DB31∕T 1160—2019 畜禽养殖过程细菌耐药性监测技术规范(上海市)

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ICS65.020.30B400031上?每市士也方标准DB31月1160~2019A畜禽养殖过程细菌耐药性监测技术规范TechnicalspecificationforantimicrobialresistancesurveillanceinbreedingofIivestockandpoultry2019-06国14发布2019-07-01实施上海市市场监督管理局发布会卢飞毛忘}飞手、 DB31月1160-2019前本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由上海市农业农村委员会提出并组织实施。本标准由上海市畜牧标准化技术委员会归口。本标准起草单位:上海市动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人:黄土新、张文刚、孙冰清、姜芹、顾欣、商军、徐峰、王晓旭、曹莹。I DB31月1160-2019畜禽养殖过程细菌耐药性监测技术规范1范围本标准规定了畜禽养殖过程细菌耐药性监测的设备和材料、试剂和培养基、操作步骤、结果观察和记录、质量控制和结果判定、菌种保存及生物安全措施的技术要求。本标准适用于畜禽源性细菌(大肠埃希菌、沙门菌属细菌、肠球菌属细菌和金黄色葡萄球菌〉分离、鉴定及常见抗菌药物敏感性试验(微量肉汤稀释法〉。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单〉适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求CLSIM100抗菌药物敏感性试验执行标准(PerformanceStandardsforAntimicrohialSuscepti-hilityTesting)3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1抗菌药物敏感性试瞌anti恤mi阳cα町r咄ial阳sus倪ce叩ptib恤ili均t句Y伽臼tt伽ing用于测试抗菌药物在体外对病原微生物有元抑制或杀灭作用的试验。药敏试验的结果通常用最低抑菌浓度(minimalinhihitoryconcentration，MIC)表示，即体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度。3.2微量肉汤带释法brothmicrodilutionmethod定量检测某一抗菌药物对动物源性细菌的体外抑菌活性的一种标准方法。在药敏测试板上设有一系列倍比稀释浓度的抗菌药物，通过加人待检细菌的菌悬液，经一定时间的孵育后对药敏板条进行读数，经数据分析得到MIC值。根据美国临床试验室标准化委员会(CLSI)的相应标准获得待检菌对某种抗菌药物敏感(S)、中介(1)或耐药(R)的结果。3.3敏感susceptible使用推荐剂量时，菌株可被通常达到的抗微生物药物浓度水平所抑制。3.4申介intermediate分离菌株的MIC接近于抗微生物药物在血液和组织中可达到的水平，对药物治疗的反应率可能低于敏感菌株。3.5耐药resistant按常规给药计划通常可达到的药物浓度不能抑制其生长的菌株，和(或〉证实其MIC值落在可能存在微生物特殊耐药机制的范围内，且治疗研究显示该药物临床疗效不可靠。1 DB31月1160-20193.6新点breakpoint用以区分菌株敏感、中介还是耐药的最低抑菌浓度或抑菌圈直径。4设备和尉料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料见附录A中A.1.5试剂和培养基5.1实验用水除非另有说明，水应符舍GB/T6682三级水的规窟。5.2氧化铀溶擅元菌0.85%氧化铀潜藏制备方法见A.2。5.3抗菌药物抗菌药物种类及贮备;在和工作液的制备与保存见八.305.4培养基本标准采用的培养基如rl一一运送培养基，制备见附录B中B.11一一营养琼脂培养基，制备见B.2;一一大肠埃希菌显色培养基(麦琪凯琼脂培持基).制备见B.3;一一缓冲蛋白陈水，制备见8.，10一←氧化镜·孔雀绿肉汤，制备见B.5o一一沙门民菌显色培养基(胆硫乳琼脂培养基)，制备见13.60一一肠球南显色培养基〈胆汁七叶背叠氯锦琼脂峰养基).制备且ß.7o←一7.5%氧化铀肉汤，制备见B.8。一一金黄色葡蕾球菌显色培养基(Baird-Parker琼脂培养基)，制备见B.9。一-Muel1er-Hinton肉汤(M-H肉汤)，制备见B.10.5.5质控菌株本标准中常用的质控菌株如下:一一大肠埃希菌(Escherichiacoli,ATCC25922)I-一一抄门民菌(Salmonella,ATCC35218或CVCC541);一一粪肠球菌(Enterococcusfaecalis,ATCC29212);←一金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,ATCC29213)。质控菌株使用的代次应为3代-5代，-60'C以下超低温冰箱保存。6操作步骤6.1样晶采集6.1.1缸门/泄殖腔拭子采集灭菌棉拭子一端插入家畜缸门或家禽泄殖腔1.5cm-2.0cm，旋转2圈-3圈，沾上粪便后，将棉2 DB31月1160-2019拭子置于10mL运送培养基中。6.1.2生鲜乳采集将储奶罐中的生鲜乳搅拌均句，使用元菌采样管采集生鲜乳100mLo6.1.3粟梓记录表样品采集时应填写采样登记表，参见附录C。6.2样晶保存与运送..采集的样品于o.C~4.C保存，并使用密封保温容器运送。粪便拭子保存时间不超过48h，生鲜乳样品保存时间不超过24h。6.3细菌分离与鉴定不同细菌的分离鉴定按下述方法进行E一-一大肠埃希菌分离与鉴定见附录D中D.1;一一抄门氏菌属细菌分离与鉴定见D.2;一一肠球菌属细菌分离与鉴定见D.3;一一金黄色葡萄球菌分离与鉴定见D.4。6.4萄敏试验6.4.1总则当药敏试验使用商品化试剂盒时，参照试剂盒说明书进行操作。当药敏试验使用自配药敏板时，按照6.4.2~6.4.6进行操作。6.4.2菌落培养将质控菌株和测试菌株分别转种于营养琼脂培养基，36.C士1.C培养18h""'24h以得到单个纯菌落。6.4.396孔药敏板准备将抗菌药物贮备液用无菌0.85%氧化铀溶液或M-H肉汤按附录A稀释至工作浓度，使用同样稀释液按倍比稀释法进一步稀释至一系列所需浓度，然后按顺序加入无菌孔板中，每孔50μL。分别设阴性和阳性对照孔。6.4.4菌擅制备无菌棉签用生理盐水润湿后，挑取培养18h""'24h的纯菌落3个""'5个，转移至含2mL""'3mL元菌0.85%氯化铀榕液或M-H肉汤的试管中混匀，用浊度仪或标准比浊管校正菌液浓度至0.5麦氏单位(细菌含量约为1X10BCFU/mL~2XlOBCFU/mL)，将调节至0.5麦氏单位的菌液用M-H肉汤稀释100倍，混匀备用，调制好浓度的菌液应在15min内完成加样。6.4.5菌攘攘种阴性对照孔中加入无菌M-H肉汤100IlL，阳性对照孔中加入制备好的菌液(用前混匀)100μL，其余孔分别加入制备菌液50μL，盖上元菌盖并标记菌株编号。3 DB31月1160-20196.4.6孵曹将接种完毕的96孔药敏板置于36'C士1'C恒温培养箱中，孵育16h~20ho7结果观察和记录7.1萄敏板判读方法自培养箱中取出药敏板，置于衬有黑底板的光线下用肉眼观察结果。如果无法辨别孔中是否有细菌生长时可使用观察装置帮助进行结果的判读。在无菌生长的孔内所含最低抗菌药物潜液的浓度为MIC。7.2试验有效性判断7.2.1对照孔生长情况判断如药敏板上阴性对照孔内无细菌生长，液体未见浑浊F阳性对照孔内有细菌生长，液体浑浊，则该药敏板结果有效，可继续判读菌株MIC。如阴性孔或阳性孔异常，则该药敏板结果无效。7.2.2质控菌株符合性判断如药敏板结果有效，且1w:控菌株MIC在规定范围内，则4二次试验结果有效，可继续判读样品药敏结果。如质控菌株MIC不在规定范围内，则本次试瞌结果无嫂。7.3梓晶药敏蜡果判读先进行试验结果有效性判断，在试验结果有效的前提下，继续判民样品MIC，判读完成后进行记录。8质量控制和结果判定8.í质量控制每次药敏试验均应采用合适的质控菌株进行质量控制，质控菌株药敏结果应符合规定范围。8.2结果判定质控菌株的实验结果符合规定的前提下，按照附录F中F.l'"'-'F.3标准判定测试菌株的敏感性一一敏感(S)、中介(1)或耐药(R)。对于只给出敏感判断标准的药物，只报告其是否敏感即可。9菌种保存及生物安全措施9.1菌种保存实验分离的菌株应由具备相关资质的实验室妥善保存。9.2生物安全措施实验过程及废弃物处理应严格按照GB19489中的规定执行。4 DB31月1160-2019附录A(资料性附录〉设备和材料A.l设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下:一一一次性接种环;一一元菌培养皿F一一微量移液器:0.5μL~10μL;10μL~100μL;100μL~l000μL;无菌试管z容量瓶F麦氏比浊管或浊度仪F一一冰箱:0'C~4'C和-60'C以下，一一电子天平z感量0.01g，感量0.00001g;一一恒温培养箱:36'C士1'C，42'C士1'C;一一自动加样仪或多通道微量加样器:1μL~100μL;一一涡旋仪E一一生物安全柜E一一微生物生化鉴定系统或者生化鉴定试条s一-PCR扩增仪。A.2元菌0.85%氧化铀溶渡称取0.85g氟化铀溶于100mL蒸馆水中，115'C灭菌30min。A.3抗菌药物A.3.1抗菌药物种类z青霉素、氨韦西林、苯瞠西林、阿莫西林/克拉维暖、头抱他睫、头抱唾峡、头抱西丁、庆大霉素、大观霉素、替米考墨、多西环素、氟苯尼考、磺股异略略、磺胶甲曙瞠/甲氧韦睫、恩诺沙星、氧氟沙星、美罗培南、乙酷甲哇、安普霉素、红毒素、克林霉素、泰妙菌素、利奈瞠腊、教菌素、万古霉素对照品或标准品。注g监测抗菌药物种类包含但不限于本条列出的抗菌药物。A.3.2抗菌药物贮备液的制备与保存z精密称定抗菌药物标准品或对照品适量，加入一定量的溶剂制成1000μg/mL<或最高测试浓度的10倍)的贮备液，置一60'C以下保存，有效期为半年。A.3.3抗菌药物工作液的制备z测试的浓度范围取决于细菌的种类和抗菌药物，选择的范围应覆盖参考菌株的MIC终点。使用M】H肉汤和两倍稀释法将抗菌药物制成0.03μg/mL~2048μg/mL之间的一系列浓度梯度，具体浓度范围见表A.L5 DB31月1160-2019表A.l抗菌药物浓度范围r--~--革兰民阳性菌监测抗菌药物革兰氏阴性菌监甜抗菌药物抗菌药物稀释浓度范围/Cμg/mL)抗菌药物稀释浓度范围/<μg/mL)青霉素256~0.12氨韦西林512~0.25阿莫西林128~0.06阿莫西林512~0.25克拉维酸64~0.03克拉维酸256~0.12红霉素256~0.12庆大霉素512~0.25克林霉素512~0.25大观霉素512~0.25恩诺沙星64~0.03四环素512~0.25氧氟沙星256~0.12氟苯尼考256~0.12头泡曝峡256-0.12头子包唾峡256-0.12头抱回丁128-0.25头抱他定256-0.12磺胶异略略512-16恩诺沙星32-0.015苯瞌西林4-0.12氧氟沙皇64-0.03』一-一-一一一万古霉素32-0.25美罗培甫64~0.03磺胶甲曙瞠/磺胶甲嚼瞠/16/304~0.12/2.432/608-0.06/0.12甲氧节咬甲氧爷咙多西环素64-0.25磺胶异略略512~0.25氟苯尼考512-0.25安普霉素64-0.03泰妙菌素512~0.25粘菌素256-0.12替米考屋512-0.25乙旨在甲喳512-1庆大霉素2048-1利奈跑胶32-0.066 DB31月1160-2019附录B(资料性附录〉培养基B.1运送培养基B.1.1成分运输培养基成分见表B.1.表B.1远输培养基成分组分用量硫乙蹲酸纳1.5g氯化锅5.0g磷酸二氢销(Na2HPO，•12H20)1.1g级化钙0.1g蒸饱水1000mLB.1.2制法称取表B.1中各成分加热溶解于1000mL蒸锢水中，调节pH至8.4土0.1，分装兰角瓶或试管，121.C高压灭菌15min备用。B.2营养琼脂培养基B.2.1成分营养琼脂培养基成分见表B.2。表B.2营养琼脂培养基成分组分用量蛋白陈10.0g牛肉浸膏3.0g主4化锅5.0g琼E旨15.0g蒸馆水1000mL】-‘.__~_o~__‘晶击'肉……--~…一国国_.二二国且••恤~---幽幽幽E国"‘国-圄<.剧..田'咱蛐-‘~-~-士'吃?【.宁工.-τ…一一一一」二o-=----'"B.2.2制法称取表B.2中各成分加热溶解于1000mL蒸情水中，分装三角瓶，调节pH至7.2土0.2，121.C高压灭菌15min，冷至50.C，摇匀后倾注平板。7 DB31月1160-20198.3大肠埃希菌显f白，培养基(麦康凯琼脂培养基)B.3.1成分麦康凯琼脂培养基成分见表B.3o表B.3麦康凯琼脂培养基成分「组分用量一~-←一-明胶姨酶水解物17.0g陈(或酶蛋白)3.0g--‘~马4化销5.0g中性红0.03g←一乳糖10.0g脱氧胆磁纳1.5g结晶紫0.001g琼脂13.5g蒸馆水1000mLB.3.2制法称取表B.3中各成分加热榕解于1000mL蒸馆水中，调节pH至7.1::l::0.2，分装三角瓶或试管，121'C高压灭菌15min备用。B.4缓冲蛋白臆水8.4.1成分缓冲蛋白陈水成分见表B.4o表8.4缓冲蛋白脏水成分组分用量蛋白陈10.0g♀4化纳5.0g磷酸二氢销(NazHPO.•12HzQ)9.0g磷磁二氢仰(KHzPO.)1.5g•-蒸馆水1000mLB.4.2制法称取表B.4中各成分溶于1000mL蒸榴水中，调节pH至7.2土0.2，分装三角瓶或试管，121'C高压灭菌15min备用。 DB31/T1160-2019B.5氧化镶·孔雀绿增菌液B.5.1溶渡AB.5.1.1成分溶液A成分见表B.5o表B.5溶蘸A成分τ.."'....-.-，-，"'.，.如组分用量膜蛋白腺5.0g氯化销8.0g磷磁二氢饵1.6g蒸馆水1000mLB.5.1.2制法称取表B.5中各成分加入1000mL蒸锢水中，调节pH至7.0，加热至70.C榕解。此溶液使用前在4.C冰箱储存不超过24h。B.5.2溶蘸BB.5.2.1成分榕液B成分见表B.6o囊B.6溶擅B成分组分用量400g1000mLB.5.2.2制法按照表B.6用量将MgC12.6H20溶于1000mL蒸铺水中。B.5.3溶渡CB.5.3.1成分溶液C成分见表B.7。」「胁一表B.7溶渡C成分l组分用量nu'l4g∞mL9 DB31月1160-2019B.5.3.2司司法按照表B.7将孔雀绿溶于100mL蒸锚水中。榕液可室温保存于棕色玻璃瓶中。B.5.4完全培养基B.5.4.1成分完全培养基成分见表B.8o表B.8完全培养基成分组分用量•d榕液A1000mL溶液B100mL洛液C10mL一-~B.5.4.2制法按表B.8比例配制，调节pH，使灭商后pH为5.2，分装于试管中，每管1QmL.115'C高压灭菌15mino4'C冰箱保存。B.6沙门民菌显色培养基(胆磕乳琼脂培养基)B.6.1成分胆硫乳瑞脂培养基成分地表13.90表B.9胆确乳琼脂培养基成分一一-唱-------唱-~一斗斗~------组分用量蛋白腺20.0g牛肉浸膏3.0g乳糖10.0g藤糖10.0g去氧胆酸纳1.0g硫代硫酸销2.3g拧橡磁锅1.0g梓橡磁铁镀1.0g中性红0.03g琼脂18.0g蒸饱水1000mL10 DB31月1160-2019B.6.2制法称取表B.9中除中性红和琼脂以外各成分溶于400mL蒸馆水中，调节pH至7.3士0.2，再将琼脂于600mL蒸铺水中煮沸至完全溶解，两液合井，加入0.5%中性红溶液6mL，待冷至50'C，摇匀后倾注平板。B.7肠球菌显色培养基(胆汁七叶曹叠氯铀琼脂培养基)B.7.1成分阻计七叶昔叠氮铀琼脂培养基成分见表B.IO。表B.10胆汁七叶苦叠氯铀琼脂培养基成分二组分用量=一一膜蛋白陈17.0g牛肉浸背3.0gM母浸费5.0g牛胆椅10.0g氧化销12.0g一二一一一一一一一一二榨橡磁锅1.0g卜一一一一一一一一←一一→-一-一÷一二一一二一一一→←一一七叶背1.0g拧橡截铁镀0.5g叠氮化锅0.25g琼脂13.5g蒸馆水1000mL…-~B.7.2制法称取表B.10中各成分榕于1000mL蒸锢水中，调节pH至7.1士0.2，121'C高压灭菌15min，于45'C~50'C保温培养基，从保温开始至倾注平极的时间不应超过4hoB.87.5%氧化铀肉汤B.8.1成分7.5%氧化纳肉汤成分见表B.llo表B.117.5%氧化铀肉汤成分组分用量蛋白陈10.0g牛肉浸粉5.0g氯化铺75.0g蒸馆水1000mL-L----11 DB31月1160-2019B.8.2制法称取表旦11中各成分加热榕于1000mL蒸铺水中，调节pH至7.4士0.1，分装于三角瓶或试管，121.C高压灭菌15min备用。B.9金黄色葡萄球菌显色培养基(Baird-Parker琼脂培养基〉B.9.1成分Baird-Parker琼脂培养基成分见表B.12。表B.12Baird-Parker琼脂培养基成分组分用量H一族蛋白陈10.0g牛肉沓5.0g穰母膏1.0g丙固磁销10.0g甘氨酸12.0g氯化铿(LiCl.6HzO)5.0g琼脂20.0g蒸缩水1000mL~B.9.2增菌剂30%卵黄盐水50mL与通过0.22μm孔径滤膜进行过滤除菌的1%的亚暗酸饵10mL混合，4.C冰箱保存。B.9.3制法称取表B.12中各成分至1000mL蒸锢水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH至7.0士0.2，分装每瓶95mL,121.C高压灭菌15mino临用时加热融化琼脂，冷至50.C，每95mL加入预热至50.C的卵黄亚砸酸饵增菌剂5mL摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在4.C冰箱储存不应超过48hoB.10Mueller-Hinton肉汤(M-H肉汤)B.10.1成分M-H肉汤的成分见表B.13o12 DB31月1160-2019表B.13M-H肉汤成分产-组分用量牛肉浸出粉2g可溶性淀粉1.5g路蛋白水解物17.5g琼脂17.0g蒸馆水1000mL一-一一-←~B.10.2制法称取表B.13各成分加入蒸铺水1000mL.搅拌加热煮沸至完全溶解，调节pH至7.4士0.2.分装三角瓶，121'C高压灭菌15min.定量(等体积)分装于灭菌试管中。13 DB31/T门60-2019附录C(资料性附录〉采样登记表畜禽养殖抗菌药物使用情况采样登记表见表C.l。表C.1畜禽养殖抗菌药物使用情况果梓登记囊采祥地采样时间养殖场姓名名称联系人电话养殖量采样动物采样品种采样部位生长阶段饲料添加抗饲料来源菌药治疗用抗菌药种类与使用方式序号药物名称生产企业使用方式剂量用药天数口注射口饮水口拌料口注射口饮水口拌料口注射口饮水口拌料预防用抗菌药种类序号药物名称生产企业剂量」用药天数14 DB31月1160-2019附录D(资料性附录〉大肠埃希菌、沙门氏菌属细菌、肠球菌属细菌与金黄色葡萄球菌分离鉴定D.1大肠埃希菌分离与鉴定棉拭子接种于大肠埃希菌显色培养基.36'C土1'C培养18h-24h.挑取粉红色、边缘光滑的可疑菌落，显色培养基上纯化一代，纯化后可疑菌落接种于营养琼脂培养基纯化一代。对己纯化的菌落，使用微生物生化鉴定系统或生化试条进行生化鉴定。大肠埃希菌分离与鉴定流程图见图D.1。接种于大炀埃希菌显色培养基.36'C土1'C.培养18h-24h挑取大肠埃希菌可疑菌落纯化「响---…·生化鉴定厂一大局阳i圄D.1大肠埃希菌分离与鉴定流程圈D.2沙门氏菌属细菌分离与鉴定棉拭子置于缓冲蛋白陈水中.36'C土1'C培养18h~24h.取100μL预增菌液置于10mL氧化娱孔雀绿培养基中.42'C土1'C培养22h-24h.随后将增菌液混匀，接种于沙门氏菌显色培养基.42'C士1'C培养22h-24h.挑取沙门氏菌显色培养基上无色半透明或精红色，菌落中心黑色或几乎全黑色的可疑菌落，接种至营养琼脂培养基纯化一代，对己纯化的菌落，应使用微生物生化鉴定系统或生化试条进行生化鉴定。沙门民菌属细菌分离与鉴定流程图见图D.2。或者通过附录E的方法进行分子生物学(PCR)鉴定。15 DB31月门60-2019动物肠造成其他拭予运送培弊基缓:(111蛋白陈水预增菌.36'c士1'C.培养18h-24h接种氯化饼孔雀绿端菌液.42'c土1'C.培养22h-24h接种沙门民菌显色培养基换取沙门民菌属细菌可疑菌落纯化生化鉴定PCR鉴定沙门民菌厨细菌沙门民菌属细菌圄D.2沙门民菌属细菌分离与鉴定流程圄D.3肠球菌属细菌分离与鉴定棉拭子接种于肠球菌显色培养基，36'C士1'C培养18h~24h，挑取褐色可疑菌落，显色培养基上纯化一代，纯化后可疑菌落接种至营养琼脂培养基纯化一代。对于已纯化的菌落，使用微生物生化鉴定系统或生化试条进行生化鉴定。肠球菌属细菌分离与鉴定流程图见图D.3。动物虹门威活殖腔拭子运送培养基接种于肠球菌显色培养篷.36'c土1'C.培养18h-24h挑取肠球菌属细菌可疑菌落纯化生化鉴定屎局球菌或粪JBi球菌圄D.3踢球菌属细菌分离与鉴定流程圄16 DB31月1160-2019D.4金黄色葡萄球菌分离与鉴定取1mL生鲜乳样品至9mL7.5%氧化饷肉商中，振荡混匀后36'C士1'C培养18h~24h.将培养物划线接种到金黄色葡萄球菌显色培养基上.36'C士1'C培养24h~48h.挑取灰黑色至黑色可疑菌落接种至营养琼脂培养基纯化一代。对于已纯化的菌落，使用微生物生化鉴定系统或者生化试条进行生化鉴定。金黄色葡萄球菌分离与鉴定流程图见图D.4.1mL生鲜乳+9mL7.5%氯化纳肉汤，混匀后'36'c士t"C培养18h-241-1叮疑商部纯化生化鉴定金黄色葡萄丑事商圈D.4金黄色葡萄球菌分离与鉴定潦程圈17 DB31月1160-2019附录E(资料性附录)沙门民菌属细菌PCR鉴定E.1InvA基因引物上游为5'-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3'下游为5'-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3'E.2阳性菌株鼠伤寒沙门民菌(Salmonellatyphimurium)CVCC541.或其他等效标准菌株。E.35xTBE缓冲灌5XTBE缓冲液成分见表E.1.表E.15x四E缓冲藏成分~~-二组分用量三控甲基氨基甲烧54.0g硝酸27.5g乙工酸四乙磁二锅0.4g蒸馆水1000mLE.450XTAE罐冲渡50XTAE缓冲液的成分见表E.2。表E.250XTAE缓冲藏成分组分用量三资甲基氨基甲烧242gNazEDTA.2HzO37.2g自董磁57.1mL蒸馆水1000mLE.5PCR法鉴定E.5.1PCR模板的制备用接种环从营养琼脂培养基上挑选16h~24h的纯培养物，置于0.5mL灭菌生理盐水中， DB31月1160-201912000r/min离心2min，弃上清液。再加0.5mL灭菌蒸锢水，悬浮并涡旋混匀，100.C沸水中煮沸10min后，移至冰上，冷却后以12000r/min离心2min，取上清液为PCR模板。阴性对照模板为灭菌蒸馆水，阳性对照模板由阳性菌株根据上述方法提取获得。E.5.2PCR反应体系的配制根据不同厂家PCR试剂用量，配制PCR反应体系，扩增片段长度为284bp。E.5.3PCR反应条件95.C预变性5min,94.C变性30s,64.C退火30s,72"c延伸30s，30个循环，最后72"c延伸10min，设立阴性对照和阳性对照，按同方法扩增。E.5.4电豫E.5.4.11.2%琼脂辘踵胶榻的制备称取1.2g琼脂糖，加入100mL0.5XTBE(或lXTAE)缓冲液中，加入核踵染料，依据样品数选用适宜的梳子，琼脂糖搭解后混匀倒入在水平台面上的凝胶盘中，肢极厚5mm左右。待凝胶冷却凝固后拨出梳子，取出胶块放入电惊槽中，加O.5XTBE(或lXTAE)缓冲穰淹没胶面。E.5.4.2加样取10μLPCR扩增产物和3μL上梓援冲液混匀后加入加样孔。E.5.4.3电泳条件电压110V，电泳时间30minoE.5.4.4结果判定电泳结束后，取出肢块置于紫外投射仪上打开紫外灯观察或用凝胶成像仪进行成像分析。如果某一待楼样品扩增产物的条带与沙门氏菌阳性对照的条带在一条直线上，即条带与加样孔的距离相间，而阴性对照无此条带，则该样品分离到的菌株可韧步判定为沙门民菌，必要时可通过测序来进一步确证。19 DB31月1160-2019附录F(资料性附录〉细菌对常见抗菌药物的判断标准和质控范围F.1大肠埃希菌和沙门氏菌属细菌对常见抗菌药物的折点判断标准和质控范围见表F.l。表F.1大肠埃希菌和沙门氏菌属细菌对常见抗菌药物的措点判断栋准和质控范围俨_.._--临床折点判断标准a质控菌株MIC范围μg/mLμg/mL抗菌药物种类抗菌药物ATCCATCCSIR2592235218bß-内就胶类氨常西林主ζ816主主322~8ß-内就胶/ß-内酸胶酶阿莫西林/克拉维酸:<8/416/8二注32/162/1~8/44/2-16月抑制剂头抱唾峡骂王24二三80.25-1头抱类头抱他睫:<48主主160.06-0.5碳青霉烯类美罗培商:<12二~40.008-0.06大观霉素王三3264~1288-64氨基糖昔类庆大霉素:<48~160.25-1多西环素:<48注160.5-2四环素类c四环素:<48二三160.5-2氯霉素类氟苯尼考:<24二三82-8磺胶异曙瞌:<256二主5128-32叶磁合成抑制剂d甲氧苇睫/磺胶甲略略:<2/38二剖/76:<0.5/9.5恩诺沙星:<0.51-2二主40.008-0.03氟喳诺国类大肠埃希菌骂王24法8氧氟沙星0.015-0.12沙门氏菌属细菌:<0.120.25~1注2多肤类教菌素骂王24二注80.25~2噎曝琳类乙就甲喳注z抗菌药物均采用标准物质。aI临床折点判断标准参照CLSIMlOO-S28制定。b"一"表示没有相应判断标准。c囚环素类药物如四环素、多西环素在药物浓度~128μg/mL时，其药物孔会出现挥浊现象，该现象是由钙镜离子沉淀造成，判读时应先观察后续浓度连续清澈孔位，以确认MIC值。当该类药物出现全部孔浑浊时，如需确定MIC值，应从高浓度孔位中取样进行平板接种，以确认是否有细菌生长，根据平板生长情况对应孔的MIC值进行报告。d叶竣合成抑制剂药物磺胶异曝略判读MIC结果时需考虑80%抑制原则，将药物孔浑浊情况与阳性对照孔进行比对，将连续药物孔浊度低于阳性对照孔的第2孔判定为该药物MIC值。L20 DB31月1160-2019F.2肠球菌属细菌对常见抗菌药物的折点判断标准和质控范围见表F.2。表F.2踢球菌属细菌对常见抗菌萄铀的括点判断标准和质控范围临床折点判断标准a质控离株MIC范围抗菌药物种类抗菌药物μg/mLμg/mLSIRATCC29212俨÷青备主素~8二二161-4ß-内自在胶类苯瞠西林~2二注48-32p、ß-内障胶/ß-内旨在胶爵抑制剂阿莫西林/克拉维酸军二8/416/8二主32/160.25/0.12-1/0.5b头抱睡峡骂王24二主8头抱类头抱西丁~4二注8红霉素~0.51-4二注81-4太环内南类替米考恩=二816二~324-16恩谱沙星~0.51-2二~40.12-1氟唾诺罔类氧氟沙星骂王12二主41-4四环素类c多西环索运48二~162-8磺胶异哪瞠~256二注512叶酸合成抑制剂d甲氧节晚/磺胶甲略略~2/38主~4/76运二0.5/9.5糖肤类万亩霉素~48-16二注321-4双喃烯类泰妙菌素~16~32级革运索类氟苯尼考~24二注82-8氨基糖背类庆大革运索运二48二注164-16略统商类利奈魄胶~24二注81-4林克前胶类克林综索骂王0.51-2二注44-16注z见表F.l的注。abcd按表F.l脚注的要求。F.3金黄色葡萄球菌对常见抗菌药物的折点判断标准和质控范围见表F.3。表F.3金黄色葡萄球菌对常见抗菌药物的折点判断标准和质控范围一一~"-I临床折点判断标准应质控菌株MIC范围抗菌药物种类抗菌药物μg/mLμg/mLSRATCC29213bp内院胶类青霉素骂王0.12二~0.250.25-2ß-内就胶/ß-内首先胶爵抑制剂阿莫西林/克拉维酸军二4/2二到/40.12/0.06-0.5/0.25头抱噬峡~24二去80.25-1头抱类头于包西丁ε骂王4二~81-421 DB31月1160-2019表F.3(续)临床折点判断标准·质控菌株MIC范围抗菌药物种类抗菌药物μg/mLμg/mLSIRATCC29213红绿素~0.51-4二主80.25-1大环内醋类替米考星~816二注321-4林克酷胶类克林霉素~0.51-2二主40.06-0.25氨基糖苦类庆大霉素~48主~160.12-1四环索类e多西环素~48~160.12-0.5恩谱沙星~0.51-2二~40.03-0.12氟喳诺酣类氧氟沙星~12注40.12-1磺胶异曝睡~256注51232-128叶酸合成抑制jflJd甲氧韦晓/磺胶甲哥哥瞠~2/38二~4/76~0.5/9.5糖肤类万古霉素骂王24-8注160.5-2双酶烯类泰妙菌素骂王16二注320.5-2氯霉素类氟苯尼考王三24二注82-8睡烧固类利奈瞪胶=二4二~81-4注z见表F.l的注.abcd按表F.l脚注的要求。e基于头抱回丁的结果报告苯睡西林敏感或耐药。22 DB31月1160-2019参考文献[1JCLSIM07-A9MethodsforDilutionAntimicrobialSusceptibilityTestsforBacteriathatGrowAerobicallyk EON-ou=H户的阁。上海市地方标准畜禽养殖过辑细菌耐药性监测技术规范DB31/T1160-2019号毒中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(10004日网址www.spc.net.cn总编室:(010)68533533发行中心以010)51780238读者服务部，(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销善开本880X12301/16印张1.75字数48千字2020年4月第一版2020年4月第一次印刷'争刊号155066•5一1264定价27.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究D831/T1160-2019举报电话:(010)68510107打印忖期2020年5月12HF002