聚合酶链式反应

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1、聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction科二一组基本概述发展简史工作原理操作步骤反应特点用途基本概述聚合酶链式反应：简称PCR。是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可以看作是生物体外的特殊DNA复制。由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。发展简史Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。1973年，台湾科学家钱嘉韵发现了稳定的TaqDNA聚合酶，为PCR技术发展做出了基础性贡献。1985年，美国科学家KaryMullis发明了PCR技术，并在Science杂志上

2、发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。Saiki等人从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就

3、成为免疫PCR等。2013年，PCR已发展到第三代技术。工作原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50~60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70~75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一

4、条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍，DNA含量既增加一倍。操作步骤1．模板DNA的抽提；2．PCR操作(在冰上操作)；3.DNA琼脂凝胶电泳检测。反应特点特异性强①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=10-6）

5、水平操作简便PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。PCR在分子克隆和DNA分析中的用途：生成双链DNA中的特异序列作为探针；由少量mRNA生成cDNA文库；从cDNA中克隆某些基因；生成大量DNA以进行序列测定；突变的分析；染色体步移；RA

6、PD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。