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电化学发光糖生物传感器的构建及分析应用（申请清华大学理学硕士学位论文）培养单位：化学系学科化学研究生：何遥指导教师：刘洋副教授二○一六年四月 FabricationofECLCarbohydrateBiosensorandItsApplicationsThesisSubmittedtoTsinghuaUniversityinpartialfulfillmentoftherequirementforthedegreeofMasterofScienceinChemistrybyHeYaoThesisSupervisor:ProfessorLiuYangApril,2016 摘要细胞表面的糖蛋白和糖脂在生命过程中发挥着重要的作用，如细胞通讯、分化、响应、免疫识别等。聚糖在细胞表面的表达情况与细胞的状态密切相关，能够反映细胞病理生理学状态。因此，聚糖能作为细胞表面标记物用以识别和检测不同类型的细胞，如用于区分癌细胞和正常细胞。电化学发光技术因其高灵敏度及在空间、时间上的可控性在免疫检测、DNA分析和疾病诊断方面有着广泛的应用。随着纳米技术的发展，纳米粒子因其物理、化学的独特性质被引入电化学发光生物传感器中，其作为电极修饰材料或电化学发光信号分子都极大提升了电化学发光传感器的性能。基于此构建的电化学发光生物传感器，特别是基于糖和凝集素的亲和作用建立起来的电化学发光糖生物传感器，被用作细胞原位检测及细胞表面糖基化分析。本论文主要包括以下几个方面：1.利用插层法制备了单层或多层的二硫化钼纳米片，将其电化学还原后得到rMoS2。以rMoS2为电极修饰材料，构建了一个基于伴刀豆凝集素ConA和细胞表面甘露糖特异相互作用的电化学发光传感器用以检测人乳腺癌细胞MCF-7。基于纳米粒子的优异性能制备得到的纳米信标ConA@C3N4QDs@Fe3O4展现出了良好的ECL发光性能，该传感器能快速灵敏的对EpCAM+细胞（MCF-7）进行检测，37-1检测线性范围为1.0×10至1.0×10cellsmL，检测限达到35个细胞。2.构建了一种可再生，双电位响应的电化学发光生物传感器用以同时进行细胞检测及其表面的N聚糖分析。该工作在一个传感器中同时构建了基2+于正电位Ru(phen)3信标的竞争机制检测路径及基于负电位ConA@Au-C3N4信标的三明治结构检测路径，实现了细胞的双信号检测。负电位和正电位的ECL信号比（ΔECLn/ΔECLp）只与细胞表面N-聚糖程度有关，使得细胞表面的N-聚糖分析能够在无额外细胞计数下实时进行。该传感器被成功用作人乳腺癌细胞MCF-7的检测及评估衣霉素抑制剂和PNGaseF酶切处理后细胞表面的N-聚糖变化。与此同时，该传感器在经过互补DNA处理后，能实现简单的循环利用，这为该传感器在微流控领域的应用及与其他仪器的联用打下了基础。关键词：糖；生物传感器；电致化学发光；纳米材料；I AbstractCellsurfaceglycoproteinsandglycolipidsplaycrucialrolesincellcommunicationanddifferentiation,signaling,immunologicalrecognition,andmetastasisamongotherprocesses.Theglycanexpressiononcellsurfaceisadynamicprocessassociatedwiththecellularconditionandstatusandreflectsthepathophysiologicalstepsofthemorbidstate.Glycanepitopesaregenerallythesurfacemarkerstodetectandrecognizespecifictypesofcells,suchastumorcellsandnormalcells.Electrogeneratedchemiluminescence(ECL)techniquewhichnotonlypresentshighsensitivityandwidedynamicconcentrationresponserangebutalsoispotential-andspatial-controlledhasbeenwidelyappliedinimmunoassays,DNAanalysisandclinicaldiagnosis.Withthedevelopmentofnanotechnology,muchattentionhasbeencenteredonnanomaterialsowingtotheiruniquephysicalandchemicalproperties.NanomaterialshasbeenusedinECLbiosensorswhichactsasanelectrodematerialorECLsignalmoleculestoimprovetheperformanceofECLbiosensor.RapiddevelopmenthasbeenmadeinECLbiosensorsindynamicprocessanalysisofcellsurface,speciallytheglyco-ECLbiosensorbasedontheinteractionbetweenglycanandlectin.Thisarticlemainlycontainstwopartsasfollows:1.ExfoliationofMoS2werepreparedbyintercalationmethod.rMoS2wasmadebyelectrochemicalreductionaselectrodemodifiesmaterial.Anelectrogeneratedchemiluminescence(ECL)biosensorwasfabricatedforcelldection.AsexcellentECLpropertiesofC3N4QDsatnegativepotential,theas-proposedbiosensorsexhibitsexcellentanalyticalperformancetowardsthecytosensingofMCF-7cellswithalinear27-1rangefrom1.0×10to1.0×10cellsmLandadetectionlimitof35cells.2.Anovelreusableanddual-potentialresponsiveelectrogeneratedchemiluminescence(ECL)biosensorwasfabricatedforsynchronousdetectionofcancercellsandtheirsurfaceN-glycan.Inthisstrategy,twoanalysismethodincluding2+competitiveassaybasedpositiveECLprobeRu(phen)3andsandwich-typeassaybasedonnegativeECLprobeConA@Au-C3N4wereconstructed.ThecytosensingandcellsurfaceN-glycanevaluationcouldbesimultaneouslyrealizedwithhighsensitivityandexcellentselectivity.BasedontheratioofECLintensitybetweenthenegativeII potentialandpositivepotential(ΔECLn/ΔECLp),dynamicanalysisoftheN-glycanoncellsurfacecouldberealizedavoidingthetraditionalroutingcellcountingprocedures.Asaproof-ofconcept,theECLcytosensorshowedexcellentperformancesfortheanalysisoftheMCF-7cancercellanditssurfaceN-glycanevaluationinhumanserumsample.Moreover,theaptamermodifiedelectrodecanberegeneratedinthepresenceofcaptureDNAsolutionsforcyclicutilization.ThereusableanddualpotentialresponseECLbiosensorendowsafeasibilitytoolformicrofluidiqueandcombinedanalyticalinstrument.Keywords:Carbohydrate;Biosensor;Nanomaterial;ElectrogeneratedChemiluminescenceIII 目录第1章引言..................................................................................................................11.1糖的结构及生物学意义......................................................................................11.1.1糖的结构.......................................................................................................11.1.2糖的生物学意义...........................................................................................21.2糖生物传感器的研究进展..................................................................................41.2.1糖生物传感器的主要类型...........................................................................41.2.2糖生物传感器面临的挑战...........................................................................51.3电致化学发光......................................................................................................71.3.1电致化学发光的主要特点...........................................................................71.3.2纳米材料在电化学发光生物传感器中的应用...........................................81.4研究内容与路线..................................................................................................9第2章基于还原性二硫化钼功能界面的ECL传感器用于癌细胞的检测...........102.1本章引言............................................................................................................102.2实验部分.............................................................................................................112.2.1实验试剂......................................................................................................112.2.2实验仪器......................................................................................................112.2.3细胞的培养和处理......................................................................................112.2.4层状二硫化钼的制备.................................................................................122.2.5ECL纳米信标ConA@C3N4QDs@Fe3O4的制备..................................122.2.6传感器制备与细胞捕获.............................................................................122.2.7细胞检测分析.............................................................................................132.3结果与讨论........................................................................................................132.3.1实验原理.....................................................................................................132.3.2层状二硫化钼的合成与表征.....................................................................142.3.3信号探针的电化学发光性质表征.............................................................162.3.4二硫化钼修饰电极的电化学表征.............................................................162.3.5传感器构建过程的电化学表征.................................................................182.3.6传感器的ECL信号响应............................................................................192.3.7传感器的优化.............................................................................................20IV 2.3.8癌细胞的检测分析.....................................................................................222.4本章小结............................................................................................................23第3章可再生、双电位响应的电化学发光传感器用于细胞检测及其表面N-聚糖分析................................................................................................................................243.1本章引言............................................................................................................243.2实验部分............................................................................................................253.2.1实验试剂.....................................................................................................253.2.2实验仪器.....................................................................................................253.2.3细胞的培养和处理.....................................................................................263.2.4层状二硫化钼的制备.................................................................................263.2.5ECL纳米信标ConA@Au-C3N4的制备.................................................263.2.6传感器制备与细胞捕获.............................................................................273.2.7细胞表面N-聚糖的分析............................................................................273.2.8电极的循环利用.........................................................................................283.3结果与讨论........................................................................................................283.3.1实验原理.....................................................................................................283.3.2纳米信标的表征.........................................................................................293.3.3传感器构建过程的电化学表征.................................................................313.3.4正负电位ECL信号的评估........................................................................323.3.5传感器的优化.............................................................................................343.3.6双信号癌细胞检测分析.............................................................................353.3.7癌细胞的检测选择性.................................................................................373.3.8细胞表面N糖基化分析............................................................................393.3.9传感器的循环利用.....................................................................................403.4本章小结............................................................................................................42结论................................................................................................................................43参考文献........................................................................................................................44致谢................................................................................................................................47声明................................................................................................................................48个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果....................................................49V 第1章引言1.1糖的结构及生物学意义早在几百年前，糖生物学就已经形成。起初，人们只关注于简单的糖类（例如葡萄糖、果糖、蔗糖）以及自然界中存在的聚糖如琼脂等，将它们用作营养品或用来制作人造丝、硝化纤维等。尽管人类很早就认识到了简单糖类和复杂聚糖的重要性，但是对比免疫、基因、分子生物学领域在近现代的飞速发展，糖生物学的发展则相对滞后。直到20世纪初，研究者们困惑于糖复合物几乎参与了从受精到生长的所有生物学过程，并且与大量疾病如癌症、阿兹海默症、艾滋病等密[1]切相关。对此的研究开辟了现代糖生物学。糖生物学旨在研究糖链的结构，化学反应，合成以及生物学功能。现代糖生物学更是延伸到了糖生物学和糖化学的几乎所有领域，包括与糖分子相关的药物学、种植学、材料学等。1.1.1糖的结构糖类是组成细胞的四种基本物质之一，它可能是最丰富、变化最多的生物大分子。在生命体系中，糖类与蛋白和脂质相连构成复合物，其结构功能变化极大[2]地影响着生理过程。在哺乳动物中，十种单糖被用作糖基化酶的反应原料。生物合成途径控制糖链的合成，在此过程中，两种单糖在酶的作用下形成糖苷键连接在一起，合成出简单的糖链。随后，在高尔基体中，糖链继续增加为低聚物和支链。合成完备的糖链少部分被转移到分泌系统，大部分通过糖基化转移酶的作用连接到细胞表面[3]或者细胞内的蛋白和脂质上。[4]蛋白的糖基化通常分为N-糖基化、O-糖基化和葡糖氨基葡聚糖。N-糖链通常将糖链连接到蛋白Asn-X-Ser/Thr这个特殊序列上的天冬酰胺残基上。O-糖基化是将糖链连接到蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基上。葡糖氨基葡聚糖与O-糖基化类似，同样连接在丝氨酸和苏氨酸上，但其为直链结构，产生于不一样的生物合成路径，并且通常是高度硫酸化的。聚糖除了与动物细胞蛋白连接形成糖蛋白外，也与脂质的头部基团连接，形成糖脂。除了这几种常见的糖基化过程之外，透明质酸是一种特殊的糖链类型，它不与蛋白质或者脂质相连，而是直接分泌到细胞外隔室。1 [3]图1.1细胞膜表面的糖基化。1.1.2糖的生物学意义在人体中，组成糖链的单元就有10种主要的寡糖，它们相互组合能形成成千上万种不同类型的糖链，它们被连接到细胞的蛋白和脂质上形成糖蛋白和糖脂。[5]所有的细胞，包括细菌，在其表面都覆盖着致密的糖被。聚糖的生物学功能包括自身结构功能、对细胞表面分子的调节作用以及与其[2]他分子的特异性识别介导生理反应的功能。例如，凝集素能够引起细胞-细胞粘[1]附以及原始真核多细胞生物的聚集（海绵动物）。哺乳动物凝集素参与细胞之间粘附最好的例子是选择素和其特异识别的糖链。该细胞粘附系统能够高度调节大部分内皮细胞和白血球的细胞表面状态，这个过程有助于白血球贩运响应，与免疫系统体内的平衡、造血作用和炎症密切相关。在分子层面，蛋白上的糖链影响着蛋白质的折叠、结构和功能，调节着蛋白的溶解度和信号响应。在细胞层面上，糖链与众多细胞生理过程密切相关，如细菌和病毒入侵、细胞的分化和生长、免疫响应、神经通讯等。因此糖链的异常表[6]达成为现今最重要的的研究课题之一。[7]阿兹海默症最显著的病理学表现为神经纤维元缠结和淀粉体斑点。神经纤维元由磷酸化的tau蛋白组成，淀粉体斑点由淀粉体前驱蛋白APP产生的淀粉体β-肽组成。研究发现APP、tau蛋白及其他蛋白上糖基化的缺陷在阿兹海默症中起到了重要的作用。APP有两个N-糖基化位点以及少数O-糖基化位点，研究表明在2 CHO细胞中，N糖基化位点Asn467和Asn496的缺失导致了APP分泌能力降低以及APP微粒体的减少，该结果表明了糖链的异常直接影响了细胞内蛋白的分拣。O糖基化位点的畸变对APP的影响机制尚不清楚，但也观测到了经过O糖基化后的APP才能被α分泌酶，β分泌酶及γ分泌酶进行加工，O糖基化的APP更倾向于被分泌出细胞外等现象。Tau蛋白是一个细胞溶质蛋白，通常N-糖基化修饰只发生在细胞外蛋白或者膜蛋白的细胞外侧，但研究表明阿兹海默症细胞的tau蛋白具有正常细胞没有的N糖修饰。这种极度异常的N-糖基化畸变使得tau蛋白更容易被磷酸化，不容易受到脱磷酸作用的影响，产生了更多的高度磷酸化的tau蛋白。[8]异常的糖基化表达在很多类型的临床癌症体系中被发现。许多糖基抗原表位被视作癌症相关的糖类抗原。许多证据表明癌症相关的糖基抗原表位在一系列癌症生理病理活动中起到了关键的作用，例如细胞转移与癌症入侵。在癌症中最常[9]见的N-糖链畸变来源于beta1,6-GlcNAc支链，产物为GnT-V。GnT-V表型的大量异常表达（上调）与很多过程密切相关，如细胞-细胞、细胞-基质的相互作用、入侵能力以及细胞的运动能力。例如在胃癌细胞中发现，GnT-V大量表达导致蛋白裂解酶的含量增高。修饰有beta1,6-GlcNAc支链的蛋白裂解酶无法自动或者被其他蛋白酶（如胰蛋白酶）降解，导致蛋白裂解酶一直处于活性状态，这个发现证实了异常的糖链表达直接导致了恶性转化。早期的研究发现癌细胞中唾液酸转移酶的含量上调，这会引起带唾液酸的糖[10]链在癌细胞表面大量表达。异常的糖基化特别是癌细胞中唾液酸的过量表达与癌症转移密切相关。唾液酸的异常表达能够从四个方面促进癌细胞转移：1）唾液酸因为其本身带负电荷能够促进癌细胞组织分离，2）能提高整合素与细胞外基质的相互作用从而促进细胞迁移和组织入侵，3）能够防止免疫识别和入侵，4）能够与内皮细胞产生强的相互作用从而使癌细胞从血液中转移到其他组织。半乳糖素-1能够增强人类免疫缺陷病毒类型1（HIV-1）与自然细胞如CD4+T[11]细胞和巨噬细胞的相互作用。HIV-1导致免疫系统防御的逐渐下降，成为免疫系统综合征即艾滋病的成因。比较其他性传播疾病病毒，传播HIV-1需要病毒的装载能力更强。半乳糖素-1在肠和生殖器粘膜上的大量存在可能增强了HIV-1的入侵能力。3 [5][7]图1.2（A）细胞膜表面覆盖的糖被；（B）异常糖基化对APP蛋白及Tau蛋白的影响。1.2糖生物传感器的研究进展基于糖生物学的重要意义，目前有许多检测手段用来对细胞表面及内部的糖[12][13][14]链进行研究。常见的检测方法有高效液相色谱、质谱、核磁共振、毛细管[15]电泳等。这些手段广泛应用于细胞不同类型糖链的分离和精确识别。但是，这些方法需要昂贵的仪器、复杂的前处理，并且都要对检测物质进行破坏性的处理，这导致其不适用于活细胞上的糖链检测。基于此，糖生物传感器应运而生。糖生物传感是一种基于生物识别分子如凝集素、硼酸、适配体等与糖类的特异相互作用，并将此识别过程通过换能器转换成光学、电学信号的技术。在所有的生物识别分子中，凝集素的应用最为广泛。凝集素是一类非免疫源的糖类识别[16]物质，它能够可逆地结合特定的单糖或糖复合物。基于此发展的凝集素阵列、电化学生物传感器等成为了糖生物传感器的主要模式。1.2.1糖生物传感器的主要类型凝集素微阵列在糖生物传感器中，微阵列技术的运用为单糖及糖复合物的快速检测提供了有利的手段。在过去二十年，微阵列平台首先被用作核酸和蛋白相互作用的研究。[17]糖阵列技术在2002年由不同的研究小组同时报道，它作为一项新兴技术主要用于糖类与蛋白、抗体、细胞以及病毒相互作用的高通量检测。糖阵列技术是将糖链连接到表面，模拟细胞表面多位点糖的表达，对目标物进行有效的识别从而达到检测的效果。糖阵列技术能在一个实验中研究数百种受体-配体相互作用。低廉的成本、高通量的模式成为它的最大特点。凝集素微阵列是糖阵列技术中最为常4 [18]见的一种，通过在表面连接20到100种不同的凝集素，能够进行糖蛋白检测，细菌及细胞表面的糖表达分析。糖电化学传感器电化学传感器因其低廉的价格、操作简便、能实现快速、实时的检测等优点[3]被广泛应用在糖生物传感器中。随着纳米技术的发展，多种多样的纳米粒子被引入电化学传感器中，极大的提升了其性能。基于此，研究者们构造了一系列糖电化学传感器用于研究糖和蛋白的相互作用及癌细胞的检测。[19]Liu等报道了一种电化学传感器用于分析细胞表面唾液酸的变化。他利用接骨木凝集素识别唾液酸表达的癌细胞，该传感器以辣根过氧化酶修饰的金纳米粒子作为信号放大分子。该方法能够快速灵敏的检测MCF-7细胞，检测限达到25[16]cells/mL。Zhang等合成三联甘露糖单元并将其固定在电极表面，该模拟的糖基化细胞表面能够与癌细胞竞争结合凝集素。该竞争模式的传感器采用辣根过氧化酶为信号分子，通过多壁碳纳米管及金纳米粒子的放大效应，对细胞表面的糖基化进行快速灵敏的分析。图1.3电化学生物传感器检测细胞表面唾液酸示意图。1.2.2糖生物传感器面临的挑战糖分析方法在近些年来发展迅速，但如何构建新的方法以发展综合性糖链分析乃至构建糖链生物学数据库，仍面临巨大的挑战。糖生物传感器作为众多技术的一种，拥有活细胞原位检测的巨大优势，它的改善与发展对糖分析方法的研究至关重要。第一，糖生物传感器灵敏度的提高（多价结合效应和信号放大）：糖生物传感器包含生物识别原件和换能器，其中生物识别原件尤为重要，它5 决定了传感器对目标物的结合能力，直接影响着传感器的灵敏度。凝集素是应用最为广泛的识别糖类的生物分子。但凝集素与单糖的结合能力较弱，这极大影响了传感器的效率。为了解决这个问题，多价效应被用来增强凝集素和糖类的结合[20][21]能力。例如伴刀豆凝集素ConA，一种能特异和甘露糖结合的凝集素，它在中性PH条件下含有4个甘露糖结合位点，分别位于其结构四面体的四个方位上，相互之间的距离为72Å。如果糖衍生的结合分子能够同时结合多个凝集素位点，那么结合能力就将大大提高。基于这种构想，聚合物，纳米粒子，囊泡等被用作载体来增强生物识别分子和糖类的结合能力。如Li实验组合成了一种甘露糖修饰的金纳米粒子，研究发现，一个直径为20nm的金纳米粒子其表面能够连接680个甘露糖单元，由此制备的甘露糖复合物对伴刀豆凝集素的结合能力是单个甘露糖的100倍。虽然多价效应已大量运用在糖生物传感器的构建中，但如何优化糖链的长度、密度去模拟出更接近生物模型的糖修饰复合物，仍面临巨大的挑战。第二，糖生物传感器在复杂体系中的应用：大部分的生物传感器通常都是单信号响应的，指的是一个电学或光学信号对应检测一个目标物。这种类型的生物传感器容易受到周围环境的影响，当体系中存在其他干扰物时无法排除错误的信号。这使得生物传感器包括糖生物传感器在复杂体系中的应用受到很大限制，如复杂的生物体系，细胞和血液等。近些年来，借鉴光学比率型检测器的原理，比率型糖生物传感器或双信号生[22]物传感器大量涌现。例如Zhang等利用CdS量子点的ECL淬灭效应和鲁米诺的ECL增强效应，将其结合在一个体系中制备得到双电势ECL比率计，用作mp53的检测。Ding等利用磁珠作为分离元件，适配体作为生物识别元件，在一个体系中对Ramos细胞进行了电化学和电化学发光的双重检测。然而，糖生物传感器在这方面的研究报道仍然非常少，这也成为糖生物传感器的另一大研究重点。第三，糖生物传感器与其他技术的联用（智能表面的发展带来的契机）：如前文提到的，糖类的分析十分复杂，虽然色谱、质谱、核磁共振、电化学、光学等方法都被用于糖类的分析研究，但每一类分析仪器都只能在一定的范围内起作用。如色谱、质谱、核磁共振偏重于糖类的精细结构研究，而光学、电化学偏重于原位检测。所以想要综合分析生物体中的糖链信息，建立一个快捷的完整的分析手段，分析联用技术必不可少。分析技术发展到现在，分析联用技术已经成为了大势所趋的研究方向，各种联用技术，如色谱-质谱连用，等离子体发射光谱等不仅早已商业化，更在生物检测、有机合成分离、水质食品检测中发挥了重要的作用。研究糖类的分析联用技术特别是糖生物传感器与其他技术的联用发展缓慢，6 受制于糖生物传感器通常不可循环利用，连接到表面的检测物质无法释放进入下一级的分析仪器中。近些年来，智能表面的发展为这一领域的研究提供的潜在方[23]向。Hou等基于聚合物接枝的硅纳米线建立的智能表面可用做循环肿瘤细胞的捕获和释放。热响应的聚合材料聚N-异丙基丙烯酰胺（poly（N-isopropylacrylamide））在不同的温度4°C和37°C下分别处于蜷缩状态和伸展状态，这导致连接于其上[24]的识别分子隐藏或暴露于表面，实现细胞的释放和捕获。Thakar等设计一种电化学响应的智能表面，利用环肽（-RGDfK-）作为识别元件，β-CD/Fc作为氧化还原响应系统，该表面能够实现肿瘤细胞的有效捕获和释放。[24]图1.4电化学响应的智能表面示意图。1.3电致化学发光电化学发光（electrogeneratedchemiluminescence或electrochemiluminescence，[25]ECL）是一种将电信号转换为光信号的技术。它包含了两部分：第一，稳定的前驱物在电极表面产生活性中间体；第二，活性中间体在不同的条件下反应产生激发态从而发光。Hercules和Bard在1960年中期首次报道了电化学发光现象。经过近50年的发展，ECL已经成为了一种强有力的分析技术被应用在免疫分析、食物及水资源检测、细胞细菌检测及细胞成像等多个方面。1.3.1电致化学发光的主要特点ECL作为电化学和化学发光的融合技术，兼具了这两种技术的特点。第一，高灵敏度、低检测限。对于光学检测来说，ECL无需光源，背景大大降低。对于7 同样不需光源的化学发光来说，发光过程能严格控制，不会产生由于物质混合和液体流动带来的干扰。同时，由于检测信号为光信号，可以避免对环境更敏感的电化学干扰。第二，时间、空间可控，这使得它可以在同一体系中同时或依次检测多个样品。第三，具有较高的稳定性，发光物质在循环伏安扫描下得以再生，[26]几乎不会产生物质损失带来的信号衰减，因此具有较好的稳定性。[27]除了常见的电化学发光体系如联吡啶钌及其衍生物体系、鲁米诺（luminol）体系外，近些年来，研究者们合成和发现了很多新型的ECL发光物质，如新型有机金属复合物、量子点、碳纳米材料等，它们具有ECL发光效率高、易修饰、稳[28]定性高、生物相容性好等特点，极大丰富了ECL传感器的应用范围。1.3.2纳米材料在电化学发光生物传感器中的应用纳米材料包含纳米粒子和纳米管，它们由金属，半导体，碳材料或聚合物质合成，因其具有独特物理和化学性质被广泛应用于生物传感器中。基于纳米材料的生物传感器展现出了高的稳定性和灵敏度，极大促进了生物传感器的发展。在[29]电化学发光生物传感器中，纳米粒子的应用主要体现在以下三个方面：第一类纳米材料作为电极的修饰材料建立一个生物传感器最重要的步骤是将生物分子固定到传感器上。生物分子能稳定的连接到传感器表面并且最大程度的保持其活性是一个成功的传感器必备的条件。所以构造一个稳定，具有良好生物相容性的界面用以连接生物分子，是提高生物传感器性能的关键因素。近些年来，纳米材料因其具有大的比表面积、[30]良好的导电性、易于修饰等独特的优势被广泛应用在电极修饰材料上。Dong研2+究组报道了碳纳米管修饰电极能够增强Ru(bpy)3/TPA体系的电化学发光，对比硅/nafion修饰电极，该体系的电化学发光强度高出二到三个数量级。第二类纳米材料作为ECL探针载体在ECL生物传感器中，将多重ECL探针固定在金属纳米粒子、碳纳米管、聚苯乙烯微球、硅球等纳米材料上，能够提高ECL传感器的灵敏度。由于纳米粒子拥有大的比表面积，一个纳米粒子能够负载多个ECL探针，该信号放大过程能够[31]2+明显提高传感器的灵敏度。Chen等合成多孔硅球，将ECL探针Ru(bpy)3包裹于硅球中，制备出性能优异的纳米探针用以监测细胞表面聚糖表达。第三类纳米材料作为ECL发光物质由于ECL信号分子的发光效率、稳定性等极大影响着ECL传感器的稳定性和检测灵敏度，不满足于传统的ECL体系，研究者开始寻找新的ECL信号分子。自从2002年首次报道硅纳米粒子的电化学发光之后，众多的纳米材料作为ECL信号8 物质被应用于生物分析中。其中，量子点作为ECL信号物质被研究得最为广泛。比起传统的ECL信号物质，量子点具有良好的稳定性，能够克服光漂白，通过尺[32]寸和表面缺陷的控制，能发出不同波长的ECL信号。Ding等报道了一种新型核壳结构量子点—CdSe@ZnSeQDs，通过调节ZnSe的厚度能够改善其ECL发光性能，该量子点被用作多巴胺的检测，检测限能够达到3.6nM。除此之外，近些年来碳点、金属纳米簇、金属氧化物半导体甚至有机纳米聚合物都被发现具有良好的ECL发光性质，这些物质的应用使得ECL传感器得到巨大的发展。1.4研究内容与路线真核生物体中超过50%的蛋白，超过80%的膜蛋白会发生糖基化作用。各种类型的糖链影响着细胞内的微环境及细胞的生理状态。糖介导的相互作用在生理过程中扮演着重要的角色。因此对生物体中糖链的研究能为研究者开辟认识生命、认识细胞的大门。基于此重要意义，糖生物传感器发展迅猛，它旨在快速、灵敏的原位检测生物体内的糖链变化。本论文以电致化学发光技术为基础，利用糖和凝集素，细胞与适配体的相互作用，创新合成了多种电化学发光纳米信标分子及电极修饰材料，构建了灵敏、多通路的ECL糖生物传感器，适用于癌症诊断及细胞表面N-聚糖分析。1.利用插层法合成了层状二硫化钼纳米材料，该方法能快速、大量地制备层状二硫化钼，显现出了巨大的应用价值。通过对二硫化钼修饰电极的电化学还原制备得到电化学性质优异的修饰电极。通过适配体与细胞，凝集素与糖类的特异相互作用，构建三明治夹心结构的ECL糖电化学传感器。该传感器实现了对人乳腺癌细胞MCF-7的快速灵敏检测。众多优点使其在癌细胞诊断，药物筛选等方面有巨大的前景。2.构建了一个可循环利用的双信号ECL生物传感器同时用于癌细胞的多重检测及其表面N-聚糖的分析。在这个工作中，受到比率型ECL传感器的启发，我们在同一个体系中构造了正负电位双响应系统。细胞检测和细胞表面N-聚糖检测能够同时高效、灵敏地进行。基于负电位和正电位的ECL信号比（ΔECLn/ΔECLp），N-聚糖的分析与细胞数量无关，不需要采用误差较大的人工计数方法。该传感器被成功用作人乳腺癌细胞MCF-7的检测及其评估衣霉素抑制剂和PNGaseF酶切处理后表面的N糖基化变化。值得一提的是，该体系能采用简单的方法进行循环利用，使得它在微流控领域有巨大的应用潜力。该传感器对于深入理解与糖相关的自然界生物过程，阐明N-聚糖相关的癌细胞发生机制以及癌症诊断领域都有巨大的应用价值。9 第2章基于还原性二硫化钼功能界面的ECL传感器用于癌细胞的检测2.1本章引言近些年来，二维材料受到了广泛的关注。石墨烯是其中的代表物质，由于其独特的光学、电学性质，如大的比表面积、在电子态中卓越的电子转移能力，它[33]们广泛应用于核酸、糖类、蛋白等生物分子的检测中。MoS2，过渡金属硫化物的一种，作为一种类石墨烯的结构，它由共价连接的S-Mo-S形成MoS2层，通过[34-35]范德华力将层与层组装在一起。纳米级的MoS2可通过微机械剥离、锂离子插[36]入、超声处理、热沉积等不同方法得到。这些方法能制备出性能各异的单层或多层层状二硫化钼。但这些方法仍存在很多局限性，特别是制备复杂、耗时长且产量小等问题限制了其在很多领域的发展。同碳材料一样，层状二硫化钼也因其优异的电学性质被视作修饰电极的可靠[37]材料，其修饰的玻碳电极已被用作葡萄糖和多巴胺等小分子的检测研究。糖表位能作为细胞表面标记物用以识别和检测不同类型的细胞，如区分正常细胞和癌细胞。基于细胞聚糖与凝集素的特异相互作用建立的生物传感器能用于癌细胞的检测。电化学发光结合化学发光及电化学的技术。对比传统的电化学和光学方法，电化学发光不仅展现出了高灵敏度和较宽的动态响应范围，并且它能通过对电压的调节实现对信号空间和时间的调控。由于上述种种优势，基于糖和凝集素的亲和作用建立起来的电化学发光糖生物传感器在动态细胞表面分析方向取得了长足的发展。本章工作利用插层法合成了层状二硫化钼纳米材料，通过对二硫化钼修饰电极的电化学还原制备得到电化学性能优异的修饰电极。将其与适配体连接，采用凝集素修饰的C3N4量子点复合材料作为信号标记物，制备得到了能用于癌细胞检测的ECL糖电化学传感器。实现了对人乳腺癌细胞MCF-7快速灵敏的检测。10 2.2实验部分2.2.1实验试剂伴刀豆蛋白凝集素（ConA），聚丙烯酸（PAA）购于Sigma-Aldrich（美国）；三聚氰胺购于上海试剂（中国）；1,-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购于AlfaAesar；适配体序列购于上海生工（中国），适配体的序列为5′-NH2-C6H12-CACTACAGAGGTTGCGTCCCACGTTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3′。其他试剂购于北京化工。2.2.2实验仪器表2.1主要测试仪器及备注信息中文名称简称规格型号备注发射激光为514nmAr离子激拉曼光谱仪RamanRenishawInVia光（50mW）紫外－可见吸收光谱仪UV-visUv-3900测试溶液为含0.1MKCl的电化学循环伏安CVCHI660b5mMK3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]混合溶液交流电压为10mV，频率范围为电化学阻抗EISPARSTAT227350.01Hz至10HzMPI-B多功能电化电势范围为-1.6V~0V，光电倍电致化学发光ECL学分析系统增管电压为600V透射电子显微镜TEMH-7650B加速电压为100KV所有电化学测试时均采用三电极系统，饱和KCl的Ag/AgCl为参比电极，铂丝为辅助电极。2.2.3细胞的培养和处理MCF-7细胞（清华大学医学院）培养溶液为DMEM（高糖）培养基（鼎国生-1物）（含10%的胎牛血清（浙江四季青），100UmL的青霉素和链霉素），置于5%CO2的培养箱中于37°C孵育。细胞采用离心方式收集，以1000rpm转速离心5分钟，用无菌DPBS洗涤两次。最后将细胞分散于配置好的特定连接缓冲液中（缓-1-1冲液为4.5gL葡萄糖，5mMMgCl2及1mgmLBSA溶解于含CaCl2及MgCl2的DPBS中）。该特定缓冲液能保障细胞与适配体SYL3C的连接亲和力。11 2.2.4层状二硫化钼的制备首先，将商业二硫化钼粉末和三聚氰胺按1:3的比例混合，加入适量N-甲基吡咯烷酮（NMP）研磨1h以上制备得到二硫化钼插层复合物。将此复合物放入三氧化二铝磁舟中，在管式炉内以8°C/分钟程序升温至700°C，同时在此温度下继续处理3h（Ar气保护氛围）。制备得到的层状二硫化钼用透射电子显微镜、拉曼光谱及紫外光谱表征。2.2.5ECL纳米信标ConA@C3N4QDs@Fe3O4的制备[38]按照早前报道的文献合成C3N4量子点。首先，用浓硫酸（20mL）和浓硝酸（20mL）混合溶液在室温下处理固态g-C3N4（1g）2h。该混合物用去离子水稀释到1L并洗涤三次，得到多孔状g-C3N4。随后，将得到的多孔状g-C3N4（100mg）分散于30mL浓NH3·H2O中，并将其转移到45mL水热釜中加热至180°C并保持12h得到多孔状的g-C3N4纳米片。冷却后，得到的沉淀物用水洗涤三次除去多余的NH3分子。最后，多孔状g-C3N4纳米片（10mg）分散于100mL水中，超声处理6h。得到的水溶液在7000rpm下离心，洗涤三次得到g-C3N4量子点（g-C3N4QDs），分散于10mL水中。-1纳米复合材料的合成采用静电吸附法，将100mLFe3O4（2mgmL）纳米颗粒超声分散于水中，缓慢加入1mL浓度为1%的阳离子聚合物PDDA溶液。震荡10分钟后，使用磁铁分离富集Fe3O4，去离子水洗涤三次。将PDDA包裹的Fe3O4材料分散于水中加入10mLg-C3N4量子点，震荡30分钟后同样采用磁铁分离洗涤。-1将40μL的ConA溶液（0.02mgmL）加入前面得到的C3N4QDs@Fe3O4溶-1液（1mgmL）中。混合溶液在室温下轻微搅拌60分钟。随后离心去除多余的2+2+ConA，最后将溶液分散于含1mMCa以及1mMMn的PBS溶液中，储存在4°C冰箱待用。2.2.6传感器制备与细胞捕获玻碳电极（GCE，直径为3mm）在使用前分别用0.3及0.05μmα-Al2O3粉末进行打磨抛光，随后电极依次用去离子水和乙醇进行超声处理。电极用−1氮气吹干后，将5μL的含0.5mgmLMoS2的0.5%PAA溶液滴涂在电极表面，在室温下干燥6h之后，对修饰电极进行电化学还原处理得到rMoS2/PAA修饰电极（rMoS2-PAA/GCE）。随后，将电极于37°C浸润于含有400mMEDC及100mMNHS的混合溶液（40μL）中1h。再将电极于12 同样温度浸泡在40μL的1μM适配体溶液中孵育1h，得到适配体连接的修饰电极（aptamer/rMoS2-PAA/GCE）。洗涤干净的修饰电极在乙醇胺溶液中浸泡15min以封闭电极表面的活性基团。用PBS清洗后，将上述电极与100μL不同浓度的MCF-7细胞悬浮液共孵育，制备得到的细胞吸附电极（cell/aptamer/rMoS2−PAA/GCE）用PBS清洗后可用于接下来的ECL测试。2.2.7细胞检测分析将细胞吸附电极（cell/aptamer/rMoS2−PAA/GCE）与40μL的ECL信标ConA@C3N4QDs@Fe3O4在37°C条件下温育1h。随后用PBS小心浸润清洗，得到三明治夹心结构的ConA@C3N4QDs@Fe3O4/cell/aptamer/rMoS2-PAA/GCE电极。ECL测试采用循环伏安法，-12−扫速为100mVs，电势扫描范围为−1.6V~0V，检测溶液为含20mMS2O8的PBS溶液（pH7.4,100mM）。以上均采用三电极系统，铂丝为辅助电极，饱和KCl的Ag/AgCl为参比电极。2.3结果与讨论2.3.1实验原理图2.1基于还原性二硫化钼的功能界面传感器用于癌细胞的选择性检测示意图。13 图2.1是基于凝集素和适配体的ECL生物传感器用于细胞检测的原理。首先，MoS2/PAA被修饰于电极表面，PAA提供了足够多的位点用以共价连接SYL3C适配体。随后，复合层进行电化学还原，MoS2被还原成电子传输性能更好的rMoS2，大大提高了电极表面的电子传输速率。由于适配体SYL3C与特定细胞系中EpCAM[39]蛋白的相互作用，癌细胞能被电极上的适配体捕获。最后，基于ConA与细胞表面甘露糖的特异相互作用，信标ConA@C3N4QDs@Fe3O4被吸附到电极表面，构建了一个三明治夹心结构ECL生物传感器系统。基于rMoS2的电极修饰表面优异的电子传输性能以及ConA@C3N4QDs@Fe3O4信标高效的ECL发光，该传感器能快速、灵敏地对EpCAM+细胞进行检测，显示出了在癌症诊断方向显示出了巨大的潜力。2.3.2层状二硫化钼的合成与表征图2.2给出了插层法制备二硫化钼纳米片的原理。首先，将商业化的二硫化钼粉末与三聚氰胺以1:3的比例混合，加入适量研磨剂N-甲基吡咯烷酮（NMP）进行研磨。在研磨过程中，NMP能作为稳定化的表面活性剂插入[40]MoS2层间，由于三聚氰胺分子在NMP中良好的溶解性，继而也被带入MoS2层间，制备得到三聚氰胺插层MoS2复合材料。将该三聚氰胺插层MoS2复合材料于管式炉内煅烧处理。三聚氰胺在惰性氛围内于700°C以上完全分解，并释放出多种气态物质，该过程能够实现MoS2层与层的分离，制备得到单层或多层的MoS2片状纳米材料。图2.2片状二硫化钼的插层制备示意图。随后我们用拉曼光谱，紫外光谱等技术对制备的层状二硫化钼进行了表征。如图2.3A所示，在拉曼光谱中，除了MoS2的两个特征拉曼峰外（分-1别属于高能态A1g和低能态E2g），没有其他的峰产生，而其在1000cm左右碳材料的拉曼峰也没有出现，证明在该温度煅烧下三聚氰胺被分解完全，没有产生残留的碳材料。在紫外可见光谱中（图2.3B），稀释的MoS2分散溶液在627nm及672nm处出现两个特征峰，分别由于MoS2价带自旋耦合劈裂出的A1和B1电子跃迁导致的。TEM的结果如图2.3C所示。MoS214 纳米片的尺寸在500nm到1μm之间。图2.3剥离MoS2纳米片的（A）拉曼光谱图，（B）紫外可见光谱图，（C）TEM透射电镜谱图。15 2.3.3信号探针的电化学发光性质表征将C3N4QDs及C3N4QDs@Fe3O4材料滴涂于玻碳电极表面用于研究其电化学发光性质。如图2.4所示，两种材料的最强ECL发光信号都处于-1.6V处，C3N4QDs@Fe3O4的ECL发光强度是C3N4QDs的3倍，这表明Fe3O4大的比表面积对C3N4QDs起到了富集的效果，使得这种复合材料更适用于电化学传感器的构建。图2.4（a）C3N4QDs与（b）C3N4QDs@Fe3O4修饰GCE的ECL强度—电势图。-1扫描速度为100mVs。光电倍增管高压为600V。内插图为C3N4QDs@Fe3O4修饰GCE的ECL时间变化图。修饰电极在含20mMK2S2O8的0.1MPBS（pH7.4）电解质中扫描10圈。2.3.4二硫化钼修饰电极的电化学表征层状二硫化钼修饰电极MoS2-PAA/GCE在氮气饱和的0.5MNaCl水溶液中循环伏安图如图2.5A所示，在0.6V到−0.6V电势扫描范围内，当进行第一圈扫描时发现，在-0.32V处出现了一个明显的还原峰，并且此还原峰在第二圈与第三圈的电势扫描中消失。这个结果表明MoS2在此电势范围内的循环伏安扫描过程中发生了不可逆的电化学还原，将修饰电极上的MoS2转化为还原MoS2即rMoS2。根据早前文献报道，此变化可能是在电化学处理过程中发生了由1TMoS2（fromoctahedral）向2HMoS2（originaltrigonal-prismatic）的相态转变，这个观[37]点被Zhang研究组用X射线光电子谱图（XPS）证实。3−/4−为了进一步评估还原二硫化钼rMoS2的性质，我们对电活性探针[Fe(CN)6]对在二硫化钼修饰的电极和还原二硫化钼修饰电极上的电化学性质进行了研究。16 3−/4−如图2.5B所示，[Fe(CN)6]在GCE裸电极上显示了一对氧化还原峰，其峰电位差ΔEp为75mV。当玻碳电极滴涂上聚合物PAA后，形成PAA修饰电极即PAA/GCE电极，由于PAA是电子的不良导体，该修饰电极的电流明显下降，峰电位差ΔEp增大到约141mV。当层状二硫化钼加入PAA后，形成MoS2-PAA/GCE修饰电极。循环伏安的峰电流得到了部分的提升，峰电位差ΔEp下降到约91mV。当此修饰电极进行如前文所述的电化学还原处理后，得到rMoS2-PAA/GCE,其峰电流明显上升，且峰电位差ΔEp下降到79mV。该峰电流和峰电位差与裸电极相差无几，考虑到此修饰电极加入了电子的不良导体PAA，所以rMoS2在电极上的修饰仍能极大的改善电极的电子传输性能，使其有潜力作为一种新型二维修饰材料应用于检测领域。图2.5（A）MoS2-PAA/GCE电极的循环伏安图，电解质为氮气饱和的0.5MNaCl−1水溶液。扫描速度为50mVs。（B）GCE（a），PAA/GCE（b）,MoS2-PAA/GCE（c）,rMoS2-PAA/GCE（d）的循环伏安图。电解质为含有0.5MKCl的5mM-1K4Fe(CN)6和5mMK3Fe(CN)6混合溶液。扫描速度为100mVs。17 2.3.5传感器构建过程的电化学表征循环伏安法CV和电化学阻抗EIS能监测修饰过程中界面电子传输能力变化，4-/3-因此被视作研究修饰电极组装过程的重要电化学技术。图2.6A为以[Fe(CN)6]为电活性探针，修饰电极组装过程的循环伏安图。修饰电极rMoS2-PAA/GCE的CV曲线显示出了一对准可逆氧化还原峰和较强的峰电流，这是由于rMoS2具有很好的电导率和大的比表面积。当适配体被连接到上述电极上后，电流信号明显降低（曲线b）。当细胞吸附到电极表面后，由于细胞体积大，且整体带负电荷，其4−/3−空间阻碍和电荷排斥，严重影响了Fe(CN)6活性对在电极表面的传输，峰电流明显下降，峰电位差变宽。最后，当信标ConA@C3N4QDs@Fe3O4吸附到电极表面后，由于信标的电子惰性，峰电流再次轻微下降。随后的电化学阻抗图进一步验证了此现象，电子阻抗奈奎斯特图包含高频条件下的半圆部分和低频下的直线部分，半圆的直径与电极界面上的电子传输转移电阻相关，可以用于评估电极的组装过程。如图2.6B所示，随着组装过程的进行包括适配体的连接（曲线b），细胞的吸附（曲线c），纳米信标的吸附（曲线d），半圆直径即电子传输阻抗逐步增大。这个结果与循环伏安结果一致，都证实适配体、细胞和纳米信标在电极上的成功组装。18 图2.6（a）rMoS2-PAA/GCE，（b）aptamer/rMoS2-PAA/GCE，（c）cell/aptamer/rMoS2-PAA/GCE，（d）ConA@C3N4QDs@Fe3O4/cell/aptamer/rMoS2-PAA/GCE的循环伏安图（A）及电化学阻抗谱图（B）。电解质为含有0.5MKCl的5mMK4Fe(CN)6-1和5mMK3Fe(CN)6混合溶液。扫描速度为100mVs。电化学阻抗实验的频率范5围为0.01Hz至10Hz，信号波幅为10mV。2.3.6传感器的电致化学发光响应为了验证该传感器的可行性，我们评估了该生物传感器ECL信号，检测溶液2−为含20mMS2O8的0.1MPBS溶液，电势扫描范围为-1.6V~0V。如图2.7的曲线e所示，由于适配体和细胞的强相互作用，ConA和细胞表面甘露糖特异性相互作用，ConA@C3N4QDs@Fe3O4/cell/aptamer/rMoS2-PAA/GCE修饰电极在−1.6V发出了强ECL信号，证实ConA@C3N4QDs@Fe3O4纳米信标与细胞表面甘露糖的特异相互作用，纳米信标被细胞特异捕获在电极表面。该结果表明我们构建的三明治夹心结构ECL传感器能对癌细胞进行响应。接下来，我们通过一系列ECL实验对其特异性进行了评估。如图2.7，未连接适配体的rMoS2-PAA/GCE电极，由于该电极界面采用乙醇胺对活性位点进行封闭，对带电荷的纳米信标的吸附很小（曲线d），而且癌细胞也没有吸附到电极表面（曲线a）。同时，未吸附细胞的aptamer/rMoS2-PAA/GCE电极即使浸泡于纳米信标中也只有微弱的信号产生。该较弱的ECL信号表明只有少量的纳米信标吸附在aptamer/rMoS2-PAA/GCE电极表面，其原因可能是由于纳米信标整体显现负电荷与适配体的负电荷相互排斥。cell/aptamer/rMoS2-PAA/GCE修饰电极显示出及微弱的ECL信号，这证实ECL信号确实来源于ConA@C3N4QDs@Fe3O4。所有的对比电极都只有微弱的ECL信号产生，这表明该传感器非特异性的吸附非常弱。由此可19 见，制备得到的生物传感器展现出了优秀的特异性和灵敏度为接下来的研究打好了基础。图2.7ConA@C3N4QDs@Fe3O4/cell/rMoS2-PAA/GCE（a），ConA@C3N4QDs@Fe3O4/aptamer/rMoS2-PAA/GCE（b），cell/rMoS2-PAA/GCE（c），ConA@C3N4QDs@Fe3O4/rMoS2-PAA/GCE（d）以及ConA@C3N4QDs@Fe3O4/cell/aptamer/rMoS2-PAA/GCE（e）的ECL强度-电势图。电解液为含20mMK2S2O8的0.1MPBS-1（pH7.4）。扫描速度为100mVs。光电倍增管电压为600V。电势扫描范围为-1.66-1V~0V（vs.Ag/AgCl）。MCF-7细胞浓度为1.0×10cellsmL。2.3.7传感器条件的优化为了得到更高性能的电化学发光生物传感器，我们对该传感器的信标合成条件，温度及信标浓度进行了优化。温度影响着活细胞的性质，如图2.8A所示，当细胞温育温度在20°C至50°C之间时，37°C为最优温度。温度低于37°C会使细胞表面蛋白活性降低，影响适配体与EpCAM蛋白及ConA和细胞表面糖的结合过程。ECL信号强度随着信标-1-1-1的浓度从0.1mgmL到2.5mgmL的逐步升高而升高，并在2mgmL左右达到平台，更高的浓度并没有使ECL信号有大幅度的提升，加之浓度过高容易造成非-1特异性吸附，所以选择2mgmL为最优信标浓度。信标承担着识别细胞和发出ECL信号两个功能。当ConA吸附量过少，信标的识别能力变差，会影响信标在电极表面的浓度。但如果当ConA吸附在C3N4QDs@Fe3O4过多，ConA的电子惰性会使电子界面电子传输能力下降并且影响C3N4的发光，导致灵敏度下降。如图2.8C所示，我们对其合成比例进行了优化，由图可知C3N4QDs@Fe3O4（2mg−1−1mL）与ConA（0.02mgmL在合成过程比例为4:1时，ECL信号最强。20 图2.8ECL传感器的优化，包括（A）细胞温育温度,（B）探针使用浓度,以及（C）合成纳米探针中，ConA与C3N4QDs@Fe3O4的比例。ECL强度取其在-1.6V（vs.Ag/AgCl）处的最大值。光电倍增管电压为600V。电势扫描范围为-1.6V~06-1V（vs.Ag/AgCl）。MCF-7细胞浓度为1.0×10cellsmL。21 2.3.8癌细胞的检测分析基于上述的优化条件，我们对人体乳腺癌细胞MCF-7进行了ECL检测。图2.9展示了不同MCF-7细胞浓度下ECL信号的强度变化。由该图可知，ECL强度37随着细胞浓度的降低逐渐降低，其强度在MCF-7细胞浓度范围在10到10cells−1mL内与细胞浓度对数呈线性关系。该ECL方法对细胞的检测限（3σ）为350cells−1mL。考虑到实验中细胞悬浮液的体积100μL，该ECL方法对MCF-7细胞检测能达到35个MCF-7细胞。该传感器优异的性能在生物分析特别是糖生物分析中拥有巨大的应用潜力。图2.9（A）ECL强度随细胞浓度的变化图。（MCF-7细胞浓度从a到e分别为34567−11.0×10,1.0×10,1.0×10,1.0×10及1.0×10cellsmL）。光电倍增管电压为600V。（B）ECL强度与MCF-7细胞浓度的线性关系图。22 2.4本章小结本章工作利用插层法合成了层状二硫化钼纳米材料，该方法能快速，大量的制备层状二硫化钼。通过对二硫化钼修饰电极的电化学还原制备得到电化学性质优异的修饰电极。将其与适配体连接，采用凝集素修饰的C3N4量子点复合材料作为信号标记物，制备得到了能用于癌细胞诊断的ECL糖电化学传感器。C3N4量子点首次被用作电化学发光信号标记物用以构建电化学发光生物传感器，C3N4量子点本身具备良好的水溶性和较高的ECL发光效率，加上C3N4QDs@Fe3O4中Fe3O4对ECL发光物质的聚集作用，ConA@C3N4QDs@Fe3O4信标展现出了良好的ECL性能。该传感器实现了对人乳腺癌细胞MCF-7的快速灵敏检测，在癌细胞诊断，药物筛选等方面有巨大的前景。23 第3章可再生、双电位响应的电化学发光传感器用于细胞检测及其表面N-聚糖的分析3.1本章引言细胞表面的糖蛋白和糖脂在生命过程中发挥着重要的作用，如细胞通讯、分化、响应、免疫识别等。糖表位通常能作为细胞表面标记物用以识别和检测不同类型的细胞，如区分癌细胞和正常细胞。聚糖在细胞表面的表达情况与细胞的状态密切相关，能够反映细胞病理生理学状态。N糖基化是蛋白糖基化的一种形式，它通常含有Manα1−6(Manα1−3)Manβ1−4GlcNAcβ1−4GlcNAc的核心结构。细胞表面N糖基化影响着细胞之间的相互作用，所以它能够调控很多病理学过程，如癌细胞生长、转移。例如在表皮生长因子表面动态变化的β1.6GlcNAc接枝N糖链与Mgat5的表达密切相关，从而影响着细胞的运动性和癌症转移能力。因此，对细胞表面N-聚糖的检测不仅对认识其在癌症发展中的作用，更对疾病诊断有着重要的意义。迄今为止，众多的检测方法已被用于糖链检测，如高效液相色谱、质谱、核磁共振、毛细管电泳等。这些方法为研究糖链的精确信息提供了强有力的手段，但是它们仍存在很多问题，比如它们所需的仪器昂贵，其破坏性的前处理方式不适用于活细胞表面糖链的检测等。近些年来，糖生物传感器例如凝集素阵列，电化学生物传感器的出现克服了上述缺点，使得使用简单方法检测细胞表面聚糖变化成为可能。基于糖和凝集素的亲和作用建立起来的电化学发光糖生物传感器在细胞表面分析方向取得了长足的发展，包括引入纳米结构建立生物分析界面，采用创新的2+ECL信号分子，如量子点、Ru(bpy)3装载的硅纳米球等。但是ECL糖生物传感器仍然面临很多问题，如细胞捕获效率较低、细胞研究需进行额外的计数、单信号响应不适用于复杂体系等。单层的二维纳米材料如石墨烯、二硫化钼等因其独特的电化学性质、大的比表面积、良好的生物相容性受到了广泛的关注。其中，价格低廉、化学性质稳定的石墨相碳氮层状复合材料—C3N4，被视为一种高效的ECL信号物质用作构建ECL生物传感器。值得一提的是，纳米尺度的C3N4，展现出了良好的水溶性和大的比表面积，这些优良的性能使其构建的ECL传感器在金属离子、多巴胺、癌症标记物检测方面具有广阔的应用前景。24 2+我们利用Ru(phen)3和金纳米粒子复合的C3N4分别作为正电位及负电位的ECL探针，构建了一个双电位ECL响应的电化学发光生物传感器用于同时进行癌细胞的检测及其表面的N-聚糖分析。该体系能够快速灵敏的对人体乳腺癌细胞MCF-7进行双信号检测，并且同时对其表面的N-聚糖变化进行分析，可应用于N糖链抑制剂的筛选。3.2实验部分3.2.1实验试剂伴刀豆蛋白凝集素（ConA）、三（2,2'-联吡啶）二氯化钌（Ru(phen)3Cl2），衣霉素（TM），聚丙烯酸（PAA），聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）购于Sigma-Aldrich（美国）；四氯金（Ⅲ）酸三水合物（HAuCl4·3H2O，质量分数48%）购于上海试剂（中国）；1，-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购于AlfaAesar；多肽-N-糖苷酶F（PNGaseF）购于NewEnglandBiolabsInc。适配体及其互补链序列购于上海生工（中国），适配体的序列为5′-NH2-C6H12-CACTACAGAGGTTGCGTCCCACGTTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3′。适配体互补DNA序列为5′-CAGGCCAACCCCCCA-3′。其他试剂购于北京化工。3.2.2实验仪器表3.1主要测试仪器及备注信息中文名称简称规格型号备注紫外－可见吸收光谱仪UV-visUv-3900测试溶液为含0.1MKCl的电化学循环伏安CVCHI660b5mMK3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]混合溶液交流电压为10mV，频率范围为电化学阻抗EISPARSTAT227350.01Hz至10Hz电势范围为0.2V~1.25V,-1.6MPI-B多功能电化电致化学发光ECLV~0V，光电倍增管电压为600学分析系统V透射电子显微镜TEMH-7650B加速电压为100KV所有电化学测试时均采用三电极系统，饱和KCl的Ag/AgCl为参比电极，铂丝为辅助电极。25 3.2.3细胞的培养和处理MCF-7细胞（清华大学医学院）培养溶液为DMEM（高糖）培养基（鼎国生-1物）（含10%的胎牛血清（浙江四季青），100UmL的青霉素和链霉素），置于5%CO2的培养箱中于37°C孵育。细胞采用离心方式收集，以1000rpm转速离心5分钟，用无菌DPBS洗涤两次。最后将细胞分散于配置好的特定连接缓冲液中（缓-1-1冲液为4.5gL葡萄糖,5mMMgCl2及1mgmLBSA溶解于含CaCl2及MgCl2的DPBS中）。该特定缓冲液能保障细胞与适配体SYL3C的连接亲和力。为了评5–1估衣霉素抑制剂对细胞表面N糖基化的影响，MCF-7细胞（2×10cellsmL）在–1含有1µgmL（约1.2µM）衣霉素的培养液中培养48h。为了评估PNGaseF的5-1酶切影响，将细胞（5×10cellsmL）置于2%BSA的溶液中，加入PNGaseF（2000NEB单位）于37°C下振荡24h。3.2.4层状二硫化钼的制备层状二硫化钼的合成同上一章制备方法。首先，将商业二硫化钼粉末和三聚氰胺按1:3的比例混合，加入适量N-甲基吡咯烷酮（NMP）研磨1h以上制备得到二硫化钼插层复合物。将此复合物放入三氧化二铝磁舟中，在管式炉内程序升温至700°C同时在此温度下继续处理3h（Ar气保护氛围）。制备得到层状二硫化钼用透射电子显微镜和拉曼光谱及紫外光谱表征。3.2.5ECL纳米信标ConA@Au-C3N4的制备g-C3N4纳米片（g-C3N4NS）的制备：g-C3N4采用早期报道的文献方法制备。首先，将三聚氰胺放置于磁舟中，在管式炉中以8°C/min升温至550°C并保持3h（N2氛围）。由此制备得到固体g-C3N4进行超声处理。100mg的固体状g-C3N4粉末分散于50mL水中，超声处理16h。将得到的悬浮液体在3000rmp下离心去除未剥离开的g-C3N4。得到的g-C3N4纳米片溶液浓度可由确定体积悬浮液冻干后的重量计算得到。[41]Au-C3N4复合的制备：Au-C3N4复合材料根据报道的文献制备。将10µl的1%HAuCl4溶液在搅拌条件下加入到2ml准备好的g-C3N4NS分散液。该溶液在室温下进行2h搅拌之后，50µL的0.01M新鲜配置的NaBH4快速加入到溶液-中用来还原AuCl4。经过20min的搅拌，逐滴加入20µL的0.01M柠檬酸钠溶液。溶液继续在黑暗中搅拌2h。制备得到的Au-C3N4复合物用去离子水洗涤3次去除多余的杂质。-1ConA@Au-C3N4的制备：将40μL的ConA溶液（0.02mgmL）加入前面得26 -1到的Au-C3N4溶液（约2mgmL）中。混合溶液在室温下轻微搅拌60分钟。随2+2+后离心去除多余的ConA，最后将溶液分散于含1mMCa以及1mMMn的PBS溶液中，储存在4°C冰箱待用。3.2.6传感器制备与细胞捕获玻碳电极（GCE,直径为3mm）在使用前分别用0.3及0.05μmα-Al2O3粉末进行打磨抛光，随后电极用干净的去离子水和乙醇进行超声处理。电极−1用氮气吹干后，将5μL的含0.5mgmLMoS2的0.5%PAA溶液滴在电极上，在室温下干燥6h之后，对修饰电极进行电化学还原处理得到rMoS2/PAA修饰电极（rMoS2-PAA/GCE）。随后，将电极于37°C侵润40μL含有400mMEDC及100mMNHS的混合溶液中1h.紧接着将电极于同样温度侵润在40μL的1μM适配体溶液中1h，得到适配体连接的修饰电极（aptamer/rMoS2-PAA/GCE）。洗涤干净的修饰电极在乙醇胺溶液中孵育15min，以封闭电极表面的活性基团。随后将电极侵泡于1μMcDNA溶液中在电极表面得到适配体-cDNA2+互补链。此电极于4°C下在20mMRu(phen)3溶液中侵泡过夜，这样Ru2+配合物能嵌入到DNA双链结构中。用PBS清洗后，Ru(phen)3嵌入的DNA2+双链修饰电极（Ru(phen)3/cDNA/aptamer/rMoS2-PAA/GCE）制备完成，用于接下来的实验。将上述电极浸润在100μL不同浓度的MCF-7细胞悬浮液中，制备得2+到的细胞吸附电极（cell/Ru(phen)3/cDNA/aptamer/rMoS2−PAA/GCE）用PBS清洗后可用于接下来的ECL测试。3.2.7细胞表面N-聚糖的分析2+将细胞吸附电极（cell/Ru(phen)3/cDNA/aptamer/rMoS2−PAA/GCE）与40μL的ECL信标ConA@Au−C3N4在37°C条件下温育1h，随后用PBS小心浸润清洗，得到三明治夹心结构的Con2+A@Au-C3N4/cell/Ru(phen)3/cDNA/aptamer/rMoS2-PAA/GCE电极。对于基2+于Ru(phen)3ECL信标的正电位ECL检测，ECL测试采用循环伏安法，扫-1速为50mVs，扫描范围为0.2V~1.25V。检测溶液为含20mMTPA的PBS溶液（pH7.4,100mM）。对于基于ConA@Au-C3N4ECL信标的负电-1位ECL检测，ECL测试采用循环伏安法，扫速为100mVs，电势扫描范围2−为-1.6V~0V，检测溶液为含20mMS2O8的PBS溶液（pH7.4,100mM）。27 以上实验均采用三电极系统，铂丝为辅助电极，饱和KCl的Ag/AgCl为参比电极。3.2.8电极的循环利用2+当三明治结构的电极ConA@Au-C3N4/cell/Ru(phen)3/cDNA/aptamer/rMoS2-PAA/GCE制备完成后,将其在37°C下浸润于溶度为5µMcDNA溶液中。在此条件下Con2+A@Au-C3N4/cell/Ru(phen)3/cDNA/aptamer/rMoS2-PAA/GCE修饰电极释放细胞，再生出cDNA/aptamer/rMoS2-PAA/GCE电极，实现体系的循环利用。3.3结果与讨论3.3.1实验原理图3.1显示了可再生，双电位响应的ECL生物传感器于细胞检测和N-聚糖变化分析的原理图。在MoS2/PAA修饰电极表面共价修饰上SYL3C适配体。电化学还原后，MoS2被还原成rMoS2，以提高了电极表面的电子传输速率。当互补DNA2+与电极表面的适配体形成双链DNA结构后，Ru(phen)3插入到双链DNA的沟道[42-43]2+中。在正电位下Ru(phen)3产生ECL发光信号，当电极吸附细胞后，由于细2+胞上EpCAM蛋白和适配体特异的相互作用，双链解离，Ru(phen)3从电极表面释放，正电位ECL信号减弱。正电位的ECL信号强度与细胞数量相关可用于细胞检测。当电极吸附细胞后，将电极浸润在ConA@Au-C3N4信标溶液中，由于ConA与细胞表面N-糖链中的甘露糖的特异相互作用，信标被捕获到电极表面与细胞相连，构建了一个三明治夹心结构ECL系统。由于ConA@Au-C3N4在负电位有强ECL发光信号，该夹心体系产生了负电位ECL信号并且其强度与细胞数量及其表面N-糖链表达相关。由此，我们构建了检测细胞的ECL生物传感器。值得一提的是，负电位和正电位ECL信号强度比即ΔECLn/ΔECLp，能够准确直接的对N糖表达进行分析，这个强度比几乎与细胞数量无关，而只与细胞的种类和状态相关。从而避免了在单通道信号响应体系中因需要额外细胞计数带来的人为误差。制备得到的细胞捕获电极能够通过简单的互补DNA取代循环利用。基于该方法，我们构建了一种简单，可再生，双电位细胞检测和无计数的N-糖分析传感器，它在癌症诊断，药物筛选方面有巨大的应用潜力。28 图3.1可再生、双电位响应ECL生物传感器用于细胞检测及N-聚糖分析的原理图。3.3.2纳米信标的表征–由于C3N4纳米片表面存在大量的−NH2及−NH–基团，它们为还原AuCl4[41]提供了大量活性位点。如图3.2C所示，制备得到C3N4纳米材料为片层状结构，尺寸在100-200nm之间，且具有很好的分散性。大量的黑色小点即金纳米粒子附着在C3N4片层上，金纳米粒子无明显的聚集情况，大小较为均一，平均尺寸在7nm左右。图3.2A分别是C3N4（曲线a）及Au-g-C3N4（曲线b）的紫外可见光谱。g-C3N4在310nm处出现了特征吸收峰，而Au-g-C3N4不仅在310nm处出现吸收峰，而且在520nm处也呈现出金纳米粒子的SPR吸收峰，该结果表明金纳米粒子在C3N4表面形成。接着我们用电化学阻抗评估了两种材料的电化学性质（图3.2B），由于金纳米粒子的导电效应，Au-g-C3N4对比g-C3N4显示出了更好的电子传输能力。29 图3.2（a）C3N4，（b）Au-C3N4的紫外可见光谱（A）及电化学阻抗谱图。（B）电化学5−1阻抗实验的频率范围为0.01Hz至10Hz，扫描速度为100mVs。（C）Au-C3N4的透射电镜谱图。30 3.3.3传感器构建过程的电化学表征循环伏安法CV和电化学阻抗EIS能监测修饰过程中界面电子传输能力变化，4-/3-因此被视作研究修饰电极组装过程的重要电化学技术。图3.3A为以[Fe(CN)6]为电活性探针修饰电极组装过程的循环伏安图，修饰电极rMoS2-PAA/GCE的循环曲线显示出了一对准可逆氧化还原峰和较强的峰电流，这是由于rMoS2具有很好的电导率和大的比表面积。当适配体被连接到上述电极上后，电流信号明显降2+低（曲线b）。当互补DNA及插入Ru(phen)3的双链DNA被修饰到电极上后，峰电流再次发生轻微下降（曲线c）。这都是由于DNA的电子惰性导致的。当细胞吸附到电极表面后，由于细胞体积大，且整体带负电荷，其空间阻碍和电荷排斥严4−/3−重影响了Fe(CN)6活性对在电极表面的传输，峰电流明显下降，峰电位差变宽。最后，当信标ConA@Au-C3N4捕获到电极表面后，峰电流再次轻微下降。该结果表明，虽然Au纳米粒子具有良好的导电性，但由于C3N4及ConA为电子惰性物质，信标整体仍然阻碍了电子传递。我们通过电化学阻抗技术对该组装过程进行了进一步验证。如图3.3B所示，随着组装过程的进行，包括适配体的连接（曲线b）、细胞的捕获（曲线c）、纳米信标的捕获（曲线d），半圆直径及界面电子转移电阻逐步增大。该结果与循环伏安结果一致，证实了修饰电极的成功组装。31 图3.3（a）rMoS2-PAA/GCE，（b）aptamer/rMoS2-PAA/GCE，（c）cDNA/ethanolamine/aptamer/2+rMoS2-PAA/GCE，（d）cell/Ru(phen)3/cDNA/ethanolamine/aptamer/rMoS2-PAA/GCE，（e）2+ConA@Au-C3N4/cell/Ru(phen)3/cDNA/ethanolamine/aptamer/rMoS2-PAA/GCE的循环伏安图（A）及电化学阻抗谱图（B）。电解质为含有0.5MKCl的5mMK4Fe(CN)6和5mM-1K3Fe(CN)6混合溶液。扫描速度为100mVs。电化学阻抗实验的频率范围为0.01Hz至510Hz，信号波幅为10mV。3.3.4正负电位ECL信号评估2+在该方法中，正电位信标Ru(phen)3和负电位信标ConA@Au-C3N4的ECL发光强度都与吸附在电极表面的细胞数量有关。并且由于甘露糖和ConA的特异相互作用，ConA@Au-C3N4信标的负电位ECL信号还与细胞上N糖的表达程度相关。因此，该传感器不仅能够用于细胞检测，更能准确分析细胞表面的N-糖表达变化。我们首先评估了该生物传感器正电位的信号，检测溶液为含20mMTPA的0.1MPBS溶液，电势扫描范围为0.2V~1.25V。如图3.4A所示，修饰电极2+Ru(phen)3/cDNA/aptamer/rMoS2-PAA/GCE在1.2V发出了非常强的ECL信号，2+表明Ru(phen)3成功的嵌入到了双链DNA的沟道中。并且如图中的内插图可知，2+该信号在扫描过程中十分稳定，表明Ru(phen)3不会在扫描过程中从电极表面脱2+附下来。当此Ru(phen)3/cDNA/aptamer/rMoS2-PAA/GCE修饰电极与癌细胞共孵育后，ECL信号急剧下降，这是由于适配体和癌细胞的特异相互作用，导致互补2+DNA被竞争下来，脱离电极，同时Ru(phen)3信标也释放到溶液相。该ECL强度的降低与细胞浓度的对数成反比。接着我们评估了该生物传感器的负电位ECL信号，检测溶液为含20mM32 2−S2O8的0.1MPBS溶液，电势扫描范围为-1.6V~0V。如图3.4B的曲线e所示，ConA@Au-C3N4/cell/aptamer/rMoS2-PAA/GCE修饰电极在−1.6V显示较强的ECL信号，并且与细胞浓度的对数值成正比，表明ConA@Au-C3N4纳米信标组装到电极表面。我们进一步对修饰电极的特异性进行了评估。如图3.4B，rMoS2-PAA/GCE电极因未连接适配体，即使电极仍然浸泡于纳米信标（曲线d）和同时浸泡于细胞和纳米信标中（曲线a），仍显示出了非常低的ECL信号。这证实未接入适配体的修饰电极由于采用了乙醇胺对其活性位点进行了封闭，使得特异性吸附变少。同时，未加入细胞的aptamer/rMoS2-PAA/GCE电极即使浸泡于纳米信标中也只有微弱的信号产生，这证明只有少量的纳米信标吸附在aptamer/rMoS2-PAA/GCE电极表面，原因在于纳米信标由于金纳米粒子的作用整体显现负电荷与适配体的负电位相互排斥。由于没有纳米信标，cell/aptamer/rMoS2-PAA/GCE修饰电极也只有微弱的ECL信号，这证实负电位ECL信号确实来源于ConA@Au-C3N4。以上对比试验结果表明该生物传感器具有很好的特异性。33 2+图3.4（A）Ru(phen)3/cDNA/ethanolamine/aptamer/rMoS2-PAA/GCE（a）2+cell/Ru(phen)3/cDNA/ethanolamine/aptamer/rMoS2-PAA/GCE（b）的ECL强度-电势图。-1电解液为含20mMTPA的0.1MPBS（pH7.4）。扫描速度为50mVs。内插图为2+Ru(phen)3/cDNA/ethanolamine/aptamer/rMoS2-PAA/GCE的时间扫描ECL图。在电解液中扫描5圈。光电倍增管电压为600V。电势扫描范围为0.2V~1.25V（vs.Ag/AgCl）。（B）ConA@Au-C3N4/cell/rMoS2-PAA/GCE（a），ConA@Au-C3N4/aptamer/rMoS2-PAA/GCE（b）,cell/rMoS2-PAA/GCE（c），ConA@Au-C3N4/rMoS2-PAA/GCE（d）以及ConA@Au-C3N4/cell/aptamer/rMoS2-PAA/GCE（e）的ECL强度-电势图。电解液为含20mM-1K2S2O8的0.1MPBS（pH7.4）。扫描速度为100mVs。光电倍增管电压为600V。电5-1势扫描范围为-1.6V~0V（vs.Ag/AgCl）。MCF-7细胞浓度为5.0×10cellsmL。3.3.5传感器条件的优化细胞及信标的温育时间，信标的滴涂体积及信标中Au−C3N4与ConA的合成比例对ECL传感器的性能有很大的影响。−1如图3.5A所示，我们对其合成比例进行了优化，由图可知Au-C3N（42mgmL）−1与ConA（0.02mgmL）在合成过程比例为3:1时，ECL信号最强。细胞的温育时间对传感器性能也有很大的影响，最好保证时间足够让细胞与电极表面达到平衡状态。如图3.5B所示，ECL的强度随着细胞温育的时间的增长而增强，当细胞温育时间达到60分钟，接近达到最大值。所以在接下来的实验中，我们选择60分钟作为细胞温育时间。同理，我们对信标温育时间和体积进行了优化，如图3.5C和图3.5D所示，ECL信号随着信标温育时间的增加而增加，在60分钟得到最大值，同理选择在60分钟为信标温育的实验条件。而ECL信号强度在信标体积3到13μL的变化范围内，随着体积的增大而逐渐增大，在10μL左右达到平台。至此，通过对这些条件的优化，选定了细胞温育时间为60分钟，信标体积和温育34 −1时间分别为10μL和60分钟，信标合成中Au-C3N4（2mgmL）与ConA（0.02−1mgmL）的比例为3:1时为ECL传感器的最优条件。图3.5ECL传感器的优化，包括（A）合成纳米探针中，ConA与C3N4-Au比例,（B）细胞温育时间,（C）探针温育时间以及（D）探针使用体积。ECL强度取其在-1.6V（vs.Ag/AgCl）处的最大值。光电倍增管电压为600V。电势范围为-1.6V~0V（vs.5-1Ag/AgCl）。MCF-7细胞浓度为5.0×10cellsmL。3.3.6双信号癌细胞检测分析基于上述的优化条件，我们对人体乳腺癌细胞MCF-7分别在正电位和负电位进行ECL检测。图3.6展示了不同MCF-7细胞浓度下正电位ECL信号的强度变化。由该图可知，正电位的ECL强度随着细胞浓度的降低逐渐降低，其强度在26−1MCF-7细胞浓度范围在10到10cellsmL内与细胞浓度对数呈线性关系，考虑到实验中细胞悬浮液的体积100μL，该ECL方法对MCF-7细胞检测极限能达到15个MCF-7细胞。接下来，我们评估了负电位ECL信号对细胞的响应。如图3.7所示，负电位ECL信号强度随着MCF-7细胞浓度的增加而逐步增加。其强度在MCF-7细胞浓26−1度范围在10到10cellsmL内与细胞浓度的对数呈线性关系。35 这样的结果表明该传感器对MCF-7细胞可分别正、负电位下检测。该ECL传感器具有检测范围广，检测限低的特点。更重要的是，细胞检测通过由电压控制的两个通道独立完成，分别形成的ECL信号能够排除复杂体系中的假阳性诊断。图3.6正电位检测模式。（A）ECL强度随细胞浓度的变化图。（MCF-7细胞浓度从a23344556到f分别为1.0×10,1.0×10,5.0×10,1.0×10,5.0×10,1.0×10,5.0×10及1.0×10cells−1mL）。光电倍增管电压为600V。（B）ECL强度与MCF-7细胞浓度的线性关系图。36 图3.7负电位检测模式。（A）ECL强度随细胞浓度的变化图。（MCF-7细胞浓度从a到23344556f分别为1.0×10,1.0×10,5.0×10,1.0×10,5.0×10,1.0×10,5.0×10及1.0×10cells−1mL）。光电倍增管电压为600V。（B）ECL强度与MCF-7细胞浓度的线性关系图。3.3.7癌细胞的检测选择性ECL生物传感器的选择性是评估其性能的重要指标。通过将2+Ru(phen)3/cDNA/aptamer/rMoS2-PAA/GCE修饰电极与不同的细胞系共温育，我们对该ECL传感器的选择性进行了研究。该传感器的选择性主要来源于适配体与EpCAM蛋白的特异相互作用，如图3.8A所示，当电极与EpCAM+细胞（MCF-7）共温育时，ECL信号发生了明显的变化（ΔECL），表面电极很好的对该细胞进行37 了吸附。而当电极与EpCAM-（K562,293T及Hela）细胞共孵育时，ECL信号只发生了轻微的变化。这表明该传感器展现了良好的选择性。为了探究该传感器在复杂体系中的检测性能，我们构建了双细胞混合溶液，包含干扰细胞K562和目标细胞MCF-7。通过将电极2+Ru(phen)3/cDNA/aptamer/rMoS2-PAA/GCE与不同比例的细胞混合溶液共温育（总细胞数一定），探究K562细胞对目标细胞的干扰情况。如图3.8B所示，随着混合溶液中MCF-7细胞比例的升高，ECL信号变化增大，值得一提的是，该ΔECL值与相等数量MCF-7细胞溶液造成的变化相似。当混合溶液中，MCF-7细胞的比例仅为1%时，也只造成了5.62%的正偏差。当MCF-7的比例升高后，正偏差值迅速下降到1.92%。该结果表明构建的ECL传感器可以有效的从细胞混合溶液中检测到目标细胞，有潜力应用于复杂体系，成为快速灵敏的癌症诊断技术。5图3.8（A）该生物传感器对不同细胞系响应的ECL强度图。细胞浓度均为5.0×10cells–1mL。（B）混合细胞溶液中目标细胞MCF-7的选择性识别。细胞混合溶液（MCF-7细胞与K562细胞）中MCF-7所占比例分别为1%,5%,10%,30%。100μL细胞混合物中细胞4总数为5×10个。38 3.3.8细胞表面N-聚糖分析N-糖基化在多种生物过程中发挥着重要的作用。在本文构造的生物传感器中，由ConA@Au-C3N4纳米信标产生的负电位信号与细胞数量及N-糖基化表达同时相关，而正电位信号只与细胞数量有关。因此负电位与正电位信号之比（ΔECLn/ΔECLp）几乎与细胞数量无关，而只于该细胞种类的N-糖基化表达相关，可被用作无需细胞计数的细胞表面的N-聚糖分析，避免了人工计数导致的误差。为了研究细胞表面N-糖基化表达，用衣霉素TM对MCF-7进行处理。衣霉素是一[44]种N糖链抑制剂，在N糖基化生物过程中，衣霉素阻碍了其第一步合成。如图3.9所示，对比未经处理的细胞，被衣霉素处理的细胞ECL强度明显降低。经过48h处理后，ECL信号下降45.3%。造成ECL信号下降的原因是衣霉素抑[45]制的细胞表面N-糖链的表达。PNGaseF是一种酰胺酶，酶切位点在N糖基化蛋白上的天冬酰胺残基和GlcNAc之间，能够释放N-糖基化蛋白的N糖链。MCF-7细胞经PNGaseF处理后，对比未处理的细胞，ECL强度急剧下降到37.3%。该结果显示构建的ECL生物传感器灵敏的分析细胞表面N糖基化表达。因该传感器正电位和负电位信号都与细胞数量相关，而负电位信号又同时与N糖基化表达相关，负电位与正电位信号比ΔECLn/ΔECLp几乎与细胞数量无关。为了验证该方法的准确性，MCF-7细胞系在相同条件下使用TM和PNGaseF进行处4−15−1理，分别研究了细胞数量为5×10cellsmL和5×10cellsmL的两个体系其ΔECLn/ΔECLp信号比在处理前后的变化情况。如图3.9所示，经过衣霉素处理的4−1及经过PNGaseF处理的细胞在细胞数量为5×10cellsmL时，ΔECLn/ΔECLp信5−1号变化值分别为46.7%及60.3%。当细胞数量改变为5×10cellsmL后，该值几乎未发生变化，这表明ΔECLn/ΔECLp在一定范围内与细胞数量无关。因此我们构建了一个能直接分析N-聚糖变化的传感器，该传感器无需进行人为的细胞计数，因此排除了人工计数带来的巨大实验误差。39 图3.9药物处理的MCF-7细胞表面N糖基化表达。MCF-7细胞分别经过PNGaseF处理–124h及衣霉素TM（1mgmL）处理48h。正电位检测模式，电解液为含20mMK2S2O8-1的0.1MPBS（pH7.4），扫描速度为100mVs。负电位检测模式，电解液为含20mMK2S2O8的0.1MPBS（pH7.4），电势扫描范围为-1.6V~0V（vs.Ag/AgCl），扫描速度为100mV/s。光电倍增管电压为600V。灰色柱状图和白色柱状图代表MCF细胞浓度分别5–14–1为5×10cellsmL及5×10cellsmL。3.3.9传感器的循环利用在本方法中，细胞通过与互补DNA竞争作用连接到电极表面的适配体上，达到检测的目的。该竞争反应的吉布斯自由能与产物和反应物的比例密切相关，可用以下公式表示，ΔG=ΔG°+RTlnQ，其中Q称为反应系数。因此，当CcDNA/Ccells的比例足够大时，能使得该竞争反应偏离原始状态，朝着反向进行。这样当cells/aptamer/rMoS2-PAA/GCE电极浸泡在大大过量的cDNA溶液中，细胞被取代，cDNA/aptamer/rMoS2-PAA/GCE形成，电极再生。图3.10A为cells/aptamer/rMoS2-PAA/GCE在未经互补链处理（曲线a）和经过互补链处理（曲线b）的奈奎斯特阻抗图。当电极侵泡于过量互补链溶液中后，阻抗图曲线中的半圆直径明显下降，该结果表明捕获于电极上的细胞已被完全释放。2+Ru(phen)3嵌入cDNA/aptamer/rMoS2-PAA/GCE电极的ECL信号能被用来评估电极的循环利用。如图3.10B所示，当2+Ru(phen)3/cDNA/aptamer/rMoS2-PAA/GCE电极与癌细胞共孵育后，ECL信号明2+显下降，证实细胞已被吸附到电极上。而当此电极继续用互补链及Ru(phen)3处理后，ECL信号得到了恢复。细胞的吸附与解吸附过程能重复多次。40 该传感器能被用于细胞表面N糖基化的多次重复测定。如图3.10C所示，在多次细胞吸附与解吸附循环中，ΔECLn/ΔECLp几乎维持在一个稳定的值。2+图3.10cell/Ru(phen)3/cDNA/aptamer/rMoS2-PAA/GCE在经过互补链cDNA浸泡前（a）和浸泡后（b）的电化学阻抗谱图。（B）细胞解吸附（黑线）和吸附（白线）的正电位ECL强度信号图，循环5次。（C）负电位与正电位ECL信号变化比（ΔECLn/ΔECLp）5−1从第1圈到第5圈的变化情况。细胞浓度为5.0×10cellsmL。41 3.4本章小结在本章中，我们构建了一个可循环利用的双信号ECL生物传感器同时用于癌细胞的多重检测及其表面N-聚糖的分析。在这个工作中，细胞检测和细胞表面N-聚糖分析检测能够同时高效，灵敏的进行，基于负电位和正电位的ECL信号比（ΔECLn/ΔECLp），N-聚糖的分析与细胞数量无关，不需要采用误差较大的人工计数方法。该传感器被成功用作人乳腺癌细胞MCF-7的检测及其评估衣霉素抑制剂和PNGaseF酶切处理后表面的N-聚糖变化。值得一提的是，该体系能采用简单的方法进行循环利用，使得它在微流控领域有巨大的应用潜力。42 结论本论文以电致化学发光技术为基础，利用糖和凝集素，细胞与适配体的相互作用，创新合成了多种电化学发光纳米信标分子及电极修饰材料，构建了灵敏，多通路的ECL糖生物传感器适用于在癌症诊断及细胞表面N‐聚糖分析。1.利用插层法首次合成了层状二硫化钼纳米材料，该方法能快速，大量的制备层状二硫化钼，显现出了巨大的应用价值。通过对二硫化钼修饰电极的电化学还原制备得到电化学性质优异的修饰电极。将其与适配体连接，采用凝集素修饰的C3N4量子点复合材料作为信号标记物，制备得到了能用于癌细胞诊断的ECL糖电化学传感器。该传感器实现了对人乳腺癌细胞MCF-7的快速灵敏检测。众多优点使其在癌细胞诊断，药物筛选等方面有巨大的前景。2.我们构建了一个可循环利用的双信号ECL生物传感器同时用于癌细胞的多重检测及其表面N-聚糖分析。在这个工作中，细胞检测和细胞表面N-聚糖分析检测能够同时高效，灵敏的进行。基于负电位和正电位的ECL信号比（ΔECLn/ΔECLp），N-聚糖的分析与细胞数量无关，不需要采用误差较大的人工计数方法。该传感器被成功用作人乳腺癌细胞MCF-7的检测及其评估衣霉素抑制剂和PNGaseF酶切处理后细胞表面的N-聚糖表达。值得一提的是，该体系能采用简单的方法进行循环利用，使得它在微流控领域有巨大的应用潜力。该传感器对于深入理解与糖相关的自然界生物过程，阐明N-聚糖相关的癌细胞发生机制以及癌症诊断领域都有巨大的应用价值。43 参考文献[1]TaniguchiN,HartGW,SeebergerPH,etal.Glycoscience:BiologyandMedicine.Springer:2015.[2]PilobelloKT,MahalLK.Decipheringtheglycocode:thecomplexityandanalyticalchallengeofglycomics.CurrOpinChemBiol.2007,11:300-305.[3]CunninghamS,GerlachJQ,KaneM,etal.Glyco-biosensors:Recentadvancesandapplicationsforthedetectionoffreeandboundcarbohydrates.Analyst2010,135:2471-2480.[4]BrockhausenI,SchachterH.GlycosyltransferasesInvolvedinN–andO–GlycanBiosynthesis.Glycosciences:statusandperspectives1997,79-113.[5]MagerMD,LaPointeV,StevensMM.Exploringandexploitingchemistryatthecellsurface.NatChem.2011,3:582-589.[6]OhtsuboK,MarthJD.Glycosylationincellularmechanismsofhealthanddisease.Cell2006,126:855-867.[7]Schedin‐WeissS,WinbladB,TjernbergLO.TheroleofproteinglycosylationinAlzheimerdisease.FEBSJournal2014,281:46-62.[8]DubeDH,BertozziCR.Glycansincancerandinflammation—potentialfortherapeuticsanddiagnostics.NatRevDrugDiscov.2005,4:477-488.[9]CheungP,PawlingJ,PartridgeEA,etal.Metabolichomeostasisandtissuerenewalaredependentonβ1,6GlcNAc-branchedN-glycans.Glycobiology2007,17:828-837.[10]BüllC,BoltjeTJ,vanDintherEA,etal.Targeteddeliveryofasialicacid-blockingglycomimetictocancercellsinhibitsmetastaticspread.ACSnano2015,9:733-745.[11]KontermannRE,MartineauP,CummingsCE,etal.Enzymeimmunoassaysusingbispecificdiabodies.Immunotechnology1997,3:137-144.[12]RoyleL,CampbellMP,RadcliffeCM,etal.HPLC-basedanalysisofserumN-glycansona96-wellplateplatformwithdedicateddatabasesoftware.AnalBiochem.2008,376:1-12.[13]NishikazeT,KaneshiroK,KawabataS-i,etal.StructuralanalysisofN-Glycansbytheglycan-labelingmethodusing3-aminoquinoline-basedliquidmatrixinnegative-IonMALDI-MS.AnalChem.2012,84:9453-9461.[14]CarneiroMG,KoharudinLM,BanD,etal.SamplingofGlycan‐BoundConformersbytheAnti‐HIVLectinOscillatoriaagardhiiagglutininintheAbsenceofSugar.AngewChemIntEd.2015,54:6462-6465.[15]VanderschaegheD,SzekrenyesA,WenzC,etal.High-throughputprofilingoftheserumN-glycomeoncapillaryelectrophoresismicrofluidicssystems:towardclinicalimplementationofGlycoHepatoTest.AnalChem.2010,82:7408-7415.[16]ZhangX,TengY,FuY,etal.Lectin-basedbiosensorstrategyforelectrochemicalassayofglycanexpressiononlivingcancercells.AnalChem.2010,82:9455-9460.44 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致谢时光匆匆，七年飞逝。回想初入清华园的场景，不禁感慨万千。四年的本科生涯，三年的研究生阶段都是我人生中最重要的回忆，在这其中我的人生观，思想观，价值观都发生变化，成为一个更好的自己。在这里，我要感谢导师刘洋副教授，他带我踏入科学研究的大门，让我认识到科学研究是多么神圣，需要多大的毅力和坚持。与此同时，他勤奋的工作态度，勇于攀登的科学理想也给我留下了深刻的印象。希望接下来的生活中，我能汲取这营养，真正成为一个踏实，敬业的人。感谢实验室的所有兄弟姐妹，特别谢谢陈祝海，汪阳忠，张文燕，孙娜，赵廷璧，王峰，王晓涵，谢赛丹，闫志勇，邓锐杰，王丽达对我的帮助。祝福大家快乐并且勇敢。谢谢本科同学张鹏飞，王俊茗多次给我提供细胞！感谢“大堡礁”系统的格式修改！感谢所有朋友（特别感谢剪刀手·露和爱德华·晶），因为有你们，生活才精彩，祝大家平安喜乐！感谢我的父母教给我的人生经验，愿你们继续快乐“成长”。特别感谢国家自然科学基金对本课题的资助！47 声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人享有著作权的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。签名：日期：48 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果个人简历1991年4月16日出生于四川省绵阳市。2009年9月考入清华大学化学系，2013年7月本科毕业并获得理学学士学位。2013年9月免试进入清华大学化学系攻读分析化学硕士至今。发表的学术论文[1]HeY,LiJH,andLiuY*.ReusableandDual-PotentialResponsesElectrogeneratedChemiluminescenceBiosensorforSynchronouslyCytosensingandDynamicCellSurfaceN-GlycanEvaluation.AnalChem.2015,87,9777-9785.(SCI收录,检索号:CT2JU,影响因子:5.636)[2]ChenXJ,HeY,ZhangYY*,LiuMJ,LiuY*andLiJH.Ultrasensitivedetectionofcancercellsandglycanexpressionprofilingbasedonamultivalentrecognitionandalkalinephosphatase-responsiveelectrogeneratedchemiluminescencebiosensor.Nanoscale,2014,6,11196-11203.(SCI收录,检索号:AU2LR,影响因子:7.394)[3]WangZH*,SunN,HeY,LiuY*,andLiJH*.DNAAssembledGoldNanoparticlesPolymericNetworkBlocksModularHighlySensitiveElectrochemicalBiosensorsforProteinKinaseActivityAnalysisandInhibition.Anal.Chem.2014,86(12),6153–6159.(SCI收录,检索号:AJ4JX,影响因子:5.636)49
