聚合酶链式反应

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1、基因克隆（感受态细胞制备、转化、质粒提取、酶切鉴定）Westernblot（蛋白质提取、SDS-PAGE、转膜、免疫检测）RT-PCR（RNA提取、逆转录、PCR）实验内容实验考试分子生物学技术聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）KaryB.MullisUSA,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)methodTheNobelPrizeinChemistry1993PCRPCR的产物数目以指数级方式增长DNA片段Cycle1Cy

2、cle2Cycle3CycleN理论上可达2n个拷贝原料（pg）产物(ug)体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段PCR基本原理PCR反应体系PCR结果分析PCR方法拓展PCR的应用PCR的基本原理其原理类似于DNA的体内复制，在试管中的DNA的体外合成。5’3’5’3’DirectionofunwindingContinuousreplicationPrimer5’3’Primer5’3’Discontinuousreplication5’3’Primer岡崎片段(okazakifragment)replica

3、tionforkDNA的体内复制：原料：templateDNA（genomicDNA），RNAprimer，dNTPs酶：解旋酶，引物酶，DNA聚合酶，连接酶反应条件：胞液环境，37℃反应过程：起始（模板DNA解链、形成引发体）、延长、终止（三阶段）产物：模板DNA（基因组DNA）拷贝数增加一倍PCR：templateDNA（genomicDNA，cDNA）,apairofspecificoligonucleotideprimer，dNTPsDNApolymerasebuffer，三种变化的温度（94，50-70，72℃

4、），cycles（25-35）denaturation、annealing、extension（三阶段，多循环）目的DNA（特异性）拷贝数增加2n倍Denaturation（变性）templateDNA(dsDNA)——95℃±——denaturation——ssDNAAnnealing（退火）Primer（引物）：两条寡核苷酸链；分别与待扩增的目标片段两端的序列互补。primersExtension（延伸）Taq酶dNTPS新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。DNA聚合酶：催化反应体系中游离的单核苷酸（dNTPs）由

5、引物5'→3'方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的复制链。变性-退火-延伸——一个PCR循环尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。在正常的反应条件下，30次循环，酶的催化反应趋于饱和----------平台效应(Plateau)“平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、模板DNA的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。理论上，n个循环后，产量为2n拷贝。实际上，PCR的扩增倍数为（1+X）n，X为扩增效率，平均为75%PCR反应体系与反应条件成分加量（ul）灭菌双蒸水X

6、10×PCR缓冲液5.0MgCl22-8.0dNTPs1-2.0引物A1-2.0引物B1-2.0Taq酶0.25模板template血液陈旧血痕组织块或石蜡包埋组织绒毛毛发羊水脱落细胞尿咽拭子DNARNAmRNAcDNAprimer引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。2.保证引物中G-C比例为50%±15%，ATGC最好随机分布。避免两条引物间或引物内部互补，特别是3’端的互补。4.length<20bpTa（退火温度）=(4×G/C+2×A/T–5°C);length>20bpTa=62.3°C+0.41°C

7、(%GC)-5°C保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75°C范围内。5.检测目的DNA序列看是否有错配区域，计算机程序分析可以帮助避免使用设计不合理的引物对。引物的3端:必须严格互补引物的5端:可以不严格互补,可以加酶切位点，加标记物,引入突变位点等5’-ggttacttccctcgatttgggcggggattcccttccatttttttcttcccttttctcccaagatccagcttcttgggggcactcacgggtgcccgttgcgttctgctccgtcggcccc/ggagctgcatggcc

8、aactcccaccaggggccgctcctcccctaccccccacccccgggctccctctttaagtctctagctcaaggtacccgcctctccaaagggctcgtccc-3’(229bp)ggttacttccctcgatttgggaggtttcccgagcaggg-5’DNApolymer