红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响

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201420258红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响胡谋波导师姓名：吕军影专业名称：中西医结合临床申请学位类型：学术型学位答辩委员会主席：林寿宁答辩委员会委员：庞军黄李平吴新贵潘宇政二○一七年五月 原创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含获得广西医科大学或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日---------------------------------------------------------------------------学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：在校期间论文的知识产权属广西医科大学。学校有权保存论文的电子和纸质文档，可以借阅或上网公布本论文的部分或全部内容，可以采用影印、复印或其它手段保存、汇编本论文，学校可以向国家有关机关或机构送交论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅。同意广西医科大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。保密论文在解密后遵守此规定。学位论文作者签名：导师签字： 个人简历基本情况姓名：胡谋波性别：男民族：汉出生年月：1990年10月籍贯：湖北石首政治面貌：中共党员学习工作经历起止时间所在院校或单位学历学位2008.9-2013.6湖北民族学院科技学院本科/学士2014.9-2017.6广西医科大学研究生/硕士研究生期间科研经历/临床工作经历2016.6-2016.12广西医科大学第一附属医院实习2014.9-2017.7中药红花对硬皮病小鼠皮肤纤维化影响的实验研究 目录一、中文摘要………………………………………………………………………1二、英文摘要………………………………………………………………………4三、中英文缩略对照表……………………………………………………………8四、论文正文前言…………………………………………………………………………11材料…………………………………………………………………………13方法…………………………………………………………………………16结果…………………………………………………………………………25讨论…………………………………………………………………………37结论…………………………………………………………………………49参考文献……………………………………………………………………50五、综述正文…………………………………………………………………………58参考文献……………………………………………………………………64六、附图………………………………………………………………………66七、致谢………………………………………………………………………78八、攻读硕士研究生期间撰写的文章…………………………………………79 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响摘要目的通过建立硬皮病小鼠模型，观察红花水煎液干预对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响，进一步探讨红花抗SSc组织纤维化的作用机制。方法将128只BALB/C小鼠随机分为4组：空白对照组、模型对照组、醋酸泼尼松组、红花水煎液组，每组32只；建立硬皮病小鼠模型，造模的同时，空白对照组和模型对照组给予生理盐水灌胃，醋酸泼尼松组和红花水煎液组分别给予醋酸泼尼松混悬液和红花水煎液灌胃进行药物干预，在第1周、第2周、第3周、第4周分批处死各组8只小鼠。取肺组织及皮肤制成石蜡切片，进行HE染色观察小鼠皮肤和肺组织病理改变；进行Masson染色、SiriusRed染色、VanGieson染色观察胶原纤维的分布，测定皮肤和肺组织胶原纤维含量变化；IHC检测皮肤和肺组织TGF-β1、IL-10的定位及表达。取眼球血提取血清ELISA法检测TGF-β1、IL-10的表达水平。结果1、皮肤和肺组织HE染色1 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文空白对照组皮肤和肺组织在各个观察时间点无明显变化，皮肤和肺组织结构清晰完整，无或极少炎症细胞浸润。模型对照组第1周皮肤和肺组织有少量的炎症性细胞浸润，真皮增厚不明显；第2周出现真皮增厚，大量炎症细胞浸润；第3周真皮增厚进一步，炎症细胞减少，出现胶原纤维增生，成纤维细胞增多；第4周真皮进一步增厚，炎症细胞浸润减少，胶原纤维、成纤维细胞数量进一步增多。醋酸泼尼松组和红花水煎液组在各个时间点的炎症细胞和胶原纤维较模型对照组少。2、皮肤和肺组织Masson染色、SiriusRed染色、VanGieson染色空白对照组皮肤和肺组织在各个观察时间点未见明显改变，无或极少胶原纤维增生。第1周模型对照组皮肤和肺组织出现胶原纤维紊乱，有较少胶原增生；第2、3、4周成纤维细胞数量逐渐增多、胶原纤维增生。与模型对照组比较，酸泼尼松组和红花水煎液组皮肤和肺组织胶原纤维及成纤维细胞减少。3、皮肤和肺组织炎症评分空白对照组组织炎症评分在各个时间点无明显变化（P＞0.05）。各建模组炎症在第1、2周逐渐升高，在第2周达到高峰；第3、4周炎症逐渐减少，但仍高于空白对照组小鼠。经醋酸泼尼松和红花干预后药物干预组炎症较模型对照组减轻（P<0.05）。4、皮肤和肺组织胶原纤维含量变化空白对照组在各个时间点胶原纤维无明显改变（P＞0.05）。与空白对照组比较，模型对照组各个观察点小鼠胶原纤维均增多（P<0.05），且随着建模时间延长而逐渐增加。经药物干预后，醋酸泼尼松组和红花水煎液组胶原纤维2 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文含量较模型对照组下降（P<0.05）。5、皮肤和肺组织TGF-β1、IL-10IHC检测空白对照组皮肤和肺组织TGF-β1和IL-10蛋白表达量无明显改变（P＞0.05）。与空白对照组比较，建模各组小鼠皮肤和肺组织中TGF-β1、IL-10的表达在各个时间点升高（P<0.05）。与模型对照组比较，醋酸泼尼松组和红花水煎液组TGF-β1、IL-10表达量在各个时间点均出现下降，差异有统计学意义（P<0.05）。6、血清中TGF-β1、IL-10ELISA检测空白对照组血清中TGF-β1和IL-10较低，各个时间点变化不明显（P＞0.05）。与空白对照组比较，建模各组小鼠组织中TGF-β1、IL-10水平在各个时间点升高（P<0.05）。与模型对照组比较，醋酸泼尼松组和红花水煎液组TGF-β1、IL-10表达在各个时间点均出现下降，差异有统计学意义（P<0.05）。结论1、在博来霉素诱导的硬皮病小鼠皮肤和肺组织中存在TGF-β1、IL-10表达升高。2、红花水煎液可能通过降低TGF-β1、IL-10的表达水平，减轻免疫炎症，缓解硬皮病组织纤维化的进程。关键词：硬皮病，红花，TGF-β1，IL-10，BALB/C小鼠3 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文EFFECTSOFSAFFLOWERDECOCTIONONSKINANDLUNGFIBROSISANDTHEEXPRESSIONOFTGF-β1ANDIL-10INSCLERODERMAMICEABSTRACTObjectivesToobservetheeffectofsafflowerdecoctionontheexpressionofTGF-β1andIL-10inskinandlungtissueofsclerodermamice,andtoexplorethemechanismofsafflowerdecoctiononanti-SSctissuefibrosis.Methods128BALB/Cmicewererandomlydividedinto4groups:blankcontrolgroup,modelcontrolgroup,prednisoneacetategroup,safflowerdecoctiongroup,32miceineachgroup.Toestablishsclerodermamousemodel,meanwhile,thecontrolgroupandthemodelcontrolgroupweregivennormalsaline,theprednisoneacetategroupandthesafflowerdecoctiongroupwererespectivelytreatedwithprednisoneacetatesuspensionandsafflowerdecoctionfordrugintervention.Eightmiceineachgroupweresacrificedatweek1,week2,week3andweek4.ThepathologicalchangesofskinandlungtissueswereobservedbyHEstaining.Massonstaining,SiriusRedstainingandVanGiesonstainingwereusedtoobserve4 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文thedistributionofcollagenfibers.Thechangesofcollagenfibersinskinandlungtissuesweremeasured.ThelocalizationandexpressionofTGF-β1andIL-10inskinandlungtissueweredetectedbyIHC.TheexpressionofTGF-β1andIL-10inserumwasdetectedbyELISA.Results1.HEstainingofskinandlungtissueTherewasnosignificantchangeintheskinandlungtissueoftheblankcontrolgroupatallobservationtimepoints,andthestructuresoftheskinandlungtissuewereclearandcomplete,withoutobviousinflammatorycellinfiltration.Inthemodelcontrolgroup,therewasaslightinfiltrationofinflammatorycellsintheskinandlungtissueatweek1,andthedermalthickeningwasnotobvious.Inthesecondweek,thedermiswasthickenedandalotofinflammatorycellswereinfiltrated.Thethirdweekofdermalthickeningwasfurther,theinflammatorycellsdecreasedandcollagenfiberhyperplasiaoccured,alsofibroblastsincreased;Thedermalthickeningwentastepfurtherwithinflammatorycellinfiltrationdecreased,collagenfibersandthenumberoffibroblastsincreasedmuchmoreat4thweek.Thelevelsofinflammatorycellsandcollagenfibersintheprednisoneacetategroupandthesafflowerdecoctiongroupwerelessthanthoseinthemodelcontrolgroupateachtimepoint.2.Massonstaining,SiriusRedstaining,VanGiesonstainingofskinandlungtissueTherewasnosignificantchangeintheskinandlungtissueoftheblank5 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文controlgroupateachobservationtimepoint,withoutorwithlittlecollagenfibrillation.Inthe1stweek,thecollagenfiberbecamedisorderedwithlesscollagenhyperplasiaintheskinandlungtissuesofthemodelcontrolgroup,andthenumberoffibroblastsincreasedgraduallyatthe2nd,3rdand4thweek.Comparedwiththemodelcontrolgroup,thecollagenfibersandfibroblastsweredecreasedintheskinandlungtissuesoftheprednisoneacetategroupandthesafflowerdecoctiongroup.3.TheinflammationscoreofskinandlungtissueTherewasnosignificantchangeintissueinflammationscoreateachtimepointintheblankcontrolgroup（P＞0.05）.Theinflammationofthemodelcontrolgroupgraduallyincreasedinthefirstandsecondweek,reachedthepeakinthesecondweek;andgraduallydecreasedin3rd,4thweeks,butstillhigherthantheblankcontrolgroupmice.Theinflammationofprednisoneacetategroupandsafflowerinterventiongroupwerelowerthanthatofmodelcontrolgroup(P<0.05).4.CollagenfibercontentchangesofskinandlungtissueTherewasnosignificantchangeincollagenfibersintheblankcontrolgroup（P＞0.05）.Comparedwiththeblankcontrolgroup,thecollagenfibersofalltheobservationmiceinthemodelcontrolgroupincreased(P<0.05),andgraduallyincreasedwiththemodelingtime.Thecontentofcollagenfibersinprednisoneacetategroupandsafflowerdecoctiongroupdecreasedcomparedwiththemodelcontrolgroup(P<0.05).5.SkinandlungtissueTGF-β1,IL-10IHCdetectionTherewasnosignificantchangeintheexpressionofTGF-β1andIL-106 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文proteininblankcontrolgroup（P＞0.05）.Comparedwiththeblankcontrolgroup,theexpressionofTGF-β1andIL-10inthemicewereincreasedateachtimepoint(P<0.05).Comparedwithmodelcontrolgroup,theexpressionofTGF-β1andIL-10inprednisoneacetategroupandsafflowerdecoctiongroupdecreasedateachtimepoint,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).6.TheELISAdetectionofTGF-β1andIL-10inserumThelevelsofTGF-β1andIL-10intheblankcontrolgroupwerelowerateachtimepoin（tP＞0.05）.Comparedwiththeblankcontrolgroup,thelevelsofTGF-β1andIL-10inthemodelcontrolgroupincreasedateachtimepoint(P<0.05).Comparedwithmodelcontrolgroup,theexpressionofTGF-β1andIL-10inprednisoneacetategroupandsafflowerdecoctiongroupdecreasedateachtimepoint,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).Conclusions1.TheexpressionofTGF-β1andIL-10increasedintheskinandlungtissuesofbleomycin-inducedsclerodermamice.2.SafflowerdecoctionmayreducetheexpressionlevelsofTGF-β1,IL-10andimmuneinflammation,alsorelievesclerodermatissuefibrosisprocess.Keywords:systemicscleroderma,safflower,TGF-β1,IL-10,BALB/Cmice7 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文中英文缩略对照表（1）英文缩写英文全称中文全称（2）SScsystemicsclerosis系统性硬皮病（3）Th细胞helperTcel辅助性T细胞（4）Th1Th1cellTh1辅助细胞（5）Th2Th2cellTh2辅助细胞（6）Th17Thelpercell17辅助性T细胞17（7）TregRegulatorycell调节性T细胞（8）TGFTransforminggrowthfactor转化生长因子（9）TGF-β1Transforminggrowth转化生长因子-β1factor-β1（10）TGF-β2Transforminggrowth转化生长因子-β2factor-β2（11）TGF-β3Transforminggrowth转化生长因子-β3factor-β3（12）VEGFvascularendothelialgrowth血管内皮生长因子factor（13）COL-ⅠCollagenⅠⅠ型胶原（14）COL-ⅢCollagenⅢⅢ型胶原（15）RORγtretinoicacid-relatedorphan维甲酸相关孤儿受体γt8 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文receptorγt（16）IL-10interleukin10白介素10（17）IL-17interleukin17白介素17（18）SLEsystemiclupus系统性红斑狼疮erythematosus（19）RArheumatoidarthritis类风湿关节炎（20）pSSPrimarydrynesssyndrome原发性干燥综合症（21）IL-21Interleukin21白介素21（22）IL-4Interleukin4白介素4（23）IL-22Interleukin22白介素22（24）ECMextracellularmatrix细胞外基质（25）IHCImmunohistochemistry免疫组织化学（26）FBFibroblast成纤维细胞（27）PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应（28）RT-PCRreversetranscriptionPCR逆转录PCR（29）BLAFbronchoalveolarlavage肺泡灌洗液fluid（30）mRNAmRNA信使RNA（31）Foxp3forkheadtranscription叉头转录因子factorp3（32）WBWesternblotting蛋白质印迹9 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文（33）BLMBleomycin博莱霉素（34）PBSphosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液（35）HEHematoxylin-eosinstaining苏木素-伊红染色（36）HYPHydroxyproline羟脯氨酸（37）ELISAenzymelinked酶联免疫吸附测定immunosorbentassay（38）ODopticaldensity吸光度（39）pHHydrogenionconcentration氢离子浓度指数（40）rmprevolutionsperminute转数/分（41）lMicrolitre微升（42）mlMilliliter毫升（43）lLitre升（44）sSecond秒（45）minMinute分（46）hHour小时（47）dDay天（48）cmCentimeter厘米（49）gMicrogram微克（50）gGram克（51）mgMilligram毫克（52）kgKilogram千克10 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响前言硬皮病又称系统性硬化症(systemicsclerosis,SSc)，是一种侵犯皮肤及内脏器官(肺、消化道、心脏、肾脏等)的自身免疫性疾病。其发病过程包括纤维化、炎症和血管功能障碍[1]。其主要特点是成纤维细胞及胶原纤维增多，大量细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)在皮肤、肺、消化道等组织器官沉积，最终导致组织纤维化及功能异常[2]。常见临床表现为雷诺现象、皮肤变硬增厚等皮肤病变，关节痛和晨僵等肌肉骨骼表现，除此之外还可导致肺、肾等器官的损害[3]。其病因目前尚不清楚，考虑可能与感染、结核、精神神经因素、遗传、环境等因素有关。但目前倾向于胶原异常、血管异常、免疫异常这几个方面[4]。本病目前尚无有效的根治和缓解病情进展的药物，临床可使用的较多，但疗效往往不十分理想或是存有争议。其治疗主要针对免疫、血管及胶原的异常，以抑制炎症、调节免疫、抗纤维化为目标的基础上，使用糖皮质激素、免疫抑制剂、抗纤维化药物及药物对症治疗[5]。T淋巴细胞，是由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中数量最多，功能最复杂的一类细胞，与自身性免疫疾病、慢性炎症等密切相关。其中Th17细胞和Treg细胞是较为重要也是目前研究较多的两个亚群[6]。正常机体内存在有Th17/Treg平衡，其对机体促进或抑制炎症和调节免疫功能有重要的作用。＋Treg细胞又可称为抑制性T细胞，它是在Foxp3调控下的T细胞亚群，具有抑制免疫和炎症的作用，能够分泌TGF-β、IL-10、IL-4。TGF-β、IL-10作为免疫11 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文抑制因子和抗炎因子在Treg细胞中的作用受到广泛关注。硬皮病在中医学中没有相应的病名，根据其临床表现多数医家将其归为中医“痹证”、“皮痹”、“血痹”、“皮萎”、“肺痹”等范畴，认为硬皮病的发生是气血不足、营卫不和、风寒湿邪乘隙侵入，致经络闭塞不通所致。本虚标实是其基本病机，治以扶正祛邪、活血通络[7]。资料分析显示，活血化瘀药是治疗硬皮病的高频药物，贯穿内服外治诸法之中，运用活血化瘀中药能够较好地改善硬皮病患者皮肤硬化等症状，提高患者的生活质量[8]。硬皮病早期发生的血管异常理论，也从微观角度阐述了中医血瘀证的实质，为临床中医药活血化瘀治疗提供了客观依据[9]。活血化瘀药治疗硬皮病，疗效肯定，已受到国内外医学界普遍重视。红花是菊科植物红花的花，红花性味辛、温，入心、肝经，具有活血通经、祛瘀止痛之功效[10]。在历代医书及《本草纲目》中均有详细记载，是中医重要的活血化瘀药，现已被用于治疗冠心病、心绞痛、血脉闭塞、跌打损伤和痛经闭经等。红花的药理机制研究发现，红花具有扩张血管、抗血小板聚集、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用[11]。前期研究已证实红花水煎液能够降低SSc小鼠Th17细胞相关因子RORγt、IL-17和IL-6的表达水平，具有抗SSc纤维化的作用[12,13]。红花是否还可影响TGF-β1、IL-10等Treg细胞相关因子的表达，从而达到改善SSc纤维化的作用有待进一步深入研究。因此，本研究通过博来霉素诱导建立硬皮病小鼠模型，应用红花水煎液灌胃治疗，观察红花干预后硬皮小鼠皮肤、肺组织和血清中TGF-β1、IL-10表达的变化，进一步从免疫炎症的角度探讨红花治疗SSc的作用机制，为中医药抗SSc组织纤维化提供实验依据。12 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文材料1实验材料1.1实验动物128只健康BALB/C小鼠，雌性，清洁级，体质量（20±2）g，由广西医科大学动物实验中心提供，动物生产许可证号：SCXK桂2014—0002。于实验前2天一次性购进，按清洁级标准饲养于安静、恒定温度、恒定湿度的环境中，自由饮水进食。1.2实验药物注射用盐酸博来霉素（日本化药株式会社，生产批号440392），规格15mg（效价）/瓶（以博来霉素计）。醋酸泼尼松片（广东华南药业集团有限公司，产品批号150301）。红花（南宁生源中药饮片有限责任公司，生产批号140901）。所有药物均购于广西医科大学第一附属医院药剂科。1.3实验试剂序号试剂购买公司（1）水合氯醛大连美仑生物（2）硫化钠成都金山（3）磷酸盐缓冲液（PBS）武汉博士德（4）枸橼酸缓冲液武汉博士德（5）甲醛溶液北京索莱宝（6）10%中性树胶福州迈新13 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文（7）无水乙醇、二甲苯成都市科龙化工（8）兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体北京博奥森（9）兔抗鼠IL-10多克隆抗体北京博奥森（10）免疫组化试剂盒SP9001北京中杉金桥（11）DAB显色试剂盒北京中杉金桥（12）苏木素-伊红（HE）染色试剂盒南京建成（13）Masson染色试剂盒南京建成（14）SiriusRed染色试剂盒北京索莱宝（15）VanGieson染色试剂盒北京索莱宝（16）小鼠TGF-β1ELISA检测试剂盒武汉华美（17）小鼠IL-10ELISA检测试剂盒武汉华美1.4实验器材序号实验仪器生产公司（1）组织脱水机德国Leica公司（2）组织包埋机德国Leica公司（3）轮转切片机德国Leica公司（4）全自动电压力锅安徽合肥美的有限公司（5）OLYMPUS四色正置显微镜日本OLYMPUS公司生产（6）数显电热恒温培养箱美国Thermo（7）全自动酶标仪美国Thermo（8）颗粒制冰机日本SANYO公司（9）高压蒸汽灭菌锅中国海尔公司14 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文（10）电热恒温水浴箱上海精宏（11）恒温烤箱上海精宏（12）高速冷冻多用途离心机德国Eppendorf公司（13）pH计德国Sartrious公司（14）电子分析天平德国Eppendorf公司（15）聚赖氨酸防脱载玻片北京中杉金桥（16）1ml无菌注射器浙江灵洋（17）过滤器美国Millipore公司（18）各规格EP管、离心管美国Axygen公司（19）各量程移液器德国Eppendorf公司15 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文方法1实验药物制备1.1博来霉素磷酸盐缓冲液注射用盐酸博来霉素用高压灭菌后的pH=7.2磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，配成200μg/ml的博来霉素磷酸盐缓冲液4℃保存备用。1.2醋酸泼尼松混悬液醋酸泼尼松片用蒸馏水溶解配成0.45mg/ml混悬液4℃保存备用。1.3红花水煎液煎药前用蒸馏水浸泡红花30min，置于不锈钢容器中以中火煎煮30min，使用干净纱布过滤倒出药液，再次加入蒸馏水将药渣煎煮30min后滤出药液。混合两次药液以小火浓缩，使药液质量分数为0.15g/ml，离心后取上清液4℃保存备用。2实验试剂制备2.1磷酸盐缓冲液PBS粉剂一包（3g）完全溶解于2000ml蒸馏水中，制成浓度为0.01mol/l磷酸盐缓冲液，高压灭菌后置于4℃冰箱中保存备用。2.2柠檬酸抗原修复液柠檬酸抗原修复液粉剂一包（3g）完全溶解于2000ml蒸馏水中，制成浓度为0.01mol/L柠檬酸抗原修复液，室温放置保存备用。2.310%硫化钠溶液称取硫化钠10g，完全溶解于100ml生理盐水中，4℃保存备用。16 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文2.410%水合氯醛溶液称取水合氯醛10g完全溶解溶于100ml生理盐水中，锡箔纸包裹后4℃避光保存。2.510%福尔马林溶液量取甲醛溶液10ml于90ml生理盐水中，充分混匀后放于4℃冰箱中避光保存。3实验分组适应性喂养2天后，将128只BALB/C小鼠随机分为4组：空白对照组、模型对照组、醋酸泼尼松组、红花水煎液组，每组32只。4小鼠给药剂量计算根据动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表，60kg成人与20g小鼠折算系数为9.01。体质量60kg成人醋酸泼尼松使用常规剂量为30mg/d，则20g小鼠每日的醋酸泼尼松用量为9.01*(30mg/60kg)*0.02kg=0.09mg。体质量60kg成人的红花常用剂量为10g，则小鼠使用剂量为0.03g/d。5造模及药物干预用电动剃毛刀剔除小鼠背部中央区相同部位被毛，面积大小约1.5cm×1.5cm，使用棉签蘸取10%硫化钠溶液涂于剃毛部位1min左右，用无菌纱布蘸取温水轻轻擦去已脱被毛，自然晾干。根据参考文献[14-16]建立硬皮病小鼠模型。空白对照组用PBS0.1ml背部已脱毛区皮下注射，模型对照组、醋酸泼尼松组和红花水煎液组予博莱霉素磷酸盐缓冲液0.1ml背部皮下注射，4组均为每日1次。造模同时即行药物干预，空白对照组和模型对照组予生理盐水0.2ml灌胃，醋酸泼尼松组予醋酸泼尼松混悬液0.2ml（含醋酸泼尼松17 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文0.09mg）灌胃，红花组予红花水煎液0.2ml（含红花30mg）灌胃，各组小鼠均每日灌胃1次。在第1周、第2周、第3周、第4周分批随机处死各组8只小鼠。6标本采集及处理给药结束后，禁食12h，按0.04ml/20g体质量水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠。麻醉后剪去小鼠眼睛周围睫毛充分暴露眼球，弯镊迅速摘除眼球，收集眼球血于未抗凝管内，室温静置2h，4℃下2000rpm离心15min，吸取上清分装于无菌EP管中，80℃保存，用于ELISA检测；取血后剪取小鼠背部皮肤，面积大小约0.5cm×1cm，以及剖开胸腔采集肺组织，均置于10%福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，切片，用于HE、Masson、SiriusRed、VanGieson染色及IHC检测。7观察指标及检测方法7.1小鼠一般情况观察并记录各组小鼠的一般情况，如精神、进食进水情况、活动灵敏度、皮肤柔软度和硬度、被毛光泽及再生情况等。7.2HE染色方法严格按照染色试剂盒操作说明进行，具体步骤如下：将切片置于55-60℃烤箱中烘烤30min；脱蜡：依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅴ各5min；至水：依次置于100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5min；蒸馏水浸泡2min；蒸馏水湿润玻片60s；核染液染色5min，自来水冲洗5s；浆染液染色30s，增色液冲洗2次；自然晾干后中性树胶封片。18 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文镜下观察结果：采用Olmpus显微镜进行拍照，细胞核呈紫蓝色，胞浆呈红色，红细胞呈桔红色，其他成分呈深浅不同的红色。观察皮肤和肺组织一般形态变化，参考文献[17,18]进行皮肤和肺部炎症评分，计分方法如下：（1）、评0分：无；（2）、评1分：少许；（3）、评2分：轻度；（4）、评3分：中度；（5）、评4分：重度。由两名病理科医生进行盲法阅片完成。7.3Masson染色方法严格按照染色试剂盒操作说明进行，具体步骤如下：将切片置于55-60℃烤箱中烘烤30min；脱蜡：依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅴ各5min；至水：依次置于100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5min；蒸馏水浸泡2min；蒸馏水湿润玻片60s；核染液染色50s，倒丢，冲洗液冲洗30s；浆染液染色20s倒丢，冲洗液冲洗30s；黄色分色液分色8min倒丢；直接用蓝色复染液染色4min，倒丢，用无水乙醇冲洗干净；吹干后，封片，镜检。镜下观察结果：采用Olmpus显微镜进行拍照，胶原纤维呈蓝色，胞浆呈红色，胞核蓝紫色。观察皮肤和肺组织中胶原纤维分布情况。7.4SiriusRed染色方法严格按照染色试剂盒操作说明进行，具体步骤如下：将切片置于55-60℃烤箱中烘烤30min；脱蜡：依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅴ各5min；至水：依次置于100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5min；Weigert铁苏木素染色液染色17min；自来水洗10min，蒸馏水洗一次；天狼星红染色液滴染1h；流水冲洗去除染液；脱水：依次置于70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇梯度脱水各5min；透明：19 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文依次二甲苯Ⅴ、二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ各5min；封片：自然吹干后中性树胶封固。普通光学显微镜下观察染色结果：采用Olmpus显微镜进行拍照，胶原纤维呈红色；细胞核呈蓝色；肌纤维呈黄色。采用美国Image-pro-plus6.0专业图像分析软件进行定量分析，方法是：每个组织随机选取6个大小相等的视野（×200倍），SiriusRed染色阳性表达为红色胶原纤维沉积，计算每个视野中阳性表达面积百分比，并取平均值。7.5VanGieson染色方法严格按照染色试剂盒操作说明进行，具体步骤如下：将切片置于55-60℃烤箱中烘烤30min；脱蜡：依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅴ各5min；至水：依次置于100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5min；用Weigert苏木素染色5min；水洗；酸性分化液分化30s，水洗5min；VG染色液滴染1min，倒丢；95%酒精液分化30s；脱水：依次置于70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇梯度脱水各5min；透明：依次二甲苯Ⅴ、二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ各5min；封片：自然吹干后中性树胶封固。镜下观察结果：采用Olmpus显微镜进行拍照，采用美国Image-pro-plus6.0专业图像分析软件进行定量分析，方法是：每个组织随机选取6个大小相等的视野（×200倍），SiriusRed染色阳性表达为红色胶原纤维沉积，计算每个视野中阳性表达面积百分比，并取平均值。采用Olmpus显微镜进行拍照，胶原纤维呈鲜红色，肌纤维、红细胞呈黄色，细胞核呈蓝色或棕蓝色。观察皮肤和肺组织中胶原纤维分布情况。20 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文7.6免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）对皮肤和肺组织TGF-β1、IL-10表达的分析严格按照生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒（SP9001）操作，具体操作步骤如下：将切片置于55-60℃烤箱中烘烤30min；脱蜡：依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅴ各5min；至水：依次置于100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5min；抗原修复：将切片放入盛有柠檬酸修复液的修复盒中，P-80火力微波加热5min；切片自然冷却至正常室温，PBS冲洗，5min×3次，甩去PBS；使用免疫组化笔在组织周围画圈；灭活内源性过氧化物酶：滴加3%H2O2去离子水，室温孵育10min，PBS冲洗，5min×3次，甩去PBS；封闭：滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育10min，倾倒液体，不洗；滴加一抗：将稀释后的一抗TGF-β1（1:350）、IL-10（1:300），滴加在组织切片上，切片置于免疫组化湿盒中4℃过夜（12-14h）；过夜后从冰箱取出湿盒，室温下复温30min，PBS冲洗5min×3次，甩去PBS；滴加二抗：滴加生物素标记山羊抗兔IgG（二抗），37℃孵育15min，PBS冲洗5min×3次，甩去PBS；滴加辣根酶标记链霉卵白工作液（S-A/HRP），37℃孵育15min，PBS冲洗5min×3次，甩去PBS；DAB显色：滴加DAB显色剂（DAB显色剂：1滴浓缩液滴入1mLDAB底物液中，充分混匀），显微镜下控制显色时间；自来水充分冲洗，蒸馏水冲洗5min×3次；复染：滴加苏木素染色1min，自来水冲洗1min×3次；1%盐酸酒精分化5-10s；返蓝：自来水冲洗10min；脱水：依次置于70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、100%乙醇梯度脱水各5min；透明：依次二甲苯Ⅴ、二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ各5min；封片：自然21 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文吹干后中性树胶封固。采用PBS代替一抗作为阴性对照。染色结果：采用日本Olympus显微镜和美国Image-proplus6.0图像分析软件进行分析，每张切片随机选取6个视野，以细胞质、细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性表达，测定每个视野下染色的平均光密度值。平均光密度值=累积光密度值/阳性面积。7.7酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清中TGF-β1、IL-10的浓度严格按照ELISA说明书操作，步骤如下：(1)室温下解冻血清样本，1000g离心15min，进行下一步检测；(2)将试剂盒放置在室温（18-25℃）平衡30min以上；(3)血清的活化：检测TGF-β1时需对血清样本进行酸化和中和处理，以激活血清中的TGF-β1。移液器移取80ul小鼠血清于离心管中，加入20ulof1NHCL，移液器反复吸打混匀；室温温育10min；移取16ul1.2NNaOH/0.5MHEPES进行中和（PH=7.2-7.6）；反复吸打混匀，立即对活化的血清进行检测。检测IL-10时无需活化血清，忽略此步骤。(4)配制标准品：取标一支标准品于10000rpm离心30s；吸取1ml样本稀释液加入标准品中，反复吸打以助标准品完全溶解，得到标准品S7；取7个1.5ml的离心管，编号分别为S6、S5、S4、S3、S2、S1、S0；吸取250ul样本稀释液于7个离心管中；吸取250ul标准品S7于S6，吸打混匀；从S6中吸取250ul到S5，吸打混匀；从S5中吸取250ul到S4，吸打混匀；从S4中吸取250ul到S3，吸打混匀；从S3中吸取250ul到S2，吸打混匀；从S2中吸取250ul到S1，吸打混匀。(5)加样：分别设标准品孔及其副孔和血清样本孔及其副孔，进行双孔测22 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文定。每孔分别加入标准品或血清100μl，轻晃混匀，酶标板覆上板贴，37℃条件下温育2h。(6)配制生物素标记抗体工作液：酶标板温育时间内，将生物素标记抗体液按1:100倍数用生物素标记抗体稀释液稀释，反复吸打混匀，放置备用；(7)温育2h后，取出酶标板，撕去板贴，甩干，勿洗；(8)每孔加入已配制好的生物素标记抗体工作液100μl，贴上新板贴，37℃条件下温育1h；(9)配制洗涤工作液：温育期间，将浓洗涤液按1:25倍数使用去离子水进行稀释，搅拌混匀，放置备用；(10)配制辣根过氧化物酶标记亲和素工作液：温育期间，将辣根过氧化物酶标记亲和素按1:100倍数使用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释；(11)温育1h后，倾去酶标板孔内液体，甩干，每孔加入200ul洗涤工作液进行洗板，每次浸泡2min，洗板3次，甩干；(12)每孔加入已配制好的辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，贴上新板贴，37℃条件下温育1h；(13)温育1h后，倾去孔内液体，甩干，每孔加入200ul洗涤工作液进行洗板，每次浸泡2min，洗板5次，甩干；(14)依次各孔加入90ul的底物溶液，37℃条件下避光进行显色；(15)当标准品前3-4孔存在明显梯度的蓝色，而后3-4孔蓝色不明显时，依次各孔加入50ul的终止液，使反应终止；(16)终止反应5min内使用酶标仪（设置波长450nm）测量并记录每孔光密度值（即OD值）；23 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文(17)计算血清中TGF-β1、IL-10浓度：使用CurveExpert1.3曲线软件以标准品的浓度为纵坐标，以标准品的OD值为横坐标，制作标准曲线。根据血清中TGF-β1、IL-10的OD值，由标准曲线计算出血清中TGF-β1、IL-10的浓度。8统计学处理所有数据均采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，方差齐性检验后，采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法（方差齐）或Games-Howell法（方差不）进行检验。以P＜0.05为差异有统计学意义24 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文结果1一般情况观察空白对照组小鼠精神状态佳，进食、进水正常，活动灵敏度强，攻击性强，体质量未见明显减轻，背部毛发光泽发亮，再生较快，背部皮肤柔软，易被提起，未见小鼠死亡。模型对照组小鼠第2周开始逐渐出现精神变差，进食、进水减少，活动灵敏度降低，攻击性降低，体质量略减轻，背部毛发几乎无生长，背部皮肤增厚；第3周出现2只小鼠死亡，经解剖考虑可能由于肺纤维化引起。与空白对照组比较，醋酸泼尼松组和红花水煎液组小鼠精神一般，体质量稍减轻，行为灵敏度下降，攻击性降低，背部毛发缓慢生长，皮肤变硬增厚，但２组小鼠身体状况明显好于模型对照组；第2周和第3周醋酸泼尼松组分别出现1只小鼠死亡，考虑灌胃损伤和长期使用激素导致胃粘膜损伤引起；红花水煎液组无小鼠死亡。死亡小鼠已予及时补充。2HE染色结果空白对照组皮肤和肺组织在各个观察时间点无明显变化，皮肤和肺组织结构清晰完整，无或极少炎症细胞浸润。模型对照组第1周皮肤和肺组织有少量的炎症性细胞浸润，肺组织结构开始遭到破坏，少部分肺泡破坏、融合，红细胞渗出，镜下观察肺间隔和真皮增厚不明显；第2周皮肤和肺组织大量炎症细胞浸润，部分肺泡破坏、融合，红细胞渗出加重，出现肺间隔增宽、真皮增厚，汗腺、皮脂腺等皮肤附属器萎缩；第3周皮肤和肺组织炎症浸润程度较前减轻，肺间隔和真皮进一步增厚，肺纤维化明显，附属器进一步萎缩；第4周皮肤和肺组织炎症细胞浸润继续减少，肺泡结构基本消失，肺纤25 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文维化程度严重，真皮厚度继续增加，皮肤附属器严重萎缩、减少甚至消失。与模型对照组比较，第1周醋酸泼尼松组和红花水煎液组镜下观察皮肤和肺组织炎症、纤维化程度及真皮厚度不明显，第2、3、4周镜下观察皮肤和肺组织炎症、纤维化程度及真皮厚度明显减轻。见附图2-1、2-2。3皮肤和肺组织Masson染色、SiriusRed染色、VanGieson染色普通光学显微镜下观察：空白对照组皮肤和肺组织在各个观察时间点未见明显改变，肺组织无或极少胶原纤维增生，皮肤胶原纤维排列整齐。与空白对照组比较，随着建模时间的延长模型对照组肺组织胶原纤维逐渐增多，第4周达到最高峰；第1周皮肤胶原纤维排列紊乱，胶原纤维增生不明显；第2、3、4周皮肤成纤维细胞、胶原纤维逐渐增加，杂乱排列。与模型对照组比较，酸泼尼松组和红花水煎液组皮肤和肺组织胶原纤维及成纤维细胞减少。见附图3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6。4皮肤和肺组织炎症评分空白对照组皮肤和肺组织炎症评分在各个观察点无明显变化（P＞0.05）。第1周模型对照组小鼠皮肤和肺组织炎症评分较空白对照组增加（P<0.05）；第2周炎症评分达到最高峰，第3、4周出现下降，但仍高于空白对照组（P<0.05）。经药物干预后，醋酸泼尼松组和红花水煎液组较模型对照组炎症评分下降（P<0.05）。见表4-1、4-2和图4-1、4-2。26 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文表4-1各组肺组织炎症评分（s）Table4-1Eachgroupoflungtissueinflammationscore（s）组别第1周（n=8）第2周（n=8）第3周（n=8）第4周（n=8）空白对照组0.20±0.070.24±0.110.26±0.090.35±0.08★★★★模型对照组1.31±0.133.55±0.192.75±0.222.58±0.13醋酸泼尼松组0.96±0.16★●3.04±0.14★●2.46±0.13★●2.06±0.12★●红花水煎液组1.06±0.18★●3.11±0.20★●2.51±0.21★●2.08±0.18★●★●注：与空白对照组比较，P<0.05；与模型对照组比较，P<0.05图4-1各组肺组织炎症评分Fig.4-1Eachgroupoflungtissueinflammationscore（s）27 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文表4-2各组皮肤炎症评分（s）Table4-2Eachgroupofskininflammationscore（s）组别第1周（n=8）第2周（n=8）第3周（n=8）第4周（n=8）空白对照组0.25±0.090.26±0.130.27±0.120.32±0.15★★★★模型对照组1.42±0.163.67±0.232.84±0.222.41±0.14醋酸泼尼松组1.05±0.19★●3.12±0.20★●2.53±0.14★●1.96±0.22★●红花水煎液组1.14±0.17★●3.24±0.21★●2.60±0.17★●1.99±0.17★●★●注：与空白对照组比较，P<0.05；与模型对照组比较，P<0.05图4-2各组皮肤炎症评分Fig.4-2Eachgroupofskininflammationscore28 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文5皮肤和肺组织胶原纤维含量变化空白对照组皮肤和肺组织胶原纤维含量未见明显改变（P＞0.05）。模型对照组小鼠皮肤和肺组织胶原纤维含量随着建模时间延长逐渐增加（P<0.05）。经药物干预后醋酸泼尼松组和红花水煎液组皮肤和肺组织胶原纤维含量较模型对照组下降（P<0.05）。见表5-1、5-2和图5-1、5-2。表5-1各组肺组织胶原纤维含量（s）Table5-1Lungtissuecollagenfiberscontentofeachgroup（s）组别第1周（n=8）第2周（n=8）第3周（n=8）第4周（n=8）空白对照组2.01±1.622.15±1.012.37±1.432.55±1.16★★★★模型对照组5.7±1.749.8±2.5116.39±1.8620.28±0.80醋酸泼尼松组3.29±1.42★●5.41±1.36★●8.69±1.19★●10.51±1.58★●红花水煎液组3.35±1.70★●6.39±1.21★●10.92±1.56★●13.90±1.54★●★●注：与空白对照组比较，P<0.05；与模型对照组比较，P<0.05；图5-1各组肺组织胶原纤维含量Fig.5-1Lungtissuecollagenfiberscontentofeachgroup29 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文表5-2各组皮肤胶原纤维含量（±s）Table5-2Skintissuecollagenfiberscontentofeachgroup(±s)组别第1周（n=8）第2周（n=8）第3周（n=8）第4周（n=8）空白对照组3.32±0.783.35±0.613.42±0.823.52±0.73★★★★模型对照组6.04±1.439.85±1.6315.96±1.7221.01±1.20醋酸泼尼松组4.16±0.75●6.55±1.45★●9.610±1.38★●11.59±1.74★●红花水煎液组4.82±0.83★●6.69±1.03★●10.18±1.47★●13.80±1.62★●★●注：与空白对照组比较，P<0.05；与模型对照组比较，P<0.05图5-2各组皮肤胶原纤维含量（±s）Fig.5-2Skintissuecollagenfiberscontentofeachgroup(±s)6皮肤和肺组织中TGF-β1、IL-10表达及比较TGF-β1、IL-10在肺组织血管和气道平滑肌细胞、支气管、细支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、肺间质细胞以及炎症细胞均有表达。在皮肤的表皮基底层细胞、角质形成细胞及汗腺上皮细胞、皮脂腺上皮细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞均有强阳性表达。空白对照组TGF-β1、IL-10在皮肤和肺30 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文组织中呈微弱或阴性表达，模型组TGF-β1、IL-10呈强阳性表达。分析各组平均光密度显示，模型组各时间点肺组织中TGF-β1、IL-10蛋白平均阳性系数显著高于空白对照组（P<0.05）；药物干预组在各个时间点蛋白平均阳性系数低于模型对照组（P<0.05）。见表6-1、6-2、6-3、6-4和图6-1、6-2、6-3、6-4。表6-1各组小鼠肺组织TGF-β1表达（平均光密度值，s）Table6-1LungtissueTGF-β1expressionofeachgroup（meandensity，s）组别第1周（n=8）第2周（n=8）第3周（n=8）第4周（n=8）空白对照组0.02±0.000.03±0.010.05±0.010.04±0.01★★★★模型对照组0.18±0.010.25±0.020.42±0.070.51±0.05醋酸泼尼松组0.07±0.01★●0.14±0.03★●0.21±0.06★●0.29±0.07★●红花水煎液组0.12±0.02★●0.17±0.02★●0.25±0.05★●0.31±0.04★●★●注：与空白组比较，P<0.05；与模型组比较，P<0.05图6-1各组小鼠肺组织TGF-β1表达Fig.6-1LungtissueTGF-β1expressionofeachgroup31 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文表6-2各组小鼠肺组织IL-10表达（平均光密度值，s）Table6-2LungtissueIL-10expressionofeachgroup（meandensity，s）组别第1周（n=8）第2周（n=8）第3周（n=8）第4周（n=8）空白对照组0.01±0.000.02±0.010.03±0.010.03±0.01★★★★模型对照组0.14±0.010.19±0.020.28±0.030.36±0.03醋酸泼尼松组0.06±0.00★●0.11±0.01★●0.19±0.02★●0.25±0.04★●红花水煎液组0.09±0.01★●0.13±0.02★●0.23±0.02★●0.27±0.03★●★●注：与空白组比较，P<0.05；与模型组比较，P<0.05图6-2各组小鼠肺组织IL-10表达Fig.6-2LungtissueIL-10expressionofeachgroup32 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文表6-3各组皮肤小鼠TGF-β1表达（平均光密度值，s）Table6-3SkintissueTGF-β1expressionofeachgroup（meandensity，s）组别第1周（n=8）第2周（n=8）第3周（n=8）第4周（n=8）空白对照组0.11±0.010.09±0.020.13±0.010.13±0.03★★★★模型对照组0.23±0.030.37±0.050.55±0.090.67±0.05醋酸泼尼松组0.16±0.05★●0.22±0.03★●0.34±0.07★●0.42±0.08★●红花水煎液组0.19±0.04★●0.30±0.02★●0.38±0.07★●0.49±0.06★●★●注：与空白组比较，P<0.05；与模型组比较，P<0.05图6-3各组皮肤小鼠TGF-β1表达（平均光密度值，s）Fig.6-3SkintissueTGF-β1expressionofeachgroup（meandensity，s）33 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文表6-4各组小鼠皮肤IL-10表达（平均光密度值，s）Table6-4SkinIL-10expressionofeachgroup（meandensity，s）组别第1周（n=8）第2周（n=8）第3周（n=8）第4周（n=8）空白对照组0.07±0.020.05±0.000.08±0.030.06±0.03★★★★模型对照组0.21±0.020.28±0.030.49±0.020.61±0.06醋酸泼尼松组0.12±0.01★●0.16±0.02★●0.38±0.03★●0.43±0.04★●红花水煎液组0.17±0.02★●0.19±0.04★●0.36±0.02★●0.49±0.04★●★●注：与空白组比较，P<0.05；与模型组比较，P<0.05图6-4各组小鼠皮肤IL-10表达Fig.6-4SkinIL-10expressionofeachgroup7血清中TGF-β1、IL-10表达变化及比较空白对照组血清中TGF-β1、IL-10表达水平未见明显改变（P＞0.05）。模型对照组小鼠血清中TGF-β1、IL-10含量随着建模时间延长逐渐增加（P<0.05）。经药物干预后醋酸泼尼松组和红花水煎液组TGF-β1、IL-10较模型对照组下降（P<0.05）。见表7-1、7-2和图7-1、7-2。34 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文表7-1各组血清中TGF-β1表达（ng/ml，s）Table7-1ExpressofTGF-Β1inserumofeachgroup（ng/ml，s）组别第1周（n=8）第2周（n=8）第3周（n=8）第4周（n=8）空白对照组4.62±0.934.71±1.545.45±2.205.3±1.38★★★★模型对照组9.70±1.4513.32±2.4322.96±3.0537.75±7.21醋酸泼尼松组7.38±1.08★●10.60±1.66★●16.79±3.09★●25.2±6.62★●红花水煎液组7.98±1.22★●11.26±2.10★●19.06±1.74★●26.00±8.39★●★●注：与空白对照组比较，P<0.05；与模型对照组比较，P<0.05图7-1各组血清中TGF-β1表达Fig.7-1ExpressofTGF-Β1inserumofeachgroup（ng/ml，s）35 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文表7-2各组小鼠血清中IL-10表达（pg/ml，s）Table7-2ExpressofIL-10inserumofeachgroup（pg/ml，s）组别第1周（n=8）第2周（n=8）第3周（n=8）第4周（n=8）空白对照组92.30±30.68101.39±46.9685.34±24.63101.61±33.72★★★★模型对照组197.53±17.86263.61±20.87515.81±33.15716.28±56.63醋酸泼尼松组142.65±36.65★●217.88±20.95★●472.19±41.37★●512.98±42.35★●红花水煎液组155.61±30.81★●238.98±24.96★●479.81±39.52★●610.62±52.15★●★●注：与空白对照组比较，P<0.05；与模型对照组比较，P<0.05图7-2各组小鼠血清中IL-10表达（pg/ml，s）Fig.7-2ExpressofIL-10inserumofeachgroup（pg/ml，s）36 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文讨论1组织纤维化检测方法应用与体会胶原是一种结构蛋白质，是ECM中的主要组分。根据其结构功能，分为成纤维胶原和非成纤维胶原，其中成纤维胶原包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原[19]。胶原含量的测定及胶原类型的确定对组织病理变化和纤维化程度的判断具有重要的指导意义。临床和动物实验研究中评价组织纤维化常用的方法有HE染色、组织化学染色法、IHC、HYP测定。胶原纤维染色方法多种多样，染色步骤繁简不一，染色效果受多种因素影响，因此选择合适的染色方法对实验研究有重要帮助。HE染色法，是显示组织病理变化最简单、最基本的方法，在组织学、病理学、胚胎学及科研中最常用的染色方法。本实验HE染色将肺和皮肤中的细胞浆、肌纤维、胶原纤维等染成不同程度的红色，红细胞则呈橙红色。通过HE染色后镜下观察空白对照组皮肤和肺组织结果基本完整，染色较为均一，肺组织中红细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞呈红色，气管、支气管呈紫蓝色；皮肤中表皮、毛囊、皮脂腺、汗腺、炎症细胞呈蓝色，真皮胶原纤维和肌纤维呈红色，肌纤维红色较深。各建模组肺组织肺泡结构随着造模时间延长，红色逐渐加深，可初略代表胶原纤维含量增多；炎症细胞较小，呈蓝色圆形或椭圆形颗粒，第1周蓝色细小颗粒较少，第2周可见皮肤和肺组织大部分视野均见蓝色颗粒，而在第3、4周呈局部下降趋势；胶原纤维呈梭性，空白对照组真皮层胶原纤维形态规则、排列整齐，建模组第1周红色胶原纤维卷曲，形态发生一定变化，而在继续建模过程中，红色梭性胶原不仅在形态学上发生了异常，而且数量逐步增加，因此我们认为皮肤真皮胶原纤维呈逐步增多趋势，尽管其颜色在各个观察点深浅变化无明显差异。同时，37 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文在每周不同组别中发现，第1周红色胶原纤维、蓝色炎症细胞在皮肤和肺组织中的颜色及数量变化不明显，这也为病理医师进行炎症评分带来了不便，而在第2、3、4周我们可明显看到模型对照组胶原纤维和炎症细胞增多，以及药物干预后的差异变化。HE染色仅能显示一般的组织病理改变，不能显示特异的组织成分、化学物质等，胶原纤维在HE染色呈均一的粉红色，与周围间质分界不明显，而网状纤维使用HE染色不能着色[20]，无法准确判断胶原纤维的分布及测定胶原纤维的含量，适用于显示皮肤和肺组织一般形态学变化。若要进行胶原纤维定性和定量分析，则需在HE染色的基础上使用其他方法。HE染色步骤虽然简单，但也会出现染色过深或过浅，细胞核和细胞浆颜色对比不明显、染色杂质等情况出现。进行组织固定时应使用10%的福尔马林浓度，且稍高于以上浓度更利于组织固定，反之，配制福尔马林浓度过低影响组织固定。由于早期取材时肺组织容易漂浮于福尔马林上方，并未完全浸入，可采取棉团填塞使组织沉于液体中。固定时间过长容易使甲醛氧化甲酸，液体酸性增加导致胞核不易着色，胞浆染色加深，此时可在甲醛溶液中加入碳酸镁或碳酸钠进行中和[21]。在进行脱蜡时要严格掌握脱蜡时间和二甲苯温度，脱蜡时间宁长勿短，在室温较低的情况下，建议对二甲苯进行预热后脱蜡，使蜡完全脱干净。进行盐酸酒精分化应先进行预实验，把握时间，就本实验而言，肺组织结构疏松，3-5秒即可，而皮肤组织不同，分化时间常延长至10秒以上。Masson染色、SiriusRed染色、VanGieson染色是动物试验中较为常见的胶原组织化学染色方法。Masson染色是显示组织中胶原纤维最常用的方法，其原理是将多种分子大小不同的阴离子染料混合，根据组织渗透性可选择阴38 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文离子同时或先后作用不同组织成分并染色。它能够将胶原纤维、软骨、粘液染成蓝色，胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质染成红色，胞核染成紫蓝色。作为经典的胶原纤维染色方法，此法应用十分广泛，在病理诊断、临床和基础研究工作中均具有重要的价值，对炎症[22]、纤维化[23]、肿瘤[24]、神经损伤[25]、骨损伤[26]等疾病均有辅助判断作用，但目前在纤维化疾病应用最多见。本实验中我们进行了Masson染色，染色后的皮肤和肺组织色彩丰富，对比度明显，可准确观察胶原纤维分布、排列，而且可利用图像分析软件对皮肤和肺组织中的胶原纤维进行半定量分析，其优势比HE染色明显。但该方法操作步骤相对复杂、染色时间不易控制、染色条件苛刻，对肺组织染色存在染色不足或过染情况。同时也发现同一批次甚至同张组织玻片存在染色不均情况。因此容易造成胶原纤维假阳性的存在，影响整个实验结果。在对组织进行合适固定保存、切片、脱蜡等操作步骤的基础上，往往仍需多次摸索染色时间，才能达到最佳染色效果，影响了实验进度，降低了效率。SiriusRed属于酸性染料，可与胶原中的碱性基团相结合而染色。胶原纤维在普通光学显微镜下被染成红色，胞核呈蓝色。本实验结果显示，皮肤和肺组织胶原纤维呈红色，在各个时间点空白对照组红色胶原纤维数量无差别，而随着建模时间的延长建模组胶原纤维含量逐步增加，明显高于空白对照组。虽然仅在镜下观察尚不能对第1周各组小鼠胶原纤维进行比较，但通过定量分析发现模型对照组胶原纤维仍高于空白对照组，而药物干预后低于模型对照组。SiriusRed染色后皮肤和肺组织胶原纤维分布与Masson染色大致相同，同时由于SiriusRed染色只含有红蓝两种颜色，色彩较Masson染色更为简单，红色胶原纤维更为明显，有利于对胶原纤维的快速识别，在利用图像分析软39 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文件对胶原纤维含量进行测定时相对于Masson染色快捷方便。SiriusRed染色步骤较简单，染色条件和时间较易控制，因此，我们认为在显示SSc皮肤和肺组织胶原纤维较Masson染色更有优势，也有研究者报道SiriusRed在评价心肌[27]、肾脏纤维化[28]效果较Masson更好。SiriusRed染色后的组织不仅可在普通光学显微镜下观察组织结构形态变化、胶原纤维分布及定量分析，还可在偏光显微镜下进行胶原纤维分型和定量。胶原纤维有正的单轴双折光性的属性，与天狼星红复合染色液结合后，可增强双折射，提高分辨率，因此在偏振光镜检下可区分Ⅰ、Ⅲ型胶原[29,30]。SiriusRed能够较高程度地与胶原蛋白进行特异性结合，其他常见的蛋白质对结果干扰不大[31]。HYP是一种在胶原中含量较多的非必须氨基酸，在正常胶原蛋白中的含量约为13.4％，在弹性蛋白中含量极少，其它蛋白则不存在HYP。因此，不同组织中的HYP含量可作为衡量其胶原代谢的重要指标[32]。测定HYP的含量能确定组织中胶原的含量，能较客观地反映组织纤维化程度及抗纤维化药物治疗效果。课题组前期通过检测SSc小鼠皮肤和肺组织中HYP含量发现[12]，第4周模型对照组HYP含量较空白对照组升高，而经红花水煎液灌胃治疗后，皮肤和肺组织中HYP含量下降明显，其实验结果与Masson染色、SiriusRed染色相符，也与既往报道相似[33]。王少霞等[34]同时利用SiriusRed染色图像分析和HYP测定，对两种肺纤维化小鼠肺组织中胶原表达进行了定量分析，结果发现SiriusRed染色更具定位优势，可以选择不含血管和气管、支气管的视野，而HYP测定是在将整个肺组织完全裂解后进行，其含量大部分是血管和气管支气管的产物，尽管两种胶原定量方法所得的实验数据有一致性，但SiriusRed染色呈现出的差异更明显。徐婷婷等[35]对实验性大鼠肝纤维化肝组织进行了HYP测定40 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文和SiriusRed染色图像分析，进一步利用偏光显微镜对SiriusRed染色肝组织中I、Ⅲ型胶原含量及其胶原比进行了分析，证实了SiriusRed染色胶原分型和定量较HYP检测更有优势。在实验过程中我们还发现，SiriusRed染色法灵敏度高，受干扰少，与传统的HYP法相比，SiriusRed染色法无需对皮肤和肺组织进行裂解，操作步骤简单，对于初学者容易上手，具有简便、省时等优点。VanGieson是一种古老的结缔组织染色方法，可用于区分胶原纤维和肌纤维，鉴别组织器官的缺失、硬化等。其染色原理主要是根据各种染料对不同组织的渗透和吸附作用的强弱不同，而将各种组织染成相应的颜色[36]。本实验皮肤和肺组织经VanGieson染色，胶原纤维呈鲜红色，肌纤维、红细胞呈黄色，细胞核呈蓝色或棕蓝色。VanGieson染色后显示胶原纤维分布及含量与Masson染色无差异[37]。有报道认为此法操作更为简单，在显示咽部神经时，其清晰度不如Masson染色[38]。与Masson染色、SiriusRed染色比较，VanGieson染色具有对比度差，胶原纤维易褪色等缺点，不利于长期保存，需及时拍照[39]，而Masson染色、SiriusRed染色往往经过较长时间才出现褪色。IHC染色是将免疫学与组织化学染色结合起来，在抗体上结合荧光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应，检测细胞或组织中是否有目标抗原的存在，此方式不只可以用来测知抗原的表现量也可观察抗原所表现的位置。利用IHC可进行胶原的组织或细胞定位，胶原含量的定量分析，应用较为广泛。课题组前期利用IHC对SSc皮肤COL－Ⅰ、COL－Ⅲ的含量表达水平进行了检测，结果显示SSc皮肤COL－Ⅰ、COL－Ⅲ表达明显高于正常组小鼠，而经过不同浓度的红花水煎液进行干预后，皮肤COL－Ⅰ、COL－Ⅲ表达水平出现显著下降，证实了红花水煎液具有抗SSc皮肤纤维化的作用[40]。如上所述的各种染色方法及HYP检测均无法对胶41 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文原纤维定型，IHC染色可对COL－Ⅰ、COL－Ⅲ进行定型定量分析，但不能在同一张组织切片上显示COL－Ⅰ、COL－Ⅲ，因此，无法计算COL－Ⅰ、COL－Ⅲ的比值。同时，IHC染色是一个操作复杂、干扰因素较多的实验技术，实验结果易受影响，且费用较贵[41,42]。相较而言，SiriusRed染色法在普通显微镜下可显示胶原纤维，偏光显微镜下可同时显示COL－Ⅰ、COL－Ⅲ，结合图像分析软件还可计算COL－Ⅰ、COL－Ⅲ的面积及其比值，较单纯测定COL－Ⅰ和或COL－Ⅲ含量更能反映组织胶原纤维动态变化情况。综上所述，选择合适的方法评价SSc组织纤维化至关重要。HE染色是最基本的染色方法，能够反映皮肤和肺组织一般病理改变。Masson染色、SiriusRed染色、VanGieson染色、HYP、IHC染色均能进行胶原纤维定量分析，三种组织化学染色方法比较中SiriusRed染色最具优势，可作为首选。因此我们建议，评价SSc组织纤维化时，可在HE染色基础上进行SiriusRed和IHC染色，若条件许可，可加用其他胶原检测方法能更好地反映组织纤维化。2活血化瘀类中药在SSc的应用SSc属于中医学痹证范畴。痹证是因风寒湿热侵袭，闭阻经络，气血运行不畅，导致肢体关节、筋骨、肌肉等处疼痛、重着、酸楚、麻木及活动障碍等症状的一种病证。大量中医文献对痹证病因病机进行了探讨。痹证又称痹，最早见于《黄帝内经》，《素问·内经》云：“所谓痹者，各以其时，重感于风寒湿之气也”，认为痹证外因由于风、寒、湿侵袭为主。《诸病源候论·风病·风湿痹候》曰：“由血气虚，则受风湿”，认为痹证内因是由于正气不足，卫外不固所致。《济生方·痹》亦曰：“皆因体虚，腠理空疏，受风寒湿气而成痹也”。《三因极一病证方论·痹叙论》：“夫风寒湿三气杂至，合而为痹，虽曰合痹，其用各殊。风胜为行痹，寒胜为痛痹，湿胜为着痹。……大抵痹之为病，寒多则痛，风多则行，湿多则着。在骨则重而不举，在脉则血凝不流，在筋则屈而不伸，在肉则不仁，在皮则寒，逢寒则急，逢热则纵。”除了指出42 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文痹证是由风寒湿所致，进一步概括了痹证的临床和病理特点。《症因脉治·热痹》：“热痹之因，阴血不足，阳气偏旺，偶因热极见寒，风寒外束。内经云：炅气相薄，则脉满而痛。此热痹之所由生也。”认为热痹经久不愈，气血运行不畅，经络不通，不通则痛，其为病理变化。《丹溪心法》认为“风湿与痰饮流注经络而痛”，丰富了痹证的病机理论。外邪可由经络而累及脏腑，“故骨痹不已，复感于邪，内舍于肾；筋痹不已，复感于邪，内舍于肝；脉痹不已，复感于邪，内舍于心；肌痹不已，复感于邪，内舍于脾；皮痹不已，复感于邪，内舍于肺。”近年来中医研究者对SSc的病因病机进一步研究，提出了不同观点。张秉新[43]认为SSc的病机是本虚标实，以心、脾、肾阳虚为本，气滞、痰凝、血瘀为标，阳虚、气滞导致痰饮内停、气血运行不畅形成痰、瘀，痰瘀互结，久之损害脏腑，形成SSc，治以扶助正气、活血化瘀。白郡符[44]认为本病的根源在虚，正气不足则外邪入侵，闭阻经络，气血不畅，肌肤失养而获病，将其辩证为脾肾阳虚、气血不足、肝肾阴虚三型，脾肾阳虚型予温阳通络、补肾健脾，气血不足型治以以补气养血、通经活络，散寒除湿，肝肾阴虚型治以养阴清热，活血通络。范永升[45]认为SSc的内因是虚，外因是外感六淫、饮食不节等因素，“痰阻血瘀”是重要的病机。虽然SSc症状较多，涉及五脏六腑、皮肤、肌肉等，宜从肺论治，治以补肺益气，参以活血化瘀药物。艾儒棣[46]认为SSc是因体虚感邪，瘀毒阻络。病位在肺，其本在肾，瘀阻为标。治以开肺窍，活血脉，温肾阳。由此可见，本虚标实是其基本病机，硬皮病的治疗均以扶正（或补气、或补血，或补脾、或补肾，或温肾、或补肺等）祛邪（行气、化痰、除湿、散寒等）为主，兼以活血通络。课题组前期研究表明[8]，无论内服还是外治，活血化瘀类中药均是治疗SSc使用频率极高的一类药物，其中以红花、丹参、川芎为突出代表。活血化瘀药如红花、丹参、桃仁等有扩张血管、调节免疫、43 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文抑制成纤维细胞增殖、分解胶原等作用，可改善SSc的皮肤硬化症状[47]。免疫异常、胶原异常、血管病变等导致SSc发病因素均反映在血瘀证的病理实质中，为活血化瘀药治疗SSc提供了理论支持，且活血化瘀药治疗SSc是行之有效的[48]。红花是临床常用的活血化瘀中药之一，其药理作用广泛。本实验研究结果表明：模型对照组小鼠精神、饮食变差，体质量出现下降，行为灵敏度和攻击性下降，被毛缓慢几乎无生长，皮肤明显变厚变硬，而经红花水煎液干预后上述情况明显得到改善，表明红花具有改善SSc病情的作用。3阳性对照药物及其浓度的选择依据SSc的治疗尚无特殊治疗药物，糖皮质激素、免疫抑制剂和抗纤维化药物较为常用。糖皮质激素(glucocorticoid,GCS)是目前治疗SSc最具性价比的药物，通常对常对于早期的皮肤病变、炎症期的间质性肺病、关节痛、肌肉病变及浆膜炎有一定疗效。泼尼松治疗SSc常用剂量为30~40mg／d，连用数周后，根据病情逐渐减减量，并以5～10mg／d维持治疗[49]。GCS具有抗炎作用和免疫调节，对缓解SSc组织纤维化过程具有重要作用。GCS抗炎作用广泛，在整个炎症发展过程中，均发挥重要作用。SSc早期以炎症为主，晚期以纤维化为主。在炎症早期，GCS可以通过诱导IL-10、血管紧张素转化酶、皮脂素等抗炎因子合成，抑制IL-6、IL-27等炎症因子的合成、血管收缩及炎症细胞的聚集，从而减轻炎症；在炎症晚期，GCS可以抑制血管和纤维母细胞增生，从而改善纤维化。同时GCS可在基因转录水平抑制TGF-β1等细胞因子的表达，有一定的抗纤维化作用。GCS可以抑制巨噬细胞的抗原提呈作用，促进淋巴细胞的破坏，而具有免疫抑制作用。由于糖皮质激素的免疫抑制和强大的抗炎作用，且作为治疗SSc公认的一线药物，本实验选用醋酸泼尼松作为阳性对照药物，并以符合人常用口服剂44 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文量30mg／d进行换算对小鼠灌胃治疗，以客观说明红花治疗SSc是否具有有效性。本实验结果显示：与模型对照组比较，经醋酸泼尼松和红花水煎液干预后，小鼠一般情况明显改善，炎症和纤维化下降，皮肤和肺组织及血清中TGF-β1、IL-10表达减少，表明醋酸泼尼松和红花均可影响TGF-β1、IL-10，抑制炎症，具有抗SSc组织纤维化作用，证实了选择醋酸泼尼松作为阳性对照药物的正确性。本实验中醋酸泼尼松在各个时间点治疗效果略优于红花水煎液，可能由于泼尼松具有强大的抗炎和调节免疫作用。4硬皮病小鼠TGF-β1、IL-10的表达及红花水煎液干预的影响初始CD4+T淋巴细胞活化后可分化为不同亚型的T淋巴细胞，主要分为以下几种：Th1型、Th2型、Th17型及Treg型。有研究者认为Th17/Treg失衡是导致自身免疫性疾病和炎症发生的重要因素之一[50]。Th17细胞是一种在ROR-γt调控下特异的分泌IL-17的T细胞亚群。Th17细胞除了分泌IL-17外，还可分泌IL-21、IL-22等细胞因子。IL-17是Th17细胞的标志性细胞因子，具有较强促炎作用的促炎因子，在SSc[51]、系统性红斑狼疮（systemiclupuserythematosus,SLE）[52]、多发性硬化[53]、类风湿关节炎（rheumatoidarthritis,RA）[54]等自身免疫性疾病中均有高表达水平。除了Th17，Treg及其相关因子在SLE[55]、RA[56]、干燥综合征[57]、SSc[58]等亦存在异常表达，因此认为Treg细胞与免疫异常、纤维化等有关。TGF-β1、IL-10是Treg细胞分泌的主要因子，Treg细胞主要通过这两种细胞因子发挥作用。TGF-β1属于免疫抑制因子和抗炎因子，同时也是最重要的促纤维化因子。IL-10是一种多细胞源、多功能的细胞因子，调节细胞的生长与分化，参与炎性反应和免疫反应，是目前公认的炎症与免疫抑制因子。TGF-β1、IL-10具有多种生物学效应，主要包括与免疫和炎症、纤维化和肿瘤有关[59]，两者在SSc组织纤维化进程中具有重要作用[60]。为证实TGF-β1、IL-10与SSc发病关系，研究者利用不同实验方法从不同角度45 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文进行了分析。赵会平等[61]采用IHC法对SSc患者皮损中TGF-β1的表达水平进行了检测，结果显示SSc皮损中TGF-β1的表达强度均高于正常人，提示TGF-β1在SSc发病机制可能存在作用。有研究者[62,63]采取上述方法进行类似的临床研究，发现SSc患者皮肤的TGF-β1蛋白表达量升高，进一步从蛋白表达水平证实了TGF-β1与SSc发病存在一定关系。张丽霞等[64]发现例硬皮病皮损组织成纤维细胞中TGF-β1的表达高于正常皮肤组织，提示TGF-β1可能参与了SSc皮肤纤维化的过程。毛越苹等[65]将SSc患者皮肤成纤维细胞(hsFb)进行了体外培养，样本碱水解法和ELISA法检测hsFb上清液TGF-β1含量较正常人成纤维细胞高，从体外实验角度证明了TGF-β1对SSc患者皮肤纤维化起到重要作用。杜小京等[66]利用ELISA方法检测SSc患者血浆TGF-β1水平，其表达水平高于正常人。罗睛莹等[67]采用同样方法对SSc患者血清中TGF-β1水平，其表达水平较正常人明显升高，与杜小京的研究结果相符，表明TGF-β1与SSc致病密切相关。研究者[68]同样在SSc患者血浆中检测到高水平的IL-10，而且发现其与肺纤维化程度显著相关。AravenaO等[69]发现，SSc患者IL-10+B细胞水平较正常组高，表示IL-10与SSc相关。本实验通过博来霉素诱导建立硬皮病小鼠模型，观察小鼠皮肤和肺组织纤维化以及TGF-β1、IL-10的表达变化，结果显示：（1）与空白对照组比较，在建模第1周和第2周，模型对照组出现组织炎症并在第2周达到高峰，组织和血清中的TGF-β1和IL-10、胶原纤维并未显著上升。说明机体处于稳定状态时，存在Th17/Treg平衡，此时免疫系统所产生的TGF-β1抑制着T的增殖，维持诱导初始CD4+T淋巴细胞活化成Treg细胞，从而维持机体的免疫耐受[70]；同时在博来霉素刺激下，免疫细胞被激活，IL-6大量产生，并与Treg细胞分泌的TGF-β1协同作用诱导CD4+T细胞向Th17细胞的分化水平升高，向Treg细胞分化水平降低，并使Treg细胞向Th17细胞转化[71]。由于Th17/Treg平衡向Th17细胞倾斜，Th17细胞除了分泌产生大量IL-17外，46 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文还可以分泌IL-21、IL-22等细胞因子[72]，加重炎症反应并使炎症达到高峰。急性刺激下Treg细胞虽然有所上升，但相对Th17细胞大量增加而言其抑制功能是下降的，因此其分泌的细胞因子TGF-β1和IL-10水平虽有所上升，但上升速度并不明显。而另一方面TGF-β1作为炎症趋化因子，不仅可使巨噬细胞、单核细胞等炎症细胞聚集，还可活化炎症细胞，扩大炎症反应[73]。（2）在建模第3周和第4周，模型对照组小鼠组织炎症逐渐减轻，此时TGF-β1和IL-10上升最为明显，胶原纤维显著增多。巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞大量分泌TGF-β1，TGF-β1可激活成纤维细胞，趋化成纤维细胞聚集，可使炎症向淋巴细胞转移，在合适的微环境下促进炎症的消退[74]，此时成纤维细胞占主导作用[75]。成纤维细胞产生更多的TGF-β1，TGF-β1可刺激胶成纤维细胞合成大量胶原纤维。而IL-10为对抗TGF-β促进胶原产生的作用，引起相反的变化[76,77]；另一方面，IL-10通过抑制抗原提呈，有效抑制IL-12的产生，除此外，IL-10对其他炎症细胞也具有较强的抑制作用，可抑制单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及嗜酸粒细胞产生炎症因子和趋化因子[78]。因此可见IL-10伴随TGF-β1升高，通过对抗机体免疫功能亢进而造成进一步的组织损伤，发挥其保护性因子的作用。红花是一种传统活血化瘀中药，课题组前期研究证实低中高浓度红花水煎液对SSc纤维化均有改善作用，中剂量组为本实验的最佳干预剂量[79]。因此我们选择中等浓度（以红花人常用量10g为基线剂量折算）的红花水煎液进行干预研究。结果发现：与模型对照组比较，醋酸泼尼松组和红花水煎液组在各个时间点炎症程度、TGF-β1和IL-10及胶原纤维含量均明显下降，这与以往报道一致[80]。红花可通过多个途径在多个部位发挥抗炎、抗纤维化作用[81,82]。红花能下调CD4+T的免疫应答，纠正免疫紊乱[83]，影响Th17、Th17/Treg细胞水平[84]，降低Th17细胞分泌的IL-17以及IL-6的水平[13]，从而使炎症减轻，组织纤维化程度减轻。此时，作为抑炎因子，TGF-β1和IL-10可能随着炎症47 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文的下降而出现下降，调节Th17/Treg动态平衡。而TGF-β1的下降可使SSc小鼠组织HYP表达水平下降[85]，减少成纤维细胞向肌成纤维细胞转化[86]，使I、III型胶原蛋白含量的下降[87,88]，这可能是红花通过调节TGF-β1使胶原纤维化减少抗组织纤维化的进一步机制。因此，我们认为红花可以通过直接抗炎、调节免疫而达到抗组织纤维化作用。48 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文结论1.在博来霉素诱导的硬皮病小鼠皮肤和肺组织中存在TGF-β1、IL-10表达升高。2.红花水煎液可能通过降低TGF-β1、IL-10的表达水平，减轻免疫炎症，缓解硬皮病组织纤维化的进程。49 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文参考文献[1]雷霞,伍津津.系统性硬皮病治疗的研究进展.国外医学皮肤性病学分册,2003,29(03):138-140[2]肖桂林,张莉,姜薇.系统性硬皮病组织纤维化的研究进展[J].青海医药杂志,2006,36(02):60-62.[3]罗涛.系统性硬化病治疗述要[J].河南中医,2012,32(5):545-548.[4]楚海燕，吴文育，屠文震，等.硬皮病及其在不同人群中遗传因素的差异[J].复旦学报(医学版),2011,28(3):257-264.[5]Eastaff-LeungN，MabarrackN，BarbourA，etal．Foxp3+regula-toryTcells，Th17effectorcells，andcytokineenvironmentinin-flammatoryboweldisease［J］．JClinImmunol，2010，30(1):80[6]王维维,沈茜.Th17细胞和Treg细胞的细胞因子调节网络[J].生命的化学,2010(2):269-273.[7]胡心愿.硬皮病中医辨证施治[J].中国中医药现代远程教育,2010,08(13):126-127.[8]杨欢欢,吕军影.中药治疗硬皮病的文献分析[J].风湿病与关节炎,2013,2(3):36-37.[9]赵党生,王凤仪.硬皮病血瘀证机制研究述评[J].中医研究,2011,24(2):4-6.[10]中国药典[S].2010年版,一部,141.[11]陈梦，赵丕文，孙艳玲，等.红花及其主要成分的药理作用研究进展[J].2012，5（7）：556-560.[12]梁娟,祁承林,胡谋波,等.红花水煎液对系统性硬皮病小鼠皮肤及肺组织纤维化的影响及机制[J].山东医药,2016,56(12):16-19.50 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红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文综述中药红花抗纤维化机制研究进展【摘要】红花为活血化瘀的经典中药之一，在历代医书及《本草纲目》中均有记载，常用于冠心病、心绞痛、血脉闭塞、跌打损伤和痛经闭经等疾病。目前，国内外学者对红花及其主要成分进行现代药理学研究发现,红花具有抗心脑血管疾病、抗炎、抗肿瘤、抗纤维化等多种作用,但是其抗纤维化作用的机制尚有待深入研究。本文查阅了近10年来的动物实验和临床实验研究文献，从皮肤、肝脏、肾脏、肺四个组织器官对红花抗纤维化的可能机制进行系统综述，为其深入研究提供参考。红花（carthamustinctoriusL）又称草红花或刺红花，是一年生或两年生菊科植物，性味辛、温，入心、肝经，具有活血通经、祛瘀止痛之功效。在历代医书及《本草纲目》中均有详细记载，是中医重要的活血化瘀药，现已被用于[1]治疗冠心病、心绞痛、血脉闭塞、跌打损伤和痛经闭经等。研究结果表明，红花主要有效成分为羟基红花黄色素A(hydroxysaffloryellowA，HSYA)、红花黄色素(saffloryellow，SY)、红花多糖(safflowerpolysacaccharides，SPS)。[2]药理研究结果证明，红花具有抗心脑血管疾病、抗炎、抗肿瘤等多种作用。但其抗纤维化机制研究相对较少，本文拟对其抗纤维化的可能机制进行综述。1抗皮肤纤维化作用皮肤纤维化形成的直接缔造者是真皮中的成纤维细胞，成纤维细胞具有增殖、合成细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)、释放降解ECM的蛋白酶、与58 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文ECM相互作用等多种生物学功能，在结缔组织的形成和重塑方面起重要作用。[3]胶原是导致皮肤纤维化ECM最主要的成分，杨欢欢等研究发现红花水煎液对博来霉素诱导的硬皮病小鼠皮肤I型胶原（COL-Ⅰ）、Ⅲ型胶原（COL-Ⅲ）的表达有较强的抑制作用，而未进行药物干预的硬皮病小鼠真皮层明显增厚，纤维结缔组织排列紊乱，纤维明显增粗、膨大，数量增多，COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的表达增多，提示降低皮肤COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的表达是其抗纤维化的机制之[4]一。刘燕等报道，在体外实验中，红花注射液促使增生性瘢痕的成纤维细胞密度降低及COL-Ⅰ/COL-Ⅲ比值下调，有利于增生性瘢痕的软化变薄和增生性瘢痕组织的顺应性增加。均提示其在抗皮肤纤维化的治疗中具有重要价值。血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）是一种内皮细胞的特殊生长因子，血小板衍生性生长因子（PDGF）家族成员之一，可[5]促进内皮细胞存活、增殖、分化，增加血管通透性，促进新生血管生成。其[6]与皮肤纤维化的发生也有相关性。有实验证明，在博来霉素诱导的硬皮病小鼠模型中，使用不同剂量的红花水煎液均可使皮肤VEGF的表达明显下降，真皮厚度降低，说明红花水煎液可能通过减轻硬皮病小鼠皮肤组织的缺血缺氧状态，降低VEGF的表达，降低血管通透性，进而减少ECM的渗出，抑制皮肤纤维化。2抗肝脏纤维化作用肝纤维化是肝脏受到各种损伤后所导致的ECM大量合成、分泌，而降解绝对或相对不足，使ECM在肝脏内弥漫性沉积的病理过程。肝星状细胞（hepaticstellatecells,HSC）是肝纤维化时ECM的最主要来[7][8]源细胞，其活化增殖是肝纤维化发生的关键和中心事件。刘珺等研究了红59 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文花注射液对HSC增殖、凋亡的影响，结果显示红花注射液对HSC增殖有明显的抑制作用，且作用呈剂量和时间依赖性，这可能是红花抗肝纤维化的作用[9]机制之一。赵文丽等报道，红花可以降低四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠血清透明质酸（Hyaluronicacid,HA）、层粘连蛋白（Laminin,LN）和Ⅲ型前胶原（Procollagentype1l1,PC-Ⅲ）水平，故认为红花可能有保护肝细胞，防治四[10]氯化碳诱导的大鼠肝纤维化作用。李红星等发现HYSA能降低四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型肝组织转化生长因子-β1（transforminggrowthfactor-beta1,TGF-β1）、结缔组织生长因子（connectivetissuegrowthfactor，CTGF）的表达，证实了红花在体内外实验中均有抗肝纤维化作用。[11]王艺蓉等研究HYSA对肝纤维化大鼠脂质过氧化的影响，发现红花组和HYSA组超氧化物歧化酶（SOD）含量相对于四氯化碳诱导的肝纤维化模型组显著升高，说明红花和HYSA能明显提高肝组织SOD活性，抑制自由基的产生，促进其清除，从而抑制脂质过氧化反应，使大鼠肝纤维化减轻，提示红花减轻肝纤维化可能与抑制肝细胞脂质过氧化损伤有关。3抗肾脏纤维化作用肾纤维化是多种慢性肾脏疾病的主要病理改变，是最终导致终末期肾功能衰竭（end-stagerenalfailure，ESRF）的共同通路，其病理特点包括成纤维细胞增生、ECM增多、肾小管扩张或萎缩、细胞凋亡等，是多种细胞和细胞相互作用的结果。TGF-β是一种重要的促纤维化生长因子已经得到了广泛证实。TGF-β分为3个亚型，在肾脏纤维化过程中以TGF-β1表达增强为主。其作用直接表现为刺激I、II、III、IV、V型胶原、纤连蛋白（Fibronectin,FN）、蛋白多糖60 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文（proteoglycan,PG）的表达，促进ECM的产生；同时通过增加组织金属蛋白酶组织抑制因子（tissueinhibitorsofmetalloproteinases，TIMPs）的活性和降低基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）的活性而抑制ECM的降解。此外TGF-β在肾小管上皮细胞向间充质细胞的表型转化（EMT）时发挥了重要作用，TGF-β1可单独引起并完成整个EMT过程，从而导致纤维化[12][13]。高燕等建立单侧输尿管梗阻（unilateralureteralobstruction,UUO）大鼠模型，用免疫组化法检测COL-Ⅰ在肾间质的沉积以及TGF-β的表达，结果显示SY可明显降低COL-Ⅰ在肾间质的沉积，下调肾皮质TGF-β的表达，对[14]大鼠肾间质纤维化有保护作用。另有研究发现在UUO大鼠模型中，SY粉针能抑制肾组织TGF-β1蛋白的表达，减少COL-III的沉积，减轻肾脏病理损害，从而延缓病变肾组织纤维化进程。FN是一种细胞外基质糖蛋白，是在TGF-β刺激下由肾脏近曲小管产生的，能促进COL-I、COL-II、COL-III、COL-IV和PG成分的沉积，同时还是[15]成纤维细胞的趋化剂。孙时华等研究提示SY能降低单侧UUO大鼠模型肾间质COL-I和FN的表达，延缓肾脏间质纤维化的进程。肾小管上皮细胞在某些因素刺激下转变为成纤维细胞这一表型转化现象[16]已不少见，徐庆友等发现在UUO大鼠模型中，红花可显著抑制肾小管上皮细胞表型转化标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及COL-III的表达，推断[17]抑制肾小管上皮细胞的表型转化可能是红花抗肾脏纤维化机制之一。高燕等进一步对UUO模型肾间质纤维化大鼠肾小管上皮细胞检测发现，UUO联合红花治疗组与单纯UUO组相比，肾间质纤维化病变程度较轻，凋亡细胞明显减少，提示SY可能通过减少肾小管细胞过度凋亡，保护肾小管周围环境来实61 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文现延缓肾脏纤维化的作用。[18]朱晋龙等对红花注射液抗肾纤维化指标表达进行了临床观察，显示治疗组肾功能指标即血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、内生肌酐清除率（Ccr）和LN、PC－Ⅲ、COL-IV、HA水平与对照组比较明显降低，进一步证实了红花的抗肾脏纤维化作用。4抗肺纤维化作用在动物实验和临床研究中红花均显示出一定的抗皮肤纤维化、肝脏纤维化和肾脏纤维化的作用，因此也引起了不少国内外学者的注意，开始将它引入了抗肺纤维化的领域。[19]WangL等发现在博莱霉素诱导的肺纤维化模型中，SY显著降低肺组织中羟脯氨酸含量，下调TGF-β1和α-SMA的表达，认为SY通过减少促纤维化因子TGF-β1的释放来降低肌成纤维细胞的数量，抑制α-SMA的表达进而抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，最后达到抗肺纤维化的效果。赵[20]青文等使用红花注射液治疗特发性肺纤维化19例，所有患者临床自觉症状均有不同程度减轻，9例患者能进行正常生活工作，6例能进行一般日常活动，4例能在室内少量活动。未观察到患者有明显的药物不良反应和副作用，证实红花是一种安全可靠的抗肺纤维化药物。虽然红花在抗肺纤维化方面的研究并不是很多，还处于起步阶段，但是初步的动物实验和临床实验已证实红花具有抗肺纤维化，改善肺纤维化患者生活质量的作用。5讨论综上所述，红花对多个器官组织具有抗纤维化作用，它可以通过多种途径、62 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文[21-23]不同层次，也从分子、基因水平上发挥其抗纤维化作用。目前的研究表明，机体组织器官纤维化的发生发展涉及免疫异常、炎症反应、血管损伤、胶原沉积等多种因素，其细胞分子机制与免疫细胞、炎症细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞以及细胞因子等有关。红花作为一种中药，毒副作用相对较小，虽然多数实验已证实其在体内外均有抗纤维化作用，但其抗纤维化作用及机制研究仍处于初级阶段，主要集中在成纤维细胞、细胞外基质、胶原蛋白及其相关细胞因子方面，免疫细胞及血管内皮细胞方面则研究较少，如红花调节各种免疫细胞功能对纤维化的影响，以及红花通过对细胞信号传导产生作用能否影响机体纤维化进程。因此仍有很多工作有待系统深入，进一步阐明红花抗纤维化作用的分子生物学机制,有利于更为深入地探讨红花抗纤维化的本质,对指导临床用药、新的适应症的开发具有重要意义。63 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文参考文献[1]易善勇，官丽莉，杨晶,等.红花药理作用及其开发与应用研究进展[J].北方园艺,2015,(5):191-195.[2]陈梦，赵丕文，孙艳玲,等.红花及其主要成分的药理作用研究进展[J].环球中医药,2012,5(7):556-560.[3]杨欢欢,吕军影,黄李平,等.红花水煎液内服对硬皮小鼠皮肤COL-Ⅰ、COL-Ⅲ表达的影响[J].时珍国医国药,2014,25(9):2115-2117.[4]刘燕,傅跃先,邱林,等.红花对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞及Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(37):7296-7300.[5]侯俊宸，刘新建.血管内皮生长因子在肝纤维化形成中的作用[J].中国病原生物学杂志,2014,9(7):661-663.[6]杨欢欢,吕军影,黄李平,等.红花水煎液内服对硬皮病小鼠皮肤血管内皮生长因子表达的影响[J].风湿病与关节炎,2014,3(4):26-30.[7]张莎莎,吕文良,张旭,等.肝纤维化的发病机制研究进展[J].浙江中医药大学学报,2011,35(5):797-802.[8]刘珺,徐选福,杨文娟,等.红花注射液对肝星状细胞HSC-T6增殖、凋亡及凋亡相关基因表达的影响[J].中草药,2009,40(8):1270-1274.[9]赵文丽,姜庆久,吴影.红花对实验性大鼠肝纤维化的抑制作用[J].黑龙江医药科学,2004,27(4):4-5.[10]李红星,王东,时彦,等.羟基红花黄色素A对实验性大鼠肝纤维化TGF-β1-CTGF的影响[J].中华临床医师杂志,2014,8(4):652-655.[11]王艺蓉,李雅娜,李京敏,等.羟基红花黄色素A对肝纤维化大鼠血清学指标及脂质过氧化的影响[J].四川解剖学杂志,2011,19(1):1-4.[12]赵建辉,陈洪宇.肾间质纤维化的中医药防治机制研究进展[J].光明中医,2009,24(3):580-583.[13]高燕,陈航,贾海红,等.红花黄色素对实验性肾间质纤维化大鼠TGF-β及Ⅰ型胶原表达的影响[J].医学研究与教育,2009,26(3):11-13.64 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红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文图3-1肺组织Masson染色（×200）Fig.3-1MouselungMassonstaining68 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文图3-2皮肤Masson染色（×200）Fig.3-2MouseskinMassonstaining69 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文图3-3肺组织SiriusRed染色（×200）Fig.3-3MouselungSiriusRedstaining70 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文图3-4皮肤SiriusRed染色（×200）Fig.3-4MouseskinSiriusRedstaining71 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文图3-5肺组织VanGieson染色（×200）Fig.3-5MouselungVanGiesonstaining72 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文图3-6皮肤VanGieson染色（×200）Fig.3-6MouseskinVanGiesonstaining73 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文图5-1肺组织TGF-β1IHC（×400）Fig.5-1LungtissueTGF-β1expressionIHC74 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文图5-2肺组织IL-10IHC（×400）Fig.5-2LungtissueIL-10expressionIHC75 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文图5-3皮肤组织TGF-β1IHC（×400）Fig.5-3SkintissueTGF-β1expressionIHC76 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文图5-4皮肤IL-10IHC（×400）Fig.5-4SkintissueIL-10expressionIHC77 红花水煎液对硬皮病小鼠皮肤和肺组织纤维化及TGF-β1、IL-10表达的影响2017届硕士学位论文致谢时光飞逝，转眼间我的研究生生活即将结束，回首三年寒窗，感慨良多。感谢我的导师三年来对我学业的耐心指导和为人处世方面的悉心教诲。导师为知名中医，临床和教学经验丰富，深受患者和学生喜欢。导师专业知识渊博，治学态度严谨，严于律己，宽厚待人。有幸跟随导师学习，收获颇丰。导师是我今后学习的楷模，是我在基础研究及临床工作的指路人，我会继续努力奋斗传承导师的学术思想，衷心地对导师表示深深的感谢和崇高的敬意！衷心感谢广西医科大学实验室的各位老师及同学们，为我实验能顺利完成提供了强有力的技术支持。衷心感谢广西医科大学第一附属医院各位老师在我临床轮转期间给予耐心指导，使我能更快地更好地掌握了基本临床知识。衷心感谢我的师兄师姐及同窗对我临床和实验期间的照顾，感谢我的室友在学习和生活中对我的无私关怀和热情帮助。最后衷心感谢我的父母给予我无私的支持和关爱。攻读硕士研究生期间撰写的文章胡谋波,吕军影.红花水煎液对博莱霉素诱导的硬皮病小鼠肺组织胶原含量的影响[J].风湿病与关节炎,2016,5(9):5-8.78