益气健脾和血祛痰法对冠心病患者microRNA-33和血脂的影响及相关性分析

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目录一、摘要中文论著摘要..........................................................1英文论著摘要..........................................................4二、英文缩略词表..........................................................7三、正文益气健脾和血祛痰法对冠心病患者microRNA-33和血脂的影响及相关性分析前言..................................................................8材料与方法...........................................................10实验结果（附论文图片）...............................................18讨论.................................................................27结论.................................................................31四、本研究创新性的自我评价...............................................32五、参考文献.............................................................33六、附录综述.................................................................35个人简介.............................................................45在学期间科研成绩.....................................................46致谢.................................................................47 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文摘要目的：通过益气健脾和血祛痰法干预冠心病稳定型心绞痛脾虚痰浊证患者，检测冠心病稳定型心绞痛脾虚痰浊证患者及正常人血液中MicroRNA-33（miR-33）的表达情况和血清中总胆固醇（TC)、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）的含量，探讨益气健脾和血祛痰法对MicroRNA-33、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的影响及miR-33与TC、TG、HDL、LDL血清中表达的相关性，同时期望为冠心病的研究、诊断、治疗与预后提供有价值的生物标记物。材料与方法：本研究采用分层区组随机、盲法、安慰剂对照的方法，将符合诊断标准及纳入标准的160例冠心病稳定型心绞痛患者，按1：1的比例随机分配到试验组及安慰剂组，试验组在西医常规治疗的基础上加服具有益气健脾和血祛痰的中药颗粒剂,对照组在西医常规治疗基础上加服安慰剂（含试验组中药颗粒剂成分的10%）,两组均每日2次,每次1袋，疗程12周，随访2周。同时采集20例正常人的外周血液。采用染料（SYBRGreen）法检测外周血中miR-33的表达情况，采用比色法测定TC、TG、HDL、LDL的含量，观察miR-33、TC、TG、HDL、LDL的变化情况，并分析miR-33与TC、TG、HDL、LDL的相关性。结果：1.miR-33相对表达量：1）试验组与对照组两组间比较，试验前（0周）miR-33的表达量无统计学差异（P>0.05），试验后（12周）两组表达量均增高，试验组增高明显，但无统计学差异（P>0.05）。2）试验组试验后（12周）与试验前（0周）比较，miR-33的表达量增高，但无统计学意义(P>0.05)。3）对照组试验后（12周）与试验前（0周）比较，miR-33的表达量增高，但无统计学意义(P>0.05)。4）试验组与对照组试验前（0周）miR-33的含量均明显低于正常组，两组与正常组比较均有统计学意义（P=0.000），试验后（12周）两组表达量均增高，但仍低于正常组，两组与正常组比较有统计学有差异（P=0.000)。2.总胆固醇（TC）：-1- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析1）试验组与对照组两组间比较，第4周无统计学差异（P>0.05），第12周具有统计学差异（P<0.05）。2）试验组第4、12周与第0周比较，均有统计学意义（P<0.05）。3）对照组第4、12周与第0周比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。4）试验组作用优于对照组。3.甘油三酯（TG）：1）试验组与对照组两组间比较，第4周无统计学差异（P>0.05），第12周具有统计学差异（P<0.05）。2）试验组第4、12周与第0周比较，均有统计学意义（P<0.05）。3）对照组第4、12周与第0周比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。4）试验组作用优于对照组。4.高密度脂蛋白（HDL）：1）试验组与对照组两组间比较，第4周、第12周均无统计学差异（P>0.05）。2）试验组第4、12周与第0周比较，整体有上升趋势，但无统计学差异P>0.05。3）对照组第4、12周与第0周比较，均无统计学意义P>0.05。4）试验组作用优于对照组。5.低密度脂蛋白（LDL）：1）试验组与对照组两组间比较，第4周、第12周均具有统计学差异（P<0.05）。2）试验组第4、12周与第0周比较，均无统计学意义（P>0.05）。3）对照组第4、12周与第0周比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。6.相关性分析：miR-33与TC、TG、HDL、LDL均无相关性（P>0.05）。结论：1、益气健脾和血祛痰法可以调控冠心病稳定型心绞痛脾虚痰浊证患者的脂质代谢，降低TC、TG、LDL，升高HDL。2、益气健脾和血祛痰法可以提高冠心病稳定型心绞痛脾虚痰浊证患者外周血中miR-33的表达水平。3、在冠心病稳定型心绞痛患者中miR-33与TC、TG、HDL、LDL均无相关性。4、冠心病稳定型心绞痛患者外周血中miR-33的表达水平显著低于正常人，miR-33是一-2- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文个评价脂质代谢异常的生物标记物。关键词：益气健脾和血祛痰法；冠心病；脂质代谢；microRNA-33-3- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析AbstractPurpose：ByreplenishingqiandstrengtheningthespleenandnourishingbloodandeliminatingphlegmtotreattheCHDstableanginapectoriswithspleendeficiencyandphlegmsyndrome.miR-33,TC,TG,HDL,LDLofthemandmiR-33ofnormalpersonsareobserved.ThisstudyinvestigatestheeffectsofreplenishingqiandstrengtheningthespleenandnourishingbloodandeliminatingphlegmonMicroRNA33、TC、TG、HDL、LDL.ThecorrelationbetweenmiR-33andTC,TG,HDL,LDL.Itisexpectedtoprovidevaluablebiomarkersforthestudy,diagnosis,treatmentandprognosisofcoronaryheartdisease.Materialandmethod：Theclinicaltrialdesignwascarriedoutbyusingmulticenter,blindmethod,andrandomizedandparallelcontrolgroup.Firstrecruitsubjectsaccordingtotheselectioncriteria,andthendividedthe160subjectsintotestandcontrolgroupataproportionof1:1.SubjectsintestgroupsweregivenTCMgranulewhichreplenishingqiandstrengtheningthespleenandnourishingbloodandeliminatingphlegm,combiningconventionalwesternmedicine；controlgroupsweregivenplaceboTCMgranules(10%oftheconstituentsofthetestgroups),combiningconventionalwesternmedicine.Twogroupswere2timesaday,eachtime1bags,12weeksoftreatment,followedupfor2weeks.Atthesametime,20casesofnormalhumanperipheralbloodwerecollected.SYBRGreenmethodwasusedtoinvestigatemiR-33andColorimetrymethodwasusedtoinvestigateTC,TG,HDL,LDL.ThechangesofTC,TG,HDL,LDLandmiR-33wereobserved.AnalysisofthecorrelationbetweenmiR-33andTC,TG,HDL,LDL.Results：1.RelativeexpressionofmiR-331）TherewasnostatisticalsignificanceintheexpressionofmiR-33betweenthetestgroupandthecontrolgroupbeforetreatment(P>0.05).TherewasnostatisticalsignificanceintheexpressionofmiR-33betweenthetestgroupandthecontrolgroupaftertreatment(P>0.05).2）TheexpressionofmiR-33wasincreasedaftertreatmentinthetestgroup,butnostatisticalsignificance(P>0.05).3）TheexpressionofmiR-33wasincreasedaftertreatmentinthecontrolgroup,butnostatisticalsignificance(P>0.05).4）Theexpressionoftwogroupsarelowerthantheexpressionofthenormalgroupbefore-4- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文treatmentanditwasstatisticallysignificant(P=0.000).Boththeexpressionofthetestgroupandthecontrolgroupaftertreatmentareallincreased,butitwasstilllowerthanthenormalgroupexpression.Itwasstatisticallysignificant(P=0.000).2.TC1）Itwasnotstatisticallysignificant,comparingweek4ofthetwogroups(P>0.05).Itwasstatisticallysignificant,comparingtheweek12(P<0.05).2）TCinthetestgroupwasstatisticallysignificant,comparingweek4andweek12withweek0(P<0.05).3）TCinthecontrolgroupwasnotstatisticallysignificant,comparingweek4andweek12withweek0(P>0.05).4）Thetestgroupwasbetterthanthecontrolgroup.3.TG1）Itwasnotstatisticallysignificant,comparingweek4ofthetwogroups(P>0.05).Itwasstatisticallysignificant,comparingtheweek12(P<0.05).2）TGinthetestgroupwasstatisticallysignificant,comparingweek4andweek12withweek0(P<0.05).3）TCinthecontrolgroupwasnotstatisticallysignificant,comparingweek4andweek12withweek0(P>0.05).4）Thetestgroupwasbetterthanthecontrolgroup.4.HDL1）Itwasnotstatisticallysignificant,comparingweek4andweek12ofthetwogroups(P>0.05).2）HDLinthetestgroupwasincreasedthanbeforetreatment,butitinthetestgroupwasnotstatisticallysignificant,comparingweek4andweek12withweek0(P>0.05).3）HDLinthecontrolgroupwasnotstatisticallysignificant,comparingweek4andweek12withweek0(P>0.05).4)Thetestgroupwasbetterthanthecontrolgroup.5.LDL1）Itwasnotstatisticallysignificant,comparingweek4ofthetwogroups(P>0.05).Itwasstatisticallysignificant,comparingtheweek12(P<0.05).2）LDLinthetestgroupwasnotstatisticallysignificant,comparingweek4andweek12withweek0(P>0.05).-5- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析3）LDLinthecontrolgroupwasnotstatisticallysignificant,comparingweek4andweek12withweek0(P>0.05).6.CorrelationanalysisThereisnocorrelationbetweenmiR-33andTC,TG,HDLandLDL(P>0.05).Conclusion：1.TC,TG,LDLinpatientswithstableanginapectoriswasdecreasedandHDLinpatientswithstableanginapectoriswasincreasedbyReplenishingqiandstrengtheningthespleenandnourishingbloodandeliminatingphlegm.2.TheexpressionlevelofmiR-33inpatientswithstableanginapectoriswasincreasedbyReplenishingqiandstrengtheningthespleenandnourishingbloodandeliminatingphlegm.3.ThereisnocorrelationbetweenmiR-33andTC,TG,HDL,LDL.4.TheexpressionlevelofmiR-33waslowerthanthatofnormalperson,miR-33isanevaluateofabnormallipidsmetabolismbiomarker.Keyword：replenishingqiandstrengtheningthespleenandnourishingbloodandeliminatingphlegm；CHD；lipidmetabolism；miR-33-6- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文英文缩略语英文缩写英文全称中文全称动脉粥样硬化ASatherosclerosisCHDCoronaryheartdisease冠状动脉粥样硬化性心脏病NYHANewYorkHeartAssociation美国纽约心脏病学会加拿大心血管学会CCSCanadianCardiovascularSociety微小核糖核酸33miR-33microRNA-33总胆固醇TCTotalcholesterol甘油三酯TGTriglycerideHDLHighdensitylipoprotein高密度脂蛋白HDL-CHighdensitylipoproteincholesterol高密度脂蛋白胆固醇低密度脂蛋白LDLLowdensitylipoprotein低密度脂蛋白胆固醇LDL-CLowdensitylipoproteincholesterol3’非编码区3’UTR3’Untranslatedregion-7- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析益气健脾和血祛痰法对冠心病患者MicroRNA-33和血脂的影响及相关性分析前言冠心病（coronaryMiRNA-33heartdisease和血脂的影响及相关性分析，CHD）是冠状动脉粥样硬化性心脏病简称，是指冠状动脉粥样硬化使血管腔狭窄或阻塞，或(和)因冠状动脉功能性改变(痉挛)导致[1]心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病。现多认为粥样硬化病变的形成是动脉对内皮、内膜损伤做出的炎症-纤维增生性反应的结果。氧化脂质在受损内皮下集聚，进一步损伤内皮；充满氧化修饰脂蛋白的巨噬细胞合成分泌生长因子及促炎介质，促进板块的生[1]长及炎症反应。脂质代谢异常被认为是动脉粥样硬化最重要的危险因素。流行病学资料显示，TC升高，冠心病发病危险就越高。LDL是TC在血液中的主要存在形式，其可氧化成ox-LDL,ox-LDL可参与泡沫细胞形成、促进细胞黏附和巨噬细胞源性泡沫细胞的产生、促进平滑肌细胞的增生和平滑肌源性泡沫细胞的产生、促进血小板黏附聚集及血[2，3，4]栓形成、损伤内皮细胞、加剧动脉粥样硬化的炎症反应。HDL的代谢是一个非常复杂的过程，现代研究认为其有促进胆固醇逆转运、抗氧化、抗炎、调节内皮细胞及调节[5,6,7]血小板形成作用。流行病学研究资料表明，冠心病患者血清HDL-C含量低于非冠心病患者。佛名汉姆（Framingham）心脏研究证实LDL-C与动脉粥样硬化形成呈正相关，[8]HDL-C呈显著负相关。microRNA是一组长约21-25个核苷酸的内源性非编码小RNA分子，通过与靶基因mRNA的3'-非编码区(untranslatedregion，UTR）特异性结合，在转录后水平直接降解靶标mRNA或抑制蛋白质翻译。最新研究发现，microRNA-33参与体内胆固醇平衡调节、[9,10]调节HDL-C的生物合成及脂肪酸的代谢。血液中的microRNA具有良好的稳定性且检测方便，可做为相关疾病诊断、治疗、与预后中的生物标记物。在中医治疗中，冠心病属胸痹心痛范畴，张仲景在他的著作《金匮要略》中最早提出。心与脾的相关性主要表现在经络、五行、气血三个方面。心与胃位置相邻，《素问·平人气象论》曰：“胃之大络，名曰虚里，贯膈络肺，出于左乳下，其动应衣，脉宗气也”-8- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文[11]。虚里即为心尖搏动的地方。十二经络流注中，足阳明胃经与足少阴脾经相表里，足少阴脾经与手少阴心经相交接。五行中，心属火位于上焦，脾属土位于中焦，二者属于相生关系。火生土即心火充足可温脾土，脾的功能才可正常运行。在气血方面，心主血脉，推动和调控血液在脉道中运行，流注全身。脾主运化，统血，为气血生化之源，统摄血液在脉道中运行。脾的运化功能正常，气血生化充足，心有所主，可推动血液正常运行，脾可统摄血液不溢于脉道之外，相辅相成。因此近年来对冠心病从脾论治的观点[12]被越来越多的研究并得到广泛的认可，如张会永等认为胸痹的病机心脉痹阻是“脉道不通”的特殊表现，脉道为脾运化水谷的通道，需脾运送的水谷精微来濡养维持贯通。[13]故胸痹的发生与脾失健运密切相关。国医大师邓铁涛教授提出“心脾相关”,“痰瘀相关”学说，认为肥甘厚味，劳逸失当，忧思伤脾，脏气亏虚，年老体弱，所致脾失健运，痰湿集聚，形成气虚痰浊。心脉痹阻，不通则痛，不单单是血瘀造成的，瘀实为痰[14]的进一步发展，其主要病理机制亦是痰浊为患。李德新教授认为心脾间的联系为母子相生，火土互用，补脾以益心血。心脾相生，母病及子，故心病及脾，子盗母气，则脾病及心。所以在治疗心病时应注重调理脾气，以助生化之源。本研究旨在通过益气健脾和血祛痰法干预冠心病稳定型心绞痛脾虚痰浊证患者，观察益气健脾和血祛痰法对MicroRNA-33、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白的的影响及MicroRNA-33与血脂（TC、TG、HDL、LDL）血清中表达的相关性，同时期望为冠心病的研究、诊断、治疗与预后提供有价值的生物标记物。-9- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析材料与方法1.材料与试剂1.1主要试剂TrizolInvitrogenRNA酶抑制剂Promage反转录酶QIAGEN10×RT缓冲液QIAGEN2.5mMdNTP混合液（dATP，dGTP，dCTP和华大基因dTTP各2.5mM）2×SybrgreenPCRmixQIAGENTBE华大基因6*Loadingbuffer华大基因甘油三酯（TG）测试盒上海工硕总胆固醇（TC）测试盒上海工硕1.2主要仪器及设备TissueRuptor匀浆器QIAGEN台式冷冻高速离心机5427REppendorfNanoQuantinfinireM200PROTECANBIORADPOWERPAC3000BIORADBIORADDNASUBCELLBIORAD凝胶成像系统GIS-1600上海天能科技有限公司-10- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文ABIVii7RealTimePCRSystemAppliedBiosystems洗板机WellwascVersaThermo水浴锅DK-8B上海精宏实验设备有限公司酶标仪Thermo离心机H2050R湖南湘仪实验室仪器开发有限公司2研究方法2.1研究对象本研究纳入于2013年06月至2014年12月期间来自辽宁中医药大学附属医院、辽宁中医药大学附属第二医院、内蒙古民族大学附属医院、沈阳医学院沈洲医院、中国医科大学附属第一医院、中国医科大学附属盛京医院6家三级甲等医院符合诊断标准、纳入标准、排除标准及安全性指标的受试者160例。诊断标准：西医诊断标准参照中华医学会血管病学分会2007年制定的《慢性稳定型心绞痛诊断与治疗指南》；中医诊断标准参照“十一五”国家规划教材《中医内科学》(新世纪第二版），结合专家论证，内容如下：胸闷重而心痛微，痰多气短，肢体沉重，形体肥胖，遇阴雨天而易发作或加重，伴有倦怠乏力，纳呆便溏，咯吐痰涎，舌体胖大且边有齿痕，苔腻或白滑，脉滑。纳入标准：西医符合冠心病稳定型心绞痛诊断标准；中医符合脾虚痰浊证诊断标准；年龄：男性45-75岁（包括45岁和75岁）；女性50-75岁（包括50岁和75岁）；入组前三个月以内行冠脉造影或冠脉CT提示：50%<冠脉主支血管狭窄程度<75%或50%<冠脉分支血管狭窄程度<100%病变者（需提供检查报告单）；加拿大心血管学会(CCS)心绞痛严重度分级II-IV级者；签署知情同意书者。冠脉CT的指标：容积再现图、短轴切面、曲面重建图、拉直的曲面重建；所有冠脉CT报告分别由两名中级或以上职称的影像学医师各自独立完成，若两名医师意见不一致则由第3名上级医师判定，以保证结果的真实性和可靠性，避免主观偏倚。排除标准：诊断为脾虚痰浊证以外的其他中医证型者；不稳定型心绞痛及肥厚型心肌病等其它心脏疾患，神经官能症，更年期症候群及颈椎病、胃及食管反流等所致胸痛者；冠脉造影或冠脉CT结果提示主支血管（RCA、LM，LAD、LCX）75%以上狭窄者；半-11- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析年内患有急性心肌梗死或一年内完全血运重建史；合并有严重心力衰竭（心功能IV级）、恶性心律失常、接受标准化方案降压治疗但血压仍高于160/100mmHg者、严重的其他系统疾病（如恶性肿瘤、消化道出血、胃溃疡及有出血倾向等）预计不能完成试验者及肝、肾功能异常者（血AST、ALT、Cr超过参考值上限1.5倍）；精神病患者；妊娠及有计划妊娠者或哺乳期妇女；对中药颗粒剂及碘过敏者；青光眼患者；近两月内参加其他临床研究者；拒绝或不能签署知情同意书者。剔除标准：已入组病例但符合以下之一者，予以剔除，分别是误诊、未曾用药者、服药后无任何可评价记录者、由于使用某种禁用的药物，以致无法作有效性和安全性评价。剔除的病例应说明原因，其CRF表应保留备查。不作疗效统计分析，但至少接受一次治疗，且有安全性记录者，视情况可参加安全性分析。全面中止试验的标准：研究进行中由于以下原因整个试验在多中心全面停止，分别是研究者发现严重安全性问题、方案有重大失误、申办方因经费或管理原因不能继续试验、行政主管部门撤消试验。出现以上情况，均可中途停止全部试验，全面中止试验可是暂时的，也可是永久的。中止试验时，全部试验记录应予保留备查。伦理要求：本试验遵循赫尔辛基宣言和中国有关临床试验研究规范、法规进行。临床试验开始前，试验方案需课题和各研究单位伦理委员会审议同意并签署批准意见后方能实施。在临床试验期间，试验方案的任何修改均应经伦理委员会批准后方能执行。每位受试者入选本研究前，由临床研究医师向其或其指定代理人全面地介绍本研究的目的、程序和可能的风险，并给每位病人阅读一份书面的知情同意书。患者或其代理人或家属签署知情同意书后方可进行临床试验。2.2试验设计2.2.1试验设计类型本研究采用多中心、盲法、区组随机、平行对照临床试验设计。选择国内6家医院作为分中心；对研究者、受试者、药品管理人员、数据采集人员和数据统计分析人员实施盲法；采用中心分层，采用DAS临床试验中央随机系统(DASforIWRS)申请随机号和配发药物；试验组为益气健脾和血祛痰组，对照组为安慰剂对照组。2.2.2试验干预措施试验组（益气健脾和血祛痰组）：给予具有“益气健脾、和血祛痰”功效的中药颗粒剂，组成为：黄芪10g、党参10g、白术10g、茯苓10g、清半夏6g、瓜蒌10g、丹参10g、炙甘草3g。-12- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文安慰剂对照组：中药颗粒剂安慰剂（含试验组中药颗粒剂成分的10%）服用方法：早饭、晚饭后半小时，100ml沸水冲后温服，每日2次，每周7日，疗程12周（认为75%≤服用药物≤120%为符合研究方案），随访2周。2.2.3西医基础治疗参照中华医学会2007年公布的《慢性稳定型心绞痛诊断与治疗指南》：推荐下列药物首选，研究者可以根据实际情况决定西医基础用药。(1)平素规律服用拜阿司匹林，β受体阻滞剂类（如康忻、博苏）、二氢吡啶类CCB（如拜新同）者可按原剂量继续服用；(2)心绞痛发作时，可服用硝酸甘油0.5mg舌下含服（一般连用不超过3次，每次相隔5min）或消心痛10-30mgtid。2.2.4合并用药及其它治疗方法的规定针对不同的合并症，具有降压、降糖等作用的西药受试者可以合理使用，但应详细记录所用药物的原因、名称、剂量及使用开始和停止时间；试验期间，受试者不得使用治疗本病的规定以外的其它中医治疗方法（例如中药制剂、针灸治疗、心绞痛贴膏等）；患者不得使用具有明显缓解冠脉痉挛的非二氢吡啶类CCB药物（如合心爽、合贝爽），以及调节血脂、消减AS斑块药物。2.3观察指标一般情况：性别、年龄、身高、体重、入组时CCS分级和心功能分级；疗效机制指标：miR-33、TC、TG、HDL、LDL；安全性指标：血常规、肝功（丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶）、肾功（血尿素氮、血肌酐）有无异常出现及治疗中有无不良反应出现。2.4技术路线图招募受试者诊断标准排除标准纳入标准知情同意160例合格受试-13- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析1：1随机分组试验组对照组80例80例疗程12周，随访两周疗效机制指标：miR-33、TC、TG、HDL、LDL安全指标：血常规，肝功（丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶），肾功（血尿素氮、3标本采集及储存3.1血液样本采集清晨空腹抽取静脉血（不加抗凝剂），采集后血液样本在常温25℃下，放置30分钟，将采血管放入离心机中，离心5000转/min,2分钟，以无菌吸管/移液器将血清装入EP管，每管存量至少约0.5ml。立即置于冷冻柜中，温度≤-80℃。3.2血清白细胞制备过程用5倍体积BufferEL(QIAGEN79217)加入2ml全血中，混匀，冰上放置10分钟，4000rpm离心10min（4°），去上清，用1倍体积EL重悬沉淀，转移至2ml离心管，4°，4000rpm离心10min，弃上清，管底的浅黄色沉淀即为白细胞。4实验方法4.1miR33测定4.1.1总RNA抽提1）将收集的白细胞离心去除上清，加1mlTrizol,用QIAGENTissueRuptor匀浆，室温放置10min；2）加200μl氯仿，充分混匀，15000转离心5-7min。3）取上清，至1.5mlEppendorf管加600μl氯仿，混匀，15000转离心5min。4）取上清，至1.5mlEppendorf管加500ul异丙醇，混匀，15000转离心10min。5）弃上清，用75％乙醇1ml冲洗，高速离心5min。6）弃上清，RNA沉淀于空气中干燥（2－3min）。-14- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文7）将干燥后的RNA溶解于DEPC处理水中。8）取1ul总RNA测OD260，并定量。4.1.2cDNA合成4.1.2.1primer合成列表Primer名称碱基序列(5'to3')hmiR33a-3P-RTGTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACGTGATGhmiR33a-3P-FGcaaTgTTTccacagTgcaTcU6RTGTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAAAATATGU6-FATTAGCATGGCCCCTGCGMiRNAprimer-RTGCGTGTCGTGGAGTCG注：miRNAprimer是与RT引物相匹配的引物F对应miRNA的特异引物4.1.2.2操作方法1）制备RT混合反应液：dNTP(2.5mMeach）2ul、10XRTBuffer2ul、RT特异引物(1uM)2ul、TotalRNA2ug、反转录酶(10U/ul)1ul、RNA酶抑制剂(40u/ul)1ul、无RNA酶水upto20ul，总体积20ul。2）在PCR扩增仪进行RT反应：16℃30min;42℃40min;85℃5min反应结束后，将其放在冰上待用或-20℃保存。4.1.3实时定量PCR：进行RealtimePCR反应1）所有cDNA样品分别配制RealtimePCR反应体，体系配置如下：-15- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析2×PCRMIX8µl10uM的PCR特异引物F1µl10uM的PCR特异引物R1µlcDNA1µl加水至总体积为混16µl，5000rpm短暂离心。2）步骤1配置的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR反应。95℃，6min；50个PCR循环(95℃，10秒；55℃，10秒；72℃，30秒）收集荧光。4.2TC、TG、HDL、LDL测定4.2.1样本处理血清：直接测定，如超过线性范围用生理盐水稀释测定。4.2.2操作表96孔板操作，酶标仪比色空白孔校准孔样本孔蒸馏水（ul）3校准品（ul）3样本（ul）3工作液（ul）300300300混匀后37℃保温5min，500nm，酶标仪测定各孔吸光度值。5数据处理5.1MicroRNA结果与计算-△△CT各样品的目的miRNA和内参（U6）分别进行RealtimePCR反应。数据采用2法进行分析。待测指标以内参校正:实时定量PCR时各样品加样量均为1µl，然而由于受RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个样品的1µl体积的cDNA其含量并不完全相同，为校正此差异，我们使用管家基因U6（不同样品间表达量基本恒定）作为内参，以样品待测基因得值除-16- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文以此样品内参得值，最终得到的比值为样品的待测基因相对含量。5.2TC、TG、HDL、LDL的计算公式酶标仪比色：（样本OD值-空白OD值）*校准品浓度TC/TG/HDL/LDL=校准OD值-空白OD值5.3统计学分析1）采用SPSS软件对实验数据进行统计分析，TC、TG、HDL、LDL均采用均数±标准差（x±s）表示，若P<0.05有统计学意义。2）miR-33用TTEST检验。3）组内比较采用t检验，若P<0.05有统计学意义。4）两组间比较采用方差检验，若P<0.05有统计学意义。5）miR-33相对表达量与血脂TC、TG、HDL、LDL的相关性分析采用spearman双变量秩相关性分析。-17- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析实验结果1基线情况1.1PPS数据集范围：经招募、筛选受试者后，试验组与对照组符合要求的入组病例各80例，共计160例。试验组中有2例患者失访、2例患者时间超窗、1例患者不符合纳入标准；对照组5例患者失访、3例患者时间超窗、2例患者不符合纳入标准。最终符合方案的试验组75例，对照组70例，纳入PPS数据集，共计145例（见table1、table2）。Table1thedistributionofsubjectsineachcenter试验组对照组合计序号中心名称入组PP入组PP入组PP1辽宁中医药大学附属医院2019201740362辽宁省中医药研究院1212121124233内蒙古民族大学附属医院666512114沈阳医学院沈洲医院2220222244425中国医科大学附属第一医院1414141028246中国医科大学附属盛京医院6465129——合计80758070160145Table2thecompletionsituationoftheselectedsubjects试验组对照组合计入选总人数8080160完成人数7570145脱落人数(脱落率％)5（6.25）10（12.5）15脱落原因失访257时间超窗235不符合入选标准、纳排标准123-18- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文1.2人口学特征将试验组与对照组性别、年龄、体重、身高、CCS心绞痛分级、NYHA心功能分级进行比较，均无统计学差异（P>0.05），说明均衡性好，两者具有可比性（见table3）将试验组与对照组检测miR-33患者与正常人基线比较，性别、年龄、体重、身高进行比较，均无统计学差异（P>0.05），说明基线齐，两组具有可比性。试验组与对照组CCS心绞痛分级、NYHA心功能分级差异无统计学意义（P>0.05），基线齐，两组具有可比性（见table4、table5）。Table3Comparisonofgeneralfeaturesofsubjectsin2groups项目试验组(N=75)对照组(N=70)P值统计方法性别（%）男33（44）38（54.29）0.216卡方检验女42（56）32（45.71）年龄59.76±6.1158.99±6.460.459t检验身高165.65±8.16166.96±6.870.301t检验体重68.43±9.4769.12±9.460.663t检验CCS心绞痛分级（%）Ⅱ级68（90.67）63（90）Mann-WhitneyU检0.892Ⅲ级7（9.33）7（10）验NYHA心功能分级（%）Ⅰ级5（6.67）5（7.14）Mann-WhitneyU检Ⅱ级63（84）58（82.86）0.976验Ⅲ级7（9.33）7（10）Table4Comparisonofgeneralfeaturesofsubjectsin3groups例性别组别年龄（岁）体重（Kg）身高（cm）数男女试验1981160.32±5.71267.46±9.412166.74±8.150组对照1971258.53±5.73568.63±9.560167.57±7.488组正常2081260.58±6.01769.59±9.591166.54±7.678人组P值0.2970.2910.4300.263-19- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析Table5Comparisonofgeneralfeaturesofanginapatientsin2groupsCCS心绞痛分级（%）NYHA心功能分级（%）组别Ⅱ级Ⅲ级Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级试验组17(51.5)2(40)1(50)16(51.6)2(40)对照组16(48.5)3(60)1(50)15(48.4)3(60)P0.3750.3152血清miR-33实时荧光定量检测情况2.1miR-33的扩增曲线和熔解曲线（1）扩增曲线：miR-33的扩增正常可靠，荧光信号随循环的增加而增加（见Fig.1）。（2）熔解曲线：以miR-33的cDNA为模版，Tm值基本一致，扩增产物没有其他非特异性干扰（见Fig.2）。Fig.1TheamplificationcurveofmiR-33Fig.2ThemeltcurveofmiR-332.2益气健脾和血祛痰法对血液中miR-33表达量的影响血液中miR-33在没有采用益气健脾和血祛痰法的药物干预前，试验组与对照组患者miR-33的表达量无明显统计学差异（P>0.05），但两组miR-33的含量均明显低于正常组，有统计学意义（P=0.000）。经过12周具有益气健脾祛痰的药物治疗后，试验组治疗后miR-33的表达量增高，-20- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文但无统计学意义(P>0.05)。对照组干预后的miR-33表达量增高，但无统计学意义（P>0.05）。试验组治疗后和对照组治疗后表达量均增高，但两组间无统计学差异（P>0.05），与正常组统计学有差异（P=0.000)。(如Table6、Fig.3所示）Table6ThecomparisonofmiR-33ingroups试验组与正常人试验组与对照试验组对照组对照组与正常人组项目组组前VS后前VS后前VS正后VS正前VS正后VS正前后⊿Ct0.9811.1281.6281.6601.6411.454-0.1031.141-⊿⊿Ct20.5070.4580.3240.3160.3210.3651.0740.453P0.7780.2060.0000.0000.0000.0000.9250.104Fig.3ThelevelsofmiR-33inthreegroups3益气健脾和血祛痰法对血清中血脂（TC、TG、HDL、LDL）影响3.1TC的检测结果（见Table7、Table8、Table9、Fig4）2）试验组与对照组两组间比较，第4周无统计学差异（P>0.05），第12周具有统计学差异（P<0.05）。-21- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析2）试验组第4、12周与第0周比较，均有统计学意义（P<0.05）。3）对照组第4、12周与第0周比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。4）试验组作用优于对照组。Table7ThecomparisonofTCofbetweentwogroups组别试验组（N=75）对照组(N=70)F值P值时间点第0周4.84±3.224.35±0.801.0310.312第4周3.62±1.484.21±3.013.2330.074第12周3.25±1.404.01±2.455.1790.024Table8ThecomparisonofTCofwithintestgroup组别试验组(N=75)T值P值时间点0-4周1.23±3.363.2240.0020-12周1.71±3.284.4570.000Table9ThecomparisonofTCofwithincontrolgroup组别对照组(N=70)T值P值时间点0-4周0.16±2.680.5250.6010-12周0.14±3.220.3730.710Fig.4ThelevelsofTCintwogroups-22- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文3.2TG的检测结果（见Table10、Table11、Table12、Fig5）1）试验组与对照组两组间比较，第4周无统计学差异（P>0.05），第12周具有统计学差异（P<0.05）。2）试验组第4、12周与第0周比较，均有统计学意义（P<0.05）。3）对照组第4、12周与第0周比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。4）试验组作用优于对照组。Table10ThecomparisonofTGofbetweentwogroups组别试验组（N=75）对照组(N=70)F值P值时间点第0周1.41±0.941.51±1.080.3300.567第4周1.11±0.921.49±1.543.2980.071第12周1.10±0.881.61±1.586.1380.014Table11ThecomparisonofTGofwithintestgroup组别试验组(N=75)T值P值时间点0-4周0.28±0.872.8540.0060-12周0.33±0.992.8140.006Table12ThecomparisonofTGofwithincontrolgroup组别对照组(N=70)T值P值时间点0-4周0.019±1.59-0.1050.9170-12周-0.104±1.654-0.5340.595-23- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析Fig.5ThelevelsofTGintwogroups3.3HDL的检测结果（见Table13、Table14、Table15、Fig6）1）试验组与对照组两组间比较，第4周、第12周均无统计学差异（P>0.05）。2）试验组第4、12周与第0周比较，整体有上升趋势，但无统计学差异P>0.05。3）对照组第4、12周与第0周比较，HDL均无统计学意义P>0.05。4）试验组作用优于对照组。Table13ThecomparisonofHDLofbetweentwogroups组别试验组（N=75）对照组(N=70)F值P值时间点第0周20.27±30.3223.68±42.360.3440.558第4周21.06±16.6725.48±41.640.8480.359第12周22.90±23.1822.31±22.060.0460.831Table14ThecomparisonofHDLofwithintestgroup组别试验组(N=75)T值P值时间点0-4周-0.29±36.16-0.710.9430-12周-2.08±38.10-0.4640.644-24- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文Table15ThecomparisonofHDLofwithincontrolgroup组别对照组(N=70)T值P值时间点0-4周-1.68±60.69-0.1050.9170-12周2.09±36.470.4870.628Fig.6ThelevelsofHDLintwogroups3.4LDL的检测结果（见Table16、Table17、Table18、Fig7）1）试验组与对照组两组间比较，第4周、第12周均具有统计学差异（P<0.05）。2）试验组第4、12周与第0周比较，均无统计学意义（P>0.05）。3）对照组第4、12周与第0周比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。Table16ThecomparisonofLDLofbetweentwogroups组别试验组（N=75）对照组(N=70)F值P值时间点第0周42.75±18.1743.39±30.420.0110.916第4周40.69±16.4550.63±24.218.4410.004第12周40.07±16.4450.24±29.226.3890.013-25- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析Table17ThecomparisonofLDLofwithintestgroup组别试验组(N=75)T值P值时间点0-4周2.29±19.560.9910.3250-12周3.41±22.511.2830.204Table18ThecomparisonofLDLofwithincontrolgroup组别对照组(N=70)T值P值时间点0-4周-7.27±34.16-1.8300.0710-12周-6.89±39.70-1.4710.146Fig.7ThelevelsofLDLintwogroups4miR-33与TC、TG、LDL、HDL相关性分析将冠心病稳定型心绞痛患者试验前（0周）外周血中miR-33的表达水平分别与其血清中TC、TG、HDL、LDL的含量进行相关性分析。结果显示，miR-33表达水平与TC、TG、HDL、LDL均无相关性（P>0.05）。（见table19）Table19ThecorrelationofmiR-33andBlood-fatTCTGHDLLDLmiR-33相关系数（r）-0.0220.1720.0210.040显著性（P）0.8950.3000.8990.814-26- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文讨论1益气健脾和血祛痰法治疗冠心病稳定型心绞痛心与脾在经络、五行、气血三个方面均有联系。在十二经络流注中，足少阴脾经与手少阴心经、足阳明胃经和足少阴脾经两相交接，互为表里。五行中，心属火位于上焦，脾属土位于中焦，二者属于相生关系。火生土即心火充足可温脾土，脾的功能才可正常运行。在气血方面，心主血脉，推动和调控血液在血脉中流动运行，使血脉通畅，分布全身。脾主运化，统血，乃气血发生之地，统摄血脉中运行之血液。脾的运化功能正常，气血生化充足，心有所主，可推动血液正常运行，脾可统摄血液不溢于脉道之外，相辅相成。因此近年来对冠心病从脾论治的观点被越来越多的研究并得到广泛的认可，如张[12]会永等认为胸痹的病机心脉痹阻是“脉道不通”的特殊表现，脉道为脾运化水谷的通道，需脾运送的水谷精微来濡养维持贯通。故胸痹的发生与脾失健运密切相关。国医大[13]师邓铁涛教授提出“心脾相关”,“痰瘀相关”学说，认为肥甘厚味，劳逸失当，忧思伤脾，脏气亏虚，年老体弱，所致脾失健运，痰湿集聚，形成气虚痰浊。心脉痹阻，不通则痛，不单单是血瘀造成的，瘀实为痰的进一步发展，其主要病理机制亦是痰浊为[14]患。李德新教授认为心脾间的联系为母子相生，火土互用，补脾以益心血。心脾相生，母病及子，故心病及脾，子盗母气，则脾病及心。所以在治疗心病时应注重调理脾气，以助生化之源。2益气健脾和血祛痰法对miR-33的影响microRNA（miRNA）是一组长约21～25个非编码小RNA分子。在特异性地和靶基因内部的mRNA的3'-非编码区(简称UTR）进行结合的作用下，经转录过程，直接对靶标[15]mRNA予以降解或者是对蛋白质翻译起到明显的抑制作用。作为一种内含子miRNA，miR-33位于人类srebp2上，不管是基因组序列还是所处位置，均属于高度保守。miR-33首先在细胞核内产生，由Drosha剪切成茎环结构RNA（基本架构为核苷酸，数量为70-100个），而后由Ran2GTP/Exportin5(Exp5)将受体进行输出，从细胞核内部将pre-miRNA转运到细胞质，在核酸酶Dicer的剪切作用下，形成双链microRNA（数量为21～25个核苷酸长度）；再经解旋酶的作用，形成成熟的miR-33（主要构成为核苷酸，数量为22个左右）。miR-33主要通过对ATP三个靶基因（转运因子ABCA1、NPC1以及ABCGA1）-27- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析[16,17,18]结合，以此来调节体内的胆固醇水平。研究表明，miR-33在对ABCA1表达起到抑制作用的同时，可促使血浆的HDL含量不断减少。通过对内源性miR-33表达予以拮抗，小鼠体内的血浆HDL含量也会显著增多，其脂质和炎症基因相应的表达则会明显下调，[19，20]对斑块大小有削减作用，同时还可提高斑块的稳定性。miR-33能够下调CROT、HADHB以及AMPKα等介导脂肪酸氧化基因的表达，并使介导脂肪酸合成基因自身的表达得到显[18]著上调。Najafi等认为，miR-33能够沉默磷酸腺苷（AMP）诱导激活蛋白激酶（AMPK）。作为一种蛋白激酶，AMPK能够对细胞内部的能量代谢起到相应的调节作用，对脂肪酸β-氧化、生酮起到促进作用，并对SREBP-1c水平发挥明显的负调控作用，同时对脂肪酸、甘油三酯两者间的合成起到抑制和阻碍作用。综上所述，miR-33对脂质代谢有一定的调控作用，而脂质代谢紊乱又是导致冠状动脉粥样硬化的最重要的危险因素，所以miR-33水平的高低对冠状动脉粥样硬化的形成具有重要的影响。本研究采用益气健脾和血祛痰的方法治疗脾虚痰浊证的冠心病稳定型心绞痛患者，并检测其治疗前和治疗后外周血中的miR-33的表达水平，同时抽取20例正常人的外周血检测miR-33的表达水平。发现治疗前的冠心病患者miR-33的表达水平远远低于正常人（见Fig.3），为正常人的0.23倍，统计学有差异（P=0.000）。治疗后的冠心病患者miR-33的表达水平试验组和对照组均有升高，但仍低于正常人组（见Fig.3），统计学有差异（P=0.000）。试验组miR-33表达水平升高比对照组明显（见Fig.3），但统计学无差异（P>0.05)。由此看出益气健脾祛痰法治疗脾虚痰浊型的冠心病稳定型心绞痛患者，可以升高外周血中miR-33的表达水平，使其表达水平接近正常人，但无统计学意义。本次研究中治疗后的患者miR-33的表达水平并未达到正常人的表达水平，推测可能由于治疗时间过短，若延长治疗时间，可能继续调节miR-33的表达水平，使其越来越接近正常人的表达水平。通过本次研究，可以看出miR-33的表达水平在冠心病患者和正常人中有明显差异，反映了miR-33和冠心病的关系密切，为下一步研究miR-33作为冠心病生物标志物的价值提供了临床依据。同时也提出了一个新的科学问题，本次采用的益气健脾和血祛痰的药物是作用到了哪些作用靶点，机制如何，进而调控了miR-33的表达情况，这些需要进行更深入的研究与探讨。3益气健脾和血祛痰法对TC、TG、HDL、LDL的影响脂质代谢异常被认为是动脉粥样硬化最重要的危险因素。随着生活水平的提高，在近20至30年间，我国人均血脂水平明显上升，全国至少有1.7亿人口血脂异常。在对-28- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文我国的队列研究结果分析中显示，TC从3.65mmol/L开始，随TC的升高，患心血管疾病[21，22]的风险也随之增加。LDL是TC在血液中的主要存在形式，被公认为致动脉粥样硬化脂蛋白，其可氧化成ox-LDL,ox-LDL可参与泡沫细胞形成、促进细胞黏附和巨噬细胞源性泡沫细胞的产生、促进平滑肌细胞的增生和平滑肌源性泡沫细胞的产生、促进血小板[2，3，4]黏附聚集及血栓形成、损伤内皮细胞、加剧动脉粥样硬化的炎症反应。因此，LDL在血中含量越高，患AS的风险越大。HDL的代谢是一个非常复杂的过程，现代研究认为[5,6,7]其有促进胆固醇逆转运、抗氧化、抗炎、调节内皮细胞及调节血小板形成作用。流行病学研究资料表明，冠心病患者血清HDL-C含量低于非冠心病患者。佛名汉姆（Framingham）心脏研究证实LDL-C与动脉粥样硬化形成呈正相关，HDL-C呈显著负相[8][23]关。TG具有促使血管内皮失调、促进泡沫细胞形成及诱发炎症反应的作用。ZhangX在实验中，敲除小鼠的脂蛋白质脂肪酶，结果发现小鼠血浆中的TG含量显著升高，在小鼠的主动脉根部，出现富含泡沫细胞的动脉粥样硬化斑块。由此说明，TG的升高，可以促进AS的发生发展。本研究采用益气健脾和血祛痰方法治疗脾虚痰浊证的冠心病稳定型心绞痛患者，并检测其治疗前和治疗后血清中的TC、TG、HDL、LDL的含量。TC试验组与对照组两组间比较，第4周无统计学差异（P>0.05），第12周具有统计学差异（P<0.05）。试验组第4、12周与第0周比较，均有统计学意义（P<0.05）。对照组第4、12周与第0周比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。试验组作用优于对照组。TG试验组与对照组两组间比较，第4周无统计学差异（P>0.05），第12周具有统计学差异（P<0.05）。试验组第4、12周与第0周比较，均有统计学意义（P<0.05）。对照组第4、12周与第0周比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。试验组作用优于对照组。HDL试验组与对照组治疗前和治疗后（4周、12周）均无统计学差异P>0.05。试验组第4、12周与第0周比较，整体有上升趋势，但无统计学差异P>0.05。对照组第4、12周与第0周比较，HDL均无统计学意义P>0.05。试验组作用优于对照组。LDL试验组与对照组两组间比较，第4周、第12周均具有统计学差异（P<0.05）。试验组第4、12周与第0周比较，均无统计学意义（P>0.05）。对照组第4、12周与第0周比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。由此看出益气健脾和血祛痰法治疗脾虚痰浊证的冠心病稳定型心绞痛患者，可以一定程度上降低冠心病患者血清中TC、TG、LDL的含量，升高HDL含量，调节脂质代谢。为抑制AS斑块的形成，减缓AS的发展提供了新的有效方法。-29- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析4miR-33与TC、TG、HDL、LDL的相关性分析HDL是一种有多种亚类的异质性脂蛋白，脂质和蛋白含量大致相等。大量流行病学资料表明，血浆HDL-C水平与动脉粥样硬化的形成有很强的负相关性，认为HDL具有抗动脉粥样硬化的作用。根据Framingham心脏的研究数据，HDL-C的循环每增加1%，出[24][18]现动脉粥样硬化相关性心脏病的可能性则会降低2%。Najafi-Shoushtari等以高脂饮食的小鼠进行造模；通过对miR-33a的某些特殊核苷酸进行锁定，最终得出：血浆HDL-C含量明显升高35%，说明抑制miR-33a的表达，可以升高HDL-C的含量。Horie等[25]利用拮抗miR-33a对动物进行处理，得知处理后的血浆HDL水平也有很大地提升。说明抑制miR-33a的表达，可以升高HDL-C的含量。microRNA33不仅调节HDL-C的生物合[9,10]成，同时参与体内胆固醇平衡调节及脂肪酸的代谢。实验显示，利用抗miR-33能够显著上调ABCA1的表达水平，促进胆固醇更好地向载脂蛋白A1方向流入，从而对胆固醇水平起到下调作用。相反，miR-33a表达增加后，血浆内部的胆固醇也会明显提升。[18]Najafi等诸多学者认为，miR-33能够沉默磷酸腺苷（AMP）诱导激活蛋白激酶（AMPK）。作为一种蛋白激酶，AMPK能够对细胞内部的能量代谢起到相应的调节作用，对脂肪酸β-氧化、生酮起到促进作用，并对SREBP-1c水平发挥明显的负调控作用，同时对脂肪酸、甘油三酯两者间的合成起到抑制和阻碍作用。本研究将冠心病稳定型心绞痛患者试验前（0周）外周血中miR-33的表达水平分别与其血清中TC、TG、HDL、LDL的含量进行相关性分析。结果显示，miR-33表达水平与TC、TG、HDL、LDL均无相关性（P>0.05）。本次研究结果显示，miR-33与HDL无相关性，与现有文献不符，现有文献显示两者呈负相关。虽然miR-33与HDL无相关性，但是并不能证明miR-33对于HDL的调控没有影响。因为miR-33是在对ABCA1表达起到抑制作用的基础上，可促使血浆的HDL含量不断减少，所以miR-33对HDL的调控属于间接调控。同时推测是否有其他的作用靶点，而影响了miR-33与对HDL负向调控作用靶点的结合。理论上miR-33对TC、TG、LDL的合成应为促进作用，但是本次实验结果显示miR-33表达水平与TC、TG、LDL均无相关性，但是并不能说明miR-33的表达水平对TC、TG、LDL的含量无影响，具体调节机制有待研究，今后miR-33是否有新的作用靶点可侧重于此进行探讨和研究。5本研究的局限性本研究存在一定的不足及局限性。如不清楚西医基础用药及合并用药是否会对结果造成影响；需优化研究方法来进一步研究miR-33作为冠心病生物标记物的价值和意义。-30- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文结论1、益气健脾和血祛痰法可以调控冠心病稳定型心绞痛脾虚痰浊证患者的脂质代谢，降低TC、TG、LDL，升高HDL。2、益气健脾和血祛痰法可以提高冠心病稳定型心绞痛脾虚痰浊证患者外周血中miR-33的表达水平。3、在冠心病稳定型心绞痛患者中，miR-33与TC、TG、HDL、LDL均无相关性。4、冠心病稳定型心绞痛患者外周血中miR-33的表达水平显著低于正常人，miR-33是一个评价脂质代谢异常的生物标记物。-31- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析本研究创新性的自我评价1、将“从脾论治”冠心病稳定型心绞痛的观点与临床相结合，运用到治疗中。2、将miRNA的检测从动物实验优化至临床试验。3、在临床试验中，探讨miRNA与血脂（TC、TG、HDL、LDL)的相关性分析。-32- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文参考文献[1]陆再英，钟南山.内科学[M].7版.北京:人民卫生出版社，2009，274.[2]AielloRJ.Increasedatherosclerosisinhyperlipidemicmicewithin-activationofABCA1inmacrophages[J].ArteriosclerThrombVascBiol,2002,22:630-637.[3]郑琼莉,祝炜.高脂血症[M].北京:中国医药科技出版社,2007:109.[4]丛晓强,孟晓萍,李颖.基质金属蛋白酶在动脉粥样硬化中的作用研究进展[J].中国动脉硬化杂志,2007,15(5):397-399.[5]OwenJS,MulcahyJV.ATP-bindingcassetteA1proteinandHDLhomeostasis.AtherosclerSuppl,2002,3:13-22.[6]曾武威,吴钢,薛红,陈保生.ABCA1与高密度脂蛋白代谢.中国动脉硬化杂志,2002,10(39):77-78.[7]RaderDJ.High-densitylipoproteinsandatherosclerosis.AmJCardiol,2002,90:62i-70i.[8]FranceschiniG.Epidemiologicevidenceforhigh-densitylipoproteincholeSterolasariskfactorforcoronaryarterydisease[J].AmJCardiol,2001,88:9-13.[9]YueJ.miRNAandvascularcellmovement[J].AdvDrugDelivRev，2011,63(8):616-622．[10]RamírezCM,GoedekeL,Fernández-HernandoC.“Micromanaging”metabolicsyndrome[J].CellCycle,2011,10(19):3249-3252．[11]南京中医药大学.黄帝内经素问译释[M].4版.上海：上海科学技术出版社，2009，142.[12]张会永，崔家鹏，杨关林.从《内经》脾病“脉道不利”探讨“从脾论治”冠心病[J].中国中医基础医学杂志，2013,19（11）：1256-1258.[13]赵益业，林晓忠，张敏州，等.邓铁涛教授以心脾相关学说诊治冠心病经验介绍[J].新中医，2007，39(4)．[14]倪菲.李德新教授从脾论治冠心病经验集萃[J].世界中医药，2014,9（1）.[15]SainiHK，Griffiths-JonesS，EnrightAJ．GenomicanalysisofhumanmicroRNAtranscripts［J］．ProcNatlAcadSciUSA，2007，104:17719-17724．-33- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析[16]RaynerKJ，SuárezY，DávalosA，etal．miR-33contributestotheregulationofcholesterolhomeostasis［J］．Science，2010，328:1570-1573．[17]MarquartTJ，AllenRM，OryDS，etal．miR-33linksSREBP-2inductiontore-pressionofsteroltransporters［J］．ProcNatlAcadSCIUSA，2010，107:12228-12232．[18]Najafi-ShoushtariSH，KristoF，LiY，etal．MicroRNA-33andtheSREBPhostgenescooperatetocontrolcholesterolhomeostasis［J］．Science，2010，328(5985):1566-1569．[19]ZampetakiA，MayrM．MicroＲNAsinvascularandmetabolicdisease［J］．CircRes，2012，110(3):508-522．[20]MichaelS,Brown,JinYe,etal.Goldstein.HDLmiR-edDownbySREBPIntrons.Science,2010,328(5985):1495-1496.[21]武阳丰，赵冬，周北凡，等.中国人群血脂异常诊治和分层方案的研究[J].中华心血管病杂志，2007，35(5):428-433.[22]国家九五攻关课题协作组.我国心血管发病趋势预测及21世纪预防策略的研究[J].医学研究通讯，2003，32(1):2-5.[23]zhangX,QiR,XianX,etal.Spontaneousatherosclerosisinagedlipoproteinlipase-deficientmicewithseverehypertriglyceridemiaonanormolchowdiet[J].CireRes,2008,102(2):250-256.[24]RaynerKJ，SheedyFJ，EsauCC，etal．AntagonismofmiＲ-33inmicepromotesreversecholesteroltransportandregressionofather-osclerosis［J］.JClinInvest，2011，121(7):2921-2931．[25]HorieT，OnoK，HoriguchiM，etal．MicroＲNA-33encodedbyanintronofste-rolregulatoryelement-bindingprotein2(Srebp2)regulatesHDLinvivo［J］．ProcNatlAcadSCIUSA，2010，107:17321-17326．-34- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文综述MicroRNA33、MicroRNA126在脂质代谢中作用摘要：miRNA-33与脂代谢密切相关，是脂代谢转录后调控因子之一。miRNA-126也与动脉粥样硬化脂质代谢密切相关，本文将近年来研究的miRNA-33、miRNA-126在脂质代谢中调节体内胆固醇平衡、调节高密度脂蛋白胆固醇的生物合成、调节脂肪酸代谢、与甘油三酯合成等调控机制进行综述，旨在为探讨microRNA在脂质代谢紊乱过程中的作用机制提供更有力依据，对临床治疗动脉粥样硬化带来更大的帮助。关键词：microRNA-33、microRNA-126、脂质代谢、动脉粥样硬化人体的代谢复杂而严密，其中脂质代谢起着广泛而重要的生理作用。当人体内胆固醇、甘油三酯含量过高时，会产生高脂血症、高胆固醇血症危害人体健康。现代医学研究发现，高脂血症与冠心病、脑梗塞、糖尿病、脂肪肝均有着密切的联系,特别是在动[1]脉粥样硬化（AS）演变中担任着极为关键的角色。一项新的研究得出，miRNA有多个家族成员或可介导动脉粥样硬化，如miRNA-122、miRNA-125a-5p、miRNA-155、miRNA-[2]126和miRNA-33等。本文将近年来报道的miRNA-33、miRNA-126在脂质代谢中的调控机制予以论述，希望能为临床探讨miRNA在脂质代谢紊乱过程中的作用机制提供参考，从而更好地诊断动脉粥样硬化，并对之提供更科学、合理的治疗，帮助患者改善预后。1microRNA的生物学特性1.1microRNA形成microRNA（miRNA）是一组长约21～25个非编码小RNA分子。在特异性地和靶基因内部的mRNA的3'-非编码区(简称UTR）进行结合的作用下，经转录过程，直接对靶标mRNA予以降解或者是对蛋白质翻译起到明显的抑制作用[3]。miRNA的合成是一个复杂且受精密调控的生物学过程。首先，miRNA基因在细胞核内转录出一个初始转录产物pri-miRNA（译为初级miRNA），它有着5'帽子结构，在细胞核中通过Drosha、DGCR8这两者的蛋白复合物剪切成为70～90碱基长度且带有茎环结构的pre-miRNA（次级miRNA）；转运蛋白Exportin-5立即向细胞质内传输pre-miRNA，利用核酸酶Dicer剪切成约22个核苷酸的双链miRNA。最后在解旋酶作用下，其中一条链被降解，另一条为成熟度相对较高的miRNA。成熟miRNA和RNA介入形成的沉默复合-35- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析物(简称RISC)相互结合，能够最终产生miＲNA诱导沉默复合体(miRISC),与靶基因mR[4-5]NA在结合状态下产生P小体，对转录作用下的翻译水平起到明显的调节作用。1.2miRNA的作用机制[6]miRNA的靶点通常存在于靶基因mRNA的3'UTR内，也可存在于5'UTR内。miRNA的作用机制分成两种：第一种，若miRNA和靶mRNA两者间能够实现完全互补地配对，目的基因彻底被断裂，则mRNA能够被成功降解。第二种，若miRNA无法和靶mRNA之间很好地配对，蛋白质中目的基因实际的表达水平受到很大的抑制，并干扰细胞翻译，但[4]此时mRNA的稳定性不受影响。miRNA的表达具有组织特异性和细胞特异性，并且在细[7]胞的增殖、凋亡和分化等生物学过程中发挥关键作用。2miR-33在脂质代谢中的作用胆固醇、脂肪酸两者能够参与动脉粥样硬化的产生及演变过程，这点已被公众所认[8-10]可。作为一种内含子miRNA，miR-33位于人类srebp2上，不管是基因组序列还是所处位置，均属于高度保守。现其已被证明在转录后水平对细胞内胆固醇流出和高密度脂蛋白代谢基因，如ABC、A1、ABCG1、NPC1，以及脂肪酸氧化基因，如CROT、CPT1A、AM[9-11]PK等含量进行调节。因此，miR-33对细胞内胆固醇的动态平衡有着重要的意义，在对miR-33表达进行抑制的过程中，对以上基因的抑制予以解除，从而更好地预防动脉粥样硬化的形成。2.1miRNA-33人类miR-33分成两种亚型：1）miR-33a，其位置在22号染色体SREBP-2结合蛋白对应的第16内含子上；2）miR-33b，位置在于22号染色体相关的SREBP-1结合蛋白对应的第17内含子上。miR-33a和miR-33b之间具有高度同源，只有2个碱基的差异。miR-33b在小鼠体内无法测得，缺乏保守性[1]，如何选择适合的哺乳动物作为今后实验的对象有待研究。miR-33首先在细胞核内产生，由Drosha剪切成茎环结构RNA(pre-miRNA)（基本架构为核苷酸，数量为70-100个），而后由Ran2GTP/Exportin5(Exp5)将受体进行输出，从细胞核内部将pre-miRNA转运到细胞质，在核酸酶Dicer的剪切作用下，形成双链microRNA（数量为21～25个核苷酸长度）；再经解旋酶的作用，形成成熟的miR-33（主要构成为核苷酸，数量为22个左右）。在心脏、内皮细胞、大脑以及肺部等各个组织或者是细胞内，miR-33均有较为普遍的表达，无组织特异性。2.2miR-33调节体内胆固醇平衡-36- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文miR-33主要通过对ATP结合三个靶基因（转运因子ABCA1、NPC1以及ABCG1），以[12-14]此来调节体内的胆固醇水平。2.2.1miR-33通过ABCA1调节胆固醇水平miR-33在和ABCA1相互结合的过程中，可以调控胆固醇的逆向转运，促进合成高密度脂蛋白。ABCA1上部的3’非编码区上呈现出3个结合位点。当miR-33a分别和上述位点结合，ABCA1相应的基因表达便会受到明显抑制，最终升高人体血浆内部的胆固醇水平。实验显示，利用抗miR-33能够显著上调ABCA1的表达水平，促进胆固醇更好地向载脂蛋白A1方向流入，从而对胆固醇水平起到下调作用。相反，miR-33a表达增加后，血[14]浆内部的胆固醇也会明显提升。Najafi-Shoushtari等多位学者通过将小干扰RNA分别对人体和小鼠的细胞系处理后进行观察，结果显示，小干扰RNA对Drosha酶、Dicer酶两者间的降解有较大的促进作用，导致miR-33含量降低，而细胞里面的ABCA1蛋白水平则相应地有所提升。该种现象在人类成纤维细胞IMR-90、肝癌细胞HepG2以及小鼠体内的J774（巨噬细胞系）中尤为显著。除上述外，细胞内还可能有pre-miR-33a转染，使其miR-33a原有的表达量显著上升。同时发现，该类细胞内部的ABCA1表达水平也将被显著地抑制。小鼠体内的巨噬细胞J774，人体成纤维细胞IMR-90两者中，上述现象十分明显。相应地，通过将miR-33a相对应的反义核苷酸，也可在细胞内进行转染，AB[15]CA1蛋白自身的含量将得到显著上升。同样Horie等通过上调miR-33a的表达来调控ABCA1的表达，结果血浆胆固醇含量升高；反之，下调miR-33a的表达血浆胆固醇含量下降。通过对小鼠进行造模，使之成为miR-33缺陷模型；再将模型、野生型小鼠做出比对，结果得知：和野生型小鼠相比，miR-33缺陷模型小鼠体内的ABCA1蛋白、载脂蛋白A1均有显著地增加。另外，肝脏细胞内部的ABCA1、高密度脂蛋白两者也较之前有所上[12]升，而三酰甘油则基本未变。除此之外，Rayner等人还发现：小鼠体内的肝脏、巨噬细胞中，miR-33a的表达会下调和减少ABCG1蛋白，使流向高密度脂蛋白的胆固醇减少。2.2.2miRNA-33通过ABCG1、NPC1调节胆固醇水平ABCG1和miR-33有2个结合位点，ABCG1促进胆固醇外排。小鼠ABCG1基因内部的3'UTR，有2个miR-33结合位点；而在人类基因3'UTR中，上述位点是不存在的。因此，[12]人类细胞内ABCG1不表达。-37- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析NPC1含有两个人类miR-33a的结合位点。miR-33a通过结合NPC1，能够对NPC1蛋白的表达起到抑制作用，通过下调巨噬细胞、肝细胞内部的miR-33，降低细胞内的胆固醇水平。miR-33a通过对NPC1表达起到抑制作用，从而降低内质网中实际转运的胆固醇，[16]通过对SREBP-2起到活化作用，来减少胆固醇的生成。NPC1在和ABCA1共同作用下，能够促进胆固醇向载脂蛋白A1中流动。综上所述，miR-33能够对人体细胞内部的胆固[12]醇外排起到抑制作用，且为双重性抑制。在胆固醇中，miR-33同样具有关键的调节作用。它利用细胞内部胆固醇所形成的负反馈环来发挥作用。当胆固醇处于缺乏状态，miR-33能够结合胆固醇调节元件，并发生转录，从而对胆固醇的平衡起到调节作用。摄取胆固醇和合成路径开始的同时胆固醇的流出也被抑制。相反，若细胞内胆固醇水平过高，miR-33则可利用ABCA1途径，促使胆固醇向外流出。2.3miR-33对HDL-C生物合成的调节作用研究显示，血浆HDL-C水平和血脂升高两者间呈现出显著的负相关作用。因此，HDL-C含量增加，对血脂异常的控制有着非常重要的作用。根据Framingham心脏的研究数［17］据，HDL-C的循环每增加1%，出现动脉粥样硬化相关性心脏病的可能性则会降低2%。ABCA1一方面能够介入胆固醇在细胞内部的转运过程，同时也能介入肝脏HDL-C产生。可见，在血浆HDL-C含量中，miR-33有着显著的调控作用。另研究得出，miR-33在对ABCA1表达起到抑制作用的基础上，可促使血浆的HDL含量不断减少。通过对内源性miR-33表达予以拮抗后，小鼠体内的血浆HDL含量也会显著增多，其脂质和炎症基因相应[18，23]的表达则会明显下调，对斑块大小有削减作用，同时还可提高斑块的稳定性。Rayn[17]er等用抗miRNA寡核苷酸用于对动脉粥样硬化小鼠经治疗，最初得出：HDL-C含量较之前有显著增加，斑块内部的脂质成分及巨噬细胞降低程度均大于35%，胶原成分增加[19]2倍，斑块的稳定性显著提高，同时推进动脉粥样硬化斑块转归。Marquart等人研究得出：miR-33参与转导的腺病毒，能够使HDL-C水平降低29%左右，巨噬细胞、肝细胞内部的ABCA1水平得到明显地提升，而HDL-C相应的基线水平也会上调。Najafi-Shous[14]htari等多位学者，以高脂饮食的小鼠进行造模；通过对miR-33a的某些特殊核苷酸进行锁定，最终得出：血浆HDL-C含量明显升高35%，说明抑制miR-33a的表达，可以[15]升高HDL-C的含量。Horie等学者利用拮抗miR-33a对动物进行处理，得知处理后的-/-血浆HDL水平也有很大地提升。此外，他们还认为：miR-33a鼠中同样也被检测到很多HDL-C颗粒。该结果表明：在很多组织细胞内，miR-33a对ABCA1形成的沉默表达均可-38- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文[12]出现，且可以对血浆HDL-C起到相应的调控作用。除靶向肝脏外，Rayner等多人还发现，采用注射的形式给予反义寡核苷酸，能够对粥样硬化斑块起到很好的渗透作用，最终抵达巨噬细胞，促使ABCA1表达不断提升，最终诱导胆固醇更快排出泡沫细胞。基于此，抗miR-33一方面可以上调HDL，另一方面也能对斑块内部的巨噬细胞起到靶向调节作用；根据对胆固醇外排途径予以调节，显著降低巨噬细胞内部的miR-33表达，避免斑块大量破裂。在其他灵长动物身上，给予抗miR-33同样可对血浆HDL-C起到上调作-/-用，且该结果已经得到证实。有研究表明：通过对LDLR小鼠给予抗miR-33寡核苷酸(频率为1次/周，持续14周)，其血样结果为：前2周小鼠内部的HDL-C有所上升高，但未能坚持到实验结束。而经过抗miR-33处理的另一组小鼠，其循环三酰甘油表达相较于对照组小鼠要上升很多。后续检查得知：斑块大小、具体成分基本没有发生变化。上-/-述提示：LDLR小鼠体内，长时间处于沉默的miR-33无法对血浆HDL-C水平起到上调作[19]用，其对粥样硬化形成也起不到抑制作用。抗miR-33主要可利用反义抑制剂或者是剔除等多种方法，来对循环HDL-C水平起到显著的调节作用，促使胆固醇外排。上述显示，反义寡核苷酸的miR-33有望成为降低粥样硬化斑块的一种新型疗法。早先有数据显示，胰岛素能够对血浆HDL水平起到下调作用，但其具体机制我们还不清楚。肝细胞内，胰岛素、LXR两者可同时对SREBP-1c转录起到刺激作用，使脂肪酸能够[12]更顺利地合成甘油三酯。表明miR-33b或可沉默ABCA1表达，对apoA-Ⅰ诱导的胆固醇外排，HDL形成起到促进作用；在沉默ABCG1表达的同时，对HDL参与的胆固醇外排、成熟HDL产生起到抑制作用，最终下调血浆内的HDL水平，出现以血浆甘油三脂、VLDL水平显著上升为基本征象的代谢综合症。2.4miR-33调节脂肪酸代谢miRNA33除了能够对胆固醇稳定、HDL-C生物合成起到调节作用下，同时也能直接介导脂肪酸氧化和磷脂两者间的合成过程。miR-33能够下调CROT、HADHB以及AMPKα等介导脂肪酸氧化基因的表达，并使介导脂肪酸合成基因自身的表达得到显著上调。CROT等上述四种基因均包含miR-33a/b结合位点。CROT实际上为过氧化物酶体的酶，它能够对短链脂肪酸直接转移至肉碱起到较好的催化作用，促使其在β-氧化作用下顺利降解，［20］使脂肪酸能够从过氧化物酶体中直接向细胞质中进行运输。CPT1A实际上为β-氧化的限速酶，是乙酰辅酶A不可或缺的耦合肉碱，能够将长链脂肪酸直接转运直线粒体中-39- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析进而完成β氧化。HADHB能够对线粒体起催化作用，使之完成β-氧化后期的3个步骤；[20]AMPKα能够对肝的脂肪酸氧化以及生酮起到明显的刺激作用。研究认为：若肝细胞内部的miR-33过量，CPT1A、HADHB两项指标相对下调，则脂肪酸β氧化会被大大衰减，脂肪酸的降解过程将受到抑制，促使中性脂质在此处大量聚集。反过来，内源性对mi[10][21]Ｒ-33表达所形成的抑制机理，能够加快脂肪酸的成功降解。Rayner等在研究中得出：通过将反义miR-33寡核苷酸用于对非人类灵长动物进行处理，极低密度脂蛋白含量将明显减少。由上述可知，抗miR-33有着广阔的应用前景。通过上调血浆HDL，减少极低密度脂蛋白含量，对高脂血症的临床治疗，对动脉粥样硬化预防均有重要的指导意义。miR-33b，是miR-33的另一个亚型，其在脂肪酸β氧化过程中有没有发挥作用，尚未有明确说明。当细胞里面的脂肪酸β氧化有所下降，过多分泌出来的胰岛素可以对SREBP-1c表达起到诱导作用，miR-33b和SREBP-1c之间能够共同参与转录，加快合成脂[12，22]肪酸。相较于miR-33a，miR-33b的区别仅在于2个核苷酸上，且它们对于CPT1A以及HADHB所参与的靶向结合活性并影响。上述提示，miR-33b或可对脂肪酸β氧化起到一定的抑制作用。2.5miR-33与甘油三酯合成[14]Najafi等诸多学者认为，miR-33能够沉默磷酸腺苷（AMP）诱导激活蛋白激酶（AMPK）。作为一种蛋白激酶，AMPK能够对细胞内部的能量代谢起到相应的调节作用，对脂肪酸β-氧化、生酮起到促进作用，并对SREBP-1c水平发挥明显的负调控作用，同时对脂肪酸、甘油三酯两者间的合成起到抑制和阻碍作用。但目前的生物学信息显示，AMPK的3'UTR与miR-33并无靶向结合位点，我们推测miR-33是否与AMPK的5'UTR有靶向结合位点，今后研究miR-33与甘油三酯合成可侧重于此。3miR-126在脂质代谢中的作用miR-126是一类保守性较高的miRNA，处在Egfl7基因内的第7内含子上。其前体为[24]二级结构，性状似发夹。该种二级结构相对来说比较稳定。研究显示，miR-126的生物功能需通过其成熟体来起作用。2010年，miRBase正式列出了15种动物身上所出现的miR-126成熟体。在该序列中，分别标出了它们各自的位置。以人类、大鼠为例，它们的序列为UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG。-40- 辽宁中医药大学2016届硕士学位论文现代研究表明，miR-126的表达对内皮细胞炎症反应的发生有抑制作用，对血管内皮细胞凋亡可以进行调控，对血管新生和维持血管完整性可以进行调控，并与脂质代谢[25，26，27，28]有一定相关性。在此仅讨论miR-126在脂质代谢中发挥的作用。有研究显示，miR-126主要是通过对RGS16（也就是G蛋白信号16）所产生的减弱过程，来对蛋白表达起到抑制作用，最终对动脉粥样硬化的形成予以阻碍。RGS16有助于上调内皮细胞中CXCR4的具体表达，CXCR4则可上调其配位体CXCR12，而CXCR12上调对斑块的稳定性起着决定性作用。有实验表明，通过分别抽取31例冠心病、非冠心病患者（分别为31例、36例）进行研究，对其血浆内部的miR-126、LDL-C含量予以测定，在冠心病患者的血浆中，miR-126的含量随LDL-C的含量升高而升高，随LDL-C的含量降低而降低，证明了miR-126与脂质代谢存在一定的相关性。4问题与展望大量研究表明，miR-33是参与脂质代谢调控的非常重要的组成部分，其调控功能已被证实。并且为我们研究脂质代谢方面，提供了新的视角。但是miR-33通过何种方式对靶基因进行激活，经过何种调控通路，各通路之间有着何种关联等，这些问题都有待我们去解决。miR-126在动脉粥样硬化形成的过程中参与相关因素的调控，包括炎症反应、细胞凋亡、血管新生、脂质代谢。但是miR-126与脂质代谢关系及相关调控目前研究较少，这也为今后研究miR-126对动脉粥样硬化的形成提供了新的思路及方向。相信随着我们的深入研究，能更深入、更全面的了解miR-33和miR-126，并为冠心病动脉粥样硬化等心血管系统疾病提供临床诊断依据，为治疗、预后、转归提供新的方法。参考文献［1］SaccoJ，AdeliK．MicroRNAs:emergingrolesinlipidandlipopro-teinmetabolism［J］．CurrOpinLipidol，2012，23(3):220-225．［2］RamírezCM，GoedekeL，Fernández-HernandoC．“Micromanaging”metabolicsyndrome［J］．CellCycle，2011，10(19):3249-3252．［3］SainiHK，Griffiths-JonesS，EnrightAJ．GenomicanalysisofhumanmicroRNAtranscripts［J］．ProcNatlAcadSciUSA，2007，104:17719-17724．［4］YueJ．miRNAandvascularcellmovement［J］．AdvDrugDelivRev，2011，63(8):616-622．-41- 益气健脾和血祛痰对稳定型心绞痛患者miR-33和血脂的影响及相关性分析［5］VickersKC，RemaleyAT。MicroRNAsinatherosclerosisandlipo-proteinmetabolism［J］．CurrOpinEndocrinolDiabetesObes，2010，17(2):150-155.［6］FormanJJ，Legesse-MillerA，CollerHA．Asearchforconservedsequencesincodingregionsrevealsthatthelet-7microRNAtar-getsDicerwithinitscodingsequence［J］．ProcNatlAcadSciUSA，2008，105(39)：14879-14884．［7］HulsmansM，DeKeyzerD，HolvoetP．MicroRNAsregulatingox-idativestressandinflammationinrelationtoobesityandathero-sclerosis［J］．FASEBJ，2011，25(8):2515-2527．［8］BlasiC．Theautoimmuneoriginofatherosclerosis［J］．Atheroscle-rosis，2008，201(1):17-32．［9］RotllanN，Fernández-HernandoC．MicroＲNAregulationofcholes-terolmetabolism［J］．Cholesterol，2012，2012:847849．［10］DávalosA，GoedekeL，SmibertP，etal．miR-33a/bcontributetotheregulationoffattyacidmetabolismandinsulinsignaling［J］．ProcNatlAcadSciUSA，2011，108(22):9232-9237．［11］Fernández-HernandoC，MooreKJ．MicroRNAmodulationofcho-lesterolhomeostasis［J］．ArteriosclerThrombVascBiol，2011，31(11):2378-2382．［12］RaynerKJ，SuárezY，DávalosA，etal．miR-33contributestotheregulationofcholesterolhomeostasis［J］．Science，2010，328:1570-1573．［13］MarquartTJ，AllenRM，OryDS，etal．miR-33linksSREBP-2inductiontore-pressionofsteroltransporters［J］．ProcNatlAcadSCIUSA，2010，107:12228-12232．［14］Najafi-ShoushtariSH，KristoF，LiY，etal．MicroRNA-33andtheSREBPhostgenescooperatetocontrolcholesterolhomeostasis［J］．Science，2010，328(5985):1566-1569．［15］HorieT，OnoK，HoriguchiM，etal．MicroＲNA-33encodedbyanintronofste-rolregulatoryelement-bindingprotein2(Srebp2)regulatesHDLinvivo［J］．ProcNatlAcadSCIUSA，2010，107:17321-17326．［16］FuX，MenkeJG，ChenY，etal．27-hydroxycholesterolisanendogenousligandforliverXreceptorincholesterol-loadedcells［J］．JBiol-42- 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辽宁中医药大学2016届硕士学位论文致谢三年的硕士研究生学习转瞬间就要过去了，在此，我向三年来在学习和生活中所有关心、爱护、帮助、鼓励我的老师和同学们表达我最衷心的感谢。首先感谢我的恩师杨关林教授，在整个研究生阶段对我的谆谆教导，不论在学习还是生活当中，都给予我无私的关怀。杨老师渊博的知识，严谨的治学态度，精湛的医术，对科研精益求精的态度也为我今后进入工作树立了良好的榜样！衷心的感谢我的张哲师姐，在工作学习和科研方面给与我的指导、帮助和关心，让我的科研能力，逻辑思维能力等各个方面都有了明显的提高。衷心的感谢辽宁中医药大学心内一科，王风荣主任、李文杰、杜毅、杨莺、王帅、陈维等所有老师在临床实习中给予的指导和帮助，你们的仁心仁术让我对医疗工作者有了全新的认识，让我时刻叮嘱我自己要做一名合格的医务工作者。衷心感谢重大科研平台贾连群主任，曲怡、王英、杜莹、吴瑾等老师对我实验过程中的支持和帮助，让我知道实验容不得一点马虎和错漏，实验是一件非常严肃的事情。衷心感谢血脉病研究室王洋师姐、刘悦师姐、孔德昭师姐、孟繁丽师姐、尹妮师姐在平时工作中对我的帮助和鼓励，让我知道什么是认真，什么是负责，什么是独挡一面。衷心感谢师姐张哲教授，孟繁丽师姐在论文中对我的指导和帮助。衷心感谢和我一起奋斗在实验室的小伙伴曲文彦同学和赵娜同学。最后，感谢辽宁中医药大学，记录了我的青春，见证了我的成长。不论将来我在何方，从事什么工作，我都不会忘记我爱的你们，和我在这所学校学到的一切！-47-