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《阴茎海绵体注射基质血管组分改善Ⅰ型糖尿病小鼠勃起功能的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：R699密级：公开UDC：610学校代码：11065硕士学位论文阴茎海绵体注射基质血管组分改善Ⅰ型糖尿病小鼠勃起功能的研究林向楠指导教师高振利教授、石磊教授学科专业名称外科学（泌尿外）论文答辩日期2017年5月27日 阴茎海绵体注射基质血管组分改善Ⅰ型糖尿病小鼠勃起功能的研究摘要研究目的：通过腹腔注射链脲佐菌素（STZ）诱导建立糖尿病性勃起功能障碍小鼠模型，用电刺激阴茎海绵体神经方法检测实验小鼠勃起时阴茎海绵体内压力值的变化，评估阴茎勃起功能。探究单次阴茎海绵体内注射基质血管组分（SVF）治疗糖尿病小鼠勃起功能障碍的疗效及作用机制。研究方法：8周龄C57BL6J雄性小鼠随机分为4组：正常对照（Normal）组、糖尿病未治疗（Notreatment）组、海绵体内注射PBS（DM+PBS）组和海绵体内注射SVF（DM+SVF）组。正常实验小鼠通过低剂量（50mg/kg/d）连续5天腹腔注射链脲佐菌素，诱导建立Ⅰ型糖尿病（DM）小鼠模型，根据体重及血糖值筛选出糖尿病小鼠，在DM小鼠建模8W后，勃起力测定技术证实DM小鼠并发勃起功能障碍，成功构建糖尿病性勃起功能障碍小鼠模型，Normal组和Notreatment不做任何治疗处理，PBS组和SVF组阴茎海绵体内分别一次性注射20ul的1xPBS和新鲜分离提取自eGFP小鼠附睾脂肪组织的SVF细胞（1x105cells/20ul）。局部注射2W后，在动物活体实验中，通过电刺激小鼠阴茎海绵体神经，记录海绵体组织勃起时的内压（ICP），记录电刺激之前小鼠的系统血压（MSBP），使用ICP/MBSP评估小鼠的勃起功能。处死小鼠后，立即获取阴茎海绵体组织，进行分子生物学实验，通过免疫荧光染色技术检小鼠测海绵体内VEGF-A、PH3、CD31和p-eNos的表达水平变化，通过ELISA方法检测小鼠海绵体组织内cGMP浓度变化。结果：糖尿病小鼠的勃起功能显著低于正常小鼠（P＜0.05），局部阴茎海绵体内注射治疗2W后，SVF组糖尿病小鼠的勃起功能显著改善，ICP/MBSP比值明显高于Notreatment组和PBS组（P＜0.05）。SVF增加糖尿病小鼠海绵体内VEGF-A的表达，SVF诱导糖尿病小鼠海绵体血管内皮细胞增殖，SVF融合到糖尿病小鼠海绵体内皮细胞诱导分化，SVF增加糖尿病小鼠海绵体内皮细胞含量，SVF增加糖尿病小鼠海绵体内eNos磷酸化表达水平，SVF增加糖尿病小鼠海绵体内cGMP浓度。SVF组阴茎海绵体内VEGF-A、PH3、CD31、p-eNos的表达水平和cGMP浓度明显高于DM组和PBS组（P＜0.05）。结论及意义：阴茎海绵体组织内注射SVF增加海绵体内血管生长因子的表达或融合宿主内皮细胞诱导分化增殖，使阴茎血管内皮细胞再生，通过恢复和增强内源性NO-cGMP途径改善糖尿病小鼠的勃起功能，为临床治疗糖尿病性勃起功能障碍疾病提供了一定的基础支持。Ⅰ 硕士研究生：林向楠（泌尿外科）指导教师：高振利（教授）、石磊（教授）关键词：Ⅰ型糖尿病;勃起功能障碍;海绵体神经;电刺激;基质血管组分Ⅱ IntracavernousdeliveryofSVFasanoveltherapeuticstrategyforerectiledysfunctioninthetypeIdiabeticmouseAbstractObjective:Toexplorethefeasibilityofintraperitonealinjectionofstreptozotocin(STZ)intheestablishmentofdiabeticerectiledysfunctionmousemodelandtheapplicationofelectricalstimulationofpenilecavernousnerveinmousemodelforassessmentofpenileerectilefunction.Thepurposeoftheexperomentwastoinvestigatewhetherandhowsingleintracavernousinjectionofstromalvascularfractionontherecoveryoferectiledysfunctioninthetype1diabeticmice.Methods:Eight-week-oldmaleC57BL6Jmicewererandomlydividedinto4groups:normalcontrol(Normal)group,diabeticmicewithouttreatment(Notreatment)group,intracavernousinjectionofPBS(DM+PBS)groupandSVF(DM+SVF)group.Themiceoftype1diabetesmellituswereinducedbyinjectedSTZ(50mg/kg)for5dayscontinuously.QualifiedDiabeticmicewerescreenedforweightandbloodglucoselevels.520ulof1xPBSandfreshlyisolatedSVF(1x10cells/20ul)ofepididymaladiposetissuefromeGFPmousewereinjectedintothecorpuscavernosumofPBSgroupandSVFgrouprespectivelyaftermodeling8weekindiabeticmicewhichDiabeticErectileDysfunctionMiceModelwassuccessfullyestablishedandconfirmedbyerectileforcemeasurement.Afterlocalinjectionof2W,inanimalexperiments,theICPwasrecordedandtheMSBPbeforetheelectricalstimulationwasrecorded.ICP/MBSPwasusedtoevaluatetheerectilefunctionofmice.Thecorpuscavernosumtissuewasobtainedimmediatelywhilethemiceweresacrificed,andthemolecularbiologyexperimentwascarriedout.TheexpressionlevelsofVEGF-A,PH3,CD31andp-eNosinthecorpuscavernosumweredetectedbyimmunofluorescencestaining.ThechangesofcGMPconcentrationinthecorpuscavernosumweredetectedbyELISA.Results:TheerectilefunctionofdiabeticmicewassignificantlylowerthanthatofDMgroupandPBSgroup(P<0.05).TheerectilefunctionofdiabeticmiceinSVFgroupwassignificantlyhigherthanthatinDMgroupandPBSgroup(P<0.05).SVFincreasedtheexpressionofVEGF-Ainthecorpuscavernosumofdiabeticmice.SVFinducedtheproliferationofcavernousvascularendothelialcellsindiabeticmice.SVFwasinducedtoinducedifferentiationofspongiformendothelialcellsindiabeticmice.SVFincreasedthecontentofvascularendothelialcellsindiabeticmice,SVFIncreasedexpressionofeNosphosphorylationinthecorpuscavernosumofdiabeticmice.SVFincreasedtheconcentrationofcGMPinthecorpuscavernosumofdiabeticmice.TheexpressionlevelsofVEGF-A,PH3,CD31andp-eNosinthecorpuscavernosumoftheSVFgroupweresignificantlyhigherthanthoseintheDMgroupandthePBSgroup(P<0.05)。Ⅲ Conclusion:SVFcansignificantlyimprovetheerectilefunctionofdiabeticmice.ThemechanismofSVFmaybeincreasestheexpressionofvasculargrowthfactorinthecorpuscavernosumorfusesthehostendothelialcellstoinducedifferentiationandproliferation,regeneratesthepenilevascularendothelialcells,restorestheendogenousNO-cGMPpathwayandimproveserectilefunction.Itprovidesacertainbasisforthesupportfortheclinicaltreatmentofdiabeticerectiledysfunction.Graduatestudent：LinXiang-nan（urology）DirectedbyProf.Gao-Zhen-li/ShiLeiKeywords:typeⅠdiabetesmellitus;erectiledysfunction;cavernousnerve;electricalstimulation;stromalvascularfractionⅣ 目录引言………………………………………………………………………………………1第一部分糖尿病小鼠模型的建立及电刺激法在糖尿病勃起功能障碍小鼠中的应用………………………………………………………………………….………………3研究对象与方法…..……………………………………………………..……………31实验动物及试剂………………………….…………..…...….….…………………32糖尿病小鼠模型建立………………………………………………………………..43电刺激法检测糖尿病小鼠的勃起功能…………………………..…...……………44统计学分析……………….……………………….…….…...……..…….…………5结果………….…………..…………………………….…………..……………………61STZ可以诱导C57小鼠建立糖尿病模型………..…………….……..…………….62电刺激法可以应用于糖尿病勃起功能障碍小鼠检测…………..…..…………….7讨论………………...…….……………….……………...……………..…..……………9第二部分阴茎海绵体注射SVF改善Ⅰ型糖尿病性勃起功能的研究………..…...…11研究对象与方法….……….………...……………………………………..…………111实验动物及试剂……….…………………..…………….……………..…………112消化法提取新鲜SVF细胞.……………..………..….……………………………123海绵体注射SVF改善Ⅰ型糖尿病性勃起功能障碍…..……………….…………134免疫组织化学方法…………....….………………..…………..…...….…..………145ELISA法测定cGMP浓度…….……..…………………………….……………146统计学处理………………………………………………………………………14结果…………………………………………………………………..……..…………151小鼠的代谢及生理变量变化…………………………………..……...…..…….152SVF显著改善糖尿病小鼠的勃起功能…..………………………………………162.1SVF增加糖尿病小鼠海绵体内VEGF-A的表达……..………….....….……..17 2.2SVF诱导内皮细胞增殖…………..…………………………………………….182.3SVF融合到海绵体内皮细胞诱导分化…………..…………….……………….192.4SVF增加糖尿病小鼠海绵体内皮细胞含量……………..………….………….202.5SVF增加糖尿病小鼠海绵体内eNOS磷酸化水平………….…..…………….212.6SVF增加糖尿病小鼠海绵体内cGMP浓度…………….……….…….……….22讨论……….…………………………………………………………………….………23结论…………….…….…………………………………………………………………25参考文献…………….…………………………………………………………………26综述………………….…………………………………………………………………29综述参考文献…….……………………………………………………………………34攻读学位期间的研究成果…………………..…………………………………………40缩略词表（附录）……………………………………………....……………………41致谢………………………………………..……………………….……………………43学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明…………..…………………44 引言引言糖尿病（diabetesmellitus，DM）是以血糖浓度升高、糖脂代谢异常为主要特征的慢性疾病，在疾病的进展过程中可引起多种并发症。老年患者是糖尿病高发人群，[1]目前全球范围内糖尿病患者多达3亿5000万，人们饮食结构及生活习惯随着社会进步而改变，其临床发病更趋向年轻化，发病人数也呈递增趋势。糖尿病的病变主要侵及血管，引起血管管腔狭窄、硬化等病理改变，影响其行使正常的生理功能。海绵体组织在阴茎勃起的发生及维持阶段均起着关键作用，而且是一种特殊的血管系统。糖尿病患者的慢性血管病变累及到海绵体时会引起海绵体有效灌注量不足，阴茎勃起的程度明显不足导致勃起功能障碍（erectiledysfunction，ED）。据研究统计75%的糖尿病患者有不同程度的勃起功能障碍，相比不合并糖尿病的患者，[2]ED的发病年龄要提前10～15年，其功能障碍随着年龄和病程的增长而加重。虽然该疾病不危及患者生命，但对生活质量有很大的影响，随着经济社会的不断发展，医疗水平的提高，人们的寿命显著延长，满足基本的温饱问题之后，对生活质量的要求越来越高，特别是随着思想的解放，老年男性性功能疾病成为影响和谐生活的首要问题，因此，糖尿病性勃起功能障碍成为越来越多医生和患者关注的问题。PDE5I如西地那非是临床上治疗ED的经典药物，在一般ED患者中的有效率高达[3]89%，但对DED患者的有效率只有56%。血管内皮细胞代谢异常是糖尿病患者血管并发症早期病例改变，事实上，ED被认为是系统性血管内皮功能障碍的初期[4][5]表现，而严重的血管内皮功能障碍是影响PDE5抑制剂疗效的重要因素。因此，血管内皮功能障碍的研究成为目前的一个热点，其中干细胞因为具有分化成多种细[6]胞的能力而备受关注。干细胞因来源不同分为胚胎干细胞（EmbryonicStemCells,ESCs）和成体干细[7][8]胞（AdultStemCells,ASCs），ESCs能被诱导分化成机体各种类型的细胞，但因为受伦理道德和法律的制约，研究进展极其缓慢。ASCs虽然比ESCs分化能力弱，但因为不受伦理问题等限制，反而成为更广泛深入研究的干细胞。成体干细胞中的脂肪源性干细胞（Adiposederivedstemcells，ADSCs）因为储备丰富、易于获[9]取、可大规模培养、能够自体移植减少排异同时可以特异性诱导分化等优点成为当前研究的热点。[10]有研究报道海绵体内注射ADSCs可以改善大鼠的勃起功能，其作用机理可能与神经细胞保护和防止海绵体纤维化有关。然而ADSCs虽然获取方便，但在体[11]外培养的过程中具有易污染的风险，体外扩增时原有的性状可能会发生更改。脂肪组织富含基质血管组分（stromalvascularfraction，SVF）细胞，是提取ADSCs1 青岛大学硕士学位论文[12]的重要来源，可以不经体外培养直接大量获得，除此之外，SVF还能分泌血管内皮生长因子（VEGF-A）、肝细胞生长因子（HFG）和血管生成素（Ang-1）等，[13-15]并促进体内受损血管再生。本研究以C57BL6J雄性小鼠为实验对象，利用STZ对胰岛β细胞的破坏效应，通过连续多次腹腔注射的方法诱导建立糖尿病小鼠模型，根据体重及血糖值筛选出合格的糖尿病小鼠用于后续实验，建模8周后发现糖尿病小鼠并发勃起功能障碍，应用电刺激阴茎海绵体神经的方法测量勃起过程中的海绵体内压力的变化，记录小鼠的平均系统血压，以两者的比值来评估小鼠的勃起功能状态，确定电刺激法是一种安全、稳定、可反复的评估勃起功能的方法，通过从eGFP雄性小鼠的附睾脂肪组织获取新鲜的血管基质组分，在显微镜下以单次局部海绵体组织注射的方式进行治疗，通过电刺激法检测治疗2周后有功能障碍糖尿病小鼠的勃起功能的恢复情况，获取小鼠阴茎海绵体组织应用分子生物学实验检测血管相关因子的表达情况，进一步探究应用SVF改善糖尿病性小鼠勃起功能的效果，为临床治疗ED提供有效的基础支持。2 第一部分糖尿病小鼠模型建立及电刺激法在糖尿病勃起功能障碍小鼠中的应用第一部分糖尿病小鼠模型建立及电刺激法在糖尿病勃起功能障碍小鼠中的应用ED是常见于老年男性患者，而且糖尿病患者并发的几率较大，大部分DM患者勃起功能有不同程度的损伤，其临床初期发病年龄越来越早，其功能障碍随着年龄[2]增长和病程延长而加重。而糖尿病性勃起功能障碍患者应用经典的PDE5I的疗效明显低于非糖尿病患者，这与糖尿病导致的血管内皮功能受损有关，因此有必要深入了解糖尿病性勃起功能障碍的血管因素发病机制，而进行该项实验研究的必要条件之一就是建立DMED动物模型，本节主要内容为DMED小鼠模型的建立以及电刺激阴茎海绵体神经方法在该模型中的应用研究，为后续实验奠定基础。研究对象与方法1实验动物及试剂1.1实验动物：8周龄SPF级C57BL6J雄性小鼠，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司（经山东省实验动物中心质检合格），饲养于滨州医学院医药研究中心SPF级动物房，小鼠保持在一个光/暗周期为12小时/12小时，温度控制在22°C±2°C，湿度保持在50%–55%的环境中，自由摄取食物和水。1.2试剂和仪器：罗氏全活力型血糖仪及配套试纸----------------------------德国罗氏0.1mol/l柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（PH=4.5）----------滨医医药研究中心链脲佐菌素（STZ）--------------------------------------美国sigma1ml无菌注射器-------------------------------------烟台毓璜顶医院15mlEP离心管-------------------------------------滨医医药研究中心1000ul单通道可调节移液枪---------------------------德国eppendorf精密电子天平（ME3002E）-------------------------瑞士METTLERTOLEDO4%水合氯醛溶液------------------------------------滨医医药研究中心多导生理记录仪-----------------------------------------美国BIOPAC铂金双极电极-------------------------------------------美国BIOPAC电刺激仪------------------------------------------------美国BIOPAC3 青岛大学硕士学位论文显微外科手术器械---------------------------------滨医医药研究中心小鼠无创血压仪（BP-2000）--------------------------------美国INC2糖尿病小鼠模型建立2.1实验小鼠的分组：购买的小鼠先在SPF级动物房适应性饲养1周，随机取10只作为对照组，取20只作为实验组，造模前小鼠均禁食10h。2.2STZ溶液配制：将50mgSTZ在冰浴避光条件下溶解于10ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中（0.1mol/l，PH=4.5），配制成链脲佐菌素溶液（5mg/ml）。2.3药剂注射：实验组禁食后50mg/kg剂量腹腔注射STZ溶液，每天1次，重复5次；对照组同样条件下注射0.1mol/l柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。2.4小鼠体重及血糖的测定：造模前记录各组小鼠的初始体重，造模后，每周监测并记录体重变化，建模2周后开始记录小鼠随机血糖和禁食12h后的空腹血糖变化，以剪尾法取血、罗氏血糖仪及配套试纸检测血糖值。以任意时间血糖＞16.7mmol/l为成模标准，随机选取建模成功的糖尿病小鼠10只为糖尿病组。3电刺激法检测糖尿病小鼠的勃起功能3.1实验动物分组：STZ诱导建立糖尿病模型，建模后的C57BL6J小鼠，经罗氏血糖仪检测其随机血糖稳定高于16.7mmol/l，记为糖尿病组；同一批次正常喂食的C57BL6J小鼠，作为对照组。3.2无创尾压测量仪测量小鼠血压:采用尾袖法测量小鼠安静清醒条件下尾动脉血压。将小鼠在30℃环境中预热5min后，将小鼠用合适的固定器固定，将鼠尾套入脉搏感应器中，气动加压发现脉搏波动消失时即收缩压数值达到30mmhg水平，然后慢慢减压，经压力传感器和放大器连接到生物实验系统记录血压的变化。每只小鼠间隔2min，连续3次取平均值。3.3ICP的测定：雄性小鼠应用4%的水合氯醛溶液经腹腔给药进行（0.1ml/10g）麻醉，用镊子以适中的力量夹持小鼠前爪，若反应剧烈则补注麻醉药，避免术中给予电刺激时小鼠剧烈活动影响实验数据的准确性，若麻醉效果良好则将小鼠仰面固定于解剖操作台上，剃去下腹部手术区域毛发，碘伏常规消毒，沿阴茎纵轴剪开阴茎包皮，分离包皮和白膜，充分暴露阴茎海绵体，取阴茎包皮切口4 研究对象与方法向上延续2～3cm，切开皮肤，游离皮下脂肪及结缔组织，分离耻骨联合前肌肉组织，打开腹膜，用无菌纱布条攒成圆球状塞进腹腔挤开肠道，增加手术操作空间，充分暴露前列腺组织，在前列腺组织后外侧，识别盆神经节，沿尿道方向寻及阴茎海绵体神经如图1.2，镊子夹持前列腺组织上提，从底部穿过铂金双极电极并固定妥当，用充满肝素生理盐水的头皮针穿入阴茎海绵体中部，头皮针通过三通阀门连接注射器和压力换能器，推注少许肝素生理盐水可见阴茎勃起，证明穿刺连接正确，术毕。需要注意的一点是穿刺前先打开软件，调节20cm、50cm时水柱的压力值，进行矫正。铂金双极电极连接电刺激仪，电刺激参数为电压5v，波宽1ms，频率13HZ，刺激时间60s，间隔10min，共刺激3次。观察记录电刺激时海绵体内压力值变化情况。4统计学处理：SPSSl9.0软件统计分析，实验数据以x±ｓ表示，组内采用单因素方差分析（ANOVA），各组均数间采用单样本t检验比较，P<0.05表示差异显著。5 结果结果1STZ可以诱导C57小鼠建立糖尿病模型：在诱导建立糖尿病小鼠模型中，糖尿病组小鼠在建模1周后与对照组相比开始出现尿量增多，随着时间延长，开始出现多饮、多食、多尿，消瘦、毛发无光泽等典型糖尿病症状如图1.1，期间有3只因过度消瘦及难以控制的高血糖、感染等因素死亡，2只体重增加迅速而筛除。对照组无异常死亡。建模8w，糖尿病组小鼠体重明显低于对照组小鼠，差异显著（P＜0.05）,糖尿病组小鼠与对照组小鼠相比血糖指标明显升高，差异显著（P＜0.05）如表1.1。图1.1糖尿病组（左）、正常对照组（右）表1.1糖尿病组与对照组小鼠体重与血糖测量值（x±ｓ）组别数量初始体重最后体重初始血糖（mg/dl）最后血糖（mg/dl）（只）（g）（g）随机血糖空腹血糖随机血糖空腹血糖对照组1021.6±0.430.7±0.5142.7±14.0105.8±14.5143.8±11.5108.5±12.31021.5±0.523.7±0.5#376.9±34.6#糖尿病146.7±12.3107.1±11.9508.3±72.2组P0.7790.0000.5110.8340.0000.000#注a：与对照组相比明显降低，p＜0.05；与对照组相比明显升高，p＜0.056 青岛大学硕士学位论文2电刺激法用于糖尿病小鼠勃起功能的检测：2组间小鼠的生理和代谢参数如表1.2所示。给予小鼠电刺激后，海绵体内压力迅速升高，持续电刺激期间，压力先是迅速增加，然后进入平台期，增加的幅度减弱，电刺激60s时压力达到最大值（MaxICP），可见小鼠阴茎充分勃起如图1.3，停止电刺激，勃起迅速消退如图1.4，压力迅速降低。2组小鼠电刺激前后ICP变化如图1.5所示。每组小鼠3次电刺激之间MaxICP和MSPB比值变化无统计学意义（p＞0.05），见表1.3。比较3次电刺激时2组间小鼠的勃起功能指标差异显著（p＜0.05）见表1.3。图1.2阴茎海绵体神经图1.3电刺激时阴茎勃起图1.4电刺激后阴茎勃起消退图1.5阴茎海绵体神经电刺激测正常鼠和糖尿病鼠的ICP7 结果表1.2实验组和糖尿病组小鼠的生理和代谢参数（x±ｓ）组别体重（g）随机血糖空腹血糖血压（mmHg）（mg/dl）（mg/dl）收缩压平均压舒张压对照组30.5±0.7131.2±14.8101.7±14.296.1±1.372.3±2.061.7±2.9DM组22.7±1.7581.8±37.0380.2±44.594.4±2.471.3±2.161.2±2.6注a：P＜0.05与对照组相比表1.33次电刺激时糖尿病组与对照组组间小鼠的勃起功能指标（x±ｓ）组别MaxICP（cmH2O）MSBPMaxICP/MSBP123（mmHg）123对照组100.8±6.397.4±6.195.1±6.296.1±1.30.77±0.050.75±0.050.73±0.05DM组52.3±5.749.1±6.146.7±5.894.4±2.40.41±0.040.38±0.040.37±0.04#注a：ICP：海绵体内压，MSBP：平均动脉压，P＜0.05与对照组相比，P＜0.05组内3次电刺激之间相互比较8 讨论讨论糖尿病患者常常并发勃起功能障碍，PDE5-I是目前临床上治疗ED的一线用药，[3]但对糖尿病患者的有效率要远低于非糖尿病患者。其他治疗如尿道内栓剂、阴茎[16]假体植入等方式，能获得一定效果，但均不理想。因此需要更深入的研究Ⅰ型糖尿病ED的发病机制及探索有效的新治疗方式。以患者为研究对象进行性功能研究因为受到伦理、道德、法律等限制，无法开展基础实验的研究，目前多是以动物模[17]型作为实验基础。因此选择合适的实验对象建立Ⅰ型糖尿病模型，并在此基础上进行勃起功能障碍的生理学、病生学和药动学等各方面的研究，是保证其实验结果外推到人类过程安全性和有效性的前体。勃起功能障碍的研究中，选择合适的实验动物需要考虑诸多因素，根据研究者的目的、动物成本、动物繁殖周期等因素，可以选取猫、狗、兔、大鼠、候等动物[18]作为实验对象，小鼠近来也用于研究。目前国内最常用来研究糖尿病及其并发症的实验动物是大鼠，因为其具有抗感染能力强、繁殖快、易饲养、相对经济等优点[19]，但与小鼠相比，其应用于实验的耗材及试剂仍然相对较多，因此国内外对于糖尿病性勃起功能障碍的实验研究越来越多的选择小鼠作为实验对象。目前构建的糖尿病动物模型主要有：实验性糖尿病动物模型、自发性糖尿病动[20]物模型和转基因糖尿病动物模型。其中由于育种成本高，自发性糖尿病动物模型的应用受到限制，转基因模型是敲出特定的基因产生的，目前还未广泛应用与基础研究，当前仅有实验性模型广泛应用于科学实验。而应用STZ诱导建立糖尿病模型是最经典的方法。STZ通过特异性的破环动物胰岛β细胞，引起胰岛素合成释放[21]减少，进而导致动物血糖浓度升高，广泛应用于糖尿病动物模型的建立，STZ引起β细胞死亡的机制主要有2方面：（1）烷化胰岛β细胞DNA链，使其断裂，导致β细胞死亡；（2）烷化细胞内关键酶如ADP核糖体合成酶，导致细胞内ATP[22]含量减少，引起β细胞死亡。STZ制成溶液状态后极不稳定，PH值应该维持在3.5-4.5，避光低温可以短时间保存，否则置于常温环境会迅速降解，因此最好是用柠檬酸缓冲液现配现用，并置于冰盒上，在尽可能短的时间里完成操作。目前常用的注射方式是静脉注射和腹腔注射，前者不容易准确的找到尾部静脉，难度相对较高，不易注射成功，而腹腔注射操作简单、安全，成功几率更大。本研究选择C57BL6J雄性小鼠作为实验对象，通过小剂量多次经腹腔STZ用药的途径成功创建糖尿病小鼠模型，该方法简单、安全、有效，为后续科研工作提供充足的实验动物模型。9 青岛大学硕士学位论文[23]目前文献报道的检测评价勃起功能的方法有阴茎海绵体测压、性行为直接观[24][25]察如阿扑吗啡实验、勃起时肌电图图谱测量、多普勒超声检测阴茎动脉血流[26][27][28]变化等。Steers等和Chen等分别以大鼠和小鼠为实验对象成功测量了阴茎海绵体内的压力值。对实验动物勃起功能的评估要保证客观、公正、准确等原则，其中电刺激海绵体神经诱导阴茎勃起测量内压的方法，因为能通过换能器直接读取海绵体压力的数值，不受外界环境和实验者主观因素的影响，能够客观、公正的评[29]价阴茎勃起功能，成为国内外评价阴茎勃起功能的标准方法。Sezen等报道了国外首次以电刺激法测量海绵体内压，并获得成功。[30]本实验参考国外文献的电刺激参数，以C57BL6J小鼠为实验对象，在STZ诱导糖尿病模型成功后8周，给予5v电压，波宽1ms，频率13HZ，刺激时间为60s，比较实验组和正常组的海绵体内压力，发现糖尿病小鼠较对照组小鼠明显下降，与其它实验结果一致。我们的经验是，小鼠的体积较小，生理解剖肉眼难辨，需要借助解剖显微镜和显微手术器械，减少对周围组织和脏器的损伤，减少操作过程中出血，避免失血过多对实验数据产生影响，识别前列腺后外侧的阴茎海绵体神经时，可以用无菌棉球将周围肠管推开，给予充分的操作空间。总之，利用电刺激法测量糖尿病小鼠阴茎海绵体内压，能有效反应糖尿病小鼠与正常小鼠的海绵体内压的差异，为Ⅰ型糖尿病性勃起功能障碍提供评价的客观依据，而且电刺激海绵体神经的方法测量阴茎海绵体内压，应用于小鼠糖尿病模型中安全、可靠、可重复，是一种理想的评价勃起功能的方法。10 青岛大学硕士学位论文第二部分海绵体注射SVF改善Ⅰ型糖尿病勃起功能的研究研究对象与方法1实验动物及试剂1.1实验动物：8周龄SPF级eGFP小鼠，购买自济南朋悦实验动物繁育公司（经山东省实验动物中心质检合格），建模成功的C57BL6J糖尿病雄性小鼠，同龄的正常C57BL6J雄性小鼠，饲养于滨州医学院医药研究中心SPF级动物房，小鼠保持在一个光/暗周期为12小时/12小时，温度控制在22°C±2°C，湿度保持在50%–55%的环境中，自由摄取食物和水。小鼠雄性：雌性以1:2的比例合笼饲养进行繁殖子代，取子代雄性eGFP小鼠作为实验对象。1.2试剂及耗材：15、50mlEP离心管----------------------------------------------------苏州海狸纳米电动冲击钻--------------------------------------------------------滨医医药研究中心精密电子天平（ME204E）-------------------------------瑞士METTLERTOLEDO涡旋振荡器（Vortex-Genie2）-----------------------------------------上海奥然科贸恒温培养摇床（THZ-100）--------------------------------------------------上海一恒超净工作台（AIRETCH）----------------------------------------------------苏州安泰40、70um细胞筛网-------------------------------------------------------------上海拜力各量程单通道可调节移液枪-------------------------------------------德国eppendorf超速低温离心机（5804R）---------------------------------------------德国eppendorf血球计数板------------------------------------------------------------------------上海求精显微盖玻片------------------------------------------------------------------------江苏世泰倒置显微镜（ckx41）-----------------------------------------------------日本奥林巴斯Hank's平衡盐溶液-----------------------------------------------------------美国Hyclone2型胶原酶----------------------------------------------------------------------北京索来宝胎牛血清----------------------------------------------------------------------北京博奥拓达DMEM高糖培养基-----------------------------------------------------------美国Hyclone11 青岛大学硕士学位论文新鲜获取的SVF细胞---------------------------------------------------eGFP雄性小鼠A30规格胰岛素注射器------------------------------------------------------上海碧迪4%水合氯醛溶液----------------------------------------------------滨医医药研究中心多导生理记录仪------------------------------------------------------------美国BIOPAC铂金双极电极----------------------------------------------------------------美国BIOPAC电刺激仪---------------------------------------------------------------------美国BIOPAC显微外科手术器械---------------------------------------------------滨医医药研究中心小鼠无创血压仪（BP-2000）-------------------------------------------------美国INC2消化法提取新鲜SVF细胞2.1取材并分离：1）将5只eGFP雄性小鼠拉颈处死，取附睾部脂肪组织，2）剪刀处理后置于含0.2%Ⅱ型胶原酶10ml的15mltube管中，用冲击钻打碎，3）温控摇床150rpm，37°，60min消化脂肪细胞（该过程处于避光状态），4）在无菌操作台中，70um细胞筛网和50ml离心管过滤消化液，5）向滤液中加等量含10%FBS的DMEM培养基使胶原酶失活，6）用40um细胞筛网和50ml离心管再次过滤，将滤液移至15ml离心管中，7）1800rpm，4°，4min离心，可见底部管侧壁灰白色沉淀附着，8）移除上清液及悬浮脂肪颗粒，用PBS漂洗1次，吹打混匀，9）再次1800rpm，4°，4min离心，移除上清液，10）100ulPBS重悬沉淀，所得即为新鲜的血管基质成组分细胞。2.2计数：取2ulSVF细胞原液，用PBS稀释5倍备用，将清洗干净的细胞计数板盖上载玻片，将稀释后的10ulSVF液，从计数区一侧缓慢加入，见液体完全覆盖计数池为准，水平移动到光学显微镜下，在低倍镜下找到计数区，进行计数，注意计数时数左不数右，数上不数下。25×16的计数板计算公式：细胞数/ml=(80小格内的细胞数/80)×400×10000×稀释倍数12 青岛大学硕士学位论文3海绵体注射SVF治疗Ⅰ型糖尿病性勃起功能障碍3.1实验动物分组：8周龄的C57BL6J雄性小鼠，STZ诱导糖尿病模型，建模后8周，将实验小鼠分为4组：正常对照（Normal）组，糖尿病小鼠未给予治疗（NOTreatment）组，糖尿病小鼠分别给予注射PBS（DM+PBS组）和新鲜分离自5eGFP雄性小鼠的SVFs（1x10cells/20ul，DM+SVF组）。3.2动物实验：Normal组和NoTreatment组小鼠不做处理，PBS组中的糖尿病小鼠在显微镜下使用A30规格胰岛素注射器经阴茎海绵体中段一次性注射20ulPBS溶液，SVF组中的糖尿病小鼠注射等量的SVFs溶液。注射前用血管夹夹住阴茎根部如图2.1，暂时阻断血液回流，注射时缓慢推注保证2min的注射时间，期间可见阴茎勃起如图2.2，退出针头时应缓慢，减少药剂漏出。治疗2周后，应用无创尾压测量系统记录4组小鼠的系统血压，应用电刺激法测量４组小鼠勃起时的海绵体内压，拉颈处死小鼠后，获取阴茎组织用于分子生物学实验。图2.1血管夹阻断血流图2.2海绵体注射前（左）、注射时（右）3.3冰冻切片阴茎组织放入新鲜配制冰的固定液（Ph=8.0，0.1MPBS）中，内含2%甲醛、0.0002%苦味酸。固定3小时后组织放置于冰的30%蔗糖溶液过夜，用锡纸做一方形模具，先加入少量OCT，再放组织，再在组织上方加OCT进行包埋处理，把锡13 青岛大学硕士学位论文纸下缘接触液氮液面，OCT变白即可。使用恒温冷冻切片机在箱内温度-20℃时切片。切片厚度一般为8-10um。4℃丙酮固定10min，室温晾干2h，用于免疫组化染色。4免疫组织化学方法试剂配置：封闭液羊血清或小牛血清白蛋白（用PBS或含0.05%TRITON的PBS稀释），一抗用用PBS或含0.05%TRION的PBS稀释，二抗用专用稀释液稀释，一抗工作液：血小板内皮细胞粘附分子-1（Pecam-1，CD31），PH3（磷酸化组蛋白H3）、P-eNOS、VEGF-A等对应的抗体。1）复温：取出冰冻切片放在湿盒中复温10min2）水化：二蒸水洗1次×5min3.封闭非特异性蛋白：A:PBS溶液冲洗3×5minB:取出切片，滤纸吸干残留液体，用免疫组化笔在组织周围画圈标记，圆圈内加入封闭液浸泡组织，室温封闭30-45min4）一抗孵育：控掉切片上的封闭液，滤纸吸干组织周围残留封闭液，加入稀释的一抗工作液（1:25,1:50），4℃冰箱过夜。5）二抗孵育：A:将一抗倒掉并用PBS以摇床最慢摇速洗3次×5min，B:控掉组织周围水分，滤纸吸干组织周围残留液体，37℃恒温箱二抗孵育2hC:用PBS以摇床最慢摇速洗3次×5min6）封片：抗荧光淬灭封片剂封片7）荧光显微镜or激光共聚焦显微镜观察拍片5ELISA法测定cGMP浓度：阴茎海绵体注射治疗2周后，取新鲜阴茎海绵体组织，经PBS液冲洗后，在液氮中快速冰冻，然后保存在-70°的冰箱中，根据Cayman比色法试剂盒（CaymanChemical,AnnArbor,MI,USA）提供的说明书进行处理，阴茎组织的cGMP测定量用pmol/g表示。6统计学处理：SPSSl9.0软件统计分析，实验数据以x±ｓ表示，组内采用单因素方差分析（ANOVA），各组均数间采用单样本t检验比较，P<0.05表示差异显著。14 结果结果糖尿病小鼠的体重明显低于正常小鼠，血糖浓度明显高于正常小鼠，4组小鼠系统血压无差异，动物活体实验中：血流动力学显示SVF局部作用于阴茎海绵体显著增加勃起时海绵体内的血流，maxICP较DM未治疗和PBS组小鼠明显增加；分子生物学实验显示：SVF局部作用于海绵体组织，能显著增加VEGF-A、PH3、CD31、P-eNOS表达水平和cGMP浓度。1小鼠代谢及生理变量变化：4组小鼠的代谢及生理变量，包括体重、血糖浓度、系统血压，记录在表2.1中（N=5）。表2.1治疗2周后，小鼠的代谢及生理变量STZ诱导建立糖尿病小鼠NormalNotreatmentPBSSVF体重（g）31.8±0.8421.5±0.7121.6±0.8521.4±0.61116.6±10.5401.4±57.6空腹血糖427.3±39.8407.2±36.3（mg/dl）138.2±5.5504.4±64.9随机血糖559.4±36.8563.4±46.1（mg/dl）血压（mmHg）收缩压95.7±1.596.3±1.597.1±0.797.8±1.6舒张压62.1±2.162.3±2.162.9±1.864.4±1.2平均动脉压74.1±1.773.5±2.274.4±1.976.0±1.0注a：与normal组相比明显降低，p＜0.0515 青岛大学硕士学位论文2SVF显著改善糖尿病小鼠的勃起功能：MaxICP和MaxICP/MSBP数值在糖尿病未治疗组和PBS组中要低于正常对照组，在SVFs治疗2周后，给予电刺激时，SVF组的maxICP、MaxICP/MSBP较糖尿病未治疗组和PBS组显著增加，达到正常小鼠勃起功能的81～87%左右，如图2.3、2.4所示（N=5）。图2.3电刺激阴茎海绵体神经测量各组小鼠ICP1.21＃0.80.60.40.2MaxICP/MSBP0NormalNotreatmentPBSSVF图2.4MaxICP/MSBP比值P＜0.05，与Normal组和SVF组相比，＃P＜0.05，与Notreatment和PBS组16 结果2.1SVF增加糖尿病小鼠海绵体内VEGF-A的表达：SVF局部海绵体注射1d后，与糖尿病未治疗组和PBS组小鼠相比，SVF治疗组小鼠海绵体内VEGF-A表达显著增加，我们用抗CD31（红色）和（Ser1177;蓝色）抗体进行阴茎海绵体的免疫荧光染色如图2.5所示（比例尺=100um），图像分析仪对海绵体组织内抗VEGF-A染色阳性的区域进行定量分析如图2.6所示（N=5）。图2.5阴茎海绵体抗CD31和VEGF抗体免疫组化染色（1:50,1:50；x200）3025＃2015A(+)area/10-50VEGFNormalNotreatmentPBSSVF图2.6定量分析海绵体组织内VEGF-A（+）区域＃P＜0.05，与Normal组、Notreatment和PBS组17 青岛大学硕士学位论文2.2SVF诱导内皮细胞增殖：海绵体内注射SVFs能显著促进海绵体组织内皮细胞增殖，增加其数量，在海绵体局部注射SVF（1×105cells/20uL）1d时，我们用抗CD31（红色）和磷酸化组蛋白H3（蓝色，表示细胞增殖的核蛋白）的抗体进行免疫荧光染色如图2.7（N=5），高倍镜下（x400）计数单位视野下PH3阳性的细胞数目进行定量分析如图2.8所示。图2.7阴茎海绵体抗CD31和PH3免疫组化染色（1:50，1:25；x200）18 结果4＃3.532.521.51No.PH3(+)0.50NormalNotreatmentPBSSVF图2.8高倍镜视野下PH3阳性的内皮细胞数目＃P＜0.05，与Normal组、Notreatment和PBS组2.3SVF融合到海绵体内皮细胞诱导分化：为了测试外源SVF是否分化为内皮细胞，我们用CD31抗体进行免疫荧光染色。在注射SVF后的3天（1×105个细胞/20mL），GFP阳性SVF整合入宿主海绵体内皮并表达CD31，表明SVF分化为内皮细胞如图2.9（比例尺=100um）。图2.9SVF移植进入阴茎海绵体组织分化（x800）19 青岛大学硕士学位论文2.4SVF增加糖尿病小鼠海绵体内皮细胞含量：5糖尿病未治疗组和PBS组的海绵体内皮细胞是显著降低的，SVFs（1×10cells/20uL）局部注射2w后海绵体内皮细胞数量明显增加，与正常对照组无显著差异，我们用表示内皮细胞存在的的抗PECAM(CD31，红色)抗体进行阴茎海绵体组织的免疫荧光染色如图2.10（比例尺=100um），图像分析仪定量分析海绵体组织内皮细胞含量如图2.11所示（N=5）。图2.10阴茎海绵体内皮细胞免疫组化染色（1:50；x200，x400）76＃54321Endotheliu0NormalNotreatmentPBSSVF图2.11海绵体组织内皮细胞含量定量分析P＜0.05，与Normal组和SVF组相比，＃P＜0.05，与Notreatment和PBS组20 结果2.5SVF增加糖尿病小鼠海绵体内eNOS磷酸化水平：糖尿病未治疗组和PBS组的小鼠海绵体内eNOS磷酸化和cGMP浓度是显著低于正常对照组的，SVF局部注射2w后，与糖尿病组和PBS组相比，海绵体内注射SVF（1×105细胞/20uL）能显著提高海绵体内eNOS磷酸化和cGMP浓度，我们用抗CD31（红色）和P-eNOS（绿色）抗体进行阴茎海绵体的免疫荧光染色如图2.12所示（比例尺=100um），图像分析仪定量分析海绵体内P-eNOS染色阳性的内皮细胞区域如图2.13所示（N=5）。图2.12阴茎海绵体抗CD31和P-eNOS免疫组化染色（1:50,1:25；x200）6)5＃4(+)area/32eNOS-1Pcavernousarea(%0NormalNotreatmentPBSSVF图2.13定量分析阴茎海绵体组织中P-eNOS（+）区域P＜0.05，与Normal组和SVF组相比，＃P＜0.05，与Notreatment和PBS组21 青岛大学硕士学位论文2.6SVF增加糖尿病小鼠海绵体内cGMP浓度：糖尿病未治疗组和PBS组的海绵体内cGMP浓度是显著降低的（P＜0.05），5SVFs（1×10cells/20uL）局部注射2w后，ELISA检测到海绵体内cGMP浓度明显增加，与糖尿病未治疗组和PBS组差异显著（P＜0.05），虽然cGMP浓度接近正常对照组小鼠，但还是存在差异（P＜0.05），定量分析海绵体组织内cGMP浓度如图2.14所示。3530＊25＃2015105CavernouscGMP0NormalNotreatmentPBSSVF图2.14SVF增加受损的海绵体内组织内cGMP浓度P＜0.05，与Normal组和SVF组相比，＃P＜0.05，与Notreatment组相比，＊P＜0.05，与Notreatment和PBS组相比22 讨论讨论脂肪组织已被认为是一种内分泌器官，参与能量调节、炎症及免疫应答的过程，[31]并且作为具有多项分化能力的多能细胞的来源之一。新鲜获取的脂肪组织通过机械剪碎、2型胶原蛋白酶消化、滤过作用及超速离心等步骤可以获得SVF，而SVF中含有的脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）以及多种促血管生长因子，在血管再生[32]领域具有广阔的前景。脂肪组织的获取方式较多，有研究显示，手术切除、肿胀吸脂及超声辅助下脂肪抽吸等方式或部位获取的脂肪组织并不影响SVF中有活力的细胞。包括人在内哺乳动物的白色脂肪组织中含有丰富的SVFs，可以在特定条件下进行成骨、成内皮等细胞的诱导分化。小鼠腹股沟区的白色脂肪组织是可塑性[33]最强的脂肪组织，可以作为提取干细胞的取材部位。本实验从eGFP雄性小鼠的附睾部位获取新鲜脂肪组织，分离得到SVF，通过显微镜下向阴茎海绵体内单次注射的方式，使受损的糖尿病小鼠的阴茎海绵体组织[30,34]得到修复，促进海绵体内皮细胞增殖，进而恢复勃起功能。在之前的研究，我们已发现：与正常对照组相比，未治疗的糖尿病小鼠和给予注射PBS治疗的糖尿病小鼠，其勃起时达到的maxICP显著降低，maxICP/MSBP比值也显著降低。SVF能分泌多种血管生长因子，包括VEGF-A、Ang-1、HGF等，能促进体内缺血状态[13-15]下新血管的形成，PECAM-1/CD31参与血管生成的生理过程，而磷酸化组蛋白H3则参与细胞生长、分裂等一系列生理活动过程的调控，通过CD31和PH3的双重标记，我们发现SVF能通过诱导分化为内皮细胞，增加海绵体组织内皮细胞的数量来恢复海绵体组织正常的生理功能。本实验中，我们遵循客观、准确、简单易行的原则采用电刺激法对实验动物勃起功能进行检测和评价，该方法因为通过换能器直接读取海绵体的压力，几乎不受外界环境和实验者主观因素的影响，因此能够更客观、公正的评价阴茎勃起功能，目前已经成为国内外评价阴茎勃起功能的标准方法。获取的阴茎海绵体组织用于分子生物学实验通过定性、定量分析糖尿病小鼠的海绵体组织内的病理生理变化，以及给予SVF治疗后血管生长相关因子的变化。我们发现糖尿病小鼠中的血管内皮细胞、PH3数量明显减少，eNOS的磷酸化水平和VEGF-A的表达水平也是明显降低的，而给予SVF治疗后，阴茎海绵体内的血管内皮细胞、PH3数量明显增加，eNOS的磷酸化水平和VEGF-A的表达水平也是明显升高的。cGMP与eNOS都在[35]阴茎勃起机制中起着关键作用，我们在本实验中发现，糖尿病小鼠海绵体内cGMP浓度显著低于正常小鼠，而给予SVF治疗后，其浓度是显著升高的，但与正常小鼠海绵体内的23 青岛大学硕士学位论文水平还是有一定差异，可能是实验操作误差，或是与SVF注射浓度和治疗次数相关，有待后续实验明确。研究报道存在于人脂肪组织（hAT）基质血管组分中的CD34（+）CD31（-）细胞群能显示祖细胞的性质，在特定的刺激下能使其表现出脂肪细胞和内皮细胞样表型。hAT衍生的毛细血管内皮细胞（CEC）可以产生并分泌基质衍生因子-1（SDF-1），诱导hAT-CD34+/CD31-细胞分化成内皮细胞，促进血管网络的形成[36]和发展。在小鼠缺血后肢中静脉内注射CD34（+）/CD31（-）细胞，发现腿脉[37]管系统中血流量和毛细血管密度的增加。有研究发现VEGF-A能够使内皮祖细[38]胞从骨髓迁徙到外周血，最后聚集在缺血部位。本实验在进行海绵体内注射SVF治疗糖尿病小鼠勃起功能的研究中，因为实验经费及科研时间等各种原因未明确SVF诱导CD34（+）CD31（-）细胞归巢阴茎的研究。因此，SVF诱导海绵体内VEGF-A表达增加，促进血管再生是否可以归因于CD34（+）CD31（-）细胞的归巢趋化性尚待后续研究。本实验中，我们使用的是新鲜分离的SVF，推广到患者身上，可以通过微创技术从患者身上直接获取并分离，并且可以不经体外培养及扩增，直接移植到患者体[39]内。我们认为，阴茎海绵体内局部注射SVFs将会是治疗糖尿病性勃起功能障碍的有效的自体治疗手段。然而，其SVFs的治疗效果并不完善，对于SVFs的预处理以及联合其他血管生长因子的方案，对严重血管疾病合并ED患者的疗效如何，还需要进一步的探讨。24 结论结论1.SVF治疗2周后显著增加海绵体内皮细胞含量。2.SVF治疗2周后显著增加P-eNOS表达水平、cGMP浓度来改善勃起功能。3.糖尿病小鼠阴茎海绵体局部注射SVF显著改善勃起功能。其作用机制可能是：SVF增加海绵体内血管生长因子的表达或融合宿主内皮细胞诱导分化增殖，使阴茎血管内皮细胞再生，恢复内源性NO-cGMP途径，改善勃起功能，为临床治疗DMED疾病提供了一定的基础支持。25 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参考文献[30]JINHR,KIMWJ,SONGJS,etal.Functionalandmorphologiccharacterizationsofthediabeticmousecorpuscavernosum:comparisonofamultiplelow-doseandasinglehigh-dosestreptozotocinprotocols[J].Thejournalofsexualmedicine,2009,6(12):3289-304.[31]CORREJ,BARREAUC,COUSINB,etal.Humansubcutaneousadiposecellssupportcompletedifferentiationbutnotself-renewalofhematopoieticprogenitors[J].Journalofcellularphysiology,2006,208(2):282-8.[32]OEDAYRAJSINGH-VARMAMJ,VANHAMSM,KNIPPENBERGM,etal.Adiposetissue-derivedmesenchymalstemcellyieldandgrowthcharacteristicsareaffectedbythetissue-harvestingprocedure[J].Cytotherapy,2006,8(2):166-77.[33]PRUNET-MARCASSUSB,COUSINB,CATOND,etal.Fromheterogeneitytoplasticityinadiposetissues:site-specificdifferences[J].Experimentalcellresearch,2006,312(6):727-36.[34]ZHANGLW,PIAOS,CHOIMJ,etal.Roleofincreasedpenileexpressionoftransforminggrowthfactor-beta1andactivationoftheSmadsignalingpathwayinerectiledysfunctioninstreptozotocin-induceddiabeticrats[J].Thejournalofsexualmedicine,2008,5(10):2318-29.[35]ALBERSENM,MWAMUKONDAKB,SHINDELAW,etal.Evaluationandtreatmentoferectiledysfunction[J].TheMedicalclinicsofNorthAmerica,2011,95(1):201-12.[36]SENGENESC,MIRANVILLEA,MAUMUSM,etal.ChemotaxisanddifferentiationofhumanadiposetissueCD34+/CD31-progenitorcells:roleofstromalderivedfactor-1releasedbyadiposetissuecapillaryendothelialcells[J].Stemcells(Dayton,Ohio),2007,25(9):2269-76.[37]MIRANVILLEA,HEESCHENC,SENGENESC,etal.Improvementofpostnatalneovascularizationbyhumanadiposetissue-derivedstemcells[J].Circulation,2004,110(3):349-55.[38]SHINTANIS,KUSANOK,IIM,etal.SynergisticeffectofcombinedintramyocardialCD34+cellsandVEGF2genetherapyafterMI[J].NatureclinicalpracticeCardiovascularmedicine,2006,3Suppl1(S123-8.[39]AMOSPJ,SHANGH,BAILEYAM,etal.IFATScollection:Theroleofhumanadipose-derivedstromalcellsininflammatorymicrovascularremodelingandevidenceofaperivascularphenotype[J].Stemcells(Dayton,Ohio),2008,26(10):2682-90.28 综述综述糖尿病性勃起功能障碍中血管因素发病机制的研究勃起功能障碍（ED）是指阴茎生理条件下的勃起水平不足以支持获得满意的[40]性生活。ED是一种高发病率的男性糖尿病并发症，75%的糖尿病患者在疾病进展过程中并发勃起功能不同程度的障碍，其发病呈年轻化趋势，并随着年龄增长和[2]病程进展而加重。5型磷酸二酯酶（PDE5)抑制剂是临床上治疗勃起功能障碍经[3]常使用的药物，但其治疗勃起功能障碍的有效率与是否合并糖尿病存在显著差异。[41]事实上，ED是血管内皮功能障碍和血管疾病的表现，而严重的血管内皮功能障[5]碍是影响PDE5抑制剂疗效的最重要因素。因此，血管内皮功能障碍的研究已成为目前的一个热点，本文就血管相关因素在勃起功能障碍中的研究进展做一简要综述。一、阴茎勃起机制正常的阴茎勃起是一种神经血管事件，此过程与感官刺激、心理和激素等诸多因素相关。机体接受相关刺激后，海绵体内的神经末梢和内皮细胞会调控神经递质NO的释放，使于阴茎动脉血管和海绵体平滑肌舒张，动脉血流量增加，静脉血流量减少，阴茎海绵体血液灌注总量增加，此时阴茎胀大勃起。阴茎海绵体内压力（ICP）在勃起时迅速升高，动静脉内血流量达到动态平衡，此时阴茎呈现持续勃[42]起状态。二、糖尿病性勃起功能障碍（DED）[43]阴茎勃起涉及到很多种因素，有报道称DED的患病率与年龄成正相关，但[40]ED不是衰老的必然结果，其它与年龄相关的因素也介导了ED的发生。肖旺清[44]等研究发现，老年男性身体机能下降，抵抗疾病能力减弱，是慢性疾病的高发人群，其性腺功能呈减退趋势，内分泌水平相对紊乱，老年糖尿病患者更易勃起功能障碍。三、血管组织病变随着糖尿病病程进展，机体血管不可避免的会发生损伤，其中阴茎海绵体作为一种由平滑肌和胶原基质构成的特殊血管系统，它的持续损伤会引起勃起功能的改变。糖尿病患者体内糖脂代谢异常，使血液粘稠度相对增高，血管内皮细胞的病理改变，会导致血管管腔狭窄，易形成血栓，一旦发生血栓形成会进一步加重狭窄形成恶性循环，此病理过程发生在阴茎血管时，会降低勃起时海绵体的有效灌注量，29 青岛大学硕士学位论文[45]引起勃起功能异常。Simopoulos等通过动物对照实验，发现糖尿病兔的海绵体动脉管腔明显狭窄，勃起时动脉血液灌注显著减少，影响勃起功能。而阴茎组织缺血会使血管内皮及海绵体平滑肌正常细胞数量减少，凋亡细胞增加，诱发海绵体组织[46]纤维化等病理改变，使平滑肌舒缩功能发生异常，最终导致ED。[46]影响糖尿病血管组织发生功能异常的因素有很多：一是血管舒缩相关因子，包括NO、前列腺素（PGI2）/血栓素（TXA2）、内皮素（ET）、血管紧张素（Ang）等；二是血管生成、重构相关因子，包括血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子（TGF）等。（一）血管舒缩因子1.NO系统NO是一种很重要的血管舒张因子，它由一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸[35]生成，经L-精氨酸-环磷鸟苷酸通路（L-Arg-NO-cGMP通路）发挥舒张作用。NO能激活鸟苷酸环化酶,增加cGMP生成量，通过cGMP依赖性蛋白激酶调控2+2+Ca通道,使大量细胞内Ca外移,引起血管平滑肌松弛,诱发阴茎海绵体勃起。NOS主要分布在海绵体神经、血管内皮细胞及平滑肌组织，包含3种同工酶：内皮源性[47]（eNOS）、神经源性（nNOS）和诱导性（iNOS）。Burnett等认为，nNOS引[48]发勃起反应，然后eNOS维持和增加勃起。Akingba等发现，内皮源性和神经源[49]性一氧化氮合酶在糖尿病大鼠的表达水平降低与ED的进展相关。Tuncayengin等发现糖尿病患者阴茎组织中NOS的活性也是下降的。由于NO合成时存在NOS与精氨酸酶共同竞争相同的底物的现象，因此限制其中精氨酸酶的活性可以为合成NO提供更多的底物，增加NO产量，增加血管松弛，增强阴茎循环中的血流量，[42]为治疗勃起功能障碍提供新方法。NO系统功能还受PDE5、高级糖基化终产物（AGEs）等成分的影响。PDE5在体内控制cGMP的降解，调控NO水平，进一步控制阴茎勃起，DM患者体内[50]PDE5生成增多，cGMP活性降低，通过阻断L-精氨酸-cGMP通路抑制血管舒张；AGEs能提高血管收缩因子(如ET-1)的表达水平拮抗NO的舒张作用，同时生成大[51]量的氧自由基,使NO发生过氧化反应而失活。2.PGI2/TXA2系统PGI2是一种舒张血管能力很强的前列腺素,在维持各种组织血流灌注中起重要作用，而TXA2是一种收缩血管作用很强的血管素。两者生理学作用相互拮抗，共[52]同参与阴茎海绵体平滑肌舒张与收缩，从而调节阴茎的勃起过程。糖尿病患者血30 综述管开始发生病理改变时,会引起PGI2和TXA2合成异常，打破海绵体平滑肌舒缩的[53]平衡。研究报道，糖尿病患者血管内皮细胞功能障碍，合成分泌PGI2减少，TXA2增加，继发一系列血管病变，进一步加重糖尿病并发症的进展。3.ET系统[54]有证据表明，内皮素（ET）系统发生异常变化可能会引起阴茎血管过度收缩，促使糖尿病患者发生勃起功能障碍。内皮素有三种构体和两种受体。ET-1是2+来源于血管内皮细胞分泌的一种收缩因子，它能激活海绵体平滑肌上的Ca跨膜通2+道和ET受体，进一步激活三磷酸肌醇，通过增加Ca内流，增加平滑肌细胞内2+[55]Ca浓度，引起平滑肌收缩。ET-1还能刺激海绵体组织内ROS的产生，抑制[56][57]NO介导的阴茎动脉的舒张。ET-1已被证明在糖尿病患者血浆中会升高。ETA主要存在于海绵体平滑肌上,可以促进平滑肌细胞增殖并介导平滑肌的收缩效应。[58,59]ETB受体在血管内皮细胞介导NO和PGI2来调控舒张作用。在糖尿病胰岛素抵抗状态下，ETA表达上调加强平滑肌收缩效应，而ETB表达下调，血管舒张效[60]应减弱，阴茎勃起功能出现障碍,这提示ET系统在DED的发病过程中起着重要的作用。4.RhoA/Rho激酶（ROK）信号系统RhoA／ROK通路是ET及其受体的重要转导途径，包括3个关键分子：RhoA、[61]ROK和肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)。该通道的激活会抑制eNOS活性，减少[62]NO的生成，使平滑肌内cGMP生成减少，勃起功能出现障碍。RhoA属于GTP酶家族,除了可以调节平滑肌张力外,还参与纤维组织形成和细胞迁移等过程。一般情况下,RhoA与GDP结合成非激活状态的复合物,当去甲肾上腺素(NA)和E[63]T与相应受体结合后，可以促进其转化为激活态的RhoA-GTP复合物。RhoA-GTP被激活后，通过抑制MLCP活性，使肌球蛋白轻链(MLCs)保持磷酸化,从而启动钙敏机制协助增加平滑肌的收缩即在相同Ca2+浓度下增加平滑肌的收缩强度[64][65]。而高血糖状态会诱导RhoA活化，Massey等发现在STZ诱导的糖尿病大鼠[66]中该通路表达水平升高。Chang等发现四氧嘧啶诱导的糖尿病兔模型中，其阴茎海绵体平滑肌的ET-1介导的收缩反应敏感性是正常兔的2～3倍，这是因为糖尿病兔阴茎海绵体中ROK的高表达，而给予ROK抑制剂后，收缩反应几乎完全阻断。[67]Bivalacqua等研究表明,RhoA／ROK可以抑制eNOS的表达,抑制RhoA／ROK可以减少海绵体内皮功能的损害。这提示RhoA／ROK通路可能是DED发病机制的关键组成部分。31 青岛大学硕士学位论文5.肾素-血管紧张素系统（RAS）[68]RAS是一种内环境稳态调节器。生理条件下，血管紧张素原是血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）的前体，主要存在于肝脏中，经肾素催化水解成十肽分子结构，AngⅠ在肺部的血管紧张素转化酶（ACE）作用下生成血管紧张素Ⅱ（AngⅡ），结合相应的[69]受体AT1和AT2发挥其生物学作用。AT1受体参与AngⅡ介导的血管收缩反应[70][68]。AT2受体参与NO介导的血管舒张作用拮抗AT1受体的收缩作用。除了起内分泌作用，RAS还在海绵体组织中表达，通过旁分泌的方式调节阴茎海绵体平[71][72]滑肌收缩。Kifor等阴茎海绵体内注射AngⅡ能引起阴茎海绵体平滑肌收缩并终止实验动物的勃起状态，而给予AngⅡ受体拮抗剂能引起阴茎海绵体平滑肌舒张，[73]诱发勃起。Lim等研究发现糖尿患者血浆中AngII水平明显高于正常对照组,且与糖化血红蛋白水平呈正比。因此，RAS在DED发病中起着重要的作用。(二)、生长因子除了上述的血管舒缩因子之外，生长因子对勃起功能也有很重要的影响。1.血管内皮生长因子（VEGF）[74]VEGF主要起促进血管生成生长作用。它来源于血管平滑肌、内皮细胞等，[75][76]能增加NO产生，改善内皮功能。Jesmin等发现DED大鼠体内VEGF及其受体的表达显著降低，且伴有nNOS、eNOS、抗凋亡标记物的减少和凋亡前标记物的增加，因此认为VEGF信号转导系统的异常可能是导致DED的病理生理基础。缺血缺氧信号反馈到内皮细胞会刺激分泌血管内皮生长因子，促进内皮细胞生长和[77][78]血管生成。动物实验表明VEGF能显著改善慢性缺血性疾病的血流情况。[79]Yamanaka等向糖尿病大鼠的海绵体内注射VEGF,发现VEGF给药组细胞凋亡指数显著降低,勃起功能显著恢复，这说明VEGF可能通过抑制阴茎海绵体细胞的凋亡来恢复勃起功能。2.转化生长因子（TGF）TGF-β1是一种细胞因子，它可以激活成纤维细胞，导致组织纤维化。当正常组织遭受意外轻微伤害时，机体会出现暂时的TGF-β1升高，恢复愈合，但TGF-[80]β1持续升高会引起细胞外基质沉积和组织纤维化。体外实验表明，TGF-β1可以增加阴茎海绵体平滑肌细胞胶原合成，诱导结缔组织生长因子，抑制血管平滑肌细[81]胞，而弹性纤维或胶原类型的改变会引起海绵体组织重构，降低阴茎的弹性和顺[82]应性，最终导致阴茎海绵体纤维化，这可能是低氧诱导TGF-β1的过表达。在缺血条件下，TGF-β1诱导自身合成mRNA，后者又引起TGF-β1合成增加，加重组[80][83]织纤维化程度。Ryu等发现血管性ED患者的TGF-β1及受体表达明显增加，这可能与胶原纤维的数量增加和海绵体纤维化相关，提示血管危险因素易激活32 综述[84]TGF-β1信号通路，诱发ED。Ahn等研究发现，STZ诱导建立的糖尿病大鼠模型中，海绵体组织的TGF-β1表达水平明显高于正常,而使用PDE5抑制剂后TGF-β1水平下降,提示海绵体纤维化改善。四.总结糖尿病引起的勃起异常越来越常见，在多种致病因素中，血管损伤引起的勃起功能障碍一直是人们关注的焦点，本文就血管舒缩活性因子及相关生长因子方面在疾病的发生、发展过程中的机制所做的探讨，对后续深入探讨DED的治疗有很大的帮助。33 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附录：缩略语附录：缩略语英文缩写英文全称中文全称ACEAngiotensinconvertingenzyme血管紧张素转化酶ADSCsAdiposederivedstemcells脂肪源性干细胞ADPAdenosinediphosphate二磷酸腺苷AGEsAdvancedglycationendproducts晚期糖基化终产物Ang-1Angiopoietin-1促血管生成素-1ASCsAdultStemCells成体干细胞ATPAdenosinetriphosphate三磷酸腺苷CCCorpuscavernosum阴茎海绵体cGMPCyclicguanosinemonophosphate环磷酸鸟苷DDay天DEDDiabeticerectiledysfunction糖尿病性勃起功能障碍DMDiabetesMellitus糖尿病DMEMDulbecco'sModifiedEagle'smedium改良杜氏伊格尔培养基EDErectileDysfunction勃起功能障碍eGFPEnhancedGreenFluorescentProteinmice增强型绿色荧光蛋白小鼠eNOSEndothelialnitricoxidesynthase内皮源性一氧化氮合酶ESCsEmbryonicStemCells胚胎干细胞ETEndothelin内皮素FBSFetalbovineserum胎牛血清HFGHepatocytegrowthfactor肝细胞生长因子ICPIntracavernousPressure海绵体内压iNOSInduciblenitricoxidesynthase诱导性一氧化氮合酶41 青岛大学硕士学位论文MLCPMyosinlightchainphosphatase肌球蛋白轻链磷酸酶MLCsMyosinlightchainphosphatase肌球蛋白轻链MSBPMeanSystolicBloodPressure平均系统血压NA/ENorepinephrine去甲肾上腺素NCNormalControl正常对照nNOSNeurogenicnitricoxidesynthase神经源性一氧化氮合酶NONitricoxide一氧化氮NOSNitricoxidesynthase一氧化氮合酶OCTopti-mumcuttingtemperature冰冻切片包埋剂PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PDE5Phosphodiesterasetype55型磷酸二酯酶PECAM-1/CD31Plateletendothelialcelladhesionmolecule-1血小板-内皮细胞粘附分子P-eNOSPhosphorylatedendothelialnitricoxidesynthase磷酸化内皮源性一氧化氮合酶PGI2Prostaglandin前列腺素PH3PhosphohistoneH3磷酸化组蛋白H3RASReninangiotensinsystem肾素-血管紧张素系统STZStreptozocin链脲佐菌素SVFStromalVascularFraction基质血管成分TGFβTransforminggrowthfactorβ转化生长因子TXA2ThromboxaneA2血栓素TypeIICollagenaseTypeIICollagenaseⅡ型胶原蛋白酶VEGFVascularendothelialgrowthfactor血管内皮性生长因子WWeek周42 致谢致谢首先，衷心的感谢我的导师高振利教授、石磊教授！感谢两位老师为我提供的宝贵的科研机会，为我创造的良好科研环境。老师认真负责的治学态度、严谨的逻辑思维能力、丰富的临床操作经验、崇高的人格魅力，深深的影响着我，使我终身受益，再次感谢两位老师在我读研期间的指导！衷心感谢青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院泌尿外科全体同仁，在我的临床工作和学习期间对我无私的指导、支持和帮助。在这个团结、进取、充满朝气的优秀团队中，我学会了很多，能与你们共事，我感到非常的荣幸！衷心感谢青岛大学医学院研究生处和毓璜顶医院教育处各位老师对我学业的无私帮助！衷心感谢我的家人和所有支持我和帮助我的朋友们！衷心的感谢出席论文答辩的全体老师和成员！43 学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属说明44
