益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究

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目录一、摘要中文论著摘要..........................................................1英文论著摘要..........................................................3二、英文缩略语............................................................6三、正文益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究前言..................................................................7材料与方法...........................................................10实验结果（附论文图片）...............................................16讨论.................................................................27结论.................................................................31四、本研究创新性的自我评价...............................................32五、参考文献.............................................................33六、附录综述.................................................................35个人简介.............................................................40在学期间科研成绩.....................................................41致谢.................................................................42 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文摘要目的：本试验用益气健脾和血祛痰法治疗冠心病稳定型心绞痛脾虚痰浊证患者后，检测其血清miR-126和炎症因子水平，揭示“从脾论治”冠心病稳定型心绞痛炎症机制发生的规律及其相关关系。材料与方法：1.试验对象：本试验采用多中心、盲法、区组随机、平行对照进行临床试验设计。对冠心病稳定型心绞痛脾虚痰浊证患者采用益气健脾、和血祛痰法联合西医基础治疗；2.分组方法：首先招募符合筛选标准的受试者，然后采用SPSS16.0统计软件，将受试者按1:1比例随机分配到试验组和对照组，两组各80例，同时招募正常受试者20例。3.干预措施：试验组给予具益气健脾、和血祛痰作用的中药颗粒剂（含党参、黄芪、白术、清半夏等中药）联合西医基础治疗，对照组予安慰剂作用的中药颗粒剂（含试验组中药颗粒剂成分的10%）联合西医基础治疗，疗程12周；4.观察方法：一般资料、miR-126、炎性指标。除一般资料，均以入组后第0周、4周、12周为信息采集时间点；-5.统计学方法：数据应用spssforwindows16.0整理、分析。计量资料以（x±s）形式表示，p<0.05差异具有统计学意义。结果：选取PPS数据集，最终完成的病例试验组75例，对照组70例。1.药物干预前，试验组和对照组miR-126含量明显低于正常人组，差异均有统计学意义（P＜0.05），同时试验组和对照组没有差异（P＞0.05）；药物干预后，试验组和对照组miR-126的含量虽然有所增加，但是也没有达到正常人组的含量高度，与正常人组比差异均有统计学意义（P＜0.05），同时试验组比对照组的含量稍高，差异没有统计学意义（P＞0.05）。2.试验组中hs-CRP、MCP-1、VCAM-1这三个炎症指标给药后下降明显，与对照组比较有显著差异（P＜0.05），SR-A有下降趋势、SR-B有升高趋势。对照组中给药后炎症因子变化均无统计学意义（P＞0.05）。3.给药前，冠心病患者外周血miR-126和粘附因子VCAM-1呈负相关（r=-0.694，P=0.000），miR-126与其他炎症因子无直线相关关系；给药后miR-126与炎症因子无直线相关关系。-1- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究结论：1.冠心病稳定型心绞痛患者外周血中miR-126的含量低于正常人，给予试验药品后患者血清中SR-B之外的炎症因子含量降低。2.冠心病稳定型心绞痛患者外周血中miR-126与粘附分子VCAM-1呈负相关，miR-126可以作为反应冠心病严重程度的生物学标志。3.益气健脾和血祛痰法治疗冠心病稳定型心绞痛脾虚痰浊证患者有效，可升高外周血中miR-126的水平，同时降低血清中SR-B之外的炎症因子的含量。关键词：冠心病；从脾论治；炎症因子；疗效机制-2- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文AbstractPurpose：AfterthetreatmentofreplenishingqiandstrengtheningthespleenandnourishingbloodandeliminatingphlegmwasusedforCADstableanginapectoriswithspleendeficiencyandphlegmsyndrome,investigatingthelevelsofmiR-126andinflammatoryfactors,torevealtheinflammatoryreactionmechanismofreplenishingqiandstrengtheningthespleenandnourishingbloodandeliminatingphlegmforCADstableanginapectoris.Materialandmethod：1.Subjects：Theclinicaltrialdesignwascarriedoutbyusingmulticenter,blindmethod,andrandomizedandparallelcontrolgroup.Thetreatmentofreplenishingqiandstrengtheningthespleenandnourishingbloodandeliminatingphlegm,combiningwithconventionalwesternmedicinewereusedforCADstableanginapectoriswithspleendeficiencyandphlegmsyndrome.2.Groupingmethod：Firstrecruitsubjectsaccordingtotheselectioncriteria,andthendividedthe160subjectsintotestandcontrolgroupataproportionof1:1bytheSPSS16.0statisticssoftware.Eachgrouphas80cases,andrecruit20casesofnormalpeople.3.Interventions：SubjectsintestgroupsweregivenTCMgranulewhichreplenishingqiandstrengtheningthespleenandnourishingbloodandeliminatingphlegm(includingCodonopsispilosula,Astragalusmongholicus,Atractyiodesmacrocephala,RhizomaPinelliae,etc),combiningconventionalwesternmedicine；controlgroupsweregivenplaceboTCMgranules(10%oftheconstituentsofthetestgroups),combiningconventionalwesternmedicine.Thecourseoftreatmentis12weeks.4.Observationmethod:generalsituation,miRA-126,Seattleanginaquestionnaire,inflammatoryindexes.Inadditiontothegeneralinformation,week0,week4andweek12aretakenastheinformationcollectionpoints.5.Statisticalmethods:databasedresume,applicationofSPSSforwindows16.0collationand-analysisofdata.Themeasurementdatawere(x±s),andp<0.05wasstatisticallysignificant.-3- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究Results：ThePPSdatasetwasselected,andthefinallyfinishedcasesare75inthetestgroupand70inthecontrolgroup.1.Beforedrugtreatment,theexperimentalgroupandthecontrolgroupofmiR-126contentwassignificantlylowerthannormalgroup,differenceswerestatisticallysignificant(P<0.05),andexperimentalgroupandthecontrolgrouphadnodifference(P>0.05);drugintervention,experimentalgroupandcontrolgroupofmiR-126contentdespitetheincrease,butdidnotreachnormalgroupwerehighly,withthoseofthenormalgroupthanthedifferenceswerestatisticallysignificant(P<0.05),andexperimentalgroupthancontrolgroup,thecontentisslightlyhigher,thedifferencewasnotstatisticallysignificant(P>0.05).2.Inthetestgroup,hs-CRP,MCP-1,VCAM-1afterthethreeindicatorsofinflammationdecreasedsignificantly,comparedwiththecontrolgroup,thereweresignificantdifferences(P<0.05),SR-Ahasadownwardtrend,SR-Bhasincreasedtrend.Therewasnosignificantchangeintheinflammatoryfactorsafteradministrationinthecontrolgroup(P>0.05).3.Beforeadministration,thepatientswithcoronaryheartdisease(CHD)inperipheralbloodofmiR-126andadhesionmoleculesVCAM-1wasnegativelycorrelated(R=0.694,P=0.000),miR-126andotherinflammatoryfactorsnolinearcorrelation;aftertheadministrationofmiR-126andinflammatoryfactorhasnolinearcorrelation.Conclusion：1.ThecontentofmiR-126inperipheralbloodofpatientswithcoronaryheartdiseasewaslowerthanthatinnormalsubjects,thecontentofinflammatoryfactorsinserumwasdecreasedaftertakingmedicine.2.MiR-126isnegativelycorrelatedwithVCAM-1,miR-126canbeusedasabiologicalmarkerfortheseverityofcoronaryheartdisease.3.ThetreatmentofreplenishingqiandstrengtheningthespleenandnourishingbloodandeliminatingphlegmwasusedforCADstableanginapectoriswithspleendeficiencyandphlegmsyndromeiseffective,canincreasethelevelofmiR-126inperipheralblood,andreducethecontentofinflammatoryfactorsinserum.-4- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文Keyword：coronaryheartdisease;treatmentfromthespleen;inflammatoryfactors;therapeuticmechanism-5- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称ACSacutecoronarysyndrome急性冠状动脉综合征CADchroniccoronaryarterydisease慢性冠脉病CHDcoronaryheartdiease冠状动脉粥样硬化性心脏病CISchronicischemicsyndrome慢性心肌缺血综合征hs-CRPhypersensitive-CRP超敏C反应蛋白MCP-1monocytechemotacticprotein单核细胞趋化蛋白1NSTEMInon-ST-segmentelevationmyocardialinfarction非ST段抬高型心肌梗死ox-LDLoxidizenlowdensitylipoprotein氧化低密度脂蛋白SR-Ascavengerreceptor-A清道夫受体ASR-Bscavengerreceptor-B清道夫受体BSTEMIST-segmentelevationmyocardialinfarctionST段抬高型心肌梗死UAunstableangina不稳定型心绞痛VCAM-1Vascularcelladhesionmolecule-1血管细胞粘附分子-1-6- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究前言冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronaryatheroscleroticheartdisease）简称冠心病（coronaryheartdiease,CHD），是指冠状动脉粥样硬化，使管腔狭窄或闭塞，[1]导致心肌急剧地、暂时地缺血缺氧而发生心脏病。全世界每年约有1750万人死于心脏病和，占全部死亡人数的30%；虽然每年心脏病发作和中风的幸存者至少有2000万，但其中多数人有很高的复发和死亡风险。在中国，每年大约有260万人死于心脑血管疾病，死亡人数位列世界第二。更令人不安的是，据世界卫生组织统计，到2020年，中国每年因心血管疾病死亡的人数将可能达到400万。冠心病心绞痛的病发与血管内皮功用紊乱,氧供与需求失衡，血小板活化,炎症反应,斑块破裂、血栓形成以及血清脂质代谢异常密切相关,药物治疗主要以扩冠、降低心肌耗氧量、改善血管内皮功能、抗血小板聚[2]集、调脂、抗凝等为主。内皮功能紊乱是冠心病的主要特征。炎症反应及血脂代谢紊乱均参与了内皮功能障碍的发生。miR-126是位于Ggf17基因的第7内含子，在miR-126的成熟体序列中，人类的序列为UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG，主要表达于脐静脉内皮细胞中。研究证实，miR-126作为最新的诊断和评估冠心病病情和风险的分子标志物之一，参与调控包括血管生成、炎症反应、细胞凋亡等内皮细胞的生理特性。超敏C反应蛋白（hypersensitive-CRP，hs-CRP）是预测心血管事件危险性的最重要的预测因子。冠心病患者血清中hs-CRP的含量变化可以判断疾病的严重程度，因为[3]hs-CRP是全身性炎症反应急性期的非特异性标志物。hs-CRP可与脂蛋白结合,激活补体系统,产生大量炎症介质,释放氧自由基,造成血管内膜损伤、血管痉挛及不稳定[4]斑块脱落,加重动脉粥样硬化所致的管腔狭窄。单核细胞趋化蛋白1（monocytechemotacticprotein,MCP-1）是吸引白细胞移行到感染部位的低分子量趋化因子，主要由巨噬细胞和内皮细胞产生，在炎症反应中具有-7- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究重要作用。MCP-1与CC类趋化因子受体2结合，趋化单核细胞与受损内膜粘附，并进入内膜下层，活化为巨噬细胞，巨噬细胞吞噬脂蛋白形成泡沫细胞，产生大量自由基，使[5]血管痉挛，脂质代谢异常，从而促进免疫炎症反应，粘附、浸润动脉壁，促使动脉粥样硬化斑块形成。血管细胞粘附分子-1（Vascularcelladhesionmolecule-1，VCMA-1）相对分子量为80～90kDa，有6～7个细胞外Ig样区，是免疫球蛋白超家族类粘附分子，主要表达于血管内皮细胞。在病情开始阶段，或血管痉挛、斑块破裂等炎症反应剧变时明显增加，在病变消退或平稳时，血中检测不到VCAM-1升高。外周血中VCAM-1的变化可以反应冠心病严重程度。清道夫受体（SR）是一种结构多样化的糖蛋白受体。目前被分为A、B、C、D、E、F、G几类。研究表明，清道夫受体和动脉粥样硬化进程的各个阶段均有不同程度的关联性。其中清道夫受体A（SR-A）和清道夫受体B(SR-B)已经被众多研究证实与动脉粥样硬化存在密切联系。清道夫受体A（SR-A）是一种模式识别受体,主要表达在巨噬细胞表面，它能够通过介导氧化修饰低密度脂蛋白(LDL)促进泡沫细胞形成,并能够通过激活信号通路促进巨噬细胞凋亡来加速动脉粥样硬化病变的进展。清道夫受体B(SR-B)是HDL的受体，因此在胆固醇的清除中起着重要作用。本病属于中医“胸痹”范畴，病机为心脉痹阻，痰浊痹阻证是其临床常见证型，为揭示“从脾论治”冠心病稳定型心绞痛疗效机制发生的规律，本试验用益气健脾和血祛痰法治疗冠心病稳定型心绞痛脾虚痰浊证患者后，检测其外周血中miR-126、hs-CRP、MCP-1、VCAM-1、SR-A和SR-B的含量及相关关系。-8- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文技术路线如下：多中心符合标准受试者招募随机双盲样本含量知情同意诊断标准平行对照N=80例/组优效性试验设计纳入标准排除标准基础治疗药物随机分组益气健脾、和血祛痰组安慰剂对照组疗程12周时间点：入组后第0、4、12周观察方法：一般资料、疗效指标、机制指标统计分析-9- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究材料与方法1实验材料1.1受试对象随机选取辽宁中医药大学附属医院、辽宁省中医药研究院、内蒙古民族大学附属医院、中国医科大学附属第一医院、中国医科大学附属盛京医院和沈阳医学院附属沈洲医院六家分中心于2013年01月至2014年12月期间通过电视、电台、报纸、社区及医院等方式招募的冠心病稳定型心绞痛痰浊痹阻证患者，其中试验组80例，对照组80例。受试患者西医符合冠心病稳定型心绞痛诊断标准；中医符合脾虚痰浊证诊断标准；入组前三个月以内行冠脉造影或冠脉CT提示：50%<冠脉主支血管狭窄程度<75%或50%＜冠脉分支血管狭窄程度＜100%病变者；加拿大心血管学会（CCS）心绞痛严重程度分级II-IV级者。从试验组和对照组中各随机挑选20例组成试验组（小）、对照组（小），同时招募正常人组20例，用于相关性研究。1.1.1排除标准（1）脾虚痰浊证以外的其他中医证型；（2）4周内服用具有“益气健脾”、“益气健脾、祛痰化浊”、“活血化瘀”等相似功效的中药制剂；（3）不稳定心绞痛及肥厚型心肌病等其它心脏疾患，神经官能症，更年期症候群及颈椎病、胃及食管反流等所致胸痛者；（4）冠脉造影或冠脉CT结果提示主支血管（RCA、LM，LAD、LCX）75%以上狭窄或左主干50%以上狭窄而病变未解决者；（5）半年内患有急性心肌梗死或一年内完全血管重建史；（6）合并有严重心力衰竭（心功能IV级）、恶性心律失常、接受标准化方案降压治疗但血压仍高于160/100mmHg者、严重的其他系统疾病预计不能完成试验者及肝、肾功能异常者（血AST、ALT、Cr超过参考值上限1.5倍）；（7）精神病患者；（8）妊娠及有计划妊娠者或哺乳期妇女；（9）对中药颗粒剂及碘过敏者；（10）青光眼患者；（11）近两月内参加其他研究者；-10- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文（12）拒绝或不能签署知情同意书者；1.1.2脱落标准因以下原因未完成临床方案的入组病例应视为脱落。（1）病人自行退出；（2）失访；（3）研究者劝其退出（依从性差：不能按时接受访视，虽然完成试验，但用药量不在应服量的75%-120%范围内；出现严重的合并症或并发症；严重不良事件）；（4）泄盲或紧急揭盲的病例。1.1.3剔除标准已入组病例但符合以下之一者，应予剔除。（1）误诊；（2）未曾用药者；（3）服药后无任何可评价记录者；（4）由于使用某种禁用的药物，以致无法作有效性和安全性评价。1.1.4全面中止试验标准研究进行中由于以下原因整个试验在多中心全面停止。（1）研究者发现严重安全性问题；（2）方案有重大失误；（3）申办方因经费或管理原因不能继续试验；（4）行政主管部门撤消试验。1.2实验药品及制备试验组给予具有“益气健脾、和血祛痰”功效的中药颗粒剂，组成为：黄芪10g、党参10g、白术10g、茯苓10g、清半夏6g、瓜蒌10g、丹参10g、炙甘草3g。早饭前晚饭后半小时服用，每日2次冲服，每周7日，疗程12周，随访2周。对照组予中药颗粒剂安慰剂组方（江阴天江药业有限公司生产），早饭前晚饭后半小时服用，每日2次冲服，每周7日，疗程12周。1.3主要试剂荧光定量PCR方法：Trizol（Invitrogen）、RNA酶抑制剂（Promage）、反转录酶（QIAGEN）、10×RT缓冲液（QIAGEN）、2.5mMdNTP混合液（华大基因）、2×SybrgreenPCRmix（QIAGEN）、TBE（华大基因）、6*Loadingbuffer（华大基因）-11- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELisa法）：人高敏C反应蛋白Elisa试剂盒（上海工硕）、人趋化因子MCP-1Elisa试剂盒（美国R&D）、人粘附分子VCAM-1Elisa试剂盒（美国R&D）、人清道夫受体AElisa试剂盒（上海工硕）、人清道夫受体BElisa试剂盒（上海工硕）1.4主要仪器及设备荧光定量PCR方法：TissueRuptor匀浆器（QIAGEN）、台式冷冻高速离心机5427R（Eppendorf）、NanoQuantinfinireM200PRO（TECAN）、BIORADPOWERPAC3000（BIORAD）、BIORADDNASUBCELL（BIORAD）、凝胶成像系统GIS-1600（上海天能科技有限公司）、ABIVii7RealTimePCRSystem（AppliedBiosystems）双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELisa法）：离心机H2050R（湖南）、酶联免疫检测仪MultiskanFC（美国）、全自动洗板机8*12（美国）、电热恒温水箱DK-8B（上海）、电冰箱（西门子）2实验方法2.1试验设计类型本研究采用多中心、盲法、区组随机、平行对照临床试验设计。2.1.1多中心：本研究选择国内6家医院作为分中心。2.1.2盲法：本研究对研究者、受试者、药品管理人员、数据采集人员和数据统计分析人员实施盲法。2.1.3分层区组随机：采用中心分层，采用DAS临床试验中央随机系统(DASforIWRS)申请随机号和配发药物。2.1.4对照：试验组为益气健脾和血祛痰组，对照组为安慰剂对照组。2.2样本量估算有效性角度，根据统计学要求，采用差异性检验，双侧α=0.05，β=0.2（功效=80%），安慰剂对照组有效率60%，预计益气健脾和血祛痰组有效率可达88.5%，按1:1比例，用DAS2.2.1软件，例数估算结果两组各71例。考虑脱落因素，本研究决定每组例数为80例，即试验组80例、对照组80例，共160例。2.3取材方法⑴一般试验数据记录受试者的性别、年龄、身高、体重、CCS心绞痛分级、NYHA心功能分级。-12- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文⑵血液样本采集采血用医疗用品必须符合GB15980-1995标准的产品，每个受试患者一次采集量为10毫升。采血程序：①采血前：采样人员必须核对表格编号及被采样人姓名、性别；以无菌操作法进行静脉采血。②分离血清：血样在室温放置30分钟以上，使血清析出；离心1500转10～15分钟，以无菌吸管将血清吸入1.5ml冻存管内保存。③分离白细胞：取静脉血2ml，放入加有抗凝剂的试管中，轻轻混匀；将试管直立静置于室温或37℃温箱中30～60min，待红细胞自然沉降。此时可见试管中的悬液分3层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，在紧贴红细胞层上有一呈灰白色的白细胞层；用毛细管吸取位于红细胞层上面的富含白细胞的细胞悬液，移入另一试管中；加入无Ca2+、Mg2+Hank’s液至离试管口3cm处，混匀，以水平离心机2000r/min离心10min，弃上清，同法在洗涤两次；沉淀细胞用适量10%～20%灭活小牛血清的Hank’s液重悬，6计数，配成所需的细胞浓度的悬液，一般常用2×10/min。2.4检测方法采用荧光定量PCR方法逆转录-聚合酶链反应测定试验对象外周血白细胞中miR-126含量。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELisa法）测定试验对象血清hs-CRP、MCP-1、VCAM-1、SR-A、SR-B。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，[5]使测定方法达到很高的敏感度。2.5检测步骤⑴荧光定量PCR方法①总RNA抽提：将收集的白细胞离心去除上清，加1mlTrizol,用QIAGENTissueRuptor匀浆，室温放置10min；加200μl氯仿，充分混匀，15000转离心5-7min；取上清，至1.5mlEppendorf管加600μl氯仿，混匀，15000转离心5min；取上清，至1.5mlEppendorf管加500ul异丙醇，混匀，15000转离心10min；弃上清，用75％乙醇1ml冲洗，高速离心5min；弃上清，RNA沉淀于空气中干燥（2－3min）；将干燥后的RNA溶解于DEPC处理水中；取1ul总RNA测OD260，并定量。②cDNA合成-13- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究primer合成列表Primer名称碱基序列(5'to3')hmiR126-5P-RTGTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGCGTAhmiR126-5P-FcaTTaTTacTTTTggTacgcgU6RTGTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAAAATATGU6-FATTAGCATGGCCCCTGCGMiRNAprimer-RTGCGTGTCGTGGAGTCG注：miRNAprimer是与RT引物相匹配的引物，F对应miRNA的特异引物。制备RT混合反应液：dNTP(2.5mMeach)2ul、10XRTButter2ul、RT特异引物（1uM）2ul、TotalRNA2ug、反转录酶（10U/ul）1ul、RNA酶抑制剂（40u/ul）1ul、无RNA酶水upto20ul。在PCR扩增仪进行RT反应：16℃（30min）、42℃（40min）、85℃（5min）；反应结束后，将其放在冰上待用或-20℃保存。③实时定量PCR：进行RealtimePCR反应:所有cDNA样品分别配制RealtimePCR反应体系,体系配置：2×PCRMIX（8µl）、10uM的PCR特异引物F（1µl）、10uM的PCR特异引物R（1µl）、cDNA（1µl），加水至总体积为16µl，混合后，5000rpm短暂离心。以上配置的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR反应。95℃，6min；50个PCR循环（95℃，10秒；55℃，10秒；72℃，30秒(收集荧光）。④结果与计算-△各样品的目的miRNA和内参（U6）分别进行RealtimePCR反应。数据采用2△CT法进行分析。⑵双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELisa法）①整理试剂和标本、制表,试剂盒中的各种试剂放置室温30min。②水箱加水，将泡沫放入水中。③按图表加样品、标准品每孔50ul，用膜封上，放入水浴锅孵育2h（加到最后一个样品时记录时间）。-14- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文④2h后，把样品水的倒掉（稍稍摇晃），每孔加入200ul洗液（倒一次擦一次），洗4~5次。⑤加入50ulAntibody，孵育2h，记时。⑥再洗，同4。⑦每孔加入50ulConjugate，孵育30min（此时可整理酶标仪450nm）。⑧30min后，再洗，同4。⑨每孔加入50ul底物酶（避光，盖上膜），孵育20min（若上色不明显，可放入水浴锅中），轻晃（突然变蓝可先加终止液）。⑩终每孔加终止液50ul（按顺序加），至变黄。测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终[6]止液后15分钟以内进行。3观察指标3.1一般情况性别、年龄、身高、体重、入组时CCS分级和心功能分级。3.2疗效机制指标miR-126、高敏C反应蛋白、单核细胞趋化因子-1、血管细胞粘附分子-1、清道夫受体A、清道夫受体B。3.3安全性指标观察血常规、肝功（丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶）、肾功（血尿素氮、血肌酐）有无异常出现及治疗中有无不良反应出现。4统计分析采用SPSS16.0统计分析软件进行数据分析。计量型数据符合正态性者采用均数±标准差进行统计描述，不符合正态性者用中位数进行统计描述；计数资料计算频数及构成比。计量资料组内比较采用配对样本t检验或符号秩和检验，组间比较采用成组t检验或秩和检验；计数资料采用卡方检验。所有统计检验均采用双侧检验。-15- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究实验结果1.试验对象一般数据对比1.1PPS数据集范围：经招募、筛选受试者后，试验组与对照组符合要求的入组病例各80例，共计160例。经过招募、筛选受试者，纳入合格病例，试验组和对照组各80例，共计160例，均进入FAS集。完成病例试验组75例，对照组70例，共计145例纳入PP集。见表1、表2。1.2基线水平对试验组和对照组受试者的性别、年龄、身高、体重、CCS心绞痛分级、NYHA心功能分级指标进行对比，试验组（小）、对照组（小）和正常人组的性别、年龄、身高、体重进行对比，试验组（小）和对照组（小）的CCS心绞痛分级、NYHA心功能分级指标进行对比，结果具有均衡性，差异无统计学意义（P＞0.05），见表3-表5。2.荧光定量PCR检测外周血miR-126结果2.1扩增曲线：荧光扩增曲线分为荧关背景信息、荧光信号指数扩增和平台期三个阶段。见图1曲线光滑完整，说明miR-126扩增产物没有非特异性的干扰。2.2溶解曲线：以miR-126的cDNA为模板，见图2发现Tm值基本一致，出现的峰值均为80℃，说明miR-126扩增产物没有非特异性的干扰。2.3miR-126在三组受试对象外周血中表达量对比药物干预前，试验组和对照组miR-126含量明显低于正常人组，差异均有统计学意义（P＜0.05），同时试验组和对照组没有差异（P＞0.05）；药物干预后，试验组和对照组miR-126的含量虽然有所增加，但是也没有达到正常人组的含量高度，与正常人组比差异均有统计学意义（P＜0.05），同时试验组比对照组的含量稍高，差异没有统计学意义（P＞0.05）。统计方法用TTEST，结果见图3、图4、表6。3.实验室指标对比：试验组和对照组均在给药后0周、4周、12周采集血样，两组0周、4周、12周血清hs-CRP、MCP-1、VCAM-1、SR-A、SR-B对比。两组组间比较用成组T检验，两组0周和4周血清hs-CRP、MCP-1、VCAM-1、SR-A、SR-B比较均无统计学意义（P＞0.05），12周、12-0周：血清hs-CRP、MCP-1、VCAM-1试验组低于对照组，且有统计学意义（P＜0.05）；SR-A试验组高于对照组，无统计学意义（P＞0.05）；SR-B试验组高于对照组，无统计学意义（P＞0.05）。结果见表7-表11。-16- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文两组组内0周与4周、0周与12周比较用配对T检验。0周与4周比较除了对照组VCAM-1有统计学意义（P＜0.05）外，其余炎性因子指标在两组中均无统计学意义（P＞0.05）。0周与12周比较：试验组中hs-CRP、MCP-1、VCAM-1均降低，且有统计学意义（P＜0.05），SR-A有下降趋势，无统计学意义（P＞0.05），SR-B有升高趋势，无统计学意义（P＞0.05）；对照组中给药前后对比hs-CRP、MCP-1、VCAM-1、SR-A、SR-B均无统计学意义（P＞0.05），结果见表12-表21。4.给药前后冠心病患者外周血miR-126和炎症因子的相关关系中，只有给药前miR-126和粘附因子VCAM-1呈负相关（r=-0.694，P=0.000）；miR-126与其他炎症因子无直线相关关系。结果见图5、表22、表23。-17- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究附图图1miR-126扩增曲线图2miR-126熔解曲线-18- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文图3三组miR-126给药前的含量图4三组miR-126给药后的含量-19- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究图5心绞痛患者中miR-126与VCAM-1的相关性-20- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文附表表1各分中心数据集分布情况试验组对照组合计序号中心名称入组PP入组PP入组PP1辽宁中医药大学附属医院2019201740362辽宁省中医药研究院1212121124233内蒙古民族大学附属医院666512114沈阳医学院沈洲医院2220222244425中国医科大学附属第一医院1414141028246中国医科大学附属盛京医院6465129——合计80758070160145表2完成试验例数试验组对照组合计入选总人数8080160完成人数7570145脱落人数(脱落率％)5（6.25）10（12.5）15脱落原因失访257时间超窗235不符合入选标准、纳排标准123-21- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究表3试验组和对照组受试者基线水平项目试验组(N=75)对照组(N=70)P值统计方法性别（%）男33（44）38（54.29）0.216卡方检验女42（56）32（45.71）年龄59.76±6.1158.99±6.460.459t检验身高165.65±8.16166.96±6.870.301t检验体重68.43±9.4769.12±9.460.663t检验CCS心绞痛分级（%）Ⅱ级68（90.67）63（90）Mann-WhitneyU检0.892Ⅲ级7（9.33）7（10）验NYHA心功能分级（%）Ⅰ级5（6.67）5（7.14）Mann-WhitneyU检Ⅱ级63（84）58（82.86）0.976验Ⅲ级7（9.33）7（10）表4试验组（小）、对照组（小）和正常人的基线水平例性别组别年龄（岁）体重（Kg）身高（cm）数男女试验组（小）1981160.32±5.71267.46±9.412166.74±8.150对照组（小）1971258.57±5.73568.63±9.560167.57±7.488正常人组2081260.58±6.01769.59±9.591166.54±7.678P值0.2970.2910.4300.263表5试验组（小）和对照组（小）的心绞痛和心功能情况CCS心绞痛分级（%）NYHA心功能分级（%）组别Ⅱ级Ⅲ级Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级试验组（小）17（51.5）2（40）1（50）16（51.6）2（40）对照组（小）16（48.5）3（60）1（50）15（48.4）3（60）P0.3750.315-22- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文表6三组miR-126的含量比较试验组对照组试验组与正常人组对照组与正常人组试验组与对照组项目前VS后前VS后前VS正后VS正前VS正后VS正前后⊿Ct0.9580.8820.5400.5640.5180.587-0.2710.961-⊿⊿Ct20.5150.5430.6880.6760.6980.6661.2070.514P0.7340.5140.0000.0000.0000.0000.7880.809表7高敏C反应蛋白（hs-CRP）的组间比较组别试验组（N=75）对照组(N=70)T值P值时间点第0周93.74±80.79489.24±61.3650.3820.703第4周89.69±71.78298.52±56.045-0.8370.404第12周77.45±73.216107.72±75.044-2.5000.014表8单核细胞趋化因子-1（MCP-1）的组间比较组别试验组（N=75）对照组(N=70)T值P值时间点第0周457.15±437.623462.42±511.085-0.0680.946第4周421.34±386.765381.86±238.6530.7480.456第12周281.79±246.238525.11±677.533-2.9530.004表9血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）的组间比较组别试验组（N=75）对照组(N=70)T值P值时间点第0周859.01±705.056937.20±735.872-0.6650.507第4周960.32±590.5161163.98±647.9420.7010.485第12周626.75±353.041984.15±536.9602.2610.025-23- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究表10清道夫受体A（SR-A）的组间比较组别试验组（N=75）对照组(N=70)T值P值时间点第0周11.79±8.97612.32±8.690-0.3660.715第4周11.10±10.01611.22±12.043-0.0680.946第12周10.77±11.0529.61±8.4370.7190.474表11清道夫受体B（SR-B）的组间比较组别试验组（N=75）对照组(N=70)T值P值时间点第0周13.13±6.47514.53±7.057-1.2640.208第4周13.44±6.77913.63±9.271-0.1390.890第12周14.75±7.48713.04±6.0821.5300.128表12试验组高敏C反应蛋白（hs-CRP）的组内比较组别试验组(N=75)T值P值时间点第4周3.78±76.3410.4320.667第12周16.51±70.2742.0480.044表13对照组高敏C反应蛋白（hs-CRP）的组内比较组别对照组(N=70)T值P值时间点第4周-9.29±67.812-1.1700.246第12周-18.49±-79.592-1.9840.051表14试验组单核细胞趋化因子-1（MCP-1）的组内比较组别试验组(N=75)T值P值时间点第4周35.81±531.7130.5910.556第12周175.36±518.1392.9700.004-24- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文表15对照组单核细胞趋化因子-1（MCP-1）的组内比较组别对照组(N=70)T值P值时间点第4周80.56±476.9561.4430.153第12周-62.69±820.555-0.6530.516表16试验组血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）的组内比较组别试验组(N=75)T值P值时间点第4周-101.31±114.54-1.6510.070第12周232.26±352.0153.8190.000表17对照组血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）的组内比较组别对照组(N=70)T值P值时间点第4周-226.78±918.651-2.1090.038第12周-46.95±802.194-0.5000.619表18试验组清道夫受体A（SR-A）的组内比较组别试验组(N=75)T值P值时间点第4周0.70±11.1310.5480.585第12周1.02±14.3440.6240.535表19对照组清道夫受体A（SR-A）的组内比较组别对照组(N=70)T值P值时间点第4周1.10±11.6570.8080.422第12周2.82±11.9691.9960.050-25- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究表20试验组清道夫受体B（SR-B）的组内比较组别试验组(N=75)T值P值时间点第4周-0.31±6.011-0.4580.648第12周-1.62±7.520-1.8920.062表21对照组清道夫受体B（SR-B）的组内比较组别对照组(N=70)T值P值时间点第4周0.90±10.0230.7670.446第12周1.48±8.5401.4850.142表22冠心病患者给药前miR-126与炎症因子的相关性hs-CRPMCP-1VCAM-1SR-ASR-B相关系数（r）0.389-0.422-0.6940.5830.457miR-126显著性（P）0.1750.17200.0950.276表23试验组和对照组冠心病患者给药后miR-126与炎症因子的相关性hs-CRPMCP-1VCAM-1SR-ASR-B试验组对照组试验组对照组试验组对照组试验组对照组试验组对照组相关系数（r）0.6220.289-0.388-0.265-0.541-0.7210.8520.4960.4850.329miR-126显著性（P）0.2510.1970.0850.1380.0630.0590.1080.2930.3970.094-26- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文讨论冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronaryatheroscleroticheartdisease）在很多发达国家排在死亡原因的第一位，在我国也呈逐年上升和年轻化的趋势，严重危及人的生命。1979年世界卫生组织曾将之分为五型：①隐匿型或无症状型冠心病；②心绞痛；③心肌梗死；④缺血性心肌病；⑤猝死。近年趋向于根据发病特点和治疗原则不同分为两大类：①慢性冠脉病（chroniccoronaryarterydisease,CAD），也称慢性心肌缺血综合征（chronicischemicsyndrome,CIS）；②急性冠状动脉综合征（acutecoronarysyndrome，ACS）。前者包括稳定型心绞痛、缺血性心肌病和隐匿性冠心病等；后者包括不稳定型心绞痛（unstableangina,UA）、非ST段抬高型心肌梗死（non-ST-segmentelevationmyocardialinfarction,NSTEMI）和ST段抬高型心肌梗死（ST-segment[7]elevationmyocardialinfarction,STEMI）。冠心病稳定型心绞痛的病发与血管内皮功用紊乱,氧供与需求失衡，血小板活化,炎症反应,斑块破裂、血栓形成以及血清脂质代谢异常密切相关,药物治疗主要以扩冠、降低心肌耗氧量、改善血管内皮功能、抗血[8]小板聚集、调脂、抗凝等为主。本病属于中医“胸痹”范畴，病机为心脉痹阻，临床主要表现为本虚标实，虚实夹杂，实为寒凝、血瘀、气滞、痰浊，痹阻胸阳，阻滞心脉；虚为气虚、气阴两虚、阳气虚衰，肝、脾、肺、肾等脏亏虚导致心脉失养。中医药在辨证论治的原则下施以活血、祛痰、温阳、益气、补肾等治法，疗效显著，并且在作用机制上有了深层次的研究。冠状动脉粥样硬化性心脏病发病的使动因素是内皮功能紊乱，患者体内过度的炎症反应和免疫反应严重影响了机体功能，造成了难以逆转的损伤。冠心病事件的发生与冠状动脉内皮功能异常是分不开的，内皮功能紊乱可导致灌注心肌的血流量减少，从而导致冠状动脉痉挛。炎症因子的介导以及脂质代谢等在内皮细胞激活过程中起这关键的作用，同时也是先于疾病发作的预测指标。近几年，miRNA的研究已成为热点，在许多疾病的发生发展过程中都有重要意义。其中miR-126被发现在冠心病的发生、发展和预测方面最为重要，由于它易于在血清中检出，并且存在稳定，作为冠心病早期检测的生物标记物，研究也很广泛。miR-126通过抑制VCAM-1的表达而抑制内皮细胞炎症反应。有研究证实，miR-126也可通过调节[9]CXC类趋化因子CXCL12而调控血管内皮细胞的凋亡。在冠心病急性缺血损伤时，miR-126可下调磷酸酰基醇-3-激酶调节亚基-2（PIK3R2），激活PI3K，介导AKt/PKB磷酸化，调节血管新生。有研究证实，在稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛和心肌梗死患-27- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究者的对比中，miR-126在稳定型心绞痛中表达明显下降，说明miR-126与冠心病严重程度密切相关。本研究对三组试验对象的年龄、体重、身高、心率、收缩压、舒张压进行了数据分析，结果显示差异无统计学意义，排除了这些因素对试验的影响。药物干预前，试验组和对照组miR-126含量明显低于正常人组，差异均有统计学意义，同时试验组和对照组没有差异；药物干预后，试验组和对照组miR-126的含量虽然有所增加，但是也没有达到正常人组的含量高度，与正常人组比差异均有统计学意义，同时试验组比对照组的含量稍高，差异没有统计学意义。结果说明1、患冠心病后，人外周血中miR-126的含量会降低，与以往文献相符；2、服用益气健脾和血祛痰药物治疗是有效的，miR-126含量有所提高，反应了其表达量与冠心病严重称度密切相关，可以作为反应冠心病病情的生物学指标。20世纪30年代，研究者在在感染肺炎链球菌的急性期患者血清中发现了一种蛋白质，由于其能与细菌细胞壁的C多糖成分结合并沉淀，故被命名为C反应蛋白（CRP）。直到40年后，CRP的配体才陆续被识别。CRP主要在肝脏内合成，遇到急性炎症，CRP可以快速升高到1000倍以上。CRP基因被发现在人体1号染色体上，基因序列中含有一个内含子分隔外显子。CRP是一个中央带孔的环形结构，由五个相同的非共价连接的亚单位组成。每个亚单位都有一个由两个钙离子和一个疏水环构成的结合位点来识别胆碱磷酸配体。亚单位的对面是与补体C1q和免疫球蛋白受体FCR结合的效应器。CRP是不能与正常细胞的胆碱磷酸结合的，因为在正常细胞中的CRP与胆碱磷酸结合的部位是[10]隐藏的，所以CRP只能与凋亡或坏死细胞内的胆碱磷酸结合。机体对抗感染的第一道防线是CRP与C1q结合启动的经典补体途径以及与免疫球蛋白受体结合激活吞噬作用。人MCP-1/MCAF基因定位于第17对染色体，包含了3个外显子，第一个外显子非常重要，编码23个氨基酸及5’端非翻译区的信号肽遗传信息及MCP-1蛋白的前2个氨基酸，第二个外显子编码3～40个氨基酸，C端其余36个氨基酸序列及3’端非翻译区由第三个外显子编码。人MCP-1前体长99个氨基酸，切除23个氨基酸先导序列后形成76氨基酸的成熟分子，为碱性蛋白除了单个核白细胞、成纤维细胞外，在神经元、星形胶[11]质细胞和小胶质细胞的神经组织细胞中被发现也能自主或在诱导下分泌MCP-1。在神经元中，MCP-1主要表达在海马、巨细胞网状核、面部核、外侧下丘脑和小脑的浦肯野[12]细胞、下丘脑室旁核和三叉神经脊束核、黑质、视上核、苍白球和大脑皮质。体外实-28- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文验表明，IFN-γ、IL-1β和TNF可刺激内皮细胞表达MCP-1mRNA，3小时即可出现并能持续至24小时以后。实验发现，人内皮细胞及平滑肌细胞被稍被氧化修饰的低密度脂[13]蛋白刺激后产生的单核细胞趋化活性较对照组强2～3倍。在IL-1β的作用下，培养的鼠肺泡I型上皮细胞产生的MCP-1表达增强。分布于人红细胞表面的Duffy抗原也可[14]结合MCP-1。此外，一些肿瘤细胞如骨肉瘤细胞、黑色素瘤细胞、成胶质细胞瘤细胞、纤维肉瘤细胞、横纹肌肉瘤细胞也能分泌MCP-1。这些结果提示MCP-1可能与动脉粥样[15]硬化，肺间质纤维化及肿瘤的发生、发展都有密切的关系。在动脉粥样硬化发展过程中血管内皮功能障碍是始动因素，同时血管内皮受损也出现在动脉粥样硬化疾病的各个阶段。血管内皮损伤可导致细胞表面特性发生变化，相关信号转导途径被激活，VCAM-1等大量促进内皮细胞发生炎症的细胞因子被转录释放，VCAM-1可把单核细胞迁移入内皮下层成为巨噬细胞，巨噬细胞摄取脂质后转化为泡沫细[16]胞，向淋巴细胞提供抗原使炎症反应发生。VCAM-1也可通过释放多种细胞因子，促使平滑肌细胞增殖，形成纤维斑块。因此，VCAM-1是动脉粥样硬化早期斑块形成的关键因子。动脉粥样硬化斑块中存在着含脂类的泡沫细胞，这种泡沫细胞的主要成分是巨噬细胞泡沫细胞。研究表明，对巨噬细胞泡沫细胞起重要作用的是ox-LDL，而清道夫受体(SR)[17]是介导细胞摄取ox-LDL的主要途径。所以，SR的表达是动脉粥样硬化斑块泡沫细胞形成的关键。SR-A是最早被发现的，在AS病变区，主要存在于巨噬细胞上，是巨噬细胞分化成熟的标志之一。在单核细胞向巨噬细胞分化及巨噬细胞向泡沫细胞转化的过程中，SR-A的水平均升高。SR-B主要表达于肝脏中，是目前唯一真正能够介导细胞与HDL作用的受体，此外，SR-B还可于乙酰化低密度脂蛋白、天然低密度脂蛋白和磷脂酰丝氨[18]酸等结合。本研究挑选的试验对象排除了冠心病稳定型心绞痛脾虚痰浊证以外的其他类型冠心病，并对两组试验对象的年龄、体重、身高、心率、收缩压、舒张压进行了数据分析，结果显示差异无统计学意义，排除了这些因素对试验的影响。研究结果发现，试验组中hs-CRP、MCP-1、VCAM-1这三个炎症指标给药后下降明显，与对照组比较有显著差异，SR-A有下降趋势、SR-B有升高趋势。对照组中给药后炎症因子变化均无统计学意义。本研究结果说明1、冠心病稳定性心绞痛是一种过度的炎症反应状态，在疾病中的炎症介质表达很高，这与很多研究结果是相同的。2、服用试验药物后冠心病稳定型心绞痛患者血清中hs-CRP、VCAM-1、SR-A、MCP-1均降低，表明hs-CRP、VCAM-1、SR-A、MCP-1-29- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究参与了疾病的发展，其机制可能是冠心病患者体内过度的炎症状态促使炎症因子增加，使hs-CRP、VCAM-1、SR-A、MCP-1大量合成，最终导致了内皮功能紊乱，致使冠心病的发生。3、服用试验药物后冠心病稳定型心绞痛患者血清中SR-B水平轻微升高，趋势与文献相符。SR-B是HDL的受体，因此在胆固醇的清除中起着重要作用，SR-B与血清高密度脂蛋白间存在协同作用，能够减少动脉壁脂质沉积，对动脉粥样硬化的形成有抑制作用。4、在冠心病稳定型心绞痛脾虚痰浊证患者中用益气健脾和血祛痰法治疗是有效的，以往其他试验也证实了这一点。预示着健脾化浊法改善了冠心病患者体内过度炎症反应状态。在冠心病稳定型心绞痛的发病机制中miR-126与炎症因子共同参与了内皮功能紊乱的机制。本试验发现冠心病稳定型心绞痛患者外周血中miR-126与VCAM-1有明显的负相关性，推测VCAM-1在疾病发展中加重了对血管系统的损害，miR-126可能对VCAM-1有一定的抑制作用，但抑制作用的程度无法确定。综上所述，用益气健脾和血祛痰法治疗冠心病脾虚痰浊证患者可以升高外周血中miR-126的含量，同时降低血清中SR-B以外的炎症因子的表达，说明miR-126与炎症因子共同参与了疾病的发病机制，且miR-126可抑制VCAM-1的表达。但遗憾的是，本试验没有从基因作用靶点层面探讨miR-126与炎症因子的作用关系，希望今后能深入研究，来探索miR-126和炎症因子相互间作用通路对冠心病的影响程度。-30- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文结论1.冠心病稳定型心绞痛患者外周血中miR-126的含量低于正常人，给予试验药品后患者血清中SR-B之外的炎症因子含量降低。2.冠心病稳定型心绞痛患者外周血中miR-126与粘附分子VCAM-1成负相关，miR-126可以作为反应冠心病严重程度的生物学标志。3.益气健脾和血祛痰法治疗冠心病稳定型心绞痛脾虚痰浊证患者有效，可升高外周血中miR-126的水平，同时降低血清中SR-B之外的炎症因子的含量。-31- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究本研究创新性的自我评价本试验用益气健脾和血祛痰法治疗冠心病稳定型心绞痛脾虚痰浊证患者后，检测其血清中miR-126的含量和炎症因子水平及相关关系，为揭示“从脾论治”冠心病稳定型心绞痛疗效机制发生的规律，同时为研究中医药治疗冠心病的疗效机制提供试验依据。-32- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文参考文献[1]熊琴梅,周琼琼,刘勇,曹玲玲,刘欣,贺文凤,申阳,周素贞,徐劲松,程晓曙,洪葵.冠心病患者生活质量现状及其相关影响因素分析[J].临床心血管病杂志,2014,01:27-30.[2]曲文彦，吕晓濛，赵娜.中医药治疗冠心病的作用机制概述[J].辽宁中医药大学学报,2016.[3]高芳,刘蕾.手足口病患儿外周血白细胞计数、空腹血糖、超敏C反应蛋白水平变化[J].山东医药,2016,03:66-67.[4]姜海华,张胜利.冠心病患者血清同型半胱氨酸和超敏C反应蛋白测定临床价值[J].中国现代医生,2016,02:109-111+114.[5]李俊玲,张澄元,王琳,宫玲玲,周志强.酶联免疫吸附法及饲料中的检测对象[J].山东畜牧兽医,2004,01:30.[6]赵萌,盐酸小檗碱对2型糖尿病大鼠血管平滑肌细胞作用的研究[J].泸州医学院硕士论文,2010.[7]金红梅.舒血宁注射液与丹参注射液治疗不稳定型心绞痛疗效观察[J].中国社区医师,2014,26:83-84.[8]赵忱,赵志强,王强.中医药治疗冠心病心绞痛的作用机制概述[J].中西医结合心脑血管病杂志,2012,05:588-589.[9]赵慧辉,王伟,郭淑贞.冠心病不稳定型心绞痛血瘀证的蛋白质组学[J].中国动脉硬化杂志,2008,07:545-548.[10]VolanakisJE,KaplanMH.SpecificityofC-reactiveproteinforcholinephosphateresiduesofpneumococcalC-polysaccharide.ProcSocExpBiolMed.[11]BlackS,AgrawalA,SamolsD.Thephosphocholineandthepolycation-bindingsitesonrabbitC-reactiveproteinarestructurallyandfunctionallydistinct.MolImmunol,2003,39(16):1045-54.[12]罗军,周晓萍,袁红伶,徐剑.慢性肾衰竭患者血清MCP-1、ANGⅡ水平变化[J].山东医药,2014,39:45-46.[13]郑璐玉,杨玲玲,李玲孺,井慧如,王济,王前飞,王琦.液相芯片技术检测痰湿体质人群TNF-α、IL-6、CRP及MCP-1的表达研究[J].中国中西医结合志,2013,07:920-923.-33- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究[14]张佩莲,邓丹琪.趋化因子MCP-1、MIP-1α、RANTES与自身免疫性疾病[A].中国中西医结合学会变态反应专业委员会.第六次全国中西医结合变态反应学术大会论文汇编[C].中国中西医结合学会变态反应专业委员会:,2013:1.[15]李小会,赵明君,雷根平.通络益肾方对高糖诱导肾小球系膜细胞NF-κB、MCP-1表达的影响[J].世界最新医学信息文摘,2015,62:18-19.[16]张迎怡,陈树涛,丛洪良.MCP-1及其基因多态性与原发性高血压的关系[J].山东医药,2015,39:93-94.[17]唐可京,谢灿茂,李幼姬.细胞间粘附分子-1和血管细胞间粘附分子-1的结构与功能[J].细胞与分子免疫学杂志2002.doi:10.3321/j.issn:1007-8738.2002.02.037.[18]Murgas,P.,Cornejo,F.A.,Merino,G.,VonBernhardi,R..SR-Aregulatestheinflammatoryactivationofastrocytes[J].Neurotoxicityresearch2014,1(1).-34- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文附录综述miR-126、炎性因子与冠心病的关系[1]摘要：冠心病心绞痛的病发与血管内皮功用紊乱,氧供与需求失衡，血小板活化,炎症反应,斑块破裂、血栓形成以及血清脂质代谢异常密切相关,药物治疗主要以扩冠、降低心肌耗氧量、改善血管内皮功能、抗血小板聚集、调脂、抗凝等为主。内皮功能紊乱是冠心病的主要特征。研究证实，miR-126作为最新的诊断和评估冠心病病情和风险的分子标志物之一，参与调控包括血管生成、炎症反应、细胞凋亡等内皮细胞的生理特性。冠心病是一种过度的炎症反应状态，患者体内炎性因子升高。因此，将miR-126和炎性因子对冠心病的作用机制论述如下。关键词：miR-126；炎性因子；冠心病一、miR-126与冠心病的关系miRNA在近几年的研究中非常广泛，并已取得了许多重要的成果。miRNA由21-26个碱基组成并在动植物体内广泛存在，是一类具有很好的进化保护性和稳定性的非编码单链小分子RNA。研究发现miRNAs在动植物的增值凋亡、细胞分化、激素分泌、生长发育和肿瘤形成等方面都有很重要的意义。原因是miRNAs可以与特异性靶信使结合，抑制基因表达，调控生物体发育时序和细胞周期等过程，具有非常重要的病理和生理意义[2]。其中miRNA-126被发现在冠心病患者体内存在稳定，在内皮细胞和心脏中高度表达，[3]与冠心病的发生、发展及严重程度都有密切的关系。1.miR-126的序列及表达谱miR-126位于Egfl7基因的第7内含子，前体能折叠成四个类似“发夹”的形状，是非常稳定的二级结构。miR-126是一类高度保守的miRNA，其中自由能最低的[4]-39.6kcal/mol。2010年miRBase公布并标记出了15种动物的miR-126的成熟体序列，其中大鼠和人类的miR-126的成熟体序列相同，均为UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG；野马和[5]小鼠的序列分为CAUUAUUACUUUUGGUACGCG和miR-126-5p两个亚型。有研究发现，miR-126的成熟体是重要的生物学片段，发挥了特有的生物学功能。有研究发现，用荧光定量PCR方法检测人体组织和细胞中的miR-126含量，发现miR-126在人脐静脉内皮-35- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究细胞、心脏、肺脏和胃组织中表达量较高，在肿瘤细胞中表达较低，在骨骼肌、肾脏和大脑中几乎无表达，明确了miR-126在人体中的表达情况。2.miR-126与内皮功能障碍冠脉疾病发生的重要原因之一是内皮功能受损，动脉粥样硬化性疾病发生、发展的重要因素是血管内皮的损害。血管内皮受损，内皮细胞表面的相关信号转导通路被激活，转录并释放大量促进内皮细胞发生炎症反应的炎性因子，例如hs-CRP、MCP-1、VCAM-1等等。其中VCAM-1是促使动脉粥样硬化早起形成的关键因子，同时也是miR-126的靶基因，一方面可以促进单核细胞迁移，进入内皮下层，转化成为巨噬细胞，摄取脂质后[6]转化为泡沫细胞，向淋巴细胞提供抗原，引起免疫反应；另一方面，VCAM-1释放多种细胞因子，促进平滑肌细胞表型转化和增殖，形成纤维斑块。有研究证实，VCAM-1是由肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的，而miR-126能够抑制VCAM-1的表达，敲除[7]miR-126反义寡核苷酸的小鼠中，VCAM-1的表达量升高。因此，可以上调miR-126的含量而抑制VCAM-1的表达，从而抑制冠状动脉粥样硬化的进展。3.miR-126与细胞凋亡有研究表明，凋亡或坏死的心肌细胞在细胞外降解的过程中可释放miRNA。由于细胞凋亡在梗死或严重缺血缺氧的情况下发生的，所以研究者制备内皮细胞缺氧模型来检测内皮细胞miR-126的表达情况。内皮细胞缺氧模型采用低氧培养箱制备，用RT-PCR的方法检测，结果显示，试验组比对照组miR-126的水平升高了3倍，说明缺氧环境可[8]促进内皮细胞凋亡并释放miR-126。细胞凋亡的调控中心是线粒体，它是细胞呼吸和氧化磷酸化的中心，控制着细胞的生命活动。线粒体中的Cyt-c释放到细胞质后，与凋亡相关因子1在在dATP存在的条件下结合成多聚体，并促使caspase-9与其结合形[9]成凋亡小体，被激活的caspase-9诱导细胞凋亡。Zernecke等发现miR-126可调控CXC类趋化因子CXCL12从而调控内皮细胞的凋亡。二、炎性因子与冠心病的关系目前，动脉粥样硬化与炎症反应的关系已经被大量研究证实，越来越多的与动脉粥样硬化有关的炎症因子也陆续被提出，但是早在1856年，当德国病理学家Virchow首次提出动脉粥样硬化属于动脉内膜的炎症反应的论断是并没有受到重视。近年来，普遍认可的炎症因子有参与全身应急炎症反应的hs-CRP，趋化单核细胞到内膜下的MCP-1、与单核细胞粘附的VCAM-1，介导LDL的SR-A，以及HDL的受体SR-B等，它们都在炎症-36- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文反应中起着特别重要的作用，故也同时参与了冠心病的病情发展。1.高敏C反应蛋白（hs-CRP）是预测心血管事件危险性的最重要的预测因子。冠心病患者血清中hs-CRP的含量变化可以判断疾病的严重程度，因为hs-CRP是全身性炎症[10]反应急性期的非特异性标志物。李玉彬收集门诊患者，分为不稳定型心绞痛组、稳定型心绞痛组和对照组，每组各30例。受试者于入院后24小时内采集血清，检测血清中hs-CRP的含量，结果显示对照组中最少，不稳定型心绞痛中最高。结果表明hs-CRP含量与冠心病严重程度密切相关。2.单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）是新发现的一种趋化细胞因子,属于趋化细胞因子超家族中β家系成员之一，它具有趋化和激活单核巨噬细胞的双重活性,与炎性疾病的[11]关系非常密切，在慢性炎症、抗肿瘤及机体防御等方面都发挥着非常重要的作用。流行病学研究表明，急性冠状动脉综合征患者血清MCP-1水平高于健康人群，且血清MCP-1水平升高程度与冠状动脉综合征患者预后成负相关。Hoogeveen等研究血浆MCP-1水平与外周动脉疾病或冠状动脉粥样硬化性心脏病之间关系时发现，MCP-1随动脉粥样[12]硬化程度增加而增加，MCP-1是心血管疾病的独立危险因素。近年来的分子水平研究显示，构成动脉粥样硬化病变的主要细胞，如单核细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮[13]细胞，均能表达MCP-1，并特异性地作用于外周血中的单核细胞，招募其迁移到内皮[14]下，构成AS发生发展的重要机制。3.血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）增强内皮细胞和白细胞的粘附，使白细胞向内皮[15]下游走。VCAM-1主要参与动脉粥样硬化形成的初始阶段。王宝英等对63例冠状动脉蜡块标本进行研究发现，相对于正常组，动脉粥样硬化板块中的VCAM-1含量显著增高。说明VCAM-1参与了动脉粥样硬化的发生和发展，且与动脉粥样硬化的严重程度密切相关。4.清道夫受体（SR）是一种结构多样化的糖蛋白受体。清道夫受体目前被分为A、B、C、D、E、F、G几类。研究表明，清道夫受体和动脉粥样硬化进程的各个阶段均有不同程度的关联性，其中清道夫受体A（SR-A）和清道夫受体B(SR-B)已经被众多研究证实与动脉粥样硬化存在密切联系。清道夫受体A（SR-A）是一种模式识别受体,它能够通过介导氧化修饰低密度脂蛋白(LDL)促进泡沫细胞形成,并能够通过激活信号通路促进巨噬细胞凋亡来加速动脉粥样硬化病变的进展，主要表达在巨噬细胞表面。清道夫受体B(SR-B)是HDL的受体，因此在胆固醇的清除中起着重要作用。在对清道夫受体AI转基因小鼠进行研究中发现，清道夫受体A能够在血管内皮细胞表达使脂质在血管壁的-37- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究[16]聚集增多,对动脉粥样硬化的形成有促进作用。李永红等在研究中发现，清道夫受体B则与血清高密度脂蛋白间存在协同作用，能够减少动脉壁脂质沉积，对动脉粥样硬化的形成有抑制作用。这说明SR-A值的高低与冠心病心绞痛的严重程度呈正相关，SR-B值的高低与冠心病心绞痛的严重程度呈负相关。综上所述，在冠心病稳定型心绞痛的发病机制中miR-126与炎症因子共同参与了内皮功能紊乱的机制。尽管目前miR-126及炎性因子的靶向治疗还需进一步研究，精确机[17]制也有待进一步发现，但其为慢性炎症方面提供了新的思路，我们相信，随着分子生物学技术的不断发展，miR-126、炎症因子与疾病的关系将越来越明确，从而为目前无特异性治疗并严重威胁人类健康的疾病开辟出新的治疗道路。参考文献[1]李联社，刘建荣，董铁昌.冠心宁治疗冠心病心绞痛56例[J].陕西中医，2007，28（10）：1275-1276.[2]LongG,WangF,DuanQ,etal.HumancirculatingMicroRNA-1andMicroRNA-126aspotentialnovelindicatorsforacutemyocardialinfarction.IntJBiol,2012,8:811-818.[3]CreemersEE,TijsenAJ,PintoYM.CirculatingMicroRNAs:NovelbiomarkersandextracellularcommunicatorsincardiovasculardiseaseCircRes,2012,110:483-495.[4]LiLM,HouDX,GuoYL,etal.RoleofmicroRNA-214-targetingphosphataseandtensinhomologinadvancedglycationendproduct-inducedapoptosisdelayinmonocytes.JImmunol,2011,86:2552-2560.[5]NahidMA,SatohM,ChanEK.MechanisticroleofmicroRNA-146ainendotoxin-induceddifferentialcross-regulationofTLRsignaling.JImmunol,2011,186:1723-1734.[6]HowellKW,MengX,FullertonDA,etal.Toll-likereceptor4mediatesoxidizedLDL-inducedmacrophagedifferentiationtofoamcells.JSurgRes,2011,171:27-31.[7]AlbinssonS,SessaWC.CanmicroRNAscontrolvascularsmoothmusclephenotypicmodulationandtheresponsetoinjury.PhysiolGenomics,2011,43:529-533.[8]ChenT,LiZ,JingT,etal.MicroRNA-146aregulatesthematurationprocessandpro-inflammatorycytokinesecretionbytargetingCD40LinoxLDL-stimulateddendriticcells.FEBSLett,2011,585:567-573.[9]Zernecke,Santiago-RaberML,CapponiL,etal.SilencingofcFosexpressionbymicroRNA-155iscriticalfordendriticcellmaturationandfunction.Blood,2011,117:-38- 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辽宁中医药大学2016届硕士学位论文在学期间科研成绩1.参与国家（973计划）“脾虚生痰”所致冠心病心绞痛“从脾论治”疗效机制及规律研究。2.研究生期间发表论文：曲文彦.中医药治疗冠心病的作用机制概述[J].辽宁中医药大学学报,2016.-41- 益气健脾和血祛痰法对冠心病患者miR-126、炎症指标的影响研究致谢我是来自辽北小城市的一名学生，父母在医院工作，所以我从小对医生职业有所向往。在家人和老师的引导下，我一直努力学习，2007年顺利考入了辽宁中医药大学中医学专业，开始了我的学医生涯，明确了未来的职业方向和目标。大学是我自主学习和生活的开始，在辽宁中医药大学这片医学的沃土里，我不断汲取营养，6年的本科学习使我对中医和西医知识都有了初步的了解，可我深知医学的深奥，要想做一名合格的医生还需要进一步提高。于是，2013年，我考取了心血管专家杨关林教授的研究生进行医学深造。我们的大家庭里人才济济，在杨教授的带领下，做了很多课题研究，其中包括国家“973课题”，能参与其中，我倍感荣幸。在此特别感谢杨关林教授、张哲师姐以及所有关心我、帮助过我的老师、朋友们，是你们让我获得了宝贵的知识、坚定了学医的步伐，今天能顺利完成毕业论文与你们的帮助是分不开的，今后我将带着所学的知识回报社会，在医学的道路上不断向前。-42-