肌苷对糖尿病性膀胱病的保护作用及机制

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分类号R694+.52UDC616.6密级公开肌苷对糖尿病性膀胱病的保护作用及机制张昆培养类别全日制学位类型学术学位一级学科(专业类)临床医学二级学科(专业)外科学（泌尿外）研究方向神经尿动力学与临床指导教师刘飞副教授（副主任医师）培养单位西京医院泌尿外科二O一八年五月 空军军医大学硕士学位论文目录缩略语表·····················································································································1中文摘要·····················································································································2ABSTRACT················································································································5前言·····················································································································9文献回顾···················································································································10正文···················································································································17第一部分肌苷治疗DCP的形态学分析及相关氧化指标测定·············································171材料······················································································································································171.1实验动物··················································································································171.2实验分组·················································································································171.3药品与试剂···············································································································171.4主要试剂配制············································································································181.5实验器材与材料·········································································································192方法·····················································································································································192.1糖尿病动物模型建立及取材··························································································192.2HE染色···················································································································202.3电镜观察··················································································································202.4NGF和c-kit免疫荧光染色···························································································212.5TUNEL检测各组大鼠膀胱组织细胞凋亡·········································································232.6SOD，MDA，GSH氧化指标测定··················································································243结果·····················································································································································263.1各组HE染色表现······································································································263.2电镜观察描述············································································································273.3免疫荧光观察分析······································································································293.4各组TUNEL凋亡分析································································································303.5各组氧化应激指标测定结果分析比较··············································································314讨论·····················································································································································31第二部分肌苷对糖尿病大鼠膀胱组织PIEZOS离子通道表达及分布的影响·····························34 空军军医大学硕士学位论文1材料······················································································································································341.1实验动物··················································································································341.2实验分组·················································································································341.3药品与试剂···············································································································341.4主要试剂配制············································································································351.5实验器材与材料········································································································362方法·····················································································································································362.1糖尿病动物模型建立及取材··························································································362.2piezo1和c-kit免疫荧光观察·························································································362.3QPCR检测大鼠膀胱中Piezo1和Piezo2mRNA表达··························································382.4Westernblotting检测大鼠膀胱中Piezo1和Piezo2蛋白·······················································402.5统计学分析···············································································································443结果·····················································································································································443.1免疫荧光观察分析······································································································443.2QRT-PCR检测结果分析······························································································473.3Westernblot结果分析·································································································474讨论······················································································································································48小结···················································································································51参考文献···················································································································52个人简历和研究成果····································································································60致谢···················································································································61 空军军医大学硕士学位论文缩略语表缩略词英文全称中文全称DCPDiabeticcystopathy糖尿病性膀胱病STZStreptozotocin链尿佐菌素MDAMalondialdehyde丙二醛SODSuperoxideDismutase超氧化物歧化酶GSHGlutathione谷胱甘肽NGFNervegrowthfactor神经生长因子ROSreactiveoxygenspecies活性氧自由基RNSreactivenitrogenspecies活性氮自由基ICCinterstitialcellsofCajal间质细胞PRPPPhosphoribosylPyrophosphate磷酸核糖焦磷酸ADAAdenosineDeaminase腺苷脱氨酶IMPInosineMonophosphate次黄嘌呤核苷酸PNPPurineNucleosidePhosphorylase核苷磷酸化酶HXHypoxanthine次黄嘌呤XOXanthosineOxidase黄嘌呤氧化酶pBOOpartialbladderoutletobstruction膀胱出口部分梗阻-1- 空军军医大学硕士学位论文肌苷对糖尿病性膀胱病的保护作用及机制硕士研究生：张昆导师：刘飞副教授辅导教师：邝芳副教授空军军医大学西京医院泌尿外科，西安710032资助基金项目：国家自然科学基金(81270844);陕西省科技厅社会发展科技攻关项目(2016SF-161)中文摘要糖尿病性膀胱病(diabeticcystopathy,DCP)是糖尿病患者常见的慢性并发症之一，在2004年，Lee等统计DCP的患病率为25％〜90％。在2011年，统计约有22.5％的糖尿病患者表现为膀胱过度活动症，而在这些病例中又有48.0％的患者伴有尿失禁临床症状。DCP的发病机制主要包括神经病变、逼尿肌肌源性病变和氧化应激损伤等，氧化应激损伤是糖尿病膀胱功能损伤的重要因素，有效降低机体内氧自由基的水平对保护糖尿病动物模型的神经及血管结构功能十分有利。至今为止，针对DCP的药物仍需要继续探索，利用天然抗氧化剂治疗DCP已逐渐被推崇为研究的新热点。肌苷是临床上多年广为应用、无明显不良反应的药物，而且大量研究表明肌苷能有效对抗氧化应激损伤机体，提高细胞对缺氧、缺血的耐受力。Piezos离子通道是机械敏感性离子通道中的一种，其可感受细胞膜所受机械刺激的改变，立即作出反应，将细胞膜感受到的机械信号转化为电信号或化学信号。在2010年，由Corey和Hudspeth等人研究发现，在哺乳动物中，该通道家族包含Piezo1和Piezo2蛋白，分别由FAM38A和FAM38B基因编码。Piezos离子通道存在于许多组织中，如膀胱、肾脏及神经等，并且研究发现，Piezos基因及其表达的蛋白与机体一些病理生理过程相关，如Dehydratedhereditarystomatocytosis(DHS)、Distalarthrogyposistype5(DA5)、Gordonsyndrome(GS)、Marden-Walkersyndrome（MWS）等。目前，Piezos通道蛋白在DCP中表达情况，少有文献报道，本实-2- 空军军医大学硕士学位论文验以链尿佐菌素（StreptozocinSTZ）诱导糖尿病大鼠模型，观察糖尿病对大鼠膀胱组织Piezos离子通道的影响情况，并用肌苷进行干预治疗，分析肌苷对糖尿病大鼠膀胱组织中Piezos离子通道的保护作用，为DCP的药物治疗探索一个新的研究方向。第一部分肌苷治疗DCP的形态学分析及相关氧化指标测定目的：目前针对DCP的治疗仍缺乏有效药物，研究天然抗氧化剂已经逐渐成为当今的新热点。本研究目的在于观察肌苷对糖尿病大鼠膀胱的保护作用以及探索肌苷的抗氧化应激机制。方法：将60只成年大鼠随机分为正常对照组，糖尿病组和糖尿病肌苷治疗组，每组大鼠各20只，给予链脲佐菌素(60mg/kg)一次性腹腔注射以诱导糖尿病大鼠模型，1周后取尾静脉血，测血糖水平≥16.7mmol/L达到造模成功的标准。造模成功后肌苷治疗组接受肌苷(75mg/kg，ip，bid)治疗，糖尿病组接受同量生理盐水。肌苷治疗干预4周、8周后，在两个时间点分别从各组中取10只大鼠，取膀胱组织切片做苏木精-伊红（HE）染色、用免疫荧光法观察膀胱组织中干细胞因子受体（c-kit）、神经生长因子（NervegrowthfactorNGF）表达情况，电镜下观察各组大鼠膀胱组织的超显微结构。同时对大鼠膀胱组织进行TUNEL凋亡分析，并测定膀胱组织中谷胱甘肽(GlutathioneGSH)、丙二醛(MalondialdehydeMDA)以及超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutaseSOD)的含量和活性。结果：糖尿病组大鼠膀胱组织HE染色提示黏膜显著增生，肌束排列紊乱，结构松散，肌束断裂，肌束间间隙明显增宽，肌细胞萎缩，淋巴细胞浸润，肌束间胶原纤维填充，血管增生充血，神经束少见；在电镜下观察，可见肌细胞排列紊乱，中间连接消失，肌细胞和间质细胞内线粒体空泡化显著，核膜皱缩，核仁消失，染色质不规则边集，凝聚成块；免疫荧光结果提示NGF和c-kit信号均较正常对照组减弱；TUNEL检测显示凋亡细胞比例显著增多，MDA在8周时显著增加，SOD，GSH则显著减少。肌苷治疗组大鼠膀胱组织及细胞结构较糖尿病组显著改善，NGF和c-kit信号显著增强，凋亡细胞比例显著减少，且以上改善肌苷治疗组在4周和8周时无显著差别，8周时肌苷治疗组膀胱组织中MDA含量较糖尿病组显著减少。结论：氧化应激在DCP的发生和发展中起重要作用，肌苷能有效降低-3- 空军军医大学硕士学位论文糖尿病大鼠膀胱组织中氧化应激水平，减轻糖尿病大鼠膀胱组织的受损程度，保护膀胱的组织结构和功能。第二部分肌苷对糖尿病大鼠膀胱组织piezos离子通道表达及分布的影响目的：观察糖尿病大鼠膀胱组织内piezos离子通道变化及肌苷（inosine）对糖尿病大鼠膀胱组织内piezos离子通道的影响情况。方法：将54只大鼠随机分为正常对照组(NC组),糖尿病对照组(DM组)和糖尿病肌苷治疗组(Inosine组)，每组18只大鼠，DM组和Inosine组大鼠分别给予链脲佐菌素(60mg/kg)一次性腹腔注射诱导糖尿病大鼠模型，1周后测血糖在16.7mmol／L以上，视为造模成功。造模成功后，Inosine组大鼠腹腔注射肌苷(75mg/kg,ip,bid)治疗，DM组接受同量生理盐水。在肌苷治疗1、2、8周后，各组分别取3只大鼠，用免疫荧光法观察大鼠膀胱组织中c-kit、Piezo1表达情况。再取3只大鼠，用QPCR定量分析Piezo1和Piezo2基因表达水平，并通过Westernblot对大鼠膀胱组织内Piezo1和Piezo2蛋白表达水平分析比较。结果：在肌苷治疗1、2周后，Inosine组Piezo1和Piezo2基因及蛋白表达水平与NC组无显著差别（P>0.05），DM组Piezo1和Piezo2基因及蛋白表达水平较NC组和Inosine组显著增高（P<0.05），在肌苷治疗第8周后，NC组、DM组和Inosine组大鼠膀胱组织中Piezo1和Piezo2基因及蛋白表达水平无显著差别（P>0.05）。结论：DCP初期，大鼠膀胱组织中Piezo1和Piezo2基因肌蛋白表达水平可显著增加，增强膀胱对机械刺激的敏感性，是产生尿频症状的重要因素之一，而肌苷可显著抑制Piezo1和Piezo2增加，从而保护膀胱功能。关键词：糖尿病；糖尿病性膀胱病；肌苷；氧化应激；Piezo；c-kit；NGF；大鼠-4- 空军军医大学硕士学位论文InosineprotectsbladderstructureandfunctioninratswithdiabeticcystopathyCandidateformaster:ZHANGKunSupervisor:LIUFeiTutor:KUANGFangDepartmentofUrology,Xijinghospital,AirForceMedicalUniversity,Xi’an710032,ChinaSponsoredPrograms:NationalNaturalScienceFoundationofChina(81270844);ShaanxiProvincialScienceandTechnologyDepartmentofSocialDevelopmentScienceandTechnologyResearchProject(2016SF⁃161)AbstractDiabeticcystopathy（DCP）,alsoknownasdiabeticneurogenicbladderdisease(DNB),isacommonchroniccomplicationsofdiabetes.In2004,Leeetalusedstatisticmothodandfoundthattheprevalencofdiabeticpatientswithbladderdiseasewas25%~90%.In2011,22.5%ofdiabeticpatientshadoveractivebladder,ofwhich48.0%wereurinaryincontinence.ThepathogenesisofDCPmainlyincludesneuropathy,detrusormyogeniclesionsandoxidativestressinjury.Andoxidativestressinjuryisanimportantfactorinthedamageofbladderfunctionindiabeticpatients.Increasingtheclearancerateofoxygenfreeradicalsmayhelptoimprovethediabeticanimal'sNeurovasculardamage,thetreatmentofDCPisstillalackofeffectivemeanstofindnaturalantioxidantshasbecomeahotresearch.Inosineiswidelyusedformanyyearsinclinicalpracticewithoutobviousadversedrugreactions.Alargenumberofstudieshaveshownthatinosinecaneffectivelycounteracttheoxidativestressanddamagetothebodyandincreasethetoleranceofcellstohypoxiaandischemia.Mechanotransduction,theconversionof-5- 空军军医大学硕士学位论文mechanicalforcesintobiologicalsignals,playscriticalrolesinvariousphysiologicalandpathophysiologicalprocessesinmammals,suchasconscioussensingoftouch,pain,andsound,aswellasunconscioussensingofurineflow,andbladderdistention.Mechanosensitive(MS)channelsrepresentaclassofionchannelsthatgateuponmechanicalforcestimulation.Piezoisanewtypeofmechanosensitivechanneldiscoveredrecently,anditisinvolvedintransferringmechanicalsignalsonthemembraneintoelectricalsignalsorchemicalsignals.Inthemammals,thechannelsfamilycontainedthePiezo1andPiezo2proteins,encodedbytheFAM38AandFAM38Bgenes,respectively.Thetwomammalianisoformsareabundantlyexpressedinawiderangeofmechanicallysensitivetissueandcells,includingbladder,kidneys,redbloodcells,dorsalrootganglia(DRG)sensoryneuronsandMerkelcells.Piezo2arefoundinthedorsalrootganglia,whichplayessentialrolesinbladdersensation.Diabeticcystopathy(DCP)isoneofthecommoncomplicationsofdiabeticurinarysystem,characterizedbyvoidingdysfunction,increasedcapacity,reduceddetrusorcontractionandincreasedresidualurine.Currently,therearefewreportsregardingPiezochannelsandDCP.Inthisstudy,diabeticratmodelsareinducedbystreptozotocin(STZ).ThechangesofPiezochannelsgeneexpressionsandproteinlevelsindiabeticratsbladdertissueareexamined,inordertoexplorethepathophysiologicalmechanismofthechangesofsensorysignalingtheDCP,andprovideatheoreticalbasisforclinicaltreatment.PARTI:MorphologicalAnalysisofInosineinTreatmentofDiabeticcystopathyandMeasurementofRelatedOxidativeIndexesObjective:Atpresent,thetreatmentofdiabeticcystopathy（DCP）isstilllackofeffectivemeans,andfindingnaturalantioxidantshasbecomeahotresearch.Thisresearchisaimtodiscussthepositiveefficacyofinosineonadiabeticratbladderandexploreantioxidantstressmechanism.Investigatewhetherinosineisabletoreversetheoxidativedamageandprotectbladderfunctionindiabeticrats.Methods:Atotalof60SDratswere-6- 空军军医大学硕士学位论文randomlydividedinto3groups:Normalcontrolsgroup（NC）,Diabeticratsgroup（DM）andinosinetreatmentgroup（INOSINE）.ThelasttwogroupswerebothbyinjectedofSTZ,60mg/kg,byasingleintraperitoneal，NCgroupinjectedbyaconsiderablevolumeofcitricacidbuffercorrespondingly.oneweekaftertheinjection,theInosinegroupaccepted4and8weeksoftreatmentwithinosine(75mg/kg,ip,bid),andDMGroupwithsaline.measuredtheweightandbloodglucoseoftheratsinthreegroupsonceaweek.ThetissuesoftheratsbladderswereexaminedforstructuralchangesusingHEstaining,ElectronmicroscopyandTUNEL.Theexpressionsofnervegrowthfactorandc-kitwasinvestigatedbyimmunofluorescencemethod.Thenoxidativestressindicatorsdetectedbythekits.Result:Thebladderdetrustorweresignificantlyimprovedbyinosine,andinosinesignificantlyconstrainedtheincreasedofMDAbutincreasedtheactivitiesofSODandGSH.Conclusion:InosinehasabeneficialeffectonDCPbyamelioratingoxidativestressinthediabeticratsbladders.PARTII:EffectofinosineonthepiezoionchannelsinthebladdertissueofdiabeticratsObjective:Toinvestigatethetime-dependentexpressionanddistributionofPiezoionchannelsandtheeffectofinosineonthepiezoionchannelsinthebladdertissueofdiabeticrats.Methods:atotalof54Eight-week-oldmaleSDratswereallocatedinto3groupsrandomly:normalcontrolsgroup(NC),diabetesmellitusgroup(DM)anddiabetesmellituswithinosinetreatmentgroup(INOSINE).DMandINOSINEgroupswereinjectedSTZ,60mg/kg,byintraperitoneal,butNCgroupwereinjectedwithanequalvolumeofvehicle(0.1Mcitratebuffersolution)correspondingly.SevendaysaftertheinjectionofSTZ,thebloodglucoselevelwasmeasured.Whenthebloodglucoselevelwashigherthan16.7mmol/L,theratwasconsideredtobediabeticandwasusedinthefollowingexperiments.Thelevelofbloodglucoseandbodyweightweremeasuredonceaweek.Subsequently,theratswerehumanelykilledat1,2or8weekpoints(6ratseach)andthebladderswereharvestedformeasurements.TheexpressionsofPiezo1andPiezo2mRNA-7- 空军军医大学硕士学位论文inthebladdertissuewereanalyzedbyReal-timePCR.Thechangesofpiezo1andpiezo2proteinlevelsinthebladderwereanalyzedbyWesternBlotassay.Andpiezo1andc-kitexpressionswereobservedbyimmunofluorescencestaining.Results:At1and2weekpointsafterdiabetesinduction,theexpressionsofthemRNAandproteinofPiezo1andPiezo2inDMweresignificantlyhigherthanthoseinINOSINEandNC(P<0.05),howeverat8weekpointafterdiadetes,thereisnoobviouslydifferentchange(P>0.05).Conclusion:TheexpressionlevelsofPiezo1andPiezo2intherat`sbladdertissuecanbesignificantlyincreasedintheearlystageofdiabeticcystopathy,andthesemaybeimportantfactorsofthelowerurinarytractsymptoms.InosinecansignificantlyinhibitPiezo1andPiezo2increasestoprotectbladderfunctionKeywords：Diabetesmellitus;diabeticcystopathy;inosine;oxidativestress;Piezo;c-kit;NGF;rat-8- 空军军医大学硕士学位论文前言糖尿病性膀胱病(diabeticcystopathy,DCP)是糖尿病患者常见的慢性并发症之[1]一，在2004年，Lee等统计DCP的患病率为25％〜90％。在2011年，据统计有22.5％的糖尿病患者表现为膀胱过度活动症，而这些病例中有48.0％的患者临床症[2]状伴有尿失禁。DCP的发病机制主要包括神经病变、逼尿肌肌源性病变和氧化应激损伤等，氧化应激损伤是糖尿病膀胱功能损伤的重要因素，有效降低机体内氧自由基的水平对保护糖尿病动物模型的神经及血管结构功能十分有利。至今为止，针对DCP的药物仍需要继续探索，利用天然抗氧化剂治疗DCP已逐渐被推崇为研究[3-5]的新热点。肌苷是临床上多年广为应用、无明显不良反应的药物，而且大量研究表明肌苷能有效对抗氧化应激损伤机体，提高细胞对缺氧、缺血的耐受力。Piezos离子通道是机械敏感性离子通道中的一种，其可感受细胞膜所受机械刺激的改变，立即作出反应，将细胞膜感受到的机械信号转化为电信号或化学信号[6]，在2010年，由Corey和Hudspeth等人研究发现，在哺乳动物中，该通道家族[7]包含Piezo1和Piezo2蛋白，分别由FAM38A和FAM38B基因编码。Piezos离子通道存在于许多组织中，如膀胱、肾脏及神经等，并且研究发现，Piezos基因及其表达的蛋白与机体一些病理生理过程相关，如Dehydratedhereditarystomatocytosis(DHS)、Distalarthrogyposistype5(DA5)、Gordonsyndrome(GS)、Marden-Walker[8]syndrome（MWS）等。目前，Piezos通道蛋白在DCP中表达情况，少有文献报道，本实验以链尿佐菌素（StreptozocinSTZ）诱导糖尿病大鼠模型，观察糖尿病对大鼠膀胱组织中Piezos离子通道的影响情况，并用肌苷进行干预治疗，分析肌苷对糖尿病大鼠膀胱组织中Piezos离子通道的保护作用，为DCP的药物治疗探索一个新的研究方向。-9- 空军军医大学硕士学位论文文献回顾第一部分DCP研究进展据世界卫生组织报告，在世界各个地区，糖尿病的患病人数都在不断增加，流行程度也不断加剧，2014年，有4.22亿人(或人口的8.5%)患有糖尿病。在我国随着国民收入的逐渐增长，糖尿病的患病率也随之呈现逐步递增的趋势，有报道达11.6%，已经很大程度上影响到了国民的身体健康，且绝大多数糖尿病患者都存在多种不同程度的并发症，其中较为常见的就是膀胱功能障碍，具统计约半数以上的[5]糖尿病患者并发DCP。DCP早期可出现各种下尿路症状，然而在临床上常常因不能及时鉴别而延误治疗。DCP晚期则会出现尿潴留、泌尿系感染、尿失禁等各种并[9]发症，甚至引起肾功能不全及尿毒症，而且血糖尽管能够得到有效地治疗，以上[10,11]并发症的出现依然有较大概率。目前认为，糖尿病外周神经病变和逼尿肌自身[3,5]的肌源性功能障碍可能是主要致病因素，此外，DCP发病机制还涉及到多元醇旁路的活化、非酶糖基化产物的沉积、局部血流微循环障碍、神经生长因子减少以[12,13]及遗传因素、自身免疫功能、氧化应激损害等多种因素共同作用。若DCP能获得到更早的确诊并得到有效治疗，其部分病程是可逆转的。探讨氧化应激在DCP中的作用及机制，利用抗氧化剂多靶点多途径综合作用的优势保护糖尿病膀胱，有望[14]为DCP的治疗提供新思路。1．综合各方面研究，在DCP的发病机制中，神经病变、逼尿肌肌源性病变和氧化应激损伤是主要的致病因素。1.1膀胱神经异常1.1.1膀胱感觉神经障碍因长时间处于高血糖状态，周围自主神经会发生阶段性的脱髓鞘和轴突受损改变，从而出现传导障碍导致膀胱感觉功能下降。最初可无感觉传入神经和副交感神经纤维的器质性病变，但随着疾病发展便会产生程度不断加重的轴突萎缩，出现神经髓鞘变性脱落、运动终板肿胀、细胞大量凋亡坏死。又因-10- 空军军医大学硕士学位论文糖尿病可并发各种代谢紊乱和微血管病变，导致组织发生缺血、缺氧等不利因素，引起神经细胞、神经轴突变性、神经纤维脱髓鞘改变，胆碱酯酶活性降低和神经膜[15]细胞增生等。糖尿病时膀胱的传入神经传导速率下降，但是膀胱逼尿肌中的P物质却是明显增多的，P物质是速激肽族多肽，能够使平滑肌收缩，血管舒张和血[16,17]压降低，由此可表明去神经的超敏感性。1.1.2膀胱运动神经异常因糖尿病时胆碱乙酰化酶与去甲肾上腺素对神经末梢的作用减弱，造成控制膀胱容量的交感神经敏感性和副交感神经的功能发生障碍。此外，患有糖尿病时，NGF随病程时间呈进行性下降必然成为交感神经发生病变的必要条件，NGF生成减少以及NGF转送到腰骶神经节的量减少是DCP发病机制中的一[18]个重要环节。另有报道阐述，膀胱的收缩过程主要与胆碱能M受体相关，包括[19]M2和M3受体，M3受体可跟G蛋白发生耦联，促使逼尿肌收缩。研究发现，DCP[20]的逼尿肌收缩功能下降可能与M受体减少有关。1.2逼尿肌肌源性病变膀胱收缩功能在DCP初期即有可能受损，其受损原因可能与膀胱逼尿肌原肌球蛋白的含量下降有关，并且膀胱逼尿肌细胞因长期的高血糖状态导致钠钾离子通道功能下降，从而逼尿肌细胞内钠离子浓度相应升高，引起逼尿肌收缩力敏感性下降，膀胱逼尿肌出现代偿性肥大。在DCP晚期膀胱逼尿肌细胞发生萎缩、凋亡，膀胱壁菲薄而呈无张力的囊状。普通透射电镜观察提示：逼尿肌的超显微结构改变主要表现为：肌细胞形态不一致,分布不均，肌纤维排列紊乱；细胞中间连接消失，细胞间大量胶原纤维填充；肌细胞膜内侧吞饮小泡减少；线粒体数[21]量减少，肌丝排列紊乱，致密体分布不均等。STZ诱导的糖尿病模型与蔗糖利尿动物模型组相比较，利尿组的膀胱结构和功能变化与糖尿病组相似。膀胱肌源性病变引起患者出现早期尿动力学结果与晚期相比存在一定的差异性，逼尿肌兴奋性下降是早期最显著改变，而在尿动力学表现与正常膀胱参考值无显著差异，不同之处在于膀胱感觉减退，具体表现为初始尿意的膀胱容量增大。随着DCP病程进一步发展，膀胱感觉减退程度更加明显，并且最大膀胱容量增大，排尿期的逼尿肌压[22-力降低、残余尿量增多，最大尿流率下降，膀胱结构及功能损害程度进一步加重24]。-11- 空军军医大学硕士学位论文1.3氧化应激损伤高血糖可以引起氧化应激反应，氧化应激损伤是DCP发病的重[25]要因素之一。机体在受到有害刺激时，生成过多的活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)与活性氮自由基(reactivenitrogenspecies，RNS)，导致机体内氧化系[26]统和抗氧化系统出现紊乱，由此引起组织损伤。ROS的过多产生与细胞内线粒体电子传递链和其外部NADPH氧化酶的大量激活密切相关。线粒体DNA对氧化应激尤为敏感，氧化应激可诱导线粒体内膜去极化，膜通透性增加，使神经元获[27,28]能受损、功能丧失甚至坏死或凋亡。已有研究显示，ROS可充当第二信使激活[29]相应的氧化还原敏感的信号通路，间接导致组织和细胞损伤。大量研究显示氧化应激可通过多种方式导致糖尿病外周神经、血管及膀胱病变，采用抗氧化治疗方[30]法能够显著改善患者的临床症状。另有研究显示DCP膀胱功能障碍的主要因素之[31]一是缺血再灌注损伤。DCP膀胱张力的反复大幅度变化产生缺血再灌注促使氧自由基的生成数量显著增加，脂质分子中所存在的不饱和脂肪酸被氧自由基氧化生成过氧化脂质MDA等小分子代表性产物，从而导致线粒体损伤。一方面，DCP膀胱出现局部缺血和再灌注，再灌注和再氧化产生的活性氧自由基使细胞膜的脂质产生过氧化反应，导致细胞膜损伤；另一方面，在缺氧状态下，细胞肌质网和线粒体释放2+更多钙离子促使细胞内游离的Ca显著增加，从而激活钙蛋白酶和磷脂酶A2，使细胞膜和细胞器受到损害。细胞膜的损害和钙离子动态失衡都是膀胱逼尿肌功能发生障碍的重要因素。此外，再灌注和再氧化的反复发生所产生的氧自由基引起的细胞膜和细胞器的脂质过氧化反应，会进一步加重细胞内钙离子的动态失衡和细胞膜损[32]害，而这些结局则与DCP膀胱逼尿肌功能障碍显著相关。氧自由基的半衰期十分短暂，因此直接检测氧自由基十分困难，所以采用氧自[33]由基与细胞DNA、蛋白质和脂类反应的氧化终产物来反映机体氧化应激的水平。MDA可以间接反映机体氧化应激状况，此外，还有一些抗氧化酶如SOD、GSH等也[26,34]可间接反映机体氧化应激水平。脂质过氧化反应是细胞结构及功能受损的重要因素之一。2．DCP的药物治疗临床上用来治疗DCP的药物种类繁多，然而治疗效果均不等[35,36]达到理想要求，这些药物主要分为如下几种:(1)维生素B1、B6、B12：能够降低血液黏度、扩张血管。(2)拟胆碱药，可增强胆碱能神经递质的生物活性及作用，-12- 空军军医大学硕士学位论文加强膀胱逼尿肌的收缩力，促进逼尿肌收缩,减少残余尿量。并且其对膀胱具有高度选择性作用。(3)神经节苷脂：可促进自主神经细胞神经突触增长，增强神经轴突的轴浆运输速率，改善神经功能和膀胱功能。(4)醛糖还原酶抑制剂：能够增加组++织肌醇浓度，同时增强Na-K-ATP酶的活性，对抗糖尿病的肌醇消耗量。(5)奥昔布宁：通过抗胆碱能、解痉作用，缓解尿频、尿急及尿失禁等临床症状，并能够提升膀胱容量以及降低残余尿量。(6)肌醇：能够增加外周神经的肌醇含量。(7)Niceritrol，能够增强神经的血液供应，增加神经内肌醇的含量，而且能够降低血清中三酰甘油的浓度。(8)胰岛素，能够有效控制血糖，保护自主神经结构功能。DCP的发病机制包括多种因素的共同作用，单纯降血糖、增加神经内肌醇含量治疗手段单一，且这些药物临床疗效并不是十分满意，而抗氧化剂的优势就在于其可从多靶点多途径发挥综合作用。3.肌苷概论及应用肌苷(inosine)是临床上多年广为应用、无明显副作用的药物，参与体内核酸、能量代谢和核蛋白的合成，能提高机体细胞对缺氧、缺血的耐受[37-39]力，肌苷能提高胶质细胞和神经元对缺氧和缺血的耐受力，体内应用肌苷可[39-41]保护肾脏、肝脏和心脏耐受缺血，腺苷对缺氧星形细胞的保护作用也是通过水[42]解脱氨形成肌苷。近年来，肌苷在保护神经细胞和促进神经再生方面扮演着既往研究所从未发现的重要角色，已受到愈来愈多的关注。肌苷是一种嘌呤核苷，被核苷磷酸化酶催化生成1-磷酸核糖和次黄嘌呤，前者在磷酸核糖变位酶的作用下转变成5-磷酸核糖，后者在磷酸核糖焦磷酸合成酶作用下生成磷酸核糖焦磷酸（PhosphoribosylPyrophosphate，PRPP），PRPP在嘌呤核苷酸的从头合成过程中生成6磷酸葡萄糖，再发生无氧糖酵解生成ATP，从而为受损神经元提供一定的能量[43]。肌苷代谢的另一中间产物——次黄嘌呤，由PRPP参与经次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）催化后产生黄嘌呤和尿酸，黄嘌呤可参与嘌呤核苷酸的补救[44]合成，而尿酸又是重要的生理性抗氧化剂之一，是过氧亚硝基阴离子的天然清除剂，能够有效抑制H2O2和过氧亚硝基阴离子的积聚，使细胞内的钙离子达到平衡水平，从而保护线粒体的结构及功能。研究显示通过口服肌苷治疗多发性硬化，11名患者中有3人临床症状得到显著改善，其余8人无病情加重倾向，且无任何副作用[45][46-49]。慢性退行性神经系统疾病及外伤等均伴有过氧亚硝基阴离子水平的增高，-13- 空军军医大学硕士学位论文[50]而氧化应激损伤对于脊髓继发性损伤具有重要影响。本研究小组在2009年首次报道，肌苷对膀胱出口部分梗阻造成的膀胱功能损害具有明显的保护作用，且该保护[51]作用与肌苷的抗氧化作用有关。肌苷抗氧化应激损伤保护糖尿病膀胱结构，维持[52,53]膀胱功能。4.糖尿病动物模型STZ对特定种属的动物的胰岛β细胞具有高度选择性损害作用，一般采用大鼠或者小鼠诱导糖尿病动物模型。诱导Ⅰ型或Ⅱ型糖尿病动物模型和STZ注射量密切相关：给予小剂量多次注射STZ，配合高糖高脂饮食的方法，则能够诱导Ⅱ型糖尿病动物模型，而给予一次性大剂量STZ注射能够诱导Ⅰ型糖尿病[54-58]动物模型。本研究通过一次性腹腔注射大剂量STZ的方式制作Ⅰ型糖尿病大鼠模型，具体如下：操作方法：将STZ与柠檬酸缓冲液（PH4.5）配置成1%STZ溶液，并按空腹体重给予大鼠1%STZ(60mg/kg)一次性腹腔注射，以半个小时为时限，避免STZ失效。准备造模的大鼠须禁食且不禁水至少12小时。因为大鼠禁食的时限愈大，STZ损害胰岛β细胞的程度越大，造模成功率越高，所以禁食时间延长，可以降低STZ的用量。造模期间须提供足够的饮水量及食物量，每日更换垫料1-2次，或根据垫料浸湿程度更换，并且应积极预防感染，特别是尿路感染和腹腔感染。在注射给药或测血糖等侵入性操作时，均应强调消毒处理并更换注射器。若有模型血糖没到标准，3日后可补注1%STZ（20mg/kg），或待血糖达到正常时再次重新注射STZ。第二部分肌苷对糖尿病大鼠膀胱组织piezos离子通道表达及分布的影响Piezos离子通道是一种新型机械敏感性离子通道，可感受细胞膜所受机械刺激改[6]变并迅速作出反应，将膜感受到的机械信号转化为电信号或化学信号，在2010年，Corey和Hudspeth等人研究发现，在哺乳动物中，该通道家族包含Piezo1和Piezo2[7]蛋白，分别由FAM38A和FAM38B基因编码。Piezos基因及其表达的蛋白与机体一些病理生理过程相关，如脱水遗传性口形红细胞增多症（DehydratedhereditarystomatocytosisDHS）、戈登综合征（GordonsyndromeGS）、Marden-Walkersyndrome-14- 空军军医大学硕士学位论文[8]（MWS）等。Piezos离子通道存在于许多组织中，膀胱组织中存在大量Piezo1，支[59,60]配膀胱的背根节中存在大量Piezo2，对膀胱感觉有明确的影响作用。（见图1）DCP是糖尿病泌尿系统慢性并发症之一，主要以膀胱充盈的感觉受损、膀胱容量增大、逼尿肌收缩力降低和剩余尿量增加为特征。DCP初期临床症状主要是刺激性症状，可表现为膀胱过度活动症，包括逼尿肌过度兴奋或膀胱感觉过敏诱发的尿急、尿频、夜尿增多和急迫性尿失禁，后期则以梗阻性症状为主，多与假性膀胱梗阻相关，[3]症状包括尿量减少和尿流率降低，尿后滴沥，膀胱充盈感减弱和大量残余尿。至今为止，通过对DCP的病因学研究，发现本病主要与神经因素、逼尿肌因素及其它因素有关，而肌源性因素是近年来研究的热点，主要包括膀胱逼尿肌细胞内容物、酶类、离子通道、膜受体以及神经递质变化引起逼尿肌结构受损及功能发生不同程度的障[5]碍，近些年研究结果表明，膀胱尿路上皮不仅是尿路屏障，也可作为感受器发挥作用，膀胱尿路上皮上存在大量受体和离子通道，在膀胱受到损伤或炎症时，膀胱尿路上皮对痛觉等刺激的反应性发生改变，释放前列腺素等介质，影响膀胱传入神经，从[61]而在DCP膀胱功能障碍中发挥作用。Piezos作为机械敏感性受体，可将机械性刺激转变为电信号或化学信号，据报道，有研究者已经在人类尿路上皮发现Piezo1离2+子通道,该离子通道在受到机械刺激时能够使Ca向细胞内流动并同时产生ATP,[62]这一过程是尿路上皮对所受压力和尿液流动产生感应的重要原理，另外，Piezo1被[63,64]大量激活后可促进膀胱粘膜增生，出现膀胱肥大，可认为是DCP产生膀胱肥大因素之一。目前，Piezos在DCP中表达情况少有文献报道，本实验以链尿佐菌诱导糖尿病大鼠模型，采用QPCR、Westernblot和免疫荧光观察糖尿病大鼠膀胱组织中Piezos的基因表达及蛋白水平变化，为探索糖尿病膀胱感觉信号变化规律及其病理生理学机制提供理论依据。同时，我们辅以肌苷治疗糖尿病大鼠，并观察分析糖尿病大鼠膀胱组织中Piezo离子通道是否得意保护，为保护糖尿病机体组织中piezo离子通道功能提供一个延伸性的研究。-15- flow(e.g.,kidneys,redbloodcells),whereasPiezo2ispredominantlyfoundinsensorytissues[e.g.,dorsalrootganglia(DRG)sensoryneuronsandMerkelcells]thatrespondtotouch(Figure2).ThisdistinctdistributionpatternisapparentlyconservedinotherspecieswithmultipleArticleisoforms,asPiezo1isfoundinerythrocytesandPiezo2inRohon–Beardsensoryneuronsinzebrafish;Piezo2expressionhasalsobeenconfirmedinsensorytrigeminalganglionneuronsinthestar-nosedmoleandbirds(withaparticularenrichmentofPiezo2-expressingneuronsintactileforagingwaterfowl)[6,9–12].ThesingleDrosophilaisoformisfoundbothinsensorytissues(includingTypeIciliatedandTypeIImultidendriticsensoryneurons)andinnonsensoryPiezo1inSmoothMuscleCellsIsInvolvedintissues(includinghindgut,aorta,andtrachea),suggestingthatPiezosmaybelessspecialized空军in军医大学硕士学位论文lowerorganisms[2].Inaddition,afewcelltypesexpressbothPiezo1andPiezo2,raisingtheHypertension-DependentArterialRemodelingpossibilitythattheycouldformheteromericchannelswithpotentiallydistinctfunctions[13].TheGraphicalAbstractAuthorsNeuralprogenitorcellNeuralmorphologyKevinRetailleau,FabriceDuprat,MalikaPressureArhatte,...,SophieDemolombe,Amanda1Keratinocytes2NeuronPatel,EricHonore´534NeuralPiezo2MerkelcellsSubstratedifferentiationSubstratestiffnessroughnessCorrespondence6Synapse7Neuron–astrocytepatel@ipmc.cnrs.fr(A.P.),interactionhonore@ipmc.cnrs.fr(E.H.)AstrocyteLTMRafferent8Piezo19ApicalroughnessInBriefActionpotential10Shearstress11Piezo1isastretch-activatedionchannelPiezo2VascularstructurearterialremodelingexpressedintheendotheliumanditsDRGneurondeletionaltersvasculararchitecture.CardiovasculardevelopmentEndothelialcellHowever,itsroleinarterialmyocytesalignmentVolumeregulation12inredbloodcellsPiezo1remainsunknown.Retailleauetal.showthatsmoothmusclePiezo1isCompressionOsmoticpressureCalcifiedbonedispensableforthearterialmyogenicArticularPiezo1ProximalconvolutedtubecartilagetonebutinvolvedintheremodelingofPiezo2Osmoticpressuresmallarteriesuponhypertension.ShearstressRadialChondrocytespressureContractionCollectingductPiezo1HighlightsFigure2.ExpressionandPhysiologicalRolesofPiezos.Piezo1andPiezo2areexpressedinadiversesetoforgansandtissueswithinthehumanbody,contributingdSmoothmusclePiezo1isrequiredforstretch-activatedtoanequallydiversesetofphysiologicalroles[1,9–11,13,15–22,29,33–35,38,81–83].Numberedtissuesareasfollows:1,brain;2,opticnervehead;3,periodontalligament;4,trigeminalganglion;5,dorsal图rootganglionand1skin;6,lungs;Piezos7,cardiovascularsystemand离子通道redbloodcells;8,gastrointestinalsystem;在人体内分布及作用机制9,kidney;cationicchannelactivity10,colon;11,bladder;and12,articularcartilage.TissuesinwhichPiezofunctionhasbeenextensivelystudiedareexpandedtoshowdetail.TopleftinsetillustratesPiezo2expressedinMerkelcellsoftheskin,wheremechanicalactivationofPiezomediatesdepolarizationandactivationofdorsalrootganglioncellafferents,whichalsoexpressPiezo2.Together,thesecellsareinvolvedinsensinglighttouchandproprioception(DRG,dorsalrootganglion;LTMR,Low-thresholdmechanoreceptor).dPiezo1isdispensableforthearterialmyogenictoneBottomleftinsethighlightstheexpressionofbothPiezo1andPiezo2inchondrocytesofarticularcartilage,wheretheyactivateundercompressiveforce.ToprightinsetillustratestheroleofPiezo1insensingmechanicalpropertiesoftheenvironmentofneuralprogenitorcells,therebyinitiatingsignalingpathwaysthatleadtoneuronaldifferentiationandsubsequentdevelopmentofneuritemorphology,neuron–gliainteractions,andnanoroughnessofglialmembranes.MiddlerightinsetdepictstheroleofdPiezo1openinghasatrophiceffectonthearterialwallofPiezo1inregulatingvolumeofredbloodcellsaswellassensingshearstresstoregulatevascularbranchingandalignmentofendothelialcells.BottomrightinsetshowsthesmallarteriesroleofPiezo1insensingfluidflowthroughoutthenephronofthekidney.DeficitsinPiezo1functioninthekidneymayleadtodownstreameffectsonurinaryosmolarityandrenalpathologies.dPiezo1activationincreasescytosoliccalciumandtransglutaminaseactivity60TrendsinBiochemicalSciences,January2017,Vol.42,No.1Retailleauetal.,2015,CellReports13,1161–1171November10,2015ª2015TheAuthorshttp://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2015.09.072-16- 空军军医大学硕士学位论文第一部分肌苷治疗DCP的形态学分析及相关氧化指标测定1材料1.1实验动物健康成年清洁型SD大鼠(第四军医大学动物实验中心提供)，雄性，8周龄，(250±20)g，60只，实验动物合格证号:SCXK(军)2012⁃0007，于动物中心购回适应性喂养1周后进行造模。动物饲养环境；室温24°C左右，提供大鼠自由摄食、饮水条件，每日9:00-10:00投喂饲料，更换垫料2次，或视垫料浸湿程度更换。1.2实验分组SD成年健康大鼠随机分成3组，每组20只：正常对照组（等量柠檬酸盐缓冲液腹腔注射一次），糖尿病组（1%STZ按60mg/kg腹腔注射1次，待造模成功后给予每日生理盐水腹腔注射）和肌苷治疗组（1%STZ按60mg/kg腹腔注射1次，待造模成功后给予每日肌苷注射液150mg/d分两次腹腔注射），首次1%链尿佐菌素诱导后空腹血糖未达到16.7mmol/L可重新追加1%STZ，直至空腹血糖达到标准。1.3药品与试剂链脲佐菌素(STZ)，Sigma，美国肌苷（inosine），Sigma，美国二甲苯，国药，北京苏木精，Solarbio，北京DAB显色液，Solarbio，北京-17- 空军军医大学硕士学位论文TritonX-100，碧云天，北京RabbitAnti⁃NGFantibody(Abcam)，美国GoatAnti⁃RabbitIgG，康为世纪，北京MouseAnti⁃c⁃Kitantibody，SantaCruz，美国GoatAnti⁃MouseIgG，Earthox，美国SOD试剂盒，中国南京建成MDA试剂盒，中国南京建成GSH试剂盒，中国南京建成1.4主要试剂配制1.4.1柠檬酸缓冲液的配制柠檬酸（FW：210.14）2.1g加入双蒸水100mL中配成A液。柠檬酸钠（FW：294.10）2.94g加入双蒸水100mL中配成B液。1.4.2链脲佐菌素配制液将A、B液按1:1进行混合，PH试纸测量PH值，调节PH=4.2～4.5，即得到配置STZ所要求的柠檬酸缓冲液。1.4.34%多聚甲醛固定液配制称取40g多聚甲醛，加入800ml0.01MPBS缓冲液，加热到60°C，采用磁力搅拌并加入适当氢氧化钠使粉末完全溶解，用0.01MPBS缓冲液定容至1000ml，充分混匀后密封保存。1.4.40.01MPBS溶液配制将PBS干粉11.34g置入800ml蒸馏水中，充分搅拌使其完全溶解，并用HCl或NaOH在PH试纸下调节PH值于7.4，最终用蒸馏水定容至1000ml。1.4.51%盐酸酒精分别量取5ml浓HCL、70%酒精495ml，充分混匀。1.4.6苏木素20g硫酸铝溶于1500ml蒸馏水，4g苏木精溶于500ml无水乙醇，将两者混匀后加热至沸腾，然后混入1g柠檬酸和0.5g碘酸钠，充分混匀，冷却至室温。1.4.73%H2O2-18- 空军军医大学硕士学位论文27ml甲醇和3ml30%H2O2混匀。1.5实验器材与材料万能显微镜，OlympusBX60，日本透射电子显微镜，JEM⁃1230，德国激光共聚焦显微镜，OlympusFV1200，日本酶标仪，美国。96孔板，中国石蜡切片机RM2235德国电热恒温鼓风干燥箱QH01-9030A上海电热恒温培养箱DH36001B天津超纯水机NW10LVF香港显微镜DP73日本2方法2.1糖尿病动物模型建立及取材造模之前将大鼠禁食24小时，不禁水，DM组和INOSINE组大鼠按60mg/kg腹腔注射1%STZ溶液(pH=4.5)，NC组大鼠则给予等量柠檬酸缓冲液，1周后取尾静脉血测随机血糖水平，若大鼠血糖水平在16.7mmol/L以上，则视为糖尿病大鼠造模成功，造模成功后每周测1次血糖和体重。糖尿病大鼠模型诱导成功后开始腹腔注射肌苷，肌苷治疗组接受inosine(75mg/kg，2/日)治疗，糖尿病组接受同量等[51,65]渗盐水。正常对照组、糖尿病组和肌苷治疗组于4周和8周后每组取10只SD大鼠，采取颈椎脱臼处死法，大鼠被处死后，迅速仰卧固定，于耻骨上作约2cm的纵行正中切口，逐层切开，充分暴露大鼠膀胱，用血管钳分别阻断双侧输尿管及膀胱颈部，再用20ml注射器于膀胱尖注入生理盐水以测膀胱最大容积，最后利用组织剪齐根剪断双侧输尿管及膀胱颈部后游离出膀胱，反复用等渗盐水清洗，用滤纸吸干膀胱表面水分，称量膀胱湿重，见表1，沿膀胱纵轴切取膀胱组织4份，1份立即制作冰冻切片进行常规HE病理染色观察大鼠膀胱组织结构情况，1份放入2%戊二醛固定后制作电镜标本后采用透射电镜观察大鼠膀胱组织超显微结构差异，2-19- 空军军医大学硕士学位论文份至于4%多聚甲醛溶液进行固定24小时，给予梯度脱水后利用冰冻切片机制作冰冻切片，进行免疫荧光染色观察及TUNEL凋亡检测分析，剩余膀胱组织用液氮速冻后置于-80°C超低温冰箱保存备用氧化指标测定。2.2HE染色大鼠膀胱组织取材后，立即做膀胱全层6µm冰冻切片，于4%多聚甲醛液中固定后进行HE染色。具体操作如下：（1）将经过4%多聚甲醛液中固定后的组织冰冻切片用清水洗2秒（2）然后将用清水洗净的组织冰冻切片放入苏木精溶液中进行染色45秒，温度60℃。（3）待染色时间结束后，从苏木精溶液中取出组织冰冻切片，用流水冲分清除苏木精液8秒。（4）之后将切片放入1%盐酸乙醇2秒。（5）再次将组织冰冻切片用流水洗2秒。（6）用水清洗完后，将标本放入促蓝液进行返蓝8秒。（7）用流水冲洗20秒后，注意不可直接冲洗组织。（8）组织切片洗净后，用0.5%曙红液进行组织染色40秒。（9）充分染色后，再次用双蒸水冲洗2秒。（10）将组织切片置入80%、95%及无水乙醇各1秒。（11）将组织切片由无水乙醇中取出放入炭酸二甲苯2秒。（12）随后放入二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）各持续2秒。（13）最后采用中性树胶进行封片处理。（14）在光镜下随机选取5个视野，观察各组膀胱组织形态结构体征。2.3电镜观察（1）取材：大鼠经颈椎脱臼处死后，迅速取出膀胱，沿膀胱纵轴全层切取2mm×5mm膀胱组织块。（2）固定：将大鼠膀胱组织块置入2%戊二醛固定液中2小时。随后取出组织块用0.01MPBS液清洗3次，每次10分钟，再用1%锇酸溶液将清洗后的大鼠膀胱组织块进行固定处理，时间2小时。-20- 空军军医大学硕士学位论文（3）脱水：再次以上述相同方法清洗组织块，将组织块依次浸入50%、70%、90%乙醇，90%乙醇、90%丙酮混合液（1：1），90%、100%丙酮室温浸泡，每个浓度脱水时间各20分钟，脱水温度4℃。（4）包埋：将组织块取出，放入100%丙酮与包埋液（2：1）混合液，在室温3小时，再放入100%丙酮+包埋液（1：2）混合液内室温过夜，第二日晨取出组织块放入纯包埋液中烘箱37℃温度下浸育过夜。（5）固化：将组织块再放入45℃、60℃烘箱内分别为12、24小时。（6）将固化好的大鼠膀胱组织块取出，利用超薄切片机切取60nm切片。（7）将切片放入电镜金属托盘，采用3%醋酸铀-枸橼酸铅进行双染色。（8）采用普通透射电镜对大鼠膀胱超微结构进行观察。2.4NGF和c-kit免疫荧光染色2.4.1物品准备⼩⿏抗⼤⿏MouseAnti⁃c⁃Kitantibody⼀抗，兔抗⼤⿏RabbitAnti⁃NGFantibody⼀抗;GoatAnti⁃MouseIgG⼆抗，GoatAnti⁃RabbitIgG二抗;⼀抗稀释液;⼆抗稀释液;0.01MPBS溶液;0.1MPBS溶液;DAPI;50%⽢油封⽚液;标本瓶;冰冻切⽚机;防脱载玻⽚;盖玻⽚;4°C冰箱;洗涤⽫;10µl移液器;1ml移液器;湿盒。2.4.2实验步骤2.4.2.1膀胱组织冰冻切⽚的制作将⼤⿏膀胱组织⽤4%多聚甲醛固定24h后，依次⽤20%、30%蔗糖溶液梯度脱⽔过夜，在冰冻切⽚机内-20°C温度下，⽤OCT冰冻包埋液包埋组织，冰冻切⽚机沿垂直于粘膜层⽅向全层切取10µm冰冻切⽚，即刻贴在防脱载玻⽚表⾯，放⼊-20°C冰箱存储待免疫荧光双标染⾊。-21- 空军军医大学硕士学位论文2.4.2.2免疫荧光双标染⾊(1)⽤0.01MPBS充分漂洗冰冻切⽚10分钟×3次;(2)3%BSA室温下孵育30分钟;(3)0.3%TritonX-100PBS溶液室温孵育10分钟;(4)⼀抗：将⼩⿏抗⼤⿏MouseAnti⁃c⁃Kitantibody⼀抗，兔抗⼤⿏RabbitAnti⁃NGFantibody⼀抗按1:100的⽐例稀释；将⼤⿏膀胱组织冰冻切⽚取出，0.01MPBS漂洗3次，每次10分钟，然后浸⼊⼀抗⼯作液中，在4°C冰箱中孵育过夜(阴性对照实验以0.01MPBS代替⼀抗);(5)⼆抗：把切⽚由冰箱中取出，0.01MPBS漂洗3次，每次10分钟，然后将GoatAnti⁃MouseIgG⼆抗按1:300⽐例进⾏稀释，将GoatAnti⁃RabbitIgG二抗按1:500的⽐例进⾏稀释，将组织切⽚置⼊⼆抗⼯作液内室温孵育2⼩时以上;(6)细胞核染⾊。将已经孵育好的组织切⽚取出，⽤0.01MPBS漂洗3次，每次10分钟，然后加⼊DAPI中孵育10分钟进⾏细胞核染⾊;(7)封⽚。将DAPI孵育好的冰冻切⽚取出，0.01MPBS漂洗3次，每次10分钟，将0.01MPBS漂洗后的组织切⽚均匀地在载玻⽚中⼼展平，于载玻⽚中⼼滴上50%⽢油封⽚液约100µl，并且使组织标本完全浸⼊50%⽢油封⽚液中，加盖盖玻⽚，避免产⽣⽓泡，⽽后置于湿盒中以备观察。-22- 空军军医大学硕士学位论文(8)将已染好的组织切⽚置于激光共聚焦显微镜下，选取适当区域拍照并观察细胞形态及荧光表达情况。2.5TUNEL检测各组大鼠膀胱组织细胞凋亡2.5.1包埋，切片(1)脱水：将大鼠膀胱组织用4%多聚甲醛固定后，制成块状，用清水冲洗3小时。充分清洗后用酒精梯度脱水，脱水过程：70%(3h)、80%(过夜)、90%（1h）、100%I(1h)、100%II(1h)。(2)然后置于二甲苯溶液内，直至组织块透明为止。(3)透蜡：把组织块取出放入二甲苯与石蜡的混合溶液里，于60℃烘箱中3小时。(4)包埋：将浸过蜡的膀胱组织块完全埋于液态石蜡，待液态石蜡冷却成蜡块。(5)把膀胱组织蜡块装在切片机上，切成5µm的薄片，置入温水内铺开。把铺开的石蜡组织切片贴于载玻片上，放入烘箱，设定温度为37℃，时间为12小时进行烘干处理。2.5.2切片脱蜡至水大鼠膀胱组织切片从烘箱中取出置入下列各试剂中进行处理：(1)二甲苯Ⅰ，20分钟。(2)二甲苯Ⅱ，20分钟。(3)无水乙醇Ⅰ，6分钟。(4)无水乙醇Ⅱ，浸泡6分钟。(5)95%、85%、75%乙醇，各2分钟。(6)蒸馏水，2分钟。(7)0.01MPBS，5分钟。2.5.3TUNEL检测A.透化：将组织切片取出并滴入0.1%TritonX–100溶液40µl，8分钟，室温。-23- 空军军医大学硕士学位论文B.将组织切片取出并用0.01MPBS清洗3次，每次5分钟。C.充分清洗后，向切片滴3%浓度H2O240µl，室温15分钟。D.再次将组织切片用0.01MPBS清洗3次，每次5分钟。E.将配制好的TUNEL反应液50µl滴ru入切片，烘箱内37℃，60分钟。F.将组织切片取出并用0.01MPBS清洗3次，每次5分钟。G.组织切片彻底清洗后，加入50µlConverter-POD，烘箱内37℃，60分钟。H.将组织切片取出并用0.01MPBS清洗3次，每次5分钟。I.组织切片彻底清洗后，滴入40µlDAB底物，待组织标本颜色转深时，放入水中。J.将组织切片取出并用0.01MPBS清洗3次，每次5分钟。K.将切片浸入苏木素溶液5分钟，自来水冲洗2min，放入1%盐酸乙醇3秒，，自来水冲洗20分钟反蓝。L.依次75%、85%、95%乙醇溶液中，各浓度2分钟，在依次放入无水乙醇Ⅰ、II、二甲苯I、II内，各10分钟，适量中性树胶封片。2.5.4镜检(1)利用万能显微镜对切片的染色情况进行观察。(2)每个切片在400倍镜下观察并随机取3个区域进行拍照，分析大鼠膀胱细胞凋亡情况，各组进行统计比较。2.6SOD，MDA，GSH氧化指标测定2.6.1待测样本准备将大鼠膀胱组织从-80°C冰箱取出，以1:9的比例加入冰生理盐水后，用超声匀浆器匀浆，制成10%的匀浆液。将组织匀浆液放入4°C离心机内，设定3000r/min进行离心15min后，去掉沉渣，留上清液。2.6.2SOD测定本试剂盒采用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)测定超氧化物歧化酶（SOD）活力。试剂操作方法如下（表1）：-24- 空军军医大学硕士学位论文表1SOD测定配置表对照管测定管试剂一（ml）1.01.0双蒸水（ml）0.0051%的组织匀浆（ml）0.005试剂二（ml）0.10.1试剂三（ml）0.10.1试剂四（ml）0.10.1南京建成生物工程研究所（本试剂盒仅用于科研）www.njjcbio.com充分混匀30秒，37℃水浴40分钟丙二醛（MDA）测试盒说明书显色剂(ml)2.02.0（货号：A003-1）计算公式：一、实验仪器：SOD活力对照管OD值-测定管OD值3.3051%匀浆蛋白含量玻璃试管或EP管（10ml,本所有售）=、微量移液器，可见分光光度计（532nm）÷50%´稀释倍数（）÷、沸水浴箱（95(U/mgprot)对照管OD值0.005(mgprot/ml)℃左右）、旋涡混匀器、离心机二、适用范围：2.6.3MDA测定本试剂盒可测血清、血浆、乳汁等细胞外液；肿瘤细胞、红细胞、白细胞、各种培养细胞以及各过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA）能够与硫代巴比妥酸（TBA）缩合种动植物组织等样本中MDA的含量后，形成红色产物，并在532nm处有最大吸收峰。因为底物为TBA，所以此法称三、测定意义：为TBA机体通过酶系统和非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧法。具体操作如下表（表2）：化作用，并由此形成脂质过氧化物，使组织细胞受损伤。表2MDA测定配置表四、操作表：标准管空白管测定管对照管10nmol/ml标准品(ml)a*无水乙醇（ml）a*测试样品（ml）a*a*试剂一（ml）a*a*a*a*混匀（摇动几下试管架）试剂二（ml）3333试剂三（ml）11150%冰醋酸（ml）1旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃沸水浴40分钟，取出后流水冷却，然后3500～4000转/分，离心10分钟，（3000转/分以下离心时间需延长，目的使沉淀完全）。取上清，532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。a*表示所取的样品量、标准品量、无水乙醇的量、试剂一的量，四者均相等。五、计算公式：组织中MDA含量计算公式:1、血清（浆）等液体样本中MDA含量计算公式：血清（浆）中MDA测定OD值对照OD值−-25-标准品浓度样本测试前=××含量（nmolml/1）标准OD值空白OD值−（）0nmolml/稀释倍数2、组织中MDA含量计算公式：组织中MDA含量测定OD值对照OD值−标准品浓度待测样本蛋白浓度=×÷（）nmolmgprot/标准OD值空白OD值−（）10nmolml/（mgprotml/）公司地址：南京市玄武区中央路258-27号新立基大厦邮政编码：210009E-Mail：njjcbio@vip.163.com联系电话：025-83360321、83360969、83551389技术支持：025-83360272传真号码：025-83227943 谷胱甘肽（GSH）测试盒说明书（货号：A006-1除蛋白）一、实验仪器：试管、微量移液器、旋涡混匀器、离心机、可见分光光度计（波长420nm）空军军医大学硕士学位论文。二、适用范围：组织中MDA含量=测定OD值−对照OD值×标准品浓度÷待测样本蛋白浓本试剂盒可测动物血清、血浆、组织以及全血、红细胞、培养细胞、培养液中的GSH的含量。度(nmol/mgprot)标准OD值−空白OD值(10nmol/ml)(mgprot/ml)三、测定意义：2.6.4GSH是一种低分子自由基清除剂，它可清除OGSH测定-2、H2O2、LOOH。还原型谷胱甘肽是蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种小分子肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，并且是二硫代二硝基苯甲酸于硫基化合物反应时能产生一种黄色化合物，可进行比GPX和GST两种酶类的底物，为这二种酶分解氢过氧化物所必需，并且能稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其它辅因子受氧色定量测定。具体操作如下（表3）：化损伤。最近还证明GSH也参与使VE恢复到还原态的作用。GSH在防止动脉粥样硬化、冠心病、防衰老、抗肿瘤、防老年性痴呆等疾病的预防、恢复、治疗的研究过程中起到重要参考作用。上清液制备:取待测样本0.5ml加入试剂一应用液2ml中充分混匀，在四、操作步骤：3500~4000转/分条件下离心10分钟，然后取上清液1ml进行显色反应。1、上清液制备：取待测样本0.5ml,加试剂一应用液2ml混匀，3500～4000转/分离心10分钟，取上清液1ml进行显色反应。表3MDA测定配置表2、显色反应：空白管标准管测定管试剂一（ml）1.020μmol/LGSH标准（ml）1.0上清液（ml）1.0试剂二（ml）1.251.251.25试剂三（ml）0.250.250.25试剂四（ml）0.050.050.05混匀，静置5分钟，420nm处，1cm光径，蒸馏水调零比色测各管OD值。五、计算公式：组织中GSH含量计算公式:1、全血中GSH含量计算公式：全血中GSH含量测定OD值-空白OD值标准品浓度GSH分子量样本测试前血红蛋白浓度组织中GSH含量=×=测定OD值-空白OD值×标准品浓度×GSH×分子量×样本测试前稀释倍数×÷÷待测匀浆蛋白浓度(/)gGSHgHb标准OD值-空白OD值（20×10−6mol/L)（307）稀释倍数(gHb/L)-3(mgGSH/gprot)标准OD值-空白OD值(20×10mmol/L)(307)(gprot/L)2、血清（浆）中GSH含量计算公式：2.7血清（浆）中统计学分析GSH含量本研究数据测定OD值-空白OD值通过SPSS23标准品浓度统计软件进行统计学分析，GSH分子量样本测试前采用均数±=×××(/mgGSHL)标准OD值-空白OD值（20×10m-3mol/L)（307）稀释倍数标准差（x±S）表示，应用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t。以P≤0.05为差3、组织中GSH含量计算公式：异有统计学意义。组织中GSH含量测定OD值-空白OD值标准品浓度GSH分子量样本测试前待测匀浆蛋白=×××÷(/mgGSHgprot)标准OD值-空白OD值（2010×-3mmol/L)（307）稀释倍数浓度prot/L)(g3结果公司地址：南京市玄武区中央路3.1各组HE染色表现258-27号新立基大厦邮政编码：210009E-Mail：njjcbio@vip.163.com联系电话：025-83360321、83360969、83551389技术支持：025-83360272传真号码：025-83227943在普通光学显微镜下，NC组膀胱逼尿肌横截面及纵切面的肌纤维走行整齐，连接紧密，少量胶原纤维填充间隙，神经结构完整（图2-A,D）。DM组能够观察到膀胱黏膜显著增生，肌纤维走行紊乱，连接结构错乱，肌纤维有不同程度断裂，间隙明显增宽，有胶原纤维填充，肌细胞明显萎缩，有部分淋巴细胞存在，血管增生充血明显，-26- 空军军医大学硕士学位论文神经组织少见（图2-B,E）。INOSINE组逼尿肌横截面和纵切面肌纤维走行的较整齐，相互连接较为紧密，间隙被少量胶原纤维组织填充。神经组织较多见（图2-C,F）。同组大鼠8周和4周比较，正常对照组和肌苷治疗组前后对比无明显差异，糖尿病组8周较4周时逼尿肌萎缩变薄，排列更加紊乱，黏膜层增生明显，肌束间大量胶原纤维填充，血管增生充血更加明显，神经束更加少见。NCDMINOSINE4wk8wk注↑逼尿肌（横行、纵行），增生黏膜，图示肌苷治疗组逼尿肌排列及黏膜增生情况较糖尿病组明显改善。图2镜下观察正常对照组、糖尿病组和肌苷治疗组大鼠膀胱组织4周（A,B,C）和8周(D,E,F)时HE染色（×100）3.2电镜观察描述NC组：肌细胞排列整齐、紧密，各细胞器结构普遍正常，逼尿肌及间质细胞的胞核、胞膜无显著改变，各细胞结构完整。DM组：肌细胞排列紊乱，间隙增宽、间隙内胶原填充、中间连接消失。可见核外膜增厚呈板状，核周间隙增宽，染色质结块、边集，不规则堆积于核周内侧，可见部分核碎片于核质内。线粒体数量减少，内室肿胀呈大泡状，基质稀释，嵴变短、数目减少、排列紊乱，形成较宽的电子透亮区，相邻线粒体膜破裂融合。间质细核被膜内陷，核周间隙增宽。胞线粒体肿胀、空化明显，部分细胞质内可见线粒体坏死，内质网物扩张，液泡化，肌丝排列紊乱。INOSINE组：肌细胞间隙正常，部分中间连接消失，包膜内面存在大量吞饮小泡。肌细胞核膜轻度内陷，核仁正常，染色质无结块、边集现象。核膜无增厚，核周间隙无增宽，线粒体-27- 空军军医大学硕士学位论文数量多，无肿胀。内质网物无扩张，无液泡化。肌丝排列较为整齐、电镜下清晰可见。与DM组相比，INOSINE组细胞质内偶见线粒体坏死，偶见肌细胞线粒体发生空化及肿胀，间质细胞内的线粒体同样较少发现空化现象。同组大鼠8周和4周比较，NC组和INOSINE组超显微结构无显著差异，DM组8周较4周时逼尿肌细胞排列更加紊乱，且细胞间隙有大量渗出，线粒体空泡化更加明显。（图3）NC4wkDM4wkINOSINE4wkNC8wkDM8wk-28- 空军军医大学硕士学位论文INOSINE8wk图示INOSINE组逼尿肌细胞和间质细胞超显微结构较DM组明显改善。图3电镜下观察各组大鼠膀胱组织4周（A,B,C）和8周(D,E,F)时超显微结构（×6000，×12000，×20000）。3.3免疫荧光观察分析激光共聚焦显微镜下观察，c-Kit主要在黏膜下层表达，绿色；NGF主要在黏膜层表达，阳性呈红色。NC组红色和绿色荧光信号较DM组和INOSINE治疗组强(图4-A,D)，INOSINE组红色和绿色荧光信号较DM组强(图4-C,F)，DM组荧光信号最弱(图4-B,E)。同组8周与4周相比，糖尿病组8周较4周弱，NC组和INOSINE组同组变化不明显。NC4wkDM4wkINOSINE4wkNC8wkDM8wk-29- 空军军医大学硕士学位论文INOSINE8wk图示INOSINE组的红色和绿色荧光信号强度较DM组强，介于NC组和DM组之间。图4激光共聚焦显微镜下观察大鼠膀胱组织中NGF和c-kit的表达（标尺20µm）（间接免疫荧光双标法，×400）3.4各组TUNEL凋亡分析由图4可见，在第4周和第8周时，NC组膀胱黏膜上凋亡细胞数量均较少，但是DM组凋亡细胞数量相对NC组明显增多，INOSINE组较DM组凋亡细胞数量显著减少(P<0.01)。同组大鼠8周和4周比较细胞凋亡差异无统计学意义（P>0.05）。（图5）NCDMInosine4wk8wk注凋亡细胞细胞凋亡率组别第4周第8周NC组4.65±1.855.48±2.00∗∗DM组11.68±3.0410.51±0.90△△INOSINE组7.00±1.727.24±1.66与NC组同时间点比较，∗P<0.01;与DM组同时间点比较，△P<0.05。图5NC组、DM组和INOSINE组大鼠膀胱组织4周（A,B,C）和8周(D,E,F)时tunnel染色及细胞凋亡率。(×400)-30- 空军军医大学硕士学位论文3.5各组氧化应激指标测定结果分析比较4周时，DM组大鼠膀胱组织中SOD、GSH含量明显高于NC组，MDA含量明显低于NC组。INOSINE组与DM组比较，INOSINE组大鼠膀胱组织中SOD含量明显减少，MDA含量明显增加，GSH无明显差异，INOSINE与NC组比较,SOD和MDA无明显差异，GSH增多（P<0.05）。8周时，DM组大鼠膀胱组织中SOD、GSH含量明显低于NC组和INOSINE组，但是与NC组和INOSINE组相比，MDA含量显著增加(P<0.01)。INOSINE组与NC组比较，SOD、GSH和MDA含量无明显差异(P>0.05)。同组8周与4周比较，DM组较DM组MDA含量明显增多，INOSINE组MDA明显减少(P<0.01)，NC组无明显变化。此外，NC组膀胱湿重无明显变化，DM组及INOSINE组膀胱湿重明显增加且与同周龄NC组存在显著差异（P<0.01）。表4。表4各组大鼠膀胱最大容量、湿重和膀胱组织MDA、SOD及GSH活性变化膀胱最大容积（ml）膀胱湿重(mg)MDA（nmol/mgprot）SOD(U/mgprot)GSH（µmol/gprot）组别n第4周第8周第4周第8周第4周第8周第4周第8周第4周第8周NC组102.04±0.692.99±0.63185.9±31.10202.60±25.1849.18±15.8841.82±4.33187.60±4.40112.36±3.39199.06±29.08221.61±27.98******DM组102.71±0.957.86±2.28231.4±34.93281.80±24.3233.94±8.8965.62±16.93195.64±3.9295.50±5.32250.43±55.04168.57±11.52****∆∆∆INOSINE组103.79±0.927.65±1.25234.8±34.15270.90±27.6152.38±14.9038.88±2.24186.44±6.22108.43±2.71242.06±69.71210±32.30*∆注与NC组比较P<0.01,与DM组比较P<0.01.4讨论本研究的主要以对抗氧化应激损伤为切入点，氧化应激是指机体在遭受有害刺激时，活性氧自由基和活性氮自由基等一些高活性分子生产过多，导致氧化系统和抗氧化系统比例失衡，从而造成组织损伤的现象，其是糖尿病慢性并发症的主要机制之一[26]。自由基在生物体内是一种非常常见的生物因子，例如NO自由基、羟自由基、烷[34,66]自由基、超氧根阴离子和脂质过氧化物自由基等均是人体内常见的自由基。ROS一族的稳定性较差，但在氧化应激损伤中影响最为突出，其可参与多种信号通路，导致神经元发生坏死或是凋亡，进而影响神经的运动及感觉功能。具目前报道显示，脑-31- 空军军医大学硕士学位论文[67]组织在发生缺血再灌注现象时，ROS会大量急剧产生，从而对脑组织造成损伤。同时ROS能够也能够通过多种途径促使糖尿病发生膀胱病变。糖尿病膀胱组织由于膀胱张力反复大幅度变化导致膀胱缺血再灌注现象频繁发生，一方面会促使氧自由基的生成数量显著增加，而氧自由基则会将脂质分子中的不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂质MDA等小分子代表性产物，使线粒体受到损伤；另一方面在缺氧的状态2+下，膀胱组织肌质网和线粒体大量释放出钙离子，导致逼尿肌细胞内游离的Ca大幅度增加，促使钙蛋白酶和磷脂酶A2被激活，最终导致细胞膜和细胞器受到不同程[4,68,度的破坏，另外，细胞膜发生损伤及钙表现为动态失衡均与逼尿肌功能障碍有关69]。至今为止已经有大量研究结果显示，肌苷能够有效对抗氧化应激损伤。有研究用NADH脱氢酶抑制剂鱼藤酮来抑制呼吸链，从而使鼠胚脊髓细胞受到破坏，肌苷可使神经元的存活率和正常形态细胞数量显著增多，且对肌苷浓度具有依赖性，其[70]机制是胶质细胞可降解肌苷形成尿酸，尿酸可以保护神经元，防止缺氧损伤，尿[71]酸又是重要的生理性抗氧化剂之一，为过氧亚硝基阴离子的清除剂，抑制H2O2和[45]过氧亚硝基阴离子的积聚，稳定细胞内钙离子平衡，保护线粒体的功能。曾有临床试验表明口服肌苷可提高血清内尿酸水平，并维持在高水平达一年之久，而无任[46]何副作用。此外，肌苷还具有减弱核蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶作用从而减缓受损细胞内ATP消耗，避免细胞能量耗竭，并能降低NO合酶，减少NO合成，促使过亚硝酸盐生成减少，进而减少细胞所受的氧化损伤，保护细胞的膜性结构，也可以进入细胞内部，激活蛋白激酶N，启动轴突生长及再生的基因表达，肌苷还可以[72,73]激活PI-3K/ArK或MEE/Erk通路，升高Bcl-2水平，进而抑制细胞的凋亡。本研究小组于2009年研究报道，肌苷对膀胱出口部分梗阻造成的膀胱功能损害具有显著[51]的保护作用，且该保护作用与肌苷的抗氧化作用有关。综上所述，肌苷可以通过其抗氧化和抗自由基机制，保护糖尿病膀胱免受氧化损伤。本研究在以往关于DCP模型研究的文献基础上，利用STZ诱导大鼠模型，并依照本小组前期研究，应用适当剂量的肌苷对大鼠DCP进行治疗干预。通过对糖尿病大鼠膀胱组织常规病理HE染色和透射电镜观察肌苷组织结构及超显微结构的改变。HE染色提示：与DM组比较，逼尿肌横截面和纵行走行的肌束排列较为整齐，肌束-32- 空军军医大学硕士学位论文间相互连接紧密，肌束间隙被少量结缔组织所填充。同组大鼠8周和4周比较，NC组及INOSINE组无明显差异；透射电镜提示：INOSINE组：肌细胞间隙正常，部分中间连接消失，包膜内面存在大量吞饮小泡。肌细胞核膜轻度内陷，核仁正常，染色质无结块、边集现象。核膜无增厚，核周间隙无增宽，线粒体数量多，无肿胀。内质网物无扩张，无液泡化。肌丝排列较为整齐、电镜下清晰可见。与DM组相比，INOSINE组细胞质内偶见线粒体坏死，偶见肌细胞线粒体发生空化及肿胀，间质细胞内的线粒体同样较少发现空化现象。同组大鼠8周和4周比较，NC组和INOSINE组超显微结构无显著差异，可见inosine可改善糖尿病大鼠膀胱病理改变和[74]平滑肌细胞表型转化，对维持DCP平滑肌细胞功能有重要意义。NGF对神经的存活、修复、血管再生、氧化应激、炎性介质水平均有广泛的影响，参与糖尿病神经[18]病变的发生和发展。糖尿病可导致膀胱组织内NGF减少，从而对膀胱内神经血管[75]等造成损伤。c-kit是膀胱间质细胞（ICCs）特异标志物，而膀胱中的ICCs是自主神经末梢与逼尿肌之间信号的有效转导,这些细胞可能负责产生电位和诱导逼尿肌收[76]缩。在本研究中，对糖尿病大鼠膀胱组织进行免疫荧光双标法，观察到糖尿病组的NGF和c-kit均减少，且随患病时间递减，在对糖尿病大鼠应用inosine治疗后，观察到NGF和c-kit荧光信号显著增强，表明肌苷可对抗糖尿病对神经和膀胱间质细胞[77]的损伤。已有研究表明，糖尿病可显著增加细胞凋亡，通过TUNEL检测，糖尿病组大鼠膀胱细胞凋亡率较正常对照组显著增高，肌苷治疗组的细胞凋亡率则较糖尿病组显著降低，且与正常对照组无差别，这说明Inosine可有效降低糖尿病大鼠膀胱组织细胞的凋亡率，维持膀胱结构稳定，进而保护膀胱功能。在对大鼠膀胱组织进行生理氧化指标检测时，发现糖尿病大鼠在应用肌苷治疗后，第4周时，糖尿病组SOD、GSH含量明显高于正常对照组，MDA含量明显低于正常对照组，这可能与[57]应激反应有关，但是肌苷治疗组与糖尿病组比较，肌苷治疗组大鼠膀胱组织中SOD含量明显减少，MDA含量明显增加，GSH无明显差异。第8周时，肌苷治疗组大鼠膀胱组织中MDA含量明显降低，SOD和GSH含量明显增加。已有研究表明：MDA是一种反映氧化应激的通用标记，在糖尿病大鼠膀胱组织中含量增高。SOD是生物体内清除自由基的关键物质，是生物体内常见的重要抗氧化酶之一。GSH2-则是一种低分子自由基的清除剂，其可有效清除O、H2O2、LOOH等离子，已被研究证实是机体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，能与自由基、重金属等有害物-33- 空军军医大学硕士学位论文[78,79]质结合，从而把有毒物质转化为无害的物质排出机体。在本研究中，大鼠膀胱组织的这些指标变化也证明了inosine具有抗氧化作用，抑制氧自由基的产生和脂质过氧化反应的发生。因此，肌苷能有效对抗氧化应激损伤，对糖尿病大鼠膀胱具有显著保护作用，为未来肌苷治疗DCP临床应用提供了一定的理论基础及实验证据。第二部分肌苷对糖尿病大鼠膀胱组织piezos离子通道表达及分布的影响1材料1.1实验动物健康成年清洁型SD大鼠(第四军医大学动物实验中心提供)，雄性，8周龄，(250±20)g，54只，实验动物合格证号：SCXK(军)2012⁃0007，于动物中心购回适应性喂养1周后进行造模。动物饲养环境；室温24°C左右，提供大鼠自由摄食、饮水条件，每日9:00-10:00投喂饲料，更换垫料2次，或视垫料浸湿程度更换。1.2实验分组将SD成年健康大鼠随机分成3组，每组18只大鼠：正常对照组（等量柠檬酸盐缓冲液腹腔注射一次），糖尿病组（1%STZ按60mg/kg腹腔注射1次，待造模成功后给予每日生理盐水腹腔注射）和肌苷治疗组（1%STZ按60mg/kg腹腔注射1次，待造模成功后给予每日肌苷注射液150mg/d分两次腹腔注射），首次1%链尿佐菌素诱导后空腹血糖未达到16.7mmol/L可重新追加1%STZ，直至空腹血糖达到标准。1.3药品与试剂链脲佐菌素(STZ)，Sigma，美国肌苷（inosine），Sigma，美国RabbitAnti-Piezo1antibody，abcam，美国GoatAnti-RabbitIgG，earthox，美国-34- 空军军医大学硕士学位论文MouseAnti-c-Kitantibody，santacruz，美国GoatAnti-MouseIgG，earthox，美国SuperM-MLV反转录酶，BioTeke，北京高纯总RNA快速提取试剂盒，BioTeke，北京2×PowerTaqPCRMasterMix，BioTeke，北京SYBRGreen，SY1020，Solarbio，北京RabbitAnti-Piezo2antibody，origene，北京RNase固相清除剂，天恩泽，北京BCA蛋白浓度测定试剂盒，wanleibio，沈阳预染蛋白分子量标准，Fermentas，加拿大Piezo1，alomone，以色列Piezo2，origene，北京羊抗兔IgG-HRP，wanleibio，沈阳内参抗体β-actin，wanleibio，沈阳1.4主要试剂配制1.4.1柠檬酸缓冲液的配制柠檬酸（FW：210.14）2.1g加入双蒸水100mL中配成A液。柠檬酸钠（FW：294.10）2.94g加入双蒸水100mL中配成B液。1.4.2链脲佐菌素配制液将A、B液按1:1进行混合，PH试纸测量PH值，调节PH=4.2～4.5，即得到配置STZ所要求的柠檬酸缓冲液。1.4.34%多聚甲醛固定液配制称取40g多聚甲醛，加入800ml0.01MPBS缓冲液，加热到60°C，采用磁力搅拌并加入适当氢氧化钠使粉末完全溶解，用0.01MPBS缓冲液定容至1000ml，充分混匀后密封保存。1.4.40.01MPBS溶液配制将PBS干粉11.34g置入800ml蒸馏水中，充分搅拌使其完全溶解，并用HCl或NaOH在PH试纸下调节PH值于7.4，最终用蒸馏水定容至1000ml。-35- 空军军医大学硕士学位论文1.5实验器材与材料激光共聚焦显微镜，OlympusFV1200，日本超纯水系统，NW10LVF，香港紫外分光光度计，NANO2000，美国荧光定量PCR仪，Exicycler96，韩国电泳仪，DYY-7C，中国转移槽，DYCZ-40D，中国双垂直蛋白电泳仪，DYCZ-24DN，中国凝胶成像系统，WD-9413B型，中国酶标仪，ELX-800，美国2方法2.1糖尿病动物模型建立及取材造模之前给予大鼠禁食24小时，不禁水，正常对照组大鼠给予一次性腹腔注射等体积柠檬酸盐缓冲液，糖尿病组和肌苷治疗组大鼠则按60mg/kg一次腹腔注射1%STZ溶液(pH=4.5)，1周后取尾静脉血测大鼠血糖，若大鼠血糖在16.7mmol/L以上则视为糖尿病大鼠造模成功，造模成功后每周测1次血糖和体重。糖尿病大鼠模型诱导成功后开始腹腔注射肌苷，肌苷治疗组接受inosine(75mg/kg,2/日)治疗，[45,64]糖尿病组接受同量等渗盐水。正常对照组、糖尿病组和肌苷治疗组分别于1周、2周和8周后每组取6只SD大鼠，采取10%水合氯醛按0.3mL/100g体重麻醉，仰卧固定，生理盐水灌注后，在耻骨上作约3cm的纵行手术切口充分暴露露膀胱，去除输尿管及膀胱浆膜层后取出膀胱，反复用等渗盐水清洗，再用滤纸吸干膀胱表面水分，称量膀胱湿重，沿膀胱纵轴切取膀胱组织适量，采用4%多聚甲醛溶液对组织进行固定，剩余膀胱组织冻存于-80°C冰箱备用。2.2piezo1和c-kit免疫荧光观察2.2.1物品准备小鼠抗大鼠MouseAnti⁃c⁃Kitantibody一抗，兔抗大鼠RabbitAnti⁃Piezo1antibody一抗;GoatAnti⁃MouseIgG二抗，GoatAnti⁃RabbitIgG二抗;一抗稀释液;-36- 空军军医大学硕士学位论文二抗稀释液;0.01MPBS溶液;0.1MPBS溶液;DAPI;50%甘油封片液;标本瓶;冰冻切片机;防脱载玻片;盖玻片;4°C冰箱;洗涤皿;10µl移液器;1ml移液器;湿盒。2.2.2实验步骤2.2.2.1膀胱组织冰冻切片的制作将⼤⿏膀胱组织⽤4%多聚甲醛固定24h后，依次⽤20%、30%蔗糖溶液梯度脱⽔过夜，在冰冻切⽚机内-20°C温度下，⽤OCT冰冻包埋液包埋组织，冰冻切⽚机沿垂直于粘膜层⽅向全层切取10µm冰冻切⽚，即刻贴在防脱载玻⽚表⾯，放⼊-20°C冰箱冻存储待免疫荧光双标染⾊。2.2.2.2免疫荧光染色(1)用0.01MPBS充分漂洗冰冻切片10分钟×3次;(2)3%BSA室温下孵育30分钟;(3)0.3%TritonX-100PBS溶液室温孵育10分钟;(4)一抗：将小鼠抗大鼠MouseAnti⁃c⁃Kitantibody一抗，兔抗大鼠RabbitAnti⁃Piezo1antibody一抗按1:100的比例进行稀释；将大鼠膀胱组织冰冻切片取出，0.01MPBS漂洗3次，每次10分钟，然后浸入一抗工作液中4°C冰箱中孵育过夜(阴性对照实验以0.01MPBS代替一抗);(5)二抗：把切片由冰箱中取出，0.01MPBS漂洗3次，每次10分钟,然后将GoatAnti⁃MouseIgG二抗按1:300比例进行稀释，GoatAnti⁃RabbitIgG二抗按1:500的比例进行稀释，将组织切片置入二抗工作液内室温孵育2小时以上;(6)细胞核染色。将已经孵育好的组织切片取出，0.01MPBS漂洗3次，每次10分钟，然后滴加DAPI工作液并孵育10分钟进行细胞核染色;-37- 空军军医大学硕士学位论文(7)封片。将DAPI孵育好的冰冻切片取出，0.01MPBS漂洗3次，每次10分钟，将0.01MPBS漂洗后的组织切片均匀地在载玻片中心展平，于载玻片中心滴上50%甘油封片液约100µl，并且使组织标本完全浸入50%甘油封片液中，加盖盖玻片，避免产生气泡，而后置于湿盒中以备观察。(8)将已染好的组织切片置于激光共聚焦显微镜下，选取适当区域拍照并观察细胞形态及荧光表达情况。2.3QPCR检测大鼠膀胱中Piezo1和Piezo2mRNA表达2.3.1总RNA提取(1)把样本放入无RNA酶离心管中，并向离心管内加入RIPA裂解液完全浸没样本，于冰上利用超声研磨器对样本充分研磨。(2)然后向无RNA酶离心管中加入氯仿200ul，密闭条件下充分混匀，室温静置5分钟。(3)将盛有样本混悬液的无RNA酶离心管放入离心机内离心，设定参数为4℃，12000rpm，12分钟，离心后取下层无色透明的水相进行下一步操作。(4)向已取出来的水相待测样本中加入1倍体积的70%乙醇，充分摇匀后，移至吸附柱中，继续离心，设定参数：4℃，12000rpm，40秒，弃废液。(5)将去蛋白液500μl用移液器滴入吸附柱中，继续离心，设定参数：4℃，12000rpm，40秒，弃废液。(6)将漂洗液500μl移液器滴入吸附柱中，将吸附柱静置2min后，再次进行离心，设定参数为4℃，12000rpm，40秒，弃废液。(7)采用1.5ml容量的收集管承载吸附柱，利用离心机充分离心，设定参数：4℃，12000rpm，3min，弃废液。(8)取一新的无RNA酶离心管，放入吸附柱，然后再用移液器量取RNase-freeddH2O30μl缓慢滴入离心管中，静置3min，设定离心机参数：4℃，12000rpm，3min，得到总RNA。2.3.2反转录(1)在无RNA酶离心管内加入如下试剂（冰上操作）：-38- 空军军医大学硕士学位论文待加入RNA样本的量需要以提取的RNA样本浓度为参照，从而使RNA浓度一致：oligo(dT)151µlrandom1µldNTP2µl利用超纯水将总反应体积配为14.5µl。(2)将混合液加热至70℃并维持5分钟，随后即刻转移至冰上冷却3min，同时向无RNA酶离心管中加入以下试剂：5×Buffer4µlRNasin0.5µl(3)用移液器向无RNA酶离心管中加入M-MLV1μl，充分摇匀。(4)将离心管放入25℃温水中12min，再放入42℃热水中1小时。(5)最后将盛有混合液的离心管放入95℃热水中6min。2.3.3实时荧光定量分析反应体系：cDNA模板1µl上下游引物（10µM）各0.5µlSYBRGREENmastermix10µl用超纯水补足到20µl反应条件：Incubateat94.00℃，for10minIncubateat94.00℃，for10sIncubateat60.00℃，for20sIncubateat72.00℃，for30sScanGotoline2，Cycle40Incubateat72.00℃，for2min30sIncubateat40.00℃，for5min30sMelting60℃to94℃，Every1.0℃，1s-39- 空军军医大学硕士学位论文Incubateat25.00℃，for1min应用荧光定量PCR仪自动绘制熔解曲线图并逐一分析，内参照为β-actin的-ΔΔCTmRNA表达，采用相对定量(2)法分别得到Piezo1和Piezo2的mRNA相对表达值。引物序列见表5(生工生物工程（上海）有限公司合成)。表5QPCR引物序列及长度GenePrimersequencePrimerlength(bp)Tm(℃)Amplicon(bp)F:TGCCTCAGCCTCCTCTTC1855.3Piezo1147R:CTTCAGGTCCAGCCTTGTA1953.1F:TAAGGAGTTCATCGGCAATA2053.5Piezo2180R:AGGCAGCCAAACAGCAAT1856.2F:GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC2560.1b-actin155R:GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT2562.02.4Westernblotting检测大鼠膀胱中Piezo1和Piezo2蛋白2.4.1蛋白质抽提a)裂解液于室温融化后，混入1%体积的PMSF备用。b)依每个样本质量加入相应体积的裂解液，冰浴条件上，利用超声研磨器研磨10分钟。c)将用超声研磨器研磨好的样本组织混悬液放入离心机中，设定离心机工作参数4℃，12000rpm，12min，留上清液进行下述操作。2.4.2样本组织中蛋白质的定量步骤：A.绘制标准曲线：把浓度为0.5µg/µlBSA标准液分别以0、1、2、4、8、12、16、20µl体积加入96孔酶标板，再用0.01MPBS将每个孔液体量补到20µl。B.待测组织蛋白质液：取0.01MPBS19µl加入待测组织蛋白液1µl，充分混合。C.BCA反应：A液与B液以50：1即可混匀使用，以每个孔液体量200µl体积作为标准，加入BCA工作液，将96孔板密封后放在37℃烘箱反应30分钟，观察到96孔板内各孔混合液由绿色变成紫色即可。D.酶标仪数据读取：待酶标仪充分预热后，将96孔板按照字母顺序对应放于工作台上，选取扫描波长562nm，测定OD值并记录数据。-40- 空军军医大学硕士学位论文E.将待测样本组织蛋白对应的OD值带入回归方程计算待测组织蛋白浓度度。2.4.3SDS-PAGE(1)组装电泳装置：用流水彻底清洗玻璃板后，用蒸馏水冲洗2遍，再用滤纸沿玻璃板边缘吸干水分，放置在清洁空间内晾干后组装。把短玻璃板插在电泳槽的内侧，在电泳槽的外侧插入长玻璃板，确保玻璃板底边紧密连接，然后楔子将两个玻璃板充分固定，再次确保两个玻璃板的底边密封性是否良好，最后向两玻璃板内灌入凝胶。(2)聚丙烯酰胺凝胶：选取5%浓度的聚丙烯酰胺凝胶，分离胶浓度为10%，由下而上进行灌胶。首先，沿玻璃板一端灌入分离胶，用水密封后，静置数分钟。观察到分离胶聚合后，将水弃去，随后灌入已经配制好的浓缩胶，最后用梳子封口，1小时后，将梳子轻轻拔出，开始上样。（表6）：表6聚丙烯酰胺凝胶配方胶浓度ddH2O（ml）30%凝胶储备液Gelbuffer10%SDS5%5.71.72.50.110%4.13.32.50.1注：分离胶用分离胶缓冲液。浓缩胶用浓缩胶缓冲液。(3)蛋白上样液制备：用5×LoadingBuffer和0.01MPBS稀释待测蛋白液，放进沸水中5分钟，得到上样液20µl，内含有蛋白40µg。(4)SDS-PAGE：取出梳子，将已经配制好的电泳液倒入电泳槽中，凝胶上的每个梳子孔各加上样液20µl，Marker5µl，电流设为最大值，电压设定为80V，电泳时间为两个半小时。2.4.4转印(1)准备：提前准备转印用的滤纸、海绵等，将其充分浸于转印液中，根据实验需要剪所需尺寸的PVDF转印膜，并在转印膜的正面适当位置写上记号，随后将已裁减好的PVDF转印膜用浓度为100%甲醇充分浸润，最后将PVDF转印膜取出至于转印液中，应用自动摇床充分摇动。(2)制备“三明治”：待电泳完毕，切断电源，迅速取出双层玻璃板，用刀片轻轻将玻璃板起开，弃掉浓缩胶部分，适当修整分离胶，将选取好的凝胶放入-41- 空军军医大学硕士学位论文转印液，充分润湿15分钟。然后于转印夹负极到正极的顺序依次铺海绵1张，滤纸五张，裁剪好的凝胶，PVDF转印膜（注意膜正面和凝胶接触），最后在PVDF转印膜的上面再铺滤纸五张，海绵1张。(3)“三明治”制作成功后，转印夹要求充分夹紧，随后放于转印槽，用转印液充分浸没，接通转印槽电极，设定最大电流值，设定电压80V转印一个半小时。2.4.5封闭(1)待转印在一个半小时后结束，PVDF膜即可取出，将其浸没于TBST缓冲液中，应用自动摇床充分摇动五分钟。(2)随后把PVDF膜从TBST缓冲液中取出并放入脱脂奶粉所配成的溶液中，摇床轻轻摇动一小时。2.4.6孵育一抗(1)一抗采用5%（M/V）脱脂奶粉溶液进行适当稀释。(2)将获得适当稀释后的抗体工作液用移液器转移至杂交袋中，同时将封闭好的PVDF膜放入杂交袋中，密封（表7）。表7一抗孵育条件一抗名称稀释比例孵育条件Piezo11：5004℃过夜Piezo21：10004℃过夜2.4.7孵育二抗(1)把已经孵育过一抗的PVDF膜取出，浸没于TBST缓冲液内，摇动5分钟换新TBST缓冲液，重复4次。(2)将二抗用5%（M/V）脱脂奶粉溶液根据所需浓度稀释。(3)将已稀释好的二抗工作液用移液器转移至杂交袋内，随后放进PVDF膜，密封（表8）。表8二抗孵育条件一抗名称二抗名称稀释比例孵育条件Piezo1羊抗兔IgG-HRP1：500037℃45min-42- 空军军医大学硕士学位论文Piezo2羊抗兔IgG-HRP1：500037℃45min2.4.8ECL底物发光(1)将孵育好二抗的PVDF膜取出，浸没于TBST，摇动5分钟后重新换TBST，重复6次。(2)将ECL中的发光试剂A和B以1:1混合。(3)取保鲜膜平铺在实验台上，利用滤纸将PVDF背面的液体充分吸净，铺展在保鲜膜上，将ECL发光液在PVDF的正面均匀洒上，室温静置5分钟。(4)最后再取1张保鲜膜在PVDF膜上铺平，用玻璃棒滚压出液体，放于暗盒内，立即在暗室内进行曝光处理。2.4.9抗体剥脱(1)把适当曝光处理的PVDF膜取出，至于蒸馏水内，摇动5分钟后换重新换蒸馏水，重复2次。(2)将蒸馏水倒出，倒进剥脱液，使其充分淹没PVDF膜，随后摇动15分钟。(3)再次应用蒸馏水对PVDF膜进行冲洗，换蒸馏水，置于自动摇床10分钟，重复2次。2.4.10封闭(1)用TBST缓冲液充分浸润PVDF膜，摇动5分钟。(2)最后用脱脂奶粉溶液浸润PVDF膜，放在摇床上摇动1小时即可。2.4.11孵育内参抗体内参抗体孵育及ECL底物发光的操作步骤同以上步骤。内参一二抗体孵育条件见表9、表10。表9内参抗体孵育条件内参抗体名称稀释比例孵育条件β-actinantibody1：10004℃过夜表10二抗孵育条件一抗名称二抗名称稀释比例孵育条件β-actinantibody羊抗兔IgG-HRP1：500037℃45min-43- 空军军医大学硕士学位论文2.4.12结果分析在暗室内对胶片进行扫描，应用Gel-Pro-Analyzer计算光密度值，采用待测蛋白灰度与β-actin蛋白灰度之比值来代表待测蛋白的相对表达量。2.5统计学分析采用SPSS23软件进行统计学分析，数据采用x±s表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t统计方法。将P<0.05定义为差异有统计学意义。3结果3.1免疫荧光观察分析激光共聚焦显微镜(×400倍)下观察，c-Kit抗体主要在黏膜下层和肌肉包膜外表达，黏膜下层可见较多梭形分布间质细胞表达，阳性呈绿色;Piezo1抗体遍布细胞表面，尿路上皮及肌细胞间信号较其它区域信号更强，阳性呈红色。由图1可见第1、2周时，与NC组和Inosine组相比较，DM组红色信号较强；与NC组比较，Inosine组荧光信号无显著差别，第8周时各组红色信号强度无显著差异。绿色荧光信号在第1周时各组无显著差异，第2、8周时，与NC组和Inosine组相比较，DM组较弱；与NC组相比，Inosine组绿色荧光信号较弱，NC组绿色荧光信号最强（图6）。DAPIPiezo1c-kitMergeNC1wkDM1wk-44- 空军军医大学硕士学位论文INOSINE1WKNC2wkDM2wkINOSINE2WK-45- 空军军医大学硕士学位论文NC8wkDM8wkINOSINE8WK图6在第1、2、8周时，利用免疫荧光双标法标记NC组、DM组和inosine组大鼠膀胱组织中Piezo1(红色)和c-kit（绿色）的表达情况。第1、2周时，与NC组和Inosine组相比较，DM组红色信号较强；与NC组比较，Inosine组荧光信号无显著差别，第8周时各组红色信号强度无显著差异。绿色荧光信号在第1周时各组无显著差异，第2、8周时，与NC组和Inosine组相比较，DM组较弱；与NC组相比，Inosine组绿色荧光信号较弱，NC组绿色荧光信号最强。标尺20µm。U：尿路上皮；D：逼尿肌，↑ICCS-46- 空军军医大学硕士学位论文3.2QRT-PCR检测结果分析与NC组和Inosine组相比，DM组大鼠膀胱中Piezo1和Piezo2在第1、2周mRNA表达水平明显增强（P<0.05）甚至在第一周时Piezo1表达水平更加显著（P<0.01），Inosine组和NC组中Piezo1和Piezo2表达水平在第1、2周无明显差异(P>0.05)，第8周时NC组、DM组和Inosine组中Piezo1和Piezo2表达水平无显著差异(P>0.05)。（图7）-ΔΔCT图7每个样品以β-actin的mRNA表达作为内参照，通过相对定量(2)法计算Piezo1和Piezo2在各样品中相对mRNA的表达水平。DM组大鼠膀胱中Piezo1和Piezo2在第1、2周表达水平明显高于NC组和inosine组（P<0.01,P<0.05），第8周时DM组与NC组和inosine组的Piezo1和Piezo2mRNA表达水平无显著差异(P>0.05)，n=3.**:P<0.01,*:P<0.05.3.3Westernblot结果分析与NC组和Inosine组相较，DM组大鼠膀胱中Piezo1和Piezo2在第1、2周蛋白表达水平明显高于（P<0.05），Inosine组和NC组中Piezo1和Piezo2蛋白表达水平在第1、2周无明显差异(P>0.05)，第8周时NC组、DM组和Inosine组中Piezo1和Piezo2蛋白表达水平无显著差异(P>0.05)。图8.○A1wk2wk8wkPiezo1287kDaβ-Actin42kDaPiezo277kDa-47- 空军军医大学硕士学位论文β-Actin42kDaNCDMInosineNCDMInosineNCDMInosine○B图8在第1、2、8周时，Westernblot法测定piezo1和piezo2在NC组和DM组大鼠膀胱组织中蛋白表达水平。A:Westernblot法测定piezo1和piezo2在三组大鼠膀胱组织中蛋白表达水平；B：三组大鼠膀胱组织中piezo1和piezo2蛋白表达水平比较柱状图，DM组大鼠膀胱中Piezo1和Piezo2在第1、2周蛋白表达水平明显高于NC组和inosine组（P<0.05），第8周时NC组、inosine组和DM组Piezo1和Piezo2蛋白表达水平无显著差异(P>0.05),n=3.**:P<0.01,*:P<0.05.4讨论DCP初期临床症状多以刺激性症状为主，可表现为膀胱过度活动症，包括逼尿肌过度兴奋或膀胱感觉过敏诱发的尿急、尿频、夜尿增多和急迫性尿失禁，后期则以梗阻性症状为主，多与假性膀胱梗阻相关，症状包括尿量减少和尿流率降低，[3]尿后滴沥，膀胱充盈感减弱和大量残余尿。目前通过对DCP的病因学研究发现本病主要与神经因素、逼尿肌因素及其它因素有关，其中的膀胱逼尿肌因素已逐渐成为近年来研究的新热点，主要研究内容包括因逼尿肌细胞内容物、相关酶类、离子通道、膜受体及神经递质的不利改变而导致的膀胱逼尿肌结构受到不同程度的破坏-48- 空军军医大学硕士学位论文[5]以及膀胱功能的障碍，近些年研究结果表明，膀胱尿路上皮不仅具有尿路屏障作用，也可具有感受器的功能，膀胱尿路上皮上存在着大量的受体和离子通道，在膀胱受到损伤或炎症时，膀胱尿路上皮对痛觉等刺激的反应性发生改变，释放前列腺[61]素等介质，影响膀胱传入神经，从而在DCP膀胱功能障碍中发挥作用。Piezos作为机械敏感性受体，可将机械性刺激转变为电信号或化学信号，据报道，有研究者已经在人类尿路上皮发现Piezo1离子通道,该离子通道在受到机械刺激时能够使2+Ca向细胞内流动并同时产生ATP,这一过程是尿路上皮对所受压力和尿液流动产[62]生感应的重要原理，另外，Piezo1被大量激活后可促进膀胱粘膜增生，出现膀胱[63]肥大，可认为是DCP产生膀胱肥大因素之一。本研究用1%STZ诱导糖尿病大鼠模型，在造模成功第1、2周后，用QPCR和Westernblot检测发现：DM组大鼠膀胱组织Piezo1的mRNA和蛋白表达水平较INOSINE组和NC组增强，动物实验证实，在膀胱出口部分梗阻(partialbladderoutletobstructionpBOO)初期，大鼠膀胱组织Piezo1显著增加，膀胱敏感性增加，[59]出现尿频症状，这与本研究结果类似。对Piezo1和c-kit进行免疫荧光显示，第1、2周DM组Piezo1荧光信号明显高于INOSINE组和NC组，尤其是在粘膜层；在造模成功第8周时，两组大鼠膀胱组织Piezo1荧光信号强度无明显差异。但是，c-kit免疫荧光信号则随患糖尿病时间逐渐减弱，而c-kit为间质细胞（interstitialcellsofCajalICCs）特异标志物，目前研究证明膀胱中的ICCs是自主神经末梢与逼尿肌之间信号的有力转导，在膀胱粘膜下ICCs产生动作电位而诱导逼尿肌收缩。糖尿病会导致膀胱ICCs数量减少，从而动作电位产生减少，出现逼尿肌麻[80]痹，对机械刺激敏感性下降，膀胱残余尿量增加，由以上结果可推断，在DCP第1、2周时，大鼠膀胱组织Piezo1表达水平显著升高，膀胱粘膜组织中piezo1增多，使得尿路上皮对所受到的机械刺激更加敏感，弥补了因糖尿病初期ICCs功能降低所导致的逼尿肌麻痹现象。Piezo2主要存在背根神经节，有文献指出，Piezo2在调节神经及运动功能中起[81,82][83]重要作用，在DRG中干扰Piezo2表达可调节细胞的感觉阈值。本研究采用QPCR和Westernblot对膀胱中的Piezo2进行定量分析，发现Piezo2在正常膀胱组织中表达较少，在第1、2周时，糖尿病大鼠膀胱组织中Piezo2基因及蛋白的表达较正常组显著增加，8周时反而下降且与正常对照组无显著差异。-49- 空军军医大学硕士学位论文目前关于piezos的研究表明，piezos在尿路上皮和肾上皮细胞确实存在，且可[84]作为感受器感受组织所受机械力等作用，MaiMichishita等人研究指出在大鼠[59]PBOO模型的膀胱组织中piezo1可较正常组显著增加。我国学者研究指出piezos广泛存在于肠道、牙周组织，通过免疫组织化学染色观察发现piezo1在直肠组织内无表达，piezo2在直肠粘膜内有一定表达，并在介导直肠感觉和排便过程中发挥重[85]要作用。但是piezo1在牙周组织中要远多于piezo2，参与牙周组织的感知功能[86]。本研究显示，DCP初期，Piezo1和Piezo2可显著增加，从而使膀胱对机械刺激更加敏感，产生尿频等症状，而肌苷可显著抑制Piezo1和Piezo2增加，从而减轻尿频症状；DCP后期，由于Piezo1和Piezo2与正常对照组无显著差异，膀胱对机械刺激敏感性下降，尿频症状减弱，膀胱残余尿量增加，这一现象可能与高血糖致膀胱组织损伤有关，而且有关DCP中piezos的研究目前国内外尚未见文献报道，尚需进一步研究。结论DCP初期，大鼠膀胱组织中Piezo1和Piezo2可显著增加，增强膀胱对机械刺激的敏感性，是产生尿频症状的重要因素之一，肌苷可对抗糖尿病对膀胱组织的损伤，保护膀胱组织结构，抑制Piezo1和Piezo2增加，维持膀胱功能。-50- 空军军医大学硕士学位论文小结1.DCP的发病机制主要包括氧化应激损伤、损伤神经病变和逼尿肌肌源性病变等，氧化应激损伤是DCP膀胱功能受损的重要因素之一，提高氧自由基的清除速度有助于保护糖尿病动物的膀胱结构及功能；2.肌苷(inosine)是临床上多年广为应用、无明显副作用的药物，参与体内核酸、能量代谢和核蛋白的合成，能提高机体细胞对缺氧、缺血的耐受力，并能促进神经元存活，肌苷可在体内生成尿酸，而尿酸是已知的天然抗氧化剂，过氧亚硝基阴离子的清除剂，抑制H2O2和过氧亚硝基阴离子的积聚，稳定细胞内的钙平衡，保存线粒体的功能，从而肌苷可清除过氧亚硝基阴离子或使之变成无毒的产物，因此，肌苷可以通过其抗氧化和抗自由基机制，保护糖尿病膀胱免受氧化损伤。3.Piezos离子通道存在于许多组织中，如膀胱、肾脏及神经等。已有研究发现，Piezos基因及其表达的蛋白与机体一些病理生理过程相关，本研究表明，糖尿病可对大鼠膀胱Piezos离子通道产生影响，从而产生尿频等早期临床症状，并与膀胱增生肥大有一定相关性，肌苷可抵抗糖尿病对大鼠膀胱Piezos离子通道的影响，从而保护膀胱功能。-51- 空军军医大学硕士学位论文参考文献[1]LEEWC,WUHP,TAITY,etal.Effectsofdiabetesonfemalevoidingbehavior[J].JournalofUrology,2004,172(3):989-92.[2]LIURT,CHUNGMS,LEEWC,etal.Prevalenceofoveractivebladderandassociatedriskfactorsin1359patientswithtype2diabetes[J].JournalofUrology,2011,185(4):e604-e.[3]ARRELLANOVALDEZF,URRUTIAOSORIOM,ARROYOC,etal.Acomprehensivereviewofurologiccomplicationsinpatientswithdiabetes[J].Springerplus,2014,3(1):549.[4]KANIKAND,CHANGJ,TONGY,etal.Oxidativestressstatusaccompanyingdiabeticbladdercystopathyresultsintheactivationofproteindegradationpathways[J].BjuInternational,2011,107(10):1676-84.[5]YUANZ,TANGZ,HEC,etal.Diabeticcystopathy:Areview[J].JournalofDiabetes,2015,7(4):442-7.[6]GUY,GUC.Physiologicalandpathologicalfunctionsofmechanosensitiveionchannels[J].MolecularNeurobiology,2014,50(2):339-47.[7]COSTEB,XIAOB,SANTOSJS,etal.Piezoproteinsarepore-formingsubunitsofmechanicallyactivatedchannels[J].Nature,2012,483(7388):176.[8]VOLKERSL,MECHIOUKHIY,COSTEB.Piezochannels:fromstructuretofunction[J].PflugersArch,2015,467(1):95-9.[9]JAMESR,HIJAZA.LowerUrinaryTractSymptomsinWomenwithDiabetesMellitus:ACurrentReview[J].CurrentUrologyReports,2014,15(10):440.[10]纪世琪,丁国富,王勤章.糖尿病性膀胱病研究进展[J].承德医学院学报,2008,25(3):298-301.[11]GOMEZCS,KANAGARAJAHP,GOUSSEAE.Bladderdysfunctioninpatientswithdiabetes[J].CurrentUrologyReports,2011,12(6):419-26.[12]KEBAPCIN,YENILMEZA,EFEB,etal.Bladderdysfunctionintype2diabetic-52- 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空军军医大学硕士学位论文个人简历和研究成果个人简历:张昆，男，汉族，2004年12月入伍。2004.12-2006.9北海舰队航空兵莱阳场站军械保管员2006.9-2011.6空军军医大学航空航天医学系学员2011.7-2014.8解放军第201医院医师2014.8-2015.8西京医院泌尿外科进修生2015.8-至今空军军医大学西京医院泌尿外科硕士研究生硕士期间发表论文:1.张昆，邝芳，闫飞，谭超，袁建林，刘飞，肌苷对糖尿病性膀胱病的保护作用及机制[J].医学研究生学报,2018(1):5-12.2.张昆，邝芳，闫飞，杨波，杨力军，王福利，袁建林，秦荣良，刘飞，糖尿病对大鼠膀胱组织Piezos离子通道的影响[J].现代泌尿外科杂志,2018(6):445-449.-60- 空军军医大学硕士学位论文致谢转眼间，三年的硕士研究生生活即将结束。在这里，我要衷心的感谢我的导师刘飞副教授，正是在他的指导与关怀下，我才能顺利的完成实验和论文。感谢导师在学业上对我的谆谆教诲和严格要求，衷心感谢刘飞副教授为我打开了探索科学奥秘的大门，引导我走进医学研究的圣殿，他渊博的学识、敏锐的思维、严谨求实的科学作风、孜孜不倦的敬业精神，都给我留下了深刻的印象，必将使我受益终身。衷心感谢空军军医大学神经生物教研室邝芳教授，在实验的设计和具体操作上，给予了我很多宝贵意见。衷心感谢我校西京医院泌尿外科各位老师，感谢袁建林主任、秦卫军教授、武国军副教授、杨晓剑副教授、秦荣良教授、杨力军副教授、刘贺亮副教授、张运涛副教授、王福利副教授、于磊副教授、杨波副教授、秦军副教授、张更副教授、孟平副教授，以及其他老师们在科研和临床实践过程中为我提供的指导与帮助，衷心感谢老师们的帮助!特别感谢我校西京医院泌尿外科闫飞老师，薛沁老师，陈莹老师，田春娟老师和陈美红老师在科研和临床实践过程中提供的支持、指导和帮助，衷心地道声谢谢!感谢魏迪博士、朱政博士、王志勇硕士、张智硕士、谭超硕士等在实验中给我的热情帮助。最后感谢我的家人和朋友们对于我科研及临床实践的支持和鼓励！是他们的支持和鼓励使我最终能够顺利完成学业。-61-