镜鲤不同选育世代对疱疹病毒（CyHV-3）抗病力评估

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学校代码：10264研究生学号：M140101017上海海洋大学硕士学位论文题目：镜鲤不同选育世代对疱疹病毒(CyHV-3)抗病力评估Evaluationoftheresistanceofdifferentmirror英文题目：carpbreedinggenerationstoCyHV-3专业：水产养殖学研究方向：水产动物遗传育种姓名：白姗姗指导教师：石连玉研究员二0一七年四月五日 上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月 上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注韩英东北农业大学教授主席贾智英黑龙江水产研究所研究员委员常玉梅黑龙江水产研究所研究员委员委员委员委员委员张震黑龙江水产研究所秘书黑龙江水产研究所1号楼答辩地点答辩日期2017-5-193楼会议室 上海海洋大学硕士学位论文镜鲤不同选育世代对疱疹病毒(CyHV-3)抗病力评估摘要锦鲤疱疹病毒病(KHVD)由锦鲤疱疹病毒3型(CyHV-3)引起，随着该病在全球鲤养殖产区的连续爆发，给鲤的规模化养殖带来巨大经济损失，因此研究鲤对CyHV-3防御机制对防治该病具有重要意义。对镜鲤抗锦鲤疱疹病毒(CyHV-3)新品种的选育工作，目前已进行到F3代。本研究利用实时荧光定量PCR技术及免疫指标检测试剂盒技术研究三个选育世代的CyHV-3病毒载量、免疫相关基因(TRAF6、MyD88a、IL-1β、TLR7a、I-IFN)的表达、磷酸酶活性(AKP、ACP)、抗氧化能力(GSH、SOD、T-AOC)、特异性免疫相关指标(IgM)及非特异免疫相关指标(LZM、C3、C4)的变化规律，对镜鲤抗病选育世代进行抗病力评估。研究结果如下：CyHV-3病毒载量比较：病毒感染时，三个选育世代的脾中CyHV-3病毒载量均显著高于肾(P<0.05)，说明CyHV-3可能主要侵染鲤的脾组织。三个选育世代间，CyHV-3病毒载量在脾和肾中呈下降趋势，其中F3脾、肾中病毒载量显著低于F1、F2(P<0.05)，推测选育世代间抗病力具有逐代增强的趋势，且F3抗病力显著。免疫基因表达分析：(1)未感染组中TRAF6、TLR7a、MyD88a及IL-1β基因的表达量呈现上升趋势，I-IFN基因的表达量在三个选育世代间呈下降趋势，仅TRAF6基因在F3的表达量显著高于F1、F2(P<0.05)，推测在选育世代间，除TRAF6基因表达较高外，其他基因未受选育影响。(2)感染组中I-IFN、TLR7a、TRAF6、MyD88a、IL-1β基因在三个选育世代中的表达水平均呈上升趋势，F3脾中MyD88a、IL-1β基因显著高于F1、F2(P<0.05)、TRAF6基因显著高于F1(P<0.05)，F3肾中IL-1β、TRAF6基因显著高于F1、F2(P<0.05)，推测选育世代间抗病力具有逐代增强的趋势，F3抗病力显著。免疫基因表达水平在脾、肾间存在显著性差异(P<0.05)。其中，脾中TLR7、I-IFN基因表达量显著高于肾(P<0.05)，肾中TRAF6、MyD88及IL-1β基因表达量显著高于脾(P<0.05)。结合病毒载量的结果说明病毒感染时，肾可能是免疫CyHV-3的主要免疫器官，且TRAF6、MyD88及IL-1β基因在抗病毒感染中起到重要作用。组织中免疫指标变化：三个选育世代中AKP活性呈上升趋势，ACP活性变化1 上海海洋大学硕士学位论文趋势与AKP相反，推测可能是由于ACP和AKP最适pH值不同造成的。F2、F3的AKP活性显著高于F1(P<0.05)，说明AKP活性水平呈逐代增强趋势。肾中AKP显著高于脾(P<0.05)，脾中ACP活性显著高于肾(P<0.05)，说明磷酸酶活性存在一定组织间差异性。脾、肾中SOD无显著差异(P>0.05)，脾中T-AOC显著高于肾(P<0.05)，肾中GSH指标仅在F2中显著高于脾(P<0.05)，其余均无显著性差异(P>0.05)。三个选育世代中SOD、T-AOC、GSH指标均存在F10.05),theT-AOCinspleenwassignificantlyhigherthanthatinkidney(P<0.05),andtheF2’sGSHindexinkidneywassignificantlyhigherinspleen(P<0.05),buttherewasnosignificantdifferencebetweentherest(P>0.05).TheindexesofSOD,T-AOCandGSHinF3werehigherthanthoseinF1,andtheindexesofSODandT-AOCinF3werehigherthanthoseofF2(P<0.05);theGSHindexesinF2weresignificantlyhigherthanthoseinF1andF3(P<0.05).Theresultsindicatedthatthediseaseresistanceofbreedinggenerationshasthetrendofincreasinggenerationbygeneration,andtheresistancetodiseaseofF3isremarkable.Changesofimmuneindexinserum:nonspecificimmune(LZM,C3,C4)andspecificimmuneindex(IgM),showedanupwardtrendbetweenthethreebreedinggenerations,theactivitylevelsofLZMandIgMinF3weresignificantlyhigherthanthoseinF1(P<0.05),andtheLZMandC4inF3weresignificantlyhigherthaninF2(P<0.05).TheC4inF2waslowerthaninF1,butwithnotsignificantdifferent(P>0.05).Thoseresultsindicatingthatthediseaseresistanceofbreedinggenerationshasthetrend4 上海海洋大学硕士学位论文ofincreasinggenerationbygeneration,andtheresistancetodiseaseofF3isremarkable.Theresultofculturecontrastexperiment:Inthecontrastexperiment,thesurvivalratesofF1,F2andF3were61.1%,86.6%and92.5%respectively,thecontrolgroupis57.4%,indicatingthattheresistancetodiseasewasincreasedbygenerationbygeneration,andthediseaseresistanceofF3wasremarkable.Incombination,CyHV-3viralload,immunegeneexpressionandimmunerelatedindicatorsallindicatedthatheresistancetodiseasewasincreasedbygenerationbygeneration,andthediseaseresistanceofF3wasremarkable.Thisresultswasconsistentwiththeculturecontrastexperiment.Theseresultsshowedthatwehavesuccessfullyevaluatedtheresistancetodiseaseinbreedinggenerationsofthecarpthroughtheabovethreeindicators.Italsoshowsthatthediseaseresistanceassessmentmethodisaneffectivemethodforassessingthediseaseresistanceofcarp.KEYWORDS:carp,immunegene,CyHV-3,antioxidantcapacity,immunoglobulinM5 上海海洋大学硕士学位论文目录摘要................................................................................................................................IABSTRACT....................................................................................................................III目录.............................................................................................................................VI引言...............................................................................................................................9第一章文献综述...........................................................................................................101.1鱼类固有免疫应答..........................................................................................101.1.1防御屏障的作用....................................................................................101.1.2固有免疫应答的识别机制...................................................................101.1.3固有免疫的效应细胞...........................................................................111.1.4固有有免疫的效应分子.......................................................................121.2鱼类适应性免疫应答......................................................................................131.2.1淋巴细胞抗原识别、提呈及激活........................................................131.2.2适应性免疫应答的效应机制................................................................141.3本研究的目的及意义......................................................................................15第二章鲤CyHV-3病毒载量比较及选育世代抗病力评估........................................162.1材料和方法.......................................................................................................162.1.1实验设计...............................................................................................162.1.2实验鱼及样品采集................................................................................162.1.3主要试剂及仪器....................................................................................162.1.4基因组DNA提取..................................................................................162.1.5CyHV-3病毒载量的相对定量..............................................................172.1.6实时荧光定量PCR................................................................................172.1.7数据统计与分析....................................................................................182.2结果与分析......................................................................................................182.2.1基因组DNA提取.................................................................................182.2.2选育世代间CyHV-3病毒载量情况比较............................................182.2.3脾、肾中CyHV-3病毒载量情况比较................................................192.3讨论...................................................................................................................19第三章鲤免疫基因的差异表达及选育世代抗病力评估...........................................213.1材料和方法.......................................................................................................213.1.1实验设计...............................................................................................213.1.2实验用鱼及样品采集............................................................................213.1.3实验试剂及仪器...................................................................................213.1.4总RNA提取.........................................................................................223.1.5未感染组感染CyHV-3检测.................................................................226 上海海洋大学硕士学位论文3.1.6实时荧光定量PCR...............................................................................223.1.7数据统计与分析...................................................................................223.2结果与分析......................................................................................................233.2.1基因组DNA、总RNA提取、cDNA合成.........................................233.2.2夏花组CyHV-3检测结果.....................................................................243.2.3未感染组F1、F2、F3中免疫基因的表达............................................243.2.4感染组F1、F2、F3中免疫基因的表达................................................253.2.5感染组脾、肾组织免疫基因表达........................................................263.3讨论...................................................................................................................273.3.1免疫基因表达分析................................................................................273.3.2抗病力评估............................................................................................28第四章组织中免疫相关指标的变化及选育世代抗病力评估...................................294.1材料和方法.......................................................................................................294.1.1样本采集与处理...................................................................................294.1.2实验试剂...............................................................................................294.1.3实验仪器...............................................................................................294.1.4免疫指标检测.......................................................................................294.1.5数据统计与分析...................................................................................304.2结果与分析.......................................................................................................304.2.1磷酸酶活性比较....................................................................................304.2.2抗氧化能力比较....................................................................................314.3讨论..................................................................................................................344.3.1鱼类磷酸酶酶活分析...........................................................................344.3.2鱼类抗氧化能力分析...........................................................................344.3.3抗病力评估...........................................................................................35第五章血清中免疫相关指标的变化及选育世代抗病力评估...................................365.1材料和方法.......................................................................................................365.1.1实验设计...............................................................................................365.1.2样本采集与处理...................................................................................365.1.3实验试剂...............................................................................................365.1.4实验仪器...............................................................................................365.1.5数据统计与分析...................................................................................365.2结果与分析.......................................................................................................375.2.1溶菌酶(LZM)活性比较........................................................................375.2.2补体C3、补体C4比较.......................................................................375.2.3免疫球蛋白M(IgM)比较.....................................................................385.3讨论...................................................................................................................395.3.1血清中非特异性免疫指标及特异性免疫指标比较分析....................395.3.2抗病力评估...........................................................................................40第六章养殖对比实验及选育世代抗病力评估...........................................................416.1材料和方法.......................................................................................................416.1.1实验场地选择及养殖模式...................................................................417 上海海洋大学硕士学位论文6.1.2网箱规格及排布方式...........................................................................416.1.3放养密度及养殖管理...........................................................................416.1.4捕捞及统计...........................................................................................416.2结果与分析.......................................................................................................416.3讨论...................................................................................................................42结论...............................................................................................................................43参考文献.........................................................................................................................44致谢...............................................................................................................................54攻读硕士论文期间发表的学术论文.............................................................................558 上海海洋大学硕士学位论文引言锦鲤疱疹病毒病(Kioherpesvirusdisease，KHVD)由鲤疱疹病毒3型(Cyprinidherpesvirus3，CyHV-3)引起，锦鲤[1]、镜鲤[2]等对其易感。鱼体感染该病后不立即发病，当环境水温达到18~27℃条件时才可能发病[3]，该病具有难预防、长期潜伏性及高传染性的特点。自20世纪末，报道该病至今，在德国[4]、美国[5]、以色列[120]、日本[6]等国家均有发现，锦鲤及其他鲤产品全球性贸易流动是该病广泛爆发的重要原因之一。我国自2002年首次自进口的锦鲤中检出该病至今，在大部分地区均发现该病[7]，目前该病已呈全国范围内爆发的特点。机体受病原刺激后，将启动免疫应答防御病原入侵，减轻病原对机体的损伤，免疫应答的激活、维持及效应机制均离不开各类免疫相关功能基因的表达及调控。一般情况下，免疫基因在机体中的表达处于较低水平，当病原刺激时免疫基因的表达将发生显著变化。例如，CyHV-3病毒入侵能上调I型干扰素(I-IFN)、白细胞介素(IL-1β)基因的表达[8][9]。研究发现，免疫基因的表达能从分子水平更直观的反映机体在病原入侵时的免疫应答水平，免疫基因表达水平越高，机体启动的免疫应答水平越高，对病原的抑制能力越强，说明机体抗病能力越强[10]，例如中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)的TLR基因表达被抑制时抗病毒能力有所下降[11]，因此，对CyHV-3感染发病期鲤各项免疫指标的研究即能比较鲤不同选育世代的抗病毒能力。近几年，镜鲤(CyprinuscarpioL.mirror)在北方地区养殖中发生了大规模死亡现象，损失严重。研究发现，镜鲤感染该病的死亡个体和成活个体在基因水平及遗传物质上存在差异[9]，为此黑龙江所开展了镜鲤抗疱疹病毒(CyHV-3)新品种的选育工作。目前已经选育到F3代。因选育群体经过人工选育，存在选育群体对其他疾病抗病力减弱的可能。因此，本研究拟通过研究三个选育世代感染CyHV-3后病毒增殖复制、免疫基因表达水平及免疫相关指标的变化，结合2016年养殖对比实验中统计的抗病成活率情况，有效评估选育群体的抗病力从而指导下一代选育。9 上海海洋大学硕士学位论文第一章文献综述我国鱼类养殖历史悠久，市场需求巨大，养殖过程中的病害问题也相当突出。每年，由各类真菌、细菌及病毒诱发的疾病，给我国鱼类养殖业造成巨大的经济损失，因此，研究鱼类免疫应答尤为重要。增强鱼类免疫应答水平，以提高机体抗病能力是研究鱼类抗病免疫的重中之重。免疫应答是指机体对于异己成分或者变异的自体成分做出的防御反应。而免疫应答的一般过程包括抗原呈递与识别阶段、活化增殖和分化阶段、效应阶段。鱼类免疫学研究证明，与哺乳动物等高等脊椎动物一样，鱼类免疫存在适应性（特异性）免疫和固有（非特异性）免疫。但是，鱼类是变温水生动物，免疫应答过程中固有免疫应答机制起主要作用。1.1鱼类固有免疫应答鱼类固有免疫应答具有种系内稳定遗传、没有特异性、免疫识别广泛的特点，与抗原的初次接触即产生效应，不具有二次免疫功能，协助并参与适应性免疫应答。1.1.1防御屏障的作用由皮肤、鳞片、粘膜表皮层构成鱼类的基础屏障，是鱼类的第一线防御。鱼类表皮黏液中含有溶菌酶和糖蛋白等，能抑制细菌微生物的生长或使其失活。溶菌酶广泛存在于淡、海水鱼类的皮肤黏液、血清、淋巴组织和组织器官中[12]，可以分解细菌细胞壁的肽聚糖。鱼类黏液中存在特异性抗体(尤其是IgM)[13]，可直接对入侵的病原体发挥免疫作用。1.1.2固有免疫应答的识别机制免疫应答离不开对抗原的识别。鱼类固有免疫对抗原的识别是通过模式识别分子和模式识别受体(PRR)识别病原体相关分子模式(PAMP)实现的。PRR与病原体表面的PAMP相互识别和作用是启动固有免疫应答的关键。值得注意的是，PAMP很少是蛋白质，蛋白质类病原体主要为淋巴细胞识别，诱发适应性免疫应答[14]。10 上海海洋大学硕士学位论文模式识别受体(PRR)包括吞噬性受体（可溶性受体）和信号受体（膜结合受体）。已证实，鱼类的前者包括C型凝集素受体(CLR)、清道夫受体(SR)，后者则包括Toll样受体(TLR)、NOD样受体(NLR)、RIG样受体(RLR)。CLR主要识别糖类抗原，介导并调节细胞因子的产生、上调单核/巨噬细胞（Mo/MΦ）[15]-[16]，并触发激活Th细胞的抗真菌免疫应答[17]。硬骨鱼类尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)的CLR与哺乳类NK细胞受体同源[18]。SR主要有SRA和SRB两种，SRB能与革兰氏菌结合[19]。SRA参与细菌及RNA病毒引发的免疫应答[20]-[21]。TLR是细胞膜表面识别受体，可以直接特异性结合病原体结构[22]，也可以激发NF-κB信号通路，而NF-κB通路是先天免疫系统中细胞信号通路激活的核心[23]。TLR信号转导途径为MyD88依赖途径和非MyD88依赖途径，分别参与炎症反应和抗病毒效应[24]-[25]。目前在鱼类中发现了十几种TLR，其中TLR2、TLR5、TLR9可以专门识别细菌的PAMPs[26]-[27]。TLR4参与细菌和病毒引发的免疫应答[28]-[29]。对鱼类参与介导炎症级联反应的NLR类型知之甚少，日本学者认为LPS可能是NLR介导炎症反应的配体[30]。有学者推测，NLR在细胞调控、细胞凋亡及免疫应答中有重要作用，硬骨鱼类中普遍存在保守的NLR基因序列[31]。RLR属于I型干扰素诱导蛋白[32]，鱼类的RLR对胞内、外的各种病毒均有识别功能，诱发IFN信号通路以抵抗病毒感染[33]-[34]。模式识别分子(PRM)参与炎症反应中病原体的清除。鱼类PRM主要包括急性时相蛋白C反应蛋白(CRP)、抗菌/通透性蛋白(BPI)和脂多糖结合蛋白(LBP)。CRP在炎症信号及IL-6的激发下由肝脏产生，对入侵的异己成分做出免疫应答[36]。因CRP参与补体的激活，常被作为炎症反应的生物标志物[37]。鱼感染嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)后，血清中CRP含量增加[38]-[39]。哺乳动物在炎症反应和组织坏死的早期CRP含量也增加，这一现象在尼罗罗非鱼中已被证实[41]。部分硬骨鱼类中，证实了BPI和LBP参与并诱导急性时相蛋白对细菌疾病的免疫应答[42]-[43]。1.1.3固有免疫的效应细胞固有免疫的效应细胞主要有单核/巨噬细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(Naturalkiller,NK)等，具有吞噬和杀伤功能，也分泌免疫相关的细胞因子，介导炎症反应的发生。单核/巨噬细胞与中性粒细胞是鱼类中两大类重要的吞噬细胞[44]。单核细胞迁移出血管至各组织中，发育为巨噬细胞。鱼类的单核细胞与哺乳动物相似。硬骨鱼类的细胞因子如IL-4、IL-13及γ-干扰素与巨噬细胞激活与分化有关[45]-[46]。单11 上海海洋大学硕士学位论文核巨噬细胞不仅在固有免疫中发挥吞噬作用，在适应性免疫中作为抗原提呈细胞APCs发挥作用。巨噬细胞可以被多种细胞因子（IL-1、IFN-γ等）活化，直接分泌杀伤物质直接杀死靶细胞，还可以分泌如IFN-γ、IL-1、TNF-α等细胞因子增强自身杀伤能力。鱼类的IFNγ、IL-4、IL-13等细胞因子参与巨噬细胞极化为M1、M2类巨噬细胞的过程，也证明鱼类中同样存在Th1和Th2类免疫反应[32]。嗜中性粒细胞具有吞噬、杀伤功能，是鱼类固有免疫的重要细胞，鱼类嗜中性粒细胞与哺乳动物嗜中性粒细胞的功能相似[47]-[48]。中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophilextracellulartraps,NETs)由DNA和抗菌蛋白组成，在固有免疫应答中阻拦并消除病原体，目前已经在鲤鱼(Cyprinuscarpio)中发现，是固有免疫的重要部分[49]。哺乳动物的NK细胞一般依靠IL-2和IL-12等细胞因子激活。这些细胞因子能直接影响NK细胞的迁移速率，促进NK细胞的增殖[50]。NK细胞通过释放NK细胞毒因子(NKCF)、TNF-α及干扰素IFN-γ等杀伤介质和靶细胞。鱼类的NK细胞包括非特异性细胞毒性细胞(NCCs)和NK细胞[51]。NCC细胞是源于器官的细胞，NK细胞来源于外周血淋巴细胞(PBL)[52]。NK细胞清除“异己”成分不需要预先激活，可以直接杀死病毒感染的细胞[53]。温度影响自然杀伤细胞的杀伤作用及吞噬细胞等的吞噬作用[54]，这可能是某些鱼类疾病发生时具有温度依赖性的原因之一。而鱼类中还存在自然杀伤细胞增强因子(NKEF)，可增强鱼类免疫病菌和病毒的免疫应答水平，是巨噬细胞和细胞毒性细胞在固有免疫应答过程中的沟通桥梁[55][56]。1.1.4固有有免疫的效应分子大多数鱼类的抗菌肽(AMPs)具有直接抗菌功能[57]，如溶菌酶(Lysozyme)可使细菌溶解[58]并激活补体系统，促进吞噬细胞的吞噬作用，防御素(Defense)能直接杀伤细菌活性[59]-[60]。补体(Complement,C)具有调理、吞噬、炎症介导、补体防御和清除病原体的作用[61]。补体活化途径包括经典途径、凝集素途径和旁路途径[62]。与哺乳类相比，鱼类的补体存在多种亚型，可以识别更多的外源细胞表面[63]。C3是鱼类补体系统的主要成分，可以调理中性粒细胞的吞噬作用[64]。无頜鱼类的C3只能通过替代途径激活，促进细胞吞噬[65]。补体C5介导炎症反应中靶细胞溶解过程[66]。补体C6是免疫反应的重要感受器和效应器，参与消除感染细胞的过程[67]。补体C7在补体激活及效应过程中，作用于靶细胞膜上，发挥杀伤作用[68]，属于效应分子。由于补体经典途径的激活需要抗原抗体复合物(APC)的出现，所以补体也参与调节T细胞介导的适应性免疫应答[69]。12 上海海洋大学硕士学位论文细胞因子是一类由免疫细胞和非特异性免疫细胞合成或分泌的小分子多肽物质，仅在机体进入免疫应答阶段大量分泌[70]。鱼类中已鉴别出的细胞因子有白细胞介素(Interleukin,IL)、趋化因子(Chemokine)、干扰素(IFN)、转化生长因子(TGF-β)。目前已经报道的鱼类白细胞介素中IL-1β、IL-6、TNF-α具有促炎作用，IL-10具有抗炎作用，IL-21参与T细胞增殖/分化，IL-12刺激NK细胞激活[71]-[72]。由此可见，白细介素在鱼类固有免疫和适应性免疫中均有不可替代的作用。IL-2和IL-6优先驱动巨噬细胞分化[73]。值得注意的是，IL-2可以诱导激活T细胞、B细胞和NK细胞分泌IFN-γ[74]，促进Th细胞分化并分泌IFN-γ介导细胞免疫[75]。在金头鲷(Sparusaurata)发现的白细胞介素IL-6对TNF-α的活化作用由NF-κB、p38MAPK和JNK信号转导通路介导[76]。TNF可以诱发香鱼(Plecoglossusaltivelis)肾脏呼吸爆发，这与哺乳类相似[77]。与细菌相比，病毒可以更高更快地诱导TNF-α的产生[78]。趋化因子(Chemokine)家族有四个亚族：C-X-C亚族、C-C亚族、C-X3-C亚族和C亚族。前3个亚族在鱼类中均已发现[79]，鱼类的趋化因子家族与哺乳类具有同源性，但是功能有所差别[80][81]。趋化因子可使趋化白细胞参与炎症反应[83]。C-C趋化因子是趋化因子的最大亚家族，是先天免疫系统的重要组成部分，具有招募白细胞和增强固有免疫应答的功能[84]。在虹鳟(Oncorhynchusmykiss)中发现Fractalkine类似物，属于C-X3-C趋化因子，对单核细胞和T淋巴细胞有趋化作用[85]。鲤鱼C-X-C亚族对中性粒细胞、吞噬细胞有趋化作用[86]。鱼类趋化因子C亚族的报道较少。干扰素能诱导多种细胞因子，根据结构和功能IFN可分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。I型干扰素斑马鱼(Brachydaniorerio)幼鱼感染神经坏死病毒(NNV)的免疫至关重要[87]。转化生长因子(TGF-β)家族在鲑鳟鱼中已经成功分离，推测其可能与鱼类病毒免疫相关[88]。1.2鱼类适应性免疫应答1.2.1淋巴细胞抗原识别、提呈及激活T淋巴细胞通过抗原提呈细胞(APC)分解抗原，由MHC类分子递送到细胞表面才能识别。抗原提呈细胞主要有树突状细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞，抗原提呈分子主要有MHCI类分子、MHCII类分子及T细胞表面受体(TCR)。其他抗原提呈辅助分子如CD[89]3、CD4、CD8等都与T细胞表面受体(TCR)的识别有关。13 上海海洋大学硕士学位论文哺乳动物的T淋巴细胞表面分子标记CD4和CD8将T细胞分为辅助性T细胞和细胞毒性T细胞两种主要亚群，鱼类也有这两种分子标记。CD4/CD8淋巴细胞同时出现在胸腺中，说明硬骨鱼类的胸腺是T淋巴细胞发育的器官[90]-[91]。CD8和CD4分子分别通过与自身MHCⅠ类分子和Ⅱ类分子的恒定区结合，加强T细胞与APC或靶细胞的相互作用以及TCR-CD+3信号的转导。CD8细胞毒性T淋巴细胞提呈MHCI类分子，识别内源性抗原。CD+4Th细胞提呈MHCII类分子，识别外源性抗原[92]。CD+[93]4T细胞可以诱导产生二次免疫抗体。参与T细胞活化的主要蛋白激酶和蛋白磷酸酶，通常前者在信号转导的上游发挥作用，后者在下游发挥作用，并直接作用于转录因子[3]。IL-2、核转录因子NF-κB的活化和表达在T细胞的活化中发挥重要作用[94]。T细胞介导MHC递呈的抗原信号后需要CD28或APC表面的配体分子结合才能被真正激活。目前仅在少数硬骨鱼类中报道过CD28分子，对其具体生物学功能还知之甚少[95]。B细胞对抗原的识别通过B细胞抗原受体BCR实现，可以识别多种抗原，不存在MHC类分子的限制条件。BCR是一种膜型免疫球蛋白mIg。辅助作用的受体有CD19、CD21、CD81等，在鱼类中研究较少。鲤科鱼类中IL-4、IL-13可以促进B淋巴细胞增殖和IgM的分泌[96]。IL-10与B淋巴细胞的活化有关，B淋巴细胞活化因子BAFF可以刺激IL-10和NF-κB的转录和表达[97]。在哺乳类中参与B淋巴细胞活化及增殖的细胞因子大部分是由Th细胞分泌，这一观点还未在鱼类中广泛证实。1.2.2适应性免疫应答的效应机制1.2.2.1抗体的效应功能B淋巴细胞激活分化为浆细胞后，分泌产生以免疫球蛋白IgM为主的抗体分子。抗体结合抗原，激活补体经典途径，形成攻膜复合物使靶细胞迅速裂解，现已证实鱼类的IgM和补体C在免疫过程存在共同变化的特点[98]。免疫球蛋白主要存在于血浆中。鱼类有多种免疫球蛋白，如IgD、IgZ、IgT、IgR等。在哺乳类中发挥抗体中和作用及免疫调理作用的IgG在鱼类中比较少见。免疫球蛋白M(IgM)主要由脾脏和淋巴结中浆细胞分泌合成，相对分子质量最大，几乎存在于所有脊椎动物中[99]。胸腺是重要的免疫器官，但鱼类的胸腺中IgM的表达量较低。这可能是鱼类的胸腺随着生长而退化的结果[100]。外壳蛋白VP7与草鱼(Ctenopharyngodonidellus)血清IgM特异性结合可免疫草鱼呼肠孤病毒感染[101]。IgM广泛分布于鱼类的免疫器官如头肾、脾脏中，而IgD、IgZ的分布范围明显较小[102]。IgZ、IgT、IgR主要在体表和肠道等黏膜系统发挥免疫作用[103]。虹鳟14 上海海洋大学硕士学位论文中存在一种专门B淋巴细胞分泌IgT，而IgM阳性B淋巴细胞却不能分泌IgT[104]，这可能是因为B淋巴细胞在粘膜组织和非粘膜组织中发挥的免疫应答功能不同[105]。1.2.2.2T细胞介导的效应机制在哺乳动物中，细胞毒性T细胞CTLs杀伤靶细胞的作用必须有Th细胞分泌的IL-2细胞因子的参与才能完成。CTLs首先通过MHCI类分子与靶细胞结合并释放穿孔素杀伤靶细胞，该过程依赖Mg2+、Ca2+离子存在[106]。细胞毒性T细胞分泌TNF-α可以与靶细胞表面相应受体结合发挥细胞毒作用并杀死靶细胞[107]。鱼类的细胞毒性T细胞参与病毒诱发免疫应答的功能和哺乳类相似，对CD8、TCR、MHCI类子等与CTLs免疫相关分子的mRNA表达谱的研究，证实了CTLs的抗病毒免疫功能[108]。虽然鱼类是水生低等脊椎动物，但同样具备固有免疫和适应性免疫。与哺乳类相比，鱼类适应性免疫的进化程度较低，主要是因为免疫球蛋白的类型较少，再次免疫的记忆程度较低。多数鱼类的抗体类型单一，有可能开发出其他潜在的免疫应答策略。鱼类某些固有免疫可能优于哺乳类，如多种形式的溶菌酶、补体亚型、C反应蛋白及急性时相蛋白等，大大增加了固有免疫对抗原的识别能力，提高了免疫应答水平。但是鱼类的免疫应答水平受外界环境影响巨大，尤其是温度的变化，直接影响T细胞和补体等免疫成分的生物活性。鱼类种类和品种多样，免疫应答的种间差异很大，免疫应答作用机理也不能一概而论。随着现代生物技术，尤其是基因分析、蛋白表达等技术的迅速发展，鱼类免疫研究应从基因、蛋白、细胞水平进一步细致、深化鱼类免疫应答机制的研究，尽早形成一套完善的鱼类免疫应答机制理论。1.3本研究的目的及意义本研究通过比较锦鲤疱疹病毒病(KHVD)爆发时CyHV-3在镜鲤抗病选育世代中的病毒载量、免疫基因表达及免疫指标的变化趋势，对选育群体的抗病力进行有效评估，为抗鲤疱疹病毒病新品种（系）的选育提供依据，丰富鱼类抗性育种理论。15 上海海洋大学硕士学位论文第二章鲤CyHV-3病毒载量比较及选育世代抗病力评估2.1材料和方法2.1.1实验设计攻毒实验方法借鉴了Ødegård等[109]将健康鱼与患病鱼混养方式进行攻毒试验的方法。即将2016年镜鲤抗疱疹病毒(CyHV-3)选育世代F1、F2、F3夏花分别在同一水域相邻网箱中进行养殖，在暴发锦鲤疱疹病毒病时采集F1、F2、F3为感染组。以选育世代F1为对照组，通过实时荧光定量PCR技术对选育世代F1、F2、F3中CyHV-3病毒载量进行相对定量，比较三个选育世代的抗病能力及脾、肾组织对CyHV-3的防御能力。2.1.2实验鱼及样品采集分别采集无发病症状的F1、F2、F3，规格：8~12cm，每个选育世代均随机采集3尾，且每个选育世代设两组平行，每尾分别采集脾和肾。所有样本均液氮保存后转移至实验室-80℃超低温冰箱中保存备用。2.1.3主要试剂及仪器组织DNA提取试剂盒(MagPureTissueDNAKFKit)SYBRGreenI荧光染料试剂盒(康为世纪UItraSYBRMixture(highROX))美国BIO-RADPCR仪C1000Nanovue微量分光光度仪AgilentMx3005P荧光定量PCR仪2.1.4基因组DNA提取使用组织DNA试剂盒（MagPureTissueDNAKFKit）提取组织DNA。Nanovue微量分光光度仪测定DNA浓度。1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，16 上海海洋大学硕士学位论文根据荧光定量试剂盒说明书要求，稀释DNA浓度至50ng/μl左右，-20℃保存备用。2.1.5CyHV-3病毒载量的相对定量利用实时荧光定量PCR技术，将F1设为对照组，以18sRNA为内参基因，CyHV-3的衣壳蛋白ORF72(CapsidtriplexproteinORF72)[110]和胸腺嘧啶核苷激酶TK(Thymidinekinase)[111]为目的基因，比较感染组F1、F2、F3的CyHV-3病毒载量的变化趋势。2.1.6实时荧光定量PCR所有引物均由生工生物（上海）有限公司提供，引物信息见表2-1，实时荧光定量PCR反应体系为25μl，2×UItraSYBRMixture(highROX)12.5μl，上游引物(10μM)0.5μl，下游引物(10μM)0.5μl，基因组DNA1μl/cDNA0.5μl，ddH2O补足25μl。上机程序：(1)循环数1，UNG酶启动，50℃10min；(2)循环数1，预变性，95℃1min；(3)循环数40，变性：95℃30s，退火：X℃1min；(4)溶解曲线：95℃1min，55℃30s，95℃1min。所有样本均进行了三次重复，每个样品的Ct值为三次重复的均值，病毒载量研究中以去离子水为空白对照，去除假阳性可能。表2-1.荧光定量PCR引物Tab.2-1Primersusedinquantitativereal-timePCR引物名引物序列(5’–3’)退火/℃primerssequences(5’–3’)TmCyHV-360℃F:CCCTTCACCGTCAGAATCTCTCthymidinekinaseR:AGCTCGTACTGGGCCATCCCyHV-3capsidtriplexproteinF:CGAGAAGCAGGGTATGGTC60℃ORF72R:GGCGTGTAGGGCACAAAG18sRNAF:TCTGCCCTAACTTTCGATGGTA60℃R:AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCTTT17 上海海洋大学硕士学位论文2.1.7数据统计与分析使用2-△△Ct法[112]处理荧光定量实验数据计算出相对表达量，实验所得数据以mean±SD形式表示。SPSS17.0进行单因子方差分析(one-wayANOVA)。P<0.05为存在显著性差异，将实验结果进行Excel2010作图。2.2结果与分析2.2.1基因组DNA提取微量分光光度计检测提取组织DNA浓度，组织DNA的A260/A280比值约为1.8。提取组织DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2-1。图2-1DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig.2-1AgarosegelelectrophoresisdetectionresultofDNA2.2.2选育世代间CyHV-3病毒载量情况比较如图2-2，TK和ORF72基因扩增结果一致，表明本研究通过实时荧光定量PCR对F1、F2、F3中CyHV-3病毒载量进行相对定量的研究方法具有一定可行性。研究结果显示：CyHV-3病毒载量在三个选育世代中呈下降趋势，在脾、肾中变化趋势一致，F3脾、肾中CyHV-3病毒载量显著低于F1、F2(P<0.05)，F2脾、肾的CyHV-3病毒载量高于F1但二者间无显著性差异(P>0.05)。18 上海海洋大学硕士学位论文图2-2选育世代F1、F2、F3中CyHV-3病毒增殖情况注：标记字母不同表示组内存在显著性差异(P<0.05)Fig.2-2CyHV-3virusproliferationinthethreebreedinggenerationsF1,F2,F3Note:Differentlettersindicatethepresenceofsignificantdifferencewithinthetwogroups(P<0.05)2.2.3脾、肾中CyHV-3病毒载量情况比较如图2-3所示，三个选育世代中，脾中TK和ORF72基因的相对载量均显著高于肾(P<0.05)，在三个选育世代中两组织间差异水平呈上升趋势，其中F1与F3间达到了显著性差异水平(P<0.05)。图2-3脾、肾组织中CyHV-3病毒增殖情况比较注：标记字母不同表示组间存在显著性差异(P<0.05)；“*”表示脾、肾组织间存在显著性差异(P<0.05)Fig.2-3ComparisonofCyHV-3virusproliferationinspleenandkidneyNote:Differentlettersindicatethepresenceofsignificantdifferencebetweenthetwogroups(P<0.05);"*"indicatessignificantdifferencebetweenspleenandkidney(P<0.05)19 上海海洋大学硕士学位论文2.3讨论目前，实时荧光定量PCR技术越来越广泛的应用于水产动物病毒病的定性、定量检测及抗病毒防御机制的研究[113]。锦鲤疱疹病毒3型(CyHV-3)的检测方法主要有抗体血清学检测、电镜观察、多重PCR检测、双引物PCR检测、环介导等温扩增法检测等，本研究利用实时荧光定量PCR技术通过双引物检测法对鲤脾、肾组织中CyHV-3病毒的相对载量进行研究。本研究选择的TK基因和ORF72基因均获得了良好的扩增效果，即在脾、肾组织中的变化趋势及三个选育世代间的变化趋势均基本一致，结果说明利用实时荧光定量PCR技术进行CyHV-3的相对定量分析具有一定可行性。研究发现，鲤感染CyHV-3后在全身多个器官组织中均能检测到该病毒，但主要是在鲤的鳃、脾、肾中[114]，而脾、肾是鲤重要的免疫器官，因此本研究主要比较了脾、肾中病毒载量情况。本研究结果显示，三个选育世代肾中CyHV-3病毒载量均显著低于脾(P<0.05)，且脾、肾间病毒载量差异水平有逐代升高趋势，其中F3显著高于F1(P<0.05)，F2与F1间无显著性差异(P>0.05)，结果说明与肾相比，CyHV-3可能主要侵染鲤的脾组织。选育世代间，脾、肾中CyHV-3病毒载量呈下降趋势，说明脾、肾抑制CyHV-3病毒增殖复制能力逐代增强。F3中CyHV-3病毒载量显著高于F1、F2(P<0.05)，而F2的CyHV-3病毒载量高于F1间无显著性差异(P>0.05)，说明F3抑制CyHV-3病毒增殖能力显著强于F1、F2(P<0.05)，因此推断三个选育世代间抗病能力逐代增强，其中F3抗病力显著。20 上海海洋大学硕士学位论文第三章鲤免疫基因的差异表达及选育世代抗病力评估3.1材料和方法3.1.1实验设计攻毒实验方法同第二章。采集夏花规格的F1、F2、F3为未感染组（病毒检测确定其未感染CyHV-3），并在暴发锦鲤疱疹病毒病时采集F1、F2、F3为感染组。通过实时荧光定量PCR技术研究鲤未感染CyHV-3和感染CyHV-3后免疫相关基因TLR7a、TRAF6、MyD88a、IL-1β及I-IFN基因的相对表达量，并比较选育世代间抗病能力。3.1.2实验用鱼及样品采集未感染组采样：分别采集F1、F2、F3的全鱼样本，规格：2~3cm左右，每个选育世代均随机采集3尾，且每个选育世代设两组平行，受夏花鱼规格限制无法区分脾和肾，因此仅在夏花鱼同一部位采集样品用于总RNA和基因组DNA提取。感染组采样：分别采集无发病症状的F1、F2、F3，规格：8~12cm，每个选育世代均随机采集3尾，且每个选育世代设两组平行，每尾分别采集脾和肾。所有样本均液氮保存后转移至实验室-80℃超低温冰箱中保存备用。3.1.3实验试剂及仪器组织DNA试剂盒(MagPureTissueDNAKFKit)2×EsTagMasterMix(康为世纪生物公司，产品号CW0690)QIAGENRNA提取试剂盒(RNeasylipidtissueminikit)逆转录试剂盒康为世纪(superQuickRTCDNAKit)SYBRGreenI荧光染料试剂盒(康为世纪UItraSYBRMixture(highROX))美国BIO-RADPCR仪C1000Nanovue微量分光光度仪AgilentMx3005P荧光定量PCR仪21 上海海洋大学硕士学位论文电泳仪(北京君意JY300+)等3.1.4总RNA提取使用QIAGENRNA提取试剂盒(RNeasylipidtissueminikit)提取总RNA。Nanovue微量分光光度仪测定RNA浓度。2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，-80℃保存RNA。将RNA逆转录为cDNA（康为世纪superQuickRTCDNAKit），2%琼脂糖凝胶电泳检测cDNA并测cDNA浓度，并根据荧光定量试剂盒说明书要求稀释cDNA至5~10ng/μl左右，-20℃保存备用。3.1.5未感染组感染CyHV-3检测利用MagPureTissueDNAKFKit提取基因组DNA，检测质量并稀释至50ng/μl，用OIE推荐的TK引物和sph引物[115]检测夏花组F1、F2、F3是否感染CyHV-3。PCR体系20μL：DNA模板1μL，2×EsTaqMasterMix酶10μL，上、下游引物各0.5μL，最终体积由灭菌超纯水补足，PCR程序：预变性95℃5min；94℃变性30s，56℃/63℃退火30s，72℃延伸30s，30~35个循环；72℃后延伸5min，4℃终止反应。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。3.1.6实时荧光定量PCR将F1设为对照组，以18sRNA为内参基因，免疫基因TLR7a、TRAF6、MyD88a、IL-1β及I-IFN为目的基因[116]，比较F1、F2、F3中免疫基因表达的变化趋势。所有引物均由生工生物上海有限公司提供，引物信息见表1，实时荧光定量PCR反应体系为25μl，2×UItraSYBRMixture(highROX)12.5μl，上游引物(10μM)0.5μl，下游引物(10μM)0.5μl，基因组DNA1μl/cDNA0.5μl，ddH2O补足25μl。上机程序：(1)循环数1，UNG酶启动，50℃10min；(2)循环数1，预变性，95℃1min；(3)循环数40，变性：95℃30s，退火：X℃1min；(4)溶解曲线：95℃1min，55℃30s，95℃1min。所有样本均进行了三次重复，每个样品的Ct值为三次重复的均值，病毒载量研究中以去离子水为空白对照，去除假阳性可能。3.1.7数据统计与分析使用2-△△Ct法处理荧光定量实验数据计算出相对表达量，实验所得数据以22 上海海洋大学硕士学位论文mean±SD形式表示。SPSS17.0进行单因子方差分析(one-wayANOVA)及LSD多重比较。P<0.05为存在显著性差异，将实验结果进行Excel2010作图。表3-1.荧光定量PCR引物Tab.3-1Primersusedinquantitativereal-timePCR引物名引物序列(5’–3’)退火/℃primerssequences(5’–3’)TmCyHV-3thymidine56℃F:GGGTTACCTGTACGAGkinase(TK)R:CACCCAGTAGATTATGCCyHV-3polymerase(sph)F:GGGTYACCTGTACGAG63℃R:GACACATG'ITACAATGCTCGCR:GGCGTGTAGGGCACAAAGCyHV-3thymidinekinaseF:CCCTTCACCGTCAGAATCTCTC60℃R:AGCTCGTACTGGGCCATCCCyHV-3capsidtriplexF:CGAGAAGCAGGGTATGGTC60℃proteinORF7218sRNAF:TCTGCCCTAACTTTCGATGGTA60℃R:AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCTTTIL-1βF:CTGTGACGCTGAGTGCTGGAGCAATG60℃R:TTCGGGTGGTTGGCATCTGGTTMyD88aF：TGACTTCCAGTTTGTGCATGAG60℃R：ATGTCCACTATGTAGAATGGCTTLR7aF:GCACCTTTTCCATGCGTTCC60℃R:CGGTTGGATGTCTTCCTGCTI-IFNF：AAGATGAACCAAACTCAAATGTGGAC58℃R：CTGATGAACATTTACAAACAAATCATGTRAF6F：AGATCCGGGAGCTGTGCATCC60℃R：GCCTCTGGAATGCCTGCAAGTC3.2结果与分析3.2.1基因组DNA、总RNA提取、cDNA合成微量分光光度计检测提取总RNA的A260/A280比值在1.8~2.0之间，组织DNA的A260/A280比值约为1.8。提取总RNA、组织DNA及反转的cDNA经琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3-1。均符合进行常规PCR及实时荧光定量PCR的条件。23 上海海洋大学硕士学位论文图3-1RNA、cDNA及DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果A为RNA；B为cDNA；C为DNAFig.1AgarosegelelectrophoresisdetectionresultofRNA,cDNAandDNAAisRNA;BiscDNA;CisDNA3.2.2夏花组CyHV-3检测结果1%琼脂糖凝胶电泳结果显示：TK和Sph基因的扩增结果相同，夏花组F1、F2、F3均未扩增出目的条带，说明夏花组F1、F2、F3未感染CyHV-3。图3-2夏花组CyHV-3检测结果1、2为F1样品；3、4为F2样品；5、6为F3样品；7为阳性对照；8为空白对照；M为marker；Fig.3-2CyHV-3testresultsofsummerlingsgroups1and2:theF1samples,3and4:theF2samples,5and6:theF3samples,7:thepositive,8:thenegativecontrol,Mwasmarker；3.2.3未感染组F1、F2、F3中免疫基因的表达如图3-3所示，在F1、F2、F3中，I-IFN的相对表达量呈现下降趋势，TRAF6、TLR7a、MyD88a及IL-1β的相对表达量呈现上升趋势，仅TRAF6基因在F3的表达显著高于F1、F2(P<0.05)，其余均差异不显著(P>0.05)。24 上海海洋大学硕士学位论文图3-3未感染组F1、F2、F3中免疫基因的表达注：标记字母不同表示组内存在显著性差异(P<0.05)Fig.3-3ExpressionofimmunegenesinuninfectedgroupsF1、F2、F3Note:Differentlettersindicatethepresenceofsignificantdifferencewithinthetwogroups(P<0.05)3.2.4感染组F1、F2、F3中免疫基因的表达如图3-4所示，在脾中：F1、F2、F3中免疫基因的表达呈上升趋势，其中，TRAF6基因在F3的表达显著高于F1(P<0.05)，MyD88a、IL-1β基因在F3的表达显著高于F1和F2(P<0.05)；F2中TLR7a、TRAF6、MyD88a基因的相对表达量高于F1，IL-1β及I-IFN基因的相对表达量低于F1，但F2与F1间免疫基因表达均差异不显著(P>0.05)。在肾中：F1、F2、F3中免疫基因的表达呈上升趋势，其中，TRAF6、IL-1β基因在F3中的表达显著高于F1、F2(P<0.05)，其余均差异不显著(P>0.05)，且F2与F1之间免疫基因的表达差异均不显著(P>0.05)。图3-4感染组F1、F2、F3中免疫基因在脾、肾中的表达注：标记字母不同表示组内存在显著性差异(P<0.05)Fig.3-4TheexpressionofimmunegenesinthediseasegroupF1、F2、F3’spleenandkidneyNote:Differentlettersindicatethepresenceofsignificantdifferencewithinthetwogroups(P<0.05)25 上海海洋大学硕士学位论文图3-5感染期免疫基因在脾、肾组织中的表达注：标记字母不同表示组间存在显著性差异(P<0.05)；“*”表示脾、肾组织间存在显著性差异(P<0.05)Fig.3-5TheexpressionofimmunegenesintheperiodofinfectioninthekidneyandspleenNote:Differentlettersindicatethepresenceofsignificantdifferencebetweenthetwogroups(P<0.05);"*"indicatessignificantdifferencebetweenspleenandkidney(P<0.05)3.2.5感染组脾、肾组织免疫基因表达如图3-5所示，在三个选育世代脾中，TLR7a、I-IFN表达量均显著高于肾(P<0.05)。脾、肾间免疫基因表达水平的差异在三个选育世代间比较结果为TLR7a基因：F10.05)。26 上海海洋大学硕士学位论文三个选育世代肾中，TRAF6、MyD88a、IL-1β表达量均显著高于脾组织(P<0.05)，脾、肾间免疫基因表达水平的差异在三个选育世代间比较结果为TRAF6基因：F20.05)，在TRAF6基因中，F2虽低于F1但均未达显著性水平(P>0.05)。3.3讨论3.3.1免疫基因表达分析Kongchum等[117]通过对TLR2、TLR4、TLR7、MyD88、TRAF6、I-IFN和IL-1β等基因进行克隆测序发现了与鲤抗CyHV-3病毒相关的多个SNP位点，笔者选择了其中的TLR7、MyD88、TRAF6、I-IFN和IL-1β基因进行了本次研究。研究发现，健康鱼类脾中TLR7a、I-IFN、TRAF6、MyD88a、IL-1β基因的表达显著高于肾[118][119]。本研究中，当鲤感染CyHV-3后，TRAF6、MyD88及IL-1β基因在肾中表达量显著高于脾(P<0.05)，脾中TLR7a、I-IFN基因表达显著高于肾(P<0.05)，说明CyHV-3显著上调了TRAF6、MyD88及IL-1β基因在肾中表达量。通过结合本文第三章中脾、肾间病毒载量及本章中免疫基因表达变化的研究结果说明肾可能是免疫CyHV-3的主要免疫器官，也说明TRAF6、MyD88及IL-1β基因在鲤免疫CyHV-3感染过程中发挥重要作用。研究发现，感染CyHV-3后，鲤对由真菌、细菌、寄生虫等引发疾病更易感，从而导致该病更高的死亡率。CyHV-3[120]与细菌[121]均能上调IL-1β基因的表达，IL-1β基因表达量的增加能增强鱼类抗病能力[122]。Toll样受体(Toll-likereceptor,TLR)能直接与MyD88配体结合，并结合IL-1受体相关激酶(IRAKs)向下激活下游接头分子TRAF6，而TRAF6可以激活下游因子IKKs从而分别诱导NF-κB、IRF7和其他炎性因子的表达[123][124]。本文第二章的研究结果表明肾抑制CyHV-3的能力显著高于脾，本研究中感染组TRAF6、MyD88及IL-1β基因在肾中表达量显著高于脾，且感染组TRAF6、MyD88及IL-1β基因的表达量在具有高成活率的F3中显著高表达，由以上结果推测镜鲤在感染CyHV-3后，机体启动多种TRAF6、MyD88参与的TLRs信号通路，并能诱导IL-1β基因的表达，从而发挥抗病毒作用，但这一防御机制还有待进一步的深入研究。27 上海海洋大学硕士学位论文3.3.2抗病力评估本研究中，未感染组仅TRAF6基因在F3的表达量显著高于F1、F2(P<0.05)，推测在选育世代间，除TRAF6基因表达较高外，其他基因未受选育影响。不同选育世代间免疫基因的显著差异表达可以反映选育评估效果。感染组脾、肾中免疫基因表达水平均呈上升趋势；脾中F3的MyD88a、IL-1β基因表达量显著高于F1、F2(P<0.05)、TRAF6基因表达显著高于F1(P<0.05)；肾中IL-1β、TRAF6基因表达显著高于F1、F2(P<0.05)；脾、肾中F1与F2间免疫基因表达水平均差异不显著。以上结果说明F2免疫基因表达水平不稳定，F3免疫基因表达水平较高且趋于稳定，由此推断三个选育世代的抗病能力逐代增强，其中F3抗病力显著。28 上海海洋大学硕士学位论文第四章组织中免疫相关指标的变化及选育世代抗病力评估4.1材料和方法4.1.1样本采集与处理攻毒实验方法同第二章；样品采集同第三章；组织匀浆液制备：准确称取0.1g组织样品，加入9倍体积预冷除菌的0.86%生理盐水，制成10％组织匀浆（电动组织匀浆机，匀浆时间5秒/次，间隙30秒，连续3次，冰水浴中研磨），将制备好的10％匀浆用4℃离心机3000r/min左右离心10～15分钟，取上清，分装后低温保存并待用。4.1.2实验试剂免疫酶活性指标及抗氧化能力指标检测试剂盒：碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、还原型谷胱甘肽(GSH)、蛋白定量测试(BCA法)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，超氧化物歧化酶(SOD，WST-8法)、总抗氧化能力(T-AOC，FRAP法)检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。4.1.3实验仪器组织电动均浆机、台式高速冷冻离心机(eppendorf)、37℃恒温水浴锅、微量酶标仪(Gene5)、移液器(eppendorf)、超低温冰箱及试管等。4.1.4免疫指标检测通过试剂盒检测ACP、AKP、GSH、SOD、T-AOC五个免疫相关指标，比较选育世代F1、F2、F3间脾、肾组织中各免疫指标的变化规律。具体实验步骤完全按照试剂盒说明书操作。ACP酶活检测中金氏单位定义：每克组织蛋白在37℃下与基质作用30分钟产生1mg酚为1金氏单位。AKP酶活检测中金氏单位定义：每克组织蛋白在37℃下与基质作用15分钟产生1mg酚为1金氏单位。SOD酶活力单位的定义：WST-8和黄嘌呤氧化酶催化产生的超氧化物阴离子反应产生水溶性的甲臜染料，SOD29 上海海洋大学硕士学位论文抑制该黄嘌呤氧化酶藕联反应体系，当抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位(unit)。4.1.5数据统计与分析实验所得数据均以平均值±标准差(mean±SD)形式表示，SPSS17.0进行单因子方差分析(one-wayANOVA)。P<0.05为存在显著性差异，将实验结果进行Excel2010作图。4.2结果与分析4.2.1磷酸酶活性比较如图4-1所示，在选育世代F1、F2、F3的脾、肾中，ACP活性均呈下降趋势，F1、F2的脾中ACP活性显著高于肾(P<0.05)，F3的脾、肾中无显著差异(P>0.05)。在脾中，仅F1与F3间存在显著性差异(P<0.05)。在肾中，三个选育世代间均无显著性差异(P>0.05)。如图4-2所示，在选育世代F1、F2、F3的脾、肾中，碱性磷酸酶活性均呈上升趋势，肾中AKP活性显著高于脾(P>0.05)，在两组织中F2、F3均显著高于F1(P<0.05)，但F2与F3间无显著性差异(P>0.05)。图4-1F1、F2、F3间酸性磷酸酶活性比较Fig.4-1ComparisonofacidphosphataseactivitybetweenF1,F2andF3注：标记字母不同表示组内存在显著性差异(P<0.05)；“*”表示脾、肾间存在显著性差异(P<0.05)；“**”表示脾、肾间存在极显著性差异(P<0.01)Note:Differentlettersindicatethepresenceofsignificantdifferencewithinthetwogroups(P<0.05);"*"indicatessignificantdifferencebetweenspleenandkidney(P<0.05);"**"indicatesextremelysignificantdifferencebetweenspleenandkidney(P<0.05)30 上海海洋大学硕士学位论文图4-2F1、F2、F3间碱性磷酸酶活性比较Fig.4-2ComparisonofalkalinephosphataseactivitybetweenF1,F2andF3注：标记字母不同表示组内存在显著性差异(P<0.05)Note:Differentlettersindicatethepresenceofsignificantdifferencewithinthetwogroups(P<0.05)4.2.2抗氧化能力比较4.2.2.1超氧化物歧化酶(SOD)活性比较如图4-3所示，在选育世代F1、F2、F3的脾、肾中，两组织间SOD活性水平无显著性差异(P>0.05)，选育世代中SOD活性变化趋势相同：F20.05)。31 上海海洋大学硕士学位论文图4-3F1、F2、F3间超氧化物歧化酶活性比较Fig.4-3ComparisonofSODbetweenF1,F2andF3注：标记字母不同表示组内存在显著性差异(P<0.05)Note:Differentlettersindicatethepresenceofsignificantdifferencewithinthetwogroups(P<0.05)4.2.2.2总抗氧化能力(T-AOC)比较如图4-4所示，在选育世代F1、F2、F3中，脾中T-AOC指标显著高于肾(P<0.05)，其中F1、F3的脾、肾中均存在极显著性差异(P<0.01)。脾中T-AOC变化趋势：F20.05)。图4-4F1、F2、F3间超氧化物歧化酶活性比较32 上海海洋大学硕士学位论文Fig.4-4ComparisonofT-AOCbetweenF1,F2andF3注：标记字母不同表示组内存在显著性差异(P<0.05);“*”表示脾、肾间存在显著性差异(P<0.05)；“**”表示脾、肾间存在极显著性差异(P<0.01)Note:Differentlettersindicatethepresenceofsignificantdifferencewithinthetwogroups(P<0.05);"*"indicatessignificantdifferencebetweenspleenandkidney(P<0.05);"**"indicatesextremelysignificantdifferencebetweenspleenandkidney(P<0.01)4.2.2.3还原性谷胱甘肽(GSH)比较如图4-5所示，在选育世代F1、F2、F3的脾、肾中，F2脾中GSH显著低于肾(P<0.05)，其余均差异不显著(P>0.05)。脾组织中GSH变化趋势：F10.05)、GSH显著高于F1(P<0.05)，这可能是导致T-AOC在F2肾组织中高于F1的原因。本研究中，在三个选育世代脾中T-AOC显著高于肾(P<0.05)，且T-AOC在脾、肾间变化规律不一致，说明不同组织间T-AOC存在一定差异性。脾中T-AOC指标变化趋势为F20.05)。图5-1F1、F2、F3间溶菌酶性比较Fig.5-1ComparisonofLSMbetweenF1,F2andF3注：标记字母不同表示组内存在显著性差异(P<0.05)Note:Differentlettersindicatethepresenceofsignificantdifferencewithinthetwogroups(P<0.05)5.2.2补体C3、补体C4比较如图5-2所示，在选育世代F1、F2、F3的血清中补体C3、C4的变化趋势与抗病成活率的变化趋势不一致，补体C3中F10.05)。37 上海海洋大学硕士学位论文图5-2F1、F2、F3间补体C3、C4比较Fig.5-2ComparisonofC3,C4betweenF1,F2andF3注：标记字母不同表示组内存在显著性差异(P<0.05)Note:Differentlettersindicatethepresenceofsignificantdifferencewithinthetwogroups(P<0.05)5.2.3免疫球蛋白M(IgM)比较如图5-3所示，在选育世代F1、F2、F3的血清中免疫球蛋白M(IgM)呈上升趋势，与抗病成活率的趋势一致，仅F3的IgM显著高于F1(P<0.05)，F1与F2间无显著性差异(P>0.05)。图5-3F1、F2、F3间免疫球蛋白M比较Fig.5-3ComparisonofIgMbetweenF1,F2andF3注：标记字母不同表示组内存在显著性差异(P<0.05)Note:Differentlettersindicatethepresenceofsignificantdifferencewithinthetwogroups(P<0.05)38 上海海洋大学硕士学位论文5.3讨论5.3.1血清中非特异性免疫指标及特异性免疫指标比较分析溶菌酶是一种碱性蛋白质，也是天然存在的广泛的一种抗菌肽，它具有通过降低细菌细胞壁的稳定性等免疫学功能可以导致细菌的溶解，起到非特异性防御作用[138]，所以溶菌酶是重要的非特异性免疫指标。在正常生理状态下溶菌酶具有较高的活性，濒死时溶菌酶活性降低，所以溶菌酶也是衡量机体免疫机能的重要指标[139]。溶菌酶在机体中可与病毒蛋白直接作用使其失活[140]，被用于治疗人患疱疹病毒引发的疾病，并取得良好效果[141]。本研究中三个抗病选育世代的溶菌酶活性比较发现，溶菌酶活性在F2与F1间无显著性差异但表现出上升趋势，F3中溶菌酶活性显著高于F1(P<0.05)，这一结果说明与F1、F2相比，F3血清对细菌等病原的非特异性免疫应答水平较高。在鱼类中，补体(Complement)的出现早于免疫球蛋白，因此补体在鱼类固有免疫及特异性免疫中具有十分重要的作用，而硬骨鱼类补体活性具有显著的种间特异性[142]，硬骨鱼类补体存在三种激活途径：经典、旁路及凝集素途径，C3、C4均参与这三种激活途径。补体激活产物能调节先天性免疫中病原体的吞噬和受损伤细胞的溶解，在补体激活过程中产生的C3多于C4，所以在补体介导的先天性免疫中C3发挥更重要的作用[143]，本研究中，补体C3含量高于C4，与上述研究结果一致。补体C3在三个选育世代间无统计学差异，F2中C3高于F1、F3，推测F2可能具有更高的吞噬、调理作用。本研究中，F3中C4含量显著高于F2(P>0.05)，但F3与F1无显著性差异，推测可能由于人工选择的作用使F2中补体C4活性降低。通过血清中C3、C4补体水平比较发现F2血清补体水平不稳定，F3血清补体水平较高且较稳定。总之，三个选育世代血清中溶菌酶活性及补体水平呈上升趋势，说明三个选育世代血清的非特异性免疫水平具有逐代增强的趋势。免疫球蛋白(Immunoglobulin)是具有抗体活性或结构相似的一类球蛋白，根据结构功能不同可以分为多个类型[144]，免疫球蛋白M(ImmunoglobulinM,IgM)是硬骨鱼类体液免疫中重要的组成成分，真骨鱼类中曾一度认为血液中仅存在一种免疫球蛋白即IgM[145]，虽然近年来在鱼类中不断发现其他免疫球蛋白如IgZ、IgT、IgR等，但IgM水平仍是评价鱼类特异性免疫应答水平的一项重要的免疫参数[146]，免疫球蛋白水平越高，鱼体的免疫保护作用也越强[147]。有研究发现，自然条件下，鲤感染CyHV-3并出现病症后能在血清中检测出该病毒的特异性抗体[148]。本研究中，F3的IgM水平显著高于F1(P<0.05)，F1与F2间无显著性差异39 上海海洋大学硕士学位论文(P>0.05)，推测F3血清中特异性免疫应答水平显著高于F1。研究发现，IgM不仅参与特异性体液免疫，还参与固有免疫并直接作用于入侵的病原[2]，推测血清中IgM水平也体现了鲤体液免疫应答水平，较高的体液免疫应答水平有助于鲤免疫因CyHV-3全身性迅速扩散而引起的其他病发症，其复杂的免疫机制还有待进一步验证。5.3.2抗病力评估CyHV-3能降低鲤血清中溶菌酶和免疫球蛋白的活性[149]，所以当机体具有较高溶菌酶活性或免疫球蛋白活性时，机体对CyHV-3的抑制作用较强。血清中C反应蛋白(CRP)和补体(C)在鲤感染CyHV-3后的免疫急性期反应中发挥重要作用[150]。本研究中，IgM、LZM在三个选育世代间均呈上升趋势，其中F3的IgM水平显著高于F1(P<0.05)、LZM水平均显著高于F1、F2(P<0.05)。补体C3、C4均存在F10.05)，以上结果说明F2血清免疫水平不稳定，F3血清免疫水平显著高于F1、F2。由以上结果推测，三个选育世代的抗病能力逐代增强，其中F3抗病力显著。40 上海海洋大学硕士学位论文第六章养殖对比实验及选育世代抗病力评估6.1材料和方法6.1.1实验场地选择及养殖模式辽宁丹东鸭绿江，某镜鲤养殖厂中锦鲤疱疹病毒病存在连续多年固定爆发的情况，因此选择该养殖厂进行本次研究。养殖模式：在鸭绿江中，进行高密度网箱养殖。6.1.2网箱规格及排布方式将2016年繁殖的抗病选育世代F1、F2、F3夏花及未经历选育的对照组夏花分别在同一水域相邻网箱中进行养殖并编号F1、F2、F3、对照组。网箱规格：9m×18m×5m。6.1.3放养密度及养殖管理2016年繁殖F31、F2、F3、对照组夏花的放养密度为60尾/m。饲料投喂：定时定点定量投喂，每天投喂3次，投饵率控制在3%~8%左右，日常管理：每日分早、中晚巡视网箱情况，观测水质、水温及实验鱼健康状况，并做好养殖实验记录。6.1.4捕捞及统计于爆发锦鲤疱疹病毒病后对网箱中F1、F2、F3、对照组的成活个体进行捕捞并统计，计算抗病成活率。6.2结果与分析2016年繁殖选育世代F1、F2、F3在爆发锦鲤疱疹病毒病后，统计抗病成活率为61.1%、86.6%，92.5%，对照组抗病成活率为57.4%（表6-1）。41 上海海洋大学硕士学位论文表6-12016年统计F1、F2、F3成活率情况Table6-1SurvivalrateofF1、F2、F3(2016)网箱号成活率CagenumberSurvivalrateF161.1%F286.6%F392.5%对照组(control)57.4%6.3讨论本研究在2016年进行了镜鲤抗病选育世代F1、F2、F3的养殖对比实验，比较了当感染并爆发锦鲤疱疹病毒病(KHVD)时三个选育世代及未经历选育的对照组的成活率情况。结果表明F1、F2、F3抗病力逐代提高，其中F3的抗病效果显著。而本研究中，CyHV-3病毒载量、免疫基因达及免疫相关指标的研究结果均表明选育世代间抗病力具有逐代增强的趋势，其中F3抗病力显著，与养殖对比实验的评估结果相符，说明该生的评估方法具有一定可行性，是进行鱼类抗病毒新品种选育世代评估的行之有效的方法。42 上海海洋大学硕士学位论文结论1.病毒感染时，脾中CyHV-3病毒载量显著高于肾，说明CyHV-3可能主要侵染鲤的脾组织。而肾中免疫基因TRAF6、MyD88及IL-1β基因的表达显著高于脾，说明肾可能是免疫CyHV-3的主要免疫器官。未感染组中仅TRAF6基因在F3的表达量显著高于F1、F2，推测在选育世代间，除TRAF6基因表达较高外，其他基因未受选育影响。2.选育世代间病毒载量呈下降趋势，F3显著低于F1、F2。免疫基因表达水平和免疫相关指标均呈上升趋势，其中免疫基因TRAF6、MyD88、IL-1β，组织中免疫相关指标AKP、T-AOC、GSH及血清中非特异性免疫指标(IgM)、特异性免疫指标(LZM)均存在F3显著高于F1的情况。由此推测选育世代间抗病力呈逐代增强的趋势，且F3抗病力显著。与实际养殖对比实验结果相符，说明本研究通过上述三个指标成功评估了镜鲤选育世代的抗病力。43 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上海海洋大学硕士学位论文致谢转眼间，三年的研究生生活将近尾声，在本论文即将完成之际，谨此向我的导师石连玉老师致以衷心的感谢和崇高的敬意!您治学严谨、学识渊博、待人诚恳、胸襟坦荡及兢兢业业的工作精神为我树立了榜样，将使我终生受益匪浅！本论文的顺利完成还应该感谢我的论文指导老师贾智英老师，在此请贾老师收下我真诚的谢意！在完成毕业论文的过程中，贾智英老师对我的课题设计、实验操作到论文的撰写等所有过程都付出大量的精力，当我在实验过程中感到迷茫困惑时，您的耐心开导与高度专业的引导让我受益良多，同时感谢您原谅了我因自身问题给您凭添的诸多烦恼！真诚的感谢课题组郎延贺师姐在实验和生活中对我的帮助！您的帮助让我的论文能更加快速和高质量的完成。真诚的感谢课题组其他老师及黑龙江水产研究所中所有帮助过我或仅给予我一抹微笑的老师和同学们，遇见你们对于我是一笔十分宝贵的财富！由衷感谢我的室友同学李渊和刘帅，两位可爱的姑娘在学术及生活上都给予了不可替代的关系和照顾，也希望你们的生活将一切美好。衷心的感谢我的父母、我的弟弟妹妹和我在哈尔滨生活的姑姑在生活上对我的关心、支持和理解，没有他们对我的关心、鼓励和支持，我无法完成现在的硕士学业。谨以此文，献给我关心的所有人，望大家的未来一切美好！白姗姗哈尔滨2017年5月54 上海海洋大学硕士学位论文攻读硕士论文期间发表的学术论文[1]．白姗姗,贾智英,石连玉.鱼类免疫应答机制研究进展[J].水产学杂志.（已录用）[2]．贾智英,白姗姗,李池陶,李保,石连玉.德国镜鲤抗病选育群体的亲子鉴定及遗传结构分析[J].基因组学与应用生物学,2017,36.（已录用）[3]．白姗姗,贾智英,郎延贺,石连玉.CyHV-3感染镜鲤选育世代免疫基因表达及抗病能力比较[J].上海海洋大学学报.（已录用）55