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分类号学号142017ＵＤＣ密级军事科学院博士学位论文天然小分子化合物VibsaninA联合酪氨酸激酶抑制剂诱导急性髓系白血病细胞分化的作用与机制研究StudyontheeffectsandmolecularmechanismsunderlyingtheinduceddifferertiationtherapyofacutemyeloidleukemiawithanaturalproductvibsaninAcombinedwithtyrosinekinasetargeteddrugs作者姓名申星学科专业病理与病理生理学指导教师从玉文答辩主席高春纪学位授予单位军事科学院论文提交日期二○一八年六月一日 原创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作新取得的研，论文中不包含其他究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外人已经发表和撰写过的研究成果，也不包含为获得军事科学院或其他教育机构的一任何贡献均已学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文题目：叫’：及曰期：７＾４年＜月／日学位论文作者签名崎学位论文版权使用授权书本人完全了解军事科学院有关保留。本人授权军事科、使用学位论文的规定学院可以保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，允许论文以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可被查阅和借阅；可以采用影印。、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文（保密学位论文在解密后适用本授权书）学位论文题目：＾ａ／日牵俛论女作者答名：年：日期６月曰期：年月日作者指导教师签名：／／％厶／＾，》 目录摘要…………………………………………………………………………...……VIIIAbstract…………………………………………………………………………….....XI前言………………………………………………………………………………......1第一章天然小分子化合物VibsaninA联合酪氨酸激酶抑制剂诱导AML细胞分化效应研究………………………………………………...………………..…….…....51.1实验材料..........................................................................................................61.1.1实验细胞...............................................................................................61.1.2实验药物...............................................................................................61.1.3实验试剂...............................................................................................61.1.4实验仪器...............................................................................................71.1.5Westernblot实验所需试剂的配制......................................................71.2实验方法..........................................................................................................71.2.1细胞培养...............................................................................................71.2.2瑞氏吉姆萨染色法观察AML细胞分化的形态学变化....................81.2.3胎盘蓝拒染法检测细胞增殖抑制曲线...............................................81.2.4流式细胞学检测方法...........................................................................81.2.5Westernblot检测相关蛋白表达水平变化..........................................81.2.6统计学分析...........................................................................................91.3实验结果..........................................................................................................91.3.1TKIs诱导HL-60细胞分化的活性研究.............................................91.3.2TKIs协同VibsaninA诱导HL-60细胞分化活性筛选...................101.3.3VibsaninA协同TKIs诱导HL-60细胞分化的量效关系...............121.3.4VibsaninA协同TKIs诱导AML细胞髓系分化.............................141.3.5VibsaninA协同TKIs抑制HL-60细胞增殖...................................151.3.6VibsaninA协同TKIs抑制HL-60细胞周期阻滞...........................171.4讨论................................................................................................................19第二章天然小分子化合物VibsaninA单独诱导AML细胞分化机制研究………………………………………………...……….……………………...........222.1实验材料........................................................................................................222.1.1实验细胞.............................................................................................22第I页 2.1.2实验药物.............................................................................................222.1.3实验试剂.............................................................................................222.1.4实验仪器.............................................................................................232.1.5质粒转染相关试剂所需试剂的配制.................................................232.2实验方法........................................................................................................232.2.1细胞培养.............................................................................................232.2.2流式细胞学检测方法.........................................................................232.2.3Westernblot检测相关蛋白表达水平变化........................................232.2.4RT-PCR检测转录因子的表达..........................................................232.2.5过表达c-Myc的重组慢病毒载体的构建和细胞转染.....................242.2.6统计学分析.........................................................................................282.3实验结果........................................................................................................232.3.1VibsaninA在转录水平降低c-Myc的表达.....................................282.3.2VibsaninA在通过蛋白酶体途径降解c-Myc..................................302.3.3构建过表达c-Myc的慢病毒载体.....................................................312.3.4过表达c-Myc拮抗VibsaninA诱导HL-60细胞分化...................332.3.5过表达c-Myc拮抗vibsaninA诱导NB4细胞分化.......................352.3.6VibsaninA通过PKC-ERK-cMyc信号轴介导AML细胞分化.....352.4讨论................................................................................................................37第三章天然小分子化合物VibsaninA协同酪氨酸激酶抑制剂诱导AML细胞分化的信号转导通路研究…………………………………………………………............393.1实验材料........................................................................................................393.1.1实验细胞.............................................................................................393.1.2实验药物.............................................................................................393.1.3实验试剂.............................................................................................393.2实验方法........................................................................................................393.2.1细胞培养.............................................................................................403.2.2流式细胞学检测方法.........................................................................403.2.3Westernblot检测相关蛋白表达水平变化........................................403.2.4RT-PCR检测转录因子的表达..........................................................403.2.5LynshRNA慢病毒的制备和细胞转染.............................................403.2.6统计学分析.........................................................................................413.3实验结果........................................................................................................413.3.1PKC的激活参与VibsaninA协同TKIs诱导HL-60细胞分化.....41第II页 3.3.2VibsaninA协同TKIs上调Lyn蛋白的表达...................................443.3.3沉默Lyn对VibsaninA协同TKIs诱导AML细胞分化的影响...483.3.4VibsaninA协同TKIs增强对Raf/MEK/ERK的调控.....................543.3.5VibsaninA协同TKIs增强对核转录因子c-Myc的调控作用.......583.4讨论................................................................................................................62第四章结论与展望………………………………………………………….……...68参考文献………………………………………………………………………...……..69第III页 表目录表2.1c-Myc、c/EBPβ、p21的Real-timePCR引物序列...............................................25表3.1Lyn的Real-timePCR引物序列.............................................................................41第IV页 图目录图1.1VibsaninA结构以及其诱导AML细胞分化作用.................................................10图1.2TKIs诱导HL-60细胞分化活性筛选.....................................................................10图1.3TKIs联合VibsaninA增强诱导HL-60细胞分化的效应研究.............................12图1.4VibsaninA联合TKIs诱导HL-60细胞分化的协同指数.....................................13图1.5VibsaninA协同TKIs诱导AML细胞分化的剂量效应曲线..............................14图1.6VibsaninA协同TKIs诱导NB4、U937、THP-1细胞CD11b的表达..............14图1.7VibsaninA协同TKIs诱导HL-60细胞分化的形态学变化.................................15图1.8VibsaninA协同TKIs抑制HL-60细胞增殖.........................................................17图1.9VibsaninA协同TKIs诱导AML细胞凋亡..........................................................17图1.10VibsaninA协同TKIs诱导HL-60细胞G1期阻滞............................................18图1.11VibsaninA协同TKIs对分化相关转录因子和周期蛋白的调控.......................19图2.1VibsaninA降低c-Myc的表达...............................................................................30图2.2VibsaninA通过蛋白酶体途径降解c-Myc............................................................32图2.3重组表达c-Myc慢病毒载体的双酶切鉴定..........................................................33图2.4c-Myc基因测序峰图（部分）...............................................................................33图2.5荧光显微镜观察慢病毒包装结果..........................................................................34图2.6c-Myc过表达对VibsaninA诱导HL-60细胞分化的影响..................................35图2.7c-Myc过表达对VibsaninA诱导NB4细胞分化的影响.....................................36图2.8PKC或ERK抑制剂逆转VibsaninA诱导HL-60细胞分化...............................37图3.1PMA协同TKIS增强诱导AML细胞分化...........................................................43图3.2VibsaninA协同TKIs通过PKC途径诱导HL-60细胞分化...............................44图3.3TKIs通过激活PKC诱导HL-60细胞分化...........................................................45图3.4VibsaninA和TKIs对HL-60细胞Lyn的调控作用.............................................47图3.5VibsaninA协同TKIs对AML细胞Lyn的调控作用...........................................49图3.6VibsaninA协同TKIs对Lyn的磷酸化水平的调节作用.....................................50图3.7VibsaninA协同TKIs对HL-60细胞LynmRNA水平的调节作用....................50图3.8LynshRNA慢病毒转染的干扰效率验证..............................................................51图3.9靶向沉默Lyn拮抗VibsaninA协同TKIs上调Lyn的作用..............................52图3.10靶向沉默Lyn对AML细胞诱导分化形态的影响............................................53图3.11VibsaninA协同TKIs通过PKC和Lyn诱导HL-60细胞分化........................54图3.12VibsaninA协同TKIs通过PKC和Lyn诱导NB4细胞分化...........................55图3.13靶向沉默Lyn对VibsaninA协同一类TKIs诱导HL-60细胞分化的影响....56图3.14TKIs对Raf/MEK/ERK的调控作用..................................................................57第V页 图3.15VibsaninA协同TKIs增强对Raf/MEK/ERK的调控作用................................59图3.16VibsaninA协同TKIs通过Raf/MEK/ERK诱导HL-60细胞分化....................60图3.17PKC和Lyn对Raf/MEK/ERK的调控作用.........................................................62图3.18PKC和Lyn共同调节Raf-1的磷酸化................................................................64图3.19VibsaninA协同TKIs对c-Myc的调控作用.......................................................66图3.20VibsaninA协同TKIs降低c-Myc的表达...........................................................67图3.21过表达c-Myc逆转VibsaninA协同TKIs诱导HL-60细胞分化.....................68图3.22过表达c-Myc逆转VibsaninA协同TKIs诱导NB4细胞分化........................69图3.23VibsaninA协同TKIs通过PKC和Lyn协同诱导AML细胞分化机制示意图..........................................................................................................................................73第VI页 缩略语表PTKproteintyrosinekinases酪氨酸激酶TKIproteinreceptortyrosinekinase(RTK)inhibitor酪氨酸激酶抑制剂PMAphorbol-12-myristate-13-acetate佛波酯12-十四酸酯13-乙酸酯AMLacutemyelocyticleukemia急性粒细胞性白血病CMLchronicmyeloidleukemia慢性粒细胞性白血病PKCproteinkinaseC蛋白激酶CDMSODimethylsulfoxide二甲基亚枫CDKcyclin-dependentkinase细胞周期依赖蛋白激酶APLacutepromyelocyticleukemia急性早幼粒细胞性白血病RT-PCRreversetranscriptionpolymerasechainreaction逆转录多聚酶链反应ERKextracellularregulatedproteinkinases细胞外调节蛋白激酶MAPKmitogen-activatedproteinkinase丝裂原活化蛋白激酶c-Myccellular-myelocytomatosisviraloncogene骨髓细胞瘤致癌基因EGFRepidermalgrowthfactorreceptor表皮生长因子受体SRCsarcomagene肉瘤基因ATRAalltransretinoicacid全反式维甲酸第VII页 摘要天然小分子化合物VibsaninA联合酪氨酸激酶抑制剂诱导急性髓系白血病细胞分化的作用与机制研究研究背景和目的急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,AML)是最常见的造血系统肿瘤，增殖缺陷和分化受阻是导致白血病干细胞能过度增殖的两大原因。至今为止，大部分AML患者的治疗现状也不容乐观，即使能够通过化疗使病情完全缓解，复发的比率也仍然不容乐观。虽然ATRA用于诱导分化治疗AML取得了成功，但是ATRA诱导分化治疗仅对占AML10%的APL(M3型AML)有效，而且还存在维甲酸综合征和维甲酸耐药两大缺陷，因此研究新的诱导分化剂也已经成为治疗AML研究的迫切需要。酪氨酸激酶（proteintyrosinekinases，PTK）的异常激活在AML发病进程中发挥重要作用，以PTK为靶点的药物研发和治疗方案已成为研究热点，许多酪氨酸蛋白激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitor，TKI)类抗肿瘤药物被报道具有脱靶效应（off-target），具有一定的白血病治疗作用。然而这些药物自身诱导AML细胞分化活性较弱，但是能协同ATRA诱导AML细胞分化。Vibsane型二萜化合物是荚醚属植物内提取的天然小分子化合物，存在80多种构型，具有鱼毒活性，被广泛报道具有抗肿瘤作用。我们前期研究发现VibsaninA是一种新型的诱导分化剂，能显著诱导AML细胞分化，随后发现并确证了蛋白激酶C（proteinkinaseC,PKC）是其诱导白血病细胞分化的作用靶点，VibsaninA通过激活PKC依赖的ERK/MAPK途径诱导AML细胞分化，研究还发现VibsaninA能够协同酪氨酸激酶抑制剂诱导AML细胞分化，本课题拟通过细胞分化模型筛选，发现酪氨酸激酶抑制剂协同VibsaninA诱导AML细胞分化的最佳组合；深入研究PTK和PKC及其介导的信号转导通路，以期揭示酪氨酸激酶抑制联合VibsaninA诱导AML细胞分化的分子机制，最终为诱导分化治疗AML提供新的治疗方案和药物靶点。研究方法1.利用流式细胞学检测细胞表面分化抗原CD11b的方法，筛选出一类可能具有诱导AML细胞分化作用的TKIs，并分别评估这些化合物联合VibsaninA协同诱导AML细胞分化的活性。第VIII页 2.通过细胞形态学实验、细胞增殖抑制实验和细胞周期实验和周期蛋白检测进一步确定酪氨酸激酶抑制剂联合VibsaninA诱导AML细胞分化的协同作用。3.利用经典PKC激动剂作为阳性对照药物，利用PKC信号分子抑制剂干预AML细胞分化，如GFX（PKC非选择性抑制剂）及GO6983（传统型和新型PKC抑制剂，抑制PKC-γ、ε、η、θ)等，观察它们对酪氨酸激酶靶向抗肿瘤药物联合FTC诱导的白血病细胞分化的作用，验证PKC途径是否参与协同诱导AML细胞分化。4.本部分研究重点以PKC下游与白血病细胞分化相关的信号转导通路如MAPK为主要研究对象，采用Westernblot、免疫共沉淀等技术，观察通路中关键性信号分子磷酸化水平变化的时空效应，确定参与诱导AML细胞分化的PKC下游信号分子，并分析PKC与酪氨酸激酶调控的相互作用关系（协同或拮抗关键信号分子的激活效应）。5.靶向沉默或过表达技术对协同诱导AML细胞分化的关键信号分子进行验证。研究结果1．VibsaninA联合TKIs诱导AML细胞分化。通过细胞表面分化抗原流式细胞学检测，我们发现一系列FDA批准于上市的TKIs在没有明显毒性的剂量下都能诱导HL-60细胞分化，大部分TKIs都能协同VibsaninA诱导AML细胞分化，其中Imatinib和Sracatinib与VibsaninA的协同作用最强。2．VibsaninA能联合TKIs诱导AML细胞生长抑制和周期阻滞。VibsaninA联合TKIs能够诱导AML细胞G1期细胞增加从而显著协同抑制细胞增殖。蛋白水平研究结果表明VibsaninA能显著的联合TKIs上调周期蛋白P21和P27的表达，降低CDK4和CDK6的表达，并且抑制Rb蛋白的磷酸化。3．VibsaninA联合TKIs通过PKC途径的激活诱导AML细胞分化。经典的PKC激动剂PMA与VibsaninA有相似的协同TKIs诱导AML细胞分化的作用，广谱PKC抑制剂能够部分抑制TKIs联合VibsaninA或TKIs单独诱导AML细胞分化。第IX页 4．VibsaninA联合TKIs上调Lyn蛋白的表达，从而诱导AML细胞分化。Y416位点是SRC家族激酶通用的磷酸化位点，研究结果表明VibsaninA能增强SRC家族激酶Y416位点磷酸化，而TKIs则抑制该位点的磷酸化，但是TKIs单独均能均诱导SRC蛋白激酶家族中Lyn蛋白表达增加，并且与VibsaninA上调Lyn蛋白表达的作用存在正向协同。对Lyn进行免疫沉淀后，发现Lyn的Y416位点磷酸化水平与其总蛋白的表达水平无关，为验证Lyn蛋白的上调在诱导AML细胞分化中的关键作用，我们构建了靶向沉默Lyn的慢病毒，发现靶向干扰Lyn能够抑制所有TKIs联合VibsaninA诱导AML细胞分化的作用，在靶向干扰Lyn的同时抑制PKC途径则几乎完全阻断AML细胞分化。5．PKC和Lyn通过Raf/MEK/ERK信号通路联合诱导AML细胞分化。VibsaninA能联合TKIs能增强ERK1/2、MEK、以及Raf-1的S338和S289/296/301位点的磷酸化的作用，并进一步抑制Raf活性抑制位点S259的磷酸化。Raf-1抑制剂Sorafenib和ERK1/2抑制剂U0126均能抑制联合诱导AML细胞分化，抑制PKC途径或者靶向沉默Lyn均能抑制Raf/MEK/ERK信号通路的激活。6．VibsaninA联合TKIs下调c-Myc蛋白的表达诱导AML细胞分化。VibsaninA联合TKIs用药后1h，实时荧光定量和Westernblot检测到c-Myc蛋白在转录水平的下调和蛋白水平的降解，Raf-1抑制剂Sorafenib和ERK1/2抑制剂U0126能够减弱VibsaninA联合TKIs诱导HL-60细胞内c-Myc蛋白下调的作用，阻断PKC途径和靶向沉默Lyn也能逆转c-Myc蛋白的表达，最后，我们建立过表达c-Myc的AML细胞株，发现过表达c-Myc能拮抗TKIs联合VibsaninA诱导AML细胞分化的作用。研究结论1.研究发现天然小分子化合物VibsaninA能够增强TKIs诱导AML分化的作用。2.VibsaninA联合TKIs通过PKC途径和Lyn途径发挥协同诱导AML细胞分化的作用。3.VibsaninA联合TKIs通过激活PKC和上调Lyn蛋白表达协同激活ERK/MAPK第X页 信号通路，增强对c-Myc的抑制作用，从而上调周期蛋白的表达使AML细胞周期阻滞，并协诱导AML细胞分化。4.VibsaninA联合TKIs有望为AML或其他白血病治疗提供新的诱导分化治疗策略。关键词：PKC，酪氨酸激酶抑制剂，Lyn，AML，分化。第XI页 AbstractStudyontheeffectsandmolecularmechanismsunderlyingtheinduceddifferertiationtherapyforacutemyeloidleukemiawithanaturalproductvibsaninAcombinedwithtyrosinekinasetargeteddrugsBackground&ObjectiveAcutemyeloidleukemia(AML)isoneofthemajorhematologicneoplasms,andischaracterizedbydefectivedifferentiationandaberrantproliferationandsurvivalofclonalprecursormyeloidcells.InthemajorityofdenovoAMLpatientswhoachieveacompleteremission(CR),leukemiawillrecur,whichisassociatedwithpooroutcomes.All-transretinoicacid(ATRA)isanAMLdifferentiationagentthathasintroducedaparadigmforsuccessofcelldifferentiationtherapyforacutepromyelocyticleukemia(APL),auniquesubtypeofAML.Unfortunately,ATRAhasnotbeenfoundtobeclinicallyusefulfortheotherAMLsubtypes,itsapplicationwaslimitedtoretinoicacidsyndromeandretinoicacidresistance.Thus,itisimperativetodevelopnoveldifferentiationtherapiestoattempttoimprovetheprognosisofAMLpatients.Emergingevidencehasimplicatedaberrantactivationofproteintyrosinekinases(PTK)playsanimportantroleinpathogenesisofAML.Manypreclinicalandclinicalstudieshaveprovidedevidencethattyrosinekinaseinhibitor(TKI)sexertmilddifferentiation-inducingeffectofAMLcelllinesduetotheir‘‘off-target’’effects，andenhancingdifferentiationinducedbyATRA.VibsaninA,isolatedfromViburnumplants,isanaturalvibsane-typediterpene,whichconstitutesmorethan80compoundsthatpossesspiscicidal,plantgrowthregulatory,cytotoxic,andanti-inflammatoryactivities.WerecentlyreportedthatvibsaninAisanoveldifferentiation-inducingagentwithpotentantileukemicactivity.Moreover,wedeterminedthatvibsaninAisaproteinkinaseC(PKC)activator,andthatitinducesAMLcelldifferentiationthroughPKCactivation.ItwasalsoshowedthatPTK-targetedanticancerdrugscouldenhancetheAMLcelldifferentiationinducedbyvibsaninA.Basedontheseresults,thisstudywillbedesignedtoscreentheoptimizingcombination,whichincludesPTK-targetedanticancerdrugsandvibsaninA,forsynergisticinductionofAMLcelldifferentiation.ItwillbethoroughlyinvestigatedthatPKCandPTKwiththeirmediatingsignalingpathways.ThemoleculartargetsforthesynergisticinductionofAMLcelldifferentiationwillfurtherbeexploredbyusingtheadvancedproteomicmethods.TotalthesefindingswillrevealthemolecularmechanismsunderlyingthesynergisticinductionofAMLcelldifferentiationbyPTK-targetedanticancerdrugscombinedwithvibsaninA.Noveltherapeuticschedule(s)anddrugtarget(s)willeventuallybeprovidedforthedifferentiationtherapyofAML.Methods1.ToidentifyTKIsthatmayinduceorfavorthedifferentiationofAMLcells,severalFDA-approvedandclinicalTKIsusedatnontoxicconcentrationswereevaluatedfor第XII页 theirabilitytotriggerthedifferentiationofAMLcellswhenusedincombinationwithvibsaninA.2.ThesynergisticeffectofvibsaninAandTKIsincombinationtoinduceAMLcelldifferentiationwasconfirmedbycellmorphology,analysisofcelldifferentiationandcellcycledistribution3.AclassicPKCactivator,PMA,andnonspecificinhibitorsofPKCwereusedtodeterminethefunctionalroleofPKCinthedifferentiationresponsetovibsaninAcombinedwithTKIs.4.Westernblotanalysis，RT-PCRandimmunoprecipitationswereusedtoinvestigatethepotentialcontributionofSFKstothedifferentiationeffectsofthecombinationofvibsaninAandTKIs.5.Genesilencingorectopicgeneexpressionwasusedtosignalpathwaystudyandmolecularmechanismstudy.Results1.VibsaninAsensitizesAMLcellstoTKI-mediatedmyeloiddifferentiation.SeveralFDA-approvedandclinicalTKIsusedatnontoxicconcentrationswereevaluatedfortheirabilitytotriggerthedifferentiationofHL-60cellsbythedetectionofthemyeloiddifferentiationmarker,CD11b.ResultsshowedthatvibsaninApotentiatedthedifferentiation-inducingactionofvariousTKIs,amongwhichimatinibandsaracatinibshowedthemostsignificantsynergisticactivity.2.VibsaninAenhancesTKI-inducedgrowthinhibitionandcellcyclearrest.Inaddition,vibsaninAaugmentedtheabilityofTKIstoinducegrowthinhibitionandG1cellcyclearrestofAMLcells,thecellcyclearrestassociatedwithcombination-induceddifferentiationwasshowntoinvolveamarkedincreaseinp21andp27levelsanddecreaseofCDK4andCDK6withresultantdephosphorylationofRb.3.ActivationofPKCisinvolvedincelldifferentiationinducedbythecombinationofvibsaninAandTKIs.AsimilarcapacityofPMAtoenhancecelldifferentiationinducedbyotherTKIswasalsoobserved,andthepharmacologicalinhibitionofPKCledtopartialreductioninthedifferentiationinducedbythecombinationtreatmentortheTKIsaloneasmeasuredusingbothmorphologicalassessmentandCD11binduction.4.VibsaninAenhancesTKI-inducedLynexpressionthatcontributestoAMLcelldifferentiation.Usingapan-SFKantibodythatrecognizesactivesitephosphorylation(Y416)inallfamilymembers,wefoundthattreatmentofHL-60cellswithvibsaninAinducedanapparentincreaseinSFKphosphorylation,whichwasblockedbyco-treatmentwithTKIs,butTKIsincreasedtotalLynproteinexpression，thisincreasewasfurtherenhancedbyco-treatmentwithvibsaninA.EvaluationofimmunoprecipitatedLynsuggestingthatSFKkinaseactivityisnotnecessaryfordifferentiationLynactivity.Lyn-knockdownsignificantlydiminishedthedifferentiationinducedbyvibsaninA第XIII页 combinedwithimatinib,saracatiniborothereffectiveTKIs.BothpharmacologicalinhibitionofPKCandtargetingLyninterferencealmostcompletelyblockedthedifferentiationofAMLcells.5.Raf/MEK/ERKcascadeactasdownstreameffectorsofPKCandLynduringthecombination-induceddifferentiation.TKIsinducedphosphorylationofERK1/2,MEK,andRaf-1atS338andS289/296/301,andcombinationtreatmentwithvibsaninApluseitherinhibitorfurtherenhancedphosphorylation,ActivationofRaf-1wasfurtherdemonstratedbythedecreaseinS259phosphorylationbecausedephosphorylationofS259initiatedtheactivationofRaf-1.Consistently,pharmacologicalblockadeofRaf-1orERK1/2activationresultedinsignificantinhibitionofcelldifferentiationinducedbythecombinationtreatment.PKCinhibitorpretreatmentclearlysuppressedthephosphorylationofRaf-1,MEK,andERK1/2inducedbyvibsaninAcombinedwithimatiniborsaracatinib,shRNA-targetingLynresultedinasimilardecreaseinMAPKactivationwiththesametreatment.6.Downregulationofc-Mycexpressionmediatesthedifferentiation-inducingeffectsofthecombinationofvibsaninAandTKIs.Downregulationofc-Mycproteinwasdetectablewithin1houroftreatmentandwithcorrespondingdecreaseinc-MycmRNAlevels.Furthermore,pretreatmentofHL-60cellswithsorafeniborU0126reversedcombination-induceddownregulationofc-MycexpressionthatcouldalsobeeffectivelyantagonizedwhenthePKCinhibitorGFXwaspresentorLynexpressionwasknockeddown.Ectopicc-MycexpressionsignificantlyabrogatedthedifferentiationinducedbyvibsaninAcombinedwithTKIs.Conclusion1.VibsaninAsensitizesAMLcellstotyrosinekinaseinhibitor(TKI)-induceddifferentiation.2.BothPKCactivationandLyninductioncontributetocombination-inducedAMLcelldifferentiation.3.ThecombinationtreatmentsynergisticallyinducesdifferentiationbyactivationofPKCandupregulationofLynfollowedbyMAPK-mediatedc-Mycsuppression.4.VibsaninAcoupledwithTKIsmayleadtonewapplicationsofdifferentiation-basedapproachesforAML.Keywords:proteinkinaseC,tyrosinekinaseinhibitor,Lyn,AML,differentiation.第XIV页 前言急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,AML)是成人发病率最高的白血病，起源于染色体异常的造血干细胞异常增殖和分化，占全部急性白血病的80％左右。AML的发病率随着年龄的增加而升高，比如在美国，65岁以下人群中，AML的发病率为1.3/10万人，而65岁以上的人群，AML发病率则高达12.2/10万人[1]，到目前为止，AML的治疗仍然是以阿糖胞苷联合蒽环类细胞毒药物化疗为主，这种治疗缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时也会损害正常机体，导致消化骨髓抑制和消化道损伤，在过去的十年里，标准的诱导化疗在60岁以下的成年人治疗中已经取得了显著的成效，约70%～80%的AML患者达到完全缓解(CR)，5年总生存率(OS)已达到30%～40%[2]，即便在如今的治疗条件下，70%的65岁以上AML患者仍然会在确诊后1年内死亡，5年OS率只有14%，难治性、复发性以及老年性AML的治疗效果仍然不容乐观[3]。肿瘤的诱导分化治疗是肿瘤治疗研究的一个重要领域，上个世纪，研究人员试图利用诱导肿瘤细胞分化来代替副作用显著的细胞毒性化疗方案。造血细胞分化异常被认为是白血病发生的重要原因，在全反式维甲酸(alltransretinoicacid，ATRA)临床应用之前，已经不断有体外实验证实ATRA能诱导白血病细胞株(如HL-60细胞)和急性早幼粒细胞白血病（acutepromyelocyticleukemia，APL）原代细胞分化[4,5,6],1986年中国学者在国际上首次使用全反式维甲酸诱导分化治疗APL并获得了成功，开创了临床应用诱导分化剂治疗白血病的先例，它通过促进APL细胞的分化，抑制肿瘤细胞异常增殖，从而避免化疗所致的骨髓抑制和诱发弥漫性血管内凝血的可能，使白血病的治疗出现了巨大突破，ATRA用于治疗APL，能使该病的完全缓解率（CR）提高到90%，5年生存率达到60%~70%，这为诱导分化治疗药物的研究提供了成功的范例。机制研究表明ATRA通过靶向结合到癌蛋白PML-RARα的维甲酸受体RARα结构域，从而解除了PML-RARα对造血细胞分化的阻遏作用，诱导APL细胞成熟[7]。但是ATRA治疗APL仍然存在维甲酸综合征和维甲酸耐药两大缺陷，而且ATRA诱导分化治疗仅仅对占AML的10%的APL(M3型AML)有效，而且目前除ATRA，国内外还没有新型诱导分化剂进入白血病的临床治疗[8]，因此，发现新型的诱导分化药物或者治疗策略仍然是目前有关急性白血病治疗的迫切需求。在国家“重大新药创制”专项课题《天然活性成分VibsaninA靶向PKC诱导分化治疗白血病的候选药物研究》资助下，本实验室从荚醚属植物早禾树树叶中分离了大量的“Vibsane”型二萜化合物，发现VibsaninA具有显著的诱导AML细胞分化的作用。随后的研究表明，VibsaninA可剂量依赖性抑制白血病细胞增殖活第1页 性，引起白血病细胞G0/G1期阻滞，分子机制研究结果揭示PKC/ERK通路参与VibsaninA诱导的白血病细胞分化，通过过同位素标记的体外结合试验以及酶活性检测证实了PKC是VibsaninA的体内作用靶点，这说明天然小分子化合物VibsaninA是一个结构新颖的PKC激动剂。此外，多数已知PKC激动剂如PMA等具有皮肤的致炎活性和致瘤作用[9]，从而导致这类药物鲜有用于临床实践，实验发现VibsaninA的没有促炎作用，并且能拮抗PMA致炎的效应，这说明VibsaninA安全性较高，综合以上结果提示，天然小分子化合物VibsaninA是一个有应用前景的靶向PKC诱导分化治疗白血病的候选药物。近20年来，一系列白血病发病相关关键基因或调控分子的诱导发病机制被阐明，继而引发了大量白血病靶向治疗药物的研发，人慢性粒细胞性白血病（chronicmyelogenousleukemia，CML）是由于造血干细胞发生t(9;22)染色体突变而形成的骨髓恶性增生疾病，基因置换产物会编码形成具有酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，BCR-ABL的高度酪氨酸激酶活性是导致CML对标准化疗方案耐受的根本原因。靶向酪氨酸激酶BCR-ABL的抗肿瘤药物伊马替尼（Imatinib）是治疗慢性粒细胞性白血病(CML)的革命性化疗方案[10]，已成为白血病分子靶向治疗的范例，这一进展也加速了对AML靶向治疗药物的研发。不同于单一因素诱发CML，AML的发病机制较为复杂。目前认为AML的发病过程中包括多种突变，第一类突变累及信号转导途径中酪氨酸蛋白激酶，如信号分子FLT3(包括内部重复串联和酪氨酸激酶区域突变)、K/NRAS,TP53、c-KIT和STAT3等基因突变或高表达，持续激活的蛋白激酶活性赋予造血前体细胞以增殖和生存优势，第二类突变累及造血调控相关的转录因子，如AMLl-ETO和PML-RARα融合基因突变以及CEBPA、MLL或NPM1点突变等，使造血细胞分化阻滞，由酪氨酸激酶和转录因子这两方面的突变合并作用所形成的“二次打击"已成为AML的主要发病机制[11]。比如AML1-ETO融合基因联合C-KIT突变双重因素才能诱导小鼠发生急性髓系白血病[12]。随着AML发病的分子机制日渐清晰，针对其致病的主要分子，寻找新的靶向诱导分化或诱导凋亡的治疗药物显得尤为重要，根据目前国际上报道的最翔实的蛋白激酶抑制剂抑制谱资料[12]，多数在研或上市的蛋白激酶抑制剂选择性不够专一。因此，已上市的酪氨酸激酶抑制剂由于其“脱靶效应”不断被报道具有抗AML活性，以突变酪氨酸激酶如FLT3和C-KIT为靶点的靶向治疗药物研发也成为研究热点，报道表明大部分上市或者处于临床前试验的酪氨酸激酶抑制剂都具有一定的诱导AML细胞分化活性，但是其作用机制众说纷纭，缺乏系统的研究[13,14]。靶向酪氨酸激酶的抗肿瘤药物治疗AML的“脱靶”效应早已引起研究人员的第2页 关注。EGFR抑制剂吉非替尼（Gefitinib）和厄洛替尼（Erlotinib）均对肺癌相关的EGFR家族激酶具有极强的结合能力，研究人员使用Erlotinib靶向治疗肺癌患者时，意外发现Erlotinib同时使患者的急性白血病进程得到缓解[15]，研究表明EGFR抑制剂对不表达EGFR的MDS和AML细胞存在脱靶效应，能够抑制AML细胞增殖，诱导细胞分化[16,17]，临床试验研究表明Erlotinib对一些EFGR表达阴性的AML病人和高危的骨髓增生异常综合征患者时均有显著的治疗作用，但其具体作用机制尚不明确[18]，进一步研究表明Gefitinib和Erlotinib能够联合同诱导分化及ATRA或维生素D3增强诱导AML细胞周期阻滞和诱导分化的作用[19]。BCR/ABL抑制伊马替尼（Imatinib）和最初均被研发用于靶向治疗CML，然而后续研究表明Imatinib和Nilotinib对AML和急性淋巴细胞性白血病（Acutelymphoblasticleukemia，ALL)）均有一定的治疗作用，Imatinib能够有效地降解APL细胞的维甲酸受体RARα以及融合蛋白PML-RARα，并协同ATRA诱导APL细胞分化[20]。BCR/ABL和SRC双重抑制剂抑制剂达沙替尼（Dasatinib）最初被用来治疗对Imatinib耐药的CML，研究表明Dasatinib通过抑制RAR介导的转录因子C/EBPε和PU.1的表达参与ATRA诱导的APL细胞分化[21]，Dasatinib在单独或联用其他化合物使用的情况下均能不同程度的增强抑制AML细胞增殖的作用[22]，体外实验表明Dasatinib能够促进t(8;21)阳性的AML向中性粒细胞分化[23]，并且同样与ATRA诱导AML细胞分化的效应存在正向协同[24]，近来，研究人员发现酪氨酸激酶抑制剂Dasatinib治疗可延长AML小鼠的寿命，并且能促进阿糖胞苷对白血病的治疗作用[25]。分化诱导药物常与其它具有抑制增殖或诱导分化活性的化合物联合使用，并发挥累加或协同增强的效应[26,27]ATRA和As2O3联用治疗APL是最有代表性的诱导分化联合治疗方案，机制研究发现ATRA与As2O3分别指向PML-RARα的不同区域而发挥协同作用，从而使得APL的临床疗效显著提高，这一结果提示AML的协同用药治疗将是今后肿瘤治疗的发展趋势。Erlotinib、Gefitinib、Imatinib以及Dsatinib均被报道能够协同ATRA或者维生素D3增强诱导AML细胞分化的活性，研究表明ATRA能诱导AML细胞向粒系分化，维生素D3能够诱导AML细胞向单核和巨噬细胞系分化，然而在ATRA和维生素D3诱导分化的HL-60细胞中都能观察到PKC的激活[28,29]。我们的前期实验发现新型PKC激动剂VibsaninA也能有效的协同这些酪氨酸激酶抑制剂诱导AML细胞分化，本研究将从已上市的或临床前的酪氨酸激酶抑制剂中筛选增强VibsaninA诱导AML细胞分化的靶向抗肿瘤药物，研究其联合VibsaninA诱导AML细胞分化的剂量范围和时间效应，筛选药物联用的最佳组合，并对其诱导AML细胞分化的机制进行研究，可望突破此类第3页 靶向药物的应用范围，找到治疗AML的新靶点并获得治疗AML的新的诱导分化治疗策略。第4页 第一章天然小分子化合物VibsaninA联合酪氨酸激酶抑制剂诱导AML细胞分化效应研究本课题前期研究在国家“重大新药创制”专项课题《天然活性成分VibsaninA靶向PKC诱导分化治疗白血病的候选药物研究》（课题编号：2009ZX09103-406；2009-2010）资助下从早禾树树叶中提取了大量的天然Vibsanin型二萜化合物，发现其中VibsaninA是一个具有潜力的诱导分化剂(如下图所示)，能够诱导白血病细胞分化、抑制白血病细胞增殖，进而降低白血病细胞的成瘤性，发现并确证了蛋白激酶C（PKC）是其诱导白血病细胞分化的作用靶点，分子机制研究结果揭示PKC/ERK通路参与VibsaninA诱导的白血病细胞分化，表明小分子化合物VibsaninA是一个有前景的靶向PKC诱导分化治疗白血病的候选药物。VibsaninA图1.1VibsaninA结构以及其诱导AML细胞分化作用本课题组前期依托重大新药创制专项课题（编号：2009ZX09103-406；2009-2010）从珊瑚树的树叶中提取大量Vibsanin型二萜化合物，发现VibsaninA具有诱导AML细胞分化活性。蛋白激酶抑制剂是目前肿瘤靶向治疗药物研究的热点。根据目前国际上报道的蛋白激酶抑制剂抑制谱资料[13]，多数在研或上市的蛋白激酶抑制剂选择性不够专一，因此，许多酪氨酸蛋白激酶抑制剂类抗肿瘤药物被报道具有脱靶效应（off-target），具有潜在的白血病治疗作用。研究发现，这些抑制剂的临床反应比较温和，一般仅可见到其对外周血和骨髓的幼稚细胞有减少作用，故目前研究的重点是激酶抑制物与化疗药的联合应用。本文通过文献调研，对可能具有诱导AML第5页 分化活性的临床前或者已上市的靶向酪氨酸激酶的抗肿瘤药物进行诱导AML细胞分化活性的筛选，包括：BCR/ABL抑制剂伊马替尼（Imatinib）、尼罗替尼（Nilotinib）[31]；EGFR抑制剂吉非替尼（Gefitinib）、厄洛替尼（Erlotinib）；SRC抑制剂[21]达沙替尼（Dasatinib）、伯舒替尼（Bosutinib）和塞卡替尼（Saracatinib）。本部分内容将从以上被报道具有诱导分化AML活性的酪氨酸激酶抑制剂中筛选出增强VibsaninA诱导AML细胞分化的靶向抗肿瘤药物，以期确证其联合VibsaninA诱导AML细胞分化的协同作用，并预期得到药物联用的最佳组合方案。1.1实验材料1.1.1实验细胞人急性髓系白血病细胞株（HL-60、U937、THP-1）、人早幼粒细胞白血病细胞株（NB4）均由本实验室自藏。1.1.2实验药物天然小分子化合物VibsaninA由本实验室依托国家“重大新药创制”专项课题提取；伊马替尼（Imatinib）、塞卡替尼（Saracatinib）、伯舒替尼（Bosutinib）、吉非替尼（Gefitinib）、厄洛替尼（Erlotinib）、达沙替尼（Dasatinib）与尼罗替尼（Nilotinib）均购自Selleck公司，均由DMSO溶解，-20℃避光保存。1.1.3实验试剂细胞培养相关试剂：RPM1640、DMEM(高糖)、胎牛血清与0.25%胰酶-EDTA购自Gibco公司；瑞氏吉姆萨复合染液(Wright-Giemsa)购自Solarbio公司；二甲基亚砜（DMSO）L-谷氨酰胺（L-glutamine）、购自SigmaAldrich公司；培养板购自Costar。流式细胞技术相关试剂：碘化吡啶（PI）和RNA酶A（RNaseA）购自联科生物公司，CD11b-PE单克隆抗体购自BDBiosciences公司。Westernblot相关试剂：丙烯酰胺（Acrylamide）和双叉丙烯酰胺（N,N’-Methylenebisacrylamide）牛血清白蛋白（BSA）购自美国Sigma公司；Tris碱、十二烷基磺酸钠（SDS）购自Amerosco公司；BCA蛋白浓度试剂盒、化学发光的辣根过氧化物酶底物(ECL)购自thermo；酶抑制剂混合物、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；NC膜（0.45µM）购自Millipore公司；Westernblot一抗p21、p27、Rb、CDK4、CDK6、p-Rb(Ser807/811)、Rb购自CellSignalingTechnology；GAPDH购自SantaCruzBiotechnology；二抗兔抗、鼠抗购第6页 自中杉金桥生物科技有限公司。1.1.4实验仪器FACSCalibur流式细胞检测仪购自BectonDickinson公司，美国；离心涂片机购自北京时代北利公司，倒置相差显微镜购自Leica，德国；CO2细胞恒温培养箱三洋，日本；多管架自动平衡离心机购自湘仪离心机仪器有限公司；电热恒温水箱购自北京长安科学仪器厂；立式压力蒸汽灭菌锅购自上海申安医疗器械厂；生物安全柜购自HealForce；稳压电泳仪、水平电泳槽购自BioRad，美国；多功能酶标仪购自深圳市汇松科技发展有限公司；紫外凝胶成像仪购自上海夏日科技有限公司；TS-1型脱色摇床购自江苏基林贝尔仪器公司。1.1.5Westernblot实验所需试剂的配制1）5×凝胶加样缓冲液：1MTris-HCl（PH6.8）0.6mL，甘油2.5mL，10%SDS2mL，β-巯基乙醇0.5mL，溴酚蓝0.01g，加水4.4mL补足至10mL，-20℃保存。2）30%丙烯酰胺（30%Acr-Bis）：丙烯酰胺29g，Bis-亚甲基双叉丙烯酰胺1g加入烧杯，三蒸水定容至100mL，4℃避光保存。3）10×TBST缓冲液：Tris12.1g，40g，HCl6.25mL，Tween200.5mL加入烧杯，三蒸水定容至500mL，室温存放。4）5×电泳缓冲液：Tris15.1g，甘氨酸94g，SDS5g，加入烧杯，三蒸水定容至1000mL，室温存放。5）10×转膜缓冲液：Tris30.3g，甘氨酸144g，加入烧杯，三蒸水定容至1000mL，用时稀释10倍，并加入总体积20%无水甲醇。6）RIPA裂解液（强）：Tris3.02g，NaCl4.38g，1%TritonX-1005mL，1%脱氧胆酸钠5g，0.1%SDS0.5g，加水定容至500mL，调节PH值至7.5，4℃保存。7）1%过硫酰胺（APS）：0.1g过硫酰铵溶于1mL水，分装后-20℃冻存。1.2实验方法1.2.1细胞培养人急性髓系白血病细胞株（HL-60、U937、THP-1）常规用含10%胎牛血清、链霉素（终浓度100U/mL）、青霉素（终浓度100U/mL）的RPMI1640培养基培养；人早幼粒细胞白血病细胞株（NB4）用含体积10%胎牛血清、链霉素（100u/mL）、青霉素（100u/mL）以及L-谷氨酰胺（2mM）的RPMI1640培养基培养，以上细胞均在37℃、5%CO2培养箱培养。第7页 1.2.2瑞氏吉姆萨染色观察AML细胞分化的形态学变化将待测细胞计数后以2×105/mL，以2mL/孔接种六孔板，加药物至相应的浓度，置37℃、5%CO2培养箱培养培养3d，使用0.25%胰酶-EDTA消化镜下贴壁细胞，离心收集细胞悬液，2000rpm离心5min，PBS重悬细胞，使用血细胞计数板进行计数，调整细胞浓度至1×106/mL，取1mL用离心涂片机离心2000rpm离心5min，将细胞甩至载玻片上，等细胞晾干后滴加无水甲醇固定，晾干后以瑞氏吉姆萨复合染液染片10min，自来水冲洗，晾干后使用二甲苯透明1min，中性树脂封片，随后于显微镜下观察并拍照。1.2.3台盼蓝拒染法检测细胞增殖抑制曲线将待测细胞重悬，制备单细胞悬液，取90µL细胞悬液与10µL0.4%的胎盼蓝溶液混匀，室温静置1min，用血细胞计数板技术，计算活细胞数量（整个计数过程在3min之内完成）。1.2.4流式细胞学检测方法1.2.4.1流式细胞学检测细胞表面标记将待测细胞计数后以2×105/mL，以2mL/孔接种六孔板，加药物干预3d，使用0.25%胰酶-EDTA消化镜下贴壁细胞，离心收集细胞悬液，2000rpm离心5min，PBS重悬，加入相应单克隆抗体，4℃避光静置30min，加入1mLPBS洗涤3次，以500µLPBS重悬，上流式细胞仪检测，本实验重复3次。1.2.4.2流式细胞学检测细胞周期将待测细胞计数后以2×105/mL，以2mL/孔接种六孔板，加药物干预24h，离心收集细胞悬液（2000rpm离心5min），以300µL含有1%BSA的PBS重悬细胞，每管加入700µL无水乙醇4℃固定过夜，次日离心收集沉淀，PBS洗涤后加入含有RNaseA的PI溶液300µL，37℃孵育30min，上流式细胞仪检测，本实验重复3次。1.2.5Westernblot检测相关蛋白表达水平变化1.2.5.1总蛋白提取收集细胞，PBS洗涤后，加入含酶抑制剂混合物（1%）的RIPA裂解液（1×106/50µL）置于4℃冰盒上裂解20min，每隔10min使用漩涡振荡器混匀，4℃，12000rpm，离心10min，取上清通过BCA蛋白定量剂盒检测蛋白浓度，将剩余蛋白液按照4:1与5×凝胶加样缓冲液混匀后，加热煮沸10min，使蛋白充分、彻底地解链，破坏其高级结构，-80℃冻存。第8页 1.2.5.2蛋白质免疫印迹1）从-80℃冰箱取出蛋白样本，煮沸变性5min。2）凝胶制备：按配方配制相应浓度分离胶，离玻璃板上沿约2cm，30min凝固后，配制5%浓缩胶。3）使用1×电泳缓冲液进行电泳，先80V40min，待蛋白marker进入分离胶后，增大电压至120V，继续电泳60min。4）NC膜裁剪后，于1×转膜缓冲液中浸泡待用，截取相应条带的分离胶，按照黑板/纤维棉/滤纸/胶/NC膜/滤纸/纤维棉/白板的“三明治”结构组装，于200mA恒流转膜90min（具体待定），转膜全程冰浴。5）封闭：将NC膜放入含5%牛奶的TBST中，室温摇床振荡1h。6）抗体孵育：将NC膜放入抗体杂交袋，加入用5%BSA溶液1:1000稀释的一抗，4℃冰箱过夜。用TBST漂洗NC膜4次（每次5min），加入相应种属的二抗（1：5000）室温孵育1h，TBST漂洗4次（每次5min）。7）显影：将ECL液的A、B液按照1:1混合，将NC膜浸入2min，用吸水纸滤干后，通过化学发光成像系统扫描分析，并拍照。1.2.6统计学分析所有实验数据均重复三次，定量的结果采用统计学分析软件SPSSStatistics19.0进行studentt检验（双侧）和单因素方差分析（one-wayANOVA）（用于协同用药组同时与两个单独用药组比,P<0.05表示有统计学差异，用均数±标准差表示，实验数据用Originlab9.0作图。为确证联合用药是否具有协同作用，根据Chou-Talalay联合指数法，使用CalcuSynsoftware1.0计算药物连用的联合指数（Combinationindex，CI）值。1.3实验结果1.3.1TKIs诱导HL-60细胞分化活性研究造血细胞胞膜上的抗原成分随着其分化成熟的各个阶段表达程度各不相同，CD11b是造血细胞向髓系分化成熟的表面标志。为探索这些药物否具有诱导AML细胞分化作用，我们将酪氨酸激酶抑制剂以不引起明显细胞毒性的剂量处理HL-60细胞，72h后检测不同剂量下的CD11b表达情况。如图1.2所示，Imatinib、Saracatinib、Dasatinib和Bosutinib单独均能显著诱导HL-60细胞CD11b的表达。Dasatinib诱导分化作用最突出，在10µM剂量下诱导HL-60细胞CD11b表达率达50%；Imatinib与Saracatinib诱导分化活性相似，10µM剂量诱导CD11b低表达，但是剂量为20µM时，CD11b的表达则分别增加至75.5%和79.2%；Bosutinib与第9页 最高在5µM剂量下诱导HL-60细胞CD11b表达率分别为36.7%；而Erlotinib、Gefitinib和Nilotinib在10µM剂量下并无明显诱导HL-60细胞CD11b表达的作用。图1.2TKIs诱导HL-60细胞分化活性筛选Imatinb(IMA)与Saracatinib(SAR)(5、10、20µM)；Bosutinib(BOSU)（1.25、2.5、5µM）；Dasatinib(DASA)、Gefitinib(GEFI)、Erlotinib(ERLO)与Nilotinib(NILO)（2.5、5、10µM）联合诱导HL-60细胞72h后经流式细胞仪检测CD11b的表达。图中数据采用均值±标准差表示，n=3，各剂量药物处理组与DMSO对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，Studentt检验分析数据显著性差异。1.3.2TKIs协同VibsaninA诱导HL-60细胞分化活性筛选天然小分子化合物VibsaninA0.1µM剂量单独诱导HL-60细胞CD11b表面标记的表达率为13.3±1.9%，故采用该剂量（0.1µM）用于联合酪氨酸激酶抑制剂诱导AML细胞分化研究（图1.3A）。流式细胞学检测结果表明（图1.3B）：大部分酪氨酸激酶抑制剂均能联合低剂量VibsaninA显著增强诱导急性髓系白血病细胞HL-60的分化效应，其中Saracatinib、Imatinib10µM剂量下联合VibsaninA0.1µM诱导HL-60细胞CD11b表达率分别从21.9%和29.5%提升至75.1%和87.3%；EGFR抑制剂Erlotinib、Gefitinib单独几乎不诱导HL-60细胞CD11b表达，联合VibsaninA却可将CD11b的表达率分别从2.99%和2.29%提高至52.6和56.7%；Dasatinib与Bosutinib联合VibsaninA增强诱导HL-60细胞分化作用相对较弱；值得注意的是，与Imatinib结构类似、抑制酶谱相似，仅侧链空间构向不同的Nilotinib非但与VibsaninA没有协同诱导分化作用，反而将VibsaninA单独诱导CD11b表达的效应（16.8%）分别抑制到了6.3%。所有酪氨酸激酶抑制剂联合VibsaninA增强诱导分化作用排序如图1.3C所示。由于Saracatinib与Imatinib具有显著的协同第10页 VibsaninA诱导HL-60细胞CD11b表达的作用，以及具有相对宽松的诱导分化剂量范围区间和较低的细胞毒性，故采用Saracatinib与Imatinib为代表药物进行后续诱导分化效应确证和进一步机制研究。ABC图1.3TKIs联合VibsaninA增强诱导HL-60细胞分化的效应研究VibsaninA(VibA)诱导HL-60细胞3d后经流式细胞仪检测CD11b的表达（A）。Saracatinib第11页 (10µM)、Imatinb(10µM)、Gefitinib（10µM）、Erlotinib（10µM）、Bosutinib（2.5µM）、Dasatinib（5µM）和Nilotinib（10µM）联合VibsaninA(0.1µM)诱导HL-60细胞分化3d后经流式细胞仪检测CD11b的表达（B）。综合评估各抑制剂增强VibsaninA诱导AML细胞分化能力（C），图中数据采用均值±标准差表示，n=3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与对DMSO对照组相比（Studentt检验）；##P<0.01,###P<0.001表示协同用药组与两个单独用药组相比同时具有统计学差异（one-wayANOVA），&P<0.05与VibsaninA组相比（Studentt检验）。1.3.3VibsaninA协同TKIs诱导HL-60细胞分化的量效关系梯度浓度（Imatinib或Saracatinib联合相应固定剂量比的VibsaninA（Imatinib/Saracatinib:VibsaninA=100：1）处理HL-60细胞72h，经流式细胞学检测CD11b表达，并根据Chou-Talalay联合指数法[32]，计算药物联用的CI值。结果表明Imatinib（图1.4A、B）或Saracatinib（图1.4C、D）联合VibsaninA诱导HL-60细胞CD11b表达的CI值均小于1，具有显著的正向协同诱导AML细胞分化的作用，当Imatinib或Saracatinib用药剂量为10µM，联合VibsaninA0.1µM的情况下，CI值均小于0.01（分别为0.009和0.002），表明在该剂量下，Imatinib或Saracatinib与VibsaninA具有极强的协同诱导分化作用。ABCD图1.4VibsaninA联合TKIs诱导HL-60细胞分化的协同指数Imatinib(IMA)(0.625、1.25、2.5、5、10µM)和VibsaninA（VibA）（0.00625、0.0125、0.025、第12页 0.05、0.1µM）单独或以100:1的剂量比联合诱导HL-60细胞3d后经流式细胞仪检测CD11b的表达（A）；Saracatinib(SAR)(0.625、1.25、2.5、5、10µM)和VibsaninA（0.00625、0.0125、0.025、0.05、0.1µM）单独或以100:1的剂量比联合诱导HL-60细胞3d后经流式细胞仪检测CD11b的表达（C）。经CalcuSynsoftware1.0计算药物联用的CI值和Fa值，绘制联合用药诱导分化的剂量效应曲线(B、D)，CI值＜1表示两个药物具有协同作用。##P<0.01,###P<0.001表示协同用药组与两个单独用药组相比同时具有统计学差异（one-wayANOVA）。为进一步明确VibsaninA与酪氨酸激酶抑制剂在协同用药中的作用和地位，我们通过梯度浓度Imatinib或Saracatinib联合固定浓度VibsaninA，以及梯度浓度VibsaninA联合固定浓度Imatinib或Saracatinib分别处理HL-60细胞72h，经流式细胞学检测CD11b表达率。结果表明VibsaninA剂量恒定的情况下，协同诱导AML细胞分化的效应与酪氨酸激酶抑制剂Imatinib或Saracatinib的用药浓度呈良好的线性关系（图1.5A、C）；而酪氨酸激酶抑制剂剂量恒定的情况下，VibsaninA从0.0125µM至0.1µM剂量区间均与Imatinib或Saracatinib表现出显著的协同诱导分化效应（图1.5B、D），该结果表明VibsaninA协同诱导AML细胞分化的效应与其自身剂量并无明显相关性，在协同分化可能相当于起到“催化剂”的作用，而VibsaninA的存在可能放大这一类酪氨酸激酶抑制自身的诱导AML分化的活性。ABCD图1.5VibsaninA协同TKIs诱导AML细胞分化的剂量效应曲线第13页 Imatinib(IMA)或Saracatinib(SAR)(1.25、2.5、5、10µM)联合VibsaninA（VibA）0.1µM（A、C），或VibsaninA（0.0125、0.025、0.05、0.1µM）联合Imatinib(IMA)或Saracatinib(SAR)10µM诱导HL-60细胞3d后经流式细胞仪检测CD11b的表达（B、D），图中数据采用均值±标准差表示，n=3。1.3.4VibsaninA协同TKIs促进AML细胞髓系分化流式细胞学检测结果表明：Imatinib或Saracatinib联合VibsaninA用药方案除了对HL-60细胞有协同诱导分化作用外，对早幼粒细胞来源的NB4细胞和单核细胞来源的U937细胞、THP-1细胞和也具有相似的增强分化的诱导活性（图1.6），由于各肿瘤细胞品系差异，对药物的敏感性也各有不同，Imatinib与Saracatinib10µM对NB4细胞系几乎毫无诱导分化作用，但是协同VibsaninA0.5µM却能显著诱导NB4细胞分化；VibsaninA诱导U937分化的作用相对较弱，但是在1µM的剂量下也能协同酪氨酸激酶抑制剂增强诱导U937的分化效果，THP-1细胞对VibsaninA最为敏感，VibsaninA即使在0.01µM剂量下也能协同Imatinib与Saracatinib增强诱导THP-1分化。该实验结果提示酪氨酸激酶抑制剂Imatinib或Saracatinib联合VibsaninA对多系AML细胞都有协同诱导分化作用。图1.6VibsaninA协同TKIs诱导NB4、U937、THP-1细胞CD11b的表达Imatinib(IMA)或Saracatinib(SAR)10µM联合VibsaninA（VibA）1µM诱导U937细胞，联合VibsaninA0.5µM诱导NB4细胞，联合VibsaninA0.01µM诱导THP-1细胞3d后经流式细胞仪检测CD11b的表达。图中数据采用均值±标准差表示，n=3，##P<0.01,###P<第14页 0.001表示协同用药组与两个单独用药组相比同时具有统计学差异（one-wayANOVA）。细胞分化必然伴随形态学发生变化，瑞氏吉姆萨染色法可分别针对细胞核与胞浆进行着色，可用于观察确证细胞分化。Imatinib与或Saracatinib联合VibsaninA处理HL-60细胞3天后，经光学显微镜下观察，可见大多数细胞贴壁，部分细胞出现伪足，细胞空泡增多；染色后，可见HL-60、U937、NB4、THP-1细胞胞浆染色变浅，核浆比例缩小；呈典型单核细胞形态（图1.7）。ABDC图1.7VibsaninA协同TKIs诱导HL-60细胞分化的形态学变化Imatinib(IMA)或Saracatinib(SAR)10µM联合VibsaninA（VibA）0.1µM诱导HL-60细胞(A)，联合VibsaninA1µM诱导U937细胞(B)，联合VibsaninA0.5µM诱导NB4细胞(C)，联合VibsaninA0.01µM诱导THP-1细胞(D)3d后的形态学观察（400×，标尺为20µm）。1.3.5VibsaninA协同TKIs抑制HL-60细胞增殖通过细胞计数观察Saracatinib或Imatinib联合VibsaninA对HL-60细胞增殖的影响（图1.8A、B），结果表明，低浓度VibsaninA（0.1µM）对HL-60细胞增殖几乎没有影响，而Saracatinib或Imatinib联合VibsaninA，则显著抑制HL-60细胞增殖，并且呈现明显的剂量和时间依赖性。第15页 AB图1.8VibsaninA协同TKIs抑制HL-60细胞增殖Imatinib(IMA)或Saracatinib(SAR)10µM联合VibsaninA（VibA）0.1µM处理HL-60细胞24、48、72h后通过细胞计数板经进行计数（A、B），图中数据采用均值±标准差表示，n=3，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001表示协同用药组与两个单独用药组相比同时具有统计学差异（one-wayANOVA）。为进一步明确Saracatinib或Imatinib联合VibsaninA抑制HL-60细胞增殖的作用方式，我们通过流式细胞学检测联合用药3d后HL-60细胞的凋亡情况，如图1.9A、B所示：Saracatinib与Imatinib在10µM剂量下单独诱导HL-60细胞凋亡并不显著，VibsaninA联合Saracatinib或Imatinib可诱导HL-60细胞凋亡率分别达到18.46±6.50和6.62±0.48，然而联合用药方案诱导HL-60细胞的凋亡作用并不足以造成显著的细胞增殖抑制，这提示Saracatinib或Imatinib联合VibsaninA抑制HL-60细胞增殖并非完全依赖于诱导细胞凋亡。A第16页 B图1.9VibsaninA协同TKIs诱导AML细胞凋亡Imatinib(IMA)或Saracatinib(SAR)10µM联合VibsaninA（VibA）0.1µM处理HL-60细胞72h，经凋亡试剂盒标记AnnexinV和PI，经流式细胞仪检测细胞凋亡率，图中数据采用均值±标准差表示，n=3(图A为柱状图，图B为有代表性的流式图)。1.3.6VibsaninA协同TKIs诱导HL-60细胞周期阻滞由于Imatinib或Saracatinib联合VibsaninA对AML细胞显著的抑制增殖作用并非完全来自诱导细胞凋亡，我们采用PI标记细胞，使用流式细胞仪检测HL-60经联合给药处理1d后细胞周期分布情况（图1.10A、B），结果显示Saracatinib与Imatinib10µM剂量单独抑制细胞周期的作用并不明显（S期分别47.01±3.77%和45.03±6.47%），而Saracatinib、Imatinib联合VibsaninA后，处于G0/G1期的细胞比例则显著增加，处于S期的细胞几乎完全消失（S期分别为2.82±0.55%和10.20±1.62%），细胞分化的同时往往伴随周期阻滞，该周期检测结果与酪氨酸激酶抑制剂协同诱导AML细胞分化效应一致。A第17页 B图1.10VibsaninA协同TKIs诱导HL-60细胞G1期阻滞Imatinib(10µM)或Saracatinib(10µM)联合VibsaninA(0.1µM)诱导细胞24h，PI标记后，经流式细胞仪检测细胞周期(图A为柱状图，图B为有代表性的流式峰图)，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001表示协同用药组与两个单独用药组相比同时具有统计学差异（one-wayANOVA）。Imatinib与Saracatinib在联合VibsaninA诱导AML细胞分化时具有显著的协同作用，同时二者均剂量依赖性的增强VibsaninA对HL-60细胞的增殖抑制，并伴随诱导AML细胞G0/G1期阻滞，在观察到上述诱导AML细胞分化现象的同时，我们深入研究了Imatinib与或Saracatinib联合VibsaninA对调控周期蛋白是否同样具有协同作用。Rb的磷酸化对于细胞从G1期进入S期至关重要，其磷酸化受到CDK4/6与cyclinD复合物的调控，CDK抑制剂p21和p27通过抑制CDK/cyclinD复合物从而在促进细胞周期阻滞中发挥重要作用。如图1.10所示：Westernblot结果显示：VibsaninA联合Imatinib（图1.10B）或Saracatinib（图1.10C）降低了RbSer807/811位点的磷酸化水平，降低了CDK4、CDK6的表达，并显著的增加了p27和p21蛋白的表达，以上结果表明Saracatinib或Imatinib在促进细胞周期阻滞效应上与VibsaninA有明确的正向协同作用。第18页 AB第19页 C图1.11VibsaninA协同TKIs对分化相关转录因子和周期蛋白的调控Imatinib(10µM)或Saracatinib(10µM)联合VibsaninA(0.1µM)诱导HL-60细胞24h，裂解细胞总蛋白，Westernblot检测蛋白水平的变化（(图A为代表性的Westernblot图片，图B、C为蛋白相对表达定量统计图），图中数据采用均值±标准差表示，n=3，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001表示协同用药组与两个单独用药组相比同时具有统计学差异（one-wayANOVA）。1.4讨论酪氨酸激酶是蛋白激酶最大的一个家族，有90个成员，可分为RTK（约58种）和非RTK（含Src家族等）。已有的资料表明，超过50%的原癌基因和癌基因产物都具有蛋白酪氨酸激酶活性。因此，蛋白酪氨酸激酶是目前抗肿瘤药物研究的主要靶标[11]。大量的酪氨酸蛋白激酶抑制剂类抗肿瘤药物（比如Erlotinib、Gefitinib）被报道具有“脱靶效应”，能够不依赖自身特异性靶点，抑制AML细胞增殖并诱导细胞分化，具有一定的治疗作用，但是临床试验中效果有限，而且其机制还有待进一步研究。我们将这些可能具有抗AML活性或诱导AML细胞分化作用的酪氨酸激酶抑制剂归纳总结，并对其诱导AML分化效果进行了比对评价，实验结果表明BCR/ABL抑制剂Imatinib以及SRC抑制剂Saracatinib、Dasatinib和Bosutinib单独均能显著诱导HL-60细胞CD11b的表达；EGFR抑制剂Gefitinib、Erlotinib与二代BCR/ABL抑制剂Nilotinib则没有诱导AML细胞分化的作用。目前，新型SRC抑制剂Saracatinib与Bosutinib对AML细胞的诱导分化作用尚未见第20页 文献报道。本实验室前期工作发现天然小分子化合物VibsaninA是一个具有潜力的诱导分化剂，能显著诱导AML细胞分化并剂量依赖性抑制白血病细胞增殖，发现并确证了蛋白激酶C（PKC）是其诱导白血病细胞分化的作用靶点。前期研究发现VibsaninA能够与部分酪氨酸激酶抑制剂协同增强对AML细胞的诱导分化作用，基于急性白血病发病的联合用药协同治疗趋势，我们提出将靶向酪氨酸激酶药物抑制剂与诱导分化剂VibsaninA联合应用治疗AML，并对其可能产生协同作用的机制进行研究，以期最终有可能获得针对AML治疗的新的诱导分化作用靶点或诱导分化治疗手段。进一步研究表明，自身具有诱导AML细胞分化活性的Imatinib、Saracatinib、Bosutinib、Dasatinib以及没有诱导分化作用的Gefitinib、Erlotinib在单独应用诱导AML细胞分化作用相对较弱或没有活性的剂量下，均能显著增强VibsaninA诱导AML细胞分化的作用，除了Sorafinib和Nilotinib表现为抑制分化的作用以外，其余所有药物均能显著增强VibsaninA诱导AML细胞分化，其中Imatinib与Saracatinib协同VibsaninA增强诱导AML细胞分化的作用最为显著。值得注意的是，与Imatinib结构类似、抑制酶谱相似，仅侧链空间构向不同的Nilotinib非但与VibsaninA非但不具备诱导分化活性，反而表现为持续抑制分化。TKIs联合VibsaninA诱导AML细胞分化的药物联合指数结果表明：Imatinib或Saracatinib与VibsaninA在诱导AML细胞分化的过程中存在明显协同作用，其中Imatinib或Saracatinib在10µM剂量下联合VibsaninA0.1µM的协同诱导AML细胞分化的作用最强。通过绘制Imatinib、Saracatinib与VibsaninA联合诱导分化的剂量效应曲线，结果表明：在VibsaninA剂量恒定的情况下，协同诱导分化的效应与酪氨酸激酶抑制剂Imatinib或Saracatinib的用药浓度呈良好的线性关系；而酪氨酸激酶抑制剂剂量恒定的情况下，VibsaninA从0.0125至0.1µM均与Imatinib或Saracatinib表现出显著的协同分化效应，这一重要发现提示VibsaninA在协同分化可能相当于起到“催化剂”的作用，而联合诱导分化的最终效果取决于酪氨酸激酶抑制自身的诱导分化活性。流式细胞学检测一步验证TKIs联合VibsaninA除了对HL-60细胞有协同诱导分化作用外，对早幼粒细胞来源的NB4细胞和单核细胞来源的U937细胞、THP-1细胞和也具有相似的协同诱导增强分化的活性；瑞氏吉姆萨染色实验结果同样也提示TKIs联合VibsaninA能诱导AML细胞向髓系分化。随后的实验结果表明TKIs协同VibsaninA诱导AML细胞分化的同时，伴随剂量依赖的抑制AML细胞增殖，并且在联合诱导分化的药物剂量下诱导HL-60第21页 细胞凋亡并不显著，这提示Saracatinib或Imatinib联合VibsaninA抑制HL-60细胞增殖的作用来源于诱导AML细胞周期阻滞。通过PI标记HL-60细胞，使用流式细胞仪检测经联合给药处理后的细胞周期，结果显示TKIs与VibsaninA在协同诱导分化的剂量下单独抑制细胞周期的作用并不明显，而联合用药则显著诱导G0/G1期的细胞比例则增加，处于S分裂期的细胞几乎完全消失。周期蛋白Rb调节基因转录的功能，磷酸化是非活性状态，去磷酸化是其活性状态，在细胞周期的G1期，Rb蛋白被CDKs复合物磷酸化后变成p-Rb，从而释放转录因子E2F，促进细胞从G1期进入S期[33,34]；CDK抑制剂p21和p27能结合并抑制CDKs复合物的活性，能够阻止细胞从G1期进入S期[34]。Westernblot结果表明Imatinib或Saracatinib能协同VibsaninA降低HL-60细胞周期蛋白Rb的磷酸化水平，抑制CDK4、CDK6的表达，并增加周期蛋白P21和P27的表达，该结果提示TKIs与VibsaninA通过协同上调AML细胞周期蛋白的表达诱导AML细胞周期阻滞。第22页 第二章天然小分子化合物VibsaninA单独诱导AML细胞分化机制研究实验室前期在“重大新药创制”专项课题资助下，从荚蒾属植物中提取的十一环二萜类化合物VibsaninA具有显著的诱导白血病细胞分化的作用，分子机制研究结果揭示PKC/ERK通路参与VibsaninA诱导的白血病细胞分化，并提示PKC可能是VibsaninA的潜在作用靶点。随后通过同位素标记的体外结合试验以及酶活性检测证实PKC是VibsaninA的体内作用靶点。但是对VibsaninA如何调控PKC/ERK下游信号通路诱导AML细胞分化的作用机制尚不明确，对介导VibsaninA诱导AML细胞分化的关键蛋白也还有待进一步研究。2.1实验材料2.1.1实验细胞HL-60、NB4白血病细胞株见前述。293T细胞（人胚肾细胞）均由本实验室自藏；pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV质粒载体，购自Biovecter公司；DH5α感受肽购自上海生工生物工程技术服务股份有限公司；包膜蛋白质粒pMD2G和包装质粒psPAX2由本实验室保存。2.1.2实验药物天然小分子化合物VibsaninA见前述；放线菌酮（CHX）药物购自Sigma公司；蛋白酶抑制剂MG132购自SigmaAldrich公司；PKC抑制剂GF109203X、MEK抑制剂U0126均购自Selleck公司，均由DMSO溶解，-20℃避光保存。2.1.3实验试剂细胞培养相关试剂和流式细胞技术相关试剂见前述。Westernblot相关抗体：Westernblot一抗c-Myc、p-S62-Myc、p21、p-ERK、ERK、p-MEK、MEK、p-Ra（fSer338）、c-Raf购自CellSignalingTechnology；C/EBPβ购自SantaCruzBiotechnology；二抗兔抗、鼠抗购自中杉金桥生物科技有限公司。PCR与RT-PCR相关试剂：序列引物由上海生工生物技术服务公司合成；Trizol为加拿大BioBasic公司分装产品；TapDNA聚合酶、dNTPsMix、RT-PCR试剂盒、SYBRGreen反应试剂盒均购自康为世纪；琼脂糖购自Biowest。质粒转染相关试剂：1×TEbuffer、T4DNA连接酶、T4ligase、限制性内切酶EcoRI和BamHI购自NEB；凝聚胺（polybrene）购自Sigma公司；琼脂粉、胶蛋白冻（Tryptone）和酵母提取物（YeastExtract）购自OXOID；质粒抽提试剂盒、第23页 DNA胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；LipofectaminTM2000购自美国Invitrogen公司，无水Cacl2购自北京化学试剂厂。2.1.4实验仪器PCR仪购自BioRad，美国；实时荧光定量PCR仪购自BioRad，美国；Milli-Q纯水仪购自Millipore，其余仪器见前述。2.1.5质粒转染相关试剂所需试剂的配制1）LB液体培养基：称量NaCl10g，胶蛋白胨10g，酵母提取物5g，加入三蒸水，搅拌至完全溶解，定容到1000mL，调节pH值至7.2，高压蒸汽灭菌后4℃保存备用。2）LB固体培养基：称量NaCl10g，胶蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂粉15g，搅拌至完全溶解，定容到1000mL，调节pH值至7.2，高压蒸汽灭菌后倒入培养皿凝固，4℃保存备用。3)1%琼脂糖凝胶：称适量琼脂糖倒入小烧杯，倒入1×TBE，使其浓度为1mg/mL，微波炉加热混沸腾后，倒入胶槽内，插入电泳梳，室温冷却30min，待琼脂糖完全凝固后，取出电泳梳，4℃保存备用。4）100mMCaCl2：称量粉末状的无水CaCl21.11g，溶于100mL三蒸水中，0.22μm针头滤器过滤分装，-20℃保存备用。2.2实验方法2.2.1细胞培养细胞培养方法见前述。2.2.2流式细胞学检测方法流式细胞学检测方法见前述。2.2.3Westernblot检测相关蛋白表达水平变化Westernblot实验方法见前述。2.2.4RT-PCR检测转录因子的表达1）Trizol提取细胞总RNA收集细胞，在EP管中加入1mLTrizol裂解，旋涡振荡，室温放置10min，在EP管内再加入200µL氯仿，剧烈振荡混匀，室温放置2min，4℃12000rpm离心15min，小心取上层水相，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置15min，然后第24页 4℃12000rpm离心10min，弃上清，加入1mL75%乙醇洗涤沉淀，再弃上清，室温静置5min使其自然干燥，加入30µL无RNA酶的ddH2O重悬，采用核酸蛋白测定仪检测A260/280比值确定RNA的纯度，测定RNA浓度，2.1>A260/280>1.9，RNA浓度>0.4ug/µL，可进行下一步实验，-80℃冻存。2）RNA逆转录取RNA1.5µg，加入随机引物2µL，并用RNase-freeddH2O补齐10µL反应体系，65℃热变性15min后，置于冰浴中。然后在上述体系中依次加入5×反应缓冲液4µL，RNase酶抑制剂(20U/µL)0.5µL、dNTP混合物（10mM）3µL以及M-MuLV逆转录酶（40U/µL）1µL，总体系为20µL，按25℃10min，42℃1h，72℃15min逆转录得到cDNA。3）实时荧光定量PCR将上述逆转录所得的cDNA产物加入PCR反应体系中进行扩增，扩增条件如下：正向、反向引物（分别加0.6µL），TaqPCRMasterMix10µL，cDNA0.6µL，RNase-freeddH2O8.2µL（总体系20µL），按照SYBRGreen反应试剂盒（康为世纪）说明书设定程序，95℃预变性15min，然后PCR循环（95℃30s，58℃30s，72℃35s）40次，末次循环后72℃延长90s，测定溶解曲线，各引物序列如表1所示。表2.1c-Myc、c/EBPβ、p21的Real-timePCR引物序列引物名称碱基序列（5’-3’）c-MycsenseGGCTCCTGGCAAAAGGTCAc-MycantisenseCTGCGTAGTTGTGCTGATGTc/EBPβsenseAGCGACGAGTACAAGATCCGc/EBPβantisenseAGCTGCTCCACCTTCTTCTGp21senseTGTCCGTCAGAACCCATGCp21antisenseAAAGTCGAAGTTCCATCGCTCβ-actinsenseCTTCACCACCATGGAGGAGGCβ-actinantisenseGGCATGGACTGTGGTCATGAG2.2.5过表达c-Myc的重组慢病毒载体的构建和细胞转染2.2.5.1c-Myc目的基因的获得通过GenBank基因数据库搜索人c-Myc基因全长序列，HomosapiensMYCproto-oncogene，bHLHtranscriptionfactor(MYC)，mRNA。NCBIReferenceSequence:NM_002467.4，其中第526-1860为CDS序列，共1334bp，为保证c-Myc基因CDS序列的准确性，基因由上海生工生物工程技术服务股份有限公司合成。第25页 2.2.5.2c-Myc目的基因的扩增引物的设计与合成：设计c-Myc含有EcoRI和BamHI酶切位点的引物序列：上游引物pCDH-MSCV-Myc-F:5’-CCGGAATTCGAATGCCCCTCAACGTTAGCTTC-3’下游引物：pCDH-MSCV-Myc-R:5’-CGCGGATCCCGCACAAGAGTTCCGTAGCTG-3’。引物序列交由上海生工生物工程技术服务股份有限公司合成。2.2.5.3PCR反应扩增目的基因1）PCR扩增体系：DNA模板2µL10×buffer2µLMgCl22.5µLdNTPsMix（10mM）1µL上游引物（10µM）1µL下游引物（10µM）1µLTapDNA聚合酶（5U/µL）0.5µLddH2O加至25µLTotal25µL2）PCR循环条件将步骤1中的体系配制完毕后，将PCR管放入PCR仪中，扩增条件为：94℃预变性3min后，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min，4℃终止。3）PCR产物胶回收将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外透射仪照射下取出所需DNA片段至1.5mL的EP管中，按照DNA胶回收试剂盒说明书（天根）回收PCR扩增产物。2.2.5.4c-Myc过表达重组慢病毒载体质粒构建1）pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV（CD523A-1)质粒载体信息pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV质粒含有一个CpG缺陷MSCV启动子（CpGdeficientMSCVpromoter，CPPT），这个启动子在造血细胞内高表达，是白血病细胞系搭载目的仅的理想载体，该载体含有氨苄抗性和绿色荧光蛋白GFP标签，可第26页 通过荧光显微镜观察成功转染的细胞，在CPPT启动子后的EcoRI和BamHI酶切位点间可直接插入设计过表达c-MycDNA序列。2）慢病毒载体质粒酶切对载体质粒和目的基因分别酶切：取PCDH载体质粒与目的基因c-Myc分别以限制性内切酶ECORI置37℃水浴体系酶切2h，体系如下：PCDH或DNA34µL、ECORI2µL、buffer44µL共40µL。酶切完毕后，胶回收，取回收产物34µL，加入BamHI2µL、buffer44µL共40µL继续37℃水浴2h，胶回收。3）PCDH慢病毒载体与目的基因的连接0.25mLPCR管中按如下表格依次加入反应物，室温反应过夜。载体质粒DNA片段1.5µL目的基因DNA片段7µLT4连接酶0.5µLT4buffer1µLTotal10µL4）制备感受态a）取100µL大肠杆菌DH5α加入到3mLLB培养基中，37℃，150rpm，过夜摇菌；b）取100µL过夜培养的DH5α加入到2mLLB培养基中，37℃，250rpm，摇菌2h；c）吸取1.5mL菌液至1.5mL的EP管中，冰上预冷10min；d）4℃，3000rpm离心5min；第27页 e）弃上清，加入100µL预冷的100mMCaCl2溶液，打匀，可立即用于转化或-20℃长期冻存。5）重组慢病毒载体质粒PCDH转化大肠杆菌DH5α感受态a）从-80℃冰箱取出200µL感受态置于冰上融化；b）将2ng连接产物加入感受态细胞，轻柔混匀，冰上放置40min；c）立即放入42℃水浴锅内2min后，热冲击后迅速置冰上冷却2min；d）向离心管内加入不含氨苄的LB液体培养基900µL，37℃250rpm震荡60min；e）5000rpm离心2min，弃900µL，余100µL；f）；用L型涂布棒将上述100µL菌液均匀接种于含氨苄抗性的LB固体培养基上，放入细菌培养箱，37℃培养16h，随机挑选1-2个阳性克隆接种于5mL含氨苄的LB液体培养基中，次日按照质粒提取试剂盒说明书抽提质粒。6）质粒抽提质粒抽提按照质粒抽提试剂盒说明书提取，步骤如下：a）取过夜培养的菌液2mL，12000rpm离心1min后弃上清；b）加入150µLsolutionI/Rnase，用吸头打匀，旋涡震荡；c）加入200µLsolutionII颠倒混匀，彻底裂解细菌；d）加入350µLsolutionIII，颠倒混匀至出现白色絮状物；e）室温静置1min，12000rpm离心5min，将离心后的上清吸入吸附柱内，13000rpm离心30s，弃废液；f）于质粒吸附柱内加入500µLWashingBuffer，13000rpm离心30s，弃废液；g）重复步骤6一次。h）将吸附柱放回套管，13000rpm室温离心2min；i）将吸附柱置于新的收集管内，室温静置2min使乙醇完全挥发，加入50µL灭菌水，放置1min；13000rpm室温离心2min，收集DNA溶液，分装备用。7）双酶切鉴定及测序将上述提取质粒1µg进行双酶切，体系如下：抽提质粒3µLEcoRI1µLBamHI1µLbuffer41µLddH2O4µLTotal10µL37℃水浴2h，酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，将提取的质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，鉴定插入序列与GenBank序列是否一致。第28页 2.2.5.5重组慢病毒载体质粒的包装1）取对数生长的293T细胞消化后计数，以6×105/mL浓度接种于六孔板，37℃、5%CO2条件孵育24h，待细胞达到70%融合后准备转染，待转染前2h更换为无血清培养基；2）表达质粒6µg、包膜蛋白质粒pMD2G1.5µg和包装质粒psPAX24.5µg于EP管内混合均匀；3）将2步所得混合物加入无血清DMEM（总体积500µL），充分混匀，室温下放置5min；4）取LipofectamineTM200020µL与无血清DMEM混匀（总体积500µL），室温静置5min；5）将TM2000混合物与质粒包装混合物轻轻混匀，室温放置20min；6）吸去六孔板中的培养基，加入上述步骤得到的1mL脂质体-DNA混合物，37℃、5%CO2条件培养过夜；7）过夜后更换DMEM完全培养基持续培养48h，收集上清，1000rpm离心1min，沉淀细胞碎片，经0.45µM滤器过滤，将所得病毒液分装，冻存于-80℃冰箱。2.2.6统计学分析所有实验数据均重复三次，定量的结果采用统计学分析软件SPSSStatistics19.0进行studentt检验（双侧）分析，P<0.05表示有统计学差异，用均数±标准差表示，实验数据用Originlab9.0作图。2.3实验结果2.3.1VibsaninA在转录水平降低c-Myc的表达前期实验基础表明：VibsaninA是一个新型PKC激动剂，其诱导AML细胞分化的作用靶点是PKC，PKC/ERK通路参与VibsaninA诱导的白血病细胞分化，但其下信号通路作用方式尚不明确。通过对下游转录因子进行研究，其结果表明：经过VibsaninA加药处理24h后，HL-60细胞表现为剂量依赖性的降低c-Myc蛋白含量，同时增加核转录因子C/EBPβ和p21的表达（图2.1A），其中，VibsaninA处理HL-60细胞3h后即可检测到c-Myc蛋白表达明显降低（图2.1B），如2.1C可见VibsaninA处理3h后，HL-60细胞的c-MycmRNA水平就同样显著降低，因此VibsaninA这种下调c-Myc蛋白的作用可能发生在转录水平或者基因转录后，第29页 以上结果表明c-Myc蛋白应当是VibsaninA诱导AML细胞分化的关键蛋白，VibsaninA从转录水平调节c-Myc，继而诱导AML细胞分化。ABC图2.1VibsaninA降低c-Myc的表达VibsaninA(VibA)不同浓度加药处理HL-60细胞24h后，裂解细胞收集蛋白并通过Western第30页 blot检测蛋白含量(A)；VibsaninA10μM孵育0、1、3、6和12h后，通过Westernblot检测c-Myc的蛋白水平(B)，real-timePCR检测mRNA水平(C)，图中数据采用均值±标准差表示，n=3。2.3.2VibsaninA通过蛋白酶体途径降解c-Myc有研究表明c-Myc蛋白的半衰期只有20到30分钟，并且通过泛素依赖的蛋白酶体途径降解。放线菌酮(CHX)可以在真核生物中有效的抑制细胞质蛋白质的合成过程，实验结果表明，VibsaninA能明显促进经CHX处理HL-60细胞的c-Myc蛋白降解，并缩短其半衰期（图2.2A）。在进一步实验中，我们用蛋白酶抑制剂MG132抑制了c-Myc蛋白的降解，发现MG132同样抑制了VibsaninA诱导AML细胞分化的活性（图2.2B、C）。以上结果表明蛋白酶体途径参与了VibsaninA降解c-Myc蛋白的过程。A第31页 BC图2.2VibsaninA通过蛋白酶体途径降解c-Myc100μMCHX和10μMVibsaninA(VibA)孵育HL-60细胞1h不同时间点c-Myc蛋白的含量变化（A）。10μMVibsaninA和10μMMG132孵育HL-60细胞3、6h检测c-Myc蛋白的含量变化（B），24h检测CD11b的表达（C）。图中数据采用均值±标准差表示，n=3。MG132处理组与VibsaninA处理组相比，*P<0.05，Studentt检验分析数据显著性差异。2.3.3构建过表达c-Myc的慢病毒载体为确证c-Myc蛋白在细胞分化过程中的作用，我们构建了的过表达c-Myc基因的病毒载体，将构建的pCDH-GFP-MSCV-c-Myc重组载体质粒双酶切，将其产物进行琼脂糖凝胶电泳，酶切结果表明可切下两个片段，而且质粒所在的片段大小与c-Myc目的基因长度一致（图2.3），重组质粒经过DNA测序，测序结果显示插入序列与GenBank数据库序列完全一致，说明pCDH-GFP-MSCV-c-Myc重组载体质粒构建成功（图2.4）。第32页 图2.3重组表达c-Myc慢病毒载体的双酶切鉴定M:DNA10000marker；1、2、3、4：重组表达c-Myc慢病毒载体图2.4c-Myc基因测序峰图（部分）经测序无误后，将pCDH--GFP-MSCV-Vector和pCDH--GFP-MSCV-c-Myc慢病毒载体质粒转染293T细胞进行病毒包装，转染48h后，通过荧光显微镜（400×）可观察到荧光蛋白表达高峰（图2.5），荧光显示部分代表质粒转染成功，pCDH组和pCDH-c-Myc组的转染效率无明显差异，此后裂解293T细胞，收集并浓缩病毒，用于下一步靶细胞转染实验。图2.5荧光显微镜下观察过表达慢病毒载体第33页 2.3.4过表达c-Myc拮抗VibsaninA诱导HL-60细胞分化在成功构建了过表达c-Myc慢病毒载体的基础上，我们将该慢病毒转染HL-60细胞，使包含c-Myc基因的cDNA在HL-60细胞内异位表达，同时不影响细胞本身c-Myc蛋白的含量。通过过表达c-Myc的反向验证，如图2.6A、2.6B所示，过表达c-Myc基因的HL-60细胞经过VibsaninA处理后，c-Myc的下调受到明显抑制，核转录因子C/EBPβ和p21的表达升高也受到阻碍。此外，过表达c-Myc基因可完全逆转VibsaninA介导的HL-60细胞CD11b表达和G0/G1期阻滞（图2.6C、2.6D）AB第34页 CD图2.6c-Myc过表达对VibsaninA诱导HL-60细胞分化的影响Myc-cDNA转染的HL-60细胞经10μMVibsaninA孵育24h，检测其c-Myc、C/EBPβ、和p21的mRNA水平（A），Westernblot检测c-Myc、C/EBPβ、和p21蛋白含量（B），或VibsaninA孵育48h检测CD11b的表达（C），孵育24h检测细胞周期（D）。图中数据采用均值±标准差表示，n=3。第35页 2.3.5过表达c-Myc拮抗vibsaninA诱导NB4细胞分化为进一步确定c-Myc是否在调控其它AML细胞分化中也同样发挥作用，本课题组选择了内源性c-Myc含量最低的NB4细胞系进行研究（图2.7A）。如同实验预期，过表达c-Myc的NB4细胞内c-Myc蛋白含量增加，并且明显抑制了VibsaninA下调c-Myc，同时对C/EBPβ和p21表达升高也有一定的抑制作用（图2.7B），此外，过表达c-Myc基因也能抑制VibsaninA介导的NB4细胞CD11b表达（图2.7C）。ABC图2.7c-Myc过表达对VibsaninA诱导NB4细胞分化的影响Westernblot检测U937、NB4、HL-60细胞c-Myc蛋白的含量（A），过表达NB4细胞经10μMVibsaninA孵育24h，检测其c-Myc、C/EBPβ、和p21蛋白含量（B），或VibsaninA孵育24h检测CD11b的表达（C）。图中数据采用均值±标准差表示，n=3。Myc组与Empty对照组相比，*P<0.05，Studentt检验分析数据显著性差异。2.3.6VibsaninA通过PKC-ERK-cMyc信号轴介导AML细胞分化为进一步探索VibsaninA诱导降低c-Myc的表达的是否受PKC/ERK信号通路调控，小分子抑制剂实验结果表明：PKC抑制剂GFX（4μM）可以完全抑制VibsaninA增加的Raf-1、MEK以及ERK磷酸化的效应继而抑制C/EBPβ和p21的表达(图2.8A)，更为重要的是，GFX还能抑制VibsaninA介导的c-Myc下调，ERK1/2抑制剂U0126（10μM）则通过抑制ERK的磷酸化从而抑制VibsaninA对相关核转录第36页 因子的调控作用，以上结果表明VibsaninA下调c-Myc蛋白的作用是PKC通路激活ERK/MAPK信号通路的下游效应。此外c-MycSer62位点的磷酸化与维持蛋白的稳定密切相关，VibsaninA下调c-Myc作用方式可能是通过对c-Myc蛋白的Ser62位点去磷酸化发挥作用（图2.8B）。AB图2.8PKC或ERK抑制剂逆转VibsaninA诱导HL-60细胞分化4μMPKC抑制剂GFX、10μMERK1/2抑制剂U0126预处理1h后，VibsaninA处理6h或24h，裂解细胞收集蛋白，Westernblot检测蛋白含量。第37页 2.4讨论前期研究发现新型PKC激动剂VibsaninA能够协同多种酪氨酸激酶抑制剂增强诱导AML分化，因此首先研究VibsaninA诱导AML细胞分化的作用方式，将助于进一步明确TKIs联合VibsaninA诱导AML细胞分化中的分子机制。c-Myc是一个重要的致癌因子，被报道在大约半数的人类肿瘤细胞内表现为过度活化，并且与固体肿瘤和白血病的发病进展密切相关[35,36],c-Myc致瘤特性中与AML最密切相关的是它能抑制肿瘤的分化和成熟[37]，许多细胞的终末分化都与c-Myc的抑制作用密切相关[38,39],核转录因子C/EBPβ和p21对细胞分化至关重要，原癌基因c-Myc可抑制C/EBPβ和p21的表达，从而抑制造血细胞分化[40]。Westernblot实验结果表明VibsaninA能剂量依赖性的增加核转录因子C/EBPβ和p21的表达，并下调c-Myc的表达。其中，VibsaninA处理HL-60细胞3h后即可检测到c-Myc蛋白表达明显降低。荧光定量PCR结果提示VibsaninA这种下调c-Myc蛋白的作用可能发生在转录水平或者基因转录后。有文献报道c-Myc蛋白的半衰期只有20到30分钟，并且通过泛素依赖的蛋白酶体途径降解[41]，因此，我们以蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)与VibsaninA同时作用于HL-60细胞，Westernblot结果表明：CHX和VibsaninA联合用药后，c-Myc的半衰期明显缩短，相反，使用蛋白酶抑制剂MG132抑制蛋白酶体的合成，同样能有效的抑制VibsaninA诱导AML细胞分化的活性，这说明VibsaninA能在转录水平和蛋白水平同时下调c-Myc蛋白的表达。为进一步研究c-Myc蛋白在细胞分化过程中的作用，我们构建了的过表达c-Myc基因的病毒载体，使包含c-Myc基因的cDNA在HL-60和NB4细胞内异位表达，同时不影响细胞本身c-Myc蛋白的含量，通过过表达c-Myc的反向验证，我们最终在mRNA水平和蛋白水平确证了过表达c-Myc能够拮抗VibsaninA诱导AML细胞分化的活性，该实验确证了抑制c-Myc与VibsaninA诱导AML细胞分化的作用密切相关。随后的研究结果表明：广谱PKC抑制剂GFX可通过抑制PKC进而完全抑制VibsaninA激活Raf/MEK/ERK信号轴，诱导增加C/EBPβ、p21蛋白表达以及下调c-Myc的作用，这些结果说明VibsaninA通过激活PKC/ERK通路，继而下调c-Myc这一关键分子，增强C/EBPβ和p21蛋白表达从而诱导AML细胞分化，c-MycSer62位点的磷酸化与维持蛋白的稳定密切相关[42]，Westernblot结果表明VibsaninA能抑制c-MycSer62位点的磷酸化，因此VibsaninA下调c-Myc也可能是通过对c-Myc蛋白的Ser62位点去磷酸化发挥作用（图2.8B）。有文章表明通过激活ERK/MAPK能够诱导各谱系正常造血细胞向成熟细胞分化，同时也出现了抑第38页 制c-Myc蛋白表达的现象[43,44]，这与我们在AML细胞株上的实验结果也保持一致。第39页 第三章天然小分子化合物VibsaninA协同酪氨酸激酶抑制诱导AML细胞分化的信号转导通路研究现已表明VibsaninA通过PKC-ERK-cMyc信号轴介导AML细胞分化，但是酪氨酸激酶抑制剂单独以及协同VibsaninA增强诱导分化的作用机制尚不明确，此前通过梯度浓度Imatinib与Saracatinib联合VibsaninA的协同分化量效曲线结果提示：VibsaninA介导的PKC信号途径在协同分化中并非发挥主要作用，而协同诱导分化的最终效果取决于酪氨酸激酶抑制自身的诱导分化活性。究竟VibsaninA介导的PKC/ERK信号途径以及酪氨酸激酶抑制剂自身调控的诱导分化途径以何种方式协同增强诱导分化效应目前尚不清楚，故本部分内容对联合诱导分化信号途径进行进一步研究。3.1实验材料3.1.1实验细胞HL-60、NB4白血病细胞株见前述。3.1.2实验药物天然小分子化合物VibsaninA、，伊马替尼（Imatinib）、塞卡替尼（Saracatinib）见前述；Raf抑制剂索拉菲尼（Sorafenib）、PKC抑制剂GF109203X、GÖ6983以及MEK抑制剂U0126均购自Selleck公司3.1.3实验试剂细胞培养相关试剂和流式细胞技术相关试剂见前述。Westernblot相关抗体：Westernblot一抗P21、p-ERK、ERK、p-MEK、MEK、p-Raf（Ser338）、p-Raf（Ser289/296/301）、c-Raf、p-Src(Tyr416)购自CellSignalingTechnology；ProteinA/G琼脂糖珠、Lyn、C/EBPβ购自SantaCruzBiotechnology；p-Raf（Ser259）购自Abcam；二抗兔抗、鼠抗购自中杉金桥生物科技有限公司。PCR与RT-PCR相关试剂见前述3.2实验方法3.2.1细胞培养细胞培养方法见前述。第40页 3.2.2流式细胞学检测方法流式细胞学检测方法见前述。3.2.3Westernblot检测相关蛋白表达水平变化3.2.3.1Westernblot实验方法见前述。3.2.3.2蛋白质免疫沉淀方法如下：1）收集细胞，1000rpm离心5min，PBS重悬洗涤1次。2）弃上清，将细胞重悬于含有50mMβ-glycerophosphate，10mMNaF，1mg/mLpepstatinA和aprotinin的NETN（20mMTris-HCl，pH8.0，100mMNaCl，1mMEDTA，0.5%NonidetP-40）裂解液中，置于冰上裂解20min。3）冰上孵育同时对裂解液进行超声，1s/次，间隔2s，超声60s，超声完毕后4℃12000rpm离心10min。4）将裂解液加入新的EP管，加入20ulproteinA/G琼脂糖珠，4℃旋转孵育2h，3000rpm离心5min，以去除非特异性杂蛋白，降低背景。4℃，12000rpm离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除ProteinA珠子。5）加入抗体2ug和20µLproteinA/GSepharosebeads，4℃旋转孵育过夜。6）免疫亲和后的混合液4℃，3000rpm离心5min，弃上清，并用NETN洗涤4次，弃裂解液，将免疫沉淀产物加入80µL1×SDS上样缓冲液，煮沸15min，12000rpm离心1min。7）样品进行后续SDS-PAGE凝胶电泳实验。3.2.4RT-PCR检测转录因子的表达RT-PCR步骤见前述，LynmRNA引物序列如下。表3.1Lyn的Real-timePCR引物序列引物名称碱基序列（5’-3’）c-MycsenseGGCTCCTGGCAAAAGGTCAc-MycantisenseCTGCGTAGTTGTGCTGATGTLynsenseATTCACCGGGACCTGCGAGCLynantisenseCAGGGCGGTCATCACGTCGGβ-actinsenseCTTCACCACCATGGAGGAGGCβ-actinantisenseGGCATGGACTGTGGTCATGAG3.2.5LynshRNA慢病毒的制备和细胞转染1）表达LynshRNA的重组慢病毒的构建第41页 LynshRNA的靶向序列为“5’-cgagcggaagaactacatt-3’”，慢病毒由吉凯基因生物科技有限公司制备，经病毒浓缩并检测滴度后，测序无误，详细步骤参照吉凯基因RNAi慢病毒载体构建和包装手册。2）表达LynshRNA的重组慢病毒转染AML细胞取对数生长期的HL-60细胞和NB4细胞，经携带LynshRNA的慢病毒和携带GFP的阴性对照病毒转染48h后，使用嘌呤霉素5µM/mL筛选稳定表达LynshRNA的细胞株7天后转入含嘌呤霉素1µM/mL培养基继续维持培养。3.2.6统计学分析所有实验数据均重复三次，定量的结果采用统计学分析软件SPSSStatistics19.0进行studentt检验（双侧）分析和单因素方差分析（one-wayANOVA）（用于协同用药组同时与两个单独用药组比,P<0.05表示有统计学差异，用均数±标准差表示，实验数据用Originlab9.0作图。3.3实验结果3.3.1PKC的激活参与VibsaninA协同TKIs诱导HL-60细胞分化由于VibsaninA是PKC的特异性激动剂，我们推测PKC介导的信号通路可能参与协同诱导分化。为研究PKC在联合诱导分化中的作用，我们使用经典的PKC激动剂PMA[45,46]与VibsaninA进行横向对比研究。流式细胞学检测结果表明（图3.1）：在0.2nM的剂量下，PMA同样具有协同酪氨酸激酶抑制剂增强诱导HL-60细胞CD11b表达的作用，协同各酪氨酸激酶抑制剂增强诱导CD11b表达的强弱也与VibsaninA保持一致，同时拮抗VibsaninA诱导分化作用的Nilotinib也同样拮抗PMA的诱导HL-60细胞分化效应，该结果正向验证了PKC的激活可能是VibsaninA协同酪氨酸激酶抑制剂增强AML细胞分化的关键机制。第42页 图3.1PMA协同TKIS增强诱导HL-60细胞分化Saracatinib(SAR)(10µM)、Imatinb(IMA)(10µM)、Gefitinib(GEFI)（10µM）、Erlotinib(ERLO)（10µM）、Bosutinib(BOSU)（2.5µM）、Dasatinib(DASA)（5µM）和Nilotinib(NILO)（10µM）联合PMA(0.2nM)诱导HL-60细胞分化3d后经流式细胞仪检测CD11b的表达。图中数据采用均值±标准差表示，n=3，##P<0.01,###P<0.001表示协同用药组与两个单独用药组相比同时具有统计学差异（one-wayANOVA），&&P<0.01与PMA组相比（Studentt检验）。为研究PKC的激活在联合诱导分化中的作用，我们使用分子特异性抑制剂进行信号通路研究。流式细胞学结果表明非特异性广谱PKC抑制剂GFX或GO6983均能够不同程度的抑制Imatinib或Saracatinib协同VibsaninA诱导的HL-60细胞CD11b表达，其中GFX或GO6983分别将Imatinib联合VibsaninA诱导HL-60细胞CD11b的表达率（83.0%）抑制到53.8%和57.8%，抑制百分比为35.1%和30.3%（图3.2），而GFX或GO6983分别将Saracatinib联合VibsaninA诱导HL-60细胞CD11b的表达率（92.1%）抑制到24.9%和27.1%，抑制百分比为72.9%和70.5%。瑞氏吉姆萨染色结果表明：Imatinib与或Saracatinib联合VibsaninA处理HL-60细胞3天后，细胞贴壁，细胞核浆比例缩小，呈典型单核细胞分化形态，PKC抑制剂GFX或GO6983预处理，仅能够部分减少Imatinib协同VibsaninA诱导HL-60细胞单核细胞分化形态的细胞数量，但是几乎完全逆转了Saracatinib协同VibsaninA诱导HL-60细胞核浆比例缩小的单核细胞形态变化。该研究结果表明VibsaninA通过激活PKC参与协同酪氨酸激酶抑制剂诱导AML细胞分化，但是PKC途径在Saracatinib协同VibsaninA诱导AML细胞分化的机制中占主要地位，而Imatinib协同VibsaninA对PKC的调节作用相对较弱，与此同时，PKC抑制剂仅能部分抑制分化的结果也提示存在未知的非PKC途径参与协同诱导AML细胞分化。第43页 AB图3.2VibsaninA协同TKIs通过PKC途径诱导HL-60细胞分化4μMPKC抑制剂GFX、4μMPKC抑制剂GO6983预处理1h后，HL-60细胞经Imatinib(IMA)10µM或Saracatinib(SAR)10µM联合VibsaninA(VibA)0.1µM孵育72h，流式细胞学检测表面标记CD11b的表达（A），经瑞氏吉姆萨染色后进行细胞形态学观察（400×，标尺为20µm）。图中数据采用均值±标准差表示，n=3，***P<0.001与Imatinib或Saracatinib联合VibsaninA组相比，Studentt检验分析数据显著性差异。为进一步研究对非PKC途径是否受酪氨酸激酶抑制剂Imatinib或Saracatinib所调控，我们将其Imatinib或Saracatinib剂量分别提升至20µM之后单独诱导HL-60细胞分化，结果表明：Imatinib和Saracatinib20µM单独诱导HL-60细胞3d后的第44页 CD11b细胞阳性率均能达到分别为83.5±4.77%和67.6±4.20%（图3.3），同样使用PKC抑制剂干预后，发现PKC抑制剂GFX对单药的抑制作用与对其协同VibsaninA诱导分化的抑制作用类似，能将高剂量Imatinib诱导HL-60细胞CD11b表达率抑制到55%（抑制比为34.1%），将Saracatinib单独诱导HL-60细胞CD11b表达率抑制到23.7%（抑制比为64.9%）。该结果提示：对非PKC途径的调控正是来源于受酪氨酸激酶抑制剂Imatinib或Saracatinib自身，Imatinib或Saracatinib同时调控PKC途径和非PKC途径诱导AML细胞分化，PKC途径在Saracatinib诱导AML细胞分化的机制中占主要地位，而Imatinib自身激活PKC途径的活性较弱，以调控非PKC途径为主，Imatinib和Saracatinib自身的诱导分化活性决定了其协同VibsaninA诱导AML细胞分化的活性，而VibsaninA作为“催化剂”的存在，放大了酪氨酸激酶自身的诱导AML细胞分化的活性。所以，对受酪氨酸激酶自身调控的这一部分非PKC途径进行进一步研究，可能是解开其协同VibsaninA诱导AML细胞分化机制的关键。图3.3TKIs通过激活PKC诱导HL-60细胞分化4μMPKC抑制剂GFX预处理1h，HL-60细胞经Imatinib（IMA）或Saracatinib(SAR)20µM孵育72h后经流式细胞仪检测细胞CD11b的表达。图中数据采用均值±标准差表示，n=3，**P<0.01与“IMA”或“SAR”组相比，Studentt检验分析数据显著性差异。3.3.2VibsaninA协同TKIs上调Lyn蛋白的表达Lyn是Src家族激酶（Srcfamilykinase，SFK）中的重要一员，在AML原始细胞中表达升高，其升高程度也与患者预后也密切相关。经典的PKC激动剂PMA第45页 在诱导HL-60髓系分化的时候，也能观察到Lyn的激活，这说明PKC存在对Lyn的调控作用。此外，有文献表明新型SRC抑制剂Dasatinib在诱导AML细胞分化的同时也对Lyn有调控作用，并推测Dasatinib诱导AML细胞分化的“非靶”效应可能与Lyn有关[47]，因此，以上结果提示Lyn可能是酪氨酸激酶抑制剂和PKC激动剂VibsaninA发共同作用的关键分子。Y416磷酸化位点是存在于所有Src家族蛋白的保守的磷酸化位点。Westernblot实验结果表明VibsaninA0.1μM随着时间延长，能时间依赖的增强SrcY416位点的磷酸化，并诱导增加Lyn总蛋白的表达（图3.4A）；Imatinib或Saracatinib表现为剂量梯度的抑制SrcY416位点的磷酸化，Saracatinib是明确的SRC抑制剂，5µM剂量即可完全抑制SrcY416位点的磷酸化，而Imatinib抑制SrcY416位点磷酸化的作用相对较弱，不过Imatinib或Saracatinib均剂量依赖的诱导Lyn总蛋白的增加（图3.4B）。从以上结果来看VibsaninA和酪氨酸激酶抑制剂在诱导分化浓度内虽然对SrcY416磷酸化位点调控方式不同，但是都能诱导增强Lyn的表达。AB第46页 CD图3.4VibsaninA和TKIs对HL-60细胞Lyn的调控作用VibsaninA(VibA)0.1µM诱导HL-60细胞12、24、48h（图A为代表性的Westernblot图片，图B为蛋白相对表达定量统计图），Imatinib（IMA）或Saracatinib(SAR)5、10、20µM诱导HL-60细胞24h（图C为代表性的Westernblot图片，图D为蛋白相对表达定量统计图），裂解细胞总蛋白，Westernblot检测蛋白水平的变化，**P<0.001，***P<0.001与Imatinib或Saracatinib联合VibsaninA组相比，Studentt检验分析数据显著性差异。。进一步研究Imatinib或Saracatinib与VibsaninA联合作用的Westernblot实验结果表明（图3.5A、B），VibsaninA能诱导增强HL-60细胞SrcY416位点的磷酸化水平，Imatinib能削弱VibsaninA增强SrcY416磷酸化的作用，而Saracatinib则几乎完全拮抗，但是Imatinib和Saracatinib均协同VibsaninA增强Lyn总蛋白的表达，该实验结果在NB4细胞上也同样得到验证（图3.5C、D）。有文献表明该结果提示研究表示抑制Lyn磷酸化的激活，可能是酪氨酸激酶抑制剂发挥协同诱导分化作用的主要机制[48]，因此我们将通过免疫沉淀实验进一步观察Lyn磷酸化与其总蛋白的增加有无必然联系。第47页 ABC第48页 D图3.5VibsaninA协同TKIs对AML细胞Lyn的调控作用Imatinib（IMA）或Saracatinib(SAR)10µM单独，或协同VibsaninA(VibA)0.1µM诱导HL-60细胞（图A为代表性的Westernblot图片，图B为蛋白相对表达定量统计图）或NB4细胞24h（图C为代表性的Westernblot图片，图D为蛋白相对表达定量统计图），裂解细胞总蛋白，Westernblot检测蛋白水平的变化，图中数据采用均值±标准差表示，n=3，##P<0.01，###P<0.001表示协同用药组与两个单独用药组相比同时具有统计学差异（one-wayANOVA）。Src的Y416磷酸化位点相当于Lyn的Y397位点，为进一步研究vibsaninA和酪氨酸激酶抑制剂对Lyn蛋白的磷酸化水平的影响，随后的Lyn免疫沉淀结果表明，Imatinib和Saracatinib单独均抑制SrcY416（LynY397）磷酸化，当联合vibsaninA时，Saracatinib持续完全抑制VibsaninA增强Lyn磷酸化的作用，而Imatinib则无法完全拮抗（图3.5A、B）。以上结果提示酪氨酸激酶抑制剂协同vibsaninA增加Lyn蛋白的作用机制与Lyn的Y397位点磷酸化状态无关。A第49页 B图3.6VibsaninA协同TKIs对Lyn的磷酸化水平的调节作用Imatinib（IMA）或Saracatinib(SAR)10µM单独，或协同VibsaninA(VibA)0.1µM诱导HL-60细胞24h，裂解细胞，经免疫沉淀Lyn，Westernblot检测Lyn磷酸化水平的变化（图A为代表性的Westernblot图片，图B为蛋白相对表达定量统计图）。Imatinib或Saracatinib协同vibsaninA处理HL-60细胞12、24、48h，LynmRNA水平上下波动，并无明显升高，该效应与协同上调AML细胞Lyn蛋白表达的作用截然不同，说明Imatinib或Saracatinib联合vibsaninA可能在蛋白的修饰水平协同上调Lyn总蛋白的表达，Lyn蛋白的增加并不依赖于其转录水平的升高，Imatinib或Saracatinib联合vibsaninA在对LynmRNA的调控作用上并无协同作用，是通过翻译后修饰水平诱导Lyn总蛋白的增加。AB图3.7VibsaninA协同TKIs对HL-60细胞LynmRNA水平的调节作用Imatinib（IMA）或Saracatinib(SAR)10µM单独，或协同VibsaninA(VibA)0.1µM诱导HL-60细胞12、24、48h（A、B），RT-PCR检测Lyn的mRNA水平，图中数据采用均值±标准差表示，n=3。第50页 3.3.3沉默Lyn对VibsaninA协同TKIs诱导AML细胞分化的影响为进一步验证Imatinib或Saracatinib协同vibsaninA增加Lyn蛋白表达的效应是否与协同诱导AML细胞分化作用相关，我们构建了稳定表达LynshRNA的AML细胞株，HL-60和NB4细胞经携带LynshRNA的慢病毒转染48h后，加入嘌呤霉素筛选稳定表达LynshRNA的细胞株，并在蛋白水平和RNA水平上验证了LynshRNA在HL-60（图3.8A）和NB4（图3.8B）细胞上的干扰效率。AB图3.8LynshRNA慢病毒转染的干扰效率验证HL-60（A）和NB4（B）细胞经携带LynshRNA的慢病毒（shLyn）和携带GFP的阴性对照病毒（shCtl）转染48h后，经嘌呤霉素5µM/ml筛选稳定表达LynshRNA的细胞株后转入含嘌呤霉素1µM/ml培养基继续维持培养，分别采用蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR法检测稳定感染重组慢病毒的HL-60和NB4细胞中LynmRNA及蛋白的表达水平LynshRNA慢病毒转染后，HL-60细胞Lyn蛋白的基础表达水平降低，而且持续拮抗Imatinib或Saracatinib联合vibsaninA协同上调Lyn的作用（图3.9A），该实验结果同样在LynshRNA慢病毒转染的NB4细胞上得到验证（图3.9B）。第51页 AB图3.9靶向沉默Lyn拮抗VibsaninA协同TKIs上调Lyn的作用Imatinib（IMA）或Saracatinib(SAR)10µM协同VibsaninA(VibA)0.1µM诱导经携带LynshRNA的慢病毒（shLyn）和携带GFP的对照慢病毒（shCtl）转染的HL-60（A）和NB4（B）细胞24h后，裂解细胞总蛋白，Westernblot检测蛋白水平的变化。Imatinib或Saracatinib联合VibsaninA分别处理经LynshRNA慢病毒转染的HL-60细胞和空白病毒转染的对照细胞3天后，通过瑞氏吉姆萨染色法观察细胞形态，结果可见对照组HL-60细胞大量贴壁，细胞膜出现不规则变化，核浆比例缩小，呈典型单核细胞分化形态，而LynshRNA转染的HL-60细胞3天后贴壁细胞明显减少，细胞较小，核浆比缩小程度也明显减轻（图3.10A）。该实验结果同样在LynshRNA慢病毒转染的NB4细胞上得到验证（图3.10B）。第52页 AB图3.10靶向沉默Lyn对AML细胞诱导分化形态的影响Imatinib（IMA）或Saracatinib(SAR)10µM协同VibsaninA(VibA)0.1µM诱导经携带LynshRNA的慢病毒（shLyn）和携带GFP的对照慢病毒（shCtl）转染的HL-60（A）和NB4（B）细胞72h后，经瑞氏吉姆萨染色后进行细胞形态学观察（400×，标尺为20µm）。前期实验已经表明PKC途径在vibsaninA协同TKIs诱导AML细胞分化中至关重要，但是同时存在非PKC依赖的途径参与诱导AML细胞分化，且该非PKC途径受TKIs调控，为明确Lyn是否和PKC共同参与诱导AML细胞分化，我们一方面通过PKC抑制剂GFX完全阻断PKC，另一方面通过LynshRNA慢病毒转染将Lyn沉默，观察其是否能完全逆转AML分化。Imatinib或Saracatinib联合vibsaninA诱导对照病毒转染的HL-60细胞3天后，细胞表面标记CD11b的表达率分别为84.2±3.7%和94.7±0.9%，通过PKC抑制剂GFX可将其CD11b的表达率分别抑第53页 制55.9±2.1%和20.2±0.9%。同样的药物联合方案诱导LynshRNA慢病毒转染的HL-60细胞，其表面标记CD11b的表达率分别降低至43.6±3.2%和54.8±2.3%，PKC抑制剂GFX可进一步将其CD11b的表达率抑制到20.6±2.1%和8.21±0.7%（图3.11）。该结果表明沉默Lyn能逆转HL-60细胞分化，同时阻断PKC途径，两者的抑制作用正向叠加，并几乎完全抑制HL-60细胞分化。AB图3.11VibsaninA协同TKIs通过PKC和Lyn诱导HL-60细胞分化4μMPKC抑制剂GFX预处理1h后，携带LynshRNA的慢病毒（shLyn）和携带GFP的对照慢病毒（shCtl）转染的HL-60细胞经Imatinib(IMA)10µM或Saracatinib(SAR)10µM联合VibsaninA(VibA)0.1µM孵育72h，流式细胞学检测表面标记CD11b的表达（A为柱状图，B为相应的峰值图），图中数据采用均值±标准差表示，n=3，***P<0.001代表与“shLyn”组与“shCtl”组相比，###P<0.001代表各细胞株组内GFX抑制剂组与对照组相比，Studentt检验分析数据显著性差异。第54页 为进一步验证Lyn在AML细胞诱导分化中的作用，我们通过LynshRNA慢病毒转染的NB4细胞进行验证。Imatinib或Saracatinib联合vibsaninA诱导对照病毒转染的NB4细胞3天，细胞表面标记CD11b的表达率分别为58.9±3.6%和81.5±0.8%，PKC抑制剂GFX可将对照组NB4的CD11b表达率分别抑制46±2.9%和49.4±5.2%。同样的药物联合方案诱导LynshRNA慢病毒转染的NB4细胞，其表面标记CD11b的表达率分别降至37.4±3.2%和60.4±2.9%，PKC抑制剂GFX进一步将其CD11b的表达率抑制到17.6±2.6%和17±1.2%（图3.12）。该结果与HL-60细胞的实验结果保持一致，说明Lyn是vibsaninA协同TKIs诱导AML细胞分化的关键分子，Lyn的上调与AML细胞分化存在必然联系，Lyn的上调一方面受PKC调控，另一方面同时受TKIs激活的非PKC途径调控，同时抑制PKC的活性和Lyn的上调则完全拮抗该协同诱导AML细胞分化的效应。AB图3.12VibsaninA协同TKIs通过PKC和Lyn诱导NB4细胞分化4μMPKC抑制剂GFX预处理1h后，携带LynshRNA的慢病毒（shLyn）和携带GFP的对照第55页 慢病毒（shCtl）转染的NB4细胞（A）细胞经Imatinib(IMA)10µM或Saracatinib(SAR)10µM联合VibsaninA(VibA)0.5µM孵育72h，流式细胞学检测表面标记CD11b的表达（上图为柱状图，下图为其中有代表形态的峰值图），图中数据采用均值±标准差表示，n=3，**P<0.01，***P<0.001代表与“shLyn”组与“shCtl”组相比，##<0.01，###P<0.001代表各细胞株组内GFX抑制剂组与对照组相比，Studentt检验分析数据显著性差异。Gefitinib、Erlotinib、Bosutinib和Dasatinib也在前期实验中被证实具有协同VibsaninA诱导AML细胞分化的活性，图3.13结果表明，沉默Lyn基因同样能抑制这些化合物VibsaninA诱导AML细胞分化的作用，LynRNA干扰后，Gefitinib或Erlotinib协同VibsaninA诱导HL-60细胞分化相关表明标记CD11b的表达率分别从56.13±1.6%和51.2±2.4%降低至17.8±3.6%和14.8±1.8%（抑制率分别为68%和71%），Bosutinib联合VibsaninA诱导HL-60细胞分化的CD11b表达率从47.3±2.4%降低至11%±0.6%，抑制率为77%，Dasatinib联合VibsaninA的诱导HL-60细胞分化作用从40.9±2.2%降低至30.5±1.05%，抑制率为25%。以上结果表明这些被报道具有诱导AML细胞分化活性的酪氨酸激酶抑制剂均不同程度的通过调控Lyn诱导AML细胞分化，上调Lyn协同VibsaninA诱导AML细胞分化是这一类化合物的共同特点。图3.13靶向沉默Lyn对VibsaninA协同一类TKIs诱导HL-60细胞分化的影响Gefitinib（GEFI）10μM、Erlotinib（ERLO）10μM、Bosutinib（BOSU）2.5μM、Dasatinib（DASA）5μM联合VibsaninA（VibA）0.1μM诱导LynshRNA慢病毒（shLyn）和对照慢病毒（shCtl）转染的HL-60细胞72h，流式细胞学检测表面标记CD11b的表达，图中数据采用均值±标准差表示，n=3，**P<0.01，***P<0.001代表与“shLyn”组与“shCtl”组相比，Studentt检验第56页 分析数据显著性差异。3.3.4VibsaninA协同TKIs增强对Raf/MEK/ERK的调控ERK/MAPK途径与细胞的增殖、分化密切相关[49,50]。前期实验基础表明：VibsaninA通过ERK/MAPK途径诱导AML细胞分化[51,52]，TKIs联合VibsaninA增强是否通过协同增强对ERK/MAPK的调控作用诱导AML细胞分化仍需进一步研究，图3.14研究结果表明，Imatinib和Saracatinib单独均能剂量依赖的增强HL-60细胞RafS338、RafS289/296/301位点以及MEK和ERK的磷酸化，并上调了Raf-1蛋白的表达。RafS259是Raf-1活性的抑制位点，Imatinib和Saracatinib也剂量依赖的降低了RafS259的磷酸化。拮抗VibsaninA诱导分化作用的Nilotinib剂量则依赖的抑制了Raf/MEK/ERK信号轴，以上结果提示Raf/MEK/ERK信号轴在VibsaninA协同TKIs诱导AML细胞分化的作用机制中发挥重要作用。图3.14TKIs对Raf/MEK/ERK的调控作用Imatinib(IMA)10µM、Saracatinib(SAR)5、10、20µM，Nilotinib（NILO）2.5、5、10µM诱导HL-60细胞24h，裂解细胞总蛋白，Westernblot检测蛋白水平的变化。如图3.15所示，Imatinib或Saracatinib联合VibsaninA增强了HL-60细胞的RafS338、RafS289/296/301位点以及MEK和ERK的磷酸化，并且进一步抑制了Raf活性抑制位点S259的磷酸化，该结果提示TKIs激活ERK/MAPK途径的活性与VibsaninA激活ERK/MAPK的作用存在正向协同。第57页 AB第58页 C图3.15VibsaninA协同TKIs增强对Raf/MEK/ERK的调控作用Imatinib(IMA)10µM或Saracatinib(SAR)10µM，单独或联合VibsaninA（VibA）0.1µM诱导HL-60细胞24h，裂解细胞总蛋白，Westernblot检测蛋白水平的变化（图A为代表性的Westernblot图片，图B、C为蛋白相对表达定量统计图），n=3，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001表示协同用药组与两个单独用药组相比同时具有统计学差异（one-wayANOVA）。为明确ERK/MAPK途径是否是TKIs协同VibsaninA是诱导AML细胞分化的主要途径，我们使用分子特异性抑制剂进行信号通路研究。U0126是非竞争性MEK抑制剂，能结合在MEK的特定位点上，抑制下游ERK的激活；Sorafinib是Raf-1特异性抑制剂，能有效阻断大多数细胞中MEK1/2和ERK1/2磷酸化[53]。实验结果表明Raf-1抑制剂Sorafenib能够有效的抑制TKIs联合VibsaninA协同增强Raf、MEK和ERK的磷酸化的作用（图3.16A），进而抑制HL-60的CD11b的表达（图3.16B）。MEK抑制剂U0126抑制ERK的激活，同时完全拮抗了HL-60细胞CD11b的表达（图3.16A、B），这说明TKIs协同VibsaninA诱导HL-60细胞分化依赖Raf/MEK/ERK的激活。第59页 AB图3.16VibsaninA协同TKIs通过Raf/MEK/ERK诱导HL-60细胞分化Raf抑制剂Sorafenib5µM或MEK抑制剂U0126预处理1h，HL-60细胞经Imatinib10µM或Saracatinib10µM联合VibsaninA0.1µM孵育24h，裂解细胞总蛋白，Westernblot检测蛋白水平的变化（A），孵育72h，经流式细胞学检测表面标记CD11b的表达（B），***P<0.001与Imatinib或Saracatinib联合VibsaninA组相比，Studentt检验分析数据显著性差异。一方面，PKC抑制剂GFX能抑制TKIs协同VibsaninA增强Raf、MEK和ERK第60页 的磷酸化的作用，并减少Lyn的上调（图3.17A、B）；另一方面，靶向沉默Lyn基因也能有效的削弱TKIs协同VibsaninA激活ERK/MAPK的作用（图3.17C、D），这说明在TKIs协同VibsaninA诱导AML细胞分化的机制中，ERK/MAPK位于PKC和Lyn下游，同时受PKC和Lyn调控，PKC途径和Lyn途径均有激活ERK/MAPK的作用。AB第61页 CD图3.17PKC和Lyn对Raf/MEK/ERK的调控作用（A、B）4μMPKC抑制剂GFX预处理1h后，HL-60细胞经Imatinib(IMA)10µM或Saracatinib(SAR)10µM联合VibsaninA（VibA）0.1µM处理HL-60细胞24h，裂解细胞总蛋白，Westernblot检测蛋白水平的变化（图A为代表性的Westernblot图，图B为蛋白相对表达定量统计图，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001代表GFX抑制剂组与对照组相比，Studentt检验分析数据显著性差异）。（C、D）Imatinib10µM或Saracatinib10µM联合VibsaninA0.1µM处理携带LynshRNA的慢病毒（shLyn）和携带GFP的对照慢病毒（shCtl）转染的HL-60细胞24h，裂解细胞总蛋白，Westernblot检测蛋白水平的变化（图C为代表性的Westernblot图，图D为蛋白相对表达定量统计图，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001代表与“shLyn”组与“shCtl”组相比，Studentt检验分析数据显著性差异）。第62页 为确认PKC和Lyn途径是否是TKIs协同VibsaninA诱导AML细胞分化的两条主要途径，如图3.18A所示，我们一方面通过PKC抑制剂GFX阻断PKC途径，另一方面靶向沉默Lyn(图3.18A、B)，两者联合则完全抑制了Raf的磷酸化(3.18A、C、D)，该结果说明PKC和Lyn共同参与对Raf蛋白的调控，TKIs协同VibsaninA通过PKC和Lyn途径共同增强Raf-1的磷酸化，是其协同诱导AML细胞分化的主要作用机制。值得注意的是GFX抑制剂能减少VibsaninA协同Imatinib诱导Raf-1总蛋白的增加，而靶向沉默Lyn则抑制VibsaninA协同Saracatinib增加总蛋白的作用(3.18A、E)，该结果提示Raf-1总蛋白的增加也与AML细胞分化密切相关，Lyn总蛋白的增加与Raf-1总蛋白的增加可能存在某种必然联系。ABC第63页 DE图3.18PKC和Lyn共同调节Raf-1的磷酸化4μMPKC抑制剂GFX预处理1h后，Imatinib10µM或Saracatinib10µM联合VibsaninA0.1µM处理携带LynshRNA的慢病毒（shLyn）和携带GFP的对照慢病毒（shCtl）转染的HL-60细胞24h，裂解细胞总蛋白，Westernblot检测蛋白水平的变化,图A为代表性的Westernblot图片，图B、C、D、E为蛋白相对表达定量统计图。图中数据采用均值±标准差表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001代表与“shLyn”组与“shCtl”组相比，#<0.05，##<0.01，###P<0.001代表各细胞株组内GFX抑制剂组与对照组相比，Studentt检验分析数据显著性差异。3.3.5VibsaninA协同TKIs增强对核转录因子c-Myc的调控作用C/EBPα、β在造血细胞正常分化中至关重要，但是在AML中往往异常表达，而c-Myc已被证实是VibsaninA诱导AML细胞分化的关键蛋白，我们通过Westernblot实验检测了这些关键蛋白在协同诱导分化中的变化(图3.19A、B、C)，结果表明Imatinib与Saracatinib联合VibsaninA对C/EBPα、β并无协同增强的调节作用，值得注意的是：Imatinib与Saracatinib联合VibsaninA对抑制HL-60细胞的c-Myc蛋白的表达具有非常明显的正向协同作用，前期实验结果也表明：Raf抑制剂Sorafinib、ERK1/2抑制剂U0126(图3.16)，PKC抑制剂GFX以及靶向沉默Lyn(图3.17)均能有效的逆转Imatinib或Saracatinib协同VibsaninA下调c-Myc的作用，这说明：增强c-Myc蛋白的降解，可能是TKIs协同VibsaninA诱导AML细胞分化的主要作用机制。第64页 ABC图3.19VibsaninA协同TKIs对c-Myc的调控作用Imatinib(10µM)或Saracatinib(10µM)联合VibsaninA(0.1µM)诱导HL-60细胞24h，裂解细胞总蛋白，Westernblot检测蛋白含量的变化，图B、C为蛋白相对表达定量统计图。第65页 如图3.20A可见：Imatinib与Saracatinib联合VibsaninA处理HL-60细胞3h后，同样可检测到c-Myc蛋白表达明显降低，HL-60细胞的c-MycmRNA转录水平变化也有相同的趋势(图3.20B)，该结果提示VibsaninA联合Imatinib或Saracatinib的协同作用从基因转录水平降低c-Myc蛋白的表达。AB图3.20VibsaninA协同TKIs降低c-Myc的表达Imatinib(10µM)或Saracatinib(10µM)联合VibsaninA(0.1µM)孵育HL-60细胞0、1、3、6和12h后，通过Westernblot检测c-Myc的蛋白水平(A)，real-timePCR检测mRNA水平(B)，图中数据采用均值±标准差表示，n=3。第66页 鉴于c-Myc在VibsaninA诱导分化机制中的关键作用，我们使用过表达c-Myc的HL-60细胞株进行研究。结果表明Imatinib或Saracatinib协同VibsaninA从转录水平即可协同下调过表达c-MycmRNA的表达，过表达c-Myc能够分别从转录水平（图3.20A）和蛋白水平（图3.20B）逆转协同用药下调c-Myc的作用，此外，过表达c-Myc同样能够逆转Saracatinib或Imatinib联合VibsaninA诱导HL-60分化的效应（图3.20C）。AB第67页 C图3.21过表达c-Myc逆转VibsaninA协同TKIs诱导HL-60细胞分化Myc-cDNA转染的HL-60细胞经Imatinib（IMA）10µM或Saracatinib(SAR)10µM联合VibsaninA（VibA）0.1µM孵育24h，RT-PCR检测c-Myc的mRNA水平（A），Westernblot检测其c-Myc的蛋白含量（B），72h经流式细胞仪检测CD11b的表达（C），***P<0.001与对照病毒组相比，Studentt检验分析数据显著性差异。为进一步验证c-Myc在协同诱导AML细胞分化中的关键作用，我们同样选择了内源性c-Myc含量最低的NB4细胞系进行研究，结果表明过表达c-Myc同样抑制Saracatinib或Imatinib协同VibsaninA诱导NB4细胞分化的作用（图3.22A、B），以上结果提示c-Myc这一转录因子是TKIs和VibsaninA诱AML细胞分化途径的共同作用蛋白，是协同增强分化的关键因子。AA第68页 B图3.22过表达c-Myc逆转VibsaninA协同TKIs诱导NB4细胞分化Myc-cDNA转染的NB4细胞经Imatinib（IMA）10µM或Saracatinib(SAR)10µM联合VibsaninA（VibA）0.1µM孵育24h，Westernblot检测其c-Myc的蛋白含量（A），72h经流式细胞仪检测CD11b的表达（B），**P<0.01,***P<0.001与对照病毒组相比，Studentt检验分析数据显著性差异。3.4讨论前期研究表明本课题组提取的天然小分子化合物VibsaninA通过PKC-ERK-cMyc信号轴介导AML细胞分化，通过筛选，我们发现VibsaninA能够协同大部分具有抗AML活性的酪氨酸激酶抑制剂增强诱导AML细胞分化的作用。但是酪氨酸激酶抑制剂自身诱导AML细胞分化的机制尚不明确，而且这些化合物通过什么途径协同VibsaninA诱导AML细胞分化也仍需进一步研究。PKC是一类使底物蛋白分子内丝氨酸/苏氨酸残基发生磷酸化的蛋白激酶家族，白血病细胞的产生或分化往往伴随PKC的异常表达和活性增加[54]，已有文献表明诱导分化及ATRA和VD3都具有协同酪氨酸激酶诱导AML细胞分化的作用，但是其具体作用机制目前还不明确，然而，经ATRA和VD3诱导分化的HL-60细胞中均能被检测到PKC的激活[28,29]。我们已经明确VibsaninA是PKC激动剂，通过靶向激活PKC发挥诱导AML细胞分化的作用，因此，我们推测PKC介导的信号通路可能参与其协同酪氨酸激酶抑制剂诱导AML细胞分化。为进一步验证PKC在VibsaninA协同TKIs诱导分化中的作用，我们首先使用经典的PKC激动剂PMA作为阳性对照药物进行横向对比研究，结果表明PMA与VibsaninA具有相似的协同酪氨酸激酶抑制剂增强诱导HL-60细胞CD11b表达第69页 的作用，并且PMA协同各酪氨酸激酶抑制剂增强诱导CD11b表达的强弱也与VibsaninA保持一致，该结果正向验证了PKC的激活可能是VibsaninA协同酪氨酸激酶抑制剂增强AML细胞分化的关键机制。随后，我们使用广谱PKC抑制剂GFX和GO6983分别抑制PKC，经流式细胞学检测和细胞形态变化观察，发现阻断PKC途径能够有效的抑制Imatinib或Saracatinib协同VibsaninA诱导的AML分化，其中PKC途径在Saracatinib协同VibsaninA诱导AML细胞分化的机制中占主要地位，而Imatinib协同VibsaninA对PKC的调节作用相对较弱，然而经过阻断PKC也并不能完全拮抗AML细胞分化，这也提示还有非PKC途径参与协同诱导AML分化。进而，我们发现PKC抑制剂GFX同样能够有效抑制Imatinib或Saracatinib单独诱导AML细胞分化的作用，而且其抑制程度与GFX对联合诱导AML细胞分化的抑制程度一致。该实验结果进一步提示Imatinib或Saracatinib自身具有激活PKC和非PKC途径诱导分化的活性，VibsaninA通过靶向PKC，发挥“催化剂”的作用，协同增强了Imatinib或Saracatinib激活的PKC和非PKC途径，从而诱导AML细胞分化。由于VibsaninA协同TKIs诱导AML细胞分化中的非PKC途径受TKIs调控，因此我们推测TKIs诱导AML细胞分化的的非PKC途径可能与酪氨酸激酶的活性有关。受体酪氨酸激酶是最大的一类酶联受体，目前已经发现有50多种，它们即是受体，又能表现出酶的活性，能够将靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化[55,56]。SRC家族是重要的癌基因家族[57]，包括Src、abl、fgr、fes、yes、fps、lck、kek、fym、lyn和tkl，它们定位于细胞膜内面或者跨膜部分，都具有相似的基因编码结构，Lyn、Hck、Fyn和Lck都被报道在造血系统肿瘤中过度活化，其中Lyn在AML细胞中高表达，其升高程度也与患者预后密切相关[58]，有文献表明Dasatinib诱导AML细胞分化可能与抑制Lyn的活性有关[23,48]，Erlotinib和Gefitinib也被报道能够上调HL-60细胞Lyn的表达[19]，同时PKC激动剂PMA在和维生素D3诱导HL-60细胞分化后，可在分化成熟的HL-60细胞中检测到Lyn的激活，这说明PKC可能同样具有调控Lyn的作用[59,60]，因此我们推测TKIs诱导AML细胞分化的“非靶”效应可能与Lyn有关，并且Lyn可能是TKIs协同PKC激动剂VibsaninA诱导AML细胞分化分化过程中共同作用的关键分子。为进一步研究Lyn在协同诱导AML细胞分化中的关键作用，信号通路研究表明，仅管VibsaninA能够增强SRC家族Y416位点的磷酸化，而Imatinib和Saracatinib却表现为抑制作用，但是VibsaninA和Imatinib、Saracatinib均能有效的上调HL-60细胞Lyn蛋白的表达。进一步研究表明Imatinib或Saracatinib与VibsaninA在调节联合SRC家族Y416位点的磷酸化的作用存在相互拮抗，但是第70页 Imatinib或Saracatinib均协同VibsaninA上调Lyn总蛋白的表达。Src的Y416磷酸化位点相当于Lyn的Y397位点[47,61]，随后Lyn免疫沉淀结果表明，Saracatinib能持续完全抑制VibsaninA诱导增强的LynY397位点磷酸化，而Imatinib则不能，这说明虽然VibsaninA和TKIs虽然对SrcY416磷酸化位点调控方式不同，但是诱导Lyn总蛋白表达上调，此前有文章通过聚类法分析Lyn和ERK/MAPK信号通路之间的关系，认为Lyn可能通过复杂的磷酸化方式或者仅仅作为连接c-Raf的“脚手架”复合物的重要结构支撑[62]，酪蛋白激酶II（caseinkinaseII，CK2）能够连接c-Raf和RafSer259位点，Ras抑制激酶1（kinasesuppressorofRas1，KSR1）能连接c-Raf、Lyn和ERK，而Lyn蛋白和CK2以及KSR1均有直接的蛋白质相互作用[47]，我们的结果也提示Lyn总蛋白的增加能够调节MAPK的活性，该调节作用与Lyn的磷酸化水平无关。荧光定量PCR结果提示Lyn蛋白的增加并不依赖于其转录水平的升高，Imatinib或Saracatinib联合VibsaninA在对LynmRNA的调控作用上并无协同作用，这说明VibsaninA和TKIs可能在蛋白水平通过未知的修饰途径协同诱导Lyn总蛋白的增加。为研究Lyn总蛋白的增加在细胞分化过程中的作用，我们构建了的靶向沉默Lyn基因的病毒载体，能降低HL-60细胞内Lyn蛋白的表达，也能拮抗VibsaninA协同TKIs上调Lyn蛋白表达的作用，细胞形态学观察实验结果表明靶向沉默HL-60和NB4细胞的Lyn基因，能够有效的逆转VibsaninA协同TKIs诱导AML细胞髓系分化形态变化，靶向沉默Lyn的同时加上PKC抑制剂阻断PKC的激活，则能完全抑制VibsaninA协同TKIs诱导AML细胞CD11b的表达，这说明Lyn是VibsaninA协同TKIs诱导AML细胞分化的关键分子，Lyn的上调与AML细胞的分化存在必然联系，Lyn的上调一方面受PKC调控，另一方面同时受TKIs激活的非PKC途径调控，同时抑制PKC的活性和Lyn的上调则完全拮抗该协同诱导AML细胞分化的效应。MAPK，特别是ERK/MAPK信号通路在造血细胞分化调控中具有至关重要的作用[49,50]，VibsaninA作为新型的特异性PKC激动剂，已经被证实能够通过PKC途径激活Raf/MEK/ERK轴诱导AML细胞分化[51]。A-Raf，B-Raf，c-Raf(Raf-1)是由GTP结合蛋白-Ras蛋白所募集的主要效应因子，能激活MEK-MAPK途径[63]，目前对c-Raf的活化机制了解的最清楚，它涉及到许多活化位点的磷酸化，p21活化的蛋白激酶(PAK)能磷酸化c-Raf蛋白的Ser338位点，进而诱导c-Raf的活化，所以Ser338的磷酸化是反映Raf-1活性最重要的指标[64,65]；此外，c-Raf蛋白的六个位点(Ser29,Ser43,Ser289,Ser296,Ser301和Ser642位点)会以某种方式过度磷酸化，这与c-Raf蛋白的失活有关，这六个位点的过度磷酸化依赖于下游的ERK第71页 信号转导的负反馈，并使c-Raf失活[66]，所以ser289/296/301的磷酸化水平也能某种程度上反映ERK的磷酸化水平。此外，c-Raf蛋白的磷酸化Ser259位点的磷酸化对c-Raf的激活具有抑制作用[67]，因此c-Raf的Ser259位点的去磷酸化水平也能侧面反映c-Raf的活化程度。Westernblot结果表明显示Imatinib、saracatinib单独均能剂量依赖的增强HL-60细胞RafS338、RafS289/296/301位点以及MEK和ERK的磷酸化，并上调了Raf-1蛋白的表达，同时也剂量依赖的降低了RafS259的磷酸化，值得注意的是与Imatinib结构类似，抑制酶谱相似，仅侧链空间构向不同的Nilotinib剂量则依赖的抑制了Raf/MEK/ERK信号轴，说明Nilotinib具有Raf-1的抑制活性，也有文献表明Nilotinib通过抑制PDGF-β和TGF-β抑制ERK的激活[68]，这与我们的结果相一致，同时也从侧面映证了Raf/MEK/ERK可能是协同诱导AML细胞分化的关键信号通路。VibsaninA能够协同Imatinib或Saracatinib增强对Raf/MEK/ERK的调控作用。MEK抑制剂U0126和Raf抑制剂Sorafenib能够抑制Raf/MEK/ERK的激活，并抑制AML细胞CD11b的表达，这说明VibsaninA联合TKIs通过Raf/MEK/ERK诱导AML细胞分化。PKC抑制剂GFX能够抑制VibsaninA协同TKIs上调的Lyn蛋白表达，并抑制Raf、MEK、ERK的磷酸化，靶向沉默Lyn也能抑制抑制Raf/MEK/ERK的激活，一方面通过PKC抑制剂GFX阻断PKC途径，另一方面靶向沉默Lyn，两者联合则完全抑制了Raf的磷酸化，该结果说明PKC和Lyn途径是TKIs协同VibsaninA诱导AML细胞分化的两条主要途径，PKC和Lyn途径共同增强Raf-1的磷酸化，从而增强下游分化相关信号通路的激活，诱导AML细胞分化。最后，我们发现VibsaninA能够协同Imatinib或Saracatinib降低c-Myc蛋白的表达，Westernblot和RT-PCR结果提示VibsaninA联合Imatinib或Saracatinib协同降低c-Myc的作用同样发生在基因转录水平。过表达c-Myc能够拮抗VibsaninA联合Imatinib或Saracatinib诱导HL-60和NB4细胞的分化效应，以上结果说明VibsaninA协同TKIs能够通过ERK/MAPK途径放大对下游信号分子c-Myc的表达调控，最终增强诱导AML细胞分化。综上所述，如图3.23所示，协同诱导分化剂量下的VibsaninA和TKIs分别单独直接激活ERK/MAPK诱导AML细胞分化的作用有限，但是，一方面，VibsaninA激活的PKC与TKIs激活的PKC存在协同，另一方面，VibsaninA通过激活PKC上调Lyn的作用与TKIs上调Lyn的作用存在协同，PKC和上调的Lyn共同作用激活Raf/MEK/ERK信号轴，从而进一步抑制c-Myc的转录和表达，引起AML细胞周期阻滞，同时诱导AML细胞髓系分化，通过同时抑制Lyn和PKC，即可完全第72页 拮抗VibsaninA协同TKIs诱导AML细胞分化。图3.23VibsaninA协同TKIs通过PKC和Lyn协同诱导AML细胞分化机制示意图经过研究探索，我们筛选了大量的酪氨酸激酶靶向药物，也对其联合VibsaninA协同诱导AML细胞分化的机制进行了深入的研究，但受限于酪氨酸激酶抑制剂本身复杂的靶点，而且在联合分化的有效剂量下，酪氨酸激酶诱导分化活性都是由于其脱靶效应导致，通过目前已知被报道的酶抑制谱比对，线索有限，我们仍然没有明确这些药物诱导AML细胞分化的靶点，但是我们发现上调Lyn可能是这一类具有诱导AML细胞分化活性的化合物的共同特点。尽管我们的研究发现PKC能够上调Lyn，TKIs单独也能通过非PKC途径上调Lyn，从目前的研究结果来看，PKC和TKIs并非从转录水平，而是蛋白修饰水平导致了Lyn总蛋白的增加，该机制还有待研究。目前有文献表明Lyn参与Raf-1的激活，可能在连接Raf-1和MAPK的过程中充当“脚手架”的作用，Lyn总蛋白的增加而并非其磷酸化，能够有助于Raf-1的活化，该报道也与我们的研究结果一致。综上所述，本课题的研究结果表明靶向PTK的抗肿瘤药物联合新型PKC激动剂VibsaninA具有显著的诱导AML细胞分化作用，具有潜在的诱导分化治疗AML的潜力，同时，我们首次将酪氨酸激酶诱导AML细胞的分化作用方式定位至PKC和Lyn，VibsaninA联合TKIs能够通过PKC和上调Lyn进而增强对ERK/MAPK以及c-Myc的调节作用协同诱导AML细胞分化，这些研究结果表明针对上调Lyn诱导AML细胞分化的机制进行进一步研究可能为诱导分化治疗AML提供新的思第73页 路，同时，VibsaninA联合TKIs诱导分化治疗AML也可能成为一个新的治疗策略。第74页 第四章结论与展望酪氨酸激酶（PTK）的异常激活在急性髓系白血病（AML）发病进程中发挥重要作用，以PTK为靶点的药物研发和治疗方案已成为研究热点。新型蛋白激酶C（PKC）激动剂VibsaninA是一个潜在的白血病靶向诱导分化治疗药物。本研究首先通过活性筛选发现系列靶向PTK的抗肿瘤药物能够联合VibsaninA增强AML细胞分化，其中Imatinib、Saracatinib分别与VibsaninA联合诱导分化活性最强，结果显示VibsaninA与Imatinib或Saracatinib联用显著增强AML细胞分化，抑制细胞增殖，并诱导细胞周期G1期阻滞。机制研究表明：一方面，VibsaninA激活的PKC与TKIs激活的PKC存在协同，另一方面，VibsaninA通过激活PKC上调Lyn的作用与TKIs上调Lyn的作用存在协同，PKC和上调的Lyn共同作用激活Raf/MEK/ERK信号轴，从而进一步抑制c-Myc的转录和表达，引起AML细胞周期阻滞，同时诱导AML细胞髓系分化。虽然其临床试验和具体机制实验还有待进一步研究，但是我们首次将酪氨酸激酶诱导AML细胞的分化作用方式定位至PKC和Lyn，并且推测TKIs诱导AML细胞分化的“脱靶效应”可能都是源自这些药物上调Lyn蛋白的表达，通过对VibsaninA协同TKIs诱导AML细胞分化的机制进行进一步研究，有望为AML或其他白血病治疗提供新的治疗思路或者新的诱导分化治疗策略。第75页 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作者在学期间取得的学术成果[1]XingShen,ShuangXing,LuZhang,et.al.,VibsaninAsensitizeshumanacutemyeloidleukemiacellstotyrosinekinaseinhibitor-inducedmyeloiddifferentiationviaactivationofPKCandupregulationofLyn.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications.2018;doi:10.1016/j.bbrc.2018.05.129[2]XingShen,Guo-LinXiong,YuJing,HeXiao,YuCui,Yan-FengZhang,Ya-JunShan,ShuangXing,MengYang,Xiao-LanLiu,BoDong,Li-ShengWang,Qing-LiangLuo,Zu-YinYu,Yu-WenCong.TheproteinkinaseCagonistprostratininducesdifferentiationofhumanmyeloidleukemiacellsandenhancescellulardifferentiationbychemotherapeuticagents.CancerLetters.2015;356：686–696.doi:10.1016/j.canlet.2014.10.018.[3]申星，熊国林，谢玲，等.Toll样受体5激动剂CBLB502对7.0Gy~60Coγ射线照射恒河猴的辐射防护作用观察.中国实验血液学杂志，2015，40（4）：285-291.[4]申星，熊国林，柳晓兰，等.不同剂量HS6101对环磷酰胺损伤小鼠造血功能的影响.国际药学研究杂志.2015;4:303–308.[5]申星，邢爽，熊国林，等.HS-6101对重度骨髓型急性放射病猴的防护作用.中国实验血液学杂志，2014;22(6):1691–1697.第82页 主要简历姓名：申星籍贯：湖南邵东性别：男专业：病理学与病理生理学年龄：32学历/学位：本科政治面貌：中共党员联系邮箱：教育背景2004.09-2009.07第三军医大学临床医学医学学士2012.09-至今军事医学科学院病理学与病理生理学硕博连读工作经验2004.09第三军医大学学员旅五队学员2009.06总后青藏兵站部汽车第三团后勤卫生队军医2010.12总后青藏兵站部第22医院沱沱河卫生所医师2011.10军事医学科学院放射与辐射医学研究所放射病实验治疗研究室助理实验师第83页 致谢值此论文完成之际，真诚感谢在我攻读博士学位期间给予我帮助，助我度过难关的所有人。首先，感谢从玉文研究员多年来对我学习和工作中细心的教诲和关怀，让我建立了正确的科研思维；其次，感谢余祖胤副研究员对我科研工作中的精心指导和严格要求，从选题到课题设计到论文撰写等多个环节都对我提供了极大的帮助。两位导师严谨的治学态度、求实的科研作风，均为我做出了正面表率，指引我在未来的科研生涯继续永攀高峰。感谢董波老师为我无偿提供了宝贵的流式细胞仪，感谢柳晓兰老师、赵振虎老师、王丽梅师姐以及善亚君师姐对我在工作和实验上的指导。特别感谢罗庆良教授对我的爱护和照顾，感谢邢爽师姐、熊国林老师在日常工作中对我的关怀，感谢郭玲玲师姐教我基础的细胞实验操作，感谢我的师妹杨萌和我一起摸索建立了分子生物技术实验平台，感谢张蕊莹师妹、张璐师妹、王芳敏师妹、王皖湘杨婵师妹在实验中给我提供的技术支持和帮助。感谢妻子贾悦，理解我求学期间没有假期陪伴她出去好好看看这个世界，忍受了我多年经常性的夜不归宿，包容我习惯性的加班熬夜，不论我晚上几点回家，她都为我了留了门，留了一盏可能会彻夜长明的床头灯。第84页
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