《油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
：密级分类号：１０５３８学校代号：学号：２２０１２００１９８灰綦４蟖祗么Ｉ十ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｏｆＦｏｒｅｓｔｒ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｙｙｇｙ硕士学术学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究作者姓名：左杰导师姓名：周国英培养学院：林学院学科名称：森林保护学研究方向：森林微生物提交日期：２０１５年５月 ＳｔｕｄｙｏｎＳｙｎｅｒｇｉｓｍｏｆＢｉｏｃｏｎｔｒｏｌＡｅｎｔｓｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＣｈｅｍｉｃａｌｇＦｕｎｃｅｓｏｎａ－ｇｉｉｄＭｉｎＯｉｌｔｅａＣａｍｅｌｌｉａＤｉｓｅａｓｅｓｂｙＺＵＯＪｉｅＡｔｈｅｓｅｓｕｂｍｉｔｔｅｄｉｎｐａｒｔｉａｌｓａｔｉｓｆａｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒｔｈｅｄｅｇｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒＰｒｏｆｅｓｓｏｒＺＨＯＵＧｕｏｉｎｙｇＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｙｇｙ４９８ＳｈａｏｓｈａｎＳｏｕｔｈＲｏａｄ，ＴｉａｎｘｉｎＤｉｓｔｒｉｃｔＣｈａｎｓｈａＨｕｎａｎ１．Ｒｇ４０００４，Ｐ．ＣＨＩＮＡＭａｙ２０１５， 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研宄所取得的研宄成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品，也不包含为获得中南林业科技大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。对本文的研宂作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：方：杰、年上月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件或电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权中南林业科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于：１、保密口，在年解密后适用本授权书。〇不保邀ｎ“”（请以上相应方框打Ｖ）：作者签名导师签名：丨另念友齐、闲年：月％曰＃年上月鉍曰 摘要油茶Ｃ＂ａ／ｗ滿ａｏ／ｅ｜／ｅｒａＡｂｅｌ是我国南方的主要经济林木，油茶炭疽病和软腐病是油茶产区发生严重的病害。在防治过程中，化学防治对环境和食品安全的危害性、生物防治的防效慢、农业防治的局限性等问题日益凸显，阻碍了油茶产业的健康发展。菌株Ｒ６是在健康的油茶果中分离筛选的对油茶炭疽病和软腐病等多种病害具有较好拮抗作用的枯草芽孢杆菌，本论文主要研究化学杀菌剂与菌株Ｒ６可湿性粉剂对油茶炭疽病和软腐病的协同作用，主要研宄内容为筛选对拮抗细菌Ｒ６无抑制作用的化学杀菌剂，拮抗细菌Ｒ６发酵工艺优化，油茶内生拮抗细菌Ｒ６可湿性粉剂的研制和菌株Ｒ６可湿性粉剂与甲基硫菌灵的协同增效作用研宄。主要研宄结果如下：（１）筛选对拮抗细菌Ｒ６无抑制作用的化学杀菌剂。通过测定杀菌剂对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑制作用及其对菌株Ｒ６菌体和芽孢的影响，筛选出了甲基硫菌．灵，其对炭疽病菌和软腐病菌具有较好的抑制作用，ＥＣ５Ｑ分别为２．４２５ｍｇ／Ｌ和０９１４ｍｇ／Ｌ。在供试浓度下，甲基硫菌灵的不同质量浓度对菌株Ｒ６菌体和芽孢的存活数无显著性差异。不同质量浓度的甲基硫菌灵与菌株Ｒ６发酵液混配使用对炭疽病菌的抑？？制率提高了９．９９％３６．２６％％。，对软腐病菌的抑制率提高了６．６７％１３．１９（２）桔抗细菌Ｒ６的发酵工艺优化。首先进行了菌株Ｒ６发酵培养基的优化，以菌体浓度和抑菌率作为指标进行的单因素筛选试验确定了葡萄糖为最佳碳源，酵母膏为最佳氮源，硫酸镁为最佳无机盐。在此基础上进行了响应面分析，得到的最佳的发酵培养基为葡萄糖５．０２ｇ／Ｌ、酵母膏１５．１０ｇ／Ｌ、硫酸镁６．８２ｇ／Ｌ。此时，发酵液的菌体浓度、对炭疽病菌和软腐病菌的抑制率较优化前分别提高了１９．２０％、１３．６５％和１２．３１％。在优化好的发酵培养基的基础上进行了发酵培养条件的优化ａｃｋｅｔ－Ｂｕｒｍａｎ，Ｐｌ试验设计筛选出对菌体浓度影响较大的３个重要因素即初始ｐＨ、摇床转速和培养温度，经过响应面分析得到的菌株Ｒ６最佳的发酵条件为初始ｐＨ８．１０、培养温度３０．３０°Ｃ、摇床转速１７１．５０ｒ／ｍｉｎ、接种量５％、培养时间２４ｈ。在此条件下，发酵液的菌体浓度、对炭疽病菌和软腐病菌的抑制率较优化前分别提高了９．５６％、１２．２４％和１０．５０％。／结合生产实际的需要，最终得到的发酵工艺为：葡萄糖５．０２ｇ／Ｌ、酵母膏１５．１０ｇＬ、°％硫酸镁６．８２ｇ／Ｌ、初始ｐＨ８．１０、培养温度３０．３０Ｃ、摇床转速１７１．００ｒ／ｒａｉｎ、接种量５、培养时间２４ｈ。Ｉ （３）油茶内生拮抗细菌Ｒ６可湿性粉剂的研制。综合考虑菌株Ｒ６本身的性质和。各剂型的特点，将菌株Ｒ６的发酵液研制成了可湿性粉剂以菌株的生物相容性、润湿性和分散性作为指标，对可湿性粉剂中的载体和助剂进行了筛选。最终得到的菌株Ｒ６可湿性粉剂的最佳配方为原药７０％，木质素磺酸钠７％、十二烷基苯磺酸钠３％、°羧甲基纤维素钠２％、抗坏血酸０．１％、高岭土补足至１００％。菌剂在室温２５Ｃ贮存１２０ｄ后对两种病原菌的抑菌率也均在６５％以上。（４）油茶内生拮抗细菌Ｒ６可湿性粉剂与甲基硫菌灵协同作用研宄。在９个复配杀菌剂中，复配杀菌剂Ｆ８即Ｒ６菌剂与７０％甲基硫菌灵的质量比为７：１时，对油茶炭疽病菌的抑制作用为増效作用，ＳＲ值为２．０５５。复配杀菌剂Ｆ９即Ｒ６菌剂与７０％：１时甲基硫菌灵的质量比为９，对油茶软腐病菌的抑制作用为增效作用，ＳＲ值为１。５００．５６７盆栽试验和林间试验表明，复配杀菌剂Ｆ８和Ｆ９的倍液对油茶炭疽病和软腐病的防效均在６７％以上，防治效果均优于对照组百菌清。关键词：油茶病害；内生拮抗细菌；生防菌剂；化学杀菌剂；协同作用ＩＩ ＡＢＳＴＲＡＣＴＣａｍｅｌｌｉａｏｌｅｉｆｅｒａＡｂｅｌｉｓｍａｉｎｔｒｅｅｏｆｅｃｏｎｏｍｉｃｉｎｓｏｕｔｈｏｆＣｈｉｎａ．Ｃａｍｅｌｌｉａｏｌｅｉｆｅｒａ？ａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅａｎｄ撕ｅａｍｅＷａａｒｅｍａｏｒｄｉｓｅａｓｅｓｉｎｔｈｅｍａｏｒｒｏｄｕｃｉｎａｒｅａｓ．ｊｊｐｇＩｎｔｈｅｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＣａｍｅｌｌｉａｏｌｅｉｆｅｒａａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅａｎｄＡａｒｉｃｏｄｏｃｈｉｕｍｐｇｃａｍｅｌｌｉａｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｔｒｏｌｗｉｔｈｆｏｏｄａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓａｆｅｔｔｈｅｏｎｓｅｔｏｆｂｉｏｌｏｉｃａｌ，ｙ，ｇｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓｓｌｏｗａｎｄｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｃｏｎｔｒｏｌｈａｖｅｂｅｃｏｍｅｐｒｏｂｌｅｍｓ，ｗｈｉｃｈｈａｎｄｉｃａｐｓｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅＣａｍｅｌｌｉａｏｌｅｉｆｅｒａＡｂｅｌｉｎｄｕｓｔｒｙ．ＳｔｒａｉｎＲ６ｗａｓｂａｃｉｌｌｕｓｗｈ－ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｃｈｗａｓｏｂｔｉｏｎｅｄｆｒｏｍｏｉｌｔｅａｆｒｕｉｔｓｔｈｒｏｕｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｓｓｅｓｓ，ｇｈ，ｐｂｅｔｅｒｃｏｎｔｒｏｌｅｆｅｃｔｔｏＣａｍｅｌｌｉａｏｌｅｉｆｅｒａａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅａｎｄＡｇａｒｉｃｏｄｏｃｈｉｕｍｃａｍｅｌｌｉａ．ＴｈｉｓｐａｐｅｒｍａｉｎｌｓｔｕｄｉｅｓｔｈｅｓｎｅｒｂｅｔｗｅｅｎｃｈｅｍｉｃａｌｆｕｎｉｃｉｄｅｓａｎｄＲ６ｗｅｔｔａｂｌｅｏｗｅｒｄｆｏｒｙｙｇｙｇｐＣａｍｅｌｌｉａｏｌｅｉｆｅｒａａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅａｎｄＡｇａｒｉｃｏｄｏｃｈｉｕｍｃａｍｅｌｌｉａ．ＴｈｅｍａｊｏｒｒｅｓｅａｒｃｈｃｏｎｔａｉｎｓｓｃｒｅｅｎｉｎｏｆｃｈｅｍｉｃａｌｆｕｎｃｉｄｅｓｗｈｉｃｈｈａｖｅｎｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｎａｎｔａｏｎｉｓｔｉｃｂａｃｅｒｉｕｍＲ６ｇｇｉｇｔ，ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｂａｃｔｅｒｉｕｍＲ６ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｒｏｃｅｓｓａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｐ，ｐｏｆｔｈｅａｎｔａｏｎｉｓｔｉｃｂａｃｔｅｒｉｕｍＲ６ｗｅｔｔａｂｌｅｏｗｄｅｒａｎｄｔｈｅｓｎｅｒｂｅｔｗｅｅｎｃｈｅｍｉｃａｌｇｐｙｇｙｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓａｎｄＲ６ｗｅｔｔａｂｌｅｏｗｅｒｄｆｏｒＣａｍｅｌｌｉａｏｌｅｉｅｒａａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅＡａｒｉｃｏｄｏｃｈｉｕｍｐｆｇｃａｍｅｌｌｉａＴｈＱｍａｉｎｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｅｄ：１Ｓｃｒｅｅｎｉｎｏｆｃｈｅｍｉｃａｌｆｕｎｉｃｉｄｅｓｗｈｉｃｈｈａｖｅｎｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｎａｎｔａｏｎｉｓｔｉｃ（）ｇｇｇｂａｃｅｒｉｕｍｅｓｃｒｅｅｎｅｄｏｕｈｉｏｈａｎａ－ｌｔＲ６．ＷｔｔｐｔｅｍｅｔｈｙｂｙｔｅｓｔｉｎｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｔｏａｔｈｏｅｎｉｃｇｐｇｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｔｈｅｅｆｅｃｔｔｏｂａｃｔｅｒｉａｓａｎｄｓｐｏｒｅｓｏｆｓｔｒａｉｎＲ６．ＩｔｈａｖｅａｓｔｒｏｎｇｃｏｎｔｒｏｌｅｆｅｃｔＣａｍｅｌｌｉａｏｌｅｉｆｅｒａａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅａｎｄＡｇａｒｉｃｏｄｏｃｈｉｕｍｃａｍｅｌｌｉａ＾ｔｈｅＥＣ５０ｗｅｒｅ２．４２５ｍｇ／Ｌ，０．９１４ｍ／Ｌｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｓｅｌｅｃｔｅｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｒｉｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｂａｃｔｅｒｉａｓａｎｄｇｙｊｓｏｒｅｓｔｏｄｆｅｒｅｎｔｍａｓｓｃｏｎｃｅｎｉｏｎｓｏｆｈｉｏｈａｎａｅ－ｍｅｌｓｈｓｎｉｆｉｃａｎｐｉｔｒａｔｔｐｔｔｈｙｏｗｅｄｎｏｉｇｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ．ＴｈｅａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｒａｔｅｏｆＣａｍｅｌｌｉａｏｌｅｉｆｅｒａａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅａｎｄＡｇａｒｉｃｏｄｏｃｈｉｕｍ？？ｉｎｃｒｅａｓｅｄｂ９＿９９％３６．２６％６．６７％１３．１９％ｒｅｓｅｃｉｅｌｗｈｅｎｗｅｍｉｘｅｄｙ，ｐｔｖｙ，ｄ－ｍｅｔｈｉｆｅｒｅｎｔｍａｓｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｉｏｐｈａｎａｔｅｌａｎｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｏｆｓｔｒａｉｎＲ６．ｙ２ＯｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｔａｏｎｉｓｔｉｃｂａｃｔｅｒｉｕｍＲ６ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｒｏｃｅｓｓａｎｔａｏｎｉｓｔｉｃ．Ｗｅ（）ｐｇｐｇｏｐｔｉｍｉｚａｔｅｄａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃｂａｃｔｅｒｉｕｍＲ６ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍａｔｆｉｒｓｔｗｉｔｈｃｅｌｌ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｒａｔｅａｓｍａｉｎｍｅａｓｕｒｅｓ，ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｉｓｇｌｕｃｏｓｅ，ｔｈｅｏｔｉｍａｌｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｉｓｙｅａｓｔｔｈｅｏｔｉｍａｌｍｉｎｅｒａｌｓａｌｔｉｓｍａｎｅｓｉｕｍｓｕｌｆａｔｅｂｙｐ，ｐｇｓ－ｔｔｔｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｔｈｅｎｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｂｙｈｉ 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’ａｎｄｊｇａｒｋｏｃｆｏｃ／ｎｍｗｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｅｆｅｃｔｏｆｃｈｉｏｒｏｔｈａｌｏｎｉｌ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣａｍｅｌｌｉａｄｉｓｅａｓｅｓＡｎｔａｏｎｉｓｔｉｃｂａｃｔｅｒｉｕｍＢｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｅｎｔｓＣｈｅｍｉｃａｌ；ｇ；ｇ；ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ；Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃｅｆｆｅｃｔｖ 目录ｍ＾ｉＡＢＳＴＲＡＣＴＩｌｌ１雜１１．１油茶及茶油简介１．２油茶主要病１害的种类及其防治现状１１．２．１油茶炭疽病１１．２．２油茶软腐病３１．３植物病害的生物防治研宄４１．３１４．植物病害生防细菌的研究１．３．２植物病害生防放线菌的研宄６１．３．３植物病害生防真菌的研究６１．４生防菌与杀菌剂混配防治植物病害研究８１．４．１杀菌剂混配的增效系数评价方法８１．４．２生防真菌与化学杀菌剂复配防治植物病害１０１．４．３生防细菌与化学杀菌剂复配防治植物病害１０１．５油茶内生拮抗细菌Ｒ６研究现状１１．６、１本论文的课题来源目的意义及主要内容１１１．６．１课题来源１１１．６．２目的意义１１１．６．３主要研宄内容１２１．６４技术路线１３．２筛选对拮抗细菌Ｒ６无抑制作用的化学杀菌剂１４２１．实验材料１４２．１．１供试菌株１４２．１．２指示菌株１４２．１．３供试杀菌剂１４２．１．４培养基配方１５２．２实验方法１５２．２．１化学杀菌剂对油茶炭疽病菌和软腐病菌室内毒力的测定１５２．２．２化学杀菌剂对拮抗细菌Ｒ６菌体的影响１６ｉ ２．２．３化学杀菌剂对拮抗细菌Ｒ６芽孢的影响．１６２．２．４化学杀菌剂与拮抗细菌Ｒ６混配抑菌试验１７２．２．５数据分析１７２．３结果与分析１７２１．３．１化学杀菌剂对油茶炭疽病菌和软腐病菌室内毒力的测定７２．３．２化学杀菌剂对措抗细菌Ｒ６菌体的影响１８２．３．３化学杀菌剂对拮抗细菌Ｒ６芽孢的影响１９２．３．４化学Ｒ６杀菌剂与拮抗细菌混配抑菌试验２０２．４小结与讨论２１３油茶主要病害拮抗细菌Ｒ６的发酵工艺优化２３３．１实验材料２３３．１．１指示菌株２３３．１．２供试菌株２３３１．．３仪器设备２３３２．实验方法２３３．２．１菌株Ｒ６种子液的制备２３３．２．２菌株Ｒ６发酵液菌体浓度的测定２４３．２．３菌株Ｒ６发酵液抑菌活性的测定２４３．２．４菌株Ｒ６发酵培养基的优化２４３．２５．菌株Ｒ６发酵培养条件的优化２５３．３结果与分析２７３．３．１菌株Ｒ６发酵培养基的优化２７３．．３２菌株Ｒ６发酵培养条件的优化３３３．４小结与讨论４０４油茶内生拮抗细菌Ｒ６可湿性粉剂的研制４２４．１实验綱４２４．１．１供试原药４２４．１．２供试试剂４２４．２实验方法４２４．２．１可湿性粉剂的加工工艺４２４．２．２初始可湿性粉剂的成分配比４２．４２．３载体的筛选４３４．２．４助剂的筛选及最佳配比的确定４３ ４．２．５稳定剂的筛选４３４．２．６紫外保护剂的筛选４３４．２．７Ｒ６可湿性粉剂稳定性的测定４４４４４．２．８Ｒ６可湿性粉剂质量指标的测定４４４．３结果与分析４．３‘１载体的筛选４４４．３．２助剂的筛选及最佳配比的确定４４．４３．３稳定剂的筛选４６４．３．４紫外保护剂的筛选４６４．４．３５Ｒ６可湿性粉剂稳定性的测定６４．３．６Ｒ６可湿性粉剂质量指标的测定４７４．４小结与讨论４７５油茶内生拮抗细菌Ｒ６可湿性粉剂与甲基硫菌灵的协同作用研究．．．．．．．４９５１．实验材料４９５．１．１供试杀菌剂４９．５１．２供试油茶苗４９５．１．３试验地概况４９５２实验方法４９．５．２．１Ｒ６可湿性粉剂对油茶炭疽病菌和软腐病菌室内毒力测定４９５２．２．Ｒ６可湿性粉剂与甲基硫菌灵最佳复配比的测定５０５．２．３复配杀菌剂对油茶炭疽病和软腐病盆栽防治效果５０５．２．４复配杀菌剂对油茶炭疽病和软腐病林间防治效果５１５５２．３结果与分析５３Ｒ６可湿性粉５２．．１剂对油茶炭疸病菌和软腐病菌室内毒力测定５．３．２Ｒ６可湿性粉剂与甲基硫菌灵最佳复配比的测定５２５５３．３．３复配杀菌剂对油茶炭疽病和软腐病盆栽防治效果５．３．４复配杀菌剂对油茶炭疽病和软腐病林间防治效果５４５．４小结与讨论５５６结论．４９６．１筛选对拮抗细菌Ｒ６无抑制作用的化学杀菌剂５７６．２油茶主要病害拮抗细菌Ｒ６的发酵工艺优化５７６．３油茶内生拮抗细菌Ｒ６可湿性粉剂的研制５８６．４油茶内生拮抗细菌Ｒ６可湿性粉剂与甲基硫菌灵协同作用研宂５８ｉｉｉ ７Ｍｉｌ５９参考文献６１附图６９攻读硕士学位期间主要学术成果７２１ｆｔ７３ｉｖ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究１绪论１．１油茶及茶油简介油茶（ＱｗｗｅＷａＡｂｅｌ）隶属于山茶科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）中的山茶属（Ｃａｗｅ／／ｆａＬ．），为常绿的小乔木或灌木，是我国南方的主要经济林木，也是世界重要的木１［］。距今已有两千三百多年的历史。本油料树种在我国，油茶被人们栽培利用油茶茶籽及其副产品的经济价值极髙，，在国内外的市场中竞争潜力巨大发２［］展前景十分广阔。茶油是从油茶成熟的种子中提取的油脂，油脂中脂肪酸的组“”３［］成和橄榄油十分相似，营养价值很高，素有东方橄榄油之称。研宄发现茶油中除了含有不饱和脂肪酸外一，还含有些具有生物活性的微量物质，这些物质。如角鲨烯具有增强胃和肠道的吸收功能可以预防人体的多种疾病，同时还可提高人体的免疫力。多酚类物质具有防治因高血脂而引发的其他疾病。茶油中的黄酮类物质主要包括茶皂素和山茶苷，茶皂素具有抗癌、杀虫驱虫等作用，现已被用于临床预防和治疗由细菌或真菌感染引发的皮肤病。山茶苷因其可增加心肌细胞存活率、降低细胞中乳酸脱氢酶的活性，可作为治疗冠心病和心肌梗等药物的原料－。茶籽多糖具有抗感染、降血压、抗凝血和防治肿瘤等作用。Ｐ胡萝卜素、维生素Ｅ、三萜皂苷、磷脂质、植物留醇、维生素Ｄ、维生素Ｋ等其他微量物质５＋］也影响和调节着人体的多种生理活动。目前５０００，集、８个，我国油茶林面积约万亩中分布于湖南江西和广西等１省（市、区）１１００多个县。其中，以湖南、江西和广西三省区的面积最大，约６＿７１］占全国油茶面积的７０％。随着我国油茶种植面积逐年增大，油茶病虫害的发生与危害逐年加重，严重的制约了油茶产业的健康快速发展。油茶病虫害的种类很多，据调查统计，为害油茶的害虫有３２３多种隶属８目５８科，病害有５０多种，其中发生面积大。、为害较严重的有油茶炭疽病、烟煤病和软腐病油茶病虫害的８［］发生可造成花蕾、果实和叶片的严重脱落、干枯，甚至整株枯死。１．２油茶主要病害的种类及其防治现状１．２．１油茶炭疽病油茶炭疽病（Ｃｂ／ｆｃｃＭｒ／ｃＡｗｍｇ／ｏｅａｙ／ｗｚＷｉｉｅｙ）是油茶林中发生严重的病害一之，在我国主要油茶种植区发生普遍。该病由小丛壳属真菌的侵染引起。病害１ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究的发生易引发油茶叶片、花蕾和果实的脱落，甚至整株的衰亡。炭疸病引起的落一°果率般为２０／。左右，严重时可达４０％以上，病果的含油量也仅为健康果实的５０％９］［〇１．２．１．１油茶炭疽病危害症状油茶的花芽、枝梢、叶和果实均有炭疽病的发生。油茶果实和叶片受病时，危害初期为黑褐色小圆点，后逐渐扩大为黑褐色圆形或椭圆形病斑，病斑中心也变为灰白色，其上轮生有黑褐色小点，即油茶炭疽病菌的分生孢子盘，有粉红色的分生孢子产生。油茶炭疽病菌侵染油茶组织时，不同的组织最先表现出病症的位置不同，油茶果实的病斑多在近果尖处，叶片上的病斑多出现在叶尖和叶缘处，８［］花蕾和新梢的病斑以基部鳞片和树梢基部居多。１．２．１．２油茶炭疽病发生规律油茶炭疸病的发生与蔓延与环境的温度和湿度密切相关一。般情况下，当早°°春温度达到２０Ｃ后，油茶炭疽病开始发生。当温度上升至３０Ｃ左右时，病害迅速发展蔓延。春季降雨时间早、降雨量大，炭疽病的发生提前。夏季和秋季降雨次数多，持续时间长，炭疽病的发生面积增加，蔓延速度加快。炭疸病的发生也与油茶的林龄一、种植区的地形和坡向等密切相关。般情况下，成林、林缘、低山区和山脚炭疽病的发病率明显髙于幼林、林内、高山区和１（）［］山顶。不同品种的油茶，抗病能力也不同，其中以小果油茶的抗病能力最强。１．２．１．３油茶炭疽病防治方法由于油茶炭疽病的发病时间长、受害部位多和为害严重，需采用营林措施、化学防治与生物防治相结合的综合防治措施。，在冬季和春季营林措施主要包括抗炭疽病油茶品种的选育，结合油茶的复壮修剪，将油茶林内的病株、病叶、病枝、病果和病蕾清除，以减少初侵染来源。加强各地油茶种子和苗木产地检疫，减少油茶炭疽病的大面积传播。随着化学防治的弊端日益突显，针对油茶炭疸病的防治，已形成了以生物防１１治为主［］，化学防治为辅的防治方法。周国英等从健康油茶叶中分离的１５６株内生细菌中筛选出了一株对油茶炭疽病等多种病害具有强烈抑制作用的枯草芽孢１２［］杆菌。游嘉将其研制了可湿性粉剂，其林间对炭疽病的防治效果在７０％以上。１３杨蕾［］将土壤中筛选的拮抗放线菌Ｆ１０研制成菌剂，林间对炭疽病的防效可达１４［］到８０％以上。周建宏在４０多种植物提取物中筛选出的丁香和黄芩的提取物复２ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究１５上［］配使用对油茶炭疽病的林间防效在７０％以。邓鑫州等研宄发现１％波尔多液和８０％代森锰锌７００倍液对油茶炭疽病的防效最好，林间防效在７５％以上。１．２．２油茶软腐病ａＷｃｏｄｏｃＷｗｗ一油茶软腐病Ｕｇｃｏｗｅ／ｆｏｅ）是油茶林的主要病害之，在我国油茶种植区的发生面积和危害性仅次于炭疽病。该病由半知菌丛梗孢目伞座属的油。、茶伞座孢菌侵染引起病害发生时，引起严重的落叶落果和无花芽分化，阻碍了油茶的健康生长，降低了油茶的产量。软腐病对油茶苗木的为害情况更加严重，苗木在被软腐病菌侵染后的几天内就会成片感病，大面积的落叶直至整株枯死，油茶软腐病现已被列入油茶苗木的检疫性病害。１．２．２．１油茶软腐病危害症状油茶的果和叶片等均有软腐病的发生。油茶叶片感病时，最初为黄色呈水渍状的小斑点，后逐渐扩大为黑褐色或黄褐色的圆形和半圆形的病斑，在病斑的周一围出现明显的边缘，般在２至３天左右叶片会脱落。在感病的后期，病斑上会出现病菌分生孢子座，淡黄色或浅灰色的小颗粒呈蘑菇状。油茶果感染软腐病菌后的病斑与叶部基本相同，但是颜色相对较浅，其上也会出现分生孢子座，高温时病果易开裂和脱落。１．２．２．２油茶软腐病发生规律软腐病的发生与蔓延和林分密度一、温湿度有关。般地，油茶林的林分密度°１６［］大，其透光性相对较差，软腐病的发生就严重。每年３月下旬温度在２０Ｃ左右时，，，软腐病开始发生随着温度的升高和湿度的加大，病害的发展速度加快４至６月为软腐病的盛发期。夏季和秋季的雨水较多时，可能在１０至１１月之间一出现软腐病的第二次发病高峰。油茶果般在６月初开始发病，相对湿度未达到°°１７Ｃ［］７５％，温度高于３５Ｃ或低于１０，油茶果的发病较轻甚至不发病。１．２．２．３油茶软腐病防治方法针对软腐病的发生规律，需采用农业防治、生物防治并辅以化学防治的综合治理的方法一。农业防治般是对油茶林及时的进行修枝和间伐，增加林间的透光。、。性和通风性对于病叶病果和病树，要及时进行清除焚烧，减少病原菌的传播。增加油茶林地的水肥管理，增强油茶自身的抗病性在软腐病的生物防治中应用１８一较多的是生防菌剂及植物源提取物［］株对。李雪娇在健康的油茶体内分离到了３ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究软腐病菌具有强烈的抑制作用的解淀粉芽孢杆菌，命名为Ｌ４６，并将菌株Ｌ４６研制成了活菌菌剂，其林间的防效试验发现菌株Ｌ４６菌剂对软腐病的防效达到了１４［］７０％与化学杀菌剂的效果相当。周建宏研究发现丁香、黄芩、金银花、芦荟、穿心莲、侧柏和茶枯饼粕这７种植物提取物对油茶软腐病菌的抑制率均在７０％５０％－６００倍液或以上。在软腐病的发病初期可以喷洒甲基硫菌灵４００１：１：１００的１９［］波尔多液进行化学防治，防治效果比较理想。１．３植物病害的生物防治研究一植物的病害作为农林业生产的自然灾害之，严重的阻碍了农林业的健康快一种可有效控制植物病害的方法速的发展。化学防治作为，具有防治效率高、见效快、成本低、杀菌谱广及使用方法简单方便等特点，但是化学杀菌剂的滥用，“”２Ｑ２１，［］引起了严重的３Ｒ问题。因此，植物病害的生物防治成为了国内外学者的研究热点。植物病害的生物防治指的是利用生态环境中的有益微生物或其代谢产物对２２一种技术与方法［］植物的病害进行有效防治的。其实质是通过植物生长环境中的有益微生物的相关生物作用机理抑制病原菌的生长和繁殖，从而抑制植物病害的发生和发展。这些生物作用机理主要包括抗菌作用、溶菌作用、竞争作用、捕食２３］［作用、重寄生作用、诱导抗病性及植物微生态调整等。在植物病害生物防治中２４［］应用的比较多的生防菌主要有细菌、放线菌和真菌这三大类。１．３．１植物病害生防细菌的研究细菌具有种类繁多、繁殖快、代谢产物种类多、生活周期短、对植物病原菌２５［］。的作用方式多样和易于培养等特点，故其被广泛的应用于植物病害的防治中目前，在植物病害的生物防治中研宄应用较多的拮抗细菌主要是芽孢杆菌土壤放射杆菌巴氏杆菌（Ｐｏ＾ｅｗｒｅ／Ｚａ）、２６［］假单胞菌等。１．３．１．１芽孢杆菌在植物病害防治中的应用芽孢杆菌作为自然界中分布广泛的一类腐生细菌，其抗逆性强，抗菌活性显、著，其在生长代谢的过程中产生的抑菌蛋白挥发性的抑菌物质和分子量小的抑２７［］。菌肽等代谢产物可有效的抑制植物病害，同时还能促进植物的生长２８［］ＧｕｎＷｏｏｎｇＬｅｅ等在植物根系分离得到的芽孢杆菌Ｓ１６对油桃、苹果和桃４ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究２９［］采后的炭疽病等多种病害具有强烈的抑制作用。王玉英等在九里香植株内分离－１对芒果蒂腐病菌和炭疽病菌具有较好的抑制效果－到的芽孢杆菌ＨＢＳ。ＨＢＳ１菌株的发酵上清液的１０倍稀释液对芒果采后的病原菌的抑制作用优于８００倍液的化学杀菌剂特可多。３（）３１，［］Ｘｉｎ１１皿－ｑｉ１＾等研究发现短小芽孢杆菌ＳＱＲＮ４３对黄瓜枯萎病的生长繁殖有抑制作用－Ｎ４３的代谢产物进行抑菌活性的分，通过对菌株ＳＱＲ析，对病原３２菌起抑菌活性的物质是代谢产物中的低聚肽［］。王宇婷等对筛选自烟草植株中的内生短短芽孢杆菌０１１进行了发酵滤液抑菌活性的研究，研究发现菌株０１１的发酵滤液可对番茄早疫病菌、白菜黑斑病菌和辣椒疫病菌等８种植物病原菌具有抑制作用，其主要是对病原菌菌丝生长和孢子萌发产生影响，对于菌丝的影响主要表现为可使菌丝细胞出现畸形、菌丝呈现粗细不均、菌丝节间变粗变短，细胞的原生质收缩出现空泡等。对于孢子的影响表现为可使芽管畸形和发芽点处出现囊泡，直接抑制孢子萌发。在热带和亚热带地区，根结线虫（Ｍｅ／ｏ＾ｆｏｇｙｔｅｓｐｐ．）给农林业的生产带来了严重的危害，因此，关于利用生防细菌对根结线虫病的防治开始了广泛的研究。３３］［Ｍｅｋｅｔｅ等研究发现分离自埃塞尔比亚的咖啡中的生防细菌对南方根结线虫具３４［］有较好的防治效果，防效在３８％至９８％之间。张立强等在海南尖峰岭的土壤中筛选出了８株对松材线虫的拮抗活性在８０％以上枯草芽孢杆菌，其中菌株ＤＢ１３１８４对松材线虫的抑菌活性最好，其发酵滤液的１０倍稀释液对松材线虫二龄幼虫的校正死亡率仍可达到５６．７％。１．３．１．２假单胞菌在植物病害防治中的应用假单胞菌是一类在土壤中广泛分布且能有效定殖在植株根部的革兰氏阴性５［３菌］，其对植物病原菌具有抑制作用，还可促进植株的生长。利用假单胞菌进行一３６植物病害的防治已经取得了定的进展［］。何礼远等研宄表明花生种植前，利用荧光假单胞菌ＪＦ１菌株发酵液对花生种子浸泡，能显著的抑制青枯病的发生。３７Ｓ［］一ａｒｖａｎａｎ等筛选出了株对香蕉枯萎病菌有抑制作用的荧光假单胞菌，其主要是通过使香蕉体内部分酶类和酚类物质的増加，同时还诱导了相关防卫基因的表３８３９［］［］达来抑制病原菌的生长繁殖。Ｎｉｅｌｓｅｎ等和Ｎａｇａｒａ等研宄发现的荧光假单ｊ胞杆菌９６．５７８菌株和ＰｆＭＤＵ菌株分别产生的环形脂肽和乙二酸对水稻纹枯病菌４（）一［］有拮抗作用。同时，假单胞菌对植物的病毒性病害也有定的防效。翟熙伦等一株蒙氏假单胞菌在健康的烟草的根系土壤中分离筛选得到了，其发酵液对马铃５ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究９１．薯Ｙ病毒和烟草花叶病毒的抑制率分别为．４％和９３１％。１＿３．２植物病害生防放线菌的研究一放线菌作为自然界中种类多、分布广的微生物之，自１８７２年被Ｃｏｈｎ发４１［］现以来，相继已有６９属的１６８７种放线菌被报道。其中放线菌产生的代，多种谢产物如抗生素一、植物激素和酶类等，对病原菌有定的抑制作用的同时还能促一４２４３［，］进植物生长。因此，放线菌是种非常重要的生物农药的资源菌。目前，链霉菌是在植物病害生物防治中研宄最多的放线菌。链霉菌作为一种高等放线菌，其产生的代谢活性物质对植物的细菌病害、真４４［］菌病害和根结线虫病等有较好的防效。汪倬等人在作物田地的土壤中分离筛选３－－到了株对黄瓜的灰霉病菌有明显拮抗效果的拮抗链霉菌菌株ＲＢ９、ＲＢ２和ＲＢ－３。三株链霉菌的发酵上清液对病原菌孢子萌发的抑制作用最强，经过不同２５％菌株发酵上清液处理后．、７．２８％０．５９％。，病原菌的孢子萌发率分别仅为１和１４５［］王岩等－筛选出的链霉菌菌株Ｆ１对水稻的纹枯病菌具有拮抗作用，其主要是菌株的代谢产物致使病原菌顶端的菌丝弯曲、皱缩和畸形等。此外，链霉菌在根结４６［］线虫病的防治上也有了研宄报道。李玲玉等研宄发现委内瑞拉链霉菌Ｓｎｅａ２５３菌株的代谢产物对植物线虫有毒杀作用，通过薄层层析分析发现这些活性物质含氨基酸和糖。４７大量研宄也表明了链霉菌对植物有促生的作用［］。陈杰等研宂发现分离自西部极端环境土壤中的多产色链霉菌１锈赤蜡＇黄链霉菌ｒａＷ＇ｇｉｗｏｓｏ／ｚｅ／ｖｏ／Ｍｊ）和球抱链霉球菌抱亚种ｇ／ｏ坤ｐｏｍｙｓｕｂｓｐ．Ｇ／ｏｔｏ／ｗｍｓＯ的菌株发酵上清液可抑制马铃薯干腐病菌和黑猪４８病菌的同时还能促进甜瓜种子胚轴和胚根的生长［］。魏赛金等研究了链霉菌７０２对水稻春光１号种子萌发和水稻幼苗生长的影响，发现链霉菌７０２可促进水稻种＇子的萌发、胚根和胚芽的生长。；１．３．３植物病害生防真菌的研究目前，在植物病害的生物防治中研宄应用最多的拮抗真菌有木霉菌（ＴＷｃ／ｊｏｔｆｅｒ／ｗａｓｐｐ．）、淡紫拟青霉（Ｐａｅｃｚ７ｏｍｙｃｅｙ７ｚ７ａｄｍ？）和毛壳菌；（Ｃｈａｅｔｏｍｉａｃｅａｅ）等。１．３．３．１木霉菌在植物病害防治中的应用６ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究一木霉菌作为种土壤中广泛分布的腐生型真菌，其在林木病害的生物防治中具有重要的价值，。大量研宄表明大多数木霉菌产生的次级代谢产物、酶类等具有生物活性的物质对植物真菌性病害和细菌性病害的病原菌具有较好的抑制作用，同时，，促进其生长，木霉这些活性物质还可以提高林木本身的抗性。因此４９３（）菌已经被广泛的应用于林木病害的生物防治中［］，目前在国内外的市场中已经５１［］有５０余种木霉制剂应用于农林业生产实践中。５２杨蕾等［］在研宄杨树溃疡病的生物防治过程中一，在杨树组织中筛选到了株＇对杨树溃疡病菌具有抑制作用的黄绿木霉ＹＧＦ９（Ｔｈｃ／ｚｏｃ／ｅｒｗａａｗｒｅｏｖ／ｎＶ／ｅ），离５３［］体组织试验表明，菌株ＹＧＦ９７５％以上对杨树溃疡病的防效在。刘路宁等研宄发现木霉菌ＴＹ００９对水稻稻瘟病菌和水稻纹枯病菌等病原菌有较好的防效。５４＿５６［］木霉菌作为生防菌株也可应用于植物根结线虫病的防治中，木霉菌对根结线虫具有抑杀作用主要是其发酵液可直接杀死根结线虫的二龄幼虫，同时菌株也可寄生在根结线虫的卵上。哈茨木霉菌ＴＲＩ２菌株对黄瓜根结线虫２龄幼虫有较好的防效，在田间应用时菌株发酵液对根结线虫的防效仍为在７２．２％以上，与［５７］杀菌剂阿维菌素的效果相当。长枝木霉的孢子悬浮液可使小麦禾谷孢囊线虫的７２龄幼虫致死，当菌株孢子悬浮液的浓度达到１．５ｘｌ〇ｃｆｕ／ｍｌ时，经过孢子悬浮液处理７２ｈ后的线虫２龄幼虫的死亡率为９１．３％，校正死亡率为９０．４％，处理１４５８［］天后其对线虫２龄幼虫的寄生率也达到了８８．７％。１．３２．３．淡紫拟青霉在植物病害防治中的应用淡紫拟青霉作为习居在植物根部和土壤中的真菌，其产生的代谢产物和酶类等具有杀线虫活性，是多种植物寄生线虫的重要天敌。自１９７９年Ｐ．Ｊａｔａｌａ研宄发现了淡紫拟青霉对植株的根结线虫具有寄生作用开始，各国专家学者就幵始了Ｍ＠］［］淡紫拟青霉在植株根结线虫病防治上研宄应用。汪军等研宄了淡紫拟青霉菌株Ｅ７对香蕉根结线虫的防效，结果表明菌株孢子悬浮液稀释１．５倍后对２龄幼虫致死率仍达到了，９８．２％将研制的菌株Ｅ７菌剂按照５、１０和２０ｇ／株施用在室内的盆栽中，经过９０ｄ后盆栽的香蕉根部周围土壤的根结线虫２龄幼虫的密度较对照组分别较少了．７％、７１８４．５，３６６．１％和％与ｇ／株阿维地线净处理的效果相当，同时香蕉的株高，、地上部分的鲜重和香蕉根重等较对照均有明显增加表明菌株Ｅ７可有效防治香蕉根结线虫病的同时还具有促进植株生长的作用。淡紫拟青霉除了对根结线虫具有较高的致死率外，其也对烟草根结线虫、南方根结线虫和大豆孢囊线虫等有较高的寄生率，可有效的降低土壤中线虫的数量，防治病害７ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究６１［］的发生和发展。６２［］淡紫拟青霉除了可防治线虫外，还可防治多种植物病害。Ｓａｓｓｅｒ等研宄表明菌株编号为３６－、１的淡紫拟青霉发酵液对黄瓜炭疽病菌小麦赤星病菌、玉米小斑病菌和棉花枯萎病菌等病原菌都有较好的拮抗作用－，还证明了菌株３６１抑制病原菌生长的原因是菌株产生的抗菌物质。１．４生防菌与杀菌剂混配防治植物病害研究在林木病害的生物防治中，分离筛选自林木植株内或土壤中的生防菌株成为应用研宄的重点，但是生防菌在林间应用时易受环境中多种因素的影响，使得其在林间防效普遍偏低。将生防菌株与低剂量的化学杀菌剂相结合来进行植物病害的防治，既能增强生防菌对林间复杂环境下的适应性，同时也在很大程度上减少了化学杀菌剂的用量，降低了农药的残留及其对环境的污染。因此，将生防菌株与化学杀菌剂混配使用是一个增强生防菌在林间对植物病害防治效果的有效方法。自从Ｋａｎｔａｎ提出将生防菌与化学杀菌剂联合防治植物病害时，低剂量的化学杀菌剂可对土壤或植株内的病原菌及其他微生物起到抑制作用，这将有益于生防菌的快速稳定的定殖，使其在作用位点形成生防菌的有效群体，来充分的发挥＾３＂６５：１自身的防治病害的作用。将活体生防菌株和化学杀菌剂之间的混配使用在植物病虫害的防治中已经开始了大量的研究。１．４．１杀菌剂混配的增效系数评价方法两种杀菌剂在混用的过程中，其生物学作用也会发生变化，将杀菌剂进行合理的混用可以扩大杀菌剂的抗菌谱、削弱病原菌的抗药性、减少杀菌剂的用量提高防治效果。目前，在杀菌剂混用后相互作用的评价方法主要有增效系数法、共６６［］毒系数法和等效线法。１．４．１．１増效系数法一种描述杀菌剂之间相互作用的方法增效系数法是，是必须建立病原菌对杀菌剂的单剂和复配剂的剂量反应曲线，再通过对其进行分析得到线性的回归方程。以ＳＲ值来进行杀菌剂混用的増效作用的评价，若ＳＲ小于０．５时，两者为拮抗作用．．．，若０５ＳＳＲＳ１５时，两者为相加作用，若ＳＲ大于１５，两者为增效作用。复配杀菌剂的增效系数按下列公式计算：８ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究＝ｘＸ（ＰＡ＋ＰＢ）／（ＰＡ／Ａ＋ＰＢ／Ｂ）ｌ〇〇ｉ式中：：Ｘ１：复配杀菌剂的ＥＣ５〇理论值；ＰＡ复配杀菌剂中Ａ的百分含量；ＰＢ：复配杀菌剂中Ｂ的百分含量；Ａ：复配杀菌剂中杀菌剂Ａ的ＥＣ５Ｑ值；Ｂ：复配杀菌剂中Ｂ的ＥＣ５〇值；ＳＲ＝Ｘ／Ｘｉ２：ＳＲ：复配杀菌剂的增效系数：：式中；Ｘ１复配杀菌剂ＥＣ５Ｑ理论值；Ｘ２复配杀菌剂ＥＣ５Ｑ实测值；增效系数法作为测定杀菌剂复配或混合使用时判断增效性的行业标准方法一６７［］之，在杀菌剂的复配研宄中被广泛应用。韩新才等人采用增效系数法测定了百菌清和农抗１２０的不同混配比例对辣椒炭疽病菌菌丝的抑制作用，研宄发现百２０的混配比１４至１：８时１：６菌清与农抗１例为：，表现为增效作用，当混配比例为６８［］时的増效系数为３．９３达到最大，故此比例为最佳配比。马林采用了增效系数法进行了噻菌灵和福美双混配对疣孢霉和食用菌木霉的协同作用的试验，结果表明两者在５个比例下混配后对这两种菌的作用效果不同，对疣孢霉都是相加作用，而对木霉都表现为增效作用。１４．１２共毒系数法．．共毒系数法是一种利用毒力指数来计算复配剂联合毒力的方法。即先测定单剂和复配剂的毒力回归方程，根据得到的ＬＤ５Ｇ，再计算毒力指数Ｋ和共毒系数６９ＣＴＣ［］。以ＣＴＣ作为指标进行杀菌剂混用效果的评价时，若ＣＴＣ小于８０，两者表现为拮抗作用，若８０ＳＣＴＣＳ１２０，两者表现为相加作用，若ＣＴＣ大于１２０时，两者表现为增效作用。复配杀菌剂的共毒系数按下列公式计算：＝ＫＹｉ／Ｙ２ｘ１００式中：Ｋ：复配剂毒力指数实际值；１：标准药剂的ＥＣ５Ｑ理论值；Ｙ２：复配剂的ＥＣ５Ｇ理论值；＝Ｋ＞＜＋ｘＫ〇ＰＫＰｉｉ２２＝ＫｘＣＴＣ／Ｋ〇ｌ〇〇式中：ＣＴＣ：Ｋ：单剂１的毒力指：共毒系数；ＫＱ复配剂毒力指数理论值；１数：：：；Ｐ１复配剂中单剂１的百分含量；Ｋ２单剂２的毒力指数；Ｐ２复配剂中单剂２的百分含量；共毒系数法在判断两种农药混合使用时相互作用的关系在农林业病虫害的９ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究ｍ防治中也有较多的应用。侯昌亮等人研宄了申嗪霉素与咪鲜胺的不同混配比对小麦赤霉病菌的协同杀菌作用，结果发现了申嗪霉素与咪鲜胺的混配比例为５：１２６２２８时．，其共毒系数为达到最大，同时混配剂在林间对小麦赤霉病的防效达７１［］到８４．６５％，明显的优于单剂的防治效果。周锋研宂了戊唑醇与菌核净的不同复配比对油菜菌核病菌的抑制效果：１１，结果表明戊唑醇与菌核净质量比为１２时其共毒系数最高，复配剂在活体组织试验和盆栽试验中对该病菌的防治效果均好于单剂。１．４．２生防真菌与化学杀菌剂复配防治植物病害在生防真菌的研宄中，木霉菌因其抗菌谱广、对环境安全等特点，成为生防一真菌研究中的重要菌株之。学者们关于木霉菌与化学杀菌剂之间的相容性进行７２了大量的研宄［］，郎剑锋等人研宄发现哈茨木霉与杀菌剂代森锰锌、甲基硫菌灵７３和链霉素的相容性均不同［］人测定了５种杀菌剂对木霉菌株的抑制作。刘欣等用，发现菌核灵对木霉菌菌株的抑制作用最强，恶霉灵对其抑制作用最弱。目前，已有研宄表明了杀菌剂与木霉菌株复配使用后对林木病害的防治具有增效作用。％ＧｕｔａＶＰ等人研宄发现代森锰锌与拟康氏木霉混配使用后对桑葚切割腐烂病ｐ７５ＥａｄＹ等［］二甲酰亚和溃疡病等桑葚病害的防效优于单剂。ｌ研究发现杀菌剂胺与哈茨木霉菌交替或联合使用时，对黄瓜灰霉病的防治效果在９６％以上，具有明显ｍ的增效作用。ＢｉｌａｎａＧ研究发现哈茨木霉菌与甲霜百菌清交替施用对烟草根腐ｊ７７病的防效明显的高于杀菌剂甲霜百菌清单独施用［］。李敏研究发现多菌灵与哈茨木霉以４：６复配使用时，对水稻立枯病的防效较多菌灵和皓茨木霉单独处理各提高了１１．６６％和４４．４６％，同时处理过的水稻苗的根长、株高等指标均高于对照组。７８［］田连生等研宄表明５０％多菌灵粉剂与木霉菌的分生孢子粉按照质量比为２：８混．配使用，对黄瓜灰霉病的盆栽防效在７８９％以上，显著的高于两单剂单独的防治效果。１．４．３生防细菌与化学杀菌剂复配防治植物病害拮抗细菌在林木病害的生物防治中研宂应用颇多一菌株的防病机，但由于单一制比较单，在林间复杂的环境中，对病害的防治效果不佳。近年来，研究者们致力于将生防菌与化学杀菌剂混配使用，来增加防效的稳定性，提高防治效果。关于生防细菌与化学杀菌剂复配使用进行植物病害的防治过程中，应用最多７９［］Ｂ的生防细菌是芽孢杆菌。农倩将水稻内分离的巨大芽孢杆菌１９６和戊唑醇按１０ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究．３６：１混／Ｌ质量比１１配后，在施用的有效剂量为１５０ｍｇ时，在室内盆栽试验和林［Ｍ］间试验中，对水稻纹枯病防效分别为７７．７２％和７４．７１％。刘邮洲等在梨轮纹病的防治过程中，利用２５％敌力脱与筛选出的拮抗细菌ｓｆ６２８菌株在复配比为１：１、１：２、２：１和３：１时均表现出增比为３：１时的增效作用最强效作用，其中以复配，增效系数达到了２．９４２。许多研究报道表明，拮抗细菌与化学杀菌剂在适合的复配比下对林木病害的一生防因子防治效果和防效的稳定性均优于单。拮抗细菌与化学杀菌剂复配的防治效果是受多种因素影响的，如拮抗细菌和化学杀菌剂的种类、复配的比例和施用的浓度等，只有相容性好的拮抗细菌与化学杀菌剂在合适的比例下才能明显的提高对林木病害的生防效果。因此，针对不同的生防菌株筛选出适宜的杀菌剂及复配增效比例来进行林木病害的防治是其走向生产实际的关键。１．５油茶内生拮抗细菌Ｒ６研究现状油茶内生拮抗细菌Ｒ６是实验室前期在健康油茶的根部、叶片和果等组织中采用研磨法、平板对峙试验和抑菌谱测定进行初筛和复筛后，在健康的油茶果中分离出的对油茶炭疽病、、油茶根腐病、油茶半边疯病柑橘炭疽病、柑橘根腐病和芦荟根腐病等多种植物病害具有较好抑制效果的菌株。、革兰氏染色及生理生化反应测定等传统方法与通过菌株形态观察１６ＳｒＲＮＡ序列分析相结合的方法，鉴定出菌株Ｒ６为枯草芽孢杆菌ＳａｔａＹ／Ｍ研宄发现，菌株Ｒ６既对病原真菌有抑菌效果，同时对病原细菌柑桔溃疡病一菌有一这表明菌株Ｒ６分泌的是定的抑制作用，种既抗真菌也抗细菌的活性物质，也可能是分泌了多种抑菌物质。对于菌株Ｒ６分泌的抑菌物质还尚未进行分离鉴定。１．６本论文的课题来源、目的意义及主要内容１．６．１课题来源“”二五Ｂ０十农村领域国家科技计划课题（ＮＯ．２０１２ＢＡＤ１９８０３）１．６．２目的意义油茶ｏ：ｅ於ｒａＡｂｅｌ作为我国南方重要的经济林木。油茶茶籽及其副产品的经济价值极高，在国内外的市场中竞争潜力巨大，发展前景十分广阔。油１１ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究茶炭疽病和软腐病是油茶林中发生严重的病害，易引起油茶叶片、花蕾和果实的脱落，甚至整株的衰亡，严重阻碍了油茶产业的健康快速发展。在油茶病害的防治中，化学防治对环境和食品安全的危害性、生物防治的防效慢和农业防治的局限性等问题日益凸显，将生防菌剂与适宜的化学杀菌剂复配协同使用，不仅发挥、了生物农药的持效性安全性，也体现了化学农药的速效性，更重要的是减少了化学农药的使用剂量。这对油茶病害的防治和茶油品质的保证具有重要意义。本论文以在健康油茶果中分离筛选出的对油茶炭疽病和软腐病具有较好抑制作用的枯草芽孢杆菌Ｒ６为研究对象，研究了化学杀菌剂与菌株Ｒ６可湿性粉剂对油茶炭疽病和软腐病的协同作用，提高复配杀菌剂对油茶病害的防治效果，以期为无公害绿色茶油的生产提供理论上的依据。１．６．３主要研究内容（１）筛选对拮抗细菌Ｒ６无抑制作用的化学杀菌剂通过平板菌落计数法研究６种对油茶炭疽病菌和软腐病菌具有抑制作用的一化学杀菌剂对菌株Ｒ６菌体和芽孢的抑制作用，筛选出种对菌株Ｒ６无抑制作用的化学杀菌剂。（２）油茶主要病害拮抗细菌Ｒ６的发酵工艺优化通过单因素试验和响应面分析相结合的方法，优化菌株Ｒ６的发酵培养基和培养条件。（３）油茶内生拮抗细菌Ｒ６可湿性粉剂的研制以生物相容性、润湿性和分散性作为指标，筛选适宜的载体和助剂。以可湿性粉剂的质量评价标准作为衡量的指标，筛选出各助剂的比例，研制菌株Ｒ６可湿性粉剂，并对其进行贮藏时间和抑菌率等指标的测定。（４）油茶内生拮抗细菌Ｒ６可湿性粉剂与甲基硫菌灵的协同作用研宄通过增效系数法分别筛选出对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑制作用表现为协同增效作用的菌株Ｒ６可湿性粉剂与甲基硫菌灵的复配比例，对筛选出的复配杀菌剂进行盆栽试验和林间试验，检验其对油茶炭疽病和软腐病的防治效果。１２ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究１．６．４技术路线油茶主要病害病原菌化学杀菌剂拮抗细菌Ｒ６｜｜｜｜｜Ｉ］ｉｉ＾＋室内毒力测定相容性测定发酵培养基优发酵培养条件１１１１｜＇－Ｌｒｉｒｎ－１ＪＬＡ！＾ｌｒＡ二！４Ａ？对菌对士芽碳氮无ｆ初接｜霊｜体的孢的机始种ＳＳ２影响影响源源盐Ｆ量｜Ｐ｜ｇＬ￣ＪＬ￣ｒｒｌ二￣＿ｒ古去Ｉ菌株Ｒ６最佳发酵工艺对菌株Ｒ６Ｉ无抑制作载体菌株Ｒ６发酵液１｜助剂｜｜｜用的化学１１杀菌剂｜＇拮抗细菌＾６可湿性粉剂Ｉ［＿化学杀菌剂与Ｒ６菌剂复配增效比例＿＿？＋＋盆栽防效试验ＩＩ林间防效试骑ＩＩｉ油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用图１．１技术路线图Ｆｉｇ．１．１Ｄｉａｇｒａｍｏｆｓｔｕｄｙｔｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｗａｙｓ１３ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究２筛选对拮抗细菌Ｒ６无抑制作用的化学杀菌剂随着人们对食品安全和健康的关注，传统的防治方法带来的环境污染和食品安全等问题引起了人们的担心，发展和生产无公害农产品成为了时代的要求。将生物农药与化学农药复配使用来防治林木的病虫害已经成为一个新的研宄热点，由于复配使用后不仅发挥了生物农药的持效性、安全性，也体现了化学农药的速效性，更重要的是减少了化学农药的使用剂量。但是在混配的过程中不同种类的杀菌剂对拮抗菌的抑制作用不同。针对不同种类的拮抗菌，在混配使用前要对杀菌剂的种类和浓度进行筛选。对于能抑制拮抗菌生长的杀菌剂在林木病害防治中应与拮抗菌间隔施用。因此，筛选出对拮抗菌无抑制作用的化学杀菌剂是拮抗菌与化学杀菌剂混配使用的前提和关键。本课题组从健康油茶果中筛选鉴定了一株枯草芽孢杆菌Ｒ６ｗ汾ｆｆｃ），它对油茶炭疽病、油茶软腐病和柑橘溃疡病等多种林木病害具有强烈的抑制作用。为了増加其林间防效的稳定性，提高其防治效果，本文筛选对菌株Ｒ６菌体和芽孢无抑制作用，且对油茶炭疽病菌和软腐病菌抑制效果好的化学杀菌剂，为化学杀菌剂与生防菌混配来防治油茶主要病害提供理论依据。２．１实验材料２．１．１供试菌株油茶内生措抗细菌由本实验室筛选鉴定，保藏于我校微生物菌种库。２．１．２指示菌株‘油茶炭痕病菌（Ｃｏ／／ｅｔｏ／ｎｃ／ｍｍｇ／ｏｅｏｊ／ｗＷｏｆｃｆｅｓ）和油茶软腐病菌ｃｆｌｗｅ／／ｆａ）由我校微生物菌种库提供。２．１．３供试杀菌剂８０％多菌灵可湿性粉剂（天津施普乐农药技术发展有限公司）、７０％甲基硫菌灵（山东青岛奥迪斯生物科技有限公司）、７５％百菌清可湿性粉剂（威海韩孚生化药业有限公司）、１０％苯醚甲环唑水分散粒剂（山东青岛奥迪斯生物科技有１４ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究限公司）、８０％醚菌酯水分散粒剂（陕西汤普森生物科技有限公司）、８０％代森锰锌可湿性粉剂（天津施普乐农药技术发展有限公司）。２．１．４培养基配方ＰＤＡ？：土豆２００２０１０００ｍＬ１５２０Ｈ。ｇ，葡萄糖ｇ，蒸馏水，琼脂ｇ，自然ｐ？ＮＡ：牛肉膏３．０１０，ＮａＣｌ５．０蒸馏水ｌＯＯＯｍＬ，琼脂１５２０，ｇ，蛋白胨ｇｇ，ｇ？ｐＨ７．２７．４。？３０１。ＮＢ：牛肉膏？０ｇ，蛋白胨１０ｇ，ＮａＣ１５．ｇ，蒸馏水０００ｍＬ，ｐＨ７？２７．４２．２实验方法２．２．１化学杀菌剂对油茶炭疽病菌和软腐病菌室内毒力的测定２．２．１．１病原菌的活化°将病原菌菌种保藏试管置于２８Ｃ的恒温培养箱中，１２ｈ后切取小块菌饼转接°至ＰＤＡ平板上，在２８Ｃ恒温培养箱中培养，菌丝长至培养皿边缘时取出待用。２．２．１．２含杀菌剂的ＰＤＡ培养基配制根据预实验的结果，首先用无菌水将上述６种杀菌剂按照所需浓度配制成母液一ｌＯＯｍＬ，再按照梯度稀释法，用无菌水稀释成系列的浓度梯度。量取配制好的ＰＤＡ培养基９０ｍＬ于２５０ｍＬ的三角瓶中进行高压蒸汽灭菌后，根据十倍稀°释法，用无菌的移液枪分别吸取１０ｍＬ药液加入到９０ｍＬ冷却至６０Ｃ左右的ＰＤＡ培养基中，每种杀菌剂设置五个梯度，将加入１０ｍＬ无菌水的三角瓶作为对照组。每个三角瓶倒６个平板就制得了含有不同系列浓度杀菌剂的ＰＤＡ平板（表２．１）。表２．１供试杀菌剂的有效成分浓度Ｔａｂｌｅ２．１Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｒａｄｉｅｎｔｏｆｆｕｎｉｃｉｄｅｓｇｇ供试杀菌剂有效成分浓度（ｍｇ／Ｌ）８０％８．００４．００２．００１．０００．５０多菌灵７０％７．甲基硫菌灵．００３．５０１．７５０．８８０４４７５．００３７７５％．５０１８．７５９．４０４．７０百菌清１０％苯醚甲环唑４．００２．００１．０００．５００．２５８０％醚菌酯４．００２．００１．０００．５００．２５８０％代森猛锌１３４．００６７．００３３．５０１６．７５８．３７１５ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究－２．２．１．３化学杀菌剂抑菌作用测定８１采用菌丝生长速率法［］测定杀菌剂对油茶炭疽病菌和软腐病菌菌丝生长抑制作用。用打孔器在己活化培养好的病原菌的平板边缘打取直径为６ｍｍ的菌饼，°转接至含药ＰＤＡ平板的中央。置于２８Ｃ的５天，，菌丝面向上恒温培养箱培养采用十字交叉测量法测定各个平板中病原菌的菌落直径（单位ｍｍ），计算各杀菌剂的不同浓度对菌丝生长的抑制率、毒力回归方程、ＥＣ５〇和相关系数（ｒ），比较这６种杀菌剂对油茶炭疽病菌和软腐病菌的毒力大小。－－－（对照组菌落直径６）（处理组菌落直径６）１ＡＡ，＿、＝Ｘ囷落生长抑制率ｌ〇°（２－！）（％）福涵径－６２．２．２化学杀菌剂对拮抗细菌Ｒ６菌体的影响２．２．２．１括抗细菌Ｒ６菌悬液的制备在ＮＡ培养基上进行菌株活化后，挑取单菌落接种至装有５０ｍＬＮＢ培养液°的２５０ｍＬ三角瓶中，１６０ｒ／ｍｉｎ，３０Ｃ下恒温振荡培养２４ｈ５％的接种量转，再按°接至ＮＢ培养液中，１６０ｒ／ｍｉｎ，３０Ｃ下培养４８ｈ，冷冻离心后收集菌体，再用无７１于°菌水将菌体重新悬浮并将其浓度调整为１０个／ｍｌ／，置４Ｃ冰箱中保存备用。２．２．２．２化学杀菌剂对括抗细菌Ｒ６菌体生长的影响ｍＬ采用平板菌落计数法，用无菌的移液枪吸取ｌ菌株Ｒ６菌悬液接种到装有°４０ｍＬＮＢ培养液的ｌＯＯｍＬ摇瓶中，１６０ｒ／ｍｉｎ，３０Ｃ下恒温振荡培养２４ｈ后分别加入一一定量的杀菌剂，使其配制成系列不同浓度（表２．１）加入无菌水的摇，以瓶作为对照组°，每个处理重复三次，振荡摇匀后于３０Ｃ下恒温培养，４８ｈ后检测８２［］菌体的生长情况。２．２．３化学杀菌剂对拮抗细菌Ｒ６芽孢的影响２．２．３．１芽孢悬液的制备°８０Ｃ的将２．２．２．１中收集到的菌体用适量无菌水悬浮后置于恒温水浴锅中水７°？浴１５２０〇１丨１１，用无菌水将浓度调整到１０个芽孢／１＾，置于４（：冰箱中保存备用。２．２．３，２化学杀菌剂对括抗细菌Ｒ６芽孢的影响１６ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究８３［］２ｍ一ｌ的采用平板菌落计数法，在灭菌离心管中次加入ｌｍＬ无菌水、１０ｕＬ一一菌株Ｒ６芽孢悬液，加入定量的６种杀菌剂的母液，使其配制成系列浓度梯度（表２．１）理重复进行三次。振荡摇，加等量无菌水的离心管作为对照，每处°４匀，３０Ｃ下恒温培养静置培养４８ｈ，离心（１０ｒ／ｍｉｎ，ｌＯｍｉｎ）并用无菌水反复洗涤数次来尽量的清除化学杀菌剂后，吸，加入ｌｍＬ无菌水使芽孢悬液重新悬浮８４０ｕＬ［］。取１０悬浮液至ＮＡ培养基中培养，４８ｈ后对平板中的菌落进行计数２．２．４化学杀菌剂与拮抗细菌Ｒ６混配抑菌试验采用滤纸条法进行化学杀菌剂与拮抗细菌Ｒ６混配的抑菌试验，将筛选出的杀菌剂按照前面的浓度配制ＰＤＡ带药培养基，将灭菌的长８．５ｃｍ宽０．５ｃｍ的滤纸条十字交叉的放在培养基上，使用移液枪吸取发酵液４０ｕＬ均匀的滴在滤纸条上，滤纸条的中间接入油茶炭疽病菌和油茶软腐病菌的菌饼。同时设置３个对照组一：（１）单生防菌对照：滤纸条上滴加拮抗菌发酵液，置于无药的ＰＤＡ平板一上（２）单杀菌剂对照：滤纸条上滴加等量的无菌水，置于带药的ＰＤＡ平板；上３）ＤＡ；（空白对照：滤纸条上滴加无菌水，置于无药的Ｐ平板上。以上处理°均重复３次。在２８Ｃ下恒温培养３天，采用十字交叉法测量各个平板中病原菌的菌落直径（ｍｍ）。根据计算公式２．１计算各处理组对病原菌的生长抑制率。２．２．５数据分析利用ＳＰＳＳ１９．０软件对数据进行方差分析，用ＬＳＤ法比较各处理组的差异显＝著性（Ｐ０．０５）。进行毒力回归方程分析时，需先计算药剂不同浓度下的抑菌率，根据生物统计机率值表将抑菌率转换为机率值Ｙ，取杀菌剂浓度的对数值作为横坐标Ｘ．０，用ＳＰＳＳ１９软件求得毒力回归方程以及相关系数ｒ，并计算出抑菌中浓８５［］度ＥＣ５０（ｍｇ／Ｌ）〇２．３结果与分析２．３．１化学杀菌剂对油茶炭疽病菌和软腐病菌室内毒力的测定通过菌丝生长速率法测定了６种杀菌剂对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑制效果。结果表明，６种供试杀菌剂对炭疽病菌抑制效果的差异很大（表２．２）。多，菌灵苯醚甲环唑和甲基硫菌灵对油茶炭疽病菌的抑制作用较好，其中多菌灵ＥＣ５０为０．７３８ｍｇ／Ｌ，苯醚甲环唑ＥＣ５（）为０．９６３ｍｇ／Ｌ，甲基硫菌灵ＥＣ５ｏ为２．４２５１７ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究ｍ／Ｌ。ＥＣ５．２４ｍ／Ｌ。ｇ其次，醚菌酯５Ｑ为１ｇ，对病原菌的抑制作用略差百菌清和代森锰锌的ＥＣ５Ｑ分别高达了１２．４９５ｍｇ／Ｌ和４１．８８２ｍｇ／Ｌ，这两种药剂对炭疽病菌的抑制效果最差。因此，这６种杀菌剂对油茶炭疽病菌的抑制作用由小至大依次为：代森锰锌、百菌清、醚菌酯、甲基硫菌灵、苯醚甲环唑和多菌灵。表２．２６种杀菌剂对油茶邊疽病菌的室内毒力回归方程Ｔａｂｌｅ２．２ＩｎｄｏｏｒｔｏｘｉｃｉｔｙｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｅｑｕａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｓｉｘｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓａｇａｉｎｓｔＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｌｏｅｏｓｏｒｉｏｉｄｅｓｇｐ杀菌剂毒力回归方程ＥＣ５（ｍ／Ｌ）９５％置信区间相关系数ｒ〇ｇ＝？代森锰锌ｙ１．８８１ｘ＋１．９２３４１．８８２３６．０４９４８．８８２０．９９２＝？１．８６４ｘ＋５．２４６０．７３８０．６３２０多菌灵ｙ．８６１０．９９４＝？１３２ｘ＋４４４９４２５１．４９．甲基硫菌灵ｙ．４．２．．８６８３１０９６６＝？苯醚甲环唑０．８８９ｘ＋５．０１４０．９６３０．７１９１．２９００．９９５ｙ＝＋？百菌清ｙ２．２６２ｘ２．５２０１２．４９５１０．９２３１４．２９３０．９７７＝？醚菌酯ｙ０．７７８ｘ＋４．４４０５．２４１２．７２１１０．０９６０．９８７供试的６种杀菌剂对油茶软腐病的抑制效果也存在显著性差异（表２．３）。从表中可以看出，苯醚甲环唑，，甲基硫菌灵多菌灵和醚菌酯对油茶软腐病菌的抑１１制作用较好，其中苯醚甲环唑ＥＣ５〇为０．５４２＾几，甲基硫菌灵丑（：５〇为０．９１４１１＾几，多菌灵ＥＣ５Ｑ为１．００２ｍ／ＬＥＣ．８２９ｍ／Ｌ。ｇ，醚菌酯５Ｇ为１ｇ其次，百菌清和代森锰锌ＥＣ５Ｑ分别高达１２．１６６ｍ／Ｌ和３６．９２１ｍ／Ｌｇｇ，这两种药剂对软腐病菌的抑制效果较差。因此，这６种杀菌剂对油茶软腐病菌的抑制作用由小至大依次为：代森锰锌、百菌清、醚菌酯、多菌灵、甲基硫菌灵和苯醚甲环唑。表２．３６种杀菌剂对油茶软腐病菌的室内毒力回归方程Ｔａｂｌｅ２．３ＩｎｄｏｏｒｔｏｘｉｃｉｔｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｅｑｕａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｓｉｘｆｕｎｉｃｉｄｅｓａａｉｎｓｔｙｇｇＡｇａｒｉｃｏｄｏｃｈｉｕｍｃａｍｅｌｌｉａ杀菌剂毒力回归方程ＥＣ５（ｍ／Ｌ）９５％置信区间相关系数ｒ（）ｇ＝＋？代森锰锌１．１７７５．ｙ．９０４ｘ２．０１６３６９２３１．４２９０１０．９８４＝？多菌灵２３９ｘ＋４９８．．１１．ｙ．１．９１００２０８６７．５８０９５４＝？．＋５３００甲基硫菌灵ｙ０７６７ｘ．０．９１４０．６１２１．３６４０．９９＝？苯醚甲环唑０．９７６ｙ．７１６ｘ＋５．１９００．５４２０．３５６０．８２６０＝＋？百菌清ｙ０．５３９ｘ４．４１５１２．１６６７．２５９２０．３９００．９９６＝？醚菌酯＋！０．４６６ｘ４．８７８１．８２９０．９６４３．４７ｉ０．９７４ｙ供试的６杀菌剂中对油茶炭疽病菌和软腐病菌抑制效果桌好的分别是多菌灵和苯醚甲环唑，抑制效果最差的都是代森锰锌。２．３．２化学杀菌剂对拮抗细菌Ｒ６菌体的影响１８ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体分别经过６种杀菌剂处理４８ｈ的结果表明（表２．４），６种杀菌剂在供试浓度下，对枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体存活的抑制作用不同。表２．４６种杀菌剂对枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体的影响Ｔａｂｌｅ２．４Ｅｆｅｃｔｓｏｆ６ｆｕｎｉｃｉｄｅｓｏｎｔｈａｌｌｕｓｏｆＢ．ｓｕｂｔｕｌｉｓＲ６ｓｔｒａｉｎｇ￣供试浓度菌落数抑制率供试浓度菌落数抑制率｜乂茴刘求菌１７木１７／Ｌ１０ｃｆｕ／ｍＬ％／Ｌ１０ｃｆａ／ｍＬ％（ｍｇ）（）（）（ｍｇ）（）（）０２士－－．５１０．０９ｄ０２．５１土０．０９ｆ土８．３７２４７士０．ｄ０ｅ４０．１３１．６４０．５０２．２４．０８１０．±土代森锰１６．７５２１１１．．１７０．ｄ１３．５５灵１．００．８１０．０９ｄ２７４７＾｜多菌＃３３．５０１．８６士０．１０ｃ２５．９０２．００１．２３士０．１１ｃ５０．８０６７．００１０５土００８ｂ５８１．．±．．．７４０００８５０．０４ｂ６６．００土±１３４．０００１１．．５２００６ａ７９．５４０．ａ７８．４９８０００．．６０－±—０２．２．５１．．５１土００９ａ０００９ｃ０．４４２．４５士０．士０＿２．１５ａ２３９０．２５２．４８０ｃ１．２００．士１９甲基硫．８８２．４３士０．２７ａ３．１９苯醚甲０５０２．４３０．１５ｃ３．菌灵１．７５２．４０±０．１７ａ４．３８环唑１．００１．２７土０．１５ｃ４９．４０３５０２．３８土０１０ａ５１１．２１．．．８２．００６土０．１ｂ４９．８０士士７．３１．０００５ａ．００２７０．６ａ５．５８４０．８４．０６６．５４－－０２．５１±〇．〇９ｆ０２．５１士０．０９ｂ４．７０１士．１１．．．２．９６０６ｅ２．９１０２５２４３±０６ｂ３．１９士９．４０１．５１±０．．５１．百菌清．０８ｄ３９８４醚菌酯００２．４０２０ｂ３．９８±１８±０１１４．８０１．０８．４ｃ５６．９７１．００２．２９０．ｂ８．７６±±３７５００５０１０２００５．．２．．０．ｂ８０．０８．１．６００７ａ３４６±．±１４００．７５．００００５０．０４ａ９８．０．１．４７０３４ａ４１．４３’注：ｓ法于ＰＣ０同列数据后不同字母表示经Ｄｕｎｃａｎ．０５水平上差＃显著，下同。经过方差分析可知，在供试浓度下，甲基硫菌灵的不同质量浓度对菌株Ｒ６Ｐ＝０菌体的存活数无显著性差异（．９５）。其余５种杀菌剂在各自的供试浓度下，对Ｒ６菌体均有一定抑制作用，其中以百菌清的抑制作用最为明显，其对菌株Ｒ６？菌体的抑制率达到２１．９１％９８．０１％，其次为代森锰锌和多菌灵，对菌株Ｒ６菌体？？的抑制率分别为１．６０％６．６４％７８．４９％和１０．４０％７９，苯醚甲环唑和醚菌酯对Ｒ？？菌体的抑制作用相对较弱，抑制率分别是１．２０％６６．５４％和３．１９％４１．４３％。６种杀菌剂对菌株Ｒ６的菌体抑制作用强弱依次为：百菌清、多菌灵、代森锰锌、苯醚甲环唑、醚菌酯、甲基硫菌灵。２．３．３化学杀菌剂对拮抗细菌Ｒ６芽孢的影响（．５）６种杀菌６种杀菌剂对拮抗细菌Ｒ６芽孢处理４８ｈ后的结果表明表２，Ｒ６芽孢的抑制。剂在供试浓度下，对枯草芽孢杆菌作用不同１９ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究表２．５６种杀菌剂对枯草芽孢杆菌Ｒ６芽孢的影响Ｔａｂｌｅ２．５Ｅｆｅｃｔｓｏｆ６ｆｉｉｎｇｉｄｄｅｓｏｎｓｐｏｒｅｓｏｆ５．Ｒ６ｓｔｒａｉｎ￣￣￣￣供试浓度菌落数抑制率ｘ苗刘供试浓度菌落数抑制率木國介｜Ｊ７木困，Ｊ７．／Ｌ１０ｃｆｕ／ｍＬ％／Ｌ１０ｃｆｕ／ｍＬ％（ｍｇ）（）（）（ｒｎｇ）（）（）０２－±－．２６土０．０５ｄ０２．２６０．０５ｃ８．．．３７２．１６土００８ｃｄ４．４２０．５０２．１８±０．０７ｃ３５４代森锰１６．７５２．０８±０．１０ｃ７．９６１．００２．０８±０．１１ｂｃ７．９６锌±±０３３．５０１．１．．１２ｂ１３２７．７００．０７ｂ２４７８２．００９６．６７．００１．６０±０．０４ｂ２９．２０４．００１．８８±０．０８ａｂ１９．４７．１±１３４００１．０６±０．０８ａ５３．１０８．００．７００．１９ａ２７．４３０２±０－－．０５ａ２６±０．２６０２．．０５ｃ０．４４２．２３土０．１２ａ１．３３０．２５２．１４±０．１３ｃ５．３１０±．５±．１甲基硫．８８２．２２０．０７ａ１．７７苯醚甲００２．１２０．０６ｃ６９±±．菌灵１２．１８．．环唑１．．ｃ２．７５００９ａ３５３．００２１１０１０６１３±．±０７．５０２．１６００６ａ４．４２２．００１．８２．０４ｂ１９．４７．００２．１４±０．０４ａ５．３１４．００１．５６±０．１２ａ３０．９７一－０±０２．．２６土００５ｃ２．２６０．０５ｄ４±．±６９．７０２．２０００８ｃ２．６５０．２５２．１２０．０５ｃｄ．１９２．１土．±．．４０８０．１３ｃ３．５４０５０２．０２０．０８ｃ１０６２、ｔ百菌＃清士醚菌酯±±１８．８０１．８４０．０４ｂ１８．５８１．００１．６２０．０４ｂ２８．３２３７±１．２．５０１．４４〇．１４ａ３６．２８２．００１．６０±０．６ｂ２９０７５．００１．２４±０．０７ａ４５．１３４．００１．３２±０．１０ａ４１．５９经过方差分析可知，甲基硫菌灵的不同质量浓度对菌株Ｒ６芽孢无显著性影＝响（Ｐ０．２６）。甲基硫菌灵在供试的浓度下对菌株Ｒ６芽孢无影响。其余５种化学杀菌剂的不同质量浓度对菌株Ｒ６的芽孢均有一定抑制作用，其中以代森猛锌的？抑制作用最为明显，对菌株Ｒ６芽孢的抑制率达到４．４２％５３．１０％，其次为百菌Ｒ？？６芽孢的抑制作用分２．６５％４５．１３％和６．１９４１．５９％，清和醚菌酯，对菌株别为Ｒ６？５．３１３０．９７％和苯醚甲环唑和多菌灵对芽孢的抑制作用较弱，抑制率分别是？３．５４２７．４３％。６种杀菌剂对菌株Ｒ６的抑制作用强弱依次为：代森锰梓、醚菌酯、百菌清、苯醚甲环唑、多菌灵、甲基硫菌灵。２．３．４化学杀菌剂与拮抗细菌Ｒ６混配抑菌试验不同质量浓度的甲基硫菌灵与拮抗细菌Ｒ６发酵液混配后，对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑制率较单独使用甲基硫菌灵时均有增加（表２．６）。当甲基硫菌灵的有效成分浓度为７ｍｇ／Ｌ时，由于单独使用对两种病原菌的抑制率就都达到了１００％，在与拮抗细菌Ｒ６混配使用后抑菌率也分别为１００％，对两种病原菌均起完全抑制的作用。当甲基硫菌灵有效成分浓度为３．５ｍ／Ｌ、１．７５ｍ／Ｌ、０．８８ｍｇ／Ｌｇｇ’２〇． 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研宄和０．４４ｍ／Ｌ时ｇ，甲基硫菌灵与拮抗细菌混配使用较甲基硫菌灵单独使用对炭疽病菌的抑制率分别提高了９．９９％、２７．７９％、３７．８７％和３６．２６％，对软腐病菌和抑制率分别提高了１０．００％、１３．３９％、１１．３０％和６．６７％。混配使用较其单独使用对炭疽病菌的抑制率的增加量大于对软腐病菌的抑制率的增加量。拮抗细菌Ｒ６发酵液单独使用时，对油茶炭疽病菌的抑制率为６６．６７％，对软腐病菌的抑制率为４５．４８％。对炭疽病菌和软腐病菌的抑制效果与１．７５ｍｇ／Ｌ甲基硫菌灵可湿性粉剂单独使用的抑制效果相当。因此，拮抗细菌Ｒ６可与甲基硫菌灵可湿性粉剂进行混配使用用于油茶炭疽病和软腐病的防治中。表２．６拮抗细菌Ｒ６与甲基硫菌灵不同浓度混配对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑制率Ｔａｂｌｅ２．６ＴｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｒａｔｅｏｆＢ．ｓｕｂｔｕｌｉｓＲ６ｓｔｒａｉｎｍｉｘｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｏｎｓｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ－ａｒｔｈｉｏｈａｎａｔｅｍｅｈｌｔｏＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｌｏｅｏｓｏｒｉｏｉｄｅｓａｎｄＡｉｃｏｄｏｃｈｉｉａｎｃａｍｅｌｌｉａｐｙｇｐｇ甲基硫菌灵效成分浓？）—－竺吩供试病菌腿方式７．００．７５００３．５０１．８８０．４４Ｒ６发酵液１００％９６．６６％９３．３４％８０．００％６３．２１％６６．６７％油茶炭疽病菌ｆ，０７５－无菌水１０．５５２１３％８６．６％６％４．％２６．９５％Ｒ６发酵液１００％７６．６９％６０．０６％５１．３３％３３．３４％４５．４８％油茶软腐病菌ｆ，无菌水６６７％４０３％２６７－１００％６６．６９％４．．０．６％２．４小结与讨论枯草芽孢杆菌因其具有产生的代谢产物对植物病原菌有较好的抑制作用，同时其易于定殖于植株内或土壌中等特点，故其在植物病害的生物防治中应用较多。同时，菌株产生的内生芽孢抗逆性强，研制成粉剂等剂型使用，可与部分化学杀菌剂混配使用，菌株产生的代谢产物还可促进林木植株的生长，因此，其应用前景宽广。本研宄对油茶主要病害拮抗细菌无抑制作用的化学杀菌剂进行了筛选。首先进行了６种化学杀菌剂对油茶炭疸病菌和软腐病菌的室内毒力测定，对于炭疽病菌，抑制作用强弱依次为多菌灵、苯醚甲环唑、甲基硫菌灵、醚菌酯、百菌清和代森锰锌，它们ＥＣ５０分别为０．７３８ｍｇ／Ｌ、０．９６３ｍｇ／Ｌ、２．４２５ｍｇ／Ｌ、５．２４１ｍｇ／Ｌ、８６一ｍｍ［］致１２．４９５ｇ／Ｌ、４１．８８２ｇ／Ｌ，这与刘伟的研究结果相。对于软腐病菌，抑制作用强弱依次为苯醚甲环唑、多菌灵、醚菌酯、百菌清和代森锰，甲基硫菌灵锌．ｍ／Ｌ、１４ｍ／Ｌ、１．００２ｍ／Ｌ、１．８２９ｍ／Ｌ、１２．１６６ｍ／Ｌ，ＥＣ５〇分别为０５４２ｇ０．９ｇｇｇｇ和３６．９２１ｍｇ／Ｌ。６种杀菌剂对内生桔抗细菌Ｒ６的菌体和芽孢影响的试验结果表明，甲基硫２１ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研宄菌灵在供试的浓度下，对菌株Ｒ６的菌体和芽孢无影响。因此，甲基硫菌灵可与８７一［］菌株Ｒ６的发酵液或菌剂同时施用或混配施用，这与刘淑娟等人的研宂结果致。代森锰锌和百菌清在供试浓度下对菌株Ｒ６的菌体和芽孢的抑制作用较大，在林间病害的防治过程中应考虑其与菌株Ｒ６的发酵液或菌剂间隔施用。将不同质量浓度的甲基硫菌灵与菌株Ｒ６发酵液混配后，对炭疸病菌的抑制？？率提高了９．９９％３６．２６％，对软腐病菌的抑制率提高了６．６７％１３．１９％，两者混配使用对两种病原菌的抑制作用较单独使用甲基硫菌灵和生防菌均有増强，这与８８李素英等人［］研宂的化学杀菌剂与生防菌株混配使用的防治效果优于单独使用的结果一致。综合考虑６种杀菌剂对两种病原菌的抑制作用的大小以及它们在供试浓度下对拮抗细菌Ｒ６菌体及芽孢的影响，筛选出甲基硫菌灵作为与菌株Ｒ６混配的化学杀菌剂进行后续研宄。２２ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究３油茶主要病害拮抗细菌Ｒ６的发酵工艺优化在微生物的发酵生产中，其生产水平与发酵菌种本身的特性有关，同时，菌株的发酵培养基和发酵条件对其也有着至关重要的作用。在合适的发酵条件下，菌株才能充分发挥其生产能力，提高发酵过程中的效率，从而降低生产成本。因此，微生物发酵培养基和发酵条件优化是其发酵产品产业化过程中重要的环节。一种非常有效的优化试验的方法响应面分析法是。它不但克服了单因素试验带来８９＿９１［］的弊端还能在较少的试验次数和较短的时间内对其进行比较全面的分析，现９２＿９４［］己广泛的应用于微生物发酵培养基成分和发酵条件的优化研究中。因此，本研宄采用响应面分析法来优化菌株Ｒ６的发酵培养基成分和发酵条件，提高发酵液的菌体浓度和对病原菌的抑菌活性，为微生物菌剂的大规模生产奠定基础。３．１实验材料（３丄１指示菌株同２．１．１。３．１．２供试菌株２。同２．１．３．１．３仪器设备培养箱－（ＨＷＳ型，宁波江南仪器厂）、ｐＨ计（ＰＨＳ３Ｂ，上海宇隆仪器有限公司－Ｘ２８０）、超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、恒温振荡培养箱（ＨＺＱ，太仓市华美生化仪器厂）、紫外可见分光光度计（７２２Ｓ，上海著华科技仪器有限公司）等。３．２实验方法３．２．１菌株Ｒ６种子液的制备°Ｒ—将活化好的菌株６环接种到ＮＢ培养基中（装液量４０ｍＬ／１００ｍＬ），３０Ｃ恒温振荡（１６０ｒ／ｍｉｎ）培养２４ｈ。２３ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研宄３．２．２菌株Ｒ６发酵液菌体浓度的测定一以空白的ＮＢ培养基作为对照，吸取定量的Ｒ６菌株发酵液于比色皿中，在可见分光光度计（７２２ｓ）上测定波长为６００ｎｍ时，发酵液的０Ｄ值，用其大小９５［］来表示发酵液中菌体的浓度。３＿２．３菌株Ｒ６发酵液抑菌活性的测定吸取菌株Ｒ６的发酵液０．０５ｍＬ至ＰＤＡ培养基中央，用涂布棒将其涂布均匀＝丝面向上后，分别挑取病原菌菌饼（直径６ｍｍ）于ＰＤＡ平板中央，菌。以不涂°布Ｒ６菌株发酵液，只接病原菌菌饼的平板作为对照组。在２８Ｃ下恒温培养５ｄ，采用十字交叉法测量各处理菌落直径（单位＿）．１，根据公式２计算抑菌率，每个处理做三个重复。３．２．４菌株Ｒ６发酵培养基的优化３．２．４．１不同碳源对枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响称取葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、蔗糖和丙三醇各３ｇ／Ｌ替换ＮＡ培养基中的碳源，将种子液以５％的接种量分别接入配好的发酵培养基中（装液量°４０ｍＬ／１００ｍＬ），３０Ｃ恒温振荡（１６０ｒ／ｍｉｎ）培养４８ｈ，测量各个样品的ＯＤ６〇〇值和抑菌活性，方法同３．２．２和３．２．３。每个处理做三个重复。３．２Ａ２不同氮源对枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响以分别称取牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、（ＮＨ４）２Ｓ０４和ＫＮＯ３１０ｇ／Ｌ替换ＮＡ培养基中的氮源，将种子液以５％的接种量分别接入配好的发酵培养基中（装液量°４０ｍＬ／１００ｍＬ），３０Ｃ恒温振荡（１６０ｒ／ｍｉｎ）培养４８ｈ，测量各个样品的ＯＤ６〇〇值．和抑菌活性，方法同３．２．２和３．２３。每个处理做三个重复。３．２Ａ３不同无机盐对枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响称取ＮａＣｌ、ＫＣ１、ＣａＣｌ２、Ｋ２ＨＰ〇ｄｎＭｇＳ０４５ｇ／Ｌ替换ＮＡ培养基中的无机盐，将种子液以５％的接种量分别接入配好的发酵培养基中（装液量°４０ｍＬ／１００ｍＬ），３０Ｃ恒温振荡（１６０ｒ／ｍｉｎ）培养４８ｈ，测量各个样品的ＯＤ６〇〇值和抑菌活性．２．２和３．２．３。每个处理做三个重复。，方法同３３－．２．４．４ＨａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ筛选试验２４ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究一应用Ｍ三因素两水平的Ｐｌａｃｋｅｔ－ｒｍａｎｉｎｉｔａｂ１６．０软件设计个Ｂｕ试验，在葡萄糖、酵母膏和硫酸镁三个因子中用最少的试验次数估计出各因素的效应值，来一进行下一步的优化研宄－。各因素取两个水平即高水平（＋）和低水平（），９６［］－般来说，高水平是低水平的１．０１．５倍。选用菌体浓度即ＯＤ６Ｍ作为响应值（Ｙ）。３．２Ａ５最陡爬坡试验Ｐ－过根据ｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ试验设计的的结果，进行最陡爬坡试验的设计，通让主因素同时朝００＿增大的方向变化来找到极值点，从而逼近最大响应区域。３－．２．４．６ＢｏｘＢｅｈｎｋｅｎｄｅｓｉｇｎ试验－应用Ｍｉｎｉｔａｂ１６．０进行ＢｏｘＢｅｈｎｋｅｎｄｅｓｉｇｎ（ＢＢＤ）试验的设计，该法的每个－因素选，用（１０１）编码的三个水平，试验数据通过二次回归拟合后得到二，，次方程，通过分析方程中各个因素的主效应和交互效应获得最佳值。３．２Ａ７响应面模型的验证试验利用优化得到的最佳发酵培养基进行菌株Ｒ６的发酵，测定发酵液的菌体浓度和对两种病原菌的抑菌活性，每个处理重复三次，来验证模型的可靠性，进而得出最终的优化结果。３．２．５菌株Ｒ６发酵培养条件的优化３．２．５．１不同初始ｐＨ值对枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响一ＮａＣ在获得的最佳发酵培养基中分别加入定量的ｌｌｍｏｌ／ＬＨＣ１和ｌｍｏｌ／Ｌ调节其初始ｐＨ值为５．０至９．０五个梯度，再将种子液以５％的接种量分别接入上°Ｃ述发酵培养基中（装液量４０ｍＬ／１００ｍＬ），３０恒温振荡（１６０ｒ／ｍｉｎ）培养４８ｈ，值和抑菌活性．２．。测量各个样品的０Ｄ，方法同３２和３．２．３６（Ｋ）每个处理做三个重复。？３．２．５．２不同培养时间对枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响一Ｈ至在获得的最佳发酵培养基中，加入定量的ｌｍｏｌ／ＬＮａＣｌ调节其初始ｐ最适ｐＨ，再将种子液以５％的接种量分别接入上述发酵培养基中（装液量°４０ｍＬ／１００ｍＬ），３０Ｃ恒温振荡（１６０ｒ／ｍｉｎ）培养６０ｈ，从第１２ｈ开始每隔１２ｈ测量各个样品的ＯＤ６Ｃ（）值和抑菌活性，方法同３．２．２和３．２．３。每个处理做三个重复。３．２．５Ｊ不同培养温度对枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响２５ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究在获得的最佳发酵培养基中一，加入定量的ｌｍｏｌ／ＬＮａＣｌ调节其初始ｐＨ值至最适ｐＨ，再将种子液以５％的接种量分别接入上述发酵培养基中（装液量°°°°°４０ｍＬ／１００ｍＬ），在２４Ｃ、２７Ｃ、３０Ｃ、３３Ｃ和３６Ｃ的培养温度下，按照筛选得到的最佳培养时间恒温振荡（１６０ｒ／ｍｉｎ）培养，测量各个样品的ＯＤ６Ｑ（）值和抑菌活性，方法同３．２．２和３．２．３。每个处理做三个重复。３．２．５．４不同摇床转速对枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响在获得的最佳发酵培养基中一，加入定量的ｌｍｏｌ／ＬＮａＣｌ调节其初始ｐＨ值至最适ｐＨ，再将种子液以５％的接种量分别接入上述发酵培养基中（装液量４０ｍＬ／１００ｍＬ），按照筛选出的最佳培养时间和培养温度１４０ｒ／ｍｉｎ、１６０ｒ／ｍｉｎ、，在１８０ｒ／ｍｉｎ、２００ｒ／ｍｉｎ和２２０ｒ／ｍｉｎ下恒温振荡培养，测量各个样品的ＯＤ６〇〇值和抑菌活性．２．２和３．２。三。，方法同３．３每个处理做个重复３．２．Ｒ６．５５不同接种量对枯草芽孢杆菌菌体浓度和抑菌活性的影响一ＮａＣｌ在获得的最佳发酵培养基中，加入定量的ｌｍｏｌ／Ｌ调节其初始ｐＨ值至最适ｐＨ，再将种子液分别以４％、５％、６％、７％和８％的接种量分别接入上述发酵培养基中（装液量４０ｍＬ／１００ｍＬ），按照筛选出的最佳培养条件恒温振荡培养，测量各个样品的〇Ｄ６Ｗ）值和抑菌活性，方法同３．２．２和３．２．３。每个处理做三个重复。－３．２ｌａｃｋｅｒｍａｎ选试验．５．６ＰｔｔＢｕ筛一ａｂ６－１．０软件设计ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ试验应用Ｍｉｎｉｔ个五因素两水平的，在初始ｐＨ值、培养温度、摇床转速、培养时间和接种量五个因子中用最少的试验次数筛选出对菌体浓度具有显著影响的几个因子一，来进行下步的优化研究。每个因素的高水平为低水平的１．５倍，选用菌体浓度即ＯＤ６Ｍ作为响应值（Ｙ）。３．２．５．７最陡爬坡试验根据Ｐｃｋｅｔ－Ｂｕｒｍａｎ试验设计的的ｌａ结果，进行最陡爬坡试验的设计，通过让主因素同时朝ＯＤ６（Ｗ增大的方向变化来找到极值点，从而逼近最大响应区域。３－．２．５．８ＢｏｘＢｅｈｎｋｅｎｄｅｓｉｇｎ试验ａｂ－应用Ｍｉｎｉｔ１６．０进行ＢｏｘＢｅｈｎｋｅｎｄｅｓｉｇｎ（ＢＢＤｙ试验的设计，该法的每个因素选三个水平－三二次回归，用（１，０，１）编码的个水平，试验数据通过拟合后得到二次方程，通过分析方程中各个因素的主效应和交互效应获得最佳值。２６ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究３．５．．２９响应面模型的验证试验利用优化得到的最佳发酵条件进行菌株Ｒ６的发酵，测定发酵液的菌体浓度和对两种病原菌的抑菌活性，每个处理重复三次，来验证模型的可靠性，进而得出最终的优化结果。３．３结果与分析３．３．１菌株Ｒ６发酵培养基的优化３．３．１．１不同碳源对枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响碳源作为菌株生长中需要量最大的营养物质，它不但是构成菌体细胞成分及代谢产物中碳素来源一，也是菌株生命活动中能量的提供者。般情况下，微生物可以利用多种碳水化合物作为碳源，但是不同种类的碳源对微生物的生长繁殖和代谢产物表达的能力存在较大的影响。不同的碳源对菌株Ｒ６的菌体浓度和抑菌活性的影响结果见图３．１。＋Ｄ６〇Ｃ＋〇油茶炭疽病菌抑菌率油茶软腐病菌抑齒率１．８９０１ｒ．７５丨５－＼－１－２０６八一〇－！＾”４０－－呈０．６３０－－０．３１５！１００麦芽糖可溶性淀粉葡萄糖蔗糖丙三醇碳源图３１．碳源对菌株Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响Ｆｉｇ．３．１ＥｆｆｅｃｔｏｆｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｏｎｃｅｌｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃｒａｔｅｏｆＲ６一由图３．１可知，当以上述５种常用的碳源作为菌株发酵的唯碳源时，菌株Ｒ６以葡萄糖作为碳源时菌体浓度及对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑制率最高。其次为蔗糖一、可溶性淀粉、麦芽糖和丙三醇。其中以丙三醇作为唯碳源时菌体浓度和对两种病原菌的抑制率为最低。因此，菌株Ｒ６发酵培养基的最佳碳源选用葡萄糖。２７ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究３．３．１．２不同氮源对枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响氮源主要是用于微生物含氮代谢产物和细胞物质如蛋白质和核酸等的合成。不同种类的氮源对菌株Ｒ６的菌体浓度和抑菌活性的影响结果见图３．２。一－ＯＤ６００—油茶炭疽病菌抑制率＋油茶软腐病菌抑制率．１８９０「ｑ＾－７５－．，１２＼６０＾＿４卜，５｜＾－－０．６３０－－０．３１５００牛肉膏蛋白胨酵母膏硫酸铵硝酸钾氮源图３．２氮源对菌株Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响Ｆ．３．２ＥｔｉｒｅｎｓｏｕｒｃｅｏｎｃｅｃｏｎｃｅｎｎａｎｄｃｅｒｏｓａｃｒａｅｏｆＲ６ｉｇｆｆｅｃｏｆｎｔｏｇｌｌｔｒａｔｉｏｂａｔｉｔｔｉｔ３一．２可知由图，菌株以有机氮源作为唯氮源时，发酵液的菌体浓度和对病原菌的抑制率都优于无机氮源。菌株以酵母膏作为氮源时菌体浓度及对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑制率最高，这是由于酵母膏中含有丰富的维生素、氨基酸和未知的生长因子一氮源时菌体浓度和对两种病原菌的抑制率为。以硝酸钾作为唯最低，选取酵母膏作为菌株Ｒ６。因此发酵培养基的最佳氮源。３．３．１．３不同无机盐对枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响无机盐是微生物在生长过程中必不可少的营养物质，它们的主耍作用是维持细胞结构的稳定性、控制细胞氧化还原电位和为某些微生物的生长提供能源等。不同种的微生物所需的无机元素的种类和浓度差别很大。不同的无机盐对Ｒ６菌株的菌体浓度和抑菌活性的影响结果见图３．３。３一由图．３，当以５种不同的无机盐作为菌株发酵的唯可知无机盐时，菌株以硫酸镁作为无机盐时菌体浓度及对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑制率最髙。其次为氯化钠、氯化钾、氯化钙和磷酸二氢钾。其中以磷酸二氢钾作为无机盐时菌体浓度和对两种病原菌的抑制率为最低。因此，选取硫酸镁作为菌株Ｒ６发酵培养基的最佳无机盐。２８ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究■■ＯＤ６００一？一油汆炭疽病囷抑制率一油茶软腐病抑制率．１８９０「］Ｌ．１５７５Ｊｊ？１－２ｔ－６０／ｓ§Ｓ－、１！０－．９４５勝Ｂ｜和－－０．６３０－－０．３１５！！＇０〇氯化钾氯化钠硫酸镁氯化钙磷酸氢二钾无机盐图３．３无机盐对菌株Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响Ｆｉｇ．３．３ＥｆｆｅｃｔｏｆｉｎｏｒｇａｎｉｃｓａｌｔｏｎｃｅｌｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃｒａｔｅｏｆＲ６．＿３．１．４ＰｔｔＢｕｉｍａｎ．３ｌａｃｋｅ筛选试验通过对Ｐ－Ｂｕｌａｃｋｅｔｔｒｍａｎ筛选试验的结果（表３．１）进行方差分析得到的多元＝一线性回归方程为：０Ｄ６１．１４２００＋０．２３４６３＋０．１９１８２０．０５５４５（Ｋ）葡萄糖酵母膏硫酸镁。表３．１ＰＢ试验设计与结果Ｔａｂ．ｍｅｎｌｅ３１ＥｘｅｒｅｓｎａｎｄｒｅｓｕｓｏＢｄｅｓｎｐｉｔｄｉｇｌｔｆＰｉｇ处理葡萄糖（ｇ／Ｌ）酵母膏（ｇ／Ｌ）硫酸镁（ｇ／Ｌ）ＱＤ６〇ｑ１４．５１０．０７．５０．９１６２４．５１５．０５１．６５７．０３３．０１５．０７．．５０９７３．５０．０７４４１．５１．０８４５４．５１５．０５．０１．７０１６４．５１５．０７．５１．５８４７３．０１５．０７．５０．７１４８３．０１０．０７５１．２４８．９３．０１０．０５．００．５５７１０４．５１０．０５．０１．３１８１１３．０１５．０５１．．０３７４１２３．０１０．０５．００．５７８在方程中，葡萄糖和酵母膏的系数分别是＋０．２３４６３＋０．１９１８２和，均为正数，－０即葡萄糖和酵母膏对菌体浓度呈正效应。硫酸镁的系数为．０５５４５，为负数，即硫酸镁对菌体浓度呈负效应一定范围内适当的增加葡萄糖和酵母膏。因此，在２９ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究的用量，减少硫酸镁的用量能使菌体浓度增加。３３．１．５．最陡爬坡试验根据Ｐｌａｃｋｅｔ－Ｂｕｒｍａｎ试验的分析结果确定的各因素的作用效果设计了最陡爬坡试验．２，，在表３中可以看出处理２中的发酵液菌体浓度最高，即当葡萄糖（５ｇ／Ｌ）、酵母膏（１４ｇ／Ｌ）硫酸镁（７ｇ／Ｌ）时，在发酵液菌体浓度最大值附近。Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ因此，ｄｅｓｉｇｎ的零水平点选用处理２中各因素的水平进行设计。表３．２最陡爬坡试验结果Ｔａｂｌｅ３．２Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｓｔｅｅｅｓｔａｓｃｅｎｔｔｅｓｔｐ／Ｌ）硫酸镁（／Ｌ）酵母膏（／Ｌ）０Ｄ６Ｋ处理葡萄糖（ｇｇｇ）（１４．０８０１２．０１．５９９．２５．１．．７．０７０４０１０２３６０．０．６７９．６１６．０１３－ｅ．３．１．６ＢｏｘＢｈｎｋｅｎｄｅｓｉｇｎ试验根据Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎｄｅｓｉｇｎ中心组和设计的原理，以筛选出的葡萄糖、酵母膏和硫酸镁这三个因子，设计三因素三水平的响应面分析试验中心点设置三次重复。试验设计见表３．３。表３．３响应面试验的设计与结果Ｔａｂｌｅ３．３Ｔｈｅｄｅｓｉｎａｎｄｒｅｓｕｌｔｏｆｒｅｓｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅａｎａｌｓｉｓｇｐｙ－－处理Ａ？Ｂ（（ＱＤ葡萄糖（ｇ／Ｌ）酵母膏ｇ／Ｌ）Ｃ硫酸镁ｇ／Ｌ）６〇（／Ｙ１５．０１８．０９．０１．５９４２７．０１８．０１６９７．０７．３３０５８７．１４．０９．０１．４３．０１８．０７．０１．５８２５７０１００７０１．６５３．．．６５．０１４．０７．０１．７２４７５．．０１００９．０１．６８２８３．０１４．０５．０１．４９９９５．０１００５．０．．１５６４１０７０３．０１４．０９．１．５９１１３．０１０．０７．０１．４９５１２．０１５．０１４．０７．７１９１３５．０．７．０１４．０７１２５１４５．．０１８０５．０１．４７６１５７１４００１．６９５＾＾ｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎｄｅｓ根据Ｂｉｇｎ试验得到的结果（表３．３），利用Ｍｉｎｉｔａｂｌ６．０对数据３０ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究进行响应面回归分析，得到的以０Ｄ６Ｍ为响应值的回归方程：２２２＝－Ｙ－＋－－１６０２１９＋０４８８８０６７１２Ｂ＋０Ｃ０．０３９０６１＋０．．１Ａ．１．２６１１３Ａ０．００５５３Ｂ０．００１３Ｃ．００２５３ＡＢ－０－．０１８８１ＡＣ０．００１８８ＢＣ２＝对其进行方差分析见表３．４，此回归方程的相关系数为Ｒ０．９８５９，表明只有２＝１．４１％的变异不能被得到的模型解释。调整后的Ｒａｄ０．９６０５，表明该方程的可信ｊ＜度较高，试验的设计是可靠的。回归模型的Ｐ〇．〇５，此模型回归显著，拟合度好；＝失拟项的Ｐ０．２０２＞０．０５，表示失拟项不显著，说明残差是由随机误差引起的。交影响都是显著的，表明０Ｄ６Ｗ的变化时相当复杂的互因子和单因子对０Ｄ６，试（）（）的）验因子对其影响不是简单的线性关系。表３．４回归方程方差分析表Ｔａｂｌｅ３．４ＡＮＯＶＡｒｅｓｕｌｔｓｆｏｒｔｈｅｅｕａｔｉｏｎｑ＆异的来源自由度平方和均方和Ｆ值Ｐ值显著性＊＊模型９０．１５８０．０１７５３８．８７＜０．０００１＊＊Ａ－１８．００Ｅ４０．０７１３１５８．３２＜０．０００１＊＊Ｂ１０．０１７８０．０２４８５５．０４０．００１＊＊Ｃ－１２．８Ｅ５０．０１５２３３．５９０．００２－ＡＢ－３１１．６４Ｅ３１．６４Ｅ３．６４０．１１５＊－ＡＣ１－２２６２Ｅ２５０．２７０．００１．２６Ｅ．２－ＢＣ１－９．２．０Ｅ４９．０Ｅ４２．０００１７２＜＊＊Ａ．０９０１０１０．０８０７０２００．０８．０００１２＜＊＊Ｂ１０２７０７９０．０２８９１９６４１１．０．９０．０００２Ｃ１０．００６０５６０．００６０５６１３．４４０．０１４＊＊３０．＜线性．０１８６０．０８６０６３５９０．０００１＜０＊＊平方３０．１１４０．０３７９８４．２３．０００１＊＊００２５２４０－８Ｅ３１８６４０００４交互３．．．．失拟３－－１．９３９Ｅ３６．４６Ｅ４４．１２０．２０２２２Ｒ＝＝０‘９８５９Ｒａｄ０．９６０５ｊ３．３．１．７响应面分析法根据响应面法分析数据利用Ｍｉｎｉｔａｂ１６．０绘出了响应面及其等高线图（图３４？３６．．），可以直观的反映出葡萄糖、酵母膏和硫酸镁及其交互作用对ＯＤ６００的影响。在图３．４中当硫酸镁为６．８２ｇ时，葡萄糖从３．０ｇ／Ｌ增大至７．５ｇ／Ｌ，酵母膏从１０．０／Ｌ增大至１７．５／Ｌ的过程中ｇｇ，发酵液的菌体浓度均表现出先增加后减小的趋势，响应面的顶尖即为菌体浓度最大值点。同理，图３．５和图３．６中曲面分别反映了酵母膏和硫酸镁、葡萄糖和硫酸镁的交互作用。利用Ｍｉｎｉｔａｂｌ６．０软件对表３．３中数据进行分析，得出发酵液最大ＯＤ６Ｍ为１．７５９。此时，试验各因子的３１ 中南林业科技大学硕上学位论文油茶主耍病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究取值分别为葡萄糖５．０２ｇ／Ｌ、酵母膏１５．１０ｇ／Ｌ、硫酸镁６．８２ｇ／Ｌ。ＯＤ６００綱的ＺＤ、ｓ土公４，５１０．０４６７６．＇０３５７＿５ＡＬＡ：葡萄蒱（ｇ／Ｕ：葡萄辖（ｇ／）图３．４Ａ（葡萄糖）和Ｂ（酵母膏）对ＯＤ＿值影响的响应面及等高线图Ｆｉ．３．４Ｓｕｒｆａｃｅｌｏａｎｄｃｏｎｔｏｕｒｌｏｏｆｔｃｏｍｅｄｅｅｃｓｏｆｕｃｏｓｅａｎｄｘｔｒｇｐｔｐｔｈｅｂｉｎｆｆｔｇｌｙｅａｓｔｅａｃｔ，．￣＇觀ｒ￣—＾￣—＊＾―￣／６．０５ｒ１０〇ｙｉｔ１１１１＇＾１２．＾＾５１０１１１２１３１４１５１６１７１８７Ｂ：Ｓ＃ｗ（Ｌ）１＇５ｇ／ＢＬ：Ｓ母腎Ｕ／）图３．５Ｂ（酵母膏）和Ｃ（硫酸镁）对ＯＤ６ａＱ值影响的响应面及等高线图Ｆｉｆａｌｆｉｆｆｉｇ．３．５Ｓｕｒｃｅｏｔａｎｄｃｏｎｔｏｕｒｌｏｔｏｔｈｅｃｏｍｂｎｅｄｅｅｃｔｓｏｆｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔａｎｄｍａｎｅｓｕｍｐｇｐｙｓｕｌｆａｔｅ°二：歐」１４．５３４５６７６＞０７－５Ａ：葡萄糖Ｌ）Ａ（ｇ／：葡萄稽（ｇ／Ｌ）图３．６Ａ（葡萄糖）和Ｃ（硫酸镁）对ＯＤ＿值影响的响应面及等高线图Ｆ．．ｉｌｆａｔｅｉ３６Ｓｕｒｆａｃｅｌｏｔａｎｄｃｏｎｔｏｕｒｌｏｔｏｆｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｅｆｆｅｃｔｓｏｆｌｕｃｏｓｅａｎｄｍａｎｅｓｕｍｓｕｇｐｐｇｇ３２ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究３．１．８．３模型验证试验为了进一步的检验响应面分析法的可靠性，利用优化的条件进行３次发酵试验，．７５１近测得发酵液的平均０Ｄ６为１，菌体浓度较（）Ｇ，与模型的预测值十分接优化前提高了１９．２０％，对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑菌率也分别达到了８０．３２％和６７．７９％５．３１％。，较优化前分别提高了１３．６％和１２说明响应面分析法对Ｒ６菌株发酵条件进行优化是准确可靠的。优化后得到的拮抗细菌Ｒ６菌株的发酵培养基配方为：葡萄糖５２／、５Ｌ、硫６．８２Ｌ。．０ｇＬ酵母膏１．１０ｇ／酸镁ｇ／３．３．２菌株Ｒ６发酵培养条件的优化３．３．２．１不同初始ｐＨ值对枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响发酵液的ｐＨ值对微生物的生长代谢影响很大。它不仅影响着微生物对营养物质的吸收还影响参与代谢反应中多种酶的代谢活性等。不同种类微生物的最适ｐＨ不同，同种微生物的不同生长阶段等的最适ｐＨ值也不同。由于本试验采用摇瓶发酵进行条件优化，在发酵的过程中摇瓶发酵液的ｐＨ是不断发生变化的，难以控制。所以只研宄了发酵液的不同初始ｐＨ值对菌体浓度和抑菌活性的影响。不同的初始ｐＨ值对菌株Ｒ６的菌体浓度和抑菌活性的影响结果见图３．７。—■一ＯＤ６００—？一油茶炭痕病菌抑制率一＊一油茶软腐病菌抑制率２ｒ－９０１７５＿１６§０，－雲－３００４－－５１１０〇５６７８９初始ｐＨ图３．７初始ｐＨ对菌株Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响Ｆ．３．ＥＨｉｇ７ｆｆｅｃｔｏｆｉｎｉｔｉａｌｏｎｃｅｌｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｂａｃｔｅｒｏｓａｃｒａｏｆＲｐｉｔｔｉｔｅ６由图３，Ｈ值在．．７可知当初始５．０至８０之间时ｐ，随着发酵液初始ｐＨ值的增加，菌体浓度和抑菌效果逐渐増加，当初始ｐＨ值达到８时，菌体浓度和抑菌效果都达到最大。初始ｐＨ值大于９．０时，菌体浓度和抑菌效果明显下降。３３ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究３．．．２２２不同培养时间对枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响培养时间对菌株Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响如图３．８所示，菌株Ｒ６的菌体浓度在培养１２ｈ至３６ｈ时逐渐增加，在３６ｈ时达到最大，３６ｈ至４８ｈ相对稳定，４８ｈ至６０ｈ呈现逐渐下降的趋势。菌株Ｒ６发酵液对炭疽病菌和软腐病菌的抑制活性最好是培养６０ｈ。由此可知，菌株Ｒ６的抑菌物质的产生是在菌体生长的稳定期之后的衰亡期，此时菌株Ｒ６菌体发生死亡，大量次生代谢物质被释放。因此，Ｒ６菌株发酵液对两种病原菌抑菌活性达到最优时的培养时间为６０ｈ。—一ＯＤ６００油茶炭疽病菌抑制率＋油茶软腐病菌抑制率２９０「１＂－－ＩＩＩ§０－．８業１－３００－ｕ４－１５１！＇００１２２４３６４８６０培养时间（ｈ）图３．８培养时间对菌株Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响Ｆｉｇ．３．８ＥｆｆｅｃｔｏｆｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅｏｎｃｅｌｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃｒａｔｅｏｆＲ６３．２．２．３不同培养温度对枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响培养温度对微生物生长代谢的影响主要是通过改变酶反应的速率一。在定范一，培养温，酶反应的速率増大围内度升高，生长代谢加快。酶作为种生物催化，在高温下易变性失活，剂，菌体生长代谢减缓营养体和芽孢都难以形成。不同的培养温度对菌株Ｒ６的菌体浓度和抑菌活性的影响结果见图３．９。由图３．９可知，培养温度对菌株Ｒ６的菌体浓度和抑菌活性影响较大。菌株的最佳培养温度是°°°３０Ｃ，其次是３３Ｃ。在培养温度为２４Ｃ时，菌株Ｒ６的菌体浓度较小，对病原菌的抑制效果也较差，这可能是培养温度低，微生物生长代谢中酶的活力等降低引起的。３４ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究—０＿＋油茶炭疸病菌抑菌率油茶软腐病菌抑菌率２９０１「７５－１６！￣４５＃ａ００．８蓰「－＾３０°－＇４－１５！０！〇２４２７３０３３３６培养温度°Ｃ（）图３．９培养温度对菌株Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响Ｆｉ．３．９ＥｆｆｅｃｔｏｆｃｕｌｔｕｒｅｔｅｍｅｒａｔｕｒｅｏｎｃｅｌｌｃｏｎｃｅｎｒａｔｏｎｎｄａｃｅｒｏａｔＲ６ｇｐｔｉａｂｔｉｓｔｉｃｒａｔｅｏｆ３．２．２．４不同摇床转速对枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响发酵中摇床转速的高低直接影响着发酵液的溶氧，溶氧对微生物的生长繁殖，十分重要当摇床转速低时，发酵液溶氧低，菌体会死亡。而转速过高时，摇瓶中的发酵液易飞派而被污染。试验设计了５个摇床转速进行试验，如图３．１０所示结果表明当摇床转速为１７０ｒ／ｍｉｎ时，菌株Ｒ６的菌体浓度最高，抑菌活性最好。—■一ＯＤ６００＋油茶炭疽病菌抑菌率一＊－油茶软腐病菌抑菌率２９０「１７５１６＿ｇ１．２苎匕二＇４５§ｍ°０－－８奪－３００４－＿１５０〇１４０１５０１６０１７０１８０摇床转速（ｒ／ｍｉｎ）图３．１０摇床转速对菌株Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响Ｆｉｇ．３．１０ＥｆｆｅｃｔｏｆｒｏｔａｔｉｏｎｓｐｅｅｄｏｎｃｅｌｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃｒａｔｅｏｆＲ６３．２．２．５不同接种量对枯草芽孢杆菌Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响一接种量的大小与菌体的生长代谢密切相关。在定范围下，随着接种量的加一，菌体可加速成为群体优势大，使延迟期缩短。对Ｔ某特定种类的微生物，其３５ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究接种量的多少与自身的生理特性和其在培养液中处于的生长时期有关。不同的接种量对菌株Ｒ６的菌体浓度和抑菌活性的影响的试验结果表明（如图３．１１所示）接种量为５％时，Ｒ６菌株的菌体浓度最大，抑菌活性最好。一ＯＤ６００一＋—＞油茶炭疽病菌抑制率油茶软腐病菌抑制率２９０「１■７５－１．６＾＿＾ｒ：１｜§〇，－ｔ１－３００４－－，５：：！！００４５６７８％接种量（）图３．１１接种量对菌株Ｒ６菌体浓度和抑菌活性的影响Ｆｉｇ．３．１１ＥｆｆｅｃｔｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｅｏｎｃｅｌｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃｒａｔｅｏｆＲ６３－＿３＿２．６ＰｌａｃｋｅｔｔＢｕｍｉａｎ筛选试验通过对Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ筛选试验的试验结果（表３．５）进行方差分析，在方＝＝差分析的结果中可以看出（表３．６），初始ｐＨ（Ｐ０．０２５）、摇床转速（Ｐ０．００１）＝（Ｐ〇〇９３）和培养温度．这三个因素对菌体浓度的影响较显著。表３．５ＰＢ试验设计与结果Ｔａｂ．ｉｍｅｎｌｅ３５ＥｘｅｒｄｅｓｉｎａｎｄｒｅｓｕｌｆＰＢｄｅｓｉｎｐｔｇｔｓｏｇ摇床转速±咅养温度±咅养时间接种量■難ＴＴ．〇（ｒ／ｍｎ）（ｃ）（ｈ）（％）１７１２０３６３６５０．９０６２７１８０２４３６５１．７９８３５１８０３６２４８１．３０４４７１８０３６２４８１．３９４５７１８０２４３６８１．８０９６７１８０３６２４８１．６０５７５１８０３６３６５１１４．５８５１２０３６３６８１．００８９２０４３６．５１２８１１７３１０７１２０２４２４８１．４４４１１５１８０２４２４５１．５７８１２５１２０２４２４５０．９１３３６ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研宄＝＋０＋进而得到了回归方程：ＯＤ１．３７０３．１２２２０．２３０７摇床转速６（Ｘ）初始ｐＨ－０＋．０８１９１培０７８８１培＋０．０１９９９养温度．０养时间接种量，在该多元线性回归方程中，初始ｐＨ和摇床转速的系数分别是＋０．１２２２和＋０．２３０７，培养温度的系数为－０．０８１９１Ｈ和摇床，呈现负效，初始转速对ＯＤ６ＧＤ呈现正效应培养温度对ＯＤ６Ｋｐ（ｉ应。即适当的加大初始ｐＨ和摇床转速，降低培养温度能够使ＯＤ＿的值增加，也就是菌体浓度的增加。其他两个因素对菌体浓度影响不显著，因此维持在低水平。表３．６ＰＢ试验结果方差分析表Ｔａｂｌｅ３．６ＴｈｅＶＮｉｎＡＮＯｏｆＰＢｄｅｓｇ来源自由度平方和均方和ＦＰＨ１０７９１２．．．初始．１０１７９１２１８８６００２５ｐ摇床转速１０．６３８６２０．６３８６２４３１．６００．００１培养温度１０．０８０５１０８３０．０９３０．０８０５．９８培养时间１０．０７４５３０．０７４５２９３．６９０．１０３接种量１００４８００４７９６．．００．００２４０．６４３残差６０．１２１２５０．０２０２０８２合计１１１．０９８８３．３．２．７最陡爬坡试验－最陡爬坡试验根据ＰｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ试验的分析结果（表３．７），在，设计了表中可以看出－Ｂｅｈｎｋｅｎｄｅｓｉｎ的，处理２为最优的培养条件。因此，Ｂｏｘｇ零水平点选用处理２中各因素的水平进行设计。表３．７最陡爬坡试验结果Ｔａｂｌｅ３．７Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｓｔｅｅｅｓｔａｓｃｅｎｔｔｅｓｔｐ处理初始ｐＨ摇床转速（ｒ／ｍｉｎ）培养温度ＣＣ）ＱＤ６〇〇１７１６０３３１．７２１２８１８０３０１．８６３３９２００２７１．７８３３－ｎ．３．２．８ＢｏｘＢｅｈｎｋｅｎｄｅｓｉｇ试验－ｅｈｎｋｅｎ根据ＢｏｘＢｄｅｓｉｇｎ中心组和设计的原理，以对菌株Ｒ６的菌体浓度影响显著的三个因子即初始ｐＨ、摇床转速和培养温度，设计三因素三水平的响应面分析试验中心点设置三次重复．８。，试验的设计见表３－Ｂｅｈｎｋｅｎ根据Ｂｏｘｄｅｓｉｇｎ试验得到的结果（表３．８），利用Ｍｉｎｉｔａｂｌ６．０对数据进行响应面回归分析：，得到了以ＯＤ６Ｍ为响应值的回归方程３７ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研宄２２＝＋＋０－－－ＯＤ１．０２６８９Ｂ＋０．０４０４７Ｃ．．．６〇〇．９１３６７０．０４２３１Ａ０１３７０６Ａ００７１３６Ｂ０１５５０９２－－０ＡＣ－Ｃ．０１２４ＡＢ００．０２３４８ＢＣ．０２０３８，对其进行方差分析。表３．８响应面试验设计与结果Ｔａｂｌｅ３．８Ｔｈｅｄｅｓｉｇｎａｎｄｒｅｓｕｌｔｏｆｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅａｎａｌｙｓｉｓ°－－ＨＢ－处理Ａ初始摇床转速（ｒ／ｍｉｎ）Ｃ培养温度（Ｃ）ＯＤ／Ｙｐ６０Ｑ１７１６０３０１．６２１２９１６０３０１．７１９３７２００３０１７１６．４９２００３０１．７６５５７１８０３３１．５０６６９１８０３３１．６４２７７１８０２７１．６４１８９１８０２７１．６９７９８６０３３１１２１．６２００３３１．６９６１０８１１８１６０２７１．７２５１２８２００２７１．７１６１３８１８０３０１．９２１１４８１８０３０１．９１４１５８１８０３０１．９０８表３．９回归方程方差分析表Ｔａｂｌｅ３．９ＡＮＯＶＡｒｅｓｕｌｔｓｆｏｒｔｈｅｅｕａｔｉｏｎｑ变异的来源自由度平方和均方和Ｆ值Ｐ值显著性＜＊＊模型９００．０２１６８．．１９４５０９０．０００１＊＊Ａ１０．０１４３０．０１４３５６．４８＜０．０００１－－＜＊＊Ｂ１５．７８Ｅ３５．７８Ｅ３２２．８１０．０００１＜＊＊Ｃ１０．０１３１００．１３１５１．６８０．０００１－－ＡＢ１６．１５Ｅ４６１５Ｅ４．２．４３０．１８０－＊ＡＣ－１１６６１Ｅ３１．６６１Ｅ３６．５５００５１．．＊＊ＢＣ１２－－．２０４Ｅ３２．２０４Ｅ３８．６９００３２．２Ａ０＜＊＊１０．０５４５５７．０５４５５７２７３．５５０．０００１２＊＊Ｂ．０１３１１７０．０１３１１７７４．１４００００１１０＜．２８８０６０＜＊＊１０．０８８８０６Ｃ．０８３５０．２３０．０００１＊＊３０．线性．０３３２０．０３３２４３．６６０００１５６５＜＊＊３０１０．０５２２２０５．７１０．０００１平方．＊＊－－交互３４．４８１Ｅ３１．４９４Ｅ３５．８９０．０４３－－失拟３１．１６９Ｅ３３．９０Ｅ４７．９００．１１４２２Ｒ＝０＝９９３５０８１８．Ｒａ．９ｄｊ３８ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究结果表明（表３．９），此模型可以较好的解释试验数据的变异性，同时，交互因子和单因子对０Ｄ６Ｑ（）的影响都是显著的，表明０Ｄ６（）（）的变化时相当复杂的，试验２＝因子对其影响不是简单的线性关系。回归方程的相关系数为Ｒ０．９９３５，表明此２＝模型回归显著．９８１８，，拟合度好调整后的Ｒ０表明该方程的可信度较高，试；ａ４ｊ＞０验的设计是可靠的。同时，方程的失拟项是０．１１４．０５，失拟项不显著，说明残差是由随机误差引起的，因此该模型稳定。，可以很好的进行预测３．３．２．９响应面分析法根据响应面法分析数据利用Ｍｉｎｉｔａｂｌ６．０绘出了响应面及其等高线图（图３？．１２３．１４）Ｈ值、培养，可以直观的反映出初始ｐ温度和摇床转速及其交互作用对〇Ｄ．１６ＱＱ的影响。在图３２中当培养温度为３０．３３１：时，初始？田直从７．０增大至９．０，摇床转速从１６０ｒ／ｍｉｎ增大至１８０ｒ／ｍｉｎ的过程中，发酵液的菌体浓度均表现出先增加后减小的趋势，响应面的顶尖即为菌体浓度最大值点。同理，图３．１３和图３．１４中曲面分别反映了初始ｐＨ和培养温度、摇床转速和培养温度的交互作用。？一ＯＤ／一一６００？＿＿厂＿ｌ＇４＾１Ｔ８／１＝０７．０７．５８．０８．５９．０＾ＡＡ：獅ｐＨＡ：初始ｐＨ３２图．１Ａ（初始ｐＨ）和Ｂ（摇床转速）对ＯＤ影响的响应面及等高线图６（）（）值Ｆｉｇ．３．１２ＳｕｒｆａｃｅｐｌｏｔａｎｄｃｏｎｔｏｕｒｌｏｔｏｆｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｅｆｆｅｃｔｓｏｆｉｎｉｔｉａｌＨａｎｄｒｏｔａｔｉｎｓｅｅｄｐｐｇｐａＯＤ６Ｏ０。■暴暴Ｓ－５Ｖ０７５．．．３０．８０８５９０ＡｒｌｌｆｅｊＨＳＡ：初始ｐＨ图３．１３Ａ（初始Ｈ）和Ｃ（±咅养温度）对ＯＤ６（Ｋ影响的响应面及等高线图ｐ）值Ｆｉｇ．３．１３ＳｕｒｆａｃｅｐｌｏｔａｎｄｃｏｎｔｏｕｒｐｌｏｔｏｆｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｅｆｆｅｃｔｓｏｆＨａｎｄｃｕｌｔｕｒａｌｔｅｍｒａｔｕｒｅｐｐｅ３９ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究Ｏ３ＭＯ０。＿：麵霞ｌａｓ－＾＾￣￣Ｍ２－—ｐ￣２７４，，＂￣一１匁１６０１６５１７０１７５ＩＳＯ１；５（ｒ／ｍｉｎ）ｅ：ｓ練速ｔｒ／ａｉｒＯ图３．１４Ｂ（摇床转速）和Ｃ（培养温度）对ＯＤ＿值影响的响应面及等高线图Ｆｉｇ．３．１４Ｓｕｒｆａｃｅｐｌｏｔａｎｄｃｏｎｔｏｕｒｌｏｔｏｆｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｅｆｆｅｃｔｓｏｆｒｏｔａｔｉｎｓｅｅｄａｎｄｃｕｌｔｕｒａｌｐｇｐｅｍｅｒａｕｒｅｔｐｔ利用Ｍｉｎｉｔａｂｌ６．０软件对表３．８中数据进行分析，得出发酵液最大００＿为°１．９２１。此时，试验各因子的取值分别为初始ｐＨ８．１３、培养温度３０．３３Ｃ、摇床转速１７１．５２ｒ／ｍｉｎ。结合生产实际情况，将Ｒ６菌株发酵的最佳条件修正为初始ｐＨ８．１０、°培养温度３０．３０Ｃ、摇床转速１７１．５０ｒ／ｍｉｎ。３．２．３．１０模型验证试验为了进一步的检验响应面分析法的可靠性，利用优化的条件进行３次发酵试．，测得发酵液的平均〇Ｄ６９１５，验（Ｘ）为１与模型的预测值十分接近，菌体浓度较优化前提高了９．５６％。对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑菌率也分别达到了９２．５６％７８３１％，．２１０．５Ｒ和．较优化前分别提高了１２４％和０％。说明响应面分析法对６菌株发酵条件进行优化是准确可靠的。３．４小结与讨论影响微生物发酵的因素有很多，包括微生物发酵培养基中为其代谢活动、菌体细胞构建及代谢产物形成提供能量和碳、氮元素的碳源和氮源等，也包括影响微生物生长代谢速率的发酵液的初始ｐＨ、培养温度、摇床转速、接种量和培养时间等。本研究利用响应面法对菌株Ｒ６的发酵培养基组分和发酵培养条件分别进行了研宄。首先通过单因素实验得到了发酵培养基的最佳碳源、氮源和无机盐分别Ｐ－为葡萄糖ｌａｃｋｅｔＢｕｒｍａｎ、酵母膏和硫酸镁。通过试验确定了三个因素的爬坡方４０ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究。向即增加葡萄糖和酵母膏的用量，减少硫酸镁的用量能使菌体浓度增加经过响应面分析，得到的最优培养基组合为／、：葡萄糖５．０２ｇ／Ｌ、酵母膏１５．１０ｇＬ硫酸镁６８２／Ｌ。．ｇ在此条件下，发酵液的０Ｄ６Ｇ（）可达到１．７５１，与菌体浓度的理论最大值１．７５９接近。通过优化，菌体浓度提高了１９．２０％，对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑菌率９７［］分别提高了１３．６５％和１２．３１％。张艳梅对筛选出的棉花黄萎病菌的拮抗细菌ＴＵＢＰ１进行了发酵培养基的响应面优化研宄，优化后拮抗菌ＴＵＢＰ１的抑菌率有了较大的提高，达到了５３．３％。以优化好的培养基组分作为发酵培养基进行了发酵培养条件的优化。通过Ｐｅ－Ｂｕ６ｌａｃｋｔｒｍａｎ试验设计在个因素中筛选出对菌体浓度影响较大的３个重要因素即初始ｐＨ、摇床转速和培养温度，其中初始ｐＨ和摇床转速对００６〇〇呈现正效应，培养温度对〇Ｄ６呈现负效应。通过响应面分析得到的最优发酵条件为：初（）（）°％始ｐＨ８．１０、培养温度３０．３０Ｃ、摇床转速１７１．５０ｒ／ｍｉｎ、接种量５、培养时间２４ｈ。．９１５。在此条件下可达到１．５６％。，发酵液的ＯＤ６通过优化，菌体浓度提高了９（）（）０对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑菌率也分别提高了１２．２４％和１．５０％。这与陆继９８［］等对灰霉病生防菌的发酵条件进行了响应面优化后其菌体浓度即〇Ｄ有臣６Ｑ）（９９［］了明显的增加和张荣胜ｘ－１等对拮抗细菌Ｌ１的发酵工艺进行了响应面法优化，一优化后发酵活菌数和抑菌带宽度都有了显著的増加的研宄结果致。结合生产实际的需要：５．０２／Ｌ、酵，最终菌株Ｒ６的发酵工艺修正为葡萄糖ｇ°母膏１５．１０ｇ／Ｌ、硫酸镁６．８２ｇ／Ｌ、初始ｐＨ８．１０、培养温度３０．３０Ｃ、摇床转速１７１．００ｒ／ｍｉｎ、接种量５％、培养时间２４ｈ。４１ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研宄４油茶内生拮抗细菌Ｒ６可湿性粉剂的研制微生物杀菌剂作为一种利用微生物活体来抑制植物病原菌的生长或杀死植物病原菌的制剂，因其在抑制或杀死病原菌的同时还能保护周围环境的生物多样。、性，现己在林木病害防治领域中得到广泛应用可湿性粉剂因其具有有效成分高生产工艺简单和成本低等特点，是微生物农药的主要剂型。可湿性粉剂的润湿性和悬浮性直接影响其在林间应用中药液混合的均匀性和便利性，进而影响着可湿性粉剂药效的发挥。因此，它们成为了评价可湿性粉剂质量的重要指标。本文将菌株Ｒ６发酵液研制成可湿性粉剂，将生物相容性、润湿性和悬浮性作为制剂的主要指标，筛选制剂的载体和助剂，最终确定菌株Ｒ６可湿性粉剂的最佳配方。４．１实验材料４．１．１供试原药菌株Ｒ６发酵液（发酵液菌体浓度多Ｚ＾ｘＨ＾ｃｆｕ／ｍＬ，芽孢萌发率彡９８％）４．１．２供试试剂载体（硅藻土、膨润土、高岭土）、助剂（茶枯粉、十二烧基苯磺酸钠、聚乙烯醇、聚乙二醇、木质素磺酸钠、多聚磷酸钠、羧甲基纤维素钠、十二烷基硫－环糊精酸钠）、紫外保护剂（抗坏血酸、腐殖酸、）、稳定剂（碳酸钙、羧甲Ｐ基纤维素钠、磷酸氢二钾）４．２实验方法４．２．１可湿性粉剂的加工工艺°将原药与一定量的载体混合后制得母液Ｃ，经过鼓风干燥５５烘干研磨制得母粉一。母粉中加入定量的润湿剂、分散剂和紫外保护剂等，即得可湿性粉剂。４．２．２初始可湿性粉剂的成分配比４２ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究原药７０％、载体１０％、助剂１０％、稳定剂２％、保护剂０．１％、髙岭土补足＿至１００％〇４．２．３载体的筛选９５］［生物相容性的测定采用平板菌落计数法。将供试载体与牛肉膏蛋白胨培养一基按质量体积比６％混合均匀后灭菌，制成含载体的平板。将供试原药按定比例稀释后，取１００ｕＬ至平板中央，均匀涂布。以牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，°Ｃ培皿中３次重，记６每个处理进行复，置于３０养箱中培养４８ｈ录各培养菌株Ｒ的菌落数。１ＱＱ［］５４５１－２００１和ＧＢ－润湿性和悬浮性的测定分别参照ＧＢ／Ｔ／Ｔ１４８２５２００６。４．２．４助剂的筛选及最佳配比的确定一将母粉分别与８种待筛选的助剂按比例混合制得可湿性粉剂，将制剂按定比例稀释后，取１００ｕＬ至牛肉膏蛋白胨平板中央，均匀涂布，以不添加助剂的处°Ｃ培养理作为对照组，每个处理进行３次重复，置于３０箱中培养４８ｈ，记录各培养皿中菌株Ｒ６的菌落数９润湿时间和悬浮性的测定同４．２．３。从生物相容性好的助剂中筛选出润湿时间短和悬浮率高的两种助剂一，按照定的质量比与原药和载体混合后制得可湿性粉剂，测定制剂的润湿时间和悬浮率，筛选最佳的复配助剂的质量比。４．２．５稳定剂的筛选将母粉与筛选出的分散剂和润湿剂分别与三种待筛选的稳定剂（２％）混合均匀后制得可湿性粉剂°Ｃ的，其中以不加稳定剂的制剂为对照，置于５０条件下，１４ｄ后采用平板菌落计数法测定芽孢的存活率，每个处理重复三次。４．２．６紫外保护剂的筛选将母粉与筛选出的分散剂、润湿剂和稳定剂分别与三种待筛选的紫外保护剂（０．１％）混合均匀后制得可湿性粉剂，其中以不加紫外保护剂的制剂为对照，稀一释至定比例后，取１００ｕＬ至平板中央均匀涂布，在２０Ｗ紫外灯下４０ｃｍ处照射１２ｈ和２４ｈ后，记录各培养皿中菌株Ｒ６的菌落数，计算芽孢的存活率，每个处理重复三次。４３ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究４．２．７Ｒ６可湿性粉剂稳定性的测定°°分别称取１００ｇＲ６可湿性粉剂置于２５Ｃ左右的室温和４Ｃ的冰箱中贮存，每２０ｄ从中取出ｌｇ菌剂采用平板菌落计数法进行活菌数和对病原菌抑菌率的测定，每个处理重复３次，确定可湿性粉剂在贮存期间芽孢含量和对病原菌抑菌活性的变化。４．２．８Ｒ６可湿性粉剂质量指标的测定对研制的Ｒ６可湿性粉剂的ｐＨ值、细度、润湿性和悬浮性进行测定。ｐＨ值１（）Ｃ）］［６０１－５０－和细度的测定分别按照ＧＢ／Ｔ１１９９３和ＧＢ／Ｔ１６１１９９５。润湿性和悬浮性２方法同４．．３。４．３结果与分析４．３．１载体的筛选在可湿性粉剂的配方中，载体占的比例较大。因此，载体与拮抗细菌之间的生物相容性、载体的悬浮性和润湿性对可湿性粉剂的质量影响很大。由表４．１可知，高岭土作为载体时，拮抗细菌芽孢存活率最高，膨润土对拮抗细菌的芽孢影响最大。从可湿性粉剂的润湿性来看，各载体的润湿性均较好，可能是这三种载体的亲水性强，同时表面积较大，导致的吸水性强。三种载体因其颗粒不同，故其悬浮率不同，以高岭土作为载体时，可湿性粉剂的悬浮率最高，悬浮性最好。综合考虑载体与拮抗菌的生物相容性、润湿性和悬浮性等因素，最终选取高岭土作为Ｒ６可湿性粉剂的载体。表４．１载体对可湿性粉剂芽孢和理化性质的影响Ｔａｂｌｅ４．１ＥｆｉＦｅｃｔｓｏｆｆｉｌｌｅｒｏｎｓｐｏｒｅａｎｄｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｗｅｔａｂｌｅｐｏｗｄｅｒ载体存活率（％）悬浮率（％）润湿时间（ｓ）高岭土８７．５０８１１６膨润土５６．２５６３２６硅藻土７９＾７１１９４．３．２助剂的筛选及最佳配比的确定一８种助剂分别与筛选出的载体和发酵液按照定比例混合均匀后制得可湿性粉剂，测定各制剂的润湿性、悬浮性和与拮抗细菌的生物相容性，筛选出两种助４４ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究剂。表４．２助剂对可湿性粉剂芽孢和理化性质的影响Ｔａｂｌｅ４．２Ｅｆｅｃｔｓｏｆａｄｄｉｔｉｖｅｓｏｎｓｐｏｒｅａｎｄｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｒｏｉｅｓｏｆｗｅｔａｂｌｅｏｗｄｅｒｐｐｐｅｒｔｐ助剂的种类润湿时间（ｓ）悬浮率（％）芽孢存活率（％）二１５２１５十烷基苯磺酸钠５９９．聚乙二醇２０６８９０．２３茶枯粉４５３８４１．８０聚乙烯醇３２８２６７．１９木质素磺酸钠２３８０９２．５８多聚磷酸钠３６７１８４３７．羧甲基纤维素钠３９８７９８１．６４十二烷基硫酸钠３１６７１０．５５．２可知由表４，助剂十二烷基苯磺酸钠的润湿性最好，其次为聚乙二醇和木质素擴酸钠，羧甲基纤维素钠的润湿性较差，润湿时间达到３９８ｓ。８种助剂中，聚乙烯醇的悬浮性最好，其次是木质素磺酸钠和羧甲基纤维素钠，茶枯粉的悬浮性最差，悬浮率仅为３８％。生物相容性较好的有十二烷基苯磺酸钠、木质素磺酸钠和聚乙烯醇三种。综合助剂的生物相容性，悬浮性和润湿性来考虑，最终选取木质素磺酸钠作为可湿性粉剂的分散剂，十二烷基苯磺酸钠作为其润湿剂。为了使制得的可湿性粉剂的悬浮性和润湿性最好，测定了分散剂与悬浮剂的不同质量比对制剂润湿性和悬浮性的影响。如表４．３所示，助剂中随着分散剂木质素磺酸钠的质量不断增加，润湿剂十二烷基苯磺酸钠的质量不断较少，制剂的悬浮率不断増加，悬浮性逐渐增强，润湿时间不断增加，润湿性逐渐下降。当分：３时６ｓ散剂与润湿剂的质量比为７，制剂的润湿时间为２，悬浮率达到７８％，综合两种助剂的价格考虑：３。，最终确定可湿性粉剂中分散剂与润湿剂的质量比为７表４．３助剂复配比例对可湿性粉剂理化性质的影响Ｔａｂｌｅ４．３Ｅｆｆｅｃｔｓｆｔｈｅｒｏｒｔｉｏｎｏｆａｄｄｉｔｉｖｅｓｏｎｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｗｅｔａｂｌｅｏｗｄｅｒｏｐｐｏｐｐｐ组别木质素磺酸钠与十二烷基苯磺酸钠的质量比润湿时间（ｓ）悬浮率（％）１１：９１７６１２２：８１８６４３３：７２１６６４４：６２３７１５５：５２４７３６６：４２５７４７７：３２６７８８８：２３０８１９９：１３２８２４５ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究４．３．３稳定剂的筛选可湿性粉剂中的稳定剂作为在一定时间内保持制剂良好理化性质和芽孢含量的助剂，其在可湿性粉剂中是至关重要的。不同稳定剂对可湿性粉剂芽孢存活的影响见表４．４。表４．４不同稳定剂对可湿性粉剂芽孢存活率的影响Ｔａｂｌｅ４．４Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｐｏｒｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓｏｆｗｅｔｔａｂｌｅｐｏｗｄｅｒ处理前芽孢数处理后芽孢数处理稳定剂种类（％＞ｌｏ；ｒｌｏＴ（１０ｃｆｕ／ｇ）（１０ｃｆｕ／ｇ）１碳２３１．１２４１．０３酸钙．７２２５９羧甲基纤维素钠．４７１．４７．５１３磷酸氢二钾２．４８１．４１５６．８５４２．．１２对照组．６３０９５３６在３种稳定剂中，以羧甲基纤维素钠为稳定剂时，芽孢的存活率最高，达到５９．５１％，明显高于对照组。４．３．４紫外保护剂的筛选拮抗细菌可湿性粉剂在林间施用时，阳光中紫外线的直接照射对可湿性粉剂一中活菌体产生了定的威胁。紫外保护剂可以吸收阳光中大量的紫外辐射，同时，还可将吸收的能量转化成热能散发至空气中。因此，为了保证可湿性粉剂林间使用效果，必须添加适宜的紫外保护剂。不同紫外保护剂对可湿性粉剂芽孢存活率的影响见表４．５，可湿性粉剂中添－环糊精作为紫外保护剂时加抗坏血酸、腐殖酸和Ｐ，紫外灯下照射１２ｈ后芽孢的２４ｈ存活率均明显的高于。其中以抗坏血酸作为紫外保护剂时，紫外灯下分别照射－。１２ｈ和２４ｈ后芽孢的存活率为６０．２４％和４９．００％，均高于腐殖酸和卩环糊精表４．５不同紫外保护剂对可湿性粉剂芽孢存活率的影响Ｔａｂｌｅ４．５ＥｆｅｃｔｓｏｆｓｐｏｒｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｗｉｔｈｄｉｆｅｒｅｎｔＵＶｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｇｅｎｔｓｏｆｗｅｔａｂｌｅｐｏｗｄｅｒ处理前１２ｈ２４ｈ￣处理芽孢数芽孢数芽孢存活率芽孢数芽孢存活率１〇１０１Ｑ（ｌ〇ｃｆＷ）ｇ（ｌ〇ｃｆｕ／ｇ）（％）（１０ｃｆｕ／ｇ）（％）２．抗坏血酸．４９１．５０６０２４１．２２４９．００腐殖酸２．４７１．２９５２．２３０．９５３８．４６－２７．Ｐ环糊精．３６１．１２４．４６０．６４２７１２２．．．对照组．４９０６９２７７１０．４２１６８８４．３．５Ｒ６可湿性粉剂稳定性的测定Ｒ６可湿性粉剂的活菌数和对炭疽病菌和软腐病菌的抑菌活性与贮藏时间的４６ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究关系见表４．６。表４．６Ｒ６可湿性粉剂活菌数和抑菌率与贮藏时间的关系Ｔａｂｌｅ４．６Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ，ｖｉａｂｌｅｃｏｕｎｔａｎｄｓｔｏｒａｇｅｔｉｍｅｏｆｗｅｔｔａｂｌｅｏｗｄｅｒｐ贮存贮存时间（ｄ）０２０４０６０８０１００１２０温度ｌｏ活菌数（ｘｌ０ｃｆｕ／ｇ）２．６１２．２３２．０２１．８９１．７８１．６５１．５８°２Ｃ．．５７８５对炭疽病菌抑菌率（％）９０．１４８５．４７８２．８１８０９８８０４．６５７６．４７８１２９７５．５８７３２８７１．０２６９９８６７．６９６５６３对软腐病菌抑菌率（％）．．．．１００／）２６１２４７２．２１．７活菌数Ｏ１ｃｆｕｇ．．６２．０６１．９８４１．６９°４Ｃ对炭疽病菌抑菌率（％）９０．．１４８６３２８５．５９８２．９９８１５３８０．０９９．２９．７８１２９７５２７６４３８８对软腐病菌抑菌率（％）．７８．０６．７７３．７１．９６９．２６．６Ｘ１（）由表４．６，新制备的Ｒ６．６１１０Ｃｆｂ／可知可湿性粉剂中活菌数可达２ｇ，对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑菌率分别达到了９０．１４％和８１．２９％。随着贮存时间的增加，菌剂中活菌数和抑菌率都会降低，在贮存２０ｄ时可湿性粉剂的活菌数量°明显下降，从２０ｄ后可湿性粉剂的活菌数和抑菌率变化不大。在４Ｃ条件下贮藏°°的菌剂活菌数和抑菌活性均高于室温２５Ｃ。在室温２５Ｃ贮存１２０ｄ后菌剂的活菌数也可达芽孢存活率为６０．３１％，对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑菌率分别在７６．４７％和６５．６３％，因此该可湿性粉剂也可在常温下短期贮存。４．３．６Ｒ６可湿性粉剂质量指标的测定通过对菌株Ｒ６可湿性粉剂载体和助剂等进行的筛选，得到了菌株Ｒ６可湿、性粉剂的最佳配方，即原药７０％，分散剂木质素磺酸钠７％润湿剂十二烷基苯磺酸钠３％、稳定剂羧甲基纤维素钠２％、紫外保护剂抗坏血酸０．１％、高岭土补足至１００％。菌剂的Ｈ值７，５９ｓｐ．９细度９６％，润湿时间，悬浮度７９％，符合可湿性粉剂相关的国家标准。４．４小结与讨论微生物农药中生防菌株芽孢的含量、菌剂的润湿性和分散性对其在林间的防效起着决定性的作用，筛选出合适的载体和助剂成为了研宄的关键。通过对制剂的载体和各助剂的的筛选得到的菌株Ｒ６可湿性粉剂的最佳配方为原药７０％，分散剂木质素磺酸钠７％、润湿剂十二烷基苯磺酸钠３％、稳定剂羧甲基纤维素钠２％、紫外保护剂抗坏血酸０．１％、高岭土补足至１００％。４７ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究在可湿性粉剂中，载体占据的比例较大，因此载体本身的润湿性和悬浮性直接影响着制剂的润湿性及悬浮性，载体的价格也直接影响着制剂的生产及其在林间的推广应用。通过研宄发现，在供试的３种载体中，高岭土对芽孢的影响最小，润湿性和悬浮性最好，同时其价格低廉，适于生产使用，故菌株Ｒ６可湿性粉剂１（）１一的载体选取高岭土［］。这与周婷筛选的球孢白僵菌可湿性粉剂的载体致。筛一选的稳定剂羧甲基纤维素钠作为种黏附剂，可增加药液的黏稠度，因此其易于芽孢的生存，同时羧甲基纤维素钠本身具有分散性和吸湿性，还提高了菌株Ｒ６可湿性粉剂的分散性和润湿性。本研宄制备的菌株Ｒ６可湿性粉剂的活菌数为１（）２．６１ｘｌ〇ｃｆｏ／ｇ，制剂对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑制率均在８０％以上。在室温°２５Ｃ贮存１２０ｄ后菌剂对两种病原菌抑菌率均在６５％以上，防治效果稳定。对于一菌株Ｒ一６可湿性粉剂对油茶炭疽病和软腐病的盆栽防效试验下章进步研宄。４８ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究５油茶内生拮抗细菌Ｒ６可湿性粉剂与甲基硫菌灵的协同作用研究在林木病害药剂防治中应用较多的有微生物杀菌剂和化学杀菌剂。近年来，随着生物菌剂产品逐渐被开发并在农林生产中应用，关于林木病害防治己经进入１（）２一［］到了个生物防治与化学防治共存的时代。在化学杀菌剂与微生物菌剂共同作用于林木病原菌的过程中，不同比例之间可能会表现出互相促进或被抑制等多１Ｃ）３１（）４，］［种复杂的关系。因此，筛选出可以与化学杀菌剂复配使用的微生物菌剂的种类和最佳的比例，使其复配使用时表现出协同增效的作用，对于林木病害的防治具有十分重要的意义－。５．１实验材料５．１．１供试杀菌剂甲基硫菌灵可湿性粉剂（有效成分为７０％），菌株Ｒ６可湿性粉剂（活菌数１（）２ｘ约为．６１ｌ０Ｃｆｔｉ／ｇ），百菌清可湿性粉剂（有效成分为７５％）５．１．２供试油茶苗盆栽试验的油茶苗为湘林８９号２ａ。，树龄５．１．３试验地概况各杀菌剂对油茶炭疽病和软腐病的林间防效试验在攸县网岭镇油茶基地进ｘ行。试验基地油茶林龄４ａ，间距为２３ｍ，试验区管理水平较高。５．２实验方法５．２．１Ｒ６可湿性粉剂对油茶炭疽病菌和软腐病菌室内毒力测定２．２．１和２Ｒ６可湿性粉剂采用菌丝生长速率法，按照．２．５的步骤和方法进行对病原菌的室内毒力测定。根据预实验确定的平板中Ｒ６可湿性粉剂的浓度为１００．００ｍｇ／Ｌ、５０．００ｍｇ／Ｌ、２５．００ｍｇ／Ｌ、１２．５０ｍｇ／Ｌ和６．２５ｍｇ／Ｌ５个浓度。４９ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研宄５．２．２Ｒ６可湿性粉剂与甲基硫菌灵最佳复配比的测定采用菌丝生长速率法１：９、，将Ｒ６可湿性粉剂与甲基硫菌灵按照质量比为１：７、１：５、１：３、１：１、３：１、５：１、７：１和９：１均匀混合后得到的复配剂分别为复配剂？Ｆ１Ｆ９，按照２．２．１和２．２．５的步骤和方法进行复配剂的室内毒力测定。通过预实８ｍ／Ｌ、１４．／、７ｍ／Ｌ、验确定制得的平板中复配杀菌剂的浓度为２．５ｇ２５ｍｇＬ．１３ｇ３．５７ｍｇ／Ｌ、１．７９ｍｇ／Ｌ和０．８９ｍｇ／Ｌ６个浓度。根据増效系数法确定复配杀菌剂的相互作用，以增效系数（ＳＲ）来评价两种杀菌剂混用的效果。５．２．３复配杀菌剂对油茶炭疽病和软腐病盆栽防治效果５．２．３．１预防效果的测定将３００倍液、５００倍液和１０００倍液的复配杀菌剂Ｆ８和Ｆ９喷施于油茶叶片５一０ｃｆｉ上定量浓度为１ｉ／ｍＬ的两种病原菌孢子悬浮液分别接种到油茶叶片，再将上，以喷施无菌水代替杀菌剂作为空白对照组，，喷施５００倍液的７５％百菌清３００倍液、５００倍液和１０００倍液的Ｒ６可湿性粉剂和７０％甲基硫菌灵作为药剂对照。°５Ｃ３，３保湿培养２４ｈ后，置于２下培养，每个浓度处理株每个处理次重复。１４ｄ后调查各株油茶的发病情况，按公式（５．１）与公式（５．２）计算病情指数和预防效果。５．２．３．２治疗效果的测定一５将定量浓度为１０ｃＭｍＬ的病原菌孢子悬浮液接种到油茶叶片上，保湿培养２４ｈ后，再将上述浓度的复配杀菌剂Ｆ８和Ｆ９喷施于油茶叶片上，再以喷施无菌水代替杀菌剂作为空白对照组７５％百菌清的５００倍液，３００倍液、５００倍液，°和１０００倍液的Ｒ６可湿性粉剂和７０％甲基硫菌灵作为药剂对照。置于２５Ｃ下培３。１ｄ养，每个浓度处理３株，每个处理次重复４后调查各株油茶的发病情况，按公式（５．１）与公式（５．２）计算病情指数和治疗效果。５０ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究表５．１油茶叶部病害分级标准Ｔａｂｌｅ５．１ＩｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆｇｒｅａｔｓｔａｎｄａｒｄｓｏｆＣａｍｅｌｌｉａｏｌｅｉｌｌｉａｌｅａｆｄｉｓｅａｓｅ发病等级代表的数值病害发生程度Ｉ级０油茶叶片上无可见病症ＩＩ级１叶片病斑面积占总面积的１／４及以下２－ｉｎ级叶片病斑面积占总面积的１／４２／４之间３２／４－Ｗ级叶片病斑面积占总面积的３／４之间Ｖ级４叶片病斑面积在总面积的３／４以上ｘ攻各级病叶的数目各级代表的数值）＝病情指数Ｘ１００（５．１）调查的叶片总数ｘ最高级代表的数值对照组的病情指数－处理组的病情指数＝Ｘ防治效果（％）１００％（５．２）对照组的病情指数５．２．４复配杀菌剂对油茶炭疽病和软腐病林间防治效果５．２．４．１试验的设计方案（１）复配杀菌剂Ｆ８和Ｆ９防治效果的测定：分别使用清水将复配杀菌剂稀释成３００、５００和１０００倍液后进行喷洒处理。（２）ＣＸ１即菌株Ｒ６菌剂防治效果的测定：分别使用清水将菌株Ｒ６菌剂稀释成３００、５００和１０００倍液后进行喷洒处理。（３）ＣＫ２即７０％甲基硫菌灵防治效果的测定：分别使用清水将７０％甲基硫菌灵稀释成３００、５００和１０００倍液后进行喷洒处理。（４）ＣＫ３即化学杀菌剂对照组：使用将７５％百菌清稀释成５００倍液进行喷洒处理。？（５）ＣＫ４即空白对照组．用清水代替以上４种杀菌剂进行喷洒处理。以上各处理均进行３次重复。试验区采用随机区组设计，共设置１１个小的区域，每个小的区域含９株油茶，各个小区域设有保护行。５．２．４．２试验的具体实施方法２一０１４年８月５日进行第次喷洒处理，由于油茶树大小存在差异，每次药液的喷洒量以整株油茶叶片全部润湿为宜。２０１４年８月１５日进行第二次喷洒处理。２０１４年８月２５日进行第三次喷洒处理。５１ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究５．２Ａ３杀菌剂防治效果的调查在第一次二、第次、第三次药剂喷洒前和第三次药剂喷洒１０天后进行油茶病害的调查，共４次。调查时随机选取各区域的５株油茶进行调查，记录油茶叶片发病情况及严重程度等，最终计算病情指数和防治效果。５．３结果与分析５．３．１Ｒ６可湿性粉剂对油茶炭疽病菌和软腐病菌室内毒力测定通过菌丝生长速率法测定了Ｒ６可湿性粉剂对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑制效果。结果表明，Ｒ６可湿性粉剂对炭疽病菌和软腐病菌的抑制效果的差异很５２Ｒ６大（表．）。可湿性粉剂对炭疽病菌和软腐病菌的ＥＣ５Ｑ分别为１．９５６ｍｇ／Ｌ和６．０９２ｍ／Ｌ茶炭疽病菌的抑制效果优于对软腐病菌。ｇ，对油２表５．Ｒ６可湿性粉剂对油茶炭疽病菌和软腐病菌的毒力回归方程Ｔａｂｌｅ５．２ＩｎｄｏｏｒｔｏｘｉｃｉｔｒｅｒｅｓｓｉｏｎｅｕａｔｉｏｎｓｏｆｗｅｔａｂｌｅｏｗｄｅｒＲ６ａａｉｎｓｔＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｙｇｑｐｇｌｏｅｏｓｏｒｉｏｉｄｅｓｄＡａｒｉｃｏｄｏｃｈｍｃａｍｅｌｌｉａｇｐａｎｇｉｕ病原菌毒力回归方程ＥＣ５Ｃ（ｍｇ／Ｌ）９５％置信区间相关系数ｒ＝？０．３５９ｘ＋４．８９５１５６０．油茶炭疽病菌ｙ．９．２６５１４４５１０．９８７＝＋？油茶软腐病菌０６３２３１１．ｙ．７０５ｘ４．４４７，０９２．１．５５３０９５９５．３．２Ｒ６可湿性粉剂与甲基硫菌灵最佳复配比的测定？Ｆ通过菌丝生长速率法测定了复配杀菌剂Ｆ１９在不同浓度下对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑制作用。表５．３不同复配比例的杀菌剂对油茶炭疽病菌毒力回归方程Ｔａｂｌｅ５．３ＩｎｄｏｏｒｔｏｘｉｃｉｔｒｅｒｅｓｓｉｏｎｅｕａｔｉｏｎｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｍｏｕｎｄｆｕｎｉｃｉｄｅｓａａｉｎｓｔｙｇｑｐｇｇＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｌｏｅｏｓｏｒｉｏｉｄｅｓｇｐＥＣ论５。相系增数处理毒力回归方程９５％置信区间：，ｆｆ＝（ｍ／Ｌ）（ｍ／Ｌ）ｍｒＳＲｇｇＦ＝ｘ＋？Ｉｙ１．５１５５．１４７２．３７９２．３６８１．９６９２．８７５０．９６６０．９９５＝＋？Ｆ２ｙ２．０３８ｘ４．５０２１．７５５２．３５４１．４９７２．０５７０．９７０１．３７３＝？Ｆ３１．４４０ｘ＋４．５０１２．２１９２．３３２１．８１２２．７１７０．９７２１．０５１ｙ＝？Ｆ４１．３６２ｘ＋４ｙ．３９４２．７８４２．２８８２．２７５３．４０７０．９５９０．８２２Ｆ＝＋４？５０．９１１ｘ．６３４２．５２３２．１６５１．８６５３．４１４０．９８４０．８５８ｙ＝？＋．１．Ｆ６ｙ０．９２０ｘ４７４２．９０９２．０５５１．３７２２．６５６０９８０１．０７６＝２？Ｆ７１．３９ｘ＋４．５８０２．１８５２．０２０１．７２２２．７７３０．９７９０．９２４ｙ＝＋？Ｆ８ｙ０．８５１ｘ５．００９０．９７５２．００４０．５８９１．６１３０．９８４２．０５５Ｆ９＝＋４？１．４３９ｘ．５７８１．９６５１．９９５１．５９０２．４２９０．９９２１０１５ｙ．５２ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究由表？５．３可知，Ｒ６菌剂与７０％甲基硫菌灵的９个复配比例中，Ｆ１Ｆ７和Ｆ９这８个复配比例的增效系数ＳＲ值在０．５至１．５之间，即Ｒ６菌剂与７０％甲基硫菌灵在这８个比例下对油茶炭疽病菌的抑制作用是具有相加作用的。复配剂Ｆ８的增效系数ＳＲ值为２．０５５大于１．５，即Ｒ６菌剂与７０％甲基硫菌灵在此复配比例下对油茶炭疽病菌的抑制作用是均有增效作用的，此时Ｒ６菌剂与７０％甲基硫菌灵的复配的质量比为７：１。？由表５．４可知，Ｒ６菌剂与７０％甲基硫菌灵的９个复配比例中，Ｆ１Ｆ６这６个复配比例的增效系数ＳＲ值均小于０．５，它们对油茶软腐病菌的抑制作用是具有拮抗作用的。复配剂Ｆ７和Ｆ８的增效系数ＳＲ值在０．５至１．５之间，它们对油１茶软腐病菌的抑制作用是相加作用的，复配剂Ｆ９的增效系数大于．５，即在此复配比例下对油茶软腐病菌的抑制作用是增效作用的，此时Ｒ６菌剂与７０％甲基硫。菌灵的复配的质量比为９：１表５．４不同复配比例的杀菌剂对油茶软腐病菌的毒力回归方程Ｔａｂｌｅ５４Ｉｎｄｏｏｒｔｏｘｉｃｉｔｒｅｓｓｉｏｎｅｕａｔｉｏｎｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｍｏｕｎｄｆｕｎｉｃｉｄｅｓａａｉｎｓｔ．ｙｒｅｑｐｇｇｇＡｇａｒｉｃｏｄｏｃｈｉｕｍｃａｍｅｌｌｉａ处理毒力回归方程３９５％置信区间＾（ｍｇ／Ｌ）（ｍｇ／Ｌ）系数ｒ数ＳＲＦ＝？Ｉ０＋１ｙ．６１６ｘ４．２０６９．４３６０．９９９１０．７４１３５．１６９０．９５７０．０５１＝＋？Ｆ２０．７４２ｘ５．００７６．９８９１．０２３４．９３８９．８９１０．９９３０．１４６ｙ＝？Ｆ３０．６７５ｘ＋４．５４０４．８０５１．０６５３．１９１７．２３４０．９８８０．２２２ｙ＝？Ｆ４０８９９ｘ＋４．８８．９１１１５１ｙ．１７９８．６．９７９０．７０００．９７８０．１４５＝？Ｆ５１６５ｘ＋４１５９０４．９６．４８００．９８３ｙ．２．０９４５．２０４．１７０．３０６＝？Ｆ６０＋．ｙ．９６２ｘ４．３６９４．５２９０．９１４３３７０６．０８６０．９７２０．２０２＝－？Ｆ７ｌ．．ｙ．１６９ｘ４４．３６８３．４６２３．１３３２．６２７４５６４０．９５７０９０５Ｆ８＝？１＋４３．ｙ．３３７ｘ．２１９３．８４１．４６６３．０５７４．８２７０９８７０．９２９＝Ｆ９０＋４？．８２５ｘ６７４２４８５３．８９０３．９１５０．９５４１．５６７ｙ．．１．５７７５．３．３复配杀菌剂对油茶炭疽病和软腐病盆栽防治效果复配杀菌剂对油茶炭疽病盆栽防治效果见表５．５。复配杀菌剂Ｆ８对两种病害均有较好的预防效果和治疗效果。复配杀菌剂Ｆ８在各浓度下对油茶炭疽病的防治效果都优于相同浓度下的菌株Ｒ６可湿性粉剂和７０％的甲基硫菌灵的防治效果。复配杀菌剂Ｆ８和菌株Ｒ６可湿性的３００倍液、５００倍液和１０００倍液对油茶炭疽病的防治效果与７５％百菌清５００倍液相当。复配杀菌剂Ｆ８对油茶炭疽病具有较好的防治效果。５３ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究表５．５复配杀菌剂对油茶炭疽病菌盆栽的防治效果Ｔａｂｌｅ５．５ＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｅｆｆｅｃｔｓｅｆｆｅｃｔｏｆｃｏｍｐｏｓｉｔｅｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｅｓａｇａｉｎｓｔＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｌｏｅｏｓｏｒｉｏｉｄｅｓｉｎｏｔｔｅｄｔｅｓｔｇｐｐ处理预防作用治疗作用￣浓度力＾３情指数预防效果（％）病情指数治疗效果（％）３００倍液０．１．３６７９．５±１５ａ０．３８７７．４士１．３１ａＦ复配剂８５００倍液０．４５７４．０４５７３１．４±０７９ｂ．．２土１．０ｂ１０００〇＿５４６９＿３±１．７０ｄ０．５６０ｃｄｅ倍液．５３６８±０．３００５０７１．２５．２±１．２３ｃ倍液０．．６±１ｃ０．５０７０ｄＣＫ１５００倍液０．５３６９．９±０．９５ｃｄ０．５４６７．９士１．６７ｄｅ１０００倍液０．６３６４．７±１．０８ｅ０．６０６４．３±１．３７ｆ３００倍液０．５２７０．５±１．４０ｃｄ０．４９７０＿８±１．７７ｃＣＫ２５００倍液０．６０６５．９±０．３６ｅ０．５６６６．７±０．８８ｅ１０００倍液０．２２．．．．７１５９．７±１ｆ０７０５８３±０４２ｇＣＫ３５００倍液０．７５５７．４±０．１９ｇ０．７１５７．７±０．６６ｇ－－－ＣＫ４１．７６１．６８’Ｐ＜０５注：同列数据后不同字母表示经Ｄｕｎｃａｎｓ法于．０水平上差异显著，下同。复配杀菌剂Ｆ９对油茶软腐病盆栽防治效果见表５．６。复配杀菌剂Ｆ９对两种一定的预防效果和治疗效果病害均有。复配杀菌剂Ｆ９在各浓度下对油茶软腐病的防治效果都优于相同浓度下的菌株Ｒ６可湿性粉剂和甲基硫菌灵，复配杀菌剂Ｆ９３００倍液、５００倍液和１０００倍液对油茶软腐病的防治效果优于７５％百菌清５００倍液。表５．６复配杀菌剂对油茶软腐病菌盆栽的防治效果Ｔａｂｌｅ５．６ＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｅｆｆｅｃｔｓｅｆｅｃｔｏｆｃｏｍｏｓｉｔｅｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｅｓｉｎｓｔｐａｇａＡｇａｒｉｃｏｄｏｃｈｉｕｍｃａｍｅｌｌｉａｉｎｐｏｔｅｄｔｅｓｔ￣ｉｉ预防作用治疗作用浓度方式病情指数预防效果（％）病情指数治疗效果（％）３００倍液０．５２７４．１±０．９５ａ０．５４７１．．４土０９８ａ复配剂Ｆ９５００倍液０．５６７２．１士１．０８ａｂ０．５８６９．３＋０．６６ｂｃ１０００倍液０．６４６８．２±０．９６ｃｄ０．６３６６．７±０．６９ｄ３００倍液０．７６６２．２土４．０７ｅ０．７３６１．４土０．６４ｅＣＫ１５００倍液０．８３５８．７２ｆ０．８０５７．７ｆ士０．６土１．９３１０００倍液０．９２５４．２土２．１６ｇ０．８９５２．９±１．５９ｆ３００倍液０．６１６９土０ｂ．．１ａｂ．７．７５ｃ０５６７０４±．０１ＣＫ２５００倍液１．００６６．７±１．３７ｃｄ０．６１６７．７±０．６２ｃｄ１０００倍液０１．１ｅ．８５８．２±１．１３ｆ０．７５６０．３±０９ＣＫ３５００倍液０土．．９１５４．７２．０４ｇ０．８５５５．０土０８２ｆ－ＣＫ４２－－．０１１．８９５．３．４复配杀菌剂对油茶炭疽病和软腐病林间防治效果５４ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研宄由于试验基地管理规范、抚育措施合理，油茶长势较好，油茶主要病害的发病率较低。经过调查发现，复配杀菌剂Ｆ９和Ｆ８的３００倍液和５００倍液分别对油茶炭疸病和软腐病的防效均在６７％以上，优于菌株Ｒ６可湿性粉剂的防治效果。油茶喷洒了复配杀菌剂后，油茶炭疽病和软腐病的的发病率和病情指数明显降低。复配杀菌剂３００倍液、５００倍液和１０００倍液的防治效果均优于百菌清的５００。。倍液复配杀菌剂的林间防治效果好，具有应用和推广价值５表．７复配杀菌剂对油茶炭疽病和软腐病林间的防治效果Ｔａｂｌｅ５．７ＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔｅｆｆｅｃｔｓｅｆｆｅｃｔｏｆｃｏｍｏｓｉｔｅｂａｃｔｅｒｉｃｉｄｅｓａａｉｎｓｔｐｇＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓａｎｄＡｇａｒｉｃｏｄｏｃｈｉｕｍｃａｍｅｌｌｉａｉｎｔｈｅｆｏｒｅｓｔ油茶炭疽病油茶软腐病—方式＾防治效果（％）率＾防治效果（％）率（％）＾指数指数＿＿３００倍液５．８３１．４６７４．８士０．７８ａ５．８５１．８８７０．２士１．９１ａ复配剂５００倍液６．６７１．６７７１．２＋１．２１ｂ６．２４２．０８６７．０＋０．９６ｂＦ８／Ｆ９１０００倍液９．０１２．１７６２．５±１．３９ｄ７．６７２．４５６１．２±１．１５ｄ３００７．７１．倍液．５０１８６９．３士０５ｃ８．２９２．５７５９．３土０．７２ｄｅＣＫ１５００８．．１４．３倍液．３３２０８６４．１土０ｄ９９２．６６５７．８±０．５６ｅ１０００倍液９．２６２．３６５９．２土０．４４ｅ１１．４１３．０８５１．２±Ｕ５ｇ３００７８９１．６．０．２±倍液．７９６７．５土０．７８ｃ９２．００６８０．９８ａｂＣＫ２５００８．１３．６．８２２．倍液．５８２６３２土２．００ｄ．２２６４．８土１３９ｃ１０００１１．．０５ｅ倍液．９４２．５１５６．６±０．７０ｆ８４１２．５８５９１±１．ＣＫ３５００１２２．６５５．倍液．７９５４．２士０９９６２．８６５４．７．１ｆ．８ｇ±１３－—ＣＫ４１７７５．７９１６１．１．４．３６３５．４小结与讨论。将微生物杀菌剂与化学杀菌剂复配使用，己逐渐应用于林木病害的防治中本研宄首先测定出菌株Ｒ６可湿性粉剂对油茶炭疸病菌的抑制作用优于对软腐病／／菌，对炭疽病菌的ＥＣ５Ｑ为１．９５６ｍｇＬ，对软腐病菌的ＥＣ５Ｑ为６．０９２ｍｇＬ。在９个复配比例下，复配杀菌剂Ｆ８即Ｒ６菌剂与７０％甲基硫菌灵的质量比。为７：１时，对油茶炭疽病菌的抑制作用是均有增效作用，ＳＲ值为２．０５５复配杀菌剂Ｆ９即Ｒ６菌剂与７０％甲基硫菌灵的质量比为９：１时，对油茶软腐病菌的抑制作用是均有增效作用．５６７。，ＳＲ值为１将两种相容性好的杀菌剂在适宜的比例下一８７，８８［］混合后，其对病害的抑制效果是增加，这与前人的研宄结果致。复配杀菌剂Ｆ８和Ｆ９在各供试浓度下对油茶炭疽病和软腐病的盆栽防效与７５％百菌清５００５５ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研宄倍液相当，都优于相同浓度下的菌株Ｒ６可湿性粉剂和７０％甲基硫菌灵的防治效果。两种复配杀菌剂对油茶炭疽病和软腐病的林间防效均在６７％以上，防治效果好，具有应用和推广价值。Ｆ８和Ｆ９秋季喷洒在油本文只研宂了复配杀菌剂茶林中，对油茶炭疽病和软腐病的防效。为了确定复配杀菌剂Ｆ８和Ｆ９最佳喷洒时间，复配杀菌剂在春季病一步的研究害发生前喷施对病害的防治效果还有待于进。同时喷施的复配杀菌剂Ｆ一起的防效也有待于进一８和Ｆ９均为现配现用，对于将两者长期混合在步研宄。５６ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究６结论６．１筛选对拮抗细菌Ｒ６无抑制作用的化学杀菌剂采用菌丝生长速率法，进行６种化学杀菌剂对油茶炭疽病菌和软腐病菌的室内毒力测定。结果表明，多菌灵、苯醚甲环唑和甲基硫菌灵对炭疽病菌的抑制作用较好ＥＣ０．７３８ｍ／Ｌ、０．９６３ｍ／Ｌ５ｍ／。，５Ｑ分别为ｇｇ和２．４２ｇＬ代森锰锌的对其抑１．Ｌ，ＥＣ４８８２ｍ／。对于软腐病菌制效果最差５〇高达ｇ，苯醚甲环唑、甲基硫菌灵和多菌灵的抑制作用较好ＥＣ为０．５４２／Ｌ、０９Ｌｍ．１４ｍ／Ｌ．ｍ／。，５Ｇ分别ｇｇ和１００２ｇ，ＥＣ高达３６代森锰锌的抑制效果较差５Ｑ．９２１ｍｇ／Ｌ。６种杀菌剂对内生拮抗细菌Ｒ６的菌体和芽孢影响的试验结果表明，在杀菌剂的供试浓度下，甲基硫菌灵对菌株Ｒ６的菌体和芽孢无影响。甲基硫菌灵与拮？％抗细菌Ｒ６发酵液混配使用对炭疽病菌的抑制率提高了９．９９％３６．２６，对软腐７％？３病菌的抑制率提高了６．６１．１９％配使用对两种病原，甲基硫菌灵与生防菌混菌的抑制作用较单独使用甲基硫菌灵和生防菌均有増强，甲基硫菌灵作为与菌株Ｒ６混配的杀菌剂进行后续研究。６．２油茶主要病害拮抗细菌Ｒ６的发酵工艺优化本研宄首先进行了菌株Ｒ６发酵培养基的优化，以菌体浓度和抑菌率作为指标进行的单因素筛选试验确定了菌株Ｒ６最佳碳源为葡萄糖、最佳氮源为酵母膏和最佳无机盐为硫酸镁。在此基础上进行了响应面分析，得到的菌株Ｒ６最佳的发酵培养基为葡萄糖５．０２ｇ／Ｌ、酵母膏１５．１０ｇ／Ｌ、硫酸镁６．８２ｇ／Ｌ。此时，发酵液的菌体浓度、对炭疽病菌和软腐病菌的抑制率较优化前分别提高了１９．２０％、１３．６５％和１２．３１％。在优化好的发酵培养基的基础上进行了发酵培养条件的优化，Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ３Ｈ试验设计筛选出对菌体浓度影响较大的个重要因素即初始ｐ、摇床转速和培养温度，在此基础上进行响应面分析得到的菌株Ｒ６最佳的发酵条Ｈ°８．ＵＫ培养温３０Ｃ、摇１５０、５件为初始ｐ度．３０床转速１７．ｒ／ｍｉｎ接种量％、培养２４ｈ时间。在此条件下，发酵液的菌体浓度、对炭疽病菌和软腐病菌的抑制率较优化前分别提高了９．５６％、１２．２４％和１０．５０％。结合生产实际的需要，对Ｒ６的菌株的发酵条件进行了适当的修正：葡萄糖５．０２／Ｌ、，最终得到的发酵工艺为ｇ酵５７ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究°母膏１５．１０ｇ／Ｌ、硫酸镁６．８２ｇ／Ｌ、初始ｐＨ８．１０、培养温度３０．３０Ｃ、摇床转速１７１．００ｒ／ｍｉｎ、接种量５％、培养时间２４ｈ。６．３油茶内生拮抗细菌Ｒ６可湿性粉剂的研制综合考虑菌株Ｒ６本身的性质和各剂型的优缺点，笔者将菌株Ｒ６的发酵液研制成了可湿性粉剂。以菌株的生物相容性、润湿性和分散性作为指标，对可湿性粉剂中的载体、润湿剂、分散剂、稳定剂和紫外保护剂进行了筛选，得到的菌株Ｒ６可湿性粉剂的最佳配方为原药７０％，分散剂木质素磺酸钠７％、润湿剂十二烷基苯磺酸钠３％、稳定剂羧甲基纤维素钠２％、保护剂抗坏血酸０．１％、高岭土补足至１００％，经测定制剂的ｐＨ值、细度、润湿性和悬浮性均达到国家标准。研制的菌株Ｒ６可湿性粉剂的活菌数达到对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑制率均在°８０％以上。在室温２５Ｃ贮存１２０ｄ后菌剂对两种病原菌的抑菌率也均在６５％以上，防治效果稳定。６．４油茶内生拮抗细菌Ｒ６可湿性粉剂与甲基硫菌灵协同作用研究本研宄采用菌丝生长速率法测定了菌株Ｒ６菌剂对油茶炭疽病菌和炭疽病菌的抑制作用，结果表明，菌株Ｒ６菌剂对炭疽病菌的抑制效果优于软腐病菌，ＥＣ５〇分别为１．９５６ｍｇ／Ｌ和６．０９２ｍｇ／Ｌ。复配杀菌剂Ｆ８即Ｒ６菌剂与７０％甲基硫菌灵的质量比为７：１时，对油茶炭疽病菌的抑制作用是均有增效作用，ＳＲ值为２．０５５。复配杀菌剂Ｆ９即Ｒ６菌剂与７０％甲基硫菌灵的质量比为９：１时，对油茶软腐病菌的抑制作用是均有增效作用，ＳＲ值为１．５６７。盆栽试验和林间试验表明，复配杀菌剂Ｆ８和Ｆ９在各浓度下对油茶炭疽病和软腐病的防治效果与７５％百菌清５００倍液相当，都优于相同浓度下的菌株Ｒ６可湿性粉剂和７０％的甲基硫菌灵的防治效果。两种复配杀菌剂在林间对油茶炭疽病和软腐病的防效均在６７％以上，防治效果好，具有应用和推广价值。５８ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究７展望本文主要研宄了与菌株Ｒ６生物相容性好的甲基硫菌灵和菌株Ｒ６可湿性粉剂对油茶主要病害的协同作用。为了更好的对内生拮抗细菌Ｒ６进行开发利用，在今后的研究中，还可以在以下几个方面开展工作：（１）拮抗细菌Ｒ６抑菌物质的分离鉴定６。拮抗细菌Ｒ对油茶炭疽病、根腐病和软腐病等多种真菌性病害和批橘溃疡病等细菌性病害都具有抑制作用。为了使其对植物病害具有较好的防治效果一，其抑菌物质进行分离鉴定有待于进步的研宄。（２）拮抗细菌Ｒ６定殖动态的研究。在植物病害的微生物防治中，拮抗菌一是否能够在植物体内有效的定殖是防治病害的个关键因素。拮抗细菌Ｒ６来源于健康的油茶果中，为了使菌株Ｒ６可湿性粉剂及复配杀菌剂对油茶炭疽病和软一腐病均有稳定的防效，菌株Ｒ６在油茶体内的定殖时间和定殖能力有待于进步研究。５９ 中南林业科技大学硕士学位论文油荼主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究６０ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研宄参考文献［１］陈永忠，罗健，王瑞，等．中国油茶产业发展的现状与前景［Ｊ］．粮食科技与经－２０１３８１：１０１２济３．，，（）［２］黄墩元，郝家胜，余江帆，等．油茶研宄现状与展望［Ｊ］．生命科学研究，２００９．－１３５：４５９４６５（．）［３］ＪｉａｎｆｉｉＳｈｅｎ，ＺｈｉｙｉｎｇＺｈａｎｇ，ＢｉｎｇＴｉａｎ，ｅｔａｌ．ＬｉｐｏｐｈｉｌｉｃｐｈｅｎｏｌｓｅｘｐｌａｉｎｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓｔｔｔｔｒｉｎｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎａｃｔｉｖｉｔｏｆｓｕｂｆｒａｃｔｉｏｎｓｆｒｏｍｍｅｈａｎｏｌｅｘａｃｔｏｆｃａｍｅｌｌｉａｏｉｌＪ．ｙ［］Ｅｕｒｏｅａｎ－ＦｏｏｄＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏ２０１２２３４６：１０７１１０８２．ｐｇｙ，，（）４刘振香，陈鍪，罗小会．茶油在医药方面的活性成分研宄进展ｍ．金华职业［］２０１４１４３－技术学院学报：７７８１．，，（）Ｊ－５．２０１４３０８７８８．陈可丽．试：［］，陈辉析茶油的功效和应用［］赤峰学院学报，，⑶［６张超英．Ｊ．国家林业局管理干部学院学报，２０１３，１：］谈我国油茶产业的发展［］（）２－１２４．７刘凌．Ｊ．西部［］，泽桑梓，季梅，等中国油茶林害虫和螨类及其天敌研宄综述［］３４２１－林业科学：９６４．，２〇１１０，（）￣８杨坚．油茶主要病虫害的发生及防治Ｊ．２００７７：６６６８．［］［］广东农业科学，，（）［９］江朝波，杨凌方．油茶炭疽病发生于综合防治［Ｊ］．现代农业科技，２０１２，（２）：１９９．１０］饶辉福，丁坤明，饶漾萍，等．油茶主要病害的发生与防治［Ｊ］．植物医生，［－２０１３２６３：１６１７．，（）１１］周国英卢丽俐刘君昂等．油茶炭疽病拮抗内生细菌的筛选［Ｊ］．湖南农［，，，２００８－业大学学报３４６：６９８７００．，，（）１２］游鼠周国英刘君昂．３菌．中南［，等油茶内生拮抗细菌Ｙ１剂研制［Ｊ］林业，２０１０３０４１－１３４科技大学学报：１３．，，（）１３杨蕾：．油茶主要病害拮抗放线菌Ｆ１０有效成分及菌剂研究Ｄ．长沙中南［］［］林业科技大学，２０１１．１４周建宏．油茶主要病害的植物源药剂研究Ｄ．长沙：中南林业科技大学［］［］，２０１１．１５邓鑫州．５种药剂对油茶炭疽病的防治效果研究Ｊ．安［］，黄连桂，邓萌伟，等［］２０１１３９６－徽农业科学：９６５３９６５４．，，（１）６１ 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中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究［３０］ＨｕａｎｇＸＱ，ＺｈａｎｇＮ，ＹｏｎｇＸＹ，ｅｔａｌ．ＢｉｏｃｏｎｔｒｏｌｏｆＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉｄａｍ－－ｐｉｎｇｏｆｉｆｄｉｓｅａｓｅｉｎｃｕｃｕｍｂｅｒｗｉｔｈＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓＳＱＲＮ４３Ｊ］．［ｃｒｏｂｏｏｃａｅａｒｃｈ－Ｍ：ｉｉｌｇｉｌＲｅｓ２０１２１６７３１３５１４３．，，（）３１ＨｕａｎＸＱＹｏｎＸＹＺｈａｎＲ．Ｆｅｔａｌ．ＴｈｅｓｕｅｒｎａｔａｎｔｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｕｍｉｌｕｓ［］ｇ，ｇ，ｇ，ｐｐ－Ｎ４３ｈａｓａｎｔｏｗａｒｄｓＳｔｉｆＵｕｎａｌａｃｔｉｖｉｔ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＱＲｇｇｙ［Ｊ］Ｂａｓ－ｉｃＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ２０１３５３８：６５７６６３．ｇｙ，，（）［３２］王宇婷，易有金，夏菠，等．内生短短芽孢杆菌Ｏｉｌ菌发酵滤液抑菌活性研Ｊ－？２０１３３９４：２９３３究［］植物保护．，，（）［３３］ＭｅｋｅｔｅＴ？ＨａｌｌｍａｎｎＪ，ＫｉｅｗｎｉｃｋＳ？ｅｔａＬＥｎｄｏｐｈｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａｆｒｏｍＥｔｈｉｏｐｉａｎｃｏｆｆｅｅｐｌａｎｔｓａｎｄｔｈｅｉｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｔｏａｎｔａｇｏｎｉｚｅＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｉｎｃｏｇｎｉｔａ［Ｊ］．Ｎｅｍａｔｏ－ｌｏ２００９１１（１：１１７１２７．ｇｙ，，）一［３４］张立强，黄慧琴，崔莹，等．株抗根结线虫芽孢杆菌的分离筛选与鉴定［Ｊ］．２０－热带作物学报１４３５９：１８２５１８２９．，，（）３５Ｊ［李爱荣．两．］，安德荣株生防荧光假单胞杆菌的室内筛选试验［］微生物学杂２００３２３４－志：１１１３．，，（）３６礼远耀卫．［］何，康利用青枯菌无毒菌株和荧光假单胞菌诱导花生产生抗病Ｊ－性．植物保护学报９９０１７２：１１３１１６．［］，１，（）［３７］ＳａｒａｖａｎａｎＴ，ＭｕｔｈｕｓａｍｙＭ，ＭａｒｉｍｕｔｈｕＴ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｉｎｔｅｇｒａｔｅｄａｐｐｒｏａｃｈｔｏｍａｎｈｆ－ａｅｗｉｌｆｂａｎａｎａＣｒｒｏｔｅｃｇｔｅｕｓａｒｉｕｍｔｏＪ．ｏｔ２００３２２９：１１１７１１２３．［］ｐＰ，，（）［３８］ＮｉｅｌｓｅｎＴＨ，ＴｈｒａｎｅＣ，ＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｅｎＣ，ｅｔａｌ．Ｖｉｓｃｏｓｉｎａｍｉｄｅ，ａｎｅｗｃｙｃｌｉｃｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅｗｉｔｈｓｕｒｆａｃｔａｎｔａｎｄａｎｔｉｆｕｎｇａｌｒｏｅｒｔｉｅｓｒｏｄｕｃｅｄｂｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｐｐｙＰＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＤＲ５４Ｊ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２０００８９１：［］，，（）９９２－１００１．３９ＮａｇａｒａＪＫＭＪａａｒａＪＪＭｕｔｈｕｋｒｉｓｈｎａｎＳｅｔａｌ．Ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｏｘａｌｉｃａｃｉｄ［］，ｙ，，ｂｙｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｕｏｒｅｓｃｅｎｓｓｔｒａｉｎＰｆＭ２ＤＵ２：ｉｍｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｂｉｏｌｏｉｃａｌＰｐｇｆｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆｒｉｃｅｓｈｅａｔｈｂｌｉｈｔｃａｕｓｅｄｂｙｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＪ．ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｉｃａｌｇＲｈ［］ｇＲｈ２００５－ｅｓｅａｒｃ１６０３：２９１２９８．，，（）４一［０］翟熙伦，杨金广，申莉莉，等．株对ＴＭＶ和ＰＶＹ具有拮抗活性生防菌的Ｊ２０－筛选与鉴定．１２４５１１：２１８０２１８８．［］中国农业科学，，（）４一［１］文孟良刚李．从放线菌次生代谢产物创制生物农药Ｃ．，李铭，青［］第五届－：２００３：６７新农药创制交流会论文集．北京中国化工学会１４１４．，６３ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究４２ＢｅｎｓｏｎＤＲ，ＳｉｌｖｅｓｔｅｒＷＢ．ＢｉｏｌｏｏｆＦｒａｎｋｉａｓｔｒａｉｎｓａｃｔｉｎｏｍｃｅｔｅｓｍｂｉｏｎｔｓ［］ｇｙ，ｙｙｏｆｔＪ２－ａｃｉｎｏｒｈｉｚａｉｌａｎｔｓ，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏＲｅｖｉｅｗｓ１９９３５７２：９３３１９．ｐ［］ｇｙ，，（）一４３李增波薛泉宏梁军峰等－．０４的防病促生作用Ｊ．［］，，，株生防放线菌ＡＬ［］－农药２００９４８１：７４７６．，，（）［４４汪倬王茅周骏江．抗黄瓜灰霉病菌生防放线菌的筛选及其抑菌机理的初］，，１－步研宄Ｊ：．农药科学与管理２００９３０１８２２．［］，，（）４５－王岩．链霉菌菌株Ｆ１的鉴定及其对水稻．［］，李国庆枯纹病防效的初步测定［Ｊ］山东农业大学学报２０１４４５３－：３２１３２７．，，（）［４６］李玲玉，赵迪，刘晓宇，等．放线菌Ｓｎｅａ２５３代谢产物及寡糖对南方根结线Ｊ２０１４２６１１７－１２２９３虫活性的影响［．：．］天然产物研宄与开发，，，４７陈杰琳郭天文等．马铃薯土传病原真菌拮抗放线菌的促生作用Ｊ．［］，汤，，［］－０１４４２１：１１１１１９西北农林科技大学学报，２．，（）［４８］魏赛金，王世强，李昆太，等．链霉菌７０２对水稻种子萌发、幼苗生长及土－壤微生物的影响［Ｊ．农业环境科学学报３５：８５３８６１．，２０１４，３（）］４９ＥｌａｄＹ．ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍＴ３９ｒｅａｒａｔｉｏｎｆｏｒｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｏｆｌａｎｔ［］ｐｐｐｄｅａｓｅ－ｔｒｔｔｉｉＳｔｉｏｉｉｓｓｃｏｎｏｌｏｆＢｏｒｓｃｎｅｒｅａｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｒｕｍａｎｄＣｌａｄｏｓｏｒｕｍｙ９ｐｕｌｖｕｍ－Ｊ．ＢｉｏｃｏｎｔｒｏｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０００１０４：４９９５０７．ｆ［］，（），［５０］ＤｏｌａｔａｂａｄｉＫ？ＧｏｌｔａｐｅｈＥＭ，ＭｏｈａｍｍａｄｉＮ？ｅｔａｌ．ＢｉｏｃｏｎｔｒｏｌｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｒｏｏｔｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｆｉｍｉａｎｄＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｅｃｉｅｓａｇａｉｎｓｔＦｕｓｍｉｕｍｗｉｌｔｏｆｌｅｎｔｉｌｕｎｄｅｒｉｎｇｖｉｔｒｏａｎｄｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓＪ．ＪｏｕｒａｌｏｆＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄ［］ｇｅｃｈｎｏｏ－Ｔｌ２０１２１４：４０７４２０ｇｙ．，，［５１］ＷｏｏＳＬ，ＳｃａｌａＦ，ＲｕｏｃｃｏＭ？ｅｔａｌ．ＴｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｐ．？Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｉｍｇｉ，ａｎｄｐｌａｎｔｓ［Ｊ］，Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００６９６２－：１８１１８５．，（）［５２］杨蕾，周国英，梁军，等．防治杨树溃疡病内生菌的分离筛选及鉴定［Ｊ］．植物保护学报２０１４４１４－：４３８４４６．，，（）［５３］刘路宁，屠艳拉，张敬泽．绿木霉菌株ＴＹ００９防治纹枯病等水稻主要真菌病Ｊ－害的潜力［．中国农业科学２０１０４３１０：２０３１２０３８．］，，（）５４张树武徐炳良薛应钰等．长枝木霉对南方根结线虫致死和寄生作用的［］，，，－显微观察及测定Ｊ．０１３３９４：４６５１．［］植物保护，２，（）［５５］ＧｏｓｗａｍｉＪ，ＰａｎｄｅｙＲＫ，ＴｅｗａｒｉＪＰ，ｅｔａｌ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｒｏｏｔｋｎｏｔｎｅｍａｔｏｄｅｏｎ６４ 中南林业科技大学硕士学位论文．油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究ｔｏｍａｔｏｔｈｒｏｕｈａｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｉｍｇａｌａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍｓｔｒｉｃｔｕｍａｎｄｇｐｐ，ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍＪ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＨｅａｌｔｈＰａｒｔＢ［］，２００８４３３－２４０：２３７．，（）－５６ＳｈａｒｏＢａｒ－ＥａｔｔａｔｒｔｔｔｎＥｌＭＣｈｅＩｅａｌ．ＢｉｏｌｏｉｃｌＣｏｎｏｌｏｆｈｅＲｏｏｋｎｏｔＮｅｍａｏｄｅ［］，ｙ，，ｇＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅａｖａｎｉｃａｂｙＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００１，ｊ－９１７：６８７６９３（）．５７马金慧．Ｉ２的鉴定及其对黄瓜根结线［］，朱萍萍茆振川，等哈茨木霉菌株ＴＲ，Ｊ２０－虫的防治作用［］．中国农学通报１４３０２２：２６３２６９．，，（）５８Ｊ张树武徐秉良．长枝木霉对小麦禾谷孢囊线虫的致死作用［．［］，薛应钰，等，］－应用生态学报２０１４２５７：２０９３２０９８．，，（）５９ＪａｔａｌａＰＫａｌｔｅｎｂａｃｈＲｏｃａｎｅｌＭ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆＭｅｌｏｉｄｏｎｅ［］，Ｂｇ，ｇｙｉｎｃｏｇｎｉｔａａｃｒｉｔａａｎｄＧｌｏｂｏｄｅｒａｐａｌｌｉｄａｏｎｐｏｔａｔｏｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１９７９１１：３０３．，［６０］汪军，刘嘉，李传东，等．淡紫拟青霉Ｅ７菌株对香蕉根结线虫的致病性和生Ｊ－防效果［．中国植保导刊２００８２８１０：５８．］，，（）６１夏汉祥胡亮亮．．世０［］，廖美德等淡紫拟青霉的研宄现状［Ｊ］界农药５２０１，，，－３２５：８１２．（）６２ＳａｓｓｅｒＪＮ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｅｎｔｈｏｄｓａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｎ［］ｐｈｅｅｆ－ｔｆｉｃａｃｙｏｆＰａｅｃｉｌｏｍｃｅｓｌｉｌａｃｉｎｎｕｓａｓａｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｇｅｎｔｆｏｒｌａｎｔｐａｒａｓｉｔｉｃｙｐｎｅｍａｔｏｄｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１９９１，２３（４）：５５０．６３ＫａｎｔａｎＪＧｉｎｚｂｕｒＣＡｓｓａｒａｆＭ．ＰａｔｈｏｅｎＷｅａｋｅｎｉｎａｓａＣｏｍｏｎｍｅｎｔｏｆ［］，ｇ，ｇｇｐＩｎｔｅｒａｔｅｄ－ｇＣｏｎｔｒｏｌ［Ｍ］．北京：中国农业大学出版社，１９９６：３２０３２６．６４ＡｎａｓｔａｓｉａｄｉｓＩＡＧｉａｎｎａｋｏｕＩＯＰｒｏｅｔｏｕＤＡｅｔａｌ．Ｔｈｅｃｏｍｂｉｎｅｄｅｆｆｅｃｔｏｆ［］，，，ｐｈｔｈｅａｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌａｇｅｎｔＰａｅｃｉｌｏｍｃｅｓｌｉｌａｃｉｎｕｓｗｉｔｈｖａｒｉｏｕｓｐｐｙ，ｒａｃｔｃｅｓｆｏｒｅｃｏｎｏｏｏ－ｅｔｏｅｓｒｏｒｏｃｉｏｎｉｔｈｔｒｌｏｆｒｔｋｎｏｔｎｍａｄＪ．Ｃｔｅｔ２００８ｐ［］ｐＰ，，２７３－：３５２３６１．（）６５ＭａｒｃｈｅｔｔｉＯＭｏｒｅｉｌｌｏｎＰＧｌａｕｓｅｒＭＰｅｔａｌ．Ｐｏｔｅｎｔｓｎｅｒｉｓｍｏｆｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ［］，？？ｙｇｏｆｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅａｎｄｃｙｃｏｓｐｏｒｉｎｅｉｎＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓＪ．ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＡｇｅｎｔｓａｎｄ［］ｅｍｏｅｒａ－Ｃｈｔｈ２０００４４９：２３７３２３８１．ｐｙ，，（）６６ＫｏｌｌｅｒＷＷｉｌｃｏｘＷＦ．ＩｎｔｅｒａｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｏｄｉｎｅａｎｄｔｈｅＤＭＩｆｕｎｉｃｉｄｅ［］，ｇ＊￡？ｉｍｏｅｃｏｎｔｒｏｏｌｅｓｃａｎｅａｓｅ－ｌｉｎ：ｆｅｎｔｈｌｆａｐｐｂＪ．ＰｌａｔＤｉｓ２０００８４８８６３８７０．［］，，（）６５ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究６７韩新才张宁．农抗１２０与百菌清对辣椒炭疽病菌联合毒力的［］，肖国蓉等，，２４２－测定［Ｊ］：１１６０．华中农业大学学报２００５５７．，（），［６８］马林，宋金俤，曲绍轩．福美多与噻菌灵混配对食用菌木霉和疣孢霉的协同Ｊ－作用［．江苏农业科学２０１３４１８：１３９１４１．］，，（）６９ＳｕｎＹＰＪｏｈｎｓｏｎＥＲ．Ａｎａｌｓｉｓｏｆｏｉｎｔａｃｔｉｏｎｏｆｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓａａｉｎｓｔｈｏｕｓｅｆｌｉｅｓ［］，ｙｊｇＪｔ－．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｅｃｏｎｏｍｉｃｅｎｏｍｏｌｏ１９６０５３４：８８７８９２．［］ｇｙ，，（）［７０］侯昌亮，艾爽，胡寒哲，等．申嗪霉素和咪鲜胺混配对小麦赤霉病的协同杀菌作用Ｊ５３－？农药２０１４１：５８６０６５．［］，，，（）［７１］周锋，张小磊，胡承勇，等．戊唑醇和菌核净复配对油菜菌核病病原菌的增Ｊ２０－效作用？农药１３５２８：６０２６０５．［］，，（）７２郎剑锋孔凡彬．杀虫剂和杀菌剂对哈茨木霉菌丝生长的影响［］，陆宁海，等，Ｊ１－．湖南农业科学０１５：７５７８．［］，２，（）［７３］刘欣，台莲梅．几种常用杀菌剂对６个木霉菌株的室内毒力测定［Ｊ］．黑龙江一农垦大学学报２００６１８６－八：８１１．，，（）［７４］ＧｕｐｔａｂＶＰ５ＳｈａｒｍａＤＤ．Ｉｎｔｅｒｇｒａｔｉｏｎｏｆｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｐｓｅｕｄｏｋｏｎｉｎｇｉｉｗｉｔｈａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｆｏｒｄｉｓｅａｓｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔａｎｄｐｌａｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｍｕｌｂｅｒｒｙ［Ｊ］．－ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＰｈｔｏｔｈｏｌｏａｎｄ：ｙａｇｙＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ１９９９３２６５２１５２９．ｐ，，（）７５ＥｌａｄＹＺｉｍａｎｄＺａｓＹｅｔａｌ．ＵｓｅｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ［］？Ｑｑ？ｏｒａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎｗｉｔｈｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓｔｏｃｏｎｔｒｏｌｃｕｃｕｍｂｅｒｒｅｍｏｕｌｄＢｏｔｒｔｉｓｃｉｎｅｒｅｄｇｙ（ｙ）ｕｎｄｅｒｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓＪ，ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ１９９３４２３：［］，，（）３２４－３３２．７６ＢｉｌａｎａＪｕｏｓｌａｖ．ｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆ７Ｗｃ／ｚ（＾ｅｒ？ｗａｏｎｒｅｄｕｃｉｎｒｏｏｔ［］ｊＱｇＺＴｇｒｏｔｄｉｓｅａｓｅＩｔｏｂａｃｏｏｓｅｅｄｌｉｎｇｓｃａｕｓｅｄｂｙＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉＪ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ［］ｏｕｒｎａｏｆｕｎｄａｎｄｔｎｏ－ｌｒｅａａｌｉｅｄｓｃｉｅｎｃｅｓｅｃｈｌｏ２０１１２２：１１１．ｇｙ，ｊ，（）ｐｐｐ［７７］李敏，杨谦，王疏，等．哈茨木霉与多菌灵复合使用对水稻苗期立枯病的防－治［Ｊ］：６．．浙江大学学报２００９３５１５７０，，（）［７８］田连生，李贵香，高玉爽．紫外光诱导木霉产生对速克灵抗药性菌株的研究Ｊ－．２００６２６６：１８２０．［］中国植保导刊，，（）７９Ｂ１９６农倩黎起秦袁高庆等．内生细菌菌株与戊唑醇混配对水稻纹枯病［］，，，－．２０８４１的防治效果Ｊ１０４９１１：８３８．［］农药，，（）［８０］刘邮洲，常有宏，魏本强，等．化学药剂敌力脱与拮抗细菌协同防治梨轮纹６６ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究病研宄Ｊ－？果树学报２０１０２７１：８２８７．［］，，（）［８１］李石磊，刘君昂，赵莹，等．６种杀菌剂对油茶主要病害的室内毒力测定ｍ．２０￣中南林业科技大学学报１３３３９：６０６２．，，（）８２鹿秀云李社增高胜国－［］．５种２菌体，，等化学杀菌剂对枯草芽孢杆菌ＮＣＤ，Ｊ－及芽孢的影响．２００５３５６：１７３１７５］植物病理学报．［，，（）［８３］程光辉．控制辣椒青枯病的药剂筛选与应用技术研宄［Ｄ］．重庆：西南大学，２００８．［８４］柯杨，马瑜，李勃，等．生防枯草芽孢杆菌Ａ９７与化学杀菌剂的相容性研究￣Ｊ３６：４４４７．陕西农业科学．［］，２０１，（）［８５］孟昭礼，罗兰，袁忠林，等．人工模拟的植物源杀菌剂银泰防治番茄３种病－Ｊ：害的效果研宄［．中国农业科学２００２３５７８６３８６６．］，，（）［８６］刘伟．油茶炭疽病的病原学、发生规律及防治技术研宄Ｄ．武汉：华中农业［］大学，２０１２．８７刘淑娟陈秀蓉袁宏波．．与［］，，等芽孢杆菌ｓ甲基硫菌灵混配对瓶，ｐｐ？／＾ａｈＭｗｓｏ／ａｗ的抑制作用Ｊ－腐镰孢菌？植物保护２００８３４５：１４９１５２．［］，，（）［８８］李素英，刘冬青，牛赡光．生物防治菌与多菌灵混用防治棉花黄萎病的效应Ｊ－研宄．中国生态农业学报２００５１２１：１１４１１６．［］，，（）８９］ＭｏｎｔｏｍｅｒＤＣ．Ｄｅｓｉｎａｎｄａｎａｌｓｉｓｏｆｅｘｅｒｉｍｅｎｔｓ５ｔｈＥｄｉｔｉｏｎＭ．Ｎｅｗ［ｇｙｇｙｐ［］ＹｏｒｋｈｎＷｉｌｅ－９３．：ＪｏｙａｎｄＳｏｎｓ２００１：７２，［９０］ＺｈａｏＬ，ＦａｎＦ，ＷａｎｇＰ，ｅｔａｌ＿ＣｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｅｗｂａｃｔｅｒｉａｌｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｗｉｔｈｅｘｃｅｌｌｅｎｔｍｏｉｓｔｕｒｅｒｅｔｅｎｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙＪ．［］ＡｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏａｎｄＢｃｈｎｏｌｏ２００３－ｐｐｇｙｉｏｔｅ：１１０．ｇｙ，［９１］ＯｏｉｊｋａａｓＬＰ，ＷｉｌｋｉｎｓｏｎＥＣ，ＴｒａｍｐｅｒＪ，ｅｔａｌ．ＭｅｄｉｕｍｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｓｐｏｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｏｎｉｏｔｈｙｒｉｕｍｍｉｎｉｔａｎｓｕｓｉｎｇｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｂａｓｅｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｎｓｉｏｅｃｈｎｏｌｏａｎｄＢｉｏｅｎｉｎｅｅｒｉｎ－Ｊ：ｇ［．Ｂｔｇ１９９８６４１９２１００．］ｇｙｇ，，（）９２］ＣａｉＭＨＺｈｏｕＸＳＳｕｎＸｅｔａｌ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｏｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｍｅｄｉｕｍ［，，Ｑ，ｐｃｏｍｏｓｏｎａｓｅｒｎｍａｒｎｅ－ｕｓｅｒｐｉｔｉｆｏｒｐｇｉｏｌｉｄｅａｒｏｄｕｃｔｉｏｂｙｉｄｅｒｉｖｅｄｆｕｎＡｓｉｌｌｕｓｐｇｐｇｇｌａｕｃｕｓＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ２００９３６３：［］ｇｙｇｙ，，（）３８１－３８９．９３ＹｕａｎＬＬ，ＬｉＹＱ，ＷａｎＹ，ｅｔａｌ．Ｏｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｒｉｔｉｃａｌｍｅｄｉｕｍｃｏｍｏｎｅｎｔｓ［］ｇｐｐｕｓ－－ｉｎｇｒｅｓｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｆｏｒｈｅｎａｚｉｎｅ１ｃａｒｂｏｘｌｉｃａｃｉｄｒｏｄｕｃｔｉｏｎｐｇｙｐｙｐ６７ 中南林业科技大学硕士学位论文油荼主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究ｓｅｕ－ｂｙＰｄｏｍｏｎａｓｓ．Ｍ１８Ｊ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｉｎｅｅｒｉｎｇ２００８ｐＱ［］ｇ，，－１０５３：２３２２３７．（）９４ＺａｍｂａｒｅＶ，ＣｈｒｉｓｔｏｈｅｒＬ．Ｏｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ［］ｐｐｐｃｅｌｌｕｌｏｓｅｂａｓｒａｉｎＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒ＆Ｃｈｅｍｉｃａｌｙ［］ｙＥｎ－２０－ｉｎｅｅｒｉｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｎｌｉｓｈ１１３４５：５２１５２７．ｇｇｇ，，（）［９５］路宗岩．杉木炭疽病拮抗细菌的筛选及其菌剂研制［Ｄ］．长沙：中南林业科技大学０１３．，２’９６王维乐牟志美张淑君等．响应面法优化Ｐａｍｃｏｍｏｒ／ｗｍｖａｒｆａＭｅ［］，，，味ｙ－－ＧＨＪ４产漆酶发酵条件Ｊ．应用环境生物学报２０１１１７３：３２１３２５（）．［］，，９７ＴＵＢＰ１张艳梅曾红．响应面法优化棉花黄萎病菌拮抗细菌［］，发酵培养基的－Ｊ．２０１４２６２研究［：３２３８．］塔里木大学学报，，（）９８陆继臣迟乃玉窦少华等－０４培养条件［．响应面法优化灰霉病生防菌ＣＮＹ］，，，Ｊ－？微生物学通报，２０１３４０８：１４１４１４２２．［］，（）－工艺优化９９张荣胜梁雪杰刘永峰．解淀粉芽孢杆菌Ｌｘ１１生物发Ｊ．［］，，，等酵［］中国生物防治学报２０１３２９２－：２５４２６２．，，（）１００李舒雯周金伟易有金．０１１可湿性粉剂Ｊ．［］，等内生短短芽孢杆菌的研制［，，］４－植物保护２０１４４０：９６１００．，，（）－［１０１］周婷安丽娜，刘倩等．球孢白僵菌ＢＤＢ０１４可湿性粉剂配方的筛选Ｊ．，，［］２０３－植物保护，１３９５：１９０１９３．，（）一１０２马志强牛芳胜毕秋艳．种评价哈茨木霉菌与化学农药联合增效作用［］，，Ｊ－的方法［．农药２０１３５２２：９２１９２３．］，，（１）［１０３］ＥｌａｎＹＺｉｍａｎｄＺａｓＹ，ｅｔａｌ．ＵｓｉｎｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍｉｎ，Ｑｑｇｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｒａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎｗｉｔｈｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓｔｏｃｏｎｔｒｏｌｃｕｃｕｍｂｅｒｇｒｅｙｍｏｕｌｄ（ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ）ｕｎｄｅｒｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，－１９９３４２３：３２４３３２．，（）［１０４］ＢｉｌｊａｎａＧ，ＪｕｇｏｓｌａｖＺ．ＴｈｅＩｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍｏｎｒｅｄｕｃｉｎｇｒｏｏｔｒｏｔｄｉｓｅａｓｅｉｎｔｏｂａｃｏｏｓｅｅｄｌｉｎｇｓｃａｕｓｅｄｂｙＲｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｖｉｒｅａｎｄＡｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅｓａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０１１２２：ｐｐ，，（）１－１１．６８ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究附图…：嘗■■■■■Ｈ＿ＣＫ＾８＞Ｉ．３７ｍ／Ｌｉ６．７５ｍ／Ｅｋ：＃ｎ？ＣＫ８．００ｒａ／Ｌ４００ｍ／＆ｇｇｇ；ｇ：：；ｉ；４＇＞－Ｌ／＜３ｉ．－？／Ｌ．．５？ｎｔ／ｌ，６１．Ｗ）ｔｎ／ＩＳａ２０ｍ〇．ｌ（Ｏｍ０．５０ｍ／ｙ￡３４．０ＱｉｌＬｊ．０ＬｇＵ：：．．＇Ｌ０－．．Ｓ／ＬＣ１ｍ＜Ｋ０４４ｍｕ８ｍｑＫ４二１ｆＬ９．４０ｍａＬｍｍＹ」＾＂＇、乂？讚：＿；ｌｌｉＩＩＩ；纖觀入＇＇．Ｖ／Ｍ．／５—ｉ１＇Ｓ，，ｒ－ｉ．：；；；！．＿Ｌ．ｒ：ｆｌ｜＇；＇蠢、副、厂：气ｆ＊ＮＸ－■＇＾ｖｗ＾／ｗｖｗ＾ｗｖ？ｗｖｓ－Ｗ＜＇＇ｖ＇ｖ＾＇、ｆ／＊■Ｗ．＾＾Ｖ＾Ｗ＾ｙ￣＾ｆｒｙ？Ｊ＞ｌｙＣＳ＞＜ｙｙｆｇ＜ｇ＾Ｖｆ＜Ｖ？ＶＷＳｔ９ＳｔｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｈｍＨＨＨｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｎｍｉｉｉｉｉｉｎ０？ｍ＾ＣＫＣＫ．２５ｍ／Ｌ０．５０ｇ／Ｌ０．２５ｍｇ／Ｌ０．５０ｉｎｇ／Ｌ＂＇■；：＾／＾：－：Ｓ：；ｉ：；；：ＳＰ１Ｉ＾ｍｌｌ１１１ｊ｜；；；：；；；＂！：：ｌ：：；ｌ；：ＶＩ．．＾ｆ；１ｉｆ：，｜｜，１１．００ｎｉ／Ｌ２ｉ０ｍｆ２ｉｍ／Ｌ４〇ｎ＾ｇｌｇＬ．）Ｕｇ！０ｉ｜Ｌ图１６种杀菌剂在各供试浓度下对油茶炭疽病菌的抑制效果ＣＫ８＜？．３７ｒａｇ／Ｌ？０．５０ｍ／Ｌ＾１６：７５ｍｇ／．Ｋｇ｜１．〇４／１６９ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究一一一…一：！ｒ’＿麵＿＿＿＿：＿＿画ＩＩＩＩＩＩ图２６种杀菌剂在各供试浓度下对油茶软腐病菌的抑制效果誦图３甲基硫菌灵与菌株Ｒ６发酵液混配图４甲基硫菌灵与菌株Ｒ６发酵液混配对油茶炭疽病菌抑制效果对油茶软腐病菌抑制效果７０ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究麵■■■■＇’３美’’．＃：．｜：．：穿．基图５菌株Ｒ６发酵培养图６菌株Ｒ６发酵培养液图７菌株Ｒ６发酵液对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑制效果■Ｉ图８复配杀菌剂对油茶主要病害的盆栽防效试验７１ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究攻读硕士学位期间主要学术成果１）参加项目课题？序号项目来源起止；时丨司承担任务ｃｍ）南於ｃ济林主要病虫“十－五”农村领域国家－１无公害防治技术２０１２２０１６科技计划课题Ｎｏ．２０１２ＢＡＤ１９Ｂ０８０３（）；２）发表论文序号作者论文题目期刊名称（卷次、页码）；左杰，王宗永，杉木人工林林下固氮植被的江西农业大学２０１４，３６（４）：７９５－８０周国英等．筛选研宄学报１．，左杰，周国英，艾蒿和苦棟提取物对油茶尺２０１５，４２（８）：＾＾－杨菁等．蠖生物活性的研宄５１５５．，左杰，周国英，响应面法优化油茶炭疽病２０１５，２５（１）：生生物物Ｓ木－．田媛媛等．措抗细菌Ｒ６发酵条件８８９２，７２ 中南林业科技大学硕士学位论文油茶主要病害的生防菌剂与化学杀菌剂协同作用研究致谢本论文是在导师周国英教授的悉心指导下完成的。从论文的选题、设计、实施到论文的修改及定稿无不凝聚着导师的智慧和心血。三年来，导师在学习上给予了精心指导和谆谆教诲，生活方面给予了无私的帮助。导师严谨的治学态度、广博的知识和丰富的阅历使我受益终生。导师孜孜不倦的言传身教会使我在今后的人生道路上不断披荆斩棘。论文完成之际，在此谨向导师表示衷心的感谢和崇高的敬意！感谢刘君昂教授和周德明副教授在我论文实施过程中所给予的帮助和支持，刘老师和周老师新颖敏锐的研宄思路和锐意进取的科学精神成为我今后生活和学习中宝贵的财富。在此向两位老师三年的学习生活中给予的帮助致以诚挚的谢意。感谢李河师兄、何苑皞师姐、王瑞芹师姐、刘剑师兄、孟庆敏师姐、王圣洁师兄等，在我试验进行中提出的宝贵意见和建议。感谢师弟师妹们的在试验实施过程中的无私帮助。感谢田媛媛、杨菁、艾芹、刘倩丽、汤依泠、文亚雄、刘成锋、徐睿等兄弟姐妹在研宄生的学习生活中给予的帮助与鼓励。感谢我的父母和家人在我的学习和生活上给予的鼓励和支持，使我学业得以顺利完成，本研宄的完成离不开他们三年来默默的付出和无私的爱。最后谨向所有支持和帮助过我的人表示衷心的感谢和美好的祝愿！左杰２０１５年４月于长沙７３
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