3.4.1耳蜗畸形根据Sennaroglu2010标准[1]，将内耳畸形分为4大类，即耳蜗未发育、共同腔畸形、耳蜗发育不全、不完全分隔。本研究中出现3类，未发现共同腔畸形。21 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析（1）耳蜗未发育：共3例3耳，占3.12%。耳蜗未发育常表现为耳蜗、前庭、前庭导水管和耳蜗导水管缺如（如图3.4.1），在内听道底未见到耳蜗结构。图3.4.1耳蜗未发育（2）耳蜗发育不全：在Sennaroglu2010标准中，该类型共三型。本研究中共检出两型：耳蜗发育不全II型2例2耳，占2.08%；耳蜗发育不全III型2例4耳，占4.16%。耳蜗发育不全II型（如图3.4.2），特点为蜗轴和间隔缺如，耳蜗较小，但其外部形态正常，同时伴有前庭导水管扩大。图3.4.2耳蜗发育不全II型耳蜗发育不全III型（如图3.4.3），特点为耳蜗转数小于两圈但形态基本正常，常伴有前庭及半规管发育不全。22 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析图3.4.3耳蜗发育不全III型（3）不完全分隔：按照Sennaroglu2010标准，共有3种。在本研究中，不完全分隔I型9耳，占9.38%（9/96）；不完全分隔II型73耳，占76.04%（73/96）；不完全分隔III型5耳，占5.21%（5/96）。不完全分隔I型（如图3.4.4），蜗轴完全缺如，前庭常常呈囊状扩张。几乎不伴有前庭导水管扩大，耳蜗常位于内听道正常位置的外侧部,大小如常。图3.4.4不完全分隔I型不完全分隔II型（如图3.4.5），蜗轴仅在基底轴存在，常伴有前庭导水管扩大，耳蜗大小如常。23 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析图3.4.5不完全分隔II型不完全分隔III型（如图3.4.6），耳蜗分隔及蜗轴存在但不完整。耳蜗常在内听道底，大小如常。图3.4.6不完全分隔III型3.4.2前庭及半规管畸形本研究中前庭畸形14例22耳，占8.18%。伴有半规管异常者13例，前庭囊性扩张者5例（如图3.4.7），前庭缺如者2例，该患者前庭呈囊性扩张前庭导水管扩大。24 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析图3.4.7前庭囊性扩张3.4.3内听道畸形本研究中内听道畸形（如图3.4.8）患者共5例8耳，占2.97%。其中内听道狭窄2例3耳，占1.12%（3/269）；内听道扩大3例5耳，占1.86%（5/269）。图3.4.8内听道狭窄（左）、内听道扩大（右）25 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析表3-8耳蜗畸形分布情况畸形类型例数耳数所占百分比不完全分隔I型699.37不完全分隔II型397376.04不完全分隔III型355.21耳蜗未发育333.12耳蜗发育不全II222.08耳发育不全III244.163.5耳蜗畸形与GJB2、SLC26A4基因、线粒体基因的相关性3.5.1GJB2基因突变与耳蜗畸形.将患者分为无畸形组和畸形组，无畸形组261例患者中共有86例患者检出GJB2基因突变，检出率33.33%（86/261），等位基因频率为26.82%；患有内耳畸形组137例者中共有21例患者检出GJB2基因突变，检出率15.33%（21/137），等位基因频率为12.41%。比较畸形组和无畸形组GJB2基因的等位基因频率，两者差异无统计学意义（p>0.05；p=0.097)。表3-9GJB2基因突变在各组间的分布GIB2基因型双等位突变单等位突变无突变等位基因频率1组（正常组）1083217526.82%2组（畸形组）26811612.41%将患者分为GJB2基因单等位基因突变组、双等位基因突变组、上述4种基因检测均为阴性组。三组的内耳畸形发生率分别为20.00%（8/40）、19.11%（13/68）、21.60%（43/199），相互之间两两比较，无统计学差异。26 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析250200150100500基因检测阴性GJB2单等位基因突变GJB2双等位基因突变有畸形无畸形图3.5.1内耳畸形在GJB2基因突变组和基因检测结果阴性组的分布3.5.2SLC26A4基因突变与耳蜗畸形由于SL26A4基因与前庭导水管扩大以及不完全分隔II型（即以前的Mondini畸形）关系密切[31-32]，按照是否伴有前庭导水管扩大及其他内耳畸形分为伴有或患有前庭导水管扩大组、无内耳畸形组、其他内耳畸形不伴有EVA组（见表3-10）。前庭导水管扩大相关畸形组中伴有前庭导水管扩大的畸形的患者共116例，等位基因频率为59.91%；无内耳畸形患者共261例，等位基因频率为1.15%；其他内耳畸形不伴有前庭导水管扩大组共20例，等位基因频率为2.50%。EVA相关组与其他两组等位基因频率比较具有统计学意义（p<0.05）。表3-10SLC26A4基因是否伴有前庭导水管扩大组等位基因频率SLC26A4基因型（突变数）分组2个1个0个样本数等位基因频率无明显内耳畸形261062551.15单纯前庭导水管扩大435328056.88前庭导水管扩大不完全分隔II相关畸形型伴EVA18883464.7059.91其他内耳畸形伴EVA4004100.00其他内耳畸形不伴EVA0119202.50其中无内耳畸形者共261例，SLC26A4基因突变等位基因频率为1.15%；单纯前庭导水管扩大患者共80例中，检出SLC26A4基因突变等位基因频率为56.88%；患有不完全分隔II型共39例，其中SLC26A4等位基因频率为61.54%；其他内耳27 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析畸形者16人，等位基因频率为3.13%；两两比较其等位基因频率（见表3-11及表3-12）。表3-11SLC26A4基因在不同畸形组等位基因频率SLC26A4基因型（突变数）分组2个1个0个样本数等位基因频率无内耳畸形261062551.15单纯前庭导水管扩大（EVA）435328056.88不完全分隔II型391881361.54EVA相关内耳畸形11663134059.91其他内耳畸形1601153.13表3-12组间等位基因突变频率比较EVAEVA不完全分EVA相关EVA不完全分其他内耳隔II型内耳畸形隔II型畸形不完全分其他内耳其他内耳未见明显无明显内耳畸形组隔II型畸形畸形内耳畸形p>0.05p<0.05p<0.05p<0.05p<0.05p<0.05p>0.05p=0.533p=0.000p=0.000P=0.000p=0.000p=0.000P=0.34728 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析第四章讨论耳蜗植入（Cochlearimplantation,CI）是重度及极重度感音神经性听力损失最终的有效治疗途径，电子耳蜗植入患者是一个特殊的群体，由于人工耳蜗植入术的手术禁忌症以及言语康复需要考虑多方面的因素，因此该群体是一个独特的群体。该群体是感音神经性听力损失的重灾区，也是遗传性听力损失的重灾区，因此对于该群体的研究应该作为遗传性听力损失研究的重中之重。对该人群进行分子病因学研究无疑是对其遗传方式和致病机制最直接，最根本的研究方式。其一方面有助于了解和预测疾病的发生发展过程，给予更早更有效的干预，使患者获得最佳的疗效；另一方面对先证者及其家属进行基因筛查，进行追本溯源，在不远的将来还可以进行生育指导，从而做到疾病的预防。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)目前已经被越来越广泛的应用于遗传性疾病的诊断中[33]。具有费用低，耗时短，准确性高等优点。因此本研究运用该方法对398例耳蜗植入患者进行GJB2、GJB3基因、SLC26A4基因及m.1555A>G、m.1494C>T和m.1095T>C基因进行检测。4.1临床特征分析398例耳蜗植入患者中男性略多于女性，男女比例近似为1:1。因语后聋的植入年龄受到发病年龄的影响。因此本研究仅讨论语前聋患者的平均植入年龄。在语前聋患者中植入年龄最小者11月，最大14岁，平均植入年龄为5.00±3.28岁，3岁以内的患者占40.78%，5岁以内的患者占71.23%。耳蜗植入的常规年龄为1-5岁[34],我院大部分患儿基本符合该标准。其中语后聋患者有40例，其中伴有前庭导水管扩大者19例，大多数EVA患者在出生后已表现听力损失，但部分患者的听力下降可以发生在学语前和语言发育过程中[2]，即在前庭导水管扩大的患者中语后聋的患者更为常见。而本研究EVA患者语后聋所占的比例明显较少，占23.75%（19/80）。其原因可能是前庭导水管扩大的患者听力下降的形式不尽相同，可表现为先天性重度或极重度听力损失，波动性听力下降或稳定性听力下降等[3]。本研究中之所以以语前聋更为常见，可能是因为语后聋患儿，从初次发病到极重度听力损失需要一定的时间，而早期即接受耳蜗植入的EVA患者，更多的是先天性重度或极重度听力损失的患儿。4.2GJB2基因检测的结果分析GJB2基因位于染色体13q11-12，属于缝隙连接蛋白家族成员。GJB2基因所编码的为β-2型缝隙连接蛋白，即缝隙连接蛋白26(Cx26)[8]。研究表明Cx26在人类的内耳毛细胞中广泛表达[9]，在GJB2基因突变小鼠中早期即观察到Corti器退29 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析化，螺旋神经节神经元密度变小[10]。Kikuchi等人研究发现[11]Cx26是毛细胞维持钾离子平衡的重要因素，当Cx26受损时一方面使得细胞间信息交流受到影响[12-13],从而影响毛细胞的功能；另一方面使得螺旋器中钾离子外排受损，破坏了钾离子的胞内外平衡，从而使得Corti器中毒，无法维持膜电位并形成电势差。因此当声音传至内耳时，内淋巴的震动不能够使得毛细胞去极化形成电信号向中枢传递。进而引起感音神经性听力损失[14-15]。因此专家推测，Cx26发生改变会使得耳蜗的一系列功能发生障碍，因此，Cx26对内耳毛细胞的存活乃至耳蜗的功能起到决定性的作用[16]。本研究中398例非综合征型极重度听力损失的耳蜗植入患者GJB2基因检出率为27.13%，而在语前聋患者中的检出率为29.61%（106/358）。郑文波等[35]对43例NSHL语前聋患者进行GJB2基因检测，检出率为26%，最常见的突变位点为c.235delC；而柯肖枚等[36]对1190例非综合征性耳聋患者进行GJB2基因检测，检出率为21.01%，最常见的突变位点为c.235delC。本研究中，GJB2基因是检出率最高的基因。其中GJB2基因突变最常见的突变位点为c.235delC、c.299_300delAT和c.109G>A其等位基因频率分别是12.31%、3.89%和3.38%。在108例患者中共有102人携带3种常见突变的至少一种，占阳性患者的94.44%。仅有6例患者仅携带其他突变位点。由于各个研究之间样本特征不同、检测方法不同、检测所包含的位点和数量不同，以及对于位点致病性的认定不同，因此对于不同研究GJB2基因总体检出率的变化比较意义不大。本研究与郑文波[35]、柯肖枚[36]等的研究相比，GJB2基因突变的检出率均为最高，这可能与本研究听力损失的严重程度较重有关，但最常见的突变位点均为c.235delC。c.235delC突变属于框移突变，位于79位的亮氨酸和80位谷氨酰胺变为半胱氨酸和丝氨酸，而后终止翻译。c.235delC是东亚人群中最常见的致病突变[37-38]。这与本研究的检测结果所示趋势一致，c.235delC的检出率为16.08%。因此该位点是NSHL耳蜗植入患者GJB2基因检出率最高的位点。c.299_300delAT突变也属于框移突变，突变后第100位氨基酸向后延伸8个氨基酸后提前终止。c.299_300delAT突变为汉族人群的热点突变[33],本研究中的检出率为6.53%。本研究的样本中汉族为主要民族，但也属于西北地区，样本中囊括了西北地区的人种特色，因此该位点为第二常见的突变位点。XinF等[39]对中国云南地区汉族NSHL患者GJB2基因突变的检测中该位点也为第二常见的位点，趋势与本研究一致。c.109G>A突变属于错义突变，突变后第37位缬氨酸变为异亮氨酸，对于这一位点的致病性一直以来都有争议，但近年来越来越多的专家和学者认为该位点纯合突变可导致听力损失，特别是迟发型听力损失[40-42]。DVD数据库对该位点的描述为该位点为致病位点。虽然NCBI数据库对于该位点致病性的描述为：conflictinginterpretationsofpathogenic即致病性互相矛盾，也就是说部分研究认为该位点能够30 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析导致听力损失，另一部分研究则认为该位点不能够导致听力损失。但是近几年文献报道更倾向该位点纯合突变能够导致感音神经性听力损失[43]，特别是迟发型听力损失，Chen等人观察c.109G>纯合缺失小鼠的外毛细胞存在轻度损伤[43]。因而推测在部分听力正常者中也能够检测到该位点纯合突变或许是听力损失尚未发生。本文将c.109G>A位点列为候选致病突变，即c.109G>A纯合或复合杂合突变时，则认为该突变为该患者的候选分子学病因。但在本研究中26例c.109G>A突变的患者中仅有一例为复合杂合突变，其余均为杂合突变，不能认为该单杂合突变为检出患者的分子学病因。4.3SLC26A4基因检测的结果分析Abe和Usami等[31-32]发现SLC26A4基因突变与大前庭水管综合征的发生有关。SLC26A4基因位于染色体7q22.3，包含21个外显子，开放阅读框长度为2343bp。其编码的蛋白质（Pendrin）由780个氨基酸组成，为硫酸盐转运蛋白的同源蛋白，是一种有12个跨膜区的跨膜蛋白。在内淋巴管、内淋巴囊、椭圆囊和球囊斑相连非感觉上皮、外沟的外侧壁以及甲状腺等处广泛表达。介导氯离子的转运，同样也是调节内淋巴离子平衡，维持膜电位的重要成员[23]，当SLC26A4基因发生突变，Pendrin蛋白受损，从而使细胞不能够正常的转运氯离子，离子平衡无法维持，从而造成感音神经性听力损失[38]。关于SLC26A4基因和前庭导水管扩大将在第二部分进行详述。本研究中398例非综合征型极重度听力损失的耳蜗植入患者SLC26A基因检出率为20.85%。最常见的致病位点为c.919-2A>G、c.2168A>G和c.1229C>T其等位基因频率分别是9.17%、2.26%和0.75%。在83例患者中共有66人携带3种常见突变的至少一种，占阳性患者的79.50%。共有17例患者携带其他突变位点。本研究中的三个热点突变c.919-2A>G、c.2168A>G和c.1229C>T其等位基因频率分别是9.17%、2.26%和0.75%。检出率分别为13.57%、4.52%和1.51%。这三个突变为已知突变，并且在亚洲人群中为较高频率突变位点。c.919-2A>G突变位于第七内含子上，突变后会干扰信使RNA的剪接及修饰，从而影响第八外显子的翻译。[45]DuW等研究发现c.919-2A>G具有种族特异性，是我国SLC26A4基因最常见的突变位点。本研究的检测结果与此趋势一致。c.2168A>G突变属于错义突变，突变后第723位组氨酸突变为精氨酸，为SLC26A4基因另一常见突变位点，在韩国[45]和日本[46]该位点均为SLC26A4基因检出率最高的位点，分别为53％和40％。在本研究中该位点为NSHL耳蜗植入患者第二常见的SLC26A4致病基因。本研究检出SLC26A4基因突变的基因型共38种，其中以[c.919-2A>G]/[c.919-2A>G]、[c.919-2A>G]、[c.919-2A>G]/[c.2168A>G]三种最为常见，分别占24.10%、31 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析9.63%和8.43%。这三种基因型共占SLC26A4基因所有基因型的42.17%。为NSHL耳蜗植入患者SLC26A4基因突变最常见的基因型。4.4m.1555A>G、m.1494C>T和m.1095T>C基因检测的结果分析线粒体为真核生物的一种细胞器，通过氧化呼吸链为机体提供能量，并产生氧自由基[48]。线粒体内的DNA共约有16569个碱基，分为编码区和非编码区。编码区编码12s、16sRNA，22种tRNA以及线粒体氧化磷酸化酶复合体亚基。非编码区编码L链复制起始区以及控制区（D-loop区）[49]。线粒体基因突变所致的耳聋中，最常见区域为线粒体基因编码12SrRNA和tRNAser(UCN)的区域[49-50]。m.1555A>G与m.1494C>T两位点位于12SrRNA区域。Prezant[42]等最早发现m.1555A>G能够导致NSHL，并与氨基糖苷类抗生素（AminoglycosideAntibiotics，AmAn）密切相关。氨基糖苷类抗生素的抗菌机制为与细菌的核糖体RNA相结合，干扰的细菌转录和翻译的过程，并能够抑制70S核糖体的裂解，从而干扰“核糖体循环”杀灭细菌[51-52]。氨基糖苷类抗生素本身能够引起药物性耳聋，其致病机制[52]认为是氨基糖苷类抗生素随着血液循环进入内耳毛细胞，并在其线粒体内续积，干扰蛋白质的合成，从而造成氧化呼吸链的障碍，最终导致听力下降。m.1555A>G、m.1494C>T编码的蛋白都参与合成线粒体12SrRNA，突变后形成C1494-1555G或T1494-1555A碱基配对，易与氨基糖苷类药物结合，从而造成NSHL。m.1095位于线粒体编码核糖体的序列上，保守性很高，突变后可能会造成12SrRNA三级或四级结构改变，导致线粒体功能障碍进而造成NSHL[53-56]。本研究中共有9例患者检出上述三个基因，其中m.1555A>G共5例，占总样本的1.25%；m.1095T>C共4例，占总样本的1.01%。m.1494C>T未检出。其中m.1555A>G突变患者均有明确氨基糖苷类药物用药史。2例为语后聋。线粒体基因突变为NSHL耳蜗植入患者三种基因检查中最不常见的一种。线粒体相关的听力损失，具有母系遗传的特点，因此应结合相应的遗传咨询，对于母系成员应避免或禁止使用氨基糖苷类抗生素。4.5GJB3基因检查结果分析GJB3基因所编码的蛋白为缝隙连接蛋白31（Cx31），属于缝隙连接蛋白家族成员。突变可引起非综合征型听力损失，遗传特性可表现为常染色体显性或隐性[18]。在小鼠的耳蜗和听神经中可以发现GJB3基因的表达[19]，其致病机制有可能与GJB2相似，突变后有可能影响到电压门控通道，从而破坏离子平衡，造成听力损失[18]。目前已报道的能够导致听力损失的GJB3基因突变位点较少。查询DVD及NCBI数据库，均认为本研究中阳性结果的两个位点不能够导致听力损失。Huang等人[57]32 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析比较了5700例听力损失患者与4700例听力正常患者GJB3基因c.538C>T位点的检出率，发现并无统计学差异，认为该位点对听力损失没有贡献。本次对398例耳蜗植入患者进行基因检测，其中共有8位患者检出GJB3基因突变，占2.01%。其中c.538C>T突变1例，为单杂合突变，等位基因频率为0.13%；c.580G>A突变共7例，为单杂合突变，等位基因的频率为0.88%。此次检出的GJB3基因突变患者共8位，其中3位已检测到其他能够解释其听力损失的分子学病因。剩余5位仅检测出GJB3基因单杂合突变，其分子学病因还需结合家族史并进一步验证。4.6耳蜗植入患者常见听力损失基因检查结果分析对398例非综合征型极重度听力损失的耳蜗植入患者进行常见听力损失基因检测中，GJB2基因为该群体最常见的致病基因，检出率最高，与戴朴[58]等的研究结果基本一致，但热点突变并不相同。本研究的热点突变为c.235delC，而刘等[59]的热点突变为c.35delG，这可能与组成样本的人种不同有关。c.235delC是蒙古人种中最常见突变形式[60-61]，我院虽地处西北地区，但样本中仍然以蒙古人种为主，因此该位点也成为了我院耳蜗植入患者中的热点突变。SLC26A4基因在该群体中的检出率高于刘[59]等的检测结果，但热点突变相同。这可能是因为极重度听力损失的人群SLC26A4基因突变更为密集。线粒体听力损失相关基因检出率为2.26%，也高于刘[59]等的检测结果，但与陈兴健[62]等对西北地区少数民族线粒体基因检测结果基本一致。这可能与我院的地理位置，耳蜗植入人群分布具有西北特色有关。GJB2基因双等位基因突变者共75例，SLC26A4基因双等位基因突变者63例，m.1555A>G及m.1095T>C突变患者共9例。因此分子学病因明确者共147例，占36.94%（147/398）。共有251例分子病因学不明确者，占63.06%（251/398）。由于所选取的位点为较为常见的位点并非全部的位点，所以与这三种基因在NSHL中的检出率存在一定的差异。耳蜗植入患者是感音神经性听力损失的重灾区，也是遗传性听力损失的重灾区，因此对于该群体的研究应该作为遗传性听力损失研究的重中之重。自兰州大学第二医院开展耳蜗植入以来，在郭玉芬教授的带领下，截止目前已经为上千位失聪患者重建了听力。耳蜗患者的临床资料，遗传学资料，康复资料正在进一步完善中。不仅仅是救助失聪患者，使他们重建听力。更重要的是为他们完善分子病因学检测，提供遗传性咨询，优生优育。本研究针对该群体进行了一次听力损失常见基因的检测，告知其可能的遗传方式及高危因素。但目前我们能常规检测的听力损失致病基因仍然是有限，所以大部分患者依然不能够明确其听力损失的分子学病因，尚不能为患者提供更多的遗传学支持。因此希望随着检测技术的不断提高，检测费用不断降低，听力损失常见基因的检测能够在人群中普及，特别是有家族史的人群，以增33 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析强对聋病的预防，减短聋病的发现时间，避免接触高危因素，指导生育降低聋儿的出生率。耳蜗在人类胚胎形成的第25周即已完成了发育[63]。理论上，耳蜗发生畸形的时间应当在胚胎形成的25周前。内耳发生始于胚胎发育的第3周，第三周时形成听板，听板内陷形成听杯。第4周末听杯杯口相互靠近形成听泡。4-8周生发出平衡神经节。在妊娠的第5周时，耳蜗开始向外突出，至第7-8周便形成了一个芽状螺旋结构约1.5圈，第10周时达2圈，第25周时完成了2.5圈[32]。耳蜗畸形可由多种因素造成，例如感染、遗传及药物等。不同的畸形是在耳蜗发生的不同阶段形成的[64]。例如最为常见的不完全分隔II型，是由于胚胎发育至第7周时发生障碍所致。此时耳蜗只有一圈半，顶圈和第二圈融合，常伴有前庭导水管、半规管的畸形[65]。那么什么是不完全分隔，这里就不得不引出一个结构即Interscalar间隔[1]。Interscalar间隔是将耳蜗自耳蜗矢状位切开所看到的一个基底轴中心四边形或五边形的结构。当耳蜗转数不够时，Interscalar间隔的形状就会发生变化。在芽状耳蜗、耳蜗发育不全II型、不完全分隔I型时Interscalar间隔就会完全消失，而在耳蜗发育不全III型、不完全分隔II型时则会达不到四边形的结构，并以此来作为一个重要的诊断参数。耳蜗植入患者是内耳畸形高发的群体，本研究根据2010年Sennaroglu标准[1]对我院耳蜗植入患者的内耳影像学资料进行分类，了解甘肃省内NSHL耳蜗植入患内耳畸形的分布情况，并分析其与基因突变的相关性。这将对继续开展耳蜗植入项目提供理论支持，也为后续研究畸形与植入效果的分析奠定了基础。4.7影像学结果分析在398例患者中患有内耳畸形者共137例（269耳，5耳未见明显异常），内耳畸形的发生率为33.79%（137/398）。累及双侧132例，占98.54%（132/137）；累及单侧5例，占3.64%（5/137），受累耳共269耳；双侧均未累积者261例，占65.58%（261/398）。现详细讨论各种畸形。4.7.1耳蜗畸形结果分析（1）耳蜗未发育：本研究中耳蜗未发育3例3耳，占耳蜗发育畸形的3.13%（3/96）。耳蜗未发育为耳蜗植入的禁忌症，但本研究中的3例均为单侧发病，3例患者的对侧均为不完全分隔II型，我们在对侧进行了耳蜗的植入。（2）耳蜗发育不全：按照Sennaroglu2010标准[1]耳蜗发育不全分别有3种类型。耳蜗发育不全I型，为芽状耳蜗，耳蜗自内听道底芽状萌出，耳蜗严重畸形，无蜗轴及分隔，在本研究中未发现。耳蜗发育不全II型是指蜗轴和间隔缺如，耳蜗较小，但其外部形态正常，同时伴有前庭导水管扩大。耳蜗植入时，容易发生镫井喷及电极植入内听道，本研究中共有2例2耳，占2.08%（2/96）。耳蜗发育不全III34 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析型是指耳蜗转数小于两圈但形态基本正常，常伴有前庭及半规管发育不全2例4耳，占4.16%（4/96）。（3）不完全分隔：Sennaroglu2010标准[1]中不完全分隔也分为3种，不完全分隔I型，蜗轴完全缺如，前庭常常呈囊状扩张，耳蜗常位于内听道正常位置的外侧部，大小如常，本研究中共6例9耳，占9.38%（9/96）。不完全分隔II型，即Mondini畸形，蜗轴仅在基底轴存在，常伴有前庭导水管扩大，本研究中共39例73耳，占76.04%（73/96）。38例中仅有5例不伴有前庭导水管扩大与标准中描述一致。不完全分隔III型，是指耳蜗分隔及蜗轴存在但不完整，耳蜗常在内听道底，本研究中共3例5耳，占5.21%（5/96）。（4）共同腔畸形共同腔畸形，是指耳蜗与前庭成圆形或卵圆形难以区分，前庭导水管扩大与共同腔相通，蜗神经及前庭神经进入共同腔的中心。但应注意的是，此种畸形的患者在进行耳蜗植入时，一定要进行MRI检查，从而确认是否存在蜗神经及前庭神经。在本研究中尚未发现共同腔畸形。4.7.2前庭及半规管畸形包括伴有或患有前庭扩张，发育不全，缺如，半规管发育不全或缺如的患者。本研究中前庭畸形14例22耳，占8.18%。伴有半规管异常者13例，前庭囊性扩张者5例，前庭缺如者2例。4.7.3前庭导水管相关畸形前庭导水管扩大为NSHL患者中最常见的内耳畸形的类型，其扩大的金标准为高分辨率颞骨CT总脚至前庭水管外口的连线上前庭水管的宽度超过1.5mm[66]。前庭导水管相关畸形包括伴有或患有前庭导水管扩大，在本研究中共222耳，占82.52%（222/269），是NSHL耳蜗植入患者中最常见的一种内耳畸形。单纯前庭导水管扩大者155耳，占57.62%（155/269）。在合并有其他畸形时以不完全分隔II型最常见，共有34例61耳伴有前庭导水管扩大，占27.48%（61/222）。这与李幼靖等对NSHL听力损失患者[67]的研究趋势相同。与李幼瑾等[67]对860例感音神经性听力损失患者内耳畸形的构成的研究相较，本研究的畸形发生率较高。不同种类畸形的分布存在差异。纯前庭导水管扩大、耳蜗分隔不全畸形的发生率高于李幼靖等[67]的研究。但耳蜗未发育、共同腔畸形、内听道狭窄等严重的内耳畸形的检出率均高于本研究。这可能与本研究的样本选择有关。因本研究所选取的样本为耳蜗植入患者，因此患者均为极重度听力损失患者，内耳畸形的发生率可能高于其他听力损失的人群；另一方面严重的内耳畸形不具备耳蜗植入的条件，因此严重畸形所占的比例较低，仅有的几例耳蜗未发育或者发育不全的病例，也都为单侧发病，另一侧为较轻或者未见明显内耳畸形的患者。而这35 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析与最初预测的结果相一致。4.8基因检测与畸形相关性分析4.8.1GJB2基因与内耳畸形近年来GJB2基因与内耳畸形的相关性存在争议，以往研究表明GJB2基因突变主要累及膜迷路，不造成骨性畸形的改变[68]。而Propst等则认为GJB2基因突变的患者在没有SLC26A4基因的干扰下，至少有一种内耳解剖结构异常。此后也有报道GJB2纯合或复合杂合患者伴有蜗轴不对称和前庭导水管扩大[69-70]。本研究中261例耳蜗未见明显畸形患者中具有GJB2基因突变的患者共86例，检出率为33.33%（86/261），等位基因频率为26.82%。137例患有耳蜗畸形的患者中GJB2基因突变的患者共21例，检出率为15.10%（21/137），等位基因频率为12.49%。有畸形组和无畸形组GJB2基因的等位基因频率比较，p>0.05(p=0.097)，没有统计学意义。无内耳畸形组GJB2基因的检出率明显高于有内耳畸形组，虽不能说明GJB2基因为内耳畸形的保护性基因，但至少不能作为内耳畸形的候选基因。将患者分为GJB2基因单等位基因突变组、双等位基因突变组、上述4种基因检测均为阴性组。三组的内耳畸形发生率分别为20.00%（8/40）、19.11%（13/68）、21.60%（43/199），相互之间无统计学差异。也同样说明GJB2并非内耳畸形的重要因素。而在199例常见听力损失基因检测为阴性的患者中，患有内耳畸形的患者为43例占21.61%。对GJB2突变的畸形发生率与基因检测阴性的畸形发生率进行比较,二者无统计学意义，提示GJB2与内耳畸形无明显相关性。4.8.2前庭导水管相关性畸形与SLC16A4基因突变前庭水管（vestibularaqueduct，VA）为后颅窝与骨迷路相连的骨性通道，其扩大的标准为总脚至前庭水管外口的连线上前庭水管的宽度超过1.5mm[66]。大前庭水管综合征（largevestibularaqueductsyndrome，LVAS）是指前庭导水管扩大和感音神经性听力损失同时存在。研究表明前庭导水管扩大会伴随多种疾病出现，例如LVAS与综合征型听力损失Pendred综合征[71]、鳃耳肾（BOR）综合征[72]，甚至在Waardenburg综合征的部分患者中也有发现[73]。Campbell等研究发现SLC26A4基因突变与不完全分隔II型及前庭水管扩大相关，是其主要致病因素[74]。单纯前庭导水管扩的的患者中SLC26A4的等位基因频率为56.88%，不完全分隔II型患者的SLC26A4的等位基因频率为61.54%，虽然两者等位基因频率不具有统计学差异，但十分接近。并且不完全分隔II型常常伴随前庭导水管扩大，因此很有可能为二者共同的致病基因。Goldfeld曾提出，SLC26A4基因突变导致内淋巴囊水肿，进而进一步导致不完全分隔II型[75]。按照是否伴有前庭导水管扩大及其他内耳畸形分为36 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析伴有或患有前庭导水管扩大组、无内耳畸形组、其他内耳畸形不伴有EVA组。前庭导水管扩大相关畸形组中伴有前庭导水管扩大的畸形的患者共116例，等位基因频率为59.91%，，无内耳畸形患者共261例，等位基因频率为1.15%；其他内耳畸形不伴有前庭导水管扩大组共20例，等位基因频率为2.50%。EVA相关组与其他两组比较p<0.05，均有统计学意义。表明SLC26A4基因突变与前庭导水管扩大相关。其中单纯前庭导水管扩大的患者共80例中，检出SLC26A4基因突变者48例，检出率为60%（48/80），等位基因频率为56.88%；患有不完全分隔II型共39例，其中SLC26A4等位基因频率为61.54%；其他内耳畸形者16人，等位基因频率为3.13%；无明显内耳畸形组261例，等位基因频率为1.15%，不完全分隔II型组与无明显内耳畸形组等位基因频率进行比较p<0.05（p=0.000），具有统计学意义，表明SLC26A4基因突变与不完全分隔II型相关。SLC26A4基因双等位基因突变共63例，所对应的病例均为前庭导水管相关患者，其一致性为100%。李幼靖[67]等对感音神经性听力损失患者也进行过相关研究，虽听力严重程度不同，但结果一致。由此可见SLC26A4基因突变可能是前庭导水管相关畸形主要致病因素。样本中仍然有40例伴有EVA的患者未检出SLC26A4基因突变，这可能与EVA病因多元性有关，除了有其他基因突变所致外，还有可能受到环境致畸因素等的影响。4.8.3非前庭导水管相关性畸形与SLC16A4基因突变398例NSHL耳蜗植入患者中共有20例患有内耳畸形但不伴有EVA，其SLC26A4等位基因频率为2.50%，将其与前庭导水管相关性畸形组SLC26A4等位基因频率59.91%，进行比较p<0.05（p=0.000）具有统计学差异。因此可以认为SLC26A4基因突变与非前庭导水管相关性内耳畸形无明显相关性。37 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析第五章结论本课题研究的对象是甘肃省非综合征型耳蜗植入患者，了解并关注常见听力损失基因在该群体中的分布情况，以及基因的热点突变，一方面可以为患者及家属提供相应的遗传咨询，另一方面还可以为我院进一步研究耳蜗植入言语康复与畸形、基因突变相关性分析奠定基础。对398例患者进行高分辨率CT阅片统计并分析，结合基因检测的结果得出结论。本课题的研究结论有：1.甘肃省非综合征型耳蜗植入患者最常见的致病基因是GJB2基因，突变热点为c.235delC。第二常见的是SLC26A基因，突变热点为c.919-2A>G。线粒体听力损失相关基因检出率为2.26%。其中分子学病因明确者147例，占36.94%（147/398），分子病因学不明确者251例，占63.06%（251/398）。2.398例研究样本中语前聋患者为358例，最小植入年龄为为11月，最大为14岁，平均植入年龄为5.00±3.28岁；语后聋患者40例，平均发病年龄为3.48岁。其中明确用药史者2人，高热后听力下降者16人，无明显诱因者22人。语前聋与语后聋比例为8.95:1。3.c.109G>A对于这一位点的致病性一直以来都有争议。近年来的文献中越来越倾向该位点纯合突变能够导致感音神经性听力损失，特别是迟发型听力损失[37]，本次检出一例c.109G>A复合杂合突变的患者，认为GJB2基因该复合杂合突变为其候选分子学病因。4.此次检出的GJB3基因突变患者共8位，其中3位已检测到其他能够解释其听力损失的分子学病因。剩余5位仅检测出GJB3基因单杂合突变，其分子学病因还需结合家族史并进一步检测才能够确认。5.按照Sennaroglu2010标准，398例NSHL耳蜗植入患者高分辨率螺旋CT结果：EVA为最常见的内耳畸形，不完全分隔II型为次常见的内耳畸形。6.GJB2基因与内耳畸形GJB2基因基因突变并非内耳畸形的重要因素7.SLC16A4基因突变与内耳畸形SLC26A4基因突变是前庭导水管相关畸形和不完全分隔II型最主要的分子学病因。8..非前庭导水管相关性畸形与SLC16A4基因突变无明显相关性。38 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析参考文献1.SennarogluL.CochlearImplantationinInnerEarMalformationsâAReviewArticle[J].CochlearImplantsInternational,2009,11(1):4.2.FraserGR.Associationofcongenitaldeafnesswithgoiter(Pendred’ssyndrome):astudyof207families.AnnHumGenet.1965;14:201–249.3.ArjmandEM,WebberA.Audiometricfindingsinchildrenwithalargevestibularaqueduct[J].ArchOtolaryngolHeadNeckSurg,2004,130(10):1169-1174.4.LazărC,PoppR,TrifaA,etal.Prevalenceofthec.35delGandp.WFluctuatingsensorineuralhearinglossassociatedXmutationsintheGJB2geneinpatientswithnonsyndromichearinglossfromNorth-WestRomania.[J].InternationalJournalofPediatricOtorhinolaryngology,2010,74(4):351-355.5.KumarNM,GilulaNB.TheGapJunctionCommunicationChannel[J].Cell,1996,84(3):381.6.GuoYF,GuoYF,LiuXW,etal.,andmitochondrialDNAA1555GmutationsinprelingualdeafnessinNorthernChinesesubjects[J].Actaoto-laryngologica,2009,128(3):297-303.7.GuilfordP,ArabSB,BlanchardS,etal.Anon–syndromicformofneurosensory,recessivedeafnessmapstothepericentromericregionofchromosome13q[J].NatureGenetics,1994,6(1):24-288.NakagawaS,MaedaS,TsukiharaT.Structuralandfunctionalstudiesofgapjunctionchannels[J].CurrentOpinioninStructuralBiology,2010,20(4):423.9.MonishaM,PhadkeS,BalrajM.Connexin26andautosomalrecessivenon-syndromichearingloss[J].IndianJournalofHumanGenetics,2003,9(2).10.TakadaY,BeyerLA,SwiderskiDL,etal.Connexin26nullmiceexhibitspiralgangliondegenerationthatcanbeblockedbyBDNFgenetherapy[J].HearRes,2014,309(3):124-135.11.KikuchiT,KimuraRS,PaulDL,etal.Gapjunctionsintheratcochlea:immunohistochemicalandultrastructuralanalysis[J].Anatomy&Embryology,1995,191(2):101-118.12.LefebvrePP,VandewaterTR.Connexins,hearinganddeafness:clinicalaspectsofmutationsintheconnexin26gene[J].BrainResBrainResRev,2000,32(1):159-162.13.KikuchiT,KimuraRS,PaulDL,etal.Gapjunctionsystemsinthemammaliancochlea.[J].BrainResearchBrainResearchReviews,2000,32(1):163.14.SnoeckxR,CampGV.Nonsyndromichearingloss[M]//Genes,Hearing,andDeafness.2007:1876-1876.15.WangemannP.K+CyclingandItsRegulationintheCochleaandtheVestibularLabyrinth[J].Audiology&neuro-otology,2002,7(4):199.16.CohensalmonM,OttT,MichelV,etal.TargetedAblationofConnexin26intheInnerEarEpithelialGapJunctionNetworkCausesHearingImpairmentandCellDeath[J].CurrentBiologyCb,2002,12(13):1106-11.17.RobinsonDO.Mutationsinthegeneencodinggapjunctionproteinbeta-3associatedwithautosomaldominanthearingimpairment[J].NatureGenetics,1998,20(4):370.18.LiuXZ,XiaXJ,XuLR,etal.Mutationsinconnexin31underlierecessiveaswellasdominantnon-syndromichearingloss[J].HumanMolecularGenetics,2000,9(1):63.19.LPezbigasN,OlivM,RabionetR,etal.Connexin31(GJB3)isexpressedintheperipheralandauditorynervesandcausesneuropathyandhearingimpairment[J].HumanMolecularGenetics,2001,10(9):947.20.GriffithAJ,ArtsHA,DownsC,etal.FamilialLargeVestibularAqueductSyndrome[J].Laryngoscope,1996,106(8):960-5.21.AbeS,UsamiS,HooverDM,etal.Fluctuatingsensorineuralhearinglossassociatedwithenlargedvestibularaqueductmapsto7q31,theregioncontainingthePendredgene[J].AmericanJournalof39 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兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析SLC_SNP01281C>TSLC_SNP02589G>ASLC_SNP03919-2A-G(ivs7-2)SLC_SNP041174A>TSLC_SNP051226G>ASLC_SNP061229C>TSLC_SNP081975G>CSLC_SNP092027T>ASLC_SNP102168A>GIVS15+5G>A(1707+5SLC_SNP100G>A)SLC_SNP1041829C>ASLC_SNP1051927G>TSLC_SNP1061949T>ASLC_SNP1071985G>ASLC_SNP1081991C>TSLC_SNP1102014G>ASLC_SNP1122054G>TSLC_SNP1142086C>TSLC_SNP1162162C>TSLSLC_SNP1172167C>GC26SLC_SNP14109G>TA4SLC_SNP15147C>GSLC_SNP16170C>ASLC_SNP19227C>TSLC_SNP20230A>TSLC_SNP21235C>TSLC_SNP22249G>ASLC_SNP24269C>TSLC_SNP25279T>ASLC_SNP31387delCSLC_SNP32398C>TSLC_SNP33404A>GSLC_SNP34414delTSLC_SNP36421T>CSLC_SNP38439A>GSLC_SNP42563T>CSLC_SNP44665G>TSLC_SNP45668T>CSLC_SNP47754T>CSLC_SNP48766-2A>GSLC_SNP50907G>CSLC_SNP51916_917insG44 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析SLC_SNP52946G>TSLC_SNP531001+1G>ASLC_SNP541022delCSLC_SNP571079C>TSLC_SNP581105A>GSLC_SNP601160C>TSLC_SNP621173C>ASLC_SNP651225C>TSLC_SNP661238A>GSLC_SNP671240-1243GAGA>AAAGSLC_SNP681262A>CSLC_SNP701264G>ASLC_SNP721318A>TSLC_SNP731327G>CSLC_SNP741334T>GSLC_SNP751336C>TSLC_SNP761340delAM1:1343C>ASLC_SNP77_78M2:1343C>TSLC_SNP791371C>ASLC_SNP801489G>ASLC_SNP811517T>GSLC_SNP821520delTSLC_SNP831522A>GSLC_SNP841540C>TSLC_SNP861547_1548InsCSLC_SNP871586T>GSLC_SNP881594A>CSLC_SNP891595G>TSLC_SNP901614+9C>TSLC_SNP921615A>GSLC_SNP951673A>TSLC_SNP961686_1687insASLC_SNP981699A>TSLC_SNP991707+1G>A45 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析在学期间的研究成果一、发表论文1.王建朝，刘晓雯，郭玉芬。鳃耳肾谱系障碍研究进展[J]。国际耳鼻咽喉头颈外科杂志，2017.41(6)2.ChenX,NieZ,WangF,WangJetal.LateonsetnonsyndromichearinglossinaDongxiangChinesefamilyisassociatedwiththe593T>CvariantinthemitochondrialtRNAPhegene[J].Mitochondrion,2017,35:111-118.攻读硕士期间参与的科研课题项目国家自然基金面上项目项目编号：051000009项目类别：面上项目项目负责人：郭玉芬项目名称：中国西北地区3000例耳蜗患者大规模平行测序起至年月：2016.01----2019.1246 兰州大学硕士研究生学位论文人工耳蜗植入患者分子病因学分析和畸形分布的相关性的分析致谢时光如白驹过隙，稍纵即逝。尚未走出半生，却已不是少年。三年时间很长，长的要走一千多个日夜。三年时间很短，短的就在一言一行间。人生是一场死亡率百分之百的旅行，留下的除了岁月，还有心底的感恩。三年研究生生活将逝，在此向三年来助我成长的老师，朋友，同门，家人致以最衷心的感谢。愿您万事遂心，健康常驻！首先，我要感谢我的老师郭玉芬教授。师者，所以传道授业解惑也。恩师郭玉芬，与此无异也。为才先为人，为医德为先，此为传吾道矣。念不敢忘，时时谨记，施于余生之行也。为医者，必当通晓疾病之医理，预知疾病之发展，慰藉患之忧心也，此为受吾业矣。虽吾资质材昏与庸也，旦旦而学之，久而不怠焉，故业有所积也。与患而语，循循而不燥，慰其心也。每有惑，不急于解，授之以渔也，诣在不愤不启，不悱不发也。而后谆谆而教，举一隅而反三，没齿亦难忘矣。此为吾师，亦为吾辈之楷模矣。感谢袁慧军老师、程静老师、卢宇老师，是您们带领我走进遗传性听力损失的大门，学会如何看测序结果，运用外文数据库等，受用终身。愿您们工作顺利，万事如意。衷心感谢管敏鑫教授、金筱芬老师、孟飞龙老师、俞佳玲老师、聂志鹏博士、张增明博士、陈丹妮博士、崔丽梅博士、范文露博士、王呈辉硕士，感谢您们带我走进基础实验的世界，让我从零基础到自己能独立做研究。感谢您们在杭州的陪伴，那么多个风雨交加的夜晚，不是一个人从实验室到宿舍楼。衷心感谢徐百成主任手把手教我耳鼻喉科学各种操作和手术；感谢刘晓雯主任悉心教导我耳鼻喉科学理论知识，带我走进科研的大门；感谢朱一鸣师兄，永远是我的“资料库”。感谢王艳莉师姐带我值的每一个夜班，让我独自值夜班时不再害怕。感谢陈迟师兄在我每次需要帮助时都伸出援助之手。感谢段世宏主任、丁文娟师姐、南书玲师姐、边盼盼师姐、陈兴健师兄、李勇师兄、王芳师姐、刘贝贝师妹、李淑娟师妹在临床实习，课题研究以及日常生活中的帮助和支持，我常说我们的队伍向太阳，感谢大家让我感受到了团队的力量和温暖。衷心感谢兰州大学第二医院耳鼻咽喉头颈外科全体医务人员。感谢袁逸铭主任、刘增平主任在临床实习期间的指导和帮助。感谢王长兰护士长、刘风、张小娟等在采集样本中付出的艰辛劳动。衷心感谢兰大二院耳鼻喉科听力中心的程世红老师、段磊老师、李静老师、蒲玉红老师等在听力学知识上的指导。衷心感谢我的母亲，是您的坚韧给了我前进的动力，是您的爱护给了我善良的初心。感谢我的爱人吴太林，是你让我在气馁时重拾自信，迷茫中找回方向，亦师亦友，蒲草磐石。衷心感谢我的朋友金筱芬是你让我知道每时每刻该做什么事，向上之心不止。感谢我的闺蜜全福花让我做回自己，有个畅所欲言的港湾。衷心感谢兰州大学第二医院的医务工作人员及患者和患者家属，感谢你们的帮助、理解和支持！王建朝谨致47