小反刍兽疫病毒H蛋白的表达及其B细胞线性表位筛选

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分类号：０９３５单位代码：１的６４密级：学号：１２７２０４０６么後朵！太葦学位论文小反当兽疫病毒Ｈ蛋白的表达及其Ｂ细胞线性表位筛选Ｅｘｒｅｓｓ－ｐｉｏｎａｎｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇＢｃｅｌｌＬｉｎｅａｒＥｉｔｏｅｓｏｆｐｐＰＰＲＶＨｅｍａｌｕｔｉｎｉｎＰｒｏｔｅｉｎｇｇ研究生：高位相指导教师：张日月教ｊｆ合作指导教师：李震研究员申请学位口类级别：理学硕±专业名称：微生物学研究方向：微生物生理学所在学院：生命科学学院答辩委员会主席：对二零一五年五月 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加抖标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构一的学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。＞研究牛寐名；切或时间；年月＾日Ｊ关于论文使用授巧的说明目本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，Ｐ；学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，，允许论文被查阅和借阅可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意农业大学可Ｗ用不同方式在不同安徽上、。媒体发表传播学位论文的全部或部分内容保密的学位论文在解密后应遵此协议（守）＞生签杉；０／曰研名；為时间若年月究词乂＞主一第导师签名＝：年曰时间月＾ 摘要小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)感染山羊、绵羊等家养和野生小反刍动物的一种烈性、接触性、传染性疫病。2007年，在我国西藏地区首次暴发小反刍兽疫。目前，我国已有20个省市相继发现了感染病例。探索有效的快速诊断和防治相结合的防治措施对于及时应对随时可能发生的小反刍兽疫疫情具有重要的意义。本研究利用蛋白质免疫印迹方法，以免疫的新西兰大白兔血清为一抗，通过覆盖H基因的重叠16肽片段与血清的特异性反应，鉴定小反刍兽疫病毒H蛋白的线性B细胞表位。本文主要进行了以下研究：1.PPRVH基因原核表达载体的构建以密码子优化的PestedespetitsruminantsvirusstrainChina/Tibet/Geg/07-30（FJ905304）的H基因为模版，扩增H基因片段，构建了1个克隆载体pJET1.2/blunt-PPRV-H和3个表达载体pET28a-PPRV-H，pET30a-PPRV-H和pET32a-PPRV-H。2.His-H蛋白的表达与纯化对重组表达载体pET30a-PPRV-H的诱导表达条件进行优化，确定浓度为1mmol/LIPTG，诱导5h为最佳诱导表达条件。在此条件下，H蛋白主要以包涵体形式存在。通过尿素溶液洗涤包涵体，去除杂蛋白，纯化和浓缩目的蛋白，浓缩后的蛋白浓度最高为2mg/mL。3.免疫血清的制备以纯化后的重组H蛋白免疫新西兰大白兔（0.5mg/只），分别在14d、28d、42d加强免疫一次，56d颈动脉采血收集血清。通过间接ELISA方法测定血清的滴度，1号，2号和3号兔子免疫血清的滴度分别达到1∶25600,1∶12800,1∶6400。从而说明获得的抗血清可以特异性识别重组表达的His-H蛋白。4.H蛋白B细胞线性表位的筛选设计并合成覆盖H基因16肽的基因序列，构建表达载体pXXGST-3-P76-（1F~75F），将重组质粒转化大肠杆菌BL21。以兔抗H蛋白抗血清作为一抗，利用蛋白质免疫印迹来筛选重组表达的16肽片段，从而确定H蛋白的线性B细胞表位，结果共筛选出30个阳性的16肽。关键字：小反刍兽疫，小反刍兽疫病毒，H基因，H蛋白，线性B细胞表位筛选I AbstractPestedespetitsruminants(PPR)isanacute,contagiousdiseasecausedbypestedespetitsruminantsvirus(PPRV),whichinfectsmainlyhomebredandwildruminants,suchasgoatsandsheep.PPRhasbeenreportedin20provincesinChinasinceitappearancedinTibetin2007.DevelopingprophylacticmeasuresconbinedrapiddiagnosiswithpreventionwillhaveagreatsignificanceforcopingwiththeunexpectedemergenceofPPRintime.Inthisstudy,WesternblotwasemployedforscreeningoflinearB-cellepitopesonHproteinofPPRV.TheGSTfusionexpressed16merspeptidesofHProteinwerefirstseparatedbySDS-PAGE，thentheanti-HantiserumspreparedbyimmunizingtherabbitswereusedastheprimaryantibodyforscreeningofthepositiveGSTfusionexpressed16merspeptides.Themainresearchesofthisthesisareasfollows:1.ConstructionofprokaryoticexpressionplasmidTheHgenewasamplifiedbyusingcodonoptimizedHgeneofPestedespetitsruminantsvirusChina/Tibet/Geg/07-30（FJ905304）astemplate.ThenthePCRproductwasinsertedintocloningvectorpJET1.2/bluntandtheplasmidpJET1.2/blunt-PPRV-Hwasobtained.ThenConstructedprokaryoticexpressionvectorspET28a-PPRV-H、pET30a-PPRV-H、pET32a-PPRV-H.2.ExpressionandpurificationofHis-HproteinTheexpressionconditionsofHproteinwereoptimizedandtheoptimalexpressionconditionswereasfollows,IPTGconcentration1mmol/L,andinductiontime5h.TheexpressedHproteinexistedmainlyasinclusionbodiesinE.colicells.Thebacteriawerebrokenbysonication;theprecipitatewascollectedbycentrifugationandwashedseveraltimeswithgradientconcentrationureasolutioninordertoimprovethepurityoftheinclusionbodies.TherecombinantexpressedHproteinwasfurtherpurifiedandconcentration,andthehighconcentrationis2mg/mL.3.Preparationofanti-HantiserumTheNewZealandWhiteRabbitswereimmunizedwith0.5mgconcentratedHprotein,andboosterat14d,28dand42dafterthethefirstdose.Theanimalswereuthanizedat56dandtheantiserumswerecollected.Thetiterofserumfromthefirstrabbitwas1∶25600,andthatfromthe2ndwas1∶12800,andthe3rdrabbitswas1∶II 6400.TheantiserumscouldberecognizedbytherecombinantexpressedHprotein.4.ScreeningBcelllinearepitopeofHproteinTheDNAfragmentsencodingtheserialoverlapping16peptideswerechemicallysynthesizedandinsertedintheexpressingvectorpXXGSTandtheplasmidpXXGST-3-P76-(1F~75F)wereobtained.ThesequencingconfirmedplasmidsweretransformedintoE.coliBL21.Theabovementionedanti-HserumwasusedforscreeningtheepitopeofPPRVHbyWesternblotmethod.Totally,30outofthe75GSTfusionexpressed16merspeptideswereidentifiedaspositiveepitopecandidates.Keywords:Pestedespetitsruminants,Pestedespetitsruminantsvirus,Hgene，Hprotein,ScreeninglinearBcellepitopeIII 中英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称PPRPestedespetitsruminants小反刍兽疫PPRVPestedespetitsruminantsV小反刍兽疫病毒H基因Haemagglutiningene血凝素基因H蛋白Haemagglutininprotein血凝素蛋白bpBasepair碱基对DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸Ampampicillin氨苄青霉素GenBankGenBank遗传学动态序列数据库IPTGIsopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside异丙基硫代半乳糖苷ELISAenzymelinkedimmunosorbentassey酶联免疫吸附试验kbKilobase千碱基kDKilodaltons千道尔顿minMinute分钟ODOpticaldensity光密度ORFOpenreadingframe开放阅读框PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲生理盐水PBSTPhosphate-bufferedsaline/Tween20磷酸盐缓冲液/吐温20PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应PVDFpolyvinylidenefluoride聚偏二氟乙烯膜rpmRotationperminute转/分SDS-PAGEsodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳electrophoresisWBWesternblot蛋白印迹实验μLMicroliter微升μMMicromole微摩尔V 名称英文三字母缩写单字母简写甘氨酸GlycineGlyG丙氨酸AlanineAlaA缬氨酸ValineValV亮氨酸LeucineLeuL异亮氨酸IsoleucineIleI脯氨酸ProlineProP苯丙氨酸PhenylalaninePheF酪氨酸TyrosineTyrY色氨酸TryptophanTrpW丝氨酸SerineSerS苏氨酸ThreonineThrT半胱氨酸CystineCysC蛋氨酸MethionineMetM天冬酰胺AsparagineAsnN谷氨酰胺GlutarnineGlnQ天冬氨酸AsparticacidAspD谷氨酸GlutamicacidGluE赖氨酸LysineLysK精氨酸ArginineArgR组氨酸HistidineHisHVI 目录摘要................................................................................................................................IAbstract..........................................................................................................................II中英文缩略词表...........................................................................................................V文献综述........................................................................................................................11小反刍兽疫概述........................................................................................................11.1小反刍兽疫病毒PPRV的形态特征和理化特征.................................................21.2PPRV的分子生物学特征.......................................................................................31.3PPR防治的必要性..................................................................................................62表位.............................................................................................................................62.1抗原表位及B细胞表位研究的必要性.................................................................72.2抗原表位及B细胞表位研究研究进展.................................................................71引言.............................................................................................................................91.1本实验的研究意义与理论依据..............................................................................91.2本试验主要拟解决的问题......................................................................................92材料及方法...............................................................................................................112.1实验材料................................................................................................................112.1.1菌株.....................................................................................................................112.1.2培养基.................................................................................................................112.1.3主要的药品试剂................................................................................................112.1.4主要仪器设备.....................................................................................................132.1.5试剂的配制.........................................................................................................132.1.6感受态细胞制备.................................................................................................142.2方法........................................................................................................................162.2.1小反刍兽疫病毒H基因PCR扩增..................................................................162.2.2PCR产物的胶回收............................................................................................162.2.3克隆载体pJET1.2/blunt的构建........................................................................172.2.4重组克隆载体的转化.........................................................................................172.2.5重组pJET-PPRV-H质粒的提取及测序..........................................................172.2.6表达载体的构建.................................................................................................182.2.7重组His-H蛋白的诱导及检测.........................................................................192.2.8重组His-H蛋白的大量诱导以及检测.............................................................20 2.2.9重组蛋白His-H的纯化及检测........................................................................202.2.9.1透析袋的预先处理..........................................................................................202.2.9.2重组蛋白His-H的纯化回收..........................................................................212.2.9.3纯化蛋白His-H的SDS-PAGE电泳............................................................212.2.9.4纯化蛋白His-H的检测.................................................................................212.2.9.5纯化His-H蛋白的浓度检测..........................................................................212.2.10新西兰大白兔的免疫.......................................................................................212.2.11抗体滴度的测定...............................................................................................222.2.12兔子血清的特异性检测..................................................................................222.2.13H蛋白表位的筛选...........................................................................................223结果与分析...............................................................................................................303.1小反刍兽疫病毒H基因的PCR扩增.................................................................303.2重组克隆质粒酶切鉴定........................................................................................303.3重组表达质粒菌液PCR及酶切鉴定：..............................................................313.3.1重组表达质粒菌液PCR鉴定...........................................................................313.3.2重组表达质粒的酶切鉴定.................................................................................313.4重组蛋白His-H表达条件的优化........................................................................323.5重组蛋白His-H的Westernblot分析.................................................................333.6重组蛋白His-H包涵体的SDA-PAGE及Westernblot分析............................343.7重组蛋白His-H包涵体的洗涤条件优化...........................................................343.8重组蛋白His-H包涵体的纯化及浓缩...............................................................353.8.1重组蛋白His-H包涵体的纯化.........................................................................353.8.2重组蛋白His-H纯化蛋白的浓缩....................................................................363.9新西兰大白兔兔子血清抗体滴度的测定............................................................363.9.1不同免疫天数血清的检测.................................................................................363.9.2抗体滴度的检测.................................................................................................373.9.3新西兰大白兔兔子血清结合特异性检测.........................................................383.10H基因的表位筛选..............................................................................................383.10.1H基因抗原表位预测.......................................................................................383.10.2pXXGST-3载体酶切回收...............................................................................393.10.3H基因16肽质粒的酶切鉴定........................................................................393.10.4H蛋白表位的筛选...........................................................................................404讨论...........................................................................................................................444.1小反刍兽疫病毒PPRV的H蛋白表达..............................................................44 4.2小反刍兽疫病毒PPRV的H蛋白线性B细胞表位的筛选.............................445结论...........................................................................................................................465.1克隆及表达载体的构建........................................................................................465.2His-H蛋白诱导分离、回收、浓缩和检测.........................................................465.3新西兰大白兔的免疫............................................................................................465.4H蛋白的表位的筛选............................................................................................46参考文献......................................................................................................................47附录..............................................................................................................................53附录1...........................................................................................................................53致谢..............................................................................................................................54个人简介......................................................................................................................55在读期间发表的学术论文..........................................................................................55 文献综述1小反刍兽疫概述1942年，小反刍兽疫（pestedespetitsruminants，PPR）由Gargudennec等在非洲西部的科特迪瓦首先发现，并逐渐在非洲、土耳其、中东和整个印度半岛流行[1,2]（图1-1），严重威胁和影响这些国家（地区）的动物养殖业和当地农牧民的生活状况[1]。在随后的10年内，疫情几乎遍及了撒哈拉沙漠到赤道的所有非洲国家。小反刍兽疫又称为羊瘟或伪牛瘟，是由小反刍兽疫病毒引起的绵羊或者山羊的一种接触性传染病。PPRV与牛瘟病毒、麻疹病毒、犬瘟病毒同属于副粘病毒科的麻疹病毒属。虽然有报道牛、水牛、猪和骆驼也可以感染PPRV，但它们是否能将病毒传染给其它动物尚无定论。野生动物如羚羊等对PPRV也易感，但目前认为它们对PPR的传播作用非常有限[3]。由于PPR的高致病率和高致死率，世界动物卫生组织（OIE）将其规定为必须上报的A类烈性传染病。图1-1小反刍兽疫全球分布及四个PPR病毒谱系（EmmanuelAlbina等[3]）Fig.1-1GlobaldistributionandfourPPRviruslineageofPPR（EmmanuelAlbinaet.al[3].）PPR的粉红色表示病毒学证据的感染。蓝色显示血清学证据，在相应的国家有PPR感染但没有分离到病毒。灰色的颜色显示没有报道。2007-2008，在我国西藏地区暴发小反刍兽疫，2013年底在新疆地区发现小反刍兽疫疫情，发病羊1542只，死亡345只，随后传至内地多个省份[4]。2014年，甘肃、内蒙古自治区、宁夏、辽宁、江西省、江苏、安徽、吉林、黑龙江、广西、重庆、四川、湖北、浙江、湖南、云南、贵州、山西、广东相继发生小反刍兽疫疫情，发病羊9012只，死亡3498只，扑杀7730只。截止到2014年111 月份，我国有20个省区发生小反刍疫情。该疫病给我国的养殖业和牧民带来严重的经济损失（图1-2，中华人民共和国农业部兽医局）。图1-2小反刍兽疫在我国的分布情况Fig.1.2ThedistributionofPestedespetitsruminantsinChina1.1小反刍兽疫病毒PPRV的形态特征和理化特征小反刍兽疫病毒（pestedespetitsruminantsvirus，PPRV）与牛瘟病毒同是副粘病毒科麻疹病毒属的成员[5]，有相似的物理化学和免疫学特性。小反刍兽疫病毒呈多形性。通常为粗糙的球形，病毒直径大小150-700nm[6,7]。小反刍兽疫病毒可在胎绵羊肾、胎羊以及新生羊的睾丸细胞和Vero细胞上进行增值，产生病变（CPE），形成合胞体。感染山羊的尸体在4℃条件下保存8天，仍可以从感染病羊的淋巴结中分离到PPRV病毒。病毒对外界的抵抗能力比较弱，对化学试剂乙醚和氯仿敏感，在pH为6.7~9.5时，最稳定。小反刍兽疫病毒对温度和酸比较敏感，在4℃条件下12小时即可灭活。在pH为3.0条件下，3小时能灭活。小反刍兽疫病毒PPRV的病毒悬液在37℃的半衰期约为2个小时，在50℃条件下，灭活5min即可被杀死[8]。图1-3小反刍兽疫病毒（EmmanuelAlbina等[3]）Fig.1.3Pestedespetitsruminantsvirus（EmmanuelAlbinaet.al[3]）2 1.2PPRV的分子生物学特征麻疹病毒属和同属的其他成员犬瘟热病毒CDV，牛瘟病毒RPV，麻疹病毒MV，海豹瘟病毒PDV等分子生物学特征类似。PPRV的核衣壳是螺旋中空杆状。PPRV有囊膜，病毒粒子的基因组是单股负链无节段的RNA，各基因间有1个半保守多腺苷酸化信号，在各个基因mRNA的转录过程中，在每个基因的3’端断开，因而PPRV的每个基因间都可能从模板上解链，再从另一个基因的3’端重新起始转录，即不需要同时按照顺序转录mRNA[9]。1个高度保守的GAA序列，相邻的基因的一个半保守起始信号，5’和3’各有一个UTRs（非翻译区）。PPRV的基因组编码着6个结构蛋白，依次为核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，融合蛋白(F)和血凝素糖蛋白(H)和多聚酶大蛋白（L）。同时还编码两个非结构蛋白即：V蛋白和C蛋白[10,11]。根据核衣壳蛋白(N)和融合蛋白(F)基因序列的不同，可将PPRV的一个血清型分为四个系，我国发现的基本上属于Ⅳ系[12,13]。图1.4PPRV的各个基因分布(GenevièveLibeau[14])Fig.1.4ThedistributionofdifferentgenesinPPRVgenemap(GenevièveLibeauetal[14])图1-5H蛋白构象图（LeremyAColf等[15]））Fig.1-5Hproteinconformationalmap（LeremyAColfetal[15].）病毒表面的H蛋白（血凝素蛋白）是与宿主受体结合的部位，宿主受体主要为免疫细胞标记信号淋巴细胞活化分子CD150（signalinglymphocyteactivationmolecule,SLAM）[16,17,18]和CD46以及绵羊的Nectin-4蛋白（Nectin-4）[19,20,21]。3 在病毒入侵细胞时，H蛋白和细胞表面的受体“SLAM”蛋白质相结合，减少了病毒包膜与细胞膜之间的距离，H蛋白通过二聚体构象的变化改变自身蛋白构象，从而导致病毒包膜与细胞膜融合。病毒入侵淋巴细胞后迁移到上皮细胞，导致局部淋巴组织感染（例如支气管淋巴结），然后病毒进一步在宿主体内传播[22]。最终使小反刍动物出现典型的上皮细胞感染和坏死的临床病变。图1-6麻疹病毒入侵宿主细胞（TakaoHashiguchi等[22]）Fig.1-6Theprocessofthemeaslesvirusinvadinghostcells（TakaoHashiguchietal[22]）图1-7H蛋白和SLAM结合位点（TakaoHashiguchi等[22]）Fig1-7ThebindingsitesofHproteinandSLAM（TakaoHashiguchietal[22]）4 图1-8H蛋白和SLAM（红色），CD46（黄色）结合位点（LeremyAColf等[15]）Fig.1-8ThebindingsitesofHproteinandSLAM(red),CD46(yellow)（LeremyAColfetal[15]）图1-9H蛋白和Nectin-4v结合位点（XiaoaiZhang，GeorgeFGao等[21]）Fig.1-9ThebindingsitesofHproteinandNectin-4v（XiaoaiZhang，GeorgeFGaoet.al[21]）Diallo等将H基因导入羊痘病毒载体构建PPR重组疫苗，免疫山羊产生了PPRV中和抗体，并获得了对PPR强毒株攻毒保护[23]。Chen等详细分析了表达PPRVH或F基因重组痘病毒对山羊和绵羊的免疫原性，表达PPRVH基因的重组疫苗可诱导更强的中和抗体，而且绵羊和山羊的中和抗体水平没有显著的差异但是仅免疫山羊可以获得对羊痘病毒强毒株的攻毒保护[24]。Chandran等以牛痘病毒载体表达PPRVH或F基因，构建两种重组PPRV疫苗，两种疫苗第二次免疫都可以使免疫山羊获得对PPRV强毒株攻毒保护，且没有明显的不良反应[25]。Qin等将PPRV西藏株的H基因插入犬腺病毒载体，构建PPR重组疫苗，首次免疫后山羊产生PPRV中和抗体，第二次免疫后的抗体可以持续7个月以上。疫苗免疫无明显的副反应，而且免疫动物的尿和粪便中均没有分离到腺病毒[26]。5 Wang等将PPRVH基因插入真核表达载体pSCA1中构建自杀DNA疫苗，以此疫苗免疫小鼠，小鼠产生了H蛋白特异性抗体和PPRV中和抗体，淋巴细胞增殖试验表明疫苗引起了明显的细胞免疫反应[27]。Shaila等以杆状病毒为载体表达了PPRVH蛋白，得到了有生物活性的重组蛋白质[28]。以纯化的重组杆状病毒表达的PPRVH蛋白免疫山羊，免疫动物产生了体液和细胞免疫反应，如PPRV中和抗体[29]。Khandelwal等利用转基因花生表达具有生物活性的PPRV的H蛋白，通过口服转基因花生叶子免疫山羊，在没有任何佐剂的情况下，免疫绵羊产生了PPRV中和抗体和PPRVH蛋白特异性细胞免疫反应[30]。然而，这种口服疫苗的临床保护作用还需要进一步的试验验证。Buczkowski等利用反向遗传学技术构建了第一个麻疹病毒H蛋白单表位缺失的负标记疫苗，这为PPR单表位缺失负标记疫苗的构建提供了参考[31]。最近，Hu等报道了PPRV的反向遗传学技术的成功建立[32]。利用牛瘟病毒负标记疫苗相似的方法，构建PPRVH蛋白单表位缺失的负标记疫苗。这种负标记疫苗与基于H蛋白单克隆抗体的ELISA试剂盒，相互配合使用可以鉴别自然感染和免疫动物，这将大大提高PPR的防控和应急反应效率。1.3PPR防治的必要性牛瘟根除后，PPR的根除也被提上了日程[33]。然而，由于PPR流行地区的广泛性、各地区基础设施的巨大差异和易感动物（特别是野生小反刍动物迁徙特性）的复杂性，PPR的根除还有很长的路要走。另外，PPRV不仅感染羊等小反刍兽，还可以感染牛、水牛和骆驼[34]，这种情况在现在已经停止牛瘟疫苗接种的现实情况下也应当引起足够的重视。PPR弱毒疫苗需要冷链运输，才保证其在临床使用时的有效性，这在PPR流行的热带贫困地区又往往难以保证，因而仍需开发新型热稳定弱毒活疫苗或疫苗剂型。研发PPR标记疫苗和与之配合使用的血清学检测方法对于PPR的防控和最终根除具有重要的意义。反向遗传学方法通过插入正标记基因、删除非必需基因或基因的非必需部分以及突变基因的特定碱基来构建正标记、嵌合体或负标记疫苗，这为PPRV标记疫苗开发提供了重要的前期基础[35]。2表位抗原表位（epitope），又称为抗原决定簇(antigenicdeterminant，AD)或抗原决定基，是指抗原分子表面能够被抗原受体TCR和BCR特异性识别的具有特殊立体构型和免疫活性的化学基团[36]。天然抗原一般都是多价和多特异型表位抗原，抗原性与蛋白大小有一定关系，一般情况下，分子质量5kD大约会有一个表位，相对分子质量小于5kD的分子没有抗原性[37]。因而可以将小分子共价连6 接到表达的的蛋白质上，这种相对分子质量小于5kD的蛋白可以引起免疫反应。本文中合成的16肽片段和8肽片段分子量比较小，所以将它们连接到pXXGST载体上，通过与GST蛋白共表达，来筛选线性B细胞表位2.1抗原表位及B细胞表位研究的必要性传统疫苗是将病原体灭活或减毒而制成的，因而传统疫苗存在生物危害风险和因为遗传变异而导致的疫苗效力下降等问题；而且不能将免疫动物与自然感染动物区分开来，给疫病的流行病学调查带来不便。合成肽疫苗是用特异抗原表位制备的疫苗，同时可以是标记疫苗[38]。表位疫苗包括重组多表位疫苗、合成肽疫苗及表位核酸疫苗。特别是重组多表位肽疫苗，因其除细胞毒性T细胞表位（TcCE）外，同时还包含多个B细胞表位（Bcellepitope,BCE）,因而可产生更好的免疫保护力[39]。为研制充分有效的多表位肽疫苗，鉴定靶病毒结构蛋白质上全部线性BCE显得尤为重要。与表达完整的蛋白质不同，多表位肽疫苗是将特异抗原表位重复串联，并通过化学合成或合适的载体重组表达，制备的疫苗同时也是标记疫苗。多表位肽疫苗可以将来源于不同株、系或亚型的结构基因表位组合起来，从而避免了需要同时表达多个完整的蛋白质而引起的成本急剧增加。目前，对流感多表位通用疫苗的研究已经取得了很大的进展[40]，而PPR多表位疫苗的研究才刚刚起步。与细胞免疫具有清除病毒和减轻疾病不同，B细胞和B细胞产生的抗体在防止病原再次感染方面发挥作用。因此，鉴定PPRV结构蛋白质上的全部B细胞表位，特别是免疫优势中和抗体表位和不同系PPRV毒株的保守性表位，进而借助生物信息学、结构生物学等[41]手段将它们有机的组合成起来，针对未来全球范围内消除小反刍兽疫提供了初步解决方案。2.2抗原表位及B细胞表位研究研究进展由于技术的原因，对于B细胞空间构象性表位研究较少。目前对抗原表位多集中研究线性B细胞表位[42]。目前对抗原表位的预测依据主要是以下几种：（1）依据抗原的亲水性[43]；（2）依据抗原性；（3）依据抗原的可塑性；（4）依据抗原的可及性；（5依据抗原二级结构预测性；（6）依据抗原的电荷分布。目前主要以几种参数：亲水性，可及性，可塑性，电荷分布，抗原性等的综合判断图阈值以上的峰即预测的抗原表位[44]。对线性抗原表位的分析除了化学“切割”法或酶法外，目前采用的主要是噬菌体呈现技术检测法[45,46,47]、基因亚克隆法、基因工程表达法，生物合成肽检测法和表位计算机预测等方法[48,49]。但是，这些表位鉴定方法（包括它们的众多衍生或改良方法）由于费用问题，特殊检测仪器，抗体方面的原因（如需要用单抗），从而限制了线性表位鉴定研究的广泛开展。而且7 这些方法都不可以使用抗重组蛋白多克隆抗体进行表位作图[50]，而且不可以鉴定表位最小基序。鉴定表位最小基序是确定靶蛋白上全部表位和搜索病毒亚型之间同源蛋白保守性表位的前提[51]。徐万祥等建立了用于靶蛋白线性表位扫描作图和表位最小基序鉴定的“改良生物合成肽法”[52,53]，并用抗重组蛋白多抗进行筛选表位，成功地绘制了人乳头瘤58型病毒（HPV58）三个编码蛋白的“全部”且“精细”的线性表位图谱，并基于各表位最小基序的同源蛋白序列比对，确定了它们在不同型HPV中的100%或高度保守性表位。该方法以截断的GST188蛋白作为短肽合成载体为主要特征，具有操作简单（无需纯化表达的系列短肽融合蛋白）、经济（短肽生物合成是化学合成的1/20）、结果可靠和无需特殊仪器而适合普通实验室广泛应用等优点。这一方法的建立为“线性抗原表位组学”，筛选靶蛋白全部且精细线性表位组，筛查其中全部100%或高度保守性表位以及抗体可及性或中和性表位提供了理论依据。进而为研制靶病毒重组多表位肽检测抗原或“通用”疫苗（后者同时掺入已被明确鉴定的若干细胞毒性T细胞表位肽）奠定了基础。抗原表位作图定位（epitopemapping）和表位基序鉴定（epitopemotifidentifying）一直是动物病毒领域关注的重点。Choi等在PPRV病毒丰度最高且免疫原性最强的核衣壳N蛋白上，鉴定出4个B细胞抗原区域(A-1，A-2，C-1，C-2)[54]；Dechamma等用化学合成肽方法在PPRV的N蛋白的C端鉴定了一个可区别PPRV和RPV感染的特异的B细胞表位肽段（氨基酸残基454-472）[55]；Renukaradhya等研究表明PPRVH蛋白质的免疫优势B细胞表位位于相隔171个氨基酸的363-368aa和538-609aa区域[56]。上述利用单克隆抗体的研究并没有进行最小表位基序鉴定。很显然，PPRV的表位鉴定研究依旧有限且不彻底，依然有继续深入开展相关研究，特别是对更多靶蛋白表位扫描作图的必要性。于瑞嵩等用改良的生物合成肽法，开展了小反刍兽疫病毒N蛋白的线性B细胞表位的精细作图的研究，确定了PPRV的N蛋白的最小基序[57]。对小反刍兽疫病毒其它蛋白（特别是H蛋白质）的表位仍知之甚少；已有资料也表明PPRV的H蛋白是血凝素蛋白，能诱发保护性免疫应答和产生中和性抗体，因而它们都是值得关注的靶抗原，开展PPRVH（609aa）蛋白的线性表位组学研究，以解码它们的线性表位组并分析确定它们中的保守性、特异性表位。8 1引言1.1本实验的研究意义与理论依据小反刍兽疫首次出现于科特迪瓦，2007年小反刍兽疫传入我国，小反刍兽疫对山羊，绵羊高度易感，致死率高达90%~100%。给我国牧区以及饲养工作带来了重大的经济损失。尽管疫苗存在超过25年，这种疾病仍然是一个令人担忧的疾病尤其是在流行的非洲，中东，亚洲地区等高危地区。近年来对于小反刍兽疫病毒的各个基因或蛋白功能的研究工作，揭示小反刍兽疫病毒的传播途径以及带来的深远影响[58,59,60]。但是对于小反刍兽疫的防治措施，目前仅仅采用扑杀隔离[61]。传统的疫苗采用将病原体灭活或者减毒，但存在弱毒疫苗的热稳定性的问题[62,63]。表位疫苗是根据抗原表位氨基酸序列制成疫苗，具有安全，高效，对动物伤害小的优点[64,65]。鉴定出可以被免疫细胞识别的特异性多肽，是研发表位疫苗的前提条件。小反刍兽疫病毒的H蛋白为血凝素蛋白，抗原性比较强，而如今对的小反刍兽疫病毒的H蛋白线性B细胞表位研究还处于起步阶段。本文通过WesternBlot，以免疫的新西兰大白兔血清为一抗，通过人工设计覆盖H基因的重叠16肽片段与血清的特异性结合鉴定出小反刍兽疫病毒的H蛋白上全部或接近全部的线性B细胞表位。这是小反刍兽疫病毒线性抗原表位组学研究筛选的N蛋白的线性B细胞表位的延续，将鉴定出小反刍兽疫病毒的H蛋白上全部或接近全部且精细的线性B细胞表位。对筛选的线性B细胞表位可以进一步进行最小基序的精细鉴定，通过4系PPRV和RPV同源蛋白序列比较，有可能发现西藏株PPRV更多特异的表位和/或更多在同源蛋白中100％或高度保守性表位。1.2本试验主要拟解决的问题本研究以我国西藏地区分离到的小反刍兽疫病毒的经密码子优化的PPRVChina/Tibet/Geg/07-30的H基因（FJ905304）为模版：1.构建原核克隆载体pJET1.2/blunt-PPRV-H以及原核表达载体pET28a-PPRV-H，pET30a-PPRV-H和pET32a-PPRV-H。通过对原核表达载体的诱导获得重组蛋白。进而对目的蛋白的纯化，浓缩，将浓缩蛋白免疫新西兰大白兔，获得抗H蛋白的抗血清。9 2.通过合成覆盖H基因16肽基因，分别连接表达载体，通过蛋白质免疫印迹使用免疫血清作为一抗，对H蛋白线性B细胞表位进行筛选，确定了H蛋白线性表位的存在位置。10 2材料及方法2.1实验材料2.1.1菌株E.coliTop10，E.coliBL21（DE3）菌株上海市农业科学院畜牧兽医研究所基因工程研究室保存。2.1.2培养基LB液体培养基：蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g，上述物品溶解于800mL双蒸水中，调节pH值6.8~7.2，定容至1000mL，121℃灭菌后，保存于4℃冰箱。LB固体培养基：每200mL液体LB培养基加入琼脂粉4g，121℃灭菌后，超净工作台倒平板，保存于4℃冰箱。含氨苄青霉素（或卡那霉素）抗性的固体LB平板：LB培养基，高压完成后，加入100mg/mL的氨苄青霉素200μL（或者加入100mg/mL的卡那霉素100μL），混匀后，超净工作台倒平板，制备成含氨苄青霉素（或卡那霉素）抗性的LB平板，倒置，保存于4℃冰箱。SOB培养基：蛋白胨10g；酵母提取物2.5g；氯化钾0.93g；氯化钠0.292g，上述物品溶解于400mL双蒸水中，调节pH值6.8~7.0，定容至500mL。2.1.3主要的药品试剂表2-1实验药品试剂Table2-1Experimentalreagents药品试剂生产厂家琼脂糖Sigma公司酵母粉Oxoid公司蛋白胨Oxoid公司PrimeSTARHSDNAPolymerase酶TaKaRa公司T4DN连接酶TaKaRa公司DL2000DNAMarkerTaKaRa公司DL5000DNAMarkerTaKaRa公司PJET1.2/blunt载体试剂盒Thermoscientific公司限制性内切酶SalⅠ、EcoRⅠ和BamHⅠThermoscientific公司限制性内切酶NdeⅠ和XholThermoscientific公司11 EDTA（乙二胺四乙酸）GENEVIEW公司Tris（三羟甲基氨基甲烷）GENEVIEW公司脱脂奶粉上海生物工程有限公司浓盐酸昆山晶科微电子材料有限公司乙酸（冰醋酸）宜兴市第二化学试剂厂Axygen胶回收试剂盒康宁生物科技有限公司AxygenDNA质粒提取试剂盒康宁生物科技有限公司氨苄青霉素索莱宝生物科技有限公司卡那霉素索莱宝生物科技有限公司显影粉，定影粉索莱宝生物科技有限公司透析袋（D25mm）XH418北京鼎国生物技术有限责任公司甘氨酸北京鼎国生物技术有限责任公司SDS（十二烷基硫酸钠）北京鼎国生物技术有限责任公司琼脂粉北京鼎国生物技术有限责任公司丙三醇国药集团化学试剂有限责任公司氯化钾国药集团化学试剂有限责任公司氯化钠国药集团化学试剂有限责任公司碳酸氢钠国药集团化学试剂有限责任公司乙酸钾国药集团化学试剂有限责任公司无水甲醇国药集团化学试剂有限责任公司无水乙醇国药集团化学试剂有限责任公司磷酸二氢钾国药集团化学试剂有限责任公司磷酸氢二钠国药集团化学试剂有限责任公司尿素国药集团化学试剂有限责任公司X胶片Kodak公司蛋白Marker天根生化科技（北京）有限公司低分子量预染Marker天根生化科技（北京）有限公司12 2.1.4主要仪器设备表2-2实验仪器设备Table2-2ExperimentalinstrumentsDXY-31A/31B型电泳槽北京六一仪器厂BSD-250振荡培养箱上海博迅实业有限公司DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱上海一恒科技有限公司JULABOF12水浴锅JULABO公司Galanz电磁炉GALANZ公司QL-861涡旋振荡器VORTEXSHAKER公司TS-2PRBITALSHAKER摇床Kylin-BellLabInstrument85-2型恒温磁力搅拌器上海可乐仪器有限公司PH计METTLERTOLEDOFR2202CN电子天平奥豪斯仪器有限公司DXY-2型恒压稳流电泳仪北京六一仪器厂AG245分析天平METTLERTOLEDOLDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂MIKRO高速离心机Hettich公司台式离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司HR-2050R台式高速冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司PCR-200PCR仪MJReasearch公司S1000TMThermaCyclerPCR仪器BIO-RAD公司QL-861涡旋振荡器VORTEXSHAKER公司垂直电泳仪BIO-RAD公司电泳槽BIO-RAD公司割胶紫外投射台BIO-RAD公司白光透射仪UPV公司Benchtop3UVTMTransilluminatorUPV公司2.1.5试剂的配制50×TAE缓冲液：Tris242g，Na2EDTA·H2O37.2g，醋酸57.1mL，上述物品溶解于800mL双蒸水中，定容至1L。2×SDS上样缓冲液(10mL)：称取0.02g溴酚蓝，量取2mL甘油，1mL2-巯基乙醇，4mL10%SDS，1mL1mol/LTris-HCl(pH6.8)，2mL双蒸水，5mL分装，-20℃贮存。13 10×SDS-PAGE电泳缓冲液：称取30.3gTris，144.0gGlycine，10.0gSDS，上述物品溶解于800mL双蒸水中，定容至1L。考马斯亮蓝R250染色液：称取2.5g考马斯亮蓝R250，量取100mL冰乙酸，450mL甲醇，上述物品溶解于800mL去离子水中，定容至1L。脱色液：量取180mL甲醇，40mL冰乙酸，定容至400mL。半干转转膜液：称取2.93gGlycine，5.82gTris，0.375gSDS，量取200mL甘油，上述物品溶解于800mL去离子水中，定容至1L。PBS溶液：称取0.2gKH2PO4，2.9gNa2HPO4·12H20，8gNaCl，0.2gKCl，上述物品溶解于800mL双蒸水中，调节PH至7.4，搅拌混匀，定容至1L，。PBST溶液：称取0.2gKH2PO4，2.9gNa2HPO4·12H20，8gNaCl，0.2gKCl，调节PH至7.4，加1mLtween-20，上述物品溶解于800mL去离子水中，搅拌混匀，定容至1L。超声破碎液：称取11.688gNaCl，3.0285gTris，上述物品溶解于400mL去离子水中，调节pH至8.8，补加10%的甘油，搅拌混匀，定容至500mL。1M乙酸钾（KAc）：准确称取0.9814g，溶解于5mL去离子水中，定容至10mL，调节pH为9.0~10.0，备用。(注意：不能使用KOH调节溶液pH，与CaCl2反应生成沉淀)配制感受态细胞悬浮液：准确称取CaCl24.45g（无水）或CaCl2·2H2O5.90g加入适量的ddH2O溶解。待CaCl2完全溶解后加入pH为9.0~10.0的1M乙酸钾（KAc）5mL。加入50mL的甘油，调节溶液的pH为6.4，双蒸水定容500mL，1M氯化镁（MgCl2）：精确称取MgCl2·6H2O试剂20.330g，溶解于80mL去离子水中，定容100mL。121℃灭菌后，4℃贮存2M氯化锰（MnCl2）：精确称取MnCl2·4H2O试剂39.582g，溶解于80mL去离子水中，定容100mL。121℃灭菌后，4℃贮存2.1.6感受态细胞制备（1）用接种环挑-80℃超低温冰箱取出的E.coliBL21(DE3)/Top10感受态细胞菌种保藏液，在不含任何任何抗生素LB平板上划线，37℃恒温培养箱培养12~16h。不必将冰冻的细菌完全融化，无菌铂丝在冰冻的细菌原种中表面划过时，已经带上足量的细菌。因此一管冻存的菌液可使用多次。（2）从37℃培养12~16h的无抗性的平板中挑取单菌落，接种50mL小锥形瓶中，37℃，220rpm，培养16h。（3）取37℃，220rpm，培养16h的菌液1mL，接种于500mL锥形瓶中（4瓶都取同一个小锥形瓶），30℃，220rpm~300rpm，培养2.5h~3h，测量OD600=0.4~0.5之间，偏向于0.5。将浸泡75%的酒精中的50mL（4个）离心管，14 双蒸水将其清洗干净，放入超净台，离心管先倒放（卫生纸放管口下）控水，后打开盖子正放，超净台紫外灭菌30min。（4）待OD600=0.4~0.5时，将菌液立即放入冰盒中。冰上放置10min。（5）等待期间，调好离心机，预冷，将MgCl2，MnCl2按照1∶100的比例感受态细胞悬浮液(即500mL的感受态细胞悬浮液加入MgCl2，MnCl2各5mL)。（6）将预冷的菌液倒入4个50mL的离心管中，5000rpm，4℃，离心10min。（7）弃上清，在每个离心管中加入约15mL感受态细胞悬浮液混合液，悬浮沉淀。（沿着同一方向，均匀摇动，不要太快），待悬浮沉淀后，加入感受态细胞悬浮液至100mL，冰上放置20min。（8）4℃，5000rpm，离心10min，弃上清，向离心管中加入5mL的感受态细胞悬浮液，混合液悬浮。（9）将混匀的溶液分装至已经预冷的1.5mL的EP管中，200μL/每管。戴上手套用消毒后的镊子取1.5mL的EP管，整个过程在冰上进行。分装完成后放入纱布小袋内，液氮速冻1h，取出后，-70℃，保存。15 2.2方法2.2.1小反刍兽疫病毒H基因PCR扩增根据经密码子优化的PestedespetitsruminantsvirusstrainChina/Tibet/Geg/07-30（FJ905304）的H基因序列设计两条引物：上游引物：PPRV-H-F：GGAATTCCATATGATGGGACTACCTAAACCT（下划线标注是限制性内切酶NdeⅠ的酶切位点）；下游引物：PPRV-H-R：GCTCGAGAAACTGGCAGAAAGCATAG（下划线标注是限制性内切酶Xhol的酶切位点）。按照表2-3的PCR扩增体系在200μL的离心管中加入反应体系各组分，按照PCR程序进行扩增。表2-3H基因PCR扩增Table2-3HgeneamplificationbyPCR反应体系各组分各组分的体积（μL）5×PrimeSTARbuffer10上游引物2下游引物2模版DNA2dNTPMixture（2.5mMeach）4PrimeSTARHSDNAPolymerase（2.5U/μL）1ddH2O29PCR反应条件：94℃5min94℃45s60℃45s35cycles72℃2min72℃10min4℃forever取5μLPCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为170V，17min，使用UPV紫外成像系统观察电泳结果。2.2.2PCR产物的胶回收2.2.2.11%的琼脂糖凝胶的配制用电子天平准确称取琼脂糖5g，加入1×TAEBuffer50mL，轻轻混合均匀形成1%的琼脂糖凝胶溶液，使用微波炉加热使琼脂糖缓慢融化，然后补足体积16 数，冷却不烫手为宜(大约60℃左右），加入2.5μL的GoldViewⅠ，轻轻摇匀后倒胶。2.2.2.2PCR产物的回收胶完全凝固后，将50μL酶切产物加入点样孔，电泳条件为电压170V，电泳时间15~17min。电泳完毕后，使用紫外成像系统UPV观察电泳结果。使用已灭菌的手术刀片，轻轻切下目的条带，切的时候注意不要切到杂带。放入事先称量的EP管中。使用Axgen胶回收试剂盒进行回收目的片段。2.2.3克隆载体pJET1.2/blunt的构建按照克隆载体pJET1.2/blunt试剂盒说明书连接克隆载体和PCR产物，22℃连接1h。连接体系如下：表2-4克隆载体和PCR产物接体系Table2-4TheconnectionofclonevectorandPCRproducts反应体系各组分各组分的体积（μL）2×ReactionBuffer5pJET1.2/bluntCloningVector1PPRV-H胶回收片段3.5T4ligase0.52.2.4重组克隆载体的转化从-80℃超低温冰箱取出E.coliTop10感受态细胞立即置于冰上，待感受态细胞稍微融化，在超净工作台中，加入10μL的连接产物，使用移液枪小心吹打均匀，冰上放置30min，置于42℃水浴锅中，热击1min30s，立即置于冰上放置3min，超净工作台中加入1mL没有抗性的LB培养基，37℃恒温培养箱220rpm培养1h，4200rpm离心3min，弃上清，使用200μL移液枪悬浮沉淀，将上述悬浮均匀后的沉淀，取200μL均匀涂布到100μg/mL氨苄抗生素的LB琼脂平皿涂板上，，命名为：pJET-PPRV-H，A，TOP10。37℃恒温培养箱，培养过夜。2.2.5重组pJET-PPRV-H质粒的提取及测序2.2.5.1重组pJET-PPRV-H质粒的提取从4℃冰箱取出pJET-PPRV-H，A，Top10平板，挑选平板上的单菌落于5mL（含有100μg/mL氨苄青霉素的）LB培养基中，37℃恒温培养箱220rpm培养12~16h。在超净工作台中取700μL菌液，加入400μL甘油混合均匀，-80℃冻存。其余的菌液按照使用Axgen质粒小提试剂盒进行回收。2.2.5.2重组pJET-PPRV-H质粒的酶切鉴定按照表2-5酶切鉴定体系，在200μL离心管中加入反应体系各组分，然后17 将小离心管放入37℃的恒温培养箱中酶切2h。取20μL酶切产物1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为170V，17min，使用UPV紫外成像系统观察电泳结果，将酶切结果正确的质粒送上海铂尚生物技术有限公司测序，酶切体系如下：表2-5重组pJET-PPRV-H质粒的鉴定Table2-5TheidentificationofrecombinantpJET-PPRV-Hplasmid反应体系各组分各组分体积（μL）Water，nuclease-free1510×FastDigestGreenBuffer2pJET-PPRV-HplasmidDNA2FastDigestNdeⅠ0.5FastDigestXhol0.52.2.6表达载体的构建按照表2-6，2-7分别酶切表达载体和H基因片段，使用Axgen胶回收试剂盒，回收pET28a，pET30a，pET32a表达载体和H基因。按照表2-8连接体系，22℃连接1h：表2-6pET30a载体的酶切Table2-6ThedigestionofexpressionvectorpET30a反应体系各组分各组分体积（μL）Water，nuclease-free2010×FastDigestGreenBuffer5PET28a（30a，32a）plasmidDNA20FastDigestNdeⅠ2.5FastDigestXhol2.5表2-7pJET-PPRV-H质粒的酶切Table2-7ThedigestionofplasmidrecombinantpJET-PPRV-H反应体系各组分各组分体积（μL）Water，nuclease-free2010×FastDigestGreenBuffer5pJET-PPRV-HplasmidDNA20FastDigestNdeⅠ2.5FastDigestXhol2.518 表2-8表达载体和目的片段连接体系Table2-8Theconnectionofexpressionvectorandtargetfragment反应体系各组分各组分的体积（μL）10×T4ligaseBuffer1pET28a（30a，32a）expressionVector2PPRV-H胶回收片段6PEG40001T4ligase1将连接产物按照2.2.4和2.2.5的方法转化感受态细胞，提取质粒，酶切鉴定，取20μL酶切产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为170V，17min，使用UPV紫外成像系统观察电泳结果，酶切结果正确的质粒送上海铂尚生物技术有限公司测序。2.2.7重组His-H蛋白的诱导及检测2.2.7.1重组His-H蛋白的诱导将测序正确的质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞，挑选单菌落于5mL（含有50μg/mL卡那霉素）LB培养基中，37℃恒温摇床，220rpm培养12~16h。按照1∶100的接种量转接于新鲜的5mL（含有50μg/mL的卡那霉素）LB培养基中，37℃培养至OD600约为0.5~0.6时，加入IPTG浓度为（0.2mmol/L，0.4mmol/L，0.6mmol/L，0.8mmol/L，1mmol/L，37℃，220rpm分别诱导（2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h）。诱导完成后，收集诱导后的菌体，12000rpm离心2~3min，弃尽上清，加入适量的ddH2O重悬，加入等体积的2×LoadingBuffer混匀。2.2.7.2重组His-H蛋白的SDS-PAGE电泳使用厚度1.0mm的胶板配制15%的分离胶，加入分离胶5mL，配方见附件1。待分离胶和水出现明显的分层后，加入5%的浓缩胶，插入1.0mm梳子。取5μL处理后（沸水煮5min，12000rpm离心3min）后的蛋白样品，加到梳子孔中，浓缩胶80V电泳，待样品进入分离胶后，120V电泳，电泳完成后，考马斯亮蓝R250染色3h。染色完成后脱色4h。2.2.7.3重组His-H蛋白的鉴定取诱导的蛋白，沸水煮沸5min，12000rpm离心3min，进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳。电泳完成后，将切成4.5mm×8.4mm大小的蛋白胶，100%的无水甲醇浸泡5s预处理PVDF膜，4块相同大小的转膜专用滤纸，浸泡于转膜液中。将蛋白胶，滤纸，PVDF膜，滤纸，按照由上到下的顺序依次放置于半干转电转19 仪上，除去气泡。12V电转1h后，用镊子取出PVDF膜放置于培养皿中，用TBST溶液洗膜3次，每次5min。然后使用5%的脱脂奶粉4℃封闭过夜。再用TBST溶液洗膜3次，每次5min，洗尽脱脂奶粉。加入稀释2000倍的抗His-tag的单克隆抗体作为一抗，室温下置于摇床上缓慢摇动，反应1h。使用TBST溶液洗膜5次，每次15min。使用稀释20000倍的HRP标记的山羊抗鼠IgG室温下置于摇床上作用1h。用TBST溶液洗膜6次，每次15min。将膜取出，控干表面TBST溶液，加入Pro-light发光（A+B）混合试剂后，将膜置于暗盒中，在暗室内放入感光胶片，曝光10min，显影10min，之后于定影液中放置10min。2.2.8重组His-H蛋白的大量诱导以及检测2.2.8.1重组His-H蛋白的大量诱导挑选阳性克隆于5mL（含有50μg/mL卡那霉素）LB培养基中，37℃，220rpm培养12~16h。按照1∶100的接种量转接于新的100mL（含有50μg/mL的卡那霉素）LB培养基中，37℃培养至OD600为0.5~0.6时，加入IPTG终浓度为1mmol/L，37℃，220rpm诱导5h。菌液诱导完成后，使用低温离心机，12000rpm，4℃，离心10min，弃尽上清，按照每克菌体湿重加入10mL的PBS比例重悬后，超声破碎20min（超声3s，停5s），12000rpm，4℃离心15min，沉淀使用与上清同体积的PBS重悬后，分别取200μL的上清和沉淀重悬液加入200μL的2×LoadingBuffer，2.2.8.2大量诱导蛋白His-H的SDS-PAGE电泳按照1.1.7.2方法，配制蛋白胶。取2μL处理后（沸水煮5min，12000rpm离心3min）大量诱导的蛋白样品，加到梳子孔中，浓缩胶80V电泳，待样品进入分离胶后，120V电泳，电泳完成后，考马斯亮蓝R250染色3h。染色完成后脱色4h，拍照。2.2.8.3大量诱导蛋白His-H的检测取诱导的蛋白，沸水煮沸5min，12000rpm离心3min，进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳。电泳完成后进行Westernblot检测，使用稀释2000倍的抗His-tag的单克隆抗体作为一抗，用稀释20000倍的HRP标记的山羊抗鼠IgG作为二抗。2.2.9重组蛋白His-H的纯化及检测2.2.9.1透析袋的预先处理将透析袋剪成适当的长度（12cm左右）将透析袋放置于2%（W/V）的碳酸氢钠和1mmol/LEDTA(pH8.0)的混合溶液中，沸水浴煮沸10min。使用双蒸彻底清洗透析袋，洗尽残留的溶液，置于pH为8.0的1mmol/L的EDTA溶液中煮沸10min。室温充分冷却后，存放于4℃冰箱，必须确保透析袋始终浸没在PBS缓冲液内。20 2.2.9.2重组蛋白His-H的纯化回收使用厚度为1.5mm的胶板配制15%的分离胶，加入分离胶5mL，待分离胶和水出现明显的分层后，加入1mL的5%的浓缩胶，不插入梳子，浓缩胶上加水平衡。大量诱导的蛋白样品沸水煮5min，12000rpm离心3min，取400μL样品，加到浓缩胶上，浓缩胶80V电泳，待样品进入分离胶后120V电泳，电泳完成后，使用0.25M的KCl溶液，4℃，染色10min，目的条带被染成白色，使用手术刀片割取目的条带，切成2mm大小的小块，将小胶块放入提前处理的透析袋，四块蛋白胶加入6mL左右的PBS溶液以维持一定的离子浓度，放置于核酸电泳的电泳槽内，60V电泳120min，反向15min。2.2.9.3纯化蛋白His-H的SDS-PAGE电泳电泳完成后，取出含有蛋白的PBS溶液，保存于-20℃冰箱内。取20μL的PBS溶液加入20μL的2×LoadingBuffer，混匀后沸水煮5min，进行SDS-PAGE电泳检测。2.2.9.4纯化蛋白His-H的检测Westernblot使用稀释2000倍的抗His标签单克隆抗体作为一抗，二抗用HRP标记的山羊抗鼠IgG。2.2.9.5纯化His-H蛋白的浓度检测取Westernblot条带单一的纯化蛋白His-H，使用Thermoscientific公司的BCA蛋白浓度测试试剂盒，按照说明书进行蛋白浓度测定。将已经测定浓度的割胶纯化蛋白，加入透析袋中，按照浓缩倍数使用PEG4000进行浓缩，浓缩完成后，使用BCA蛋白浓度测试试剂盒，按照说明书测定浓缩后的蛋白浓度，使第一次免疫，第三次免疫，第四次免疫的终浓度达到1mg/mL，第二次免疫的终浓度2mg/mL。2.2.10新西兰大白兔的免疫新西兰大白兔饲养一周后进行免疫，免疫前，耳缘静脉抽取2mL置于离心管中，离心管倾斜45度放置4℃冰箱过夜，5000rpm离心收取血清。将浓缩的纯化蛋白His-H和等量的弗氏完全佐剂分别缓慢吸入两个注射器内（注意不要有气泡），两个注射器外面用一根长约5cm的无菌无毒塑料管连接在一起（注意连接过程中，注射器，管子中间不能有气泡），缓缓推动注射器，使注射器内的抗原蛋白和弗氏完全佐剂混合形成油包水乳剂为止。将混合均匀的乳剂取少量滴在双蒸水表面，混合均匀的乳剂滴在水面上应该保持乳剂珠的完整；混合完成后，然后使用1mL注射器分装成1mL/每管[66]，使用PBS溶液作为阴性对照。第一次免疫剂量500μg/mL，间隔一周后，耳缘静脉采血2mL置于离心管中，4℃冰箱倾斜45℃放置过夜，5000rpm离心收取血清，两周后进行加强免疫，将21 2mg/mL浓缩后的纯化蛋白和等量的弗氏不完全佐剂免疫乳化完全，皮下注射免疫。间隔一周后采血，第二次免疫两周后，同样方法进行第三次免疫，第三次免疫两周后进行第四次免疫。通过间接ELISA检测抗体水平，效价达到预期水平后，采用无菌技术，颈动脉全放血，4℃冰箱，倾斜45℃放置过夜，待血液凝固后，第二天，分离血清，把血清进行离心沉淀，弃掉红血球，再分装成1mL/每管，-80℃保存[67]。2.2.11抗体滴度的测定2.2.11.1兔子的抗体水平的检测采用间接ELISA方法，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒，测定纯化蛋白His-H的浓度。按照包被终浓度蛋白为1ug/mL的浓度，用CBS碳酸缓冲液(0.05mol/L,pH9.6)稀释，并包被到96孔酶标板，4℃包被过夜。使用PBST溶液清洗96孔酶标板3~5次，加入250μL含5%脱脂奶粉的PBST溶液，置于37℃培养箱封闭1h，用PBST溶液清洗96孔酶标板3~5次。加入100μL按照1∶400倍稀释后的血清（不同的免疫时间），37℃作用1h。PBST清洗3-5次，加入100μL按照1：5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG。37℃作用45min。洗板3-5次，加入100μLTMB底物显色液(天跟TMB)，37℃，15min避光保存，加入100μL的2M硫酸终止液，5min以内读OD450nm，时间太久，读取的数值会下降。2.2.11.2抗体滴度的检测方法同2.2.11.1，使用的一抗为稀释100倍（依次倍比稀释，直至1∶25600）的第4次免疫后的血清。二抗为稀释5000倍的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG。2.2.12兔子血清的特异性检测取诱导不同时间段的蛋白，进行SDS-PAGE电泳，电泳完成后进行Westernblot检测，一抗使用稀释2000倍的免疫新西兰大白兔得到的血清，二抗使用稀释5000倍的HRP山羊抗兔IgG。2.2.13H蛋白表位的筛选2.2.13.116肽基因片段的合成根据GenBank登陆的China/Tibet/Geg/07-30H蛋白基因序列，设计互补的序列可表达16个氨基酸残基的H蛋白短片段（共75组，1F-74F包含有16个氨基酸残基，75F位于H蛋白C端最末端，包含17个氨基酸残基），相邻的片段之，，间重叠8个氨基酸残基，且在5端含有BamHI酶切位点，3端含有TAA-SalI酶切位点。设计序列由上海生工合成。合成示意图如：22 图2-916肽片段基因的合成Fig.2-9Thesynthesisof16peptidesgene表2-1016肽片段合成的基因序列Table2-10Thegenesequencesofsynthesis16peptide短肽名称合成16肽片段的基因序列（方向5’→3’）P76-1FGATCCATGAGCGCGCAACGGGAACGTATAAACGCCTTCTACAAGGACAATCCCTAAGP76-1RTCGACTTAGGGATTGTCCTTGTAGAAGGCGTTTATACGTTCCCGTTGCGCGCTCATGP76-2FGATCCAACGCCTTCTACAAGGACAATCCCCATAATAAGAACCACCGTGTGATATAAGP76-2RTCGACTTATATCACACGGTGGTTCTTATTATGGGGATTGTCCTTGTAGAAGGCGTTGP76-3FGATCCCATAATAAGAACCACCGTGTGATATTAGACCGCGAGCGCCTGGTGATATAAGP76-3RTCGACTTATATCACCAGGCGCTCGCGGTCTAATATCACACGGTGGTTCTTATTATGGP76-4FGATCCTTAGACCGCGAGCGCCTGGTGATAGAACGCCCGTATATTCTGCTGGGCTAAGP76-4RTCGACTTAGCCCAGCAGAATATACGGGCGTTCTATCACCAGGCGCTCGCGGTCTAAGP76-5FGATCCGAACGCCCGTATATTCTGCTGGGCGTGCTTTTAGTTATGTTTTTATCCTAAGP76-5RTCGACTTAGGATAAAAACATAACTAAAAGCACGCCCAGCAGAATATACGGGCGTTCGP76-6FGATCCGTGCTTTTAGTTATGTTTTTATCCTTGATTGGGCTTCTGGCGATTGCGTAAGP76-6RTCGACTTACGCAATCGCCAGAAGCCCAATCAAGGATAAAAACATAACTAAAAGCACGP76-7FGATCCTTGATTGGGCTTCTGGCGATTGCGGGGATACGTCTGCATCGTGCTACTTAAGP76-7RTCGACTTAAGTAGCACGATGCAGACGTATCCCCGCAATCGCCAGAAGCCCAATCAAGP76-8FGATCCGGGATACGTCTGCATCGTGCTACTGTGGGCACGAGCGAAATTCAGAGCTAAGP76-8RTCGACTTAGCTCTGAATTTCGCTCGTGCCCACAGTAGCACGATGCAGACGTATCCCGP76-9FGATCCGTGGGCACGAGCGAAATTCAGAGCCGGTTGAATACTAACATAAAACTGTAAGP76-9RTCGACTTACAGTTTTATGTTAGTATTCAACCGGCTCTGAATTTCGCTCGTGCCCACGP76-10FGATCCCGGTTGAATACTAACATAAAACTGGCAGAAAGCATAGATCATCAGACCTAAG23 P76-10RTCGACTTAGGTCTGATGATCTATGCTTTCTGCCAGTTTTATGTTAGTATTCAACCGGP76-11FGATCCGCAGAAAGCATAGATCATCAGACCAAGGATGTGCTGACCCCGCTTTTTTAAGP76-11RTCGACTTAAAAAAGCGGGGTCAGCACATCCTTGGTCTGATGATCTATGCTTTCTGCGP76-12FGATCCAAGGATGTGCTGACCCCGCTTTTTAAGATCATTGGCGACGAGGTAGGGTAAGP76-12RTCGACTTACCCTACCTCGTCGCCAATGATCTTAAAAAGCGGGGTCAGCACATCCTTGP76-13FGATCCAAGATCATTGGCGACGAGGTAGGGATTCGGATTCCGCAGAAGTTTTCCTAAGP76-13RTCGACTTAGGAAAACTTCTGCGGAATCCGAATCCCTACCTCGTCGCCAATGATCTTGP76-14FGATCCATTCGGATTCCGCAGAAGTTTTCCGATCTGGTGAAGTTTATAAGCGACTAAGP76-14RTCGACTTAGTCGCTTATAAACTTCACCAGATCGGAAAACTTCTGCGGAATCCGAATGP76-15FGATCCGATCTGGTGAAGTTTATAAGCGACAAGATTAAGTTTCTGAACCCGGATTAAGP76-15RTCGACTTAATCCGGGTTCAGAAACTTAATCTTGTCGCTTATAAACTTCACCAGATCGP76-16FGATCCAAGATTAAGTTTCTGAACCCGGATCGCGAATATGATTTCCGTGATCTTTAAGP76-16RTCGACTTAAAGATCACGGAAATCATATTCGCGATCCGGGTTCAGAAACTTAATCTTGP76-17FGATCCCGCGAATATGATTTCCGTGATCTTCGTTGGTGTATGAATCCCCCGGAATAAGP76-17RTCGACTTATTCCGGGGGATTCATACACCAACGAAGATCACGGAAATCATATTCGCGGP76-18FGATCCCGTTGGTGTATGAATCCCCCGGAACGTGTGAAAATCAACTTTGATCAGTAAGP76-18RTCGACTTACTGATCAAAGTTGATTTTCACACGTTCCGGGGGATTCATACACCAACGGP76-19FGATCCCGTGTGAAAATCAACTTTGATCAGTTTTGCGAATACAAGGCGGCTGTCTAAGP76-19RTCGACTTAGACAGCCGCCTTGTATTCGCAAAACTGATCAAAGTTGATTTTCACACGGP76-20FGATCCTTTTGCGAATACAAGGCGGCTGTCAAGTCAATCGAACACATTTTTGAATAAGP76-20RTCGACTTATTCAAAAATGTGTTCGATTGACTTGACAGCCGCCTTGTATTCGCAAAAGP76-21FGATCCAAGTCAATCGAACACATTTTTGAAAGCCCGTTAAACAAGAGCAAGAAATAAGP76-21RTCGACTTATTTCTTGCTCTTGTTTAACGGGCTTTCAAAAATGTGTTCGATTGACTTGP76-22FGATCCAGCCCGTTAAACAAGAGCAAGAAATTGCAGTCTCTGACGCTGGGCCCTTAAGP76-22RTCGACTTAAGGGCCCAGCGTCAGAGACTGCAATTTCTTGCTCTTGTTTAACGGGCTGP76-23FGATCCTTGCAGTCTCTGACGCTGGGCCCTGGTACCGGCTGCCTTGGACGTACTTAAGP76-23RTCGACTTAAGTACGTCCAAGGCAGCCGGTACCAGGGCCCAGCGTCAGAGACTGCAAGP76-24FGATCCGGTACCGGCTGCCTTGGACGTACTGTGACAAAGGCGCATTTTAGTGAATAAGP76-24RTCGACTTATTCACTAAAATGCGCCTTTGTCACAGTACGTCCAAGGCAGCCGGTACCGP76-25FGATCCGTGACAAAGGCGCATTTTAGTGAATTAACTCTTACCCTGATGGATTTGTAAGP76-25RTCGACTTACAAATCCATCAGGGTAAGAGTTAATTCACTAAAATGCGCCTTTGTCACGP76-26FGATCCTTAACTCTTACCCTGATGGATTTGGATTTAGAAATGAAGCACAACGTGTAAGP76-26RTCGACTTACACGTTGTGCTTCATTTCTAAATCCAAATCCATCAGGGTAAGAGTTAAG24 P76-27FGATCCGATTTAGAAATGAAGCACAACGTGAGCAGTGTGTTTACAGTGGTAGAATAAGP76-27RTCGACTTATTCTACCACTGTAAACACACTGCTCACGTTGTGCTTCATTTCTAAATCGP76-28FGATCCAGCAGTGTGTTTACAGTGGTAGAAGAAGGCCTGTTCGGTCGTACCTACTAAGP76-28RTCGACTTAGTAGGTACGACCGAACAGGCCTTCTTCTACCACTGTAAACACACTGCTGP76-29FGATCCGAAGGCCTGTTCGGTCGTACCTACACCGTATGGCGGTCCGACGCACGCTAAGP76-29RTCGACTTAGCGTGCGTCGGACCGCCATACGGTGTAGGTACGACCGAACAGGCCTTCGP76-30FGATCCACCGTATGGCGGTCCGACGCACGCGACCCGAGCACGGACCTTGGCATCTAAGP76-30RTCGACTTAGATGCCAAGGTCCGTGCTCGGGTCGCGTGCGTCGGACCGCCATACGGTGP76-31FGATCCGACCCGAGCACGGACCTTGGCATCGGCCATTTTCTGCGTGTTTTTGAGTAAGP76-31RTCGACTTACTCAAAAACACGCAGAAAATGGCCGATGCCAAGGTCCGTGCTCGGGTCGP76-32FGATCCGGCCATTTTCTGCGTGTTTTTGAGATAGGACTGATCCGTGACTTAGGCTAAGP76-32RTCGACTTAGCCTAAGTCACGGATCAGTCCTATCTCAAAAACACGCAGAAAATGGCCGP76-33FGATCCATAGGACTGATCCGTGACTTAGGCTTAGGTCCGCCAGTGTTTCACATGTAAGP76-33RTCGACTTACATGTGAAACACTGGCGGACCTAAGCCTAAGTCACGGATCAGTCCTATGP76-34FGATCCTTAGGTCCGCCAGTGTTTCACATGACCAACTATCTTACAGTCAATATGTAAGP76-34RTCGACTTACATATTGACTGTAAGATAGTTGGTCATGTGAAACACTGGCGGACCTAAGP76-35FGATCCACCAACTATCTTACAGTCAATATGTCGGACGATTATCGTCGCTGTCTTTAAGP76-35RTCGACTTAAAGACAGCGACGATAATCGTCCGACATATTGACTGTAAGATAGTTGGTGP76-36FGATCCTCGGACGATTATCGTCGCTGTCTTTTGGCAGTCGGCGAACTGAAACTGTAAGP76-36RTCGACTTACAGTTTCAGTTCGCCGACTGCCAAAAGACAGCGACGATAATCGTCCGAGP76-37FGATCCTTGGCAGTCGGCGAACTGAAACTGACCGCGTTGTGTACCTCCAGCGAATAAGP76-37RTCGACTTATTCGCTGGAGGTACACAACGCGGTCAGTTTCAGTTCGCCGACTGCCAAGP76-38FGATCCACCGCGTTGTGTACCTCCAGCGAAACCGTCACCCTGAGCGAACGTGGGTAAGP76-38RTCGACTTACCCACGTTCGCTCAGGGTGACGGTTTCGCTGGAGGTACACAACGCGGTGP76-39FGATCCACCGTCACCCTGAGCGAACGTGGGGCACCCAAGCGGGAACCGCTGGTATAAGP76-39RTCGACTTATACCAGCGGTTCCCGCTTGGGTGCCCCACGTTCGCTCAGGGTGACGGTGP76-40FGATCCGCCAGCCAGGTTCAAGATGACAACTACCAGCGGTTCCCGCTTGGGTGCTAAGP76-40RTCGACTTAGCCAGCCAGGTTCAAGATGACAACTACCAGCGGTTCCCGCTTGGGTGCGP76-41FGATCCGCCAGCCAGGTTCAAGATGACAACTACCAGCGGTTCCCGCTTGGGTGCTAAGP76-41RTCGACTTAATACAGCTCTCCTCCCAGAGTGGGGCCAGCCAGGTTCAAGATGACAACGP76-42FGATCCCCCACTCTGGGAGGAGAGCTGTATAGTGTGCTGCCGACCAGCGATCTGTAAGP76-42RTCGACTTACAGATCGCTGGTCGGCAGCACACTATACAGCTCTCCTCCCAGAGTGGGGP76-43FGATCCAGTGTGCTGCCGACCAGCGATCTGATGGTGGAGAAGTTATATCTGAGCTAAG25 P76-43RTCGACTTAGCTCAGATATAACTTCTCCACCATCAGATCGCTGGTCGGCAGCACACTGP76-44FGATCCATGGTGGAGAAGTTATATCTGAGCTCCCATCGGGGTATAATCAAAGACTAAGP76-44RTCGACTTAGTCTTTGATTATACCCCGATGGGAGCTCAGATATAACTTCTCCACCATGP76-45FGATCCTCCCATCGGGGTATAATCAAAGACGATGAAGCGAATTGGGTGGTGCCGTAAGP76-45RTCGACTTACGGCACCACCCAATTCGCTTCATCGTCTTTGATTATACCCCGATGGGAGP76-46FGATCCGATGAAGCGAATTGGGTGGTGCCGAGTACCGACGTGCGTGACCTTCAATAAGP76-46RTCGACTTATTGAAGGTCACGCACGTCGGTACTCGGCACCACCCAATTCGCTTCATCGP76-47FGATCCAGTACCGACGTGCGTGACCTTCAAAACAAGGGCGAATGCTTAGTAGAGTAAGP76-47RTCGACTTACTCTACTAAGCATTCGCCCTTGTTTTGAAGGTCACGCACGTCGGTACTGP76-48FGATCCAACAAGGGCGAATGCTTAGTAGAGGCGTGCAAGACTCGTCCGCCTTCCTAAGP76-48RTCGACTTAGGAAGGCGGACGAGTCTTGCACGCCTCTACTAAGCATTCGCCCTTGTTGP76-49FGATCCGCGTGCAAGACTCGTCCGCCTTCCTTTTGTAATGGCACGGGCAGCGGTTAAGP76-49RTCGACTTAACCGCTGCCCGTGCCATTACAAAAGGAAGGCGGACGAGTCTTGCACGCGP76-50FGATCCTTTTGTAATGGCACGGGCAGCGGTCCTTGGAGCGAAGGCCGTATTCCATAAGP76-50RTCGACTTATGGAATACGGCCTTCGCTCCAAGGACCGCTGCCCGTGCCATTACAAAAGP76-51FGATCCCCTTGGAGCGAAGGCCGTATTCCAGCGTATGGGGTGATACGGGTATCATAAGP76-51RTCGACTTATGATACCCGTATCACCCCATACGCTGGAATACGGCCTTCGCTCCAAGGGP76-52FGATCCGCGTATGGGGTGATACGGGTATCACTGGACTTGGCGAGTGACCCGGACTAAGP76-52RTCGACTTAGTCCGGGTCACTCGCCAAGTCCAGTGATACCCGTATCACCCCATACGCGP76-53FGATCCCTGGACTTGGCGAGTGACCCGGACGTCGTCATAACGAGCGTTTTCGGGTAAGP76-53RTCGACTTACCCGAAAACGCTCGTTATGACGACGTCCGGGTCACTCGCCAAGTCCAGGP76-54FGATCCGTCGTCATAACGAGCGTTTTCGGGCCACTGATTCCACATCTTAGCGGCTAAGP76-54RTCGACTTAGCCGCTAAGATGTGGAATCAGTGGCCCGAAAACGCTCGTTATGACGACGP76-55FGATCCCCACTGATTCCACATCTTAGCGGCATGGACTTATACAACAACCCCTTTTAAGP76-55RTCGACTTAAAAGGGGTTGTTGTATAAGTCCATGCCGCTAAGATGTGGAATCAGTGGGP76-56FGATCCATGGACTTATACAACAACCCCTTTAGCCGGGCTATATGGTTGGCTGTCTAAGP76-56RTCGACTTAGACAGCCAACCATATAGCCCGGCTAAAGGGGTTGTTGTATAAGTCCATGP76-57FGATCCAGCCGGGCTATATGGTTGGCTGTCCCACCGTACGAGCAATCCTTCTTATAAGP76-57RTCGACTTATAAGAAGGATTGCTCGTACGGTGGGACAGCCAACCATATAGCCCGGCTGP76-58FGATCCCCACCGTACGAGCAATCCTTCTTAGGCATGATAAATACGATTGGTTTCTAAGP76-58RTCGACTTAGAAACCAATCGTATTTATCATGCCTAAGAAGGATTGCTCGTACGGTGGGP76-59FGATCCGGCATGATAAATACGATTGGTTTCCCGAACCGTGCCGAAGTGATGCCGTAAGP76-59RTCGACTTACGGCATCACTTCGGCACGGTTCGGGAAACCAATCGTATTTATCATGCCG26 P76-60FGATCCCCGAACCGTGCCGAAGTGATGCCGCATATACTGACCACCGAGATTCGGTAAGP76-60RTCGACTTACCGAATCTCGGTGGTCAGTATATGCGGCATCACTTCGGCACGGTTCGGGP76-61FGATCCCATATACTGACCACCGAGATTCGGGGACCACGGGGACGGTGCCACGTCTAAGP76-61RTCGACTTAGACGTGGCACCGTCCCCGTGGTCCCCGAATCTCGGTGGTCAGTATATGGP76-62FGATCCGGACCACGGGGACGGTGCCACGTCCCGATTGAACTGAGCCGCCGTGTTTAAGP76-62RTCGACTTAAACACGGCGGCTCAGTTCAATCGGGACGTGGCACCGTCCCCGTGGTCCGP76-63FGATCCCCGATTGAACTGAGCCGCCGTGTTGATGATGACATTAAGATTGGCAGCTAAGP76-63RTCGACTTAGCTGCCAATCTTAATGTCATCATCAACACGGCGGCTCAGTTCAATCGGGP76-64FGATCCGATGATGACATTAAGATTGGCAGCAATATGGTGATTCTGCCTACCATGTAAGP76-64RTCGACTTACATGGTAGGCAGAATCACCATATTGCTGCCAATCTTAATGTCATCATCGP76-65FGATCCAATATGGTGATTCTGCCTACCATGGACCTGCGCTACATAACAGCCACCTAAGP76-65RTCGACTTAGGTGGCTGTTATGTAGCGCAGGTCCATGGTAGGCAGAATCACCATATTGP76-66FGATCCGACCTGCGCTACATAACAGCCACCTATGATGTGAGTCGGTCAGAACATTAAGP76-66RTCGACTTAATGTTCTGACCGACTCACATCATAGGTGGCTGTTATGTAGCGCAGGTCGP76-67FGATCCTATGATGTGAGTCGGTCAGAACATGCGATAGTGTACTACATTTACGATTAAGP76-67RTCGACTTAATCGTAAATGTAGTACACTATCGCATGTTCTGACCGACTCACATCATAGP76-68FGATCCGCGATAGTGTACTACATTTACGATACCGGCCGTTCAAGCAGCTACTTCTAAGP76-68RTCGACTTAGAAGTAGCTGCTTGAACGGCCGGTATCGTAAATGTAGTACACTATCGCGP76-69FGATCCACCGGCCGTTCAAGCAGCTACTTCTATCCGGTACGGCTGAACTTCAAGTAAGP76-69RTCGACTTACTTGAAGTTCAGCCGTACCGGATAGAAGTAGCTGCTTGAACGGCCGGTGP76-70FGATCCTATCCGGTACGGCTGAACTTCAAGGGAAATCCGCTGAGTCTGCGTATATAAGP76-70RTCGACTTATATACGCAGACTCAGCGGATTTCCCTTGAAGTTCAGCCGTACCGGATAGP76-71FGATCCGGAAATCCGCTGAGTCTGCGTATAGAATGTTTTCCTTGGCGGCATAAGTAAGP76-71RTCGACTTACTTATGCCGCCAAGGAAAACATTCTATACGCAGACTCAGCGGATTTCCGP76-72FGATCCGAATGTTTTCCTTGGCGGCATAAGGTTTGGTGTTATCACGATTGCCTGTAAGP76-72RTCGACTTACAGGCAATCGTGATAACACCAAACCTTATGCCGCCAAGGAAAACATTCGP76-73FGATCCGTTTGGTGTTATCACGATTGCCTGATTTACAATACTATAACGGATGAATAAGP76-73RTCGACTTATTCATCCGTTATAGTATTGTAAATCAGGCAATCGTGATAACACCAAACGP76-74FGATCCATTTACAATACTATAACGGATGAAGAGGTCCACACCCGTGGCCTGACCTAAGP76-74RTCGACTTAGGTCAGGCCACGGGTGTGGACCTCTTCATCCGTTATAGTATTGTAAATGP76-75FGATCCGAGGTCCACACCCGTGGCCTGACCGGCATTGAAGTGACCTGTAACCCGGTGTAAGP76-75RTCGACTTACACCGGGTTACAGGTCACTTCAATGCCGGTCAGGCCACGGGTGTGGACCTCG12000rpm离心10min，缓慢打开管盖，按照片段说明书加入适量的DEPC27 水，稀释成10mM的溶液，漩涡充分震荡10min，12000rpm离心，室温放置10min，然后将对应序列的反向的片段加入正向的片段中，漩涡振荡器充分震荡混匀，95℃水浴锅加热15min，待离心管自然冷却至室温，将合成的片段-20℃冰箱保存。2.2.13.2pXXGET-3载体的回收使用限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ，按照表2-11酶切体系所示酶切载体pXXGST-3,使用Axgen凝胶回收试剂盒回收PXXGST-3载体。表2-11pXXGST-3载体酶切Table2-11ThedigestionofexpressionvectorpXXGST-3反应体系各组分各组分体积（μL）Water，nuclease-free2010×FastDigestGreenBuffer5pXXGST-3plasmidDNA20FastDigestBamHⅠ2.5FastDigestSalⅠ2.52.2.13.3表达载体pXXGET-3-P76-（1F~75F）的构建按照表2-12，将表达载体pXXGET-3和16肽合成基因进行连接，反应体系如下：表2-12表达载体pXXGST-3和目的片段连接Table2-12TheconnectionofexpressionvectorpXXGST-3and16peptidesynthesisgene反应体系各组分各组分的体积（μL）10×T4ligaseBuffer1pXXGST-3expressionVector216肽合成的基因片段6PEG40001T4ligase1将连接产物按照2.2.4和2.2.5的方法转化感受态细胞，使用Axgen质粒小提试剂盒提取pXXGST-3-P76-（1F~75F)质粒，并按照表2-13的体系进行酶切鉴定，挑取酶切条带正确的质粒，送上海铂尚生物技术有限公司测序。28 表2-13pXXGST-3-P76-（1F-75F）质粒鉴定Table2-13TheidentificationofplasmidpXXGST-3-P76-（1F-75F）反应体系各组分各组分体积（μL）Water，nuclease-free2010×FastDigestGreenBuffer5pXXGST-3-P76-（1F-75F）plasmidDNA2FastDigestEcoRⅠ0.5FastDigestSalⅠ0.52.2.13.416肽蛋白GST-1F~GST-75F的诱导将测序正确的质粒转化BL21感受态细胞，挑选阳性克隆于5mL（含有100μg/mL氨苄青霉素）的LB培养基中，37℃，220rpm培养12~16h。按照接种量1:100转接于5mL（含有100μg/mL的氨苄青霉素）LB培养基中，37℃培养至OD600为0.5~0.6时，调节温度42℃，220rpm分别诱导5h。收集诱导后的菌体，12000rpm离心3min，弃上清，加入适量的ddH2O重悬，加入等体积的2×LoadingBuffer，混匀后沸水煮5min，进行SDS-PAGE电泳检测。2.2.13.5阳性16肽片段的筛选取诱导的蛋白，沸水煮沸5min，12000rpm离心3min，进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，电泳完成后进行Westernblot检测，一抗使用免疫新西兰大白兔得到的免疫血清，二抗使用稀释5000倍的HRP山羊抗兔IgG。29 3结果与分析3.1小反刍兽疫病毒H基因的PCR扩增以通过融合PCR合成的PPRV-H为模版，PCR扩增H基因片段，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图3-1所示：bp20001000750500250100M1图3-1PPRV-H基因PCR扩增Fig.3-1TheamplificationofPPRV-HbyPCRM.标准分子量（DL2000）；1.H基因的PCR产物M．MarkerDL2000;1.ThePCRproductsofPPRV-H;图3-1显示，PCR产物在1830bp左右出现特异性条带，这与本实验室保存的通过融合PCR人工合成的的H基因大小一致。3.2重组克隆质粒酶切鉴定将上述PCR产物琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化，连接至pJET1.2/blunt克隆载体并转化E.coliTop10感受态细胞。将提取的pJET1.2/blunt-PPRV-H质粒进行双酶切鉴定，取20μL双酶切的产物，琼脂糖凝胶电泳分析，结果见下图：bp2000100075050025010012M图3-2阳性克隆质粒的酶切鉴定Fig.3-2Thedigestionidentificationofpositiveplasmid1.pJET1.2/blunt-PPRV-H-PPRV-H-1;2.pJET1.2/blunt-PPRV-H-PPRV-H-2;M.标准分子量（DL2000）1.pJET1.2/blunt-PPRV-H-PPRV-H-1;2.pJET1.2/blunt-PPRV-H-PPRV-H-2;M.MarkerDL200030 图3-2表明：重组克隆质粒pJET1.2/blunt-PPRV-H的双酶切产物在1830bp左右出现与目的条带大小相同的条带，将重组克隆质粒送上海博尚生物技术有限公司测序。3.3重组表达质粒菌液PCR及酶切鉴定：3.3.1重组表达质粒菌液PCR鉴定取少量菌液进行菌液PCR，将菌液PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图3-3所示：bp20001000750500250100M12345图3-3重组质粒的菌液PCR鉴定Fig.3-3ThebacterialiquidPCRofrecombinantplasmidM.标准分子量（DL2000）；1.阴性对照（以水为模版）；2.阳性对照；3.pET28-PPRV-H；4.pET30-PPRV-H；5.pET32-PPRV-HM.markerDL2000;1.Negativecontrol;2.Positivecontrol;3.BacterialiquidPCRofpET28a-PPRV-H;4.BacterialiquidPCRofpET30a-PPRV-H;5.BacterialiquidPCRofpET32a-PPRV-H图3-3显示，pET28a-PPRV-H，pET30a-PPRV-H和pET32a-PPRV-H菌液PCR产物在1830bp左右出现与目的条带大小相同的条带。3.3.2重组表达质粒的酶切鉴定挑取菌液PCR正确的提质粒，将提取的质粒pET28a-PPRV-H，pET30a-PPRV-H，pET32a-PPRV-H与pJET1.2/blunt-PPRV-H-PPRV-H分别进行双酶切鉴定，将双酶切的产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图3-4所示：31 bp20001000750500250100M1234567图3-4阳性质粒的酶切鉴定Fig.3-4ThedigestionidentificationofpositiveplasmidM:标准分子量（DL2000）；1.阴性对照（以水为模版）；2.阳性对照；3.pJET--PPRV-H；4.pET28-PPRV-H；5.pMD18T-PPRV-H；6.pET30-PPRV-H；7.pET32-PPRV-HM.markerDL2000;1.Negativecontrol;2.Positivecontrol;3.DoubledigestionofpJET1.2/blunt-PPRV-H;4.DoubledigestionofpET28a-PPRV-H;5.DoubledigestionofpMD18T-PPRV-H;6.DoubledigestionofpET30a-PPRV-H;7.DoubledigestionofpET32a-PPRV-H图3-4显示，pJET1.2/blunt-PPRV-H，pET28a-PPRV-H，pMD18T-PPRV-H，pET30a-PPRV-H和pET32a-PPRV-H酶切产物在1830bp左右出现与目的条带大小相同的条带，将酶切结果正确的pET28a-PPRV-H，pET30a-PPRV-H和pET32a-PPRV-H质粒送上海博尚生物技术有限公司测序。3.4重组蛋白His-H表达条件的优化将测序鉴定正确的重组质粒pET30a-PPRV-H转化感受态细E.coliBL21。以1mmol/LIPTG37℃诱导不同时间（3h，4h，5h，6h，7h，8h，9h），结果见下图3-5：kD94.466.2433122M1234567832 kD94.466.2433122M132910图3-5H蛋白不同时间的表达Fig.3-5DifferenttimeofexpressionofHis-HM.蛋白标准分子量marker；1.pET30a空载表达；2.His-H蛋白诱导前；3.His-H蛋白未诱导；4.His-H蛋白诱导3h；5.His-H蛋白诱导4h；6.His-H蛋白诱导5h；7.His-H蛋白诱导6h；8.His-H蛋白诱导7h；9.His-H蛋白诱导8h；10.His-H蛋白诱导9hM.ProteinmolecularweightStandard;1.pET30avectorafterinduction;2.His-Hbeforeinduction;3.His-Hwithoutinduction;4.His-H,3hinduction;5.His-H,4hinduction;6.His-H,5hinduction;7.His-H,6hinduction;8.His-H,7hinduction;9.His-H,8hinduction;10.His-H,9hinduction;图3-5表明，重组H蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达，在1-5h，随着时间的增加，蛋白表达量增加。然而，诱导时间超过5h后，由于培养基营养物质的不足，导致蛋白增加量逐渐减低，但蛋白总量基本维持平衡，所以，选择诱导5h为诱导条件。3.5重组蛋白His-H的Westernblot分析首先利用抗His-tag单克隆抗体通过Westernblot验证了重组表达的His-H蛋白，结果见下图3-6：M12345678图3-6Westernblot分析H蛋白不同时间的表达Fig.3-6WesternblotanalysisofdifferenttimeoftheexpressionofHis-HM.蛋白标准分子量marker；1.pET30a空载表达；2.His-H蛋白诱导前；3.His-H蛋白未诱导；4.His-H蛋白诱导3h；5.His-H蛋白诱导4h；6.His-H蛋白诱导5h；7.His-H蛋白诱导6h；8.His-H蛋白诱导7h;M.ProteinmolecularweightStandard;1.pET30avectorafterinduction;2.His-Hbeforeinduction;3.His-Hwithoutinduction;4.His-H,3hinduction;5.His-H,4hinduction;6.His-H,5hinduction;7.His-H,6hinduction;8.His-H,7hinduction;33 由图3-6可知：His-H表达蛋白可以和anti-His的单克隆抗体发生阳性反应，证明H蛋白成功表达。3.6重组蛋白His-H包涵体的SDA-PAGE及Westernblot分析按照蛋白表达的优化条件，5h，1mmol/LIPTG，诱导His-H大量表达，表达蛋白进行蛋白电泳以及Westernblot分析图示结果如下图所示：kD94.466.2433122M123456M123456图3-7SDS-PAGE蛋白电泳及Westernblot分析大量表达的H蛋白Fig.3-7SDS-PAGEandWesternblotanalysisofabundantlyexpressedofHis-HM.蛋白标准分子量marker；1.pET30a空载表达；2.His-H蛋白诱导3h；3.His-H蛋白诱导4h；4.His-H蛋白诱导5h；5.His-H蛋白超声破碎后上清；6.His-H蛋白超声破碎后沉淀M.ProteinmolecularweightStandard;1.pET30avectorafterinduction2.His-H,3hinduction;3.His-H,4hinduction;4.His-H,5hinduction;5.ThesupernatantofultrasonicdisruptionofHis-Hprotein;6.TheprecipitationofultrasonicdisruptionofHis-Hprotein.图3-7表明大量表达蛋白主要存在于超声破碎后的沉淀中，以包涵体的形式存在。3.7重组蛋白His-H包涵体的洗涤条件优化His-H大量表达蛋白的包涵体经过不同浓度的尿素溶液洗涤，结果见下图3-8：kDkD94.494.466.266.2434331312222M1234567M91011121314151634 kD94.466.2433122M171819202122图3-8His-H重组蛋白包涵体洗涤Fig.3-8WashofinclusionbodyofHis-HM.蛋白标准分子量marker；1.His-H蛋白第1次洗涤沉淀；2.His-H蛋白第1次洗涤上清；3.His-H蛋白第2次洗涤沉淀；4.His-H蛋白第2次洗涤上清；5.His-H蛋白第3次洗涤沉淀；6.His-H蛋白第3次洗涤上清；7.His-H蛋白第4次洗涤沉淀；8.His-H蛋白第4次洗涤上清；9.His-H蛋白第5次洗涤沉淀；10.His-H蛋白第5次洗涤上清；11.His-H蛋白第6次洗涤沉淀；12.His-H蛋白第6次洗涤上清；13.His-H蛋白第7次洗涤沉淀；14.His-H蛋白第7次洗涤上清；15.His-H蛋白第8次洗涤沉淀；16.His-H蛋白第8次洗涤上清；17.His-H蛋白第9次洗涤沉淀；18.His-H蛋白第9次洗涤上清；19.His-H蛋白第10次洗涤沉淀；20.His-H蛋白第10次洗涤上清；21.His-H蛋白第11次洗涤沉淀；22.His-H蛋白第11次洗涤上清M.ProteinmolecularweightStandard;1.Theprecipitationofthefirstwashofinclusionbody;2.Thesupernatantofthefirstwashofinclusionbody;3.Theprecipitationofthe2ndwashofinclusionbody;4.Thesupernatantofthe2ndwashofinclusionbody;5.Theprecipitationofthe3ndwashofinclusionbody;6.Thesupernatantofthe3ndwashofinclusionbody;7.Theprecipitationofthe4ndwashofinclusionbody;8.Thesupernatantofthe4ndwashofinclusionbody;9.Theprecipitationofthe5ndwashofinclusionbody;10.Thesupernatantofthe5ndwashofinclusionbody;11.Theprecipitationofthe6ndwashofinclusionbody;12.Thesupernatantofthe6ndwashofinclusionbody;13.Theprecipitationofthe7ndwashofinclusionbody;14.Thesupernatantofthe7ndwashofinclusionbody;15.Theprecipitationofthe8ndwashofinclusionbody;16.Thesupernatantofthe8ndwashofinclusionbody;17.Theprecipitationofthe9ndwashofinclusionbody;18.Thesupernatantofthe9ndwashofinclusionbody;19.Theprecipitationofthe10ndwashofinclusionbody;20.Thesupernatantofthe10ndwashofinclusionbody;21.Theprecipitationofthe11ndwashofinclusionbody;22.Thesupernatantofthe11ndwashofinclusionbody;图3-8显示，His-H表达蛋白主要以包涵体形式表达，包涵体的表达量远远高于杂蛋白的含量。随着洗涤次数的增加，杂蛋白的量越来越低，当达到第11次洗涤时，目标条带附近的杂蛋白含量显著降低。因而本文后续实验中割胶回收的蛋白采用洗涤11次的包涵体蛋白。3.8重组蛋白His-H包涵体的纯化及浓缩3.8.1重组蛋白His-H包涵体的纯化经过不同浓度尿素溶液洗涤的His-H包涵体，通过割胶纯化目的蛋白，并通过SDS-PAGE凝胶蛋白电泳，以及Westernblot分析对纯化的目的蛋白进行验证，结果如下图3-9所示：35 kD94.466.2433122M123456789123456图3-9割胶蛋白电泳及westernblot分析Fig.3-9SDS-PAGEandWesternblotanalysisofgel-recoveryofHis-HM.蛋白标准分子量marker；1.His-H蛋白诱导5h；2~9：割胶后回收的H蛋白M.ProteinmolecularweightStandard;1.His-H,5hinduction;2~9.thegel-recoveriedHis-H图3-9所示，通过KCl染色，割胶回收的蛋白通过SDS-PAGE凝胶电泳及Westernblot分析，割胶蛋白无杂蛋白，纯度良好，经过BCA蛋白浓度试剂盒测试平均回收蛋白浓度为0.109mg/mL。3.8.2重组蛋白His-H纯化蛋白的浓缩使用PEG4000对纯化的蛋白进行浓缩。浓缩后，经过SDS-PAGE电泳分析，结果如下图3-10所示：kD94.466.2433122M12345图3-10割胶纯化蛋白浓缩SDS-PAGE电泳Fig.3-10TheSDS-PAGEoftheconcentrationofgel-recoveryproteinofHis-HM.蛋白标准分子量marker；1.pET30a空载表达；2.His-H蛋白诱导5h；3.大量表达His-H蛋白4.割胶回收的His-H；5.PEG4000浓缩后的割胶蛋白M.ProteinmolecularweightStandard;1.pET30avectorafterinduction;2.His-H,5hinduction;3.His-Haftermassinduction;4.GelrecoveriedHis-H;5.proteinbyPEG4000Enrichment经过PEG4000浓缩后的蛋白，通过SDS-PAGE电泳，条带单一，经过BCA蛋白浓度试剂盒测试蛋白浓度为1.082mg/mL。3.9新西兰大白兔兔子血清抗体滴度的测定3.9.1不同免疫天数血清的检测使用间接ELISA方法对4只新西兰大白兔不同时段所采的免疫血清进行检测。使用1μg/mL纯化后的His-H蛋白包被96孔板。检测结果如图3-11：36 图3-11不同免疫天数的血清抗体水平Fig.3-11ThelevelsofserumantibodyofdifferentimmunenumberofdaysagainstHis-H用包被割胶浓缩的His-H蛋白检测血清抗体滴度研究表明，抗体在首次免疫后即可产生，迅速增加至平衡，第四次免疫后的血清抗体水平，最高检测结如图果图3-11所示。3.9.2抗体滴度的检测使用间接ELISA方法进行抗体滴度的检测。使用1μg/mL纯化后的His-H蛋白包被96孔板，检测新西兰大白兔的免疫血清在二倍倍比稀释情况下抗体水平的变化规律，检测结果如图3-12：图3-12血清倍比稀释抗体水平滴定Fig.3-12Thetitrationofthedilutionofserumantibodylevels图3-12显示：在His-H纯化蛋白抗原包被量不变，血清倍比稀释的情况下，OD450nm值变化成下降趋势，不同的兔子免疫血清效价不同，但是OD450nm值随着抗血清的加入量减少而降低，1号兔子抗体滴度为1∶25600，2号兔子的抗37 体滴度为1∶12800和3号兔子抗体滴度达到1∶6400。3.9.3新西兰大白兔兔子血清结合特异性检测利用免疫获得的新西兰大白兔血清作为一抗，通过Westernblot验证重组表达的PPRVH蛋白与得到的抗血清特异性识别效果，使用两个不同稀释度的免疫血清，分别稀释2000倍（A图）和4000倍（B图），结果如下图4-13所示：AB123456781234567图3-13Westernblot使用免疫血清检测H蛋白Fig.3-13WesternblotanalysisHis-Hwithrabbitantiserum1.pET30a空载表达；2.His-H蛋白诱导3h；3.His-H蛋白诱导4h；4.His-H蛋白诱导5h；5.His-H蛋白诱导6h；6.His-H蛋白诱导7h;7.His-H蛋白诱导8h；8.His-H蛋白诱导9h;1.pET30avectorafterinduction;2.His-H,3hinduction;3.His-H,4hinduction;4.His-H,5hinduction;5.His-H,6hinduction;6.His-H,7hinduction;7.His-H,8hinduction;8.His-H,9hinduction图3-13表明：在免疫血清浓度稀释4000倍的情况下，免疫血清仍然可以特异性识别重组His-H蛋白，但是随着免疫血清浓度的稀释，效果会相应的降低。3.10H基因的表位筛选3.10.1H基因抗原表位预测使用DNASTAR软件对H基因的抗原表位进行预测分析：图3-14H基因抗原表位预测Fig.3-14TheantigenepitopepredictionofHgene38 3.10.2pXXGST-3载体酶切回收使用AXGEN胶回收试剂盒回收pXXGST-3表达载体，结果如下图3-15所示：bp5000300020001500250100M1234图3-15pXXGST-3载体的酶切结果Fig.3-15ThedoubledigestionofplasmidpXXGST-3M.标准分子量（DL5000）1~4.双酶切回收载体;M.markerDL5000;1~4.DoubledigestionoftheplasmidpXXGST-3如图3-15所示：pXXGST-3酶切回收，条带单一，可进行下一步实验。3.10.3H基因16肽质粒的酶切鉴定将连接到pXXGST-3载体上的16肽片段进行连接转化提取质粒，对提取的质粒pXXGST-3-（1F~75F）进行酶切鉴定，结果如下图3-16所示：bp50003000200015001000750500M12345678910111213141516171819202122bp2350003000200015001000750500M2425262728293031323334353637383940414243444546M39 bp200010007505002501004748495051525354555657M585960616263646566Mbp50003000200015001000750500M676869707172737475图3-16pXXGST-3-P76-1F（~75F）质粒的双酶切Fig.3-16ThedoubledigestionofplasmidpXXGST-3-P76-1F（~75F）M.标准分子量（DL2000）1~4双酶切回收载体;M.markerDL2000;1~75.DoubledigestionoftheplasmidpXXGST-3-P76-1F（~75F）由图3-16显示：在500bp和700bp之间有特异性条带，将测序的序列与合成的序列进行比对，比对结果表明pXXGST-3与16肽序列成功连接。3.10.4H蛋白表位的筛选用稀释度为1：2000新西兰大白兔兔子血清作为一抗，对重组蛋白GST-1F~GST~75F进行Westernblot分析，结果如下图3-17所示：kDkD94.494.466.266.2434331312222M12345678910M111213141516171840 kDkD94.494.466.266.2434331312222M192021222324252627M282930313233343536kDkD94.494.466.266.2434331312222M3738394041424344454647M48495051525354kDkD94.494.466.266.2434331312222M555657585960616263646566M676869707172kD94.466.2图3-17GST-1F~GST-75F16肽蛋白SDS-PAGE电泳及分析43Fig.3-17WesternblotandSDS-PAGEanalysisofGSTfusion31expressed16mersGST-1F~GST-75FM.蛋白标准分子量marker；1~75：GST-1F~GST-75F16肽蛋白22M.ProteinmolecularweightStandard;1~75；theproteininducedofGST-1F~GST-75FM73747541 图3-17显示，使用新西兰大白兔兔子血清（免疫血清浓度1∶2000）作为一抗，通过Westernblot分析重组GST-1F~GST-75F蛋白，一共筛选出共计30个阳性16肽片段。表3-18筛选的阳性16肽片段Table3-18Screeningpositive16peptidefragments16肽片段名称16肽片段氨基酸序列P76-1FMSAQRERINAFYKDNPP76-8FGIRLHRATVGTSEIQSP76-9FVGTSEIQSRLNTNIKLP76-10FRLNTNIKLAESIDHQTP76-11FAESIDHQTKDVLTPLFP76-13FKIIGDEVGIRIPQKFSP76-14FIRIPQKFSDLVKFISDP76-15FDLVKFISDKIKFLNPDP76-16FDLVKFISDKIKFLNPDP76-21FKSIEHIFESPLNKSKKP76-30FTVWRSDARDPSTDLGIP76-33FIGLIRDLGLGPPVFHMP76-37FLAVGELKLTALCTSSEP76-38FTALCTSSETVTLSERGP76-39FTVTLSERGAPKREPLVP76-42FPTLGGELYSVLPTSDLP76-43FSVLPTSDLMVEKLYLSP76-44FMVEKLYLSSHRGIIKDP76-54FVVITSVFGPLIPHLSGP76-55FPLIPHLSGMDLYNNPFP76-56FMDLYNNPFSRAIWLAVP76-57FSRAIWLAVPPYEQSFLP76-58FPPYEQSFLGMINTIGFP76-59FGMINTIGFPNRAEVMPP76-60FPNRAEVMPHILTTEIRP76-61FHILTTEIRGPRGRCHVP76-62FGPRGRCHVPIELSRRV42 P76-63FPIELSRRVDDDIKIGSP76-65FNMVILPTMDLRYITATP76-74FIYNTITDEEVHTRGLT43 4讨论4.1小反刍兽疫病毒PPRV的H蛋白表达血凝素蛋白H蛋白是小反刍兽疫病毒上的糖蛋白，具有神经氨酸酶活性和血凝素活性，是病毒粒子表面的纤突的主要成分[68]，它主要是协助PPRV病毒侵入宿主细胞，作为病毒感染宿主的受体[69]。引起宿主细胞发生病变，并刺激机体产生中和抗体[70]。为了表达血凝素蛋白H蛋白，本研究构建了原核表达载体pET28a-PPRV-H，pET30a-PPRV-H和pET32a-PPRV-H。不同的原核表达载体的表达蛋白量不一致，pET30a-PPRV-H表达量最高，依次为pET32a-PPRV-H，pET28a-PPRV-H，高华峰等人从PPRV全长cDNA中对H基因进行PCR扩增，构建了棒状病毒重组质粒pFastBacH-H，表达重组的H蛋白，但是真核系统的表达量和实验的费用远远高于原核表达系统[71]。与真核系统的表达的蛋白，使用原核表达系统得到的H蛋白，蛋白表达量高，通过包涵体割胶过程的变性，更加有利于H蛋白线性B细胞抗原表位的筛选。pET30a-PPRV-H的蛋白表达量最高。可能与蛋白合成过程中所需要的质粒拷贝数、启动子类型、载体本身非编码区的二级结构以及密码子偏爱性有关。pET30a-PPRV-H表达的蛋白主要以包涵体的形式存在，可能是蛋白在合成过程中，大量表达，来不及折叠和二硫键形成有关。由于蛋白表达量比较高，包涵体很难得到充分的溶解。从而导致目标蛋白和镍柱分离纯化结合率很低，而和杂蛋白一起被洗脱[72]。BIO-RAD公司推荐的方法是考马斯蓝R-250染色较短时间，切胶回收蛋白[73]，国内同时也有对照染色的方法确定目的蛋白的位置从而不染色的方法，但是这种方法，作为对照的蛋白胶可能会因为胶体大小，或者因为一些人为因素而改变[74]，同时有人使用该文用弱碱性盐乙酸钠染色回收蛋白，从而保留蛋白抗原活性[75]。本文以氯化钾染色回收蛋白，具有廉价，方便，条带清晰的特点。氯化钾是实验室常备的无机盐，操作具有简单，方便的优势。4.2小反刍兽疫病毒PPRV的H蛋白线性B细胞表位的筛选本研究为了筛选PPRVH蛋白的线性B细胞表位，采用的是重叠16肽段的方法，相邻的16肽片段设计相互重叠8个短肽片段。研究发现筛选出的阳性片段P76-1F和非阳性片段P76-2F重叠有NAFYKDNP八个短肽，而片段P76-2F和免疫血清没有特异性反应，说明了，在第一个阳性片段中的阳性氨基酸多肽可以缩短至8肽，这样可以在应用中减少一些不需要的费用。于瑞嵩，樊晓明等人，44 通过对筛选出的阳性16肽再次进行8肽片段筛选，从而确定最小基序，对我们给予一定的借鉴作用[57]。此外，在筛选过程中，对免疫血清进行大肠杆菌裂解液进行共孵育，减少了一些非特异性结合，从而得到清晰的实验结果。45 5结论5.1克隆及表达载体的构建本研究以融合PCR得到的H基因为模版，通过PCR合成H基因，分别构建了克隆载体pJET1.2/blunt-PPRV-H以及表达载体pET28a-PPRV-H，pET30a-PPRV-H和pET32a-PPRV-H。5.2His-H蛋白诱导分离、回收、浓缩和检测通过对表达载体pET30a-PPRV-H的诱导，H蛋白表达主要以包涵体的形式存在，通过超声破碎离心，使用尿素对包涵体洗涤，效果比较好，目标蛋白附近的杂蛋白的含量降低，通过纯化浓缩，得到了H蛋白的浓度最高达到2mg/mL。5.3新西兰大白兔的免疫用浓缩后的蛋白免疫新西兰大白兔，在第四次免疫后血清的效价达到稳定值。使用间接ELISA测抗体滴度，1号兔子免疫血清的滴度达到1∶25600，2号兔子免疫血清滴度达到1∶12800和3号兔子免疫血清滴度1∶6400。免疫得到的抗体可以和目标蛋白特异性结合。5.4H蛋白的表位的筛选通过人工设计覆盖H基因的16肽片段进行对H蛋白B细胞线性表位进行筛选，通过对16肽的诱导和表达，确定了H蛋白的线性表位存在位置，一共筛选出的阳性16肽分别为P76-1F，P76-8F，P76-9F，P76-10F，P76-11F，P76-13F，P76-14F，P76-15F，P76-16F，P76-21F，P76-30F，P76-33F，P76-37F，P76-38F，P76-39F，P76-42F，P76-43F，P76-44F，P76-54F，P76-55F，P76-56F，P76-57F，P76-58F，P76-59F，P76-60F，P76-61F，P76-62F，P76-63F，P76-65F，P76-74F共计30个阳性16肽片段，为下一步研究最小表位基序的测定打下了基础。46 参考文献[1]BanyardAC,ParidaS,BattenC,etal.Globaldistributionofpestedespetitsruminantsvirusandprospectsforimproveddiagnosisandcontrol[J].Journalofgeneralvirology,2010,91(12):2885-97[2]SenA,SaravananP,BalamuruganV,etal.Vaccinesagainstpestedespetitsruminantsvirus[J].Expertreviewofvaccines,2010,9(7):785-96[3]AlbinaE,KwiatekO,MinetC,etal.PestedesPetitsRuminants,thenexteradicatedanimaldisease?[J].VeterinaryMicrobiol,2013,165(1-2):38-44[4]王志亮，包静月，吴晓东，等.我国首例小反刍兽疫诊断报告[J].中国动物检疫，2007，24(8)：24-26[5]DharP,SreenivasaBP,Ban'ettT,etal.Recentepidemiologyofpestedespetitsruminantsvirus(PPRV)[J].VeterinaryMicrobiol,2002,88(2):53-159[6]DialloA,etal.Controlofpestedespetitsruminantsclassicalandnewgenerationvaccines[J].DevelopmentalBiology(Basel),2003,114:113-119[7]BarrettT.Morbillivirusinfectionswithspecialemphasisonmorbillivirusesofcarnivores[J].VeterinaryMicrobiol,1999,69,3-13[8]ChauhanHC,ChandelBS,KherHN,etal.Pestidespetitsruminantsvirusinfectioninanimals[J].VeterinaryWorld,2009,2(4):150-155[9]BarretttB,LIXen,KRONE,etal.RoundTableonMorbillivirusesinMarineMammals[J].VeterinaryMicrobiol,1992,33(14):287-295[10]DialloA,MinetC,BerheG,etal.Goatimmuneresponsetocapripoxvaccineexpressingthehemagglutininproteinofpestedespetitsruminants[J].AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences,2002,969,88-91[11]BerheG,MinetC,LeGoffC,etal.DevelopmentofadualRecombinantvaccinetoprotectsmallruminantsagainstpeste-despetits-ruminantsvirusandcapripoxvirusinfections[J].Journalofvirology,2003,77,1571-1577[12]ShailaMS,ShamakiD,ForsythM,etal.Geographicdistributionandepidemiologyofpestedespetitsruminantsvirus[J].VirusResarch.1996,43,149-153[13]KwiatekO,AliYH,SaeedIK,etal.Asianlineageofpestedespetitsruminantsvirus[J].Africaemerginginfectiousdiseases.2011,17,1223-123147 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致谢感谢我的导师张明教授，在硕士学习期间和论文写作期间的指导和帮助，在硕士学习期间的指导和对生活的爱护和关心。感谢上海市农业科学院畜牧兽医研究所的李震老师，他耐心的教导，指导我们阅读和讲解大量的前沿文献，帮助扩展了研究思路。同时感谢上海市农业科学院畜牧兽医研究所的于瑞嵩老师，董世娟老师，朱于敏老师，司伏生师兄的帮助，帮助我直面实验问题，在解决实验问题中给我的指导和帮助，克服一个一个的困难和疑惑。在此，谨向老师们致以衷心的感谢！感谢安徽农业大学动物科技学院李槿年老师，对论文修改工作的帮助！本文的顺利完成得到了同届研究生安徽农业大学王国松，南京农业大学喻利，东华大学陈冰清以及师弟师妹的热情帮助和支持，同时得到已毕业的山西农业大学樊晓明师兄，南京农业大学黄瑜师姐，刘旭东师兄，东华大学张攀师兄热心帮助，帮助我很快融入实验室的生活，同时感谢在安徽农业大学学习期间柯芳芳师姐，李蕾师姐，于雷雷师兄，王超师兄，还有研究生关心、帮助过我的同学和朋友们向他们表示真挚的祝福。感谢安徽农业大学生命科学院和研究生院的老师们。然后还要感谢的是我的父母和家人，在我处于困境中给予我物质和精神上的鼓励，让我越过一个又一个难关，一步步的走向自己预定的人生轨线。感谢我的母校安徽农业大学，在这里的生活和学习是值得我一生的回忆。最后，向参加论文评阅和答辩的专家、教授致以崇高的敬意！高位相2015，4，10日于上海54 个人简介高位相，男，1989年12月生于江苏省丰县。2008年毕业于徐州生物工程学院食品（生物）工程学院生物工程专业，获工学学士学位。2012~2015年在安徽农业大学生命科学学院攻读微生物学硕士学位。在读期间发表的学术论文1.高位相，于瑞嵩，张明，等，小反刍兽疫（PPR）疫苗研究进展[J].畜牧与兽医，2015（已接受）55